ES2443302T3 - Secuencia de adn y preparación recombinante de alérgenos mayores del grupo 4 de cereales - Google Patents

Abstract

Molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de un alérgeno mayor del polen de cereales,seleccionada de una de las secuencias según SEQ ID NO 7 y 9.

Description

Secuencia de adn y preparación recombinante de alérgenos mayores del grupo 4 de cereales

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de secuencias de ADN de alérgenos mayores del grupo 4 de

5 cereales (Triticeae). La invención incluye también fragmentos, combinaciones nuevas de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico. Las moléculas de ADN recombinante y los polipéptidos derivados, fragmentos, nuevas combinaciones de secuencias parciales y variantes se pueden utilizar para la terapia de enfermedades de alergia al polen. Las proteínas recombinantes preparadas se pueden emplear para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

10 Las alergias del tipo 1 tienen importancia en todo el mundo. Hasta un 20% de la población de los países industrializados sufre de dolencias como rinitis alérgica, conjuntivitis o asma bronquial. Estas alergias son provocadas por alérgenos presentes en el aire (aeroalérgenos), que son liberados por fuentes de diferente procedencia, como polen de plantas, ácaros, gatos o perros. Hasta el 40% de estos alérgicos de tipo 1 muestran además reactividad IgE específica con alérgenos del polen de gramíneas, entre otros, alérgenos del polen de

15 cereales (Freidhoff y col., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78, 1190-2001). Entre los alérgenos del polen de cereales tienen una especial importancia los alérgenos del centeno.

Las sustancias desencadenantes de las alergias de tipo 1 son proteínas, glicoproteínas o polipéptidos. En personas sensibilizadas, tras la absorción en las mucosas estos alérgenos reaccionan con los anticuerpos IgE que están unidos a la superficie de los mastocitos. Cuando dos moléculas de IgE se enlazan a través de un alérgeno se

20 produce la liberación de mediadores (p. ej., histamina, prostaglandinas) y citoquinas mediante las células efectoras y con ello se desencadenan los correspondientes síntomas clínicos.

Dependiendo de la frecuencia relativa con la que las moléculas de alérgeno individuales reaccionan con los anticuerpos IgE de los alérgicos, se diferencia entre alérgenos mayores y menores.

Los alérgenos del polen de diferentes especies de la familia de las gramíneas (Poaceae) se clasifican en grupos 25 que son homólogos entre sí.

En particular las moléculas del grupo 4 de alérgenos mayores presentan entre sí una alta reactividad inmunológica cruzada, tanto con anticuerpos monoclonales de ratón como con anticuerpos IgE humanos (Fahlbusch y col., 1993 Clin. Exp. Allergy 23:51-60; Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98:1065-1072; Su y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 97:210; Fahlbusch y col., 1998, Clin. Exp. Allergy 28:799-807; Gavrovic-Jankulovic y col.,

30 2000, Invest. Allergol. Clin. Immunol. 10 (6):361-367; Stumvoll y col. 2002, Biol. Chem. 383:1383-1396; Grote y col., 2002, Biol. Chem. 383:1441-1445; Andersson y Lidholm, 2003, Int. Arch. Allergy Immunol. 130:87-107; Mari, 2003, Clin. Exp. Allergy, 33 (1):43-51).

Hasta ahora no se conoce una secuencia de ADN completa de ningún alérgeno mayor del grupo 4.

De los alérgenos del grupo 4 de Dactylus glomerata hasta ahora solamente se han obtenido por degradación 35 enzimática y se han secuenciado los péptidos:

DIYNYMEPYVSK (SEQ ID NO 13),

VDPTDYFGNEQ (SEQ ID NO 14),

ARTAWVDSGAQLGELSY (SEQ ID NO 15),

y GVLFNIQYVNYWFAP (SEQ ID NO 16, Leduc-Brodard y col., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 1065-1072).

40 También se han obtenido por proteolisis y se han secuenciado péptidos de los alérgenos del grupo 4 de la gramínea subtropical Bermuda (Cynodon dactylon):

KTVKPLYIITP (SEQ ID NO 17),

KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS (SEQ ID NO 18),

TVKPLYIITPITAAMI (SEQ ID NO 19),

LRKYGTAADNVIDAKVVDAQGRLL (SEQ ID NO 20), KWQTVAPALPDPNM (SEQ ID NO 21), VTWIESVPYIPMGDK (SEQ ID NO 22), GTVRDLLXRTSNIKAFGKY (SEQ ID NO 23),

5 TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS (SEQ ID NO 24), YRDLDLGVNQVVG (SEQ ID NO 25), SATPPTHRSGVLFNI (SEQ ID NO 26), y AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD (SEQ ID NO 27, Liaw y col., 2001, Biochem. Biophys.

Research Communication 280: 738-743). 10 Para Lolium perenne se describieron fragmentos de péptidos de alérgenos básicos del grupo 4 con las secuencias

siguientes: FLEPVLGLIFPAGV (SEQ ID NO 28) y GLIEFPAGV (SEQ ID NO 29, Jaggi y col., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89: 342-348). Como primera secuencia de un alérgeno del grupo 4 se ha resuelto por parte del inventor de la presente solicitud de

patente la secuencia aún no publicada de Phl p 4 de Phleum pratense (SEQ ID NO 11) y se describe en la solicitud 15 internacional WO 04/000881.

Hasta ahora no se sabe nada sobre las secuencias de los alérgenos mayores de grupo 4 de los cereales (Triceae). Por consiguiente, el objeto en el que se basa la presente invención consiste en la preparación de secuencias de ADN de alérgenos mayores del grupo 4 de los cereales, en particular del alérgeno Sec c 4 de centeno (Secale cerale) (SEQ ID NO 1, 3), Hor v 4 de cebada (Hordeum vulgare) (SEQ ID NO 5) y Tri a 4 de trigo (Triticum aestivum)

20 (SEQ ID NO 7, 9), así como de las correspondientes moléculas de ADN recombinante sobre cuya base se pueden expresar los alérgenos como proteína y se puede hacer accesible un aprovechamiento significativo como tal o en forma modificada. La secuencia de Phl p 4 (SEQ ID NO 11) ha sido el punto de partida para la presente invención.

Índice de secuencias según la invención

A las secuencias de ADN y proteínas de los alérgenos maduros según SEQ ID NO 1-10 las precede una secuencia 25 señal. Con los codones de parada TGA o TAG en la secuencia de ADN termina el segmento codificante.

-

Secuencia de ADN de Sec c 4. (a) Isoforma Sec c 4.01 (SEQ ID NO 1), (b) Isoforma Sec c 4.02 (SEQ ID NO 3).

-

Secuencias de proteína (SEQ ID NO 2, 4) derivadas de las secuencias de ADN según SEQ ID NO 1 y 3.

-

Secuencia de ADN de Hor v 4 (SEQ ID NO 5).

-

Secuencia de proteína (SEQ ID NO 6) derivada de la secuencia de ADN según SEQ ID NO 5. 30 - Secuencia de ADN de Tri a 4. (a) Isoforma Tri a 4.01 (SEQ ID NO 7), (b) Isoforma Tri a 4.02 (SEQ ID NO 9).

-

Secuencias de proteína (SEQ ID NO 8, 10) derivadas de las secuencias de ADN según SEQ ID NO 7 y 9.

-

Secuencia de ADN de Phl p 4 (SEQ ID NO 11) según SEQ ID NO 5 del documento WO 04/000881.

-

Secuencia de proteína de Phl p 4 (SEQ ID NO 12) según SEQ ID NO 6 del documento WO 04/000881.

Descripción de la invención

35 Con la presente invención se proporcionan ahora por primera vez las secuencias de ADN del alérgeno mayor del polen de cereales Sec c 4, Hor v 4 y Tri a 4 según SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, y 9.

Por consiguiente, son objeto de la presente invención las moléculas de ADN seleccionadas a partir de las secuencias de nucleótidos según SEQ ID NO 7 y 9.

Por consiguiente, la invención también trata de secuencias homólogas a la secuencia de ADN según la invención o moléculas de ADN correspondientes de los alérgenos del grupo 4 de otras Poaceae, como por ejemplo Lolium

5 perenne, Dactylis glomerata, Poa pratensis, Cynodon dactylon y Holcus lanatus, que hibridan bajo condiciones rigurosas a causa de la homología existente en las secuencias con el ADN según la invención, o presentan una reactividad inmunológica cruzada respecto los alérgenos según la invención.

La invención incluye también fragmentos, combinaciones nuevas de secuencias parciales y mutaciones puntuales con efecto hipoalergénico.

10 Por consiguiente, también son objeto de la invención las correspondientes secuencias parciales, una combinación de secuencias parciales o mutaciones de intercambio, eliminación o adición, los cuales codifican para un fragmento inmunomodulador y reactivo frente a células T de un alérgeno del grupo 4 de Poaceae.

Con el conocimiento de la secuencia de ADN de los alérgenos que existen en la naturaleza ahora sólo es posible preparar estos alérgenos como proteínas recombinantes, que se pueden emplear en el diagnóstico y la terapia de

15 enfermedades alérgicas (Scheiner y Kraft, 1995, Allergy 50: 384-391).

La inmunoterapia específica o hiposensibilización representa una aproximación clásica al tratamiento terapéutico eficaz de las alergias (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339, Bousquet y col., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102(4): 558-562). Así, se inyectan de forma subcutánea a los pacientes extractos de alérgenos naturales en dosis crecientes. No obstante, con este método existe el peligro de reacciones alérgicas o incluso de un choque

20 anafiláctico. Para minimizar estos riesgos se emplean preparados innovadores en forma de alergoides. Se trata de extractos de alérgenos modificados químicamente que presentan una reactividad IgE claramente reducida, aunque presentan idéntica reactividad frente a células T en comparación con el extracto no tratado (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).

Sería posible una optimización más amplia de la terapia con alérgenos preparados de forma recombinante.

25 Cócteles definidos, dado el caso basados en el patrón de sensibilización individual del paciente, de alérgenos recombinantes de elevada pureza podrían reemplazar a los extractos de fuentes de alérgenos naturales, ya que éstos, aparte de los diferentes alérgenos, contienen una gran cantidad de proteínas acompañantes inmunogénicas pero no alergénicas.

Perspectivas realistas, que podrían conducir a una hiposensibilización segura con productos de expresión, ofrecen

30 alérgenos recombinantes mutados dirigidos en los cuales se han eliminado de forma específica epítopos IgE, sin perjudicar a los epítopos de células T esenciales para la terapia (Schramm y col., 1999, J. Immunol. 162: 24062414).

Otra posibilidad de influir terapéuticamente en el equilibrio alterado de las células TH en los alérgicos es la vacunación inmunoterapéutica con ADN. Se trata de un tratamiento con ADN con capacidad de expresión que codi

35 fica para los alérgenos relevantes. Las primeras pruebas experimentales de la influencia alergenoespecífica de la respuesta inmune se obtuvieron en roedores mediante la inyección de ADN codificante de alérgeno (Hsu y col., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).

Por consiguiente, también es objeto de la presente invención una molécula de ADN descrita previamente o a continuación, o un vector de expresión recombinante correspondiente como medicamento.

40 Las correspondientes proteínas preparadas de forma recombinante se pueden emplear para la terapia y para el diagnóstico in vitro e in vivo de alergias al polen.

Para la preparación del alérgeno recombinante, el ácido nucleico clonado se liga a un vector de expresión y esta construcción se expresa en un organismo huésped apropiado. Tras la purificación bioquímica, se obtiene este alérgeno recombinante para la detección de anticuerpos IgE en procedimientos establecidos.

45 Por consiguiente, también es objeto de la presente invención un vector de expresión recombinante que contiene una molécula de ADN descrita previamente o a continuación, unida funcionalmente con una secuencia control de expresión y un organismo huésped, transformado con la molécula de ADN indicada o el vector de expresión indicado.

Asimismo, es objeto de la invención el uso de al menos una molécula de ADN descrita anteriormente o al menos un 50 vector de expresión descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae, preferentemente Triticeae, en particular Sec c 4, Hor v 4, Tri a 4, y/o para la prevención de dichas alergias.

Como ya se ha mencionado la invención se puede emplear como un componente esencial en un preparado que

5 contiene alérgenos o ácidos nucleicos recombinantes para la inmunoterapia específica. Así, se presentan varias posibilidades. Por un lado, la proteína no modificada en la estructura primaria puede formar parte del preparado. Por otro lado, mediante la deleción dirigida de epítopos IgE de la molécula completa o mediante la preparación de fragmentos individuales que codifican para epítopos de células T, se emplea para la terapia según la invención una forma (alergoide) hipoalergénica para evitar efectos secundarios no deseados. Finalmente, mediante el propio ácido

10 nucleico, cuando éste se liga con un vector de expresión eucariótico, se consigue un preparado que aplicado directamente modifica el estado inmune alérgico en el sentido terapéutico.

Además, la presente invención trata de polipéptidos que codifican para una o varias moléculas de ADN descritas anteriormente, preferentemente en su calidad como medicamentos.

Así, se trata de proteínas correspondientes a una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO 8 o 10. En

15 particular se trata de las proteínas maduras (sin la parte de secuencia señal), empezando con el aminoácido 22 (SEQ ID NO 8, 10). Además, la invención se refiere a proteínas que contienen estas secuencias de aminoácidos o partes de estas secuencias.

Además, la invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de dichos polipéptidos mediante el cultivo de un organismo huésped y la obtención de los correspondientes polipéptidos a partir del cultivo.

20 También según la invención se emplea al menos un polipéptido descrito anteriormente para la preparación de un medicamento para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae, preferentemente Triticeae, en particular Sec c 4, Hor v 4, Tri a 4, así como para la prevención de dichas alergias.

Para la determinación de las secuencias de proteínas y ADN según la invención se procede como sigue:

25 Sec c 4 de centeno

1. Partiendo de la secuencia de ADN de Phl p 4 (SEQ ID NO 12, WO 04/000881) se generaron cebadores específicos (Tab. 1) derivados de la secuencia Phl p 4. Mediante PCR con los cebadores #87 y #83 se obtuvieron cinco clones de ADN de polen de centeno. El fragmento 1 del gen Sec c 4 amplificado correspondiente a estos clones codifica para un polipéptido correspondiente a los aminoácidos 68-401 de Phl p 4 (SEQ ID NO 12).

30 2. Con la secuencia parcial Sec c 4 se realizó una búsqueda en la base de datos EST. Sin embargo, en la base de datos EST especializada en centeno no se pudieron encontrar secuencias homólogas. En lugar de esto, se encontraron fragmentos EST individuales, homólogos, no solapados en las bases de datos EST especializadas en cebada y trigo. Los fragmentos EST individuales alcanzan hasta el segmento 5’-UTR, otros hasta el segmento 3’-UTR (UTR = segmento no traducido) de los genes correspondientes.

35 3. Sin embargo, a partir de las secuencias EST encontradas en las bases de datos no se puede construir ningún gen completo del grupo 4 de trigo o cebada, ya que estas secuencias no se solapan y no se conoce ningún gen homólogo del grupo 4. Sin embargo, estas secuencias EST se pudieron clasificar según la secuencia Phl p 4 (SEQ ID NO 11) y el fragmento Sec c 4 obtenido en la etapa 1 y sirvieron como patrón para la preparación de cebadores de PCR.

40 4. Con ayuda de los cebadores #195 y #189 preparados de este modo se pudieron obtener tres clones mediante PCR. El cebador #195 derivó de una secuencia EST de cebada, el cebador #189 es un cebador específico de Phl p 4 y solapa el codón de parada de Phl p 4, así como los codones de los 10 aminoácidos C-terminales de Phl p 4. El fragmento 2 de Sec c 4 amplificado de este modo codifica para un polipéptido, empezando dentro de la secuencia señal y terminando con la posición que se corresponde con la posición 490 de Phl p 4. Este polipéptido cubre el

45 extremo N de Sec c 4.

5a. Otros tres clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #195 y #202. Ambos cebadores derivaron de las secuencias EST de cebada. El gen 3 de Sec c 4 amplificado codifica para los aminoácidos correspondientes empezando dentro de la secuencia señal y terminando en el extremo C de Sec c 4.

La secuencia completa de Sec c 4 madura se obtiene por tanto en la secuencia definida.

Las dos siguientes etapas 5b y 5c sirven para asegurar los resultados obtenidos en la etapa 5a: 5b. Otro clon se obtuvo mediante PCR con los cebadores #195 y #203. El cebador #195 derivó de una secuencia EST de cebada y el cebador #203, de una secuencia EST de trigo. El gen Sec c 4 amplificado codifica para los aminoácidos correspondientes empezando dentro de la secuencia señal y terminando en el extremo C de Sec c 4. 5 La secuencia completa de Sec c 4 madura se obtiene por tanto en la secuencia definida. 5c. Otro clon se obtuvo mediante PCR con los cebadores #195 y #198. El gen Sec c 4 amplificado codifica para los

aminoácidos correspondientes empezando dentro de la secuencia señal y terminando en el extremo C de Sec c 4. La secuencia completa de Sec c 4 madura se obtiene por tanto en la secuencia definida. Se encontraron dos isoformas Sec c 4.01 y 4.02. Los alérgenos maduros empiezan con el aminoácido 23 de la

10 secuencia según SEQ ID NO 2, 4 y 6.

Hor v 4 de cebada

Con ayuda de las secuencias Sec c 4 obtenidas como se describe previamente se han podido encontrar en las

bases de datos EST fragmentos EST homólogos a Hordeum vulgare. Sin embargo, estos fragmentos no se solapan

formando un gen completo. Aunque según las secuencias EST encontradas se pudieron generar cebadores 15 específicos de Hor v 4, que se emplearon para una amplificación del gen Hor v 4 a partir de ADN genómico.

En total se analizaron 15 clones.

4 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #195 y #198.

4 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #195 y #202.

3 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #194 y #198.

20 4 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #194 y #202.

La secuencia de la proteína derivada empieza dentro de la secuencia señal de Hor v 4 y llega hasta el extremo C

terminal de la proteína (a partir del aminoácido 23 de SEQ ID NO 6).

Tri a 4 de trigo

Con ayuda de la secuencia Sec c 4 obtenida como se describe previamente se han podido encontrar en las bases 25 de datos EST fragmentos EST homólogos a Triticum aestivum. Sin embargo, estos fragmentos no se solapan

formando un gen completo. Aunque según las secuencias EST encontradas se pudieron generar los cebadores

específicos de Tri a 4 #199, #203, #204 y #206, que se emplearon para una amplificación del gen Tri a 4 a partir de

ADN genómico.

En total se analizaron 13 clones. 30 4 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #204 y #203.

4 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #204 y #199.

3 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #206 y #203.

4 clones se obtuvieron mediante PCR con los cebadores #206 y #199.

Las secuencias de proteína derivadas empiezan dentro de la secuencia señal de Tri a 4 y llegan hasta el extremo

35 C-terminal de la proteína.

Se encontraron dos variantes Tri a 4.01 (a partir del aminoácido 22 de SEQ ID NO 8) y Tri a 4.02 (a partir del aminoácido 22 de SEQ ID NO 10). Para la preparación de los alérgenos recombinantes según la invención se construyeron secuencias de ADN según

SEQ ID NO 1, 3, 5, 7 y 9 en vectores de expresión (p. ej., pProEx, pSE 380). Para los aminoácidos N-terminales 40 conocidos a partir de la secuenciación de la proteína se emplearon codones optimizados de E. coli.

Tras la transformación en E. coli, la expresión y la purificación del alérgeno recombinante según la invención mediante diferentes técnicas de separación, la proteína obtenida se sometió a un proceso de replegado.

Ambos alérgenos se pueden emplear para el diagnóstico altamente específico de alergias al polen de gramíneas. Este diagnóstico se puede realizar in vitro mediante la detección de anticuerpos específicos (IgE, IgG1 - 4, IgA) y la 5 reacción con células efectoras cargadas con IgE (p. ej., basófilos de la sangre) o in vivo mediante reacciones de ensayos en la piel y provocación en el órgano de reacción.

La reacción de los alérgenos según la invención con linfocitos T de alérgicos al polen de gramíneas se puede comprobar mediante la estimulación alergenoespecífica de los linfocitos T para la proliferación y síntesis de citoquina, tanto con células T en linfocitos sanguíneos de preparación reciente como en líneas y clones de células T

10 establecidas reactivas frente a nSec c 4, nHor v 4 o nTri a 4.

Mediante mutagénesis dirigida al sitio se modificaron tripletes codificantes para la cisteína, de manera que codifican para otros aminoácidos, preferentemente serina. Se prepararon variantes, tanto en las que se reemplazaron cisteínas individuales como aquellas en las que se modificaron diferentes combinaciones de 2 restos cisteína o todas las cisteínas. Las proteínas expresadas de estas mutaciones puntuales de cisteína presentan una reactividad

15 fuertemente reducida o inexistente con anticuerpos IgE de alérgicos, aunque reaccionan con los linfocitos T de estos pacientes.

Por consiguiente, también es objeto de la presente invención una molécula de ADN descrita previamente o a continuación, en la que mediante mutagénesis dirigida al sitio, varios o todos los restos cisteína del polipéptido correspondiente se intercambiaron por otro aminoácido.

20 La actividad inmunomoduladora de los fragmentos hipoalergénicos que corresponden a polipéptidos con epítopos de células T, así como la de las mutaciones puntuales hipoalergénicas (p. ej., intercambios de cisteína) se puede comprobar mediante su reacción con las células T de los alérgicos al polen de gramíneas.

Dichos fragmentos o mutaciones puntuales de cisteína hipoalergénicos se pueden emplear como preparados para la hiposensibilización de alérgicos, ya que reaccionan con la misma eficacia con las células T, aunque a causa de la

25 reducida o inexistente reactividad IgE ocasionan pocos efectos secundarios producidos por IgE.

Si los ácidos nucleicos que codifican para las variantes de alérgenos hipoalergénicos según la invención o las moléculas de ADN no modificadas según la invención se ligan con un vector de expresión humano, estas construcciones se pueden emplear también como preparados para una terapia inmune (vacunación con ADN).

Finalmente, son objeto de la presente invención preparaciones farmacéuticas que contienen al menos una molécula

30 de ADN descrita anteriormente o al menos un vector de expresión descrito anteriormente y dado el caso otros principios activos y/o coadyuvantes para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias, en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae, preferentemente Triticeae, en particular Sec c 4, Hor v 4, Tri a 4, y/o para la prevención de dichas alergias.

Otro grupo de preparaciones farmacéuticas según la invención, en lugar de ADN contiene al menos un polipéptido 35 descrito anteriormente y es adecuado para el diagnóstico y/o tratamiento de las alergias indicadas.

Las preparaciones farmacéuticas en el sentido de la presente invención contienen como principio activo un polipéptido según la invención o un vector de expresión y/o sus respectivos derivados de uso farmacéutico, incluidas sus mezclas en todas las proporciones. Así, los principios activos según la invención pueden mezclarse

40 con al menos un excipiente o coadyuvante sólido, líquido y/o semilíquido y, en su caso, combinarse con uno o varios principios activos diferentes en una forma de dosificación adecuada.

Como coadyuvantes son particularmente apropiados el ADN inmunoestimulante u oligonucleótidos con motivos CpG.

Estas preparaciones se pueden emplear como agentes terapéuticos o diagnósticos en medicina humana o

45 veterinaria. Como excipientes entran en consideración sustancias orgánicas o inorgánicas apropiadas para la aplicación parenteral y que no influyen negativamente en el efecto del principio activo según la invención. Para la aplicación parenteral se emplean en particular soluciones, preferiblemente soluciones oleosas o acuosas, otras suspensiones, emulsiones o implantes. El principio activo según la invención también se puede liofilizar y los liofilizados obtenidos se pueden emplear, por ejemplo, para la preparación de preparados inyectables. Las pre

50 paraciones indicadas se pueden esterilizar y/o pueden contener coadyuvantes como conservantes, estabilizantes y/o humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, sustancias tampón y/o varios principios activos distintos.

Además, mediante la formulación correspondiente del principio activo según la invención se pueden obtener preparados de depósito, por ejemplo mediante adsorción en hidróxido de aluminio.

Por tanto, la invención también sirve para mejorar el diagnóstico in vitro en el marco de una identificación de componentes alérgenos activadores del espectro de sensibilización específico de los pacientes. La invención sirve también para la preparación de preparados claramente mejorados para la inmunoterapia específica de alergias al polen de gramíneas.

Tabla 1 Cebadores empleados

a) Sec c 4

Cebador nº

SEQ ID NO Secuencia

#0083

30 GGCTCCCGGGGCGAACCAGTAG

#0087

31 ACCAACGCCTCCCACATCCAGTC

#0189

32 GATAAGCTTCTCGAGTGATTAGTACTTTTTGATC AGCGGCGGGATGCTC

#0195

33 GCTCTCGATCGGCTACAATGGCG

#0198

34 CACGCACTACAAATCTCCATGCAAG

#0202

35 CATGCTTGATCCTTATTCTACTAGTTGGGC

#0203

36 TACGCACGATCCTTATTCTACTAGTTGGGC

a) Hor v 4

Cebador nº

SEQ ID NO Secuencia

#0194

37 GCCTTGTCCTGCCACCACGCCGCCGCCACC

#0195

38 GCTCTCGATCGGCTACAATGGCG

#0198

39 CACGCACTACAAATCTCCATGCAAG

#0202

40 CATGCTTGATCCTTATTCTACTAGTTGGGC

c) Tri a 4

Cebador nº

SEQ ID NO Secuencia

#0199

41 CACGCACTAAATCTCCATGCAAG

#0203

42 TACGCACGATCCTTATTCTACTAGTTGGGC

#0204

43 AAGCTCTATCGCCTACAATGGCG

#0206

44 GGTGCTCCTCTTCTGCGCCTTGTCC

secuencia señal de PROT

ADN

codón de parada

secuencia señal de ADN

secuencia señal de PROT

ADN

codón de parada

secuencia señal de ADN

secuencia señal de PROT

ADN

ADN

aminoácido indeterminado

ADN ADN

ADN

ADN

ADN ADN

ADN

ADN

ADN

ADN ADN

ADN

ADN

ADN ADN

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos de un alérgeno mayor del polen de cereales, seleccionada de una de las secuencias según SEQ ID NO 7 y 9.

2. 2.

   Vector de expresión de ADN recombinante o un sistema de clonación que contiene una molécula de ADN 5 según la reivindicación 1, unido funcionalmente con una secuencia control de expresión.

3. 3. Procedimiento para la preparación de un polipéptido, codificado mediante una secuencia de ADN según la reivindicación 1, mediante cultivo de un organismo huésped y obtención del correspondiente polipéptido a partir del cultivo.

4. 4.

   Polipéptido que comprende una de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO 8 y 10, el cual codifica 10 para una secuencia de ADN según la reivindicación 1.

5. 5. Polipéptido que comprende el alérgeno maduro de las secuencias de aminoácidos según la reivindicación 4, seleccionado del siguiente grupo de secuencias de aminoácidos

   -

   una de las secuencias de aminoácidos según SEQ ID NO 8 o 10.

6. 6. Polipéptido según la reivindicación 4 o 5 como medicamento.

   15 7. Preparación farmacéutica que contiene al menos un polipéptido según la reivindicación 6 para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae.

7. 8. Uso de al menos un polipéptido según la reivindicación 6 para la preparación de un medicamento para el diagnóstico y/o tratamiento de alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.

   20 9. Molécula de ADN según la reivindicación 1 como medicamento.

8. 10.

   Vector de expresión recombinante según la reivindicación 7 como medicamento.

9. 11.

   Preparación farmacéutica que contiene al menos una molécula de ADN según la reivindicación 9 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 10 para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de

   25 dichas alergias.
10. 12. Uso de al menos una molécula de ADN según la reivindicación 9 o al menos un vector de expresión según la reivindicación 10 para la preparación de un medicamento para la vacunación inmunoterapéutica con ADN de pacientes con alergias en cuya activación están implicados alérgenos del grupo 4 de Poaceae y/o para la prevención de dichas alergias.