ES2437614T3 - Compuestos fluorescentes hidrófilos a base de dipirrometenos-boro - Google Patents
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-
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- C07F5/02—Boron compounds
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Abstract
Compuesto fluorescente e hidrófilo que responde a la fórmula (I) siguiente: en la que: S1 representa un grupo de fórmula -CC-L'-A en la que: - L' es un grupo de enlace que es - un enlace sencillo; o - un grupo hidrocarbonado divalente seleccionado de entre el grupo que consiste en los alquilenoslineales o ramificados, que comprenden eventualmente en su cadena un o varios oxígeno, nitrógeno oazufre; los alquenilenos lineales o ramificados; los alquinilenos lineales o ramificados, y los arilenos; ouna cadena hidrocarbonada divalente constituida por un encadenamiento de por lo menos dos gruposhidrocarbonados divalentes del tipo citado anteriormente; - A es un grupo funcional polar seleccionado de entre los grupos sulfonato, sulfato, fosfato, amonio,carboxilato, fosfonato, sulfato de alquilamonio y polioxietileno; S2 representa: - un grupo -CC-L'-A idéntico o diferente de S1, en el que L' y A tienen los significados citadosanteriormente; - -F; -H; o - una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida poruno o varios átomos de oxígeno, de nitrógeno o de azufre, eventualmente ciclizada en su totalidad o enparte, eventualmente aromática, y eventualmente funcionalizada, y cada uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7 designa, independientemente de los otros, un grupo -H ouna cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno ovarios átomos de oxígeno, eventualmente ciclizada en su totalidad o en parte, eventualmente aromática yeventualmente funcionalizada, entendiéndose que la totalidad o parte de los R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7, pueden estar unidos entre sí para formaruna forma de puente.
Description
Compuestos fluorescentes hidrófilos a base de dipirrometenos-boro.
La presente invención se refiere a nuevos compuestos fluorescentes hidrófilos, útiles en particular como marcadores fluorescentes en medios acuosos o hidrófilos, que se revelan en particular adaptados a una utilización en medios biológicos, o a un injerto sobre soportes hidrófilos (óxidos metálicos, polímeros orgánicos por ejemplo).
Se conocen compuestos unos fluorescentes en particular a partir de la solicitud internacional WO 2006/087459, que se refiere a unos dipirrometenos-boro borocarbonados insaturados, que presentan un desplazamiento de Stokes elevado, que son útiles como marcadores fluorescentes, en particular para el análisis mediante fluorescencia o mediante electroluminiscencia.
Existe la necesidad de compuestos fluorescentes de este tipo, que presenten además un carácter hidrófilo y que se puedan emplear por ejemplo a modo de marcadores en el interior de un medio acuoso. En efecto, es interesante poder llevar a cabo procedimientos de análisis mediante fluorescencia en medios acuosos, en particular en el marco del estudio de los procesos biológicos, para la titulación fluoroinmunológica, la microscopía de fluorescencia, la citometría de flujo, la secuenciación de ADN y el marcaje de material biológico. Ahora bien, resulta que numerosos compuestos fluorescentes útiles a modo de marcadores se revelan inutilizables en medio acuoso. Es el caso en particular de los compuestos dados a conocer en el documento WO 2006/087459.
Además, la modificación de un compuesto fluorescente insoluble mediante un grupo de naturaleza encaminada a aumentar su carácter hidrófilo no conduce de manera sistemática a la obtención de un compuesto en particular utilizable en el interior de un medio acuoso o hidrófilo. Al contrario, la experiencia muestra que la presencia de un grupo polar en el ciclo de dipirrometeno de los dipirrometenos-boro borocarbonados insaturados del documento WO 2006/087459 no confiere de manera sistemática un carácter hidrosoluble, ni siquiera hidrófilo, al compuesto. En la práctica, se observa que tales compuestos con determinados grupos polares injertados en el ciclo de dipirrometeno se agregan de hecho en medios acuosos o hidrófilos, lo que se explica aparentemente por interacciones hidrófobas entre los dipirrometenos o interacciones específicas de tipo enlace de hidrógeno. Esta agregación o interacción intermolecular conlleva una extinción de la luminiscencia.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar compuestos útiles como marcadores fluorescentes, que se puedan utilizar en medios hidrófilos, y preferentemente en medios acuosos sin conducir al fenómeno de agregación citado anteriormente.
Para ello, la invención proporciona unos compuestos fluorescentes hidrófilos que responden a la fórmula (I) siguiente:
en la que:
- •
- S1 representa un grupo de fórmula -C:C-L’-A, en el que:
- L’ es un grupo de enlace que es
- -
- un enlace sencillo (en cuyo caso S1 es un grupo de fórmula -C:C-A); o
- -
- un grupo hidrocarbonado divalente seleccionado de entre el grupo que consiste en los alquilenos lineales o ramificados, que comprenden eventualmente uno o varios oxígeno, nitrógeno o azufre en el interior de su cadena (como los grupos polietilenglicol, polietoxilo o polipropoxilo, por ejemplo); los alquenilenos lineales o ramificados; los alquinilenos lineales o ramificados, y los arilenos; o una cadena hidrocarbonada divalente constituida por un encadenamiento de por lo menos dos grupos hidrocarbonados divalentes del tipo citado anteriormente;
- A es un grupo funcional polar seleccionado de entre los grupos sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, carboxilato, hidroxilo, fosfonato, sulfato de alquilamonio y polioxietileno;
- •
- S2 representa:
- -
- un grupo -C:C-L’-A idéntico o diferente de S1, en el que L’ y A presentan los significados citados anteriormente;
--F;
5
--H; o
- -
- una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por
uno o varios átomos de oxígeno, de nitrógeno o de azufre, eventualmente ciclizada en su totalidad o en 10 parte, eventualmente aromática, y eventualmente funcionalizada, y
• cada uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7 designa, independientemente de los otros, un grupo -H o una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno o varios átomos de oxígeno, eventualmente ciclizada en su totalidad o en parte, eventualmente aromática y
15 eventualmente funcionalizada,
entendiéndose que la totalidad o parte de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7, pueden estar unidos entre sí para formar una forma de puente (a saber, que por lo menos dos de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 pueden formar juntos un ciclo con los carbonos a los que están unidos).
20 Los compuestos que responden a la fórmula (I) anterior son hidrófilos, a saber, presentan una capacidad para crear enlaces con las moléculas de agua, en particular enlaces de hidrógeno y/o iónicos, o una fuerte polaridad. Para determinados compuestos según la invención, el carácter hidrófilo es suficiente para garantizar una hidrosolubilidad. En particular, numerosos compuestos según la invención presentan una solubilidad en agua de por lo menos
25 0,1 mg/l, y algunos presentan una solubilidad en la agua superior o igual a 1 mg/l, incluso superior a 5 mg/l, por ejemplo superior o igual a 10 mg/l.
En el marco de la presente invención, los inventores han puesto ahora de manifiesto que un compuesto que responde a la fórmula (I) citada anteriormente, en el que por lo menos uno de los grupos presentes en el boro 30 comprende un grupo polar, es hidrófilo y no conduce a fenómenos de agregación cuando se pone en medio hidrófilo
o acuoso, lo que permite su utilización en particular a modo de marcador fluorescente en medio hidrófilo o acuoso. Este resultado se revela inesperado a la vista de los resultados observados con los dipirrometenos-boro borocarbonados insaturados del documento WO2006/087459 que comprenden un grupo polar en el ciclo de dipirrometeno, citados anteriormente en la presente descripción, para los que no se observa un efecto de este tipo.
35 El efecto observado parece explicarse, por lo menos en parte, por el hecho de que la sustitución a nivel del boro con uno o varios grupos hidrófilos impide la formación de agregados, volviéndose la molécula más voluminosa y por tanto menos susceptible de agregarse.
Además, la o las funciones hidrófilas introducidas a nivel del centro de boro de los compuestos según la invención
40 confieren a los compuestos una estabilidad química superior a los compuestos difluorados (S1=S2=F) análogos. Esta estabilidad permite utilizar los compuestos según la invención para marcar moléculas, que podrán ser sometidas a etapas de síntesis química posteriores (síntesis peptídica, sintetizador de oligonucleótidos, por ejemplo), pero también permite incorporar los compuestos según la invención en dispositivos optoelectrónicos (OLED (diodo electroluminiscente orgánico), células fotovoltaicas).
45 De modo general, las variaciones de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 permiten modular la longitud de onda de emisión de los compuestos.
A continuación se describirán en más detalle diferentes aspectos y modos de realización preferidas de la invención. 50 Por “cadena hidrocarbonada” se entiende, en el sentido de la presente descripción, una cadena que comprende uno
o varios átomos de carbono y uno o varios átomos de hidrógeno, estando esta cadena funcionalizada o no funcionalizada. Las cadenas hidrocarbonadas presentes en el interior de un compuesto de fórmula (I) según la invención comprenden preferentemente de 1 a 8 átomos de carbono, preferentemente menos de 6 átomos de
55 carbono. En la presente descripción, cuando se hace referencia a una “cadena funcionalizada”, se entiende que la cadena comprende por lo menos un grupo funcional.
Por “alquileno” se entiende en la presente memoria un radical hidrocarbonado saturado divalente, de cadena lineal o ramificada, que comprende preferentemente de 2 a 10 átomos de carbono, por ejemplo de 3 a 6 átomos de carbono.
60 Como ejemplo, se pueden citar los radicales metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, octileno, nonileno, decileno, dodecileno, hexadecileno y octadecileno, lineales o ramificados. En el sentido de la presente descripción, el término “alquileno” engloba también grupos del tipo citado anteriormente y que incluyen además átomos de oxígeno. El polietilenglicol y el polipropilenglicol son los alquilenos lineales que comprenden en sus cadenas varios oxígenos preferidos.
65 Por “alquenileno” se entiende un radical hidrocarbonado divalente que comprende por lo menos una insaturación etilénica (normalmente uno o varios enlaces >C=C<, adyacentes o no), que comprende preferentemente de 2 a 8 átomos de carbono, por ejemplo de 3 a 6 átomos de carbono. A modo de ejemplos de radicales alquenileno, se pueden citar en particular los radicales alileno o vinileno.
5 Por “alquinileno” se entiende un radical hidrocarbonado divalente que comprende por lo menos una insaturación acetilénica (normalmente uno o varios enlaces -C:C-).
Por “arileno” se designa un radical divalente aromático hidrocarbonado, de 1 a 4 ciclos condensados o no, que
10 presentan en particular de 4 a 16 átomos de carbono, preferentemente de 4 a 10 átomos de carbono, y que pueden contener en su ciclo átomos de nitrógeno, de azufre o de oxígeno (heterociclos). Los grupos arilo están sustituidos eventualmente con uno o varios grupos alquilo o alcoxilo, en particular con metilo o metoxilo. Entre los radicales arilo, se pueden citar en particular el radical fenilo, naftilo, pirenilo, perilenilo, antracenilo, tienilo, pirolilo, piridinilo o furanilo.
15 Según un modo de realización particular, los grupos R3 y R4 forman juntos un grupo divalente y/o los dos grupos R6 y R7 forman juntos un grupo divalente. En este caso, dichos grupos divalentes son preferentemente tales que forman con los átomos de carbono a los que están unidos una estructura seleccionada de entre el grupo constituido por un ciclo o dos ciclos condensados, presentando cada ciclo 5 o 6 átomos y comprendiendo átomos de carbono y
20 eventualmente heteroátomos (preferentemente de 1 a 3, dado el caso) seleccionados de entre N, O y S.
Según un modo de realización interesante, cada uno de los grupos R1 R2, R3, R4, R5, R6 y R7 designa, independientemente de los otros, un grupo seleccionado de entre los grupos de fórmula -H; -L-H, -G o -L-G, en los que:
- -
- G es un grupo funcional, preferentemente seleccionado de entre los grupos amina, amida, ácido carboxílico, éster, sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, hidroxilo, fosfonato y polioxietileno
- -
- L es un grupo de enlace constituido por uno o varios segmentos seleccionados de entre un enlace sencillo;
30 los alquilenos lineales o ramificados que comprenden eventualmente en su cadena uno o varios oxígenos; los alquenilenos lineales o ramificados; los alquinilenos, y los arilenos; pudiendo portar el grupo L por lo menos un grupo funcional además del grupo G; pudiendo ser este grupo funcional idéntico al grupo G o diferente. Más generalmente, cuando L porta varios grupos funcionales, estos grupos pueden ser idénticos o diferentes entre sí y se seleccionan preferentemente de entre los grupos amina, amida, ácido carboxílico, éster,
35 sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, hidroxilo, fosfonato y polioxietileno.
Cuando varios grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 responden a la definición -G o -L-G, los grupos G pueden ser idénticos o diferentes.
40 Preferentemente, el grupo funcional A presente en el grupo -C:C-L’-A presente a modo de grupo S1 en los compuestos de fórmula (I) se selecciona de entre los grupos polioxietileno, fosfato, sulfato y sulfato de alquilamonio, lo que confiere un carácter hidrófilo, incluso hidrosoluble, particularmente pronunciado al compuesto (I). Cuando el compuesto (I) porta un grupo S2 que responde a la fórmula -C:C-L’-A, es preferible que el grupo funcional A se elija de los grupos polares citados anteriormente, lo que tiende aún más a reforzar la hidrofilia obtenida.
45 Según un modo de realización ventajoso, en los compuestos de fórmula (I) los grupos S1 y S2 son ambos grupos que responden a la fórmula -C:C-L’-A citada anteriormente (en la que L’ y A presentan uno de los significados citados anteriormente). En este modo de realización, el compuesto (I) comprende dos grupos en el boro que comprenden cada uno un grupo A polar. Los compuestos según este modo de realización presentan debido a esto, por regla
50 general, un carácter hidrófilo acentuado.
Preferentemente, en los compuestos de la invención, los grupos S1 y S2 son idénticos.
Según un modo de realización particular, en los compuestos de fórmula (I) según la invención, el grupo S1 (y
55 eventualmente el grupo S2) comprende un grupo polioxietileno. Según este modo de realización, ventajosamente, el grupo S1 comprende a modo de grupo -L’-A es un grupo de fórmula -(O-CH2-CH2)n-O-S’, y el compuesto hidrófilo y fluorescente según la invención responde entonces a la fórmula (II) siguiente: en la que:
• n representa 1, 2, 3 o 4,
• S’ representa -H, -Me-(CH2)n’-SO3-(Xm+)1/m o -(CH2)n’-PO32-(Xm+)2/m en los que: 10
- -
- Xm+ representa un catión (mono o poliatómico) de valencia m (siendo esta valencia M normalmente igual a 1, 2, 3 o 4),
- -
- n’ es un número entero igual a 1, 2, 3 o 4.
15 Los cationes Xm+ de la fórmula (II) son preferentemente cationes de metal alcalino, de metal alcalinotérreo o cationes amonio cuaternario.
Más generalmente, cuando se hace mención a cationes asociados a los compuestos de la invención en la presente
20 descripción, estos cationes X son preferentemente cationes de metal alcalino, de metal alcalinotérreo o cationes amonio cuaternario, normalmente cationes seleccionados de entre los cationes Li+, Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4+ y los cationes tetraalquilamonio.
Los compuestos que responden a la fórmula (II) anterior presentan generalmente propiedades de hidrofilia 25 particularmente pronunciadas, que se explican entre otras cosas por la aptitud que presentan los oxígenos del polioxietilenglicol para formar enlaces de hidrógeno.
La presencia de funciones portadoras de carga en uno o varios de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, S2 y S’ aumenta aún más la hidrofilia, y permite generalmente que los compuestos sean solubles en la agua.
30 Según un otro modo de realización interesante, en los compuestos de fórmula (I) según la invención, el grupo S1 (y eventualmente el grupo S2) comprende un grupo fosfato. La presencia de este grupo confiere al compuesto propiedades de hidrofilia marcadas, en particular gracias a la carga que porta el grupo fosfato, lo que, también en este caso, favorece a la hidrofilia del compuesto en agua. Según este modo de realización, el compuesto hidrófilo y
35 fluorescente según la invención responde preferentemente a la fórmula (III) siguiente:
en la que: 40
- -
- R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y S2 son tal como se han definido anteriormente,
- -
- Ar representa un arileno,
45 -Xm+ representa un catión (mono o poliatómico, preferentemente del tipo citado anteriormente) de valencia m (siendo esta valencia M normalmente igual a 1, 2, 3 o 4),
- -
- n’ es un número entero igual a 1, 2, 3 o 4.
Según todavía otro modo de realización, en los compuestos de fórmula (I) según la invención, el grupo S1 (y eventualmente el grupo S2) comprende un grupo zwitteriónico de tipo sulfato de amonio o fosfato de amonio. La presencia de un grupo de este tipo a modo de grupo S1 confiere en general propiedades de hidrofilia elevadas al compuesto, lo que se explica en particular por la presencia de la forma de betaína (asociación del catión amonio y del grupo aniónico de tipo fosfato o sulfato). Según este modo de realización, el compuesto hidrófilo y fluorescente según la invención responde preferentemente a la fórmula (IV) siguiente:
10 en la que:
- -
- R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y S2 son tal como se han definido anteriormente,
- -
- n representa 0, 1, 2, 3, 4 o 5, 15
- -
- -
- S” representa -SO3 o -PO32-(Xm+)1/m
en el que Xm+ representa un catión (mono o poliatómico) de valencia m (siendo esta valencia M normalmente igual a 1, 2, 3 o 4).
20 Ventajosamente, en los compuestos según la presente invención, por lo menos uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7 es un grupo que porta un grupo funcional polar seleccionado de entre los grupos carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, hidroxilo, fosfonato y polioxietileno. Generalmente los compuestos hidrófilos y fluorescentes según este modo de realización específica resultan ser particularmente hidrófilos, incluso hidrosolubles, lo que
25 parece explicarse por lo menos en parte por el hecho de que comprenden por lo menos un grupo polar en el grupo dipirrometeno además del o de los grupos polares S1 y/o S2 en el boro. Tal como se destacó anteriormente en la presente descripción, la sola presencia de un grupo polar en el grupo dipirrometeno no basta en sí misma para garantizar la hidrofilia buscada. No obstante, los trabajos de los inventores parecen indicar que en presencia de un grupo polar S1 (y eventualmente S2) en el boro que garantiza la hidrofilia, el grupo polar en el grupo dipirrometeno
30 aumenta aun más el carácter hidrófilo, incluso es hidrosoluble.
Por otro lado, en los compuestos de fórmula (I) según la invención, R1 representa preferentemente un grupo -Ar-L-Y, en el que:
35 -Ar representa un arileno,
- -
- L representa un enlace sencillo; un alquileno lineal o ramificado o un alquinileno sustituido lineal o ramificado,
- -
- Y representa -Cl, -Br, -I, -COOH, -COOMe, -COOEt, -CONH-CH2-CH2-NH2, -CONH-CH2-COOEt, -CONH40 CH2-COOH, -CONH-(CH2)qNCS, o bien un grupo que responde a una de las fórmulas siguientes:
en las que q representa 1, 2, 3, 4 o 5.
En la fórmula -Ar-L-Y anterior, el grupo Ar es preferentemente un fenilo, y el grupo L es preferentemente un enlace sencillo o un alquinileno.
Cuando R1 representa un grupo -Ar-L-Y, los compuestos de la invención presentan la ventaja de comprender una
5 función Y que puede servir de función de injerto mediante reacción con la función química de una molécula, en particular de una molécula biológica. El compuesto fluorescente se puede emplear entonces en particular a modo de marcador fluorescente hidrófilo o se puede injertar sobre soportes sólidos hidrófilos según técnicas conocidas en sí mismas, descritas en particular en “The Handbook A guide to fluorescence Probes and Labelling Technologies” décima edición, R. P. Haugland, Invitrogen 2005 y en las referencias que se citan en el mismo.
10 En los compuestos de fórmula (I) según la invención, según un modo de realización preferida:
• los grupos R2 y R5 son, independientemente, grupos -H o -Me, y
15 • los grupos R3, R4, R6 y R7 se seleccionan independientemente de entre -H, -Me, -C:C-CH2-N+(Me)2-(CH2)n-SO3-, -C:C-Ar-R’ y un grupo de fórmula
20 en la que:
- -
- Ar representa un arileno,
- -
- R’ representa -OMe, -CH2-PO32-(Xm+)2/m o -C:C-CH2-R”, en el que R” representa -O-(CH2-CH2-O)n-CH3, 25 O-(CH2-CH2-O)n-CH2-PO32-(Xm+)2/m, -O-(CH2-CH2-O)n-CH2-SO3-(Xm+)1/m, -N+(Me)2-CH2-(CH2)n-PO32(Xm+)1/m o -N+(Me)2-CH2-(CH2)n-SO3-, en los que:
- n representa 1, 2, 3 o 4
Xm+
30 - representa un catión (mono o poliatómico) de valencia m (siendo esta valencia M normalmente igual a 1, 2 o 3).
Más generalmente, en los compuestos de la invención, los grupos R3, R4, R6 y R7 se seleccionan preferentemente de entre -H, -Me y 35
Cuando R3, R4, R6 y/o R7 representan -C:C-Ar-R’ o
Ar representa preferentemente un fenilo o un tienilo.
Según un modo de realización particularmente preferido, en los compuestos de la presente invención: 45
• R1 representa un grupo -Ar-L-Y, en el que:
- -
- Ar representa un arileno,
50 -L representa un enlace sencillo; un alquileno lineal o ramificado o un alquinileno sustituido lineal o ramificado,
- -
- Y representa -Cl, -Br, -I, -COOH, -COOMe, -COOEt, -CONH-CH2-CH2-NH2, -CONH-CH2-COOEt, -CONH-
CH2-COOH, -CONH-(CH2)qNCS, o bien un grupo que responde a una de las fórmulas siguientes: 55
en las que q representa 1, 2, 3, 4 o 5,
- •
- los grupos R2 y R5 se seleccionan de entre -H y -Me, y
- •
- los grupos R3, R4, R6 y R7 se seleccionan de entre -H, -Me, -C:C-CH2-N+(Me)2-(CH2)n-SO3-, -C:C-Ar-R’ y
10 en la que:
- -
- Ar representa un arileno,
15 -R’ representa -OMe, -CH2-PO32-(Xm+)2/m o -C:C-CH2-R”, en el que R” representa -O-(CH2-CH2-O)n-CH3, O-(CH2-CH2-O)n,-CH2-PO32-(Xm+)2/m, -O-(CH2-CH2-O)n-CH2-SO3-(Xm+)1/m, -N+(Me)2-CH2-(CH2)n-PO32(Xm+)1/m o -N+(Me)2-CH2-(CH2)n-SO3-, en los que:
- -
- n representa 1, 2, 3 o 4 20
- -
- X representa un catión, y
- -
- m representa la valencia del catión X.
25 Según un modo de realización particular, los compuestos de la invención son compuestos de fórmula (I) citada anteriormente en la que R2 y R5 son idénticos.
Normalmente (en concreto por motivos de facilidad de síntesis) los compuestos de la invención son generalmente compuestos simétricos, a saber, compuestos en los que: 30
- -
- R2 y R5 son idénticos,
- -
- R3 y R6 son idénticos, y
- -
- R4 y R7 son idénticos.
35 No obstante, la presente invención se extiende naturalmente a compuestos no simétricos, que también presentan las propiedades y ventajas inherentes a todos los compuestos que responden a la fórmula general (I).
Según un modo de realización preferido, los compuestos fluorescentes hidrófilos de la invención pueden responder ventajosamente a la fórmula (la) a continuación: 40
en la que:
- •
- S’ es tal como se ha definido anteriormente,
- •
- Ar, L e Y son tal como se han definido anteriormente,
• n representa 1, 2, 3 o 4,
5 • R3, R6, R4 y R7 se eligen tales que:
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -H y R4 y R7 son idénticos y representan -Me,
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -Et y R4 y R7 son idénticos y representan -Me,
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -H y R4 y R7 son idénticos y representan
15 -R3 y R6 son idénticos y representan -H, R4 representa -Me y R7 representa
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -H y R4 y R7 son idénticos y representan
- -
- R3 y R4 forman juntos un grupo divalente -(CH2)4- y R6 y R7 forman juntos un grupo divalente -(CH2)4-, o 25 -R3 y R6 son idénticos y representan -H, R4 representa -Me y R7 representa
sustituido o no.
A modo de ejemplos no limitativos de compuestos de fórmula (la) bien adaptados según la invención, se pueden citar en particular los compuestos que responden a las fórmulas (Ia-1) a (Ia-20) a continuación:
Los compuestos Ia-1 a Ia-20 presentan la ventaja de presentar propiedades ópticas similares a las de los fluoróforos 5 utilizados comúnmente:
- -
- Ia-1, Ia-5, Ia-9, Ia-16 a Ia-20 presentan características ópticas similares a la fluoresceína,
-Ia-2, Ia-6, Ia-10 presentan características ópticas similares a la rodamina 6G; 10
- -
- Ia-4, Ia-8, Ia-12 presentan características ópticas similares a TMR (tetrametil-rodamina);
- -
- Ia-3, Ia-7, Ia-11 presentan características ópticas similares a TOTO-3 (tetrayoduro de 1,1’-(4,4,7,7-tetrametil4,7-diazaundecametilen)-bis-4-[3-metil-2,3-dihidro-(benzo-1,3-tiazol)-2-propeniliden]-quinolino).
15 Según un modo de realización particular, los compuestos fluorescentes hidrófilos de la invención responden a la fórmula (Ic) siguiente:
en la que:
5 -Y, L y Ar son tal como se han definido anteriormente,
- -
- R3, R6, R4 y R7 son tal como se han definido anteriormente, y,
- -
- n representa 2, 3 o 4.
10 A modo de compuestos de fórmula (Ic) bien adaptados según la presente memoria, se pueden citar en particular, entre otros, los compuestos de fórmulas (Ic-1), (Ic-2) y (Ic-3) siguientes: Según un otro modo de realización, los compuestos fluorescentes hidrófilos de la invención responden a la fórmula (Ie) siguiente:
en la que: 10 -Y, Ar y L son tal como se han definido anteriormente, y
- -
- n representa 1, 2, 3 o 4
- -
- S’ es tal como se ha definido anteriormente, y designa preferentemente -Me, 15
- -
- X representa un catión, y,
- -
- m representa la valencia del catión X, 20 -representa 1 o 2.
En un modo de realización, los compuestos fluorescentes hidrófilos de la invención presentan la fórmula (If) siguiente:
en la que:
-Y, Ar y L son tal como se han definido en la reivindicación 8, y
5
- -
- X representa un catión,
- -
- n representa 0, 1, 2, 3 o 4, 10 -m representa la valencia del catión X, y
- -
- p representa 1 o 2.
Los compuestos de la invención se revelan en particular útiles a modo de marcador fluorescente en medio acuoso.
15 En un modo de realización preferido, por lo menos uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 comprende una función que permite el injerto en la molécula que se va a marcar, en particular una función Y tal como se ha definido anteriormente. Preferentemente, el grupo R1 de los compuestos utilizados como marcador fluorescente comprende una función que permite el injerto en la molécula que se va a marcar, en particular una función Y tal como se ha definido anteriormente.
20 Normalmente, un compuesto fluorescente e hidrófilo según la invención se puede utilizar en un procedimiento de marcaje en medio acuoso que comprende una etapa de puesta en contacto en el interior de un medio acuoso de un compuesto de fórmula (I), preferentemente en estado solubilizado en dicho medio acuoso, y de una molécula que se va a marcar que porta un grupo susceptible de reaccionar con uno de los grupos del compuesto de fórmula (I), en
25 particular la función Y.
Los compuestos fluorescentes e hidrófilos de la invención se pueden utilizar en un gran número de aplicaciones, incluyendo entre otras las aplicaciones siguientes:
30 -el marcaje de moléculas de interés biológico:
o polipéptidos y proteínas
o oligonucleótidos, hebra de ADN y de ARN 35
o anticuerpos
o enzimas 40 -microscopía de fluorescencia
- -
- citometría de flujo
- -
- titulación fluoroinmunológica.
45 Los compuestos se pueden utilizar en particular para marcar aminoácidos o nucleótidos, que se pueden utilizar a continuación, respectivamente, para la síntesis de péptidos o de oligonucleótidos.
Por otro lado, gracias a la estabilidad química aumentada de los compuestos según la invención con respecto a
50 compuestos en los que S1=S2=F, y a sus propiedades electroquímicas, los compuestos según la invención se pueden utilizar en sistemas optoelectrónicos tales como OLED (diodo electroluminiscente orgánico) o células fotovoltaicas.
Estas técnicas de marcaje, de microscopía de fluorescencia, de citometría de flujo y de titulación fluoroinmunológica se pueden poner en práctica con los compuestos según la invención siguiendo las técnicas notificadas en “The Handbook A guide to fluorescence Probes and Labelling Technologies” décima edición, R. P. Haugland, Invitrogen
5 2005 y en las referencias citadas en esa obra.
Estas utilizaciones constituyen, según otro aspecto, un objeto particular de la presente invención.
Los compuestos según la invención se pueden sintetizar mediante las técnicas conocidas por el experto en la 10 materia.
A modo de ejemplo se describen a continuación rutas de síntesis de los compuestos específicos Ia-1 a Ia-20, que se pueden adaptar para la preparación de otros compuestos que responden a la fórmula (I).
15 Los compuestos Ia-1 a Ia-4 se pueden obtener mediante la acción del metoxietoxietinil-Grignard en THF (tetrahidrofurano), normalmente a una temperatura de aproximadamente 60ºC, por ejemplo siguiendo el protocolo descrito en la solicitud PCT/WO 2006/087459A2 partiendo de los compuestos 1-4 que se han preparado siguiendo la bibliografía por el experto en la materia. La función yodo se puede convertir a continuación en derivados carbonilados, por ejemplo bajo atmósfera de monóxido de carbono en presencia de catalizador [Pd(PPH3)2Cl2], en
20 particular en una mezcla de trietilamina/benceno a 70ºC. La elección del nucleófilo utilizado permite obtener directamente numerosas funciones que se pueden utilizar para el acoplamiento a una molécula biológica o la utilización en un sintetizador de proteína. Con etanol, los ésteres etílicos Ia-5 a Ia-8 se obtienen con muy buenos rendimientos, estos ésteres se saponifican para obtener los ácidos carboxílicos Ia-9 a Ia-12 correspondientes (esquema 1). Estos compuestos son muy hidrófilos. Ia-9, Ia-10 y 1a-12 presentan la ventaja de ser solubles en agua
25 a pH=7, en forma de carboxilato. Los compuestos hidrosolubles específicos constituyen un objeto particular de la presente invención. Estos ácidos carboxílicos se pueden utilizar directamente para el marcaje, o se pueden injertar unos espaciadores de los tipos de aminoácidos, utilizando técnicas de acoplamiento peptídico.
Normalmente, los compuestos se pueden sintetizar según la ruta de síntesis descrita en el esquema 1 a 30 continuación.
Esquema 1
Utilizando una diamina alifática en exceso, se puede obtener el compuesto Ia-13. También se puede introducir directamente un aminoácido protegido (ejemplo: éster etílico de la glicina) para proporcionar la-14, cuyo ácido carboxílico Ia-15 correspondiente se puede obtener mediante saponificación (esquema 2). El compuesto la-15 presenta la ventaja de ser hidrosoluble.
Normalmente, los compuestos se pueden sintetizar según la ruta de síntesis descrita en el esquema 2 a continuación.
10 Esquema 2
El compuesto Ia-16 se puede obtener en particular mediante la acción del triisopropilsilliloxietoxietinil-Grignard, por ejemplo en THF a 60ºC, en particular siguiendo los procedimientos de la solicitud PCT/WO 2006/087459A2 15 partiendo del compuesto 1. A continuación se puede eliminar el grupo protector TIPS (triisopropilsililo) en medio ácido, por ejemplo con una disolución acuosa de HCl 0,1 M. A continuación se puede desprotonar el dialcohol Ia-17, por ejemplo con t-butóxido de potasio, y se puede añadir triflato de fosfonato de dietilo. Entonces se puede modificar el compuesto Ia-18 en la posición meso, que porta un yoduro de arilo. Se puede sintetizar un éster de etilo mediante reacción con monóxido de carbono, por ejemplo en presencia de etanol, de catalizador [Pd(PPH3)2Cl2], en una
20 mezcla de trietilamina-benceno a aproximadamente 70ºC. El compuesto Ia-19 así obtenido se puede saponificar para proporcionar el compuesto objetivo Ia-20 (esquema 3).
Normalmente, los compuestos se pueden sintetizar según la ruta de síntesis descrita en el esquema 3 a continuación.
Esquema 3
5 Los compuestos de la familia Ic se pueden obtener siguiendo el protocolo de síntesis descrito en el esquema 4. Como ejemplo el compuesto 2 puede reaccionar con dimetilamino-propino-Grignard, en particular en THF a aproximadamente 60ºC, para obtener el compuesto intermedio Ic-0. Éste se puede poner a continuación en presencia de propanosultona, por ejemplo en tolueno, para proporcionar el compuesto Ic-1. El compuesto Ic-1 presenta la ventaja de ser hidrosoluble. La función yodo del compuesto Ic-1 se puede utilizar a modo de ejemplo
10 para introducir un éster carboxílico mediante reacción de carboalcoxilación, en particular en presencia de catalizador de paladio, para proporcionar el compuesto Ic-2, el cual se puede saponificar fácilmente por el experto en la materia para proporcionar el ácido carboxílico correspondiente. También se puede introducir un grupo que puede servir de cromóforo suplementario (para crear una diada, es decir una molécula compuesta por dos fluoróforos que absorben a longitudes de onda diferentes y en la que la parte que absorbe a alta energía transfiere energía a la segunda que
15 emite entonces una luz de menor energía) por ejemplo mediante acoplamiento catalizado por paladio unido a subligando con un pireno disustituido que porta una verdadera función acetilénica, para proporcionar el fluoróforo Ic
3. De modo análogo, la función éster se puede saponificar fácilmente (esquema 4).
Normalmente, los compuestos se pueden sintetizar según la ruta de síntesis descrita en el esquema 4 a 20 continuación.
Los compuestos hidrosolubles específicos Ia-9, Ia-10, Ia-12, Ia-15 y Ic-1 constituyen un objeto particular de la presente invención. 5 Ejemplos:
Los diferentes compuestos fluorescentes hidrófilos según la invención se sintetizaron según los protocolos descritos anteriormente. 10 Preparación del compuesto Ia-1
Se preparó el compuesto Ia-1 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución de 2,5-dioxaoct-7-ino (1,1 ml, 8,90 mmol) en THF anhidro, a temperatura ambiente, se le añadió bajo argón bromuro de etilmagnesio (1,0 M en THF, 8 ml). Se agitó la mezcla durante 2 h a 60ºC, después se dejó 5 enfriar a temperatura ambiente. Se transfirió la disolución así obtenida mediante una cánula a una disolución de difluoroboradipirrometeno 1b (900 mg, 1,778 mmol) en THF anhidro. Se agitó la disolución durante una noche a 60ºC, después se añadió agua. Se extrajo esta disolución con diclorometano. A continuación se lavó la fase orgánica con agua (3X20 ml) después con una disolución saturada de NaCl (1X20 ml). Tras evaporación, se purificó el residuo orgánico mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo, 10:90;
10 20:80; 30:70), y se obtuvo el compuesto Ia-1 en forma de un polvo naranja (1080 mg, 87%).
Caracterización del compuesto Ia-1
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 0,94 (t, 3H, 3J = 7,55 Hz), 1,26 (s, 6H), 2,29 (q, 4H, 3J= 7,55 Hz), 2,65 (s, 6H), 3,31 (s, 15 6H), 3,50 (m, 4H), 3,61 (m, 4H), 4,15 (s, 4H), 7,40 (sist. AB, 4H, JAB = 8,55 Hz, νo0 = 226,42 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0 = 12,19, 14,09, 14,80, 17,44, 59,06, 59,82, 68,60, 71,88, 90,72, 94,35, 128,84, 130,66, 133,11, 136,07, 136,10, 138,21, 138,53, 154.
20 UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 501 (90000), 365 (4500), 325 (5300), 280 (8700);
Análisis elemental calculado para C31H36BlN2O4: C, 58,33; H, 5,68; N, 4,39. Hallado: C, 58,12; H, 5,41; N, 4,19.
Preparación del compuesto Ia-2 25 Se preparó el compuesto Ia-2 según el siguiente esquema de reacción:
30 A una disolución de 2,5-dioxaoct-7-ino (1,1 ml, 8,90 mmol) en THF anhidro, a temperatura ambiente, se le añadió bajo argón bromuro de etilmagnesio (1,0 M en THF, 8 ml). Se agitó la mezcla durante 2 h a 60ºC, después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se transfirió la disolución así obtenida mediante una cánula a una disolución de difluoroboradipirrometeno 1b (900 mg, 1,778 mmol) en THF anhidro. Se agitó la disolución durante una noche a 60ºC, después se añadió agua. Se extrajo esta disolución con diclorometano. A continuación se lavó la fase orgánica
35 con agua (3X20 ml) después con una disolución saturada de NaCl (1X20 ml). Tras evaporación, se purificó el residuo orgánico mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo, 10:90; 20:80; 30:70), y se obtuvo el compuesto Ia-2 en forma de un polvo naranja (1080 mg, 87%).
Caracterización del compuesto Ia-2
40 1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 0,94 (t, 3H, 3J = 7,55 Hz), 1,26 (s, 6H), 2,29 (q, 4H, 3J = 7,55 Hz), 2,65 (s, 6H), 3,31 (s, 6H), 3,50 (m, 4H), 3,61 (m, 4H), 4,15 (s, 4H), 7,40 (sist. AB, 4H, JAB = 8,55 Hz, νo0 = 226,42 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0 = 12,19, 14,09, 14,80, 17,44, 59,06, 59,82, 68,60, 71,88, 90,72, 94,35, 128,84,
130,66, 133,11, 136,07, 136,10, 138,21, 138,53, 154.
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 522 (82000), 488 (20000), 381 (6400), 277 (6400).
Preparación del compuesto Ia-3
Se preparó el compuesto Ia-3 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución de 2,5-dioxaoct-7-ino (0,49 ml, 0,41 mmol) en THF anhidro, a temperatura ambiente, se le añadió bajo argón bromuro de etilmagnesio (1,0 M en THF, 3,7 ml). Se agitó la mezcla durante 2 h a 60ºC, después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se transfirió la disolución así obtenida mediante una cánula a una disolución de
15 difluoroboradipirrometeno 1c (670 mg, 0,816 mmol) en THF anhidro. Se agitó la disolución durante una noche a 60ºC, después se añadió agua. Se extrajo esta disolución con diclorometano. A continuación se lavó la fase orgánica con agua (3X20 ml) después con una disolución saturada de NaCl (1X20 ml). Tras evaporación, se purificó el residuo orgánico mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo, 80:20; 100%), y se obtuvo el compuesto Ia-3 en forma de un polvo azul (780 mg, 91%).
20 Caracterización del compuesto Ia-3
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 1,46 (s, 6H), 3,15 (m, 4H), 3,19 (s, 6H), 3,40 (s, 6H), 3,50 (m, 4H), 3,59 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 3,88 (m, 4H), 4,15 (s, 4H), 4,18 (m, 4H), 6,62 (s, 2H), 7,26 (sist. AB, 8H, JAB = 8,65 Hz, νo0 = 180,55 Hz), 7,11
25 (m, 4H), 7,82 (d, 2H), 8,05 (d, 2H).
13C-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0 =15,21, 27,01, 58,86, 59,19, 59,50, 67,64, 68,26, 69,80, 70,91, 71,61, 72,07, 91,64, 94,62, 115,20, 118,15, 119,15, 128,89, 130,24, 130,80, 131,33, 134,16, 135,37, 136,82, 138,23, 140,04, 152,26, 159,62.
30 UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 646 (126600), 600 (43000), 371 (76500), 266 (8080).
Preparación del compuesto Ia-4
35 Se preparó el compuesto Ia-4 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución de 2,5-dioxaoct-7-ino (0,25 ml, 2,1 mmol) en THF anhidro, a temperatura ambiente, se le añadió 40 bajo argón bromuro de etilmagnesio (1,0 M en THF, 1,90 ml). Se agitó la mezcla durante 2 h a 60ºC, después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se transfirió la disolución así obtenida mediante una cánula a una disolución de difluoroboradipirrometeno 4 (273 mg, 0,418 mmol) en THF anhidro. Se agitó la disolución durante una noche a 60ºC, después se añadió agua. Se extrajo esta disolución con diclorometano. A continuación se lavó la fase orgánica con agua (3X20 ml) después con una disolución saturada de NaCl (1X20 ml). Tras evaporación, se purificó el residuo
5 orgánico mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo, 20:80; 40:60), y se obtuvo el compuesto Ia-4 en forma de un polvo violeta (300 mg, 85%).
Caracterización del compuesto Ia-4
10 1H-RMN (CDCl3 300 MHz):1,40 (s, 3H), 1,44 (s, 3H), 2,73 (s, 3H), 3,25 (s, 6H), 3,30 (m, 4H), 3,39 (s, 3H), 3,54 (m, 4H), 3,59 (m, 2H), 3,72 (m, 2H) 3,87 (m, 2H) 4,17 (s, 4H), 6,02 (s, 1H), 6,59 (s, 1H), 7,22 (sist. AB, 4H, JAB = 8,65 Hz, νo0 = 179,98 Hz); 7,48 (sist. AB, 4H, JAB = 8,28 Hz, νo0 = 223,73 Hz), 7,57 (sist. AB, 2H, JAB = 16,18 Hz, νo0 = 296,87 Hz).
15 13C-RMN (CDCl3, 300 MHz,): 0 = 14,31, 14,99, 15,20, 16,36, 58,94, 59,20, 59,58, 67,63, 68,41, 69,79, 70,91, 71,69, 72,06, 91,40, 94,64, 115,13, 118,01, 119,16, 121,84, 128,72, 129,94, 130,17, 130,52, 130,68, 133,94, 135,27, 138,28, 138,61, 140,44, 140,66, 152,45, 155,40, 159,58.
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 572 (93500), 533 (27600), 328 (47800).
20 Preparación del compuesto Ia-5
Se preparó el compuesto Ia-1 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto Ia-1 (235 mg, 0,37 mmol) en 15 ml de benceno se le añadieron 1 ml de etanol (17,2 mmol), 44 mg de bis-cloruro de bis-trifenilfosfina-paladio (0,07 mmol) y 5 ml de trietilamina. Se agitó la disolución a 70ºC durante una noche haciendo “burbujear” monóxido de carbono. Se extrajo la mezcla de reacción
30 con diclorometano y se lavó con agua (3x20 ml). Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (CH2Cl2/MeOH 99:1 o AcOEt/éter de petróleo 40:60) para proporcionar el compuesto Ia-5 en forma de un polvo naranja (210 mg, 97%).
Caracterización del compuesto Ia-5
35 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): 0 = 1,33 (s, 6H), 1,42 (t, 3H, 3J = 7,0 Hz), 2,71 (s, 6H), 3,35 (s, 6H), 3,53 (m, 4H), 3,64 (m, 4H), 4,19 (s, 4H), 4,40 (q, 2H, 3J = 7,0 Hz), 6,00 (s, 2H), 7,78 (sist. AB, 4H, JAB = 8,5 Hz, νo0 = 300,4 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 100 MHz): 0 = 14,4, 14,8, 16,1, 59,0, 59,7, 61,4, 68,4, 68,6, 71,8, 90,9, 121,8, 128,6, 129,1, 130,3, 40 131,0, 140,3, 140,3, 140,9, 155,6, 166,1;
11B-RMN (CDCl3, 128,4 MHz): 0 = -10,2 (s);
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 500 (90000), 366 (4900), 308 (7700); 45 FAB+ m/z: 585,2 ([M+H]+, 100);
Análisis elemental calculado para C34H41BN2O6: C, 69,86; H, 7,07; N, 4,79. Hallado: C, 69,77; H, 7,04; N, 4,59.
50 Preparación del compuesto Ia-6
Se preparó el compuesto Ia-6 según el siguiente esquema de reacción: A una disolución del compuesto 2b (980 mg, 1,41 mmol) en 50 ml de benceno se le añadieron 3 ml de etanol (17,2 mmol), 240 mg de bis-cloruro de bis-trifenilfosfina-paladio (0,07 mmol) y 15 ml de trietilamina. Se agitó la
5 disolución a 70ºC durante una noche haciendo “burbujear” monóxido de carbono. Se extrajo la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con agua (3x20 ml). Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt/éter de petróleo 20:80; 40:60) para proporcionar el compuesto Ia-6 en forma de un polvo naranja (895 mg, cuantitativo).
10 Caracterización del compuesto Ia-6
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 0,97 (t, 6H, 3J = 7,40 Hz), 1,23 (s, 6H), 1,43 (t, 3H, 3J = 7,10 Hz), 2,31 (q, 4H, 3J = 7,40 Hz) 2,69 (s, 6H), 3,35 (s, 6H), 3,53 (m, 4H), 3,65 (m, 4H), 4,19 (s, 4H), 4,43 (q, 2H, 3J = 7,10 Hz), 7,78 (sist. AB, 4H, JAB = 8,19 Hz, νo0 = 223,07 Hz);
15 13C-RMN (CDCl3, 300 MHz,): 0 =12,03, 14,07, 14,41, 14,76, 17,40, 29,78, 59,02, 59,79, 61,37, 68,57, 71,85, 90,67, 128,60, 128,95, 130,19, 130,81, 133,11, 136,02, 138,77, 141,27, 154,05, 166,28.
11B-RMN (CDCl3,128,4 MHz): 0 = -10,2 (s);
20 UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 522 (80000),488 (20000), 381 (6400), 277 (6400).
Preparación del compuesto Ia-7
25 Se preparó el compuesto Ia-2 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto 2c (100 mg, 0,095 mmol) en 25 ml de benceno se le añadieron 1 ml de etanol
30 (17,2 mmol), 24 mg de bis-cloruro de bis-trifenilfosfina-paladio (0,035 mmol) y 5 ml de trietilamina. Se agitó la disolución a 70ºC durante una noche haciendo “burbujear” monóxido de carbono. Se extrajo la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con agua (3x10 ml). Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt/éter de petróleo 80:20; 100%) para proporcionar el compuesto Ia-7 en forma de un polvo azul (88 mg, 92%).
35 Caracterización del compuesto Ia-7
1H-RMN (CDCl3 200 MHz): 1,40 (s, 6H), 1,44 (t, 3H, 3J= 10,5 Hz) 3,15 (m, 4H), 3,19 (s, 6H), 3,41 (s, 6H), 3,50 (m, 4H), 3,59 (m, 4H), 3,74 (m, 4H), 3,88 (m, 4H), 4,15 (s, 4H), 4,18 (m, 4H), 4,41 (q, 2H, 3J= 10,5 Hz), 6,62 (s, 2H), 7,27
40 (sist. AB, 8H, JAB = 8,73 Hz, νo0 = 120,73 Hz), 7,60 (sist. AB, 4H, JAB = 16,26 Hz, νo0 = 192,63 Hz) 7,83 (sist. AB, 4H, JAB = 8,34 Hz, νo0 = 141,89 Hz).
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 647 (121000), 373 (72800).
Preparación del compuesto Ia-8
Se preparó el compuesto Ia-8 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto Ia-4 (100 mg, 0,118 mmol) en 25 ml de benceno se le añadieron 2 ml de etanol
10 (XXX mmol), 24 mg de bis-cloruro de bis-trifenilfosfina-paladio (0,07 mmol) y 5 ml de trietilamina. Se agitó la disolución a 70ºC durante una noche haciendo “burbujear” monóxido de carbono. Se extrajo la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con agua (3x10 ml). Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt/éter de petróleo 20:80; 40:60) para proporcionar el compuesto Ia-8 en forma de un polvo violeta (82 mg, 88%).
15 Caracterización del compuesto Ia-8
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 1,35 (s, 3H), 1,38 (s, 3H), 1,43 (t, 3H, 3J = 7,15 Hz) 2,74 (s, 3H), 3,25 (s, 6H), 3,31 (m, 4H), 3,39 (s, 3H), 3,54 (m, 6H), 3,72 (m, 2H), 3,87 (m, 2H), 4,18 (m, 4H), 4,43 (q, 2H, 3J = 7 Hz), 6,02 (s, 1 H), 6,59
20 (s, 1 H), 7,22 (sist. AB, 4H, JAB = 8,67 Hz, νo0 = 180,18 Hz); 7,58 (sist. AB, 2H, JAB = 16,29 Hz, νo0 = 297,72 Hz), 7,85 (sist. AB, 4H, JAB = 7,99 Hz, νo0 = 226,28 Hz).
Preparación del compuesto Ia-9
25 Se preparó el compuesto Ia-9 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto 3a (210 mg, 0,36 mmol) en 20 ml de etanol se le añadieron 215 mg de sosa
30 (5,39 mmol). Se agitó la disolución durante 3 horas a temperatura ambiente. Se añadieron 30-40 ml de acetato de etilo. Se extrajo la fase orgánica con agua (3x20 ml). Se combinaron las fases acuosas y se acidificaron con ayuda de una disolución acuosa de HCl 1 M hasta pH 1-2. Se extrajo la fase acuosa con diclorometano. Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo, después se evaporó hasta sequedad para proporcionar el compuesto 5a en forma de un polvo naranja (190 mg, 95%).
35 Caracterización del compuesto II-5a
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 501 (72800), 366 (4000), 307 (6400);
40 UV-Vis (tampón PBS) A nm (£, M-1 cm-1) = 494 (71500), 364 (3900), 307 (4900).
Preparación del compuesto Ia-10
Se preparó el compuesto Ia-10 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto Ia-6 (840 mg, 1,31 mmol) en 50 ml de etanol se le añadieron 2,10 g de sosa (0,525 mol). Se agitó la disolución durante una noche a temperatura ambiente. Se añadieron 30-40 ml de acetato de etilo. Se extrajo la fase orgánica con agua (3x20 ml). Se combinaron las fases acuosas y se acidificaron con ayuda
10 de una disolución acuosa de HCl 1 M hasta pH 1-2. Se extrajo la fase acuosa con diclorometano. Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo, después se evaporó hasta sequedad para proporcionar el compuesto Ia-10 en forma de un polvo naranja (778 mg, 97%).
1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0,97 (t, 6H, 3J= 7,35 Hz), 1,23 (s, 6H), 2,31 (q, 4H, 3J = 7,35 Hz) 2,69 (s, 6H), 3,35 (s, 15 6H), 3,53 (m, 4H), 3,65 (m, 4H), 4,19 (s, 4H), 7,78 (sist. AB, 4H, JAB = 8,19 Hz, νo0 = 223,07 Hz).
UV-Vis (tampón PBS) A nm (£, M-1 cm-1) = 517 (65000), 379 (3600), 320 (5000).
Preparación del compuesto Ia-11 20 Se preparó el compuesto Ia-11 según el siguiente esquema de reacción:
25 A una disolución del compuesto Ia-7 (80 mg, 0,080 mmol) en 20 ml de etanol se le añadieron 130 mg de sosa (3,22 mmol). Se agitó la disolución durante una noche a temperatura ambiente. Se añadieron 10-20 ml de acetato de etilo. Se extrajo la fase orgánica con agua (3x10 ml). Se combinaron las fases acuosas y se acidificaron con ayuda de una disolución acuosa de HCl 1 M hasta pH 1-2. Se extrajo la fase acuosa con diclorometano. Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo, después se evaporó hasta sequedad para proporcionar el compuesto Ia-11 en
30 forma de un polvo azul (70 mg, 90%).
Caracterización del compuesto Ia-11
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 1,41 (s, 6H), 3,15 (m, 4H), 3,20 (s, 6H), 3,41 (s, 6H), 3,52 (m, 4H), 3,60 (m, 4H), 3,74 (m,
35 4H), 3,90 (m, 4H), 4,17 (s, 4H), 4,22 (m, 4H), 6,63 (s, 2H), 7,28 (sist. AB, 8H, JAB = 8,6 Hz, νo0 = 120,59 Hz), 7,61 (sist. AB, 4H, JAB = 16,12 Hz, νo0 = 191,44 Hz) 7,88 (sist. AB, 4H, JAB = 8,19 Hz, νo0 = 144,73 Hz).
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 647 (118000), 373 (67800).
40 Preparación del compuesto Ia-12
Se preparó el compuesto Ia-12 según el siguiente esquema de reacción: A una disolución del compuesto Ia-8 (80 mg, 0,10 mmol) en 20 ml de etanol se le añadieron 162 mg de sosa
5 (4,05 mmol). Se agitó la disolución durante una noche a temperatura ambiente. Se añadieron 10-20 ml de acetato de etilo. Se extrajo la fase orgánica con agua (3x10 ml). Se combinaron las fases acuosas y se acidificaron con ayuda de una disolución acuosa de HCl 1 M hasta pH 1-2. Se extrajo la fase acuosa con diclorometano. Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo, después se evaporó hasta sequedad para proporcionar el compuesto Ia-12 en forma de un polvo naranja (70 mg, 90%).
10 Caracterización del compuesto Ia-12
1H-RMN (CDCl3 300 MHz):1,36 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 2,74 (s, 3H), 3,26 (s, 6H), 3,32 (m, 4H), 3,40 (s, 3H), 3,56 (m, 6H), 3,73 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 4,18 (m, 6H), 6,03 (s, 1H), 6,59 (s, 1H), 7,22 (sist. AB, 4H, JAB = 8,67 Hz, νo0 =
15 180,18 Hz); 7,58 (sist. AB, 2H, JAB = 16,29 Hz, νo0 = 297,72 Hz), 7,85 (sist. AB, 4H, JAB = 7,99 Hz, νo0 = 226,28 Hz).
13C-RMN (CDCl3, 300 MHz,): 0 = 14,86, 15,08, 16,37, 29,79, 58,91, 59,18, 59,58, 67,63, 68,41, 69,79, 70,88, 71,69, 72,05, 91,43, 128,76, 129,06, 129,69, 130,15, 130,44, 130,86, 134,10, 138,65, 140,39, 140,59, 141,25, 152,61, 155,54, 159,61, 170,40.
20 UV-Vis (tampón PBS) A nm (£, M-1 cm-1) = 564 (70000), 338 (25000).
Preparación del compuesto Ia-13
25 Se preparó el compuesto Ia-13 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto Ia-13 (200 mg, 0,31 mmol) en 15 ml de benceno se le añadieron 1 ml de
30 etilendiamina (15 mmol), 66 mg de bis-cloruro de bis-trifenilfosfina-paladio (0,09 mmol) y 1 ml de trietilamina. Se agitó la disolución a 70ºC durante una noche haciendo “burbujear” monóxido de carbono. Se extrajo la mezcla de reacción con diclorometano y se lavó con agua (3x20 ml). Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre sílice (gradiente de CH2Cl2 al 100% a CH2Cl2 75:25) para proporcionar el compuesto Ia-13 en forma de un polvo naranja (160 mg, 80%).
35 Caracterización del compuesto Ia-13
1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0 = 1,34 (s, 6H), 2,72 (s, 6H), 3,01 (t, 2H, 3J= 5,7 Hz), 3,36 (s, 6H), 3,55 (m, 6H), 3,64 (m, 4H), 4,20 (s, 4H), 6,01 (s, 2H), 6,98 (t, 1H, 3J = 5,5 Hz), 7,69 (sist. AB, 4H, JAB = 8,3 Hz, νo0 = 162,7 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 75,4 MHz,): 0 = 15,0, 16,2, 41,3, 42,2, 59,1, 59,8, 68,7, 71,9, 90,6, 121,9, 127,9, 128,8, 129,4, 134,9, 139,1, 140,4, 141,0, 155,7, 167,0; 11B-RMN (CDCl3, 128,4 MHz): 0 = -10,3 (s); 5 UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 500 (64500), 371 (5600). FAB+ m/z: 599,2 ([M+H]+, 100); 10 Análisis elemental calculado para C34H43BN4O5: C, 68,23; H, 7,24; N, 9,36. Hallado: C, 67,84; H, 7,07; N, 9,22. Preparación del compuesto Ia-14 Se preparó el compuesto Ia-14 según el siguiente esquema de reacción: 15
A una disolución del compuesto Ia-1 (100 mg, 0,16 mmol) en 6 ml de tolueno anhidro se le añadieron 80 mg de éster etílico de glicina (0,47 mmol), 22 mg de bis-cloruro de bis-trifenilfosfina-paladio (0,03 mmol) y 2 ml de trietilamina. Se
20 agitó la disolución a 80ºC durante 6 h haciendo “burbujear” monóxido de carbono. Se filtró la mezcla de reacción sobre Celite y se evaporó parcialmente. Se extrajo el residuo con diclorometano y se lavó con agua (2x20 ml). Se secó la fase orgánica sobre algodón hidrófilo y se evaporó. Se purificó el residuo mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (AcOEt/éter de petróleo 50:50) para proporcionar el compuesto Ia-14 en forma de un polvo naranja (43 mg, 43%).
25 Caracterización del compuesto Ia-14
1H-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0 = 1,33 (t, 3H, 3J = 7,2 Hz), 1,34 (s, 6H), 2,72 (s, 6H), 3,36 (s, 6H), 3,55 (m, 4H), 3,66 (m, 4H), 4,20 (s, 4H), 4,27 (d, 2H, 3J = 4,5 Hz), 4,29 (q, 2H, 3J = 7,1 Hz), 6,01 (s, 2H), 6,77 (t, 1H, 3J = 4,9 Hz), 7,69
30 (sist. AB, 4H, JAB = 8,3 Hz, νo0 = 156,4 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 75,4 MHz,): 0 = 14,3, 14,9, 16,2, 42,1, 59,1, 59,8, 61,9, 68,7, 71,9, 91,0, 121,9, 127,9, 129,0, 129,3, 134,2, 139,5, 140,2, 141,0, 155,8, 166,7, 170,2;
35 11B-RMN (CDCl3, 128,4 MHz): 0 = -10,3 (s);
UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 501 (84200), 366 (4200), 309 (6500).
Preparación del compuesto Ia-15
40 Se preparó el compuesto Ia-15 según el siguiente esquema de reacción: A una disolución del compuesto Ia-14 (40 mg, 0,06 mmol) en etanol (10 ml) se le añadió una disolución acuosa de sosa (60 mg, 1,2 mmol). Se agitó la disolución durante 2 h a temperatura ambiente. Se añadieron 10-20 ml de
5 acetato de etilo. Se extrajo la fase orgánica con agua (2x20 ml). Se combinaron las fases acuosas y se acidificaron con ayuda de una disolución acuosa de HCl 1 M hasta pH 1-2. Se extrajo el producto con diclorometano. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4, después se evaporó hasta sequedad para proporcionar el compuesto Ia-15 en forma de un polvo naranja (35 mg, 90%).
10 Caracterización del compuesto Ia-15
1H-RMN (CDCl3, 400 MHz): 0 = 1,32 (s, 6H), 2,72 (s, 6H), 3,36 (s, 6H), 3,55 (m, 4H), 3,66 (m, 4H), 4,19 (s, 4H), 4,27 (d, 2H, 3J = 3,4 Hz), 4,87 (a, 1H), 6,01 (s, 2H), 7,04 (t, 1H, 3J = 3,8 Hz), 7,69 (sist. AB, 4H, JAB = 6,0 Hz, νo0 = 160,2 Hz);
15 13C-RMN (CDCl3, 100 MHz,): 0 = 14,9, 16,2, 42,0, 59,0, 59,7, 68,6, 71,8, 90,9, 121,9, 128,0, 129,0, 129,3, 133,8, 139,6, 140,2, 140,9, 155,8, 167,3, 172,3;
11B-RMN (CDCl3, 128,4 MHz): 0 = -10,2 (s);
20 UV-Vis (CH2Cl2) A nm (£, M-1 cm-1) = 501 (65000), 366 (3800), 309 (5900);
UV-Vis (tampón PBS) A nm (£, M-1 cm-1) = 496 (59600), 367 (4100), 308 (6100).
25 Preparación del compuesto Ia-16
Se preparó el compuesto Ia-16 según el siguiente esquema de reacción:
30 A una disolución de 2-triisopropiloxisilanoxi-5-oxaoct-7-ino (2,20 mmol, 661 mg) en THF anhidro, a temperatura ambiente, se le añadió bajo argón bromuro de etilmagnesio (1,0 M en THF, 2 ml). Se agitó la mezcla durante 2 h a 60ºC, después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se transfirió la disolución así obtenida mediante una cánula a una disolución de difluoroboradipirrometeno 1 (330 mg, 0,733 mmol) en THF anhidro. Se agitó la disolución durante
35 una noche a 60ºC, después se añadió agua. Se extrajo esta disolución con diclorometano. A continuación se lavó la fase orgánica con agua (3X20 ml), después con una disolución saturada de NaCl (1X20 ml). Tras evaporación, se purificó el residuo orgánico mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/éter de petróleo, 10:90; 20:80; 30:70), y se obtuvo el compuesto Ia-16 en forma de un polvo naranja (620 mg, 87%).
40 Caracterización del compuesto Ia-16
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 1,05 (m, 42H), 1,40 (s, 6H), 2,71 (s, 6H), 3,56 (t, 4H, 3J= 5,70 Hz), 3,65 (s, 8H), 3,82 (t, 4H, 3J= 5,70 Hz), 4,18 (s, 4H), 6,00 (S, 2H), 7,45 (sist. AB, 4H, JAB = 8,28 Hz, νo0 = 227,51 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 300 MHz): 0 = 12,13, 14,97, 16,21, 18,11, 59,77, 63,07, 68,99, 70,80, 72,86, 77,36, 94,60, 121,84,
129,45, 130,39, 135,30, 138,34, 140,11, 140,92, 155,67.
Preparación del compuesto Ia-17
Se preparó el compuesto Ia-17 según el siguiente esquema de reacción:
10 A una disolución del compuesto Ia-16 (300 mg, 2,96 mmol) en etanol (15 ml) se le añadió una disolución acuosa de ácido clorhídrico 1 M (10 ml). Se agitó la disolución toda la noche a temperatura ambiente. A continuación se neutralizó la fase orgánica con una disolución de NaHCO3 hasta pH 7. A continuación se evaporó el crudo de reacción en el rotavapor, se disolvió en CH2Cl2 después se lavó con una disolución saturada de NaCl (2x15 ml). A continuación se secó la fase orgánica sobre Na2SO4 después se evaporó hasta sequedad. Se purificó el producto
15 bruto mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (acetato de etilo/metanol, 95/5%) y se obtuvo un polvo naranja (200 mg, 81%).
Caracterización del compuesto Ia-17
20 1H-RMN (CDCl3 200 MHz): 1,39 (s, 6H), 2,72 (s, 6H), 3,67 (m, 16H), 4,18 (s, 4H), 6,02 (s, 2H), 7,44 (sist. AB, 4H, JAB = 8,15 Hz, νo0 = 152,97 Hz).
13C-RMN (CDCl3, 200 MHz): 0 = 14,99, 16,22, 59,76, 61,89, 68,92, 70,44, 72,59, 77,35, 94,67, 121,87, 123,37, 129,40, 130,30, 135,13, 138,36, 140,21, 141,09, 155,63, 197,65. 25 Preparación del compuesto Ia-18
Se preparó el compuesto Ia-18 según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto Ia-17 (200 mg, 0,241 mmol) en THF anhidro (20 ml) se le añadió una disolución de THF (10 ml) con tBuOK en suspensión (54 mg, 0,241 mmol) con ayuda de una cánula. Inmediatamente después se añadieron 5 ml (155 mg, 0,29 mmol) de una disolución de fosfonato en THF. Se dejó agitar a temperatura ambiente
35 durante 30 min., después se añadieron las mismas cantidades de reactivos para obtener en total un exceso de 3 equivalentes.
A continuación se neutralizó el medio de reacción con 30 ml de una disolución acuosa de HCl 1 M, después se extrajo con 2x30 ml de diclorometano. A continuación se lavó la fase orgánica con 2x10 ml de agua y 1x10 ml de 40 una disolución saturada de NaCl. Se combinaron las fases orgánicas, después se secaron sobre algodón hidrófilo, después se evaporaron hasta sequedad. Se purificó el producto bruto mediante cromatografía en columna sobre gel
de sílice (acetato de etilo/metanol, 100%; 99/1; 98/2; 97/3; 94/6) para proporcionar el compuesto Ia-18 en forma de un aceite naranja (135 mg, 50%).
Caracterización del compuesto Ia-18
5 1H-RMN (CDCl3 200 MHz): 1,33 (t, 12H, 3J = 7,25 Hz), 1,40 (s, 6H), 2,70 (s, 6H), 3,75 (m, 16H), 3,83 (d, 4H, 2J = 8 Hz), 4,15 (m, 12H), 6,01 (s, 2H), 7,45 (sist. AB, 4H, JAB = 7,93 Hz, νo0 = 152,88 Hz).
Preparación del compuesto Ic-0 10 Se preparó el compuesto Ic-0 según el siguiente esquema de reacción:
15 A una disolución de 1-dimetilamino-2-propino (0,136 g, 1,976 mmol) en THF anhidro (5 ml), bajo argón se le añadió EtMgBr en THF (1,738 ml, 1,0 M) a 60ºC durante 2 horas. A continuación se añadió mediante cánula esta mezcla a una disolución de 2,6-dietil-4,4-difluoro-1,3,5,7-tetrametil-8-(4’-yodo-fenil)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno 2 (0,400 g, 0,79 mmol) en THF anhidro (3 ml). Se agitó la mezcla a 60ºC durante 30 minutos, a continuación se añadió agua H2O (3 ml), y se extrajo la mezcla con CH2Cl2. Tras evaporación, una cromatografía sobre gel de sílice
20 (CH2Cl2/AcOEt, 50:50 después MeOH/ AcOEt, 1/9) permitió obtener Ic-0 puro (0,313 g, 63%).
Caracterización del compuesto Ic-0
1H-RMN (CDCl3 300 MHz): 0,97 (t, 6H, 3J = 7,53 Hz), 1,30 (s, 6H), 2,32 (q, 4H, 3J= 7,14 Hz), 2,38 (s, 12H), 2,72 (s, 25 6H), 3,30 (s, 4H), 7,06 (sist. AB, 2H, JAB = 8,31 Hz), 7,81 (sist. AB, 2H, JAB = 8,31 Hz);
13C-RMN (CDCl3, 75 MHz): 0 = 12,11, 14,12, 14,69, 17,32, 29,36, 43,73, 48,78, 94,29, 128,69, 130,50, 133,03, 135,87, 136,07, 138,10, 138,52, 153,63.
30 EM (FAB+, m-NBA): m/z (%) = 633,1 [M + H]+ (100).
Anál. calculado para C33H42BIN4. C, 62,67; H, 6,69; N, 8,86. Hallado: C, 62,52; H, 6,51; N, 8,53.
Propiedades ópticas: 35 (CH2Cl2)= 6,6 ns.
UV-vis (CH2Cl2): Aab (£)= 521 (57000), 378 (4500).
40 Fluorescencia (CH2Cl2): 6,1 x 10-7 M. Aem = 533 nm, Φ = 48%.
Preparación del compuesto Ic-1
Se preparó el compuesto Ic-1 según el siguiente esquema de reacción: 45
A una disolución de Ic-0 (0,050 g, 0,079 mmol) en tolueno anhidro (3 ml) bajo argón, se le añadió 1,3propanosultona (0,024 g, 0,20 mmol), se agitó la mezcla a 60ºC durante la noche, hasta la desaparición completa del 5 producto de partida (control mediante CCF). Se centrifugó la suspensión, después se lavó con tolueno (5 ml) y pentano (5 ml). Tras secado del polvo a vacío se obtuvo el compuesto Ic-1 puro (0,086 g, 62%). Caracterización del compuesto Ic-1
10 1H-RMN (CD3OD, 300 MHz): 0,99 (t, 6H, 3J = 7,53 Hz), 1,37 (s, 6H), 2,20 (m, 4H,), 2,39 (q, 4H, 3J= 7,53 Hz), 2,72 (s, 6H), 2,82 (t, 4H, 3J= 6,99 Hz), 3,14 (s, 12H), 3,56 (m, 4H), 4,30 (s, 4H), 7,13 (sist. AB, 2H, JAB = 8,28 Hz), 7,93 (sist. AB, 2H, JAB = 8,28 Hz);
13C-RMN (CD3OD, 75 MHz): 0 = 10,93, 13,45, 13,59, 16,59, 18,72, 29,27, 49,71, 55,16, 62,68, 94,12, 116,51, 15 128,66, 130,33, 133,64, 135,09, 137,26, 138,37, 139,59, 153,55. EM (FAB+, m-NBA): m/z (%) = 876,1 [M + H]+ (100). Anál. calculado para Ic-1 + H2O, C39H58BIN4O8S2, C, 51,32; H, 6,40; N, 6,14; Hallado: C, 51,27; H, 6,28; N, 5,82. 20 Propiedades ópticas: (H2O)= 7,0 ns. 25 UV-vis (tampón PBS): Aab (£)= 519 (28700), 564 (15000). Fluorescencia (tampón PBS): 4,63 10-7 M. Aem = 530 nm, Φ= 61%. UV-vis (EtOH): Aab (£)= 521 (81200), 240 (34400). 30 Fluorescencia (EtOH): 3,993 10-7 M. Aem = 532 nm, Φ= 71%. Preparación del compuesto Ic-2 35 Se preparó el compuesto Ic-2 según el siguiente esquema de reacción:
En una disolución de Ic-1 (0,040 g, 0,457 mmol) con etanol absoluto (4 ml) se inyectaron trietilamina (3 ml), 40 Pd(PPH3)2Cl2 (4 mg, 0,046 mmol) a 70ºC mediante burbujeo de CO durante 4 horas. Tras evaporación del disolvente, una cromatografía sobre sílice (H2O/EtOH, 20:80), seguida por una recristalización en una mezcla de metanol-Et2O permitió obtener el producto Ic-2 (20 mg, 54%).
Caracterización del compuesto Ic-2
5 1H-RMN (CD3OD, 300 MHz): 1,01 (t, 6H, 3J = 7,53 Hz), 1,33 (s, 6H), 1,43 (t, 3H, 3J = 7,17 Hz), 2,24 (m, 4H), 2,40 (q, 4H, 3J = 7,53 Hz), 2,75 (s, 6H), 2,85 (m, 4H), 3,18 (s, 12H), 3,61 (m, 4H), 4,32 (s, 4H), 4,43 (q, 2H, 3J = 7,17 Hz), 7,50 (sist. AB, 2H, JAB = 8,28 Hz), 8,21 (sist. AB, 2H, JAB = 8,49 Hz);
UV-vis (EtOH): Aab (£)= 521 (15339), 240 (2740).
15 Fluorescencia (EtOH): 4,56 3 10-7 M. Aem = 533 nm, Φ= 45%.
Preparación del compuesto Ic-3
Se preparó el compuesto Ic-3 según el siguiente esquema de reacción: 20
Se desgasificó una disolución de Ic-1 (0,060 g, 0,068 mmol), en DMF (5 ml) y NEt3 (4 ml) con argón durante 20 min., después se añadieron [Pd(PPH3)4] (0,008 g, 0,0070 mmol) y 1-etinil-6-carboxilatopireno de metoxidietilenglicol
25 (0,31 g, 0,082 mmol). Se agitó la mezcla a 80ºC durante 36 horas, hasta el consumo completo de partida observado mediante CCF (H2O/EtOH, 20:80). A continuación se evaporó hasta sequedad la mezcla y se disolvió el residuo en 3 ml de CH2Cl2, después se precipitó con Et2O. Una recristalización en CH3OH-Et2O permitió obtener el producto puro (40 mg, 50%).
30 Caracterización del compuesto Ic-3
1H-RMN (CD3OD, 300 MHz): 1,03 (t, 6H, 3J = 7,53 Hz), 1,47 (s, 6H), 2,25 (m, 4H), 2,40 (q, 4H, 3J= 7,53 Hz), 2,77 (s, 6H), 2,86 (t, 4H, 3J= 6,78 Hz), 3,17 (s, 12H), 3,39 (s, 3H), 3,62 (m, 6H), 3,78 (m, 2H), 3,98 (m, 2H), 4,34 (s, 4H), 4,47 (m, 2H), 7,47 (sist. AB, 2H, JAB = 8,10 Hz), 7,94 (sist. AB, 2H, JAB = 8,28 Hz), 8,27 (m, 5H), 8,65 (d, 1H, 3J =
35 9,42 Hz), 8,75 (d, 1H, 3J = 9,21 Hz), 9,20 (d, 1H, 3J = 9,39 Hz).
Propiedades ópticas:
UV-vis (EtOH): Aab (£)= 521 (60936), 402 (35224), 380(37255), 291(25567).
40 Fluorescencia (EtOH): 3,793 10-7 M. Aem = 533 nm, Φ = 39%.
Preparación del compuesto IV-5c
45 Se preparó el compuesto IV-5c según el siguiente esquema de reacción:
A una disolución del compuesto IV-5b (0,030 g, 0,026 mmol) en etanol (2 ml) y agua (1 ml) se le añadió NaOH (0,020 g, 0,05 mmol). Se calentó la mezcla a 80ºC durante 40 minutos. A continuación se neutralizó la disolución 5 hasta pH 4 con una disolución acuosa de HCl (al 10%). Tras evaporación, una cromatografía en columna (sílice, H2O/EtOH, 10:90) permitió obtener el compuesto IV-6b en forma de polvo (20 mg, 75%).
Caracterización del compuesto IV-6b
10 1H-RMN (CD3OD, 200 MHz): 1,01 (t, 6H, 3J = 7,30 Hz), 1,45 (s, 6H), 2,04-2,22 (m, 8H), 2,74-2,86 (m, 9H), 3,14 (s, 12H), 3,59 (m, 5H), 4,30 (s, 4H), 7,43 (sist. AB, 2H, JAB = 8,40 Hz), 7,90 (sist. AB, 2H, JAB = 8,40 Hz), 8,10-8,27 (m, 6H), 8,66 (d, 1H, 3J = 9,14 Hz), 8,84 (d, 1H, 3J = 9,12 Hz).
EM (FAB+, m-NBA): m/z (%) = 1041,46 [M + Na]+ (100).
15 Todos los compuestos sintetizados en los ejemplos anteriores son fluorescentes e hidrófilos. Los compuestos marcados con un * son hidrosolubles y presentan una solubilidad superior a 10 mg/l, e incluso superior a 50 mg/l para la-9, la-10, Ic-1. Los valores de las propiedades de fluorescencia para determinados compuestos mostrados a modo de ejemplo se facilitan en la tabla 1 a continuación:
20 Tabla 1
- N.°
- Aabs (nm) Aem (nm) £ (M -1 cm -1) Φ (%)
- Ia-1
- 500 511 90000 65
- Ia-2
- 522 488 82000 80
- Ia-3
- 646 371 126600 75
- Ia-4
- 572 533 93500 80
- Ia-5
- 500 512 91000 63
- Ia-6
- 522 488 80000 85
- Ia-9
- 501 494* 513 506* 78500 74000* 50 60*
- Ia-10
- 517* 530* 65000* 70*
- Ia-11
- 647 662 118000 74
- la-12
- 564* 578* 70000* 70*
- Ia-13
- 500 513 65000 30
- Ia-14
- 501 511 84000 80
- Ia-15
- 501 495* 511 507* 67000 62000* 60 50*
- Ic-1*
- 519* 530* 72000* 61*
Valores obtenidos en diclorometano salvo para los marcados con un *, medidos en agua y tampón PBS.
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Compuesto fluorescente e hidrófilo que responde a la fórmula (I) siguiente:5 en la que:• S1 representa un grupo de fórmula -C:C-L’-A en la que: 10 -L’ es un grupo de enlace que es
- -
- un enlace sencillo; o
- -
- un grupo hidrocarbonado divalente seleccionado de entre el grupo que consiste en los alquilenos
15 lineales o ramificados, que comprenden eventualmente en su cadena un o varios oxígeno, nitrógeno o azufre; los alquenilenos lineales o ramificados; los alquinilenos lineales o ramificados, y los arilenos; o una cadena hidrocarbonada divalente constituida por un encadenamiento de por lo menos dos grupos hidrocarbonados divalentes del tipo citado anteriormente;20 -A es un grupo funcional polar seleccionado de entre los grupos sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, carboxilato, fosfonato, sulfato de alquilamonio y polioxietileno;• S2 representa: 25 -un grupo -C:C-L’-A idéntico o diferente de S1, en el que L’ y A tienen los significados citados anteriormente;- --
- F; 30 --H; o
- -
- una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno o varios átomos de oxígeno, de nitrógeno o de azufre, eventualmente ciclizada en su totalidad o en parte, eventualmente aromática, y eventualmente funcionalizada, y
• cada uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7 designa, independientemente de los otros, un grupo -H o una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno o varios átomos de oxígeno, eventualmente ciclizada en su totalidad o en parte, eventualmente aromática y eventualmente funcionalizada,40 entendiéndose que la totalidad o parte de los R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7, pueden estar unidos entre sí para formar una forma de puente. - 2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que el grupo funcional A presente en el grupo -C:C-L’-A presente a 45 modo de grupo S1 se selecciona de entre los grupos polioxietileno, fosfato, sulfato y sulfato de alquilamonio.
- 3. Compuesto según la reivindicación 1 o 2, en el que S1 y S2 son ambos unos grupos que responden a la fórmula -C:C-L’-A definida en la reivindicación 1, siendo S1 y S2 preferentemente idénticos.50 4. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (II) siguiente: en la que:• R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y S2 son tal como se han definido en la reivindicación 1, 5 • n representa 1, 2, 3 o 4,• S’ representa -H, -Me-(CH2)n’-SO3-(Xm+)1/m o -(CH2)n’-PO32-(Xm+)2/m en los que:
- -
- Xm+ representa un catión (mono o poliatómico) de valencia m,
- -
- n’ es un número entero igual a 1, 2, 3 o 4.
- 5. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (III) siguiente:en la que:
- -
- R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y S2 son tal como se han definido en la reivindicación 1, 20 -Ar representa un arileno,
- -
- Xm+ representa un catión (mono o poliatómico) de valencia m,
- -
- n’ es un número entero igual a 1, 2, 3 o 4.
- 6. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (IV) siguiente:en la que: 30
- -
- R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 y S2 son tal como se han definido en la reivindicación 1,
- -
- n representa 0, 1, 2, 3, 4 o 5,
- -
35 -S” representa -SO3 o -PO32-(Xm+)1/m en el que Xm+ representa un catión (mono o poliatómico) de valencia m. - 7. Compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en los que por lo menos uno de los grupos R1, R2,40 R3, R4, R5, R6 o R7 es un grupo portador de un grupo funcional polar seleccionado de entre los grupos carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, hidroxilo, fosfonato y polioxietileno.
- 8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que R1 representa un grupo -Ar-L-Y, en el que: 45 -Ar representa un arileno,
- -
- L representa un enlace sencillo; un alquileno lineal o ramificado o un alquinileno sustituido lineal o ramificado,
- -
- Y representa -Cl, -Br, -I, -COOH, -COOMe, -COOEt, -CONH-CH2-CH2-NH2, -CONH-CH2-COOEt, -CONH-CH2-COOH, -CONH-(CH2)qNCS, o bien un grupo que responde a una de las fórmulas siguientes:
en las que q representa 1, 2, 3, 4 o 5 - 9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que:
- •
- los grupos R2 y R5 son, independientemente, unos grupos -H o -Me, y
- •
- los grupos R3, R4, R6 y R7 se seleccionan independientemente de entre -H, -Me, -C:C-CH2-N+(Me)2-(CH2)n-SO3-, -C:C-Ar-R’ y un grupo de fórmula
15 en la que:- -
- Ar representa un arileno,
- -
- R’ representa -OMe, -CH2-PO32-(Xm+)2/m o -C:C-CH2-R”, en el que R” representa -O-(CH2-CH2-O)n20 CH3, -O-(CH2-CH2-O)n-CH2-PO32-(Xm+)2/m, -O-(CH2-CH2-O)n-CH2-SO3-(Xm+)1/m, -N+(Me)2-CH2-(CH2)n-PO32(Xm+)1/m o -N+(Me)2-CH2-(CH2)n-SO3-, en los que:
- -
- n representa 1, 2, 3 o 4 25 -Xm+ representa un catión de valencia m.
- 10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que:
- -
- R2 y R5 son idénticos,
- -
- R3 y R6 son idénticos, y
- -
- R4 y R7 son idénticos. 35 11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (la) siguiente:
en la que:- •
- S’ es tal como se ha definido en la reivindicación 4,
- •
- Ar, L e Y son tal como se han definido en la reivindicación 8,
- •
- n representa 1, 2, 3 o 4,
• R3, R6, R4 y R7 se eligen de manera que: 10 -R3 y R6 son idénticos y representan -H y R4 y R7 son idénticos y representan -Me,- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -Et y R4 y R7 son idénticos y representan -Me,
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -H y R4 y R7 son idénticos y representan
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -H, R4 representa -Me y R7 representa
- -
- R3 y R6 son idénticos y representan -H y R4 y R7 son idénticos y representan
- -
- R3 y R4 forman juntos un grupo divalente -(CH2)4- y R6 y R7 forman juntos un grupo divalente -(CH2)4-, o 25 -R3 y R6 son idénticos y representan -H, R4 representa -Me y R7 representa
sustituido o no. 30 12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula (Ic) siguiente:en la que: 35 -Y, L y Ar son tal como se han definido en la reivindicación 8,- -
- R3, R6, R4 y R7 son tal como se han definido la reivindicación 9,
- -
- n representa 2, 3 o 4.
-
- 13.
- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que presenta una de las fórmulas siguientes:
-
- 14.
- Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es hidrosoluble y responde a una de las fórmulas siguientes:
-
- 15.
- Utilización como marcador fluorescente en medio acuoso de un compuesto fluorescente e hidrófilo que responde a la fórmula (I) siguiente:
en la que:• S1 representa un grupo de fórmula -C:C-L’-A en el que: 5- -
- L’ es un grupo de enlace que es
- -
- un enlace sencillo; o
10 - un grupo hidrocarbonado divalente seleccionado de entre el grupo que consiste en los alquilenos lineales o ramificados, que comprenden eventualmente en su cadena uno o varios oxígeno, nitrógeno- o azufre; los alquenilenos lineales o ramificados; los alquinilenos lineales o ramificados, y los arilenos;
- o una cadena hidrocarbonada divalente constituida por un encadenamiento de por lo menos dos
grupos hidrocarbonados divalentes del tipo citado anteriormente; 15- -
- A es un grupo funcional polar seleccionado de entre los grupos sulfonato, sulfato, fosfato, amonio, carboxilato, hidroxilo, fosfonato, sulfato de alquilamonio y polioxietileno;
• S2 representa: 20- -
- un grupo -C:C-L’-A idéntico o diferente de S1, en el que L’ y A tienen los significados citados anteriormente;
- --
- F; 25
- -
- -H; o
- -
- una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por
uno o varios átomos de oxígeno, de nitrógeno o de azufre, eventualmente ciclizada en su totalidad o en 30 parte, eventualmente aromática, y eventualmente funcionalizada, y• cada uno de los grupos R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7 designa, independientemente de los otros, un grupo -H o una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, eventualmente interrumpida por uno o varios átomos de oxígeno, eventualmente ciclizada en su totalidad o en parte, eventualmente aromática y35 eventualmente funcionalizada,entendiéndose que la totalidad o parte de los R1, R2, R3, R4, R5, R6 o R7, pueden estar unidos entre sí para formar una forma de puente.
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