ES2437134T3 - Péptidos pequeños para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de fibrilogénesis de proteína beta-amiloide - Google Patents

Abstract

Un péptido, que consiste en Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-NH2.

Description

Péptidos pequeños para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de fibrilogénesis de proteína beta-amiloide 5

Campo técnico

Esta invención se refiere a péptidos útiles para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de fibrilogénesis de proteína beta-amiloide

Antecedentes de la invención

Antecedentes adicionales para el uso terapéutico de fragmentos de péptidos en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis se pueden encontrar en la patente de EE.UU. nº 7314724 presentada el 22 de agosto

15 de 2001 y en la patente de EE.UU. nº 6933280 presentada el 24 de septiembre de 2001.

Proteína beta-amiloide como una diana terapéutica para la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por el depósito y acumulación de un péptido de 39-43 aminoácidos denominado proteína beta-amiloide, Aβ o β/A4 (Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890. 1984; Masters et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82:4245-4249, 1985; Husby et al, Bull. WHO 71:105-108,1993). La Aβ es derivada de proteínas precursoras más grandes denominadas proteínas precursoras beta-amiloide (o APPs) de las que hay diversas variantes alternativamente troceadas. Las formas más abundantes para las APP incluyen proteínas que consisten en 695, 751 y 770 aminoácidos (Kitaguchi et al, Nature 331:530-532, 1988; Ponte et al, 25 Nature 331:525-527,1988; Tanzi et al, Nature 331:528-530, 1988). El péptido Aβ pequeño es un componente principal que constituye el núcleo de depósitos amiloides denominados “placas” en los cerebros de pacientes con AD. Además, la AD se caracteriza por la presencia de numerosos “enmarañamientos” neurofibrilares que consisten en filamentos helicoidales emparejados que se acumulan de forma anormal en el citoplasma neuronal (Grundke-Iqbal et al Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:4913-4917., 1986; Kosik et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:4044-4048, 1986; Lee et al, Science 251:675-678, 1991). El otro tipo principal de lesión encontrada en el cerebro de la Ad es la acumulación de amiloide en las paredes de los vasos sanguíneos, en los vasos tanto de las parénquimas como las meninges del cerebro que se sitúan fuera del cerebro. Los depósitos amiloides localizados en las paredes de los vasos sanguíneos se denominan angiopatía amiloide o congofílica cerebrovascular (Mandybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45:79-90, 1986; Pardridge et al, J. Neurochem. 49:1394-1401, 1987). Las características distintivas

35 patológicas de la AD, por lo tanto, son la presencia de “placas”, “enmarañamientos” y depósitos amiloides cerebrovasculares.

Durante muchos años, ha habido una controversia científica continuada sobre la importancia del “amiloide” en la AD y de si las características de las “placas” y “enmarañamientos” de esta enfermedad eran la causa o meramente la consecuencia de la enfermedad. Unos estudios recientes indican que el amiloide es de hecho un factor causante de la AD y no debe ser considerado meramente como una consecuencia. La proteína Aβ de Alzheimer en cultivos celulares se ha mostrado que provoca la degeneración de células nerviosas en un período de tiempo corto (Pike et al, Br. Res. 563:311-314, 1991; J. Neurochem. 64:253-265, 1995). Unos estudios sugieren que es la estructura fibrilar, característica de todos los amiloides la que es principalmente responsable de los efectos neurológicos. La Aβ 45 se ha encontrado también que es neurológica en cultivos troceados del hipocampo (Hadrian et al, Neurobiol. Aging 16:779-789, 1995) e induce la muerte de células nerviosas en ratones transgénicos (Games et al, Nature 373:523527, 1995; Hsiao et al, Science 274:99-102, 1996). La inyección de Aβ en el cerebro de ratas provoca también dificultades de memoria y disfunción neuronal (Flood et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:3363-3366, 1991; Br. Res. 663:271-276, 1994). La evidencia convincente de que la Aβ amiloide está directamente involucrada en la patogénesis de la AD procede de estudios genéticos. Se descubrió que la producción aumentada de Aβ podría resultar de mutaciones en el gen que codifica su precursor, APP (Van Broeckhoven et al, Science 248:1120-1122, 1990; Murrell et al, Science 254:97-99, 1991; Haass et al, Nature Med. 1:1291-1296, 1995). La identificación de mutaciones en el gen de APP que provocaría la aparición temprana de la AD familiar es un argumento de peso de que la Aβ y el amiloide son centrales para el procedimiento patogénico subyacente en esta enfermedad. Se han

55 descubierto ahora cuatro mutaciones que provocan las enfermedades descritas que demuestran la importancia de Aβ en causar la AD familiar (examinado por Hardy, Nature Gen. 1:233-234, 1992). Últimamente, unos estudios recientes sugieren que la reducción en el contenido de placa amiloide en ratones transgénicos de APP conduce a mejoras en las dificultades de comportamiento y pérdida de memoria (Chen et al, Nature 408:978-982, 2000; Janus et al, Nature 408:979-982, 2000; Morgan et al, Nature 408:982-985, 2000). Este es el argumento más fuerte hasta la fecha que implica que la reducción de contenido Aβ amiloide en el cerebro debía ser una diana central para el desarrollo de tratamientos nuevos y eficaces de la AD y trastornos relacionados.

Enfermedad de Alzheimer y población envejecida

65 La enfermedad de Alzheimer es la causa líder de demencia en la población de edad avanzada, afectando a un 510% de la población por encima de la edad de 65 años (Jorm, A Guide to Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders, New York University Press, New York, 1987). En la AD, las partes del cerebro esenciales para los procedimientos cognitivos como la memoria, atención, lenguaje y razonamiento se degeneran. En algunas formas hereditarias de la AD, la aparición es en una edad media, pero más comúnmente, los síntomas aparecen a partir de

5 la mitad de los 60 en adelante. La AD afecta hoy día a 4-5 millones de estadounidenses con ligeramente más de la mitad de estas personas recibiendo cuidados en muchas diferentes instituciones de atención sanitaria. La prevalencia de la AD y otras demencias se duplica para 5 años más allá de 65 y unos estudios recientes indican que casi un 50% de todas las personas con una edad de 85 y de más edad tienen síntomas de AD (NIH Progress Report on AD, National Institute on Aging, 2000). Treinta y tres millones de personas de la población total de los Estados Unidos tienen una edad de 65 y más avanzada y esto ascenderá hasta 51 millones de personas en el año 2025 (NIH Progress Report on AD, National Institute on Aging, 2000). La carga económica anual de la AD en los estados unidos en términos de gastos de cuidados sanitarios y salarios perdidos tanto para pacientes como para sus cuidadores se estima en 80 a 100 miles de millones de dólares (NIH Progress Report on AD, National Institute on Aging, 2000).

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un péptido que consiste en Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-NH2.

El péptido puede estar compuesto por N- o D-aminoácidos. Uno o más de los aminoácidos pueden estar Nmetilados.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un péptido del primer aspecto o un anticuerpo específico 25 para dicho péptido para ser usado en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por la fibrilogénesis de Aβ.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un péptido del primer aspecto o un anticuerpo específico para dicho péptido en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada para la fibrilogénesis de Aβ.

La enfermedad puede ser la enfermedad de Alzheimer. El péptido o anticuerpo del segundo y tercer aspectos pueden comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, el péptido o anticuerpo del segundo y tercer aspectos pueden ser formulados para una administración mediante una vía seleccionada entre oral, parenteral, intravenosa, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, anal y bucal.

35 Preferentemente, es formulado para una administración nasal intranasal.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido del primer aspecto y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede comprender adicionalmente un compuesto activo complementario.

Se describen péptidos pequeños que demuestran una gran eficacia para inhibir y/o destruir fibrilas amiloides. También se describe el uso de algunos péptidos para la formación de imágenes de la ubicación de Aβ en el cuerpo con fines de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos d fibrilogénesis de proteína β-amiloide (Aβ), así como el uso de algunos péptidos para detectar Aβ en muestras biológicas para fines de diagnóstico de la

45 enfermedad de Alzheimer y otros trastornos de fibrilogénesis de proteína beta-amiloide (Aβ). La “fibrilogénesis” como se usa en la presente memoria descriptiva, indica la unión clínica o patológica de beta-amiloide así misma para formar fibrilas y a veces beta-láminas, como es conocido por los expertos en la técnica.

Esta descripción se relaciona con compuestos y composiciones farmacéuticas de los mismos, que se pueden unir a proteína beta-amiloide (Aβ) y modular o moderar la agregación y/o fibrilogénesis de Aβ, para el tratamiento y diagnóstico de enfermedades de Aβ como la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos que implican la acumulación y persistencia de Aβ. Estas enfermedades de Aβ incluyen, pero sin limitación, el amiloide asociado con la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down y diversas formas de amiloidosis cerebrales, como resultará familiar los que tienen conocimientos en la técnica.

55 Las descripción se refiere al descubrimiento nuevo y sorprendente de que ciertos péptidos son elementos de unión y rompedores de fibrilas de Aβ amiloides y, por lo tanto son útiles para la intervención terapéutica de la enfermedad de Alzheimer y trastornos de Aβ relacionados. Los péptidos seleccionados son elementos de unión de Aβ amiloide de la enfermedad de Alzheimer y, por lo tanto son útiles para la formación de imágenes y diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y trastornos Aβ relacionados. Se describen métodos para tratar la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos Aβ que comprenden administrar a un sujeto paciente una dosis terapéuticamente eficaz de un péptido 69mero seleccionado.

En una realización, en la que preferentemente todos los aminoácidos indicados son Z-aminoácidos, excepto cuando 65 se indique otra cosa (como mediante la indicación de péptidos de forma L con códigos de números “LP” prefijando ciertos códigos de aminoácidos con “L-“), las composiciones farmacéuticas contienen preferentemente el péptido Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-NH2. También están incluidos ciertos análogos, derivados, enantiómeros o fragmentos de la secuencia descrita en la presente memoria descriptiva, como se expone en detalle en la presente memoria descriptiva.

5 También se describe el uso de análogos N-metilados de los péptidos de la invención, que incluyen el uso de aNmetilación o L-aminoácidos (preferentemente aminoácidos metilados) exclusiva o parcialmente durante la síntesis de forma que los péptidos resultantes tendrán puramente enlaces de amidas aN-metiladas o parcialmente aN-metiladas

o enlaces de amidas aN-metiladas y no aN-metiladas alternados. Los compuestos preferidos tienen enlaces de amidas modificadas de forma de que al menos uno de los enlaces de amidas en la cadena principal del péptido esté N-metilado, evitando en el propio péptido la formación de beta-láminas.

Se describen también compuestos miméticos (peptidomimético) como modelados a partir del péptido de la invención.

15 El término “mimético” incluye generalmente “isoésteres” como modificaciones de las cadenas principales de péptidos (es decir, miméticos de enlaces amidos) con amido-nitrógeno, amido-carbonilo o sustitución completa del enlace amido. El enlace amido puede ser ventajosamente sustituido con puentes de longitud similar conocidos por los expertos en la técnica como: -CH2S-, -CH=CH-, -CH2-NH-, -CSNH2- o COCH2.

Los miméticos pueden ser generados usando un programa de ordenador que pueda derivar un modelo de péptido virtual a partir de varias de las estructuras de péptidos descritas en la presente memoria descriptiva. Esto se puede hacer usando el programa de ordenador derivado del algoritmo SLATE. Véase Perkin, Mills and Dean, 1995 Journal of Computer Aided Molecular Design 9(6) p479-490; Mills et al. 2001 Journal of Computer Aided Molecular Design

25 15(1) p81-96; De Esch, IJ; et al 2001 Journal of Med Chem. 44(11) p1666-74; Mills Perkins and Dean 1997 Journal of Computer Aided Molecular Design 11(2) p175-92). Un ejemplo del programa derivado del algoritmo SLATE es Quasi by De Novo Pharmaceutical. Este programa superpone varias moléculas de péptidos activas pero aparentemente desiguales que son activas para llegar a la mayoría de las estructuras probables esenciales para la actividad (con una mínima restricción de energía). Esto se puede usar para generar un molde o sitio de unión diana con una posición prevista de átomos de unión de hidrógeno en un espacio tridimensional. Esto puede ser seguidamente usado para generar un mimíco no péptido de los péptidos de ligandos originales. Estos programas de ordenador generadores de moléculas están actualmente disponibles en el comercio (por ejemplo, Skelgen and Skelgen II).

35 Un “mimético” de un compuesto se refiere también a un compuesto en el que las estructuras químicas del compuesto que son necesarias para la actividad funcional han sido sustituidas con otras estructuras químicas que emulan la conformación del compuesto o péptidos del mismo. El término “mimético”, como se usa en la presente memoria descriptiva” está previsto también que incluya moléculas que emulan la estructura química de una estructura L- o D- peptídica y retinen las propiedades funcionales de una estructura L- o D-peptídica. Otras propuestas para diseñar análogos de pépticos, derivados y miméticos son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, véase P.S. Farmer, in Drug Design, E.J. Ariens, ed., Academic Press, New York, 1980, v. 10, pp. 119-143; Ball and Alewood, J. Mol. Recognition 3:55, 1990; Morgan and Gainor, Ann. Rep. Med. Chem. 24:243, 1989; and Freidinger, Trends Pharmacol. Sci. 10:270, 1989. Véase también Sawyer, "Peptidomimetic design and chemical approaches to peptide metabolism", in MD Taylor and GL Amidon, eds., in Peptide-Based Drug Design: Controlling Transport and

45 Metabolism, Ch. 17, 1995; Smith et al, J. Am. Chem. Soc. 117:11113-11123, 1995; Smith et al, J. Am. Chem. Soc. 116:9947-9962, 1994; and Hirschman et al, J. Am. Chem. Soc. 115:12550-12568, 1993 .

El término “análogos” incluye variantes de la molécula de péptido llevadas a cabo, por ejemplo, mediante sustitución homóloga de uno o más residuos de aminoácidos, como se apreciará por los expertos en la técnica, inversión de la secuencia o sustitución parcial o completa de aminoácidos componentes con enantiómeros de composición indéntica (D- frente a L- aminoácidos). Los análogos incluyen también “sustitución de aminoácidos conservadoras” en las que un aminoácido es sustituido con un aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Ejemplos de aminoácidos de cadenas laterales similares son aminoácidos de cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), aminoácidos de cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico),

55 aminoácidos de cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenillalanina, metionina, triptófano), aminoácidos de cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, aspargina, glutamina, cerina, treonina, tirosina, cistina), aminoácidos de cadenas laterales ramificadas (por ejemplo, treonina, leucina, valina, isoleucina) y aminoácidos con cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los análogos incluyen también “sustituciones de aminoácidos homólogos” en las que un aminoácido es sustituido con aminoácido homólogos, como la sustitución de fenilalanina con tirosina, piridilalanina o homofenilalanina y sustitución de leucina con valina o viceversa.

El término “derivado” incluye cambios químicos menores habituales para los expertos en la técnica en los que uno o más grupos reactivos en los péptidos de la invención has sido “derivados con péptidos” de forma que hay péptidos

65 en los que una cadena lateral de aminoácido, cadena principal de péptido o terminación amino o carboxi ha sido derivada, como se expone adicionalmente en la presente memoria descriptiva.

En cualquiera de las estructuras o secuencias anteriores, la nomenclatura o representación simbólica de cualquiera de los aminoácidos individuales es proporcionada mediante la abreviatura estándar de tres letras para los aminoácidos precedida opcionalmente por D- o L- que representa las dos formas enantiómeras (imágenes

5 especulares una de otra) de los aminoácidos individuales que constituyen la secuencia. Acetil y -amida en el N y Cterminal, respectivamente, están opcionalmente incluidos cuando estén presentes o se indique como preferido.

También se describen compuestos que incluyen los péptidos de la invención, partes de estos péptidos y sus nuevos análogos y derivados, para ser usados en el tratamiento en la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos que implican la formación y persistencia de Aa. Preferentemente, los trastornos son enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y otras Aβ amiloidosis. Normalmente, la composición farmacéutica incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito sales farmacéuticamente aceptables de un compuesto, opcionalmente con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

15 También se describe el uso de píldoras, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gelatina blandas y duras, pastillas, bolsitas, sobres, cápsulas vegetarianas, gotas líquidas, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsas de té, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), supositorios, soluciones inyectables esterilizadas y polvos envasados esterilizados, que contienen un compuesto descrito para tratar pacientes con enfermedad de Alzheimer y otros Aβ amiloidosis. Por lo tanto, el uso de un compuesto descrito para una terapia o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con Aβ amiloidosis está también contemplado.

Se proporcionan composiciones usadas para administrar a un sujeto una dosis terapéutica de un compuesto descrito seleccionado que inhibe el depósito de Aβ amiloide o la Aβ amiloidosis en trastornos en los que se produce un depósito de Aβ amiloide. Los compuestos descritos pueden ser usados terapéuticamente para tratar amiloidosis o

25 pueden ser usados profilácticamente en un sujeto susceptible a la Aβ amiloidosis. Los compuestos están basados, al menos en parte, en Aβ amiloide de unión directa en el cerebro o en la circulación periférica, y midiendo la formación de fibrilas de Aβ amiloide y/o provocando la disolución de fibrilas de Aβ amiloide previamente formadas. El secuestro periférico de Aβ por los péptidos de la invención se cree que da lugar al desplazamiento de Aβ desde el cerebro hasta la circulación periférica, inhibiendo así la formación de fibrilas de Aβ amiloide del cerebro y/o provocando la disolución de las fibrilas de Aβ amiloide del cerebro previamente formados.

Se proporcionan métodos para detectar la presencia o ausencia de péptidos Aβ en una muestra biológica. Estos métodos incluyen poner en contacto una muestra biológica con un compuesto seleccionado, en que el compuesto es marcado con una sustancia detectable, por ejemplo, con un radionucleótido, compuesto fosforescente, compuesto

35 fluorescente, proteína fluorescente, compuesto paramagnético, queladores metálicos o enzima, todos los cuales son fácilmente detectables en diversos ensayos y medios de diagnósticos conocidos por los expertos en la técnica y detectar seguidamente la sustancia detectable unida a Aβ péptidos en la muestra biológica.

Se describen en la presente memoria descriptiva métodos de formación de imágenes para la presencia o ausencia de péptidos Aβ en el cuerpo o tejidos biológicos. Estos métodos incluyen poner en contacto péptidos Aβ en el cuerpo con un compuesto, en que el compuesto es marcado con una sustancia detectable, por ejemplo, con un radionucleótido, compuesto fosforescente, compuesto fluorescente, proteína fluorescente, compuesto paramagnético, quelador metálico o enzima y detectar la sustancia detectable unida a péptidos Aβ en el cuerpo o tejidos biológicos.

45 Se presenta el uso de anticuerpos anti-idiotípicos para los péptidos de la invención, análogos, derivados o fragmentos de los mismos, como elementos de unión potentes de Aβ e inhibidores de la formación, depósito, acumulación y/o persistencia de Aβ amiloide, en la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis Aβ. La expresión “anticuerpos anti-idiotípicos” se refiere a los anticuerpos (A) surgidos contra o que reconocen específicamente las regiones Fab de otros anticuerpos (B) y las regiones Fab de anticuerpos B, reconocen uno de los péptidos de la invención. El resultado es que los anticuerpos anti-idiotípicos A para los péptidos de la invención tienen regiones Fab que emulan el péptido, en términos de reactividad. Unión amiloide y propiedades de rotura de amiloides.

Se presenta el uso de anticuerpos que reconocen compuestos para un marcado in vivo, por ejemplo, con un 55 radionucleótido, para utilizar la radioformación de imágenes para diagnósticos in vivo y/o para un diagnóstico in vitro.

Una amiloidosis Aβ importante para los que se dirigen los agentes terapéuticos descritos es la enfermedad de Alzheimer. Una cantidad terapéuticamente eficaz preferida de compuesto descrito es una dosificación en el intervalo de aproximadamente 10 μg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal/por día y, más preferentemente, en el intervalo de aproximadamente 100 μg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día.

Un agente farmacéutico que contiene un compuesto descrito seleccionado puede ser ventajosamente proporcionado mediante inyección o infusión o gotas nasales o pulverización nasal o administración oral. En cualquiera de las estructuras o secuencias anteriores, la nomenclatura o representación simbólica de cualquiera o de la totalidad de los aminoácidos individuales puede ser proporcionada mediante la abreviatura estándar de tres letras para el aminoácido o el código de letra única estándar para el aminoácido o a veces ambos en casos apropiados

Breve descripción de los dibujos

5 Los siguientes dibujos son ilustrativos de realizaciones de la invención y no está previsto que limiten el alcance de la invención.

La figura 1 son secuencias de péptidos y dibujos para los péptidos DP68 y DP74.

La figura 2 es un espectro de CD de Ab42 + polilisina y DP-065 a través de DP-072 a (1:2).

La figura 3 es un espectro de CD de de Ab42 + DP-065 a través de DP-072 a (1:0,1, 1:1, 1:2, 1:5).

15 La figura 4 es un resumen de la respuesta a la dosis de CD de Ab42 +/- DP-065 para DP-072.

La figura 5 es un resumen de tio T de Ab42 + DP-065 -72 (1:0,1, 1:1, 1:2, 1:5) y polilisina.

La figura 6 es un resumen es un sumario para la clasificación de valores de tio T 65-72.

La figura 7 A y B son espectros de CD que muestran los efectos de 0,2 mg/ml de péptido DP-074 sobre la estructura secundaria de láminas beta de fibrilas amiloides Aβ42 (es decir, Aβ42 +/- DP-074) o DP-074 solamente.

La figura 8 es un gráfico que muestra un resumen de comparación del efecto de 0,2 mg/ml de péptidos DP-065 con

25 LP-081 y polilisina, sobre la estructura secundaria de láminas beta de fibrilas amiloides Aβ42 25 μM según se valoró mediante CD-. Se muestra la elipticidad de residuos molares de Aβ42 a 218 nm en el eje y, que representan la señal asociada con la estructura secundaria de láminas beta. La pérdida de elipticidad a 218 nm comparada con la señal de fibrilas de Aβ42 solamente indica la capacidad de los péptidos para reducir la estructura secundaria de láminas beta.

Las figuras 9A y B son espectros de CD que muestran los efectos dependientes de la dosis de péptido DP-074 sobre la estructura secundaria de láminas beta de fibrilas amiloides Aβ42 (es decir, Aβ42 +/- DP-074) o DP-074 solamente.

La figura 10 es un gráfico que muestra un resumen de comparación del efecto dependiente de la dosis de péptidos

35 DP-065 respecto a LP-081 sobre la estructura secundaria de láminas beta de fibrilas amiloides Aβ42 25 μM según se valoró mediante CD. Se muestra la elipticidad de residuos molares de Aβ42 a 218 nm en el eje y, que representa la señal inversamente relacionada con la estructura secundaria de láminas beta.

La figura 11 es un gráfico que muestra un resumen ordenado de comparación del efecto de péptidos 6-9meros sobre la estructura secundaria de láminas beta de fibrilas amiloides Aβ42 25 μM según se valoró mediante espectropolarimetría CD. Se muestra el porcentaje de rotura de fibrilas de Aβ42 según se valoró mediante la pérdoida de elipticidad a 218 nm, que representa la señal que está inversamente relacionada con la estructura secundaria de láminas beta.

45 La figura 12 es un gráfico que muestra un resumen ordenado de comparación del efecto de péptidos 6-9meros sobre la estructura secundaria de láminas beta de fibrilas amiloides Aβ42 25 μM según se valoró mediante fluorometría de tioflavina T. Se muestra el porcentaje de rotura de fibrilas de Aβ42 por diversos péptidos 6-9meros a una relación de péptidos Aβ42:6-9meros de 1:2.

La figura 13 es un gráfico que muestra un resumen ordenado de comparación de la eficacia de unión de péptidos 69meros sobre sustrato Aβ42 unido según se valoró mediante mediciones de LC/MS de péptidos no unidos después de un período de equilibrio de 2 horas. Se muestra el porcentaje de diversos péptidos 6-9meros sin unir a fibrilas de Aβ42 después de 2 horas de incubación.

55 La figura 14 es un gráfico que demuestra la estabilidad del péptido DP-068 en suero humano en un período de incubación de 32 horas según se valoró mediante LC/MS.

La figura 15 es un gráfico que demuestra la estabilidad de péptido DP-074 en suero humano en un período de incubación de 32 horas, según se valoró mediante LC/MS.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

EJEMPLO 1 65 Preparación de péptidos

Los péptidos descritos en la presente memoria descriptiva fueron producidos en formas de los aminoácidos L y D. El péptido DP-068 es según la invención. En los siguientes ejemplos, el DP-068 es referido por tener una “amida” Nterminal. Se apreciará a partir de la figura 1 que esta amida es -NH2. Además, fueron ensamblados péptidos 5 truncados y análogos de péptidos para ser usados como péptidos terapéuticos potenciales para el tratamiento de fibrilogénesis de Aβ en la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados. Estos péptidos son sintetizados preferentemente de forma convencional. Por ejemplo, los L- y D- péptidos fueron sintetizados en sintetizadores de péptidos conocidos por los expertos en la técnica como el sintetizador de péptidos múltiple Advanced ChemTech Model 396 (Louisville, KY), usando un protocolo automatizado establecido por el fabricante para una síntesis a escala de 0,025 mmoles. Se realizaron acoplamientos dobles en todos los ciclos usando hexafluorofosfato de 2-(1Hbenzotriasol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU)/N,N-diisopropiletilamina (DIEA)/HOBt/FMOC-AA en un exceso de 4 veces durante 30 minutos, seguido de DIC/HOBt/FMOC-AA en un exceso de cuatro veces durante 45 minutos.

El péptido seguidamente se desprotegió y se retiró de la resina mediante tratamiento con TFA/agua (95% /5%) 15 durante 3 horas y seguidamente se precipitó con éter frío. El sólido resultante seguidamente se sedimentó mediante centrifugación (2400 rpm x 10 min) y el éter se desechó. Seguidamente el sólido se volvió a poner en suspensión en éter y se volvió a centrifugar por segunda vez, después de lo cual el éter se separó por decantación por segunda vez. El sólido se disolvió en ácido acético al 10% y se liofilizó hasta sequedad (~30 mg para péptidos de 12 aminoácidos; 18 mg para péptidos de 7 aminoácidos). El péptido en bruto se purificó mediante HPLC preparativa usando instrumentos conocidos por los expertos en la técnica, como una serie HP110 con detector de hilera de diodos, con una columna C18 Vidac (21 x 250 mm) usando un gradiente de acetonitrilo de 15%-40% durante 80 minutos (a un caudal de 5 ml/min). La fracción primaria seguidamente se recogió y se volvió a analizar en cuanto a la pureza usando HPLC analítica para asegurar un pico simétrico único a todas las longitudes de onda. La confirmación de las estructuras y secuencias se basó en una comparación de pesos moleculares previstos, con 25 pesos moleculares obtenidos mediante espectroscopía de masas ESI. Estos análisis se realizaron usando instrumentos conocidos por los expertos en la técnica, como un espectrómetro de masas de pulverización iónica de cuádruplo triple Sciex API IIIE o ESI Agilent MSD-SL. Se sintetizaron péptidos 12-13meros con las siguientes secuencias, que empleaban todos preferentemente D-aminoácidos, excepto cuando se indicó otra cosa:

Arg-Lys-Arg-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Thr (DP-001),

Arg-Gln-Val-Phe-Gln-Val-Ala-Tyr-Ile-Ile-Ile-Lys-Ala (DP-002),

Tyr-eu-Ser-Lys-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Ala-Leu-Gly (DP-003), 35 Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-004),

Ala-Gly-Gln-Trp-His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP-005),

Asp-Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP-006),

His-Gln-Thr-Trp-Thr-Arg-Asn-Leu-Gln-Val-Thr-Leu (DP-007),

Ile-Ser-Asn-Val-Phe-Val-Gln-Arg-Leu-Ser-Leu-Ser (DP-008), 45 Arg-Gly-Leu-Val-Phe-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Asn-Ser-Phe (DP-009),

Gly-Asn-Ser-Thr-Ile-Ser-Ile-Arg-Ala-Pro-Val-Tyr (DP-010),

Val-Arg-Trp-Gly-Met-Gln-Gln-Ile-Gln-Leu-Val-Val (DP-011),

Ala-Pro-Val-Asn-Val-Thr-Ala-Ser-Val-Gln-Ile-Gln (DP-012),

Thr-Arg-Ile-Ser-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Arg-Lys-Arg (DP-013), 55 Ala-Lys-Ile-Ile-Ile-Tyr-Ala-Val-Gln-Phe-Val-Gln-Arg (DP-014),

Gly-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys-Ser-Leu-Tyr (DP-015),

Met-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-His-Ala-Leu-Phe-Leu-Thr (DP-016),

Gly-Trp-Arg-Val-Ser-Val-Arg-His-Trp-Gln-Gly-Ala (DP-017),

Gly-Met-Ile-Val-Ala-Val-Arg-His-Trp-Arg-Gly-Asp (DP-018), 65 L-Arg-L-Lys-L-Arg-L-Leu-L-Gln-L-Val-L-Gln-L-Leu-L-Ser-L-Ile-L-Arg-L-Thr (DP-019), y

Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Pro-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-050).

Además se sintetizaron péptidos 6-9meros que incluyen iAβ5 (LP-025) y piAβ5 (LP-081) con las siguientes 5 secuencias y/o modificaciones:

L-Leu-L-Pro-L-Phe-L-Phe-L-Asp (LP-025), Ala-Gly-Gln-Trp-His-Arg-Val (DP-026), Gly-Gln-Trp-His-Arg-Val-Ser (DP027), Gln-Trp-His-Arg-Val-Ser-Val (DP-028), Trp-His-Arg-Val-Ser-Val-Arg (DP-029), His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp (DP-030), Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP-031), Asp-Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val (DP-032), Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val10 Ala (DP-033), Arg-Trp-His-Arg-Val-Ala-Val (DP-034), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile (DP-035), His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-036), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP-037), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-His-Gly (DP-038), Leu-Phe-Leu-Ala-His-Gly-Arg (DP-039), Phe-Leu-Ala-His-Gly-Arg-Leu (DP-040), Leu-Ala-His-Gly-Arg-Leu-Val (DP-041), Ala-His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe (DP-042), His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-043), Gly-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-044), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly (DP-045), Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys (DP-046), Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys-Ser (DP-047), Val15 Leu-Arg-Gly-Lys-Ser-Leu (DP-048), Leu-Arg-Gly-Lys-Ser-Leu-Tyr (DP-049), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP051), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-052), His-Arg-Pro-Ala-Val-Ile-Met (DP-053), His-Arg-Val-Pro-Val-Ile-Met (DP-054), His-Arg-Val-Ala-Val-Pro-Met (DP-055), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-056), Leu-Pro-Phe-Val-Leu-Arg (DP-057), Arg-Arg-Pro-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-058), Thr-Arg-Ile-Ser-Leu-Gln-Val (DP-059), Ser-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Arg (DP060), Gln-Val-Gln-Leu-Arg-Lys-Arg (DP-061), Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp (DP-062), Arg-Val-Ser-Val-Arg (DP-063), His20 Pro-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-064), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-amida (DP-065), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ileamida (DP-066), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-amida (DP-067), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-amida (DP-068), Leu-Ala-PheVal-Leu-Arg-amida (DP-069), His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met-amida (DP-070), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg (DP-071), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-072), Acetyl-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-073), Leu-Ala-Phe-Val-LeuArg-Lys-amida (DP-074), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-amida (DP-075), Acetyl-Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-amida (DP

25 076), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-Lys (DP-077), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-Lys-amida (DP-078), Trp-His-Leu-Ala-PheVal-Leu-Arg-amida (DP-079), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Lys-amida (DP-080), and Acetyl-L-Leu-L-Pro-L-PheL-Asp-L-amida (LP-081). D- indica D-aminoácidos y L- indica L-aminoácidos.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1

30 Rotura de estructura secundaria de láminas beta de fibrilas de Alzheimer mediante péptidos 12-13meros según se ensayó mediante espectropolarimetría CD

Se registraron espectros de dicroísmo circular (CD) de Aβ42 en presencia o ausencia de péptidos sintéticos

35 indicados en el ejemplo 1 a 25ºC en un espectropolarímetro JASCO-810 usando una cubeta de cuarzo con longitud de trayectoria de 0,5 mm y sobre el intervalo de 190-260 nm. El instrumento fue calibrado con una solución acuosa de ácido (+)- canforsulfónico. El instrumento seguidamente se ajustó para recoger datos a una anchura de banda de 5 mm, tiempo de respuesta de 32 segundos, modulación de datos de 0,5 nm y una velocidad de exploración de 10 nm/min. Cada espectro de CD era una media de 5 espectros, tomados cada uno a partir de una solución duplicada

40 por separado. Los resultados de CD se expresaron por elipticidad de residuo molar (MRE) de Aβ42, después de la sustracción del espectro del disolvente de fondo y/o el espectro de péptido del ensayo. Para este estudio, se incubó Aβ42 fibrilar (0,1 mg/ml) en TPBSF (10% de TFE, NaF 150 nM, HNaPO4 50 mM, pH 7,4) fue incubado durante 3 días a 37ºC en presencia y ausencia de diversos péptidos 12-13meros a una relación p/p de Aβ 42:péptido de 1:2, antes de registrar los espectros de CD. El porcentaje de rotura de estructura en láminas β se determinó calculando el

45 porcentaje de pérdida de elipticidad negativa a 218 nm en comparación con Aβ42 solo, después de que se sustrajeran los correspondientes datos en blanco.

Los rompedores de estructura secundaria en láminas beta Aβ42 entre análogos de péptidos 12-13meros se clasifican en orden de eficacia, según se valora mediante espectropolarimetría CD. Otros péptidos que son también

50 eficaces no se incluyen en esta lista. Los péptidos preferidos, incluidos en orden de eficacia son

Ala-Gly-Gln-Trp-His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP-005), Asp-Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP006), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-004), Gly-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys-Ser-Leu-Tyr (DP-015), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Pro-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-050), Gly-Trp-Arg-Val-Ser-Val-Arg-His-Trp55 Gln-Gly-Ala (DP-017), Tyr-eu-Ser-Lys-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Ala-Leu-Gly (DP-003), Gly-Met-Ile-Val-Ala-Val-Arg-His-Trp-Arg-Gly-Asp (DP-018), L-Arg-L-Lys-L-Arg-L-Leu-L-Gln-L-Val-L-Gln-L-Leu-L-Ser-L-Ile-L-Arg-L-Thr (DP-019), Met-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-His-Ala-Leu-Phe-Leu-Thr (DP-016), Thr-Arg-Ile-Ser-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Arg-Lys-Arg (DP013), Arg-Gln-Val-Phe-Gln-VaI-Ala-Tyr-Ile-Ile-Ile-Lys-Ala (DP-002), Arg-Gly-Leu-Val-Phe-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Asn-Ser-Phe (DP-009), Gly-Asn-Ser-Thr-Ile-Ser-Ile-Arg-Ala-Pro-Val-Tyr (DP-010), Val-Arg-Trp-Gly-Met-Gln-Gln-Ile-Gln

60 Leu-Val-Val (DP-O11), Ala-Pro-Val-Asn-Val-Thr-Ala-Ser-Val-Gln-Ile-Gln (DP-012), Ala-Lys-Ile-Ile-Ile-Tyr-Ala-Val-Gln-Phe-Val-Gln-Arg (DP-014), and Ile-Ser-Asn-Val-Phe-Val-Gln-Arg-Leu-Ser-Leu-Ser (DP-008). DP-005, DP-006, DP004 y DP-015 muestran >75% de rotura de Aβ42 fibrilar, mientras que DP-050, DP-017 y DP-003 muestran >50% de rotura de fibrilas de Aβ42.

65 EJEMPLO DE REFERENCIA 2 Rotura de fibrilas de Aβ de Alzheimer mediante péptidos 12-13meros según se valoró mediante fluorometría de tioflavina T.

5 Diversos péptidos sintetizados como se indican en el ejemplo 1 fueron ensayados en cuanto a la actividad de rompedora de Aβ amiloide potencial usando una diversidad de ensayos in vitro. Uno de estos ensayos, fluorometría de tioflavina T, que mide la cantidad de fibrilas amiloides (LeVine III, Protein Sci. 2:404-410, 1993; Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; Naiki and Nakakuki, Lab. Invest., 74:374-383, 1996; Castillo et al, J. Neurochem. 69:2452-2465, 1997) fue usado para identificar péptidos sintéticos capaces de romper fibrilas amiloides Aβ42. Para

10 estos estudios, se incubaron 0,1 mg/ml de Aβ42 (Bachem Inc) en tubos de microcentrifugadora a 37ºC durante 3 días (por triplicado solos o bien en presencia de 0,2 mg/ ml de péptido a una relación en peso de Aβ: péptido de 1:2) en TPBSF (10% de TFE, NaF 150 mm, HNaPO4 50 mM, pH 7,4). Se tomaron partes alícuotas de 50 μl para un análisis en el día 3 y se añadieron partes alícuotas de 200 μl de tioflavina T 125 μM en NaPO4 62 mM (pH 6,0) para proporcionar una concentración final de tioflavina T de 100 μM y 62 mM de NaPO4. Se midió la emisión de

15 fluorescencia a 480 nm en un fluorómetro de microplaca de 96 pocillos (Labsystem) a una longitud de onda de excitación de 450 nm. Para todas las determinaciones, cualquier fluorescencia proporcionada por los péptidos en presencia del reactivo de tioflavina T fue siempre sustraída de todas las lecturas pertinentes. Estudios previos han indicado que las concentraciones crecientes de Aβ42 fibrilar proporcionan un aumento proporcional de la fluorescencia en presencia de tioflavina T 100 μM descartando la presencia de cualquier efecto de filtros internos

20 desproporcionados a esta concentración de tioflavina T (Castillo et al J. Neurochem. 69:2452-2465, 1997).

Rompedores de tioflavina T que se unen a Aβ42 a partir de análogos de péptidos de entre 12-13 aminoácidos, clasificados en orden de eficacia. Los péptidos en orden de eficacia, según se determinó mediante fluorometría de tioflavina T, incluyen, pero sin limitación

25 Val-Arg-Trp-Gly-Met-Gln-Gln-Ile-Gln-Leu-Val-Val (DP-011), Gly-Met-Ile-Val-Ala-Val-Arg-His-Trp-Arg-Gly-Asp (DP018), His-Gln-Thr-Trp-Thr-Arg-Asn-Leu-Gln-Val-Thr-Leu (DP-007), Arg-Lys-Arg-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Ser-Ile-Arg-Thr (DP-001), Ile-Ser-Asn-Val-Phe-Val-Gln-Arg-Leu-Ser-Leu-Ser (DP-008), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Pro-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-050), Asp-Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP-006), Gly-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys

30 Ser-Leu-Tyr (DP-015), Gly-Asn-Ser-Thr-Ile-Ser-Ile-Arg-Ala-Pro-Val-Tyr (DP-010), Arg-Gly-Leu-Val-Phe-His-Thr-Gly-Thr-Lys-Asn-Ser-Phe (DP-009), Ala-Pro-Val-Asn-Val-Thr-Ala-Ser-Val-Gln-Ile-Gln (DP-012), Tyr-eu-Ser-Lys-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Ala-Leu-Gly (DP-003), Ala-Gly-Gln-Trp-His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP-005), and Ala-Lys-Ile-Ile-Ile-Tyr-Ala-Val-Gln-Phe-Val-Gln-Arg (DP-014). DP-017 y DP-011 demuestran una rotura >80% de fibrilas de Aβ42, DP-018 y DP-007 demuestran una rotura >60% de fibrilas Aβ42, mientras que DP-001, DP-008, DP-050, DP-006 y

35 DP-015 demuestran una rotura >40% de fibrilas de Aβ42.

EJEMPLO 2

Rotura de estructuras secundaria de láminas de fibrilas β de Alzheimer ensayados mediante espectropolarimetría 40 CD

La espectropolarimetría de dicroísmo circular (CD) es otra técnica in vitro usada para determinar la eficacia de un péptido dado para romper la estructura secundaria de láminas b de fibrilas de Aβ. Los espectros de CD de Aβ 42 en presencia o ausencia de péptidos sintéticos se registraron a 25ºC en un espectropolarímetro JASCO-810 usando 45 una cubeta de cuarzo con longitud de trayectoria de 0,5 mM y sobre el intervalo de 190-260 nm. El instrumento fue calibrado con una solución acuosa de ácido (+)-canforsulfónico. El instrumento fue seguidamente ajustado para recoger datos a una anchura de banda de 5 nm, tiempo de respuesta de 32 segundos, ondulación de datos de 0,5 nm y una velocidad de exploración de 10 nm/min. Cada espectro de CD fue una media de 5 espectros, tomados cada uno a partir de una solución duplicada por separado. Los resultados de CD fueron expresados como elipticidad 50 de residuo molar (MRE) de Aβ42, después de la sustracción del espectro del disolvente de fondo y/o espectro de péptido de ensayo. Para este estudio, se incubó Aβ42 fibrilar (0,1 mg/ml) en TPBSF (10% de TFE, NaF 150 mM, HNaPO4 50 mM, pH 7,4) durante 3 días a 37ºC en presencia y ausencia de diversos péptidos a una relación p/p de Aβ42: péptido de 1:2, antes de registrar los espectros de CD. El porcentaje de rotura de estructura de lámina beta se determinó calculando el porcentaje de pérdida de elipticidad negativa a 218 nm en comparación con Aβ42 solo

55 después de que sustrajeran los correspondientes valores en blanco.

La figura 11 muestra que los rompedores de estructura en láminas beta de Aβ42 entre péptidos 6-9meros y análogos, clasificados en orden de eficacia según se valoró mediante espectropolarimetría de CD. Los péptidos preferidos en orden de eficacia incluyen, pero sin limitación, Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-amida (DP-068), Trp-His60 Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Lys-amida (DP-080), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Lys-amida (DP-074), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-072), Acetyl- Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-073), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-069), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-079), Acetyl- Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-amida (DP-076), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-051), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg (DP-071), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-amida (DP-075), His-Arg-Val-AIa-Val-Ile-Met (DP-036), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP-037), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-056), Thr

Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-Lys-amida (DP-078), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile (DP-035), Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP031), Ala, His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe (DP-042), His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-043), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ileamida (DP-066), His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met-amida (DP-070), and His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp (DP-030). El DP068 demuestra una rotura de >90 de estructura de láminas β de Aβ42, mientras que DP-080, DP-074, DP-072,

5 DP-073, DP-069, DP-079, DP-076, DP-051, DP-071 y DP-075 demuestran todos una rotura de >60% de estructura de láminas de Aβ42 β (figura 11).

EJEMPLO DE REFERENCIA 3

10 Rotura de fibrilas de Aβ de Alzheimer mediante péptidos 6-9meros según se valoró mediante fluorometría de tioflavina T.

La fluorometría de tioflavina T, que mide la cantidad de fibrilas amiloides (LeVine III, Protein Sci. 2:404-410, 1993; Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 2:1-6, 1995; Naiki and Nakakuki, Lab. Invest., 74:374-383, 1996; Castillo et al, J. 15 Neurochem. 69:2452-2465, 1997) se usó también para determinar la eficacia de péptidos 6-9meros en la rotura de fibrilas amiloides de Aβ42. Para estos estudios, se incubó 0,1 mg/ml de Aβ42 (Bachem Inc) en tubos de microcentrifugadora a 37ºC durante 3 días (por triplicado), solos o bien en presencia de 0,2 mg/ml de péptido (a una relación en peso de Aβ: péptido de 1:2) en TPBSF (10% de TFE, NaF 150 mM, HNaPO4 50 mM, pH 7,4). Se tomaron partes alícuotas de 50 μl para un análisis en el día 3 y se añadieron partes alícuotas de 200 μl de tioflavina 20 125 μM en NaPO4 62 mM (pH 6,0) proporcionando una concentración final de tioflavina T de 100 μM y 62 mM de NaPO4. Se midió la emisión de fluorescencia a 480 nM en un fluorómetro de microplaca de 96 pocillos (Labsystem) a una longitud de onda de excitación de 450 nm. Para todas las determinaciones, cualquier fluorescencia proporcionadas por los péptidos en presencia del reactivo de tioflavina T se sustrajeron siempre de todas las lecturas pertinentes. Unos estudios previos han indicado que las concentraciones crecientes de Aβ42 fibrilar

25 proporcionan un aumento proporcional de la fluorescencia en presencia de tioflavina T 100 μM, descartando la presencia de cualesquiera efectos de filtro internos desproporcionados a esta concentración de tiflavina T (Castillo et al J. Neurochem. 69:2452-2465, 1997).

La figura 12 muestra las roturas de la unión de tioflavina T a Aβ42 a partir de péptidos 6-9meros y análogos,

30 clasificadas en orden de eficacia. Los péptidos preferidos en orden de eficacia incluyen, pero sin limitación Trp-HisLeu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Lys-amida (DP-080), Acetyl-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-073), Leu-Ala-Phe-ValLeu-Arg-Lys-amida (DP-074), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-079), Acetyl-Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Argamida (DP-076), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-051), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-Lys-amida (DP-078), Thr-LeuPhe-Leu-Ala-Arg-amida (DP-075), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly (DP-045), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP-037),

35 Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-052), His-Pro-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-064), Thr-Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-Lys (DP-077), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-056), Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP-031), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile (DP-035), His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp (DP-030), Thr-Arg-Ile-Ser-Leu-Gln-Val (DP-059), Ala-His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe (DP042), Ser-Leu-Gln-Val-Gln-Leu-Arg (DP-060), His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-043), Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp (DP062), Leu-Pro-Phe-Val-Leu-Arg (DP-057) y Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys (DP-046). DP-080, DP-073, DP-074, DP

40 079, DP-076 y DP-051 demostraron todos una inhibición/rotura > 75% de fibrilas de Aβ42, mientras que DP-078 y DP-075 demostraron una inhibición/rotura > 50% de fibrilas de Aβ42.

EJEMPLO 3

45 Unión de péptidos 6-9meros a fibrilas de Aβ42 de Alzheimer

Se determinó la capacidad de diversos péptidos para unirse a Aβ42 unido a sustrato mediante un ensayo de unión en fase sólida junto con una determinación de fracciones de péptido sin unir usando cromatografía líquida a presión elevada unida a un detector selectivo de masa (HPLC/MSD; sistema Agilent 1100 HPLC). Los péptidos fueron 50 resueltos en HPLC usando una columna Synergi-Max RP (2 x 0,4 cm; 2 μm) a partir de phenomenex con un caudal de 1 ml/min y un gradiente de 0-60% de acetonitrilo en agua, que contenía 1% de ácido fórmico durante 5,5 minutos. Los péptidos fueron detectados a medida que salían de la columna usando MSD SL (Agilent). El MSD tenía los siguientes ajustes: verificación de iones positivo en modo de exploración de 200-1200 Da; voltaje fragmentador 150; caudal secador 13 l/min de N2; presión nebulizadora 3,10 bares; temperatura del gas secador 350ºC y voltaje de

55 capilaridad 3500 voltios;

El ensayo de unión en fase sólida se realizó como sigue: partes alícuotas de 10 μg de Aβ42 se unieron a membrana PVDF en la parte inferior de una microplaca de 96 pocillos (disponible en la entidad Millipore) según las instrucciones del fabricante. La placa se dejó secar y se aplicaron partes alícuotas de 150 μl de 0,1 mg/ml de 60 péptidos 6-9meros en cada pocillo. Cada péptido 6-9mero fue aplicado por triplicado en los pocillos que contenían Aβ42 (pocillos del ensayo) y por triplicado en los pocillos que no contenían Aβ42 (pocillos en blanco). Las placas que contenían 16 péptidos 6-meros diferentes se incubaron a 37ºC durante 2 horas. El péptido sin unir en cada pocillo fue seguidamente transferido a viales de HPLC/MSD para un análisis con los ajustes anteriormente indicados. Los péptidos recuperados de los pocillos sin Aβ42 fueron tomados como los péptidos totales, mientras que los péptidos

recuperados con pocillos con Aβ42 fueron tomados como los péptidos de unión total. Seguidamente se representaron gráficamente los porcentajes de diversos péptidos unidos después de 2 horas de incubación (figura 13).

5 La figura 13 muestra los elementos de unión de Aβ42 a partir de péptidos 6-9meros y análogos, clasificados en orden de eficacia. Los péptidos preferidos en orden de eficacia incluyen, pero sin limitación, His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met (DP-036), Trp-His-Arg-Val-Ala-Val-Ile-amida (DP-066), His-Pro-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-064), Trp-His-Leu-AlaPhe-Val-Leu-Arg-Lys-amida (DP-080), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-072), Acetyl-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Argamida (DP-073), Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly-Lys (DP-046), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-069), Gly-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-044), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Lys-amida (DP-074), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-amida (DP-067), His-Arg-Val-Pro-Val-Ile-Met (DP-054), His-Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp (DP-030),Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg (DP-056), His-Arg-Pro-Ala-Val-Ile-Met (DP-053),His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met-amida (DP-070), Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Glyamida (DP-068),Ala-His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe (DP-042), His-Gly-Arg-Leu-Val-Phe-Met (DP-043),Arg-Val-Ser-Val-Arg-Trp-Gly (DP-031),Phe-Leu-Ala-His-Gly-Arg-Leu(DP-040), Trp-His-Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-amida (DP-079), Thr

15 Leu-Phe-Leu-Ala-Arg-Lys-amida (DP-078),Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly (DP-037), Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val-Ala (DP033), Asp-Gly-Arg-Trp-His-Arg-Val (DP-032), Ala-Gly-Gln-Trp-His-Arg-Val (DP-026), Leu-Ala-Phe-Val-Leu-Arg-Gly (DP-045) y Arg-Trp-His-Arg-Val-Ala-Val (DP-034). DP-036 y DP-066 demostraron una unión > 40% a Aβ42 unido a sustrato, mientras que DP-064 y DP-080 demostraron una unión >30% y DP-0072 y DP-073 demostraron una unión > 20% (figura 13).

EJEMPLO 4

Rotura de estructura secundaria de láminas de fibrilas β de Alzheimer mediante péptidos 6-9meros según se valoró mediante espectropolarimetría CD

25 La espectropolarimetría de dicroísmo circular (CD) es otra técnica in vitro usada para determinar la eficacia de un péptido dado para romper la estructura secundaria de láminas de fibrilas β de Aβ. Se registraron espectros de CD de Aβ42 en presencia o ausencia de péptidos 6-9meros sintéticos a 25ºC en un espectropolarímetro JASCO-810 usando una cubeta de cuarzo con una longitud de trayectoria de 0,5 mm y sobre el intervalo de 190-260 nm. El instrumento fue calibrado con una solución acuosa de ácido (+)-canforsulfónico. El instrumento fue seguidamente ajustado para recoger datos a una anchura de banda de 5 nm, tiempo de respuesta de 32 segundo, ondulación de datos de 0,5 nm y velocidad de exploración de 10 nm/min. Cada espectro de CD fue una media de 5 espectros, tomados cada uno a partir de una solución duplicada por separado. Los resultados de CD fueron expresados como elipticidad de residuo molar (MRE) de Aβ42, después de la sustracción del espectro del disolvente de fondo y/o el

35 espectro del péptido del ensayo. Para este estudio, se incubó Aβ42 fibrilar (0,1 mg/ml) en TPBSF (10% de TFE, NaF 150 mM, HNaPO4 50 mM, pH 7,4) durante 3 días a 37ºC en presencia y ausencia de diversos péptidos 6-9meros a una relación p/p de Aβ42 2: péptido de 1:2, antes de registrar los espectros de CD.

Los espectros de CD de Aβ42 solo, Aβ42 más péptido 6-9mero y péptido 6-9mero solo se representan en la figura 7, con un resumen global en la figura 8.

La figura 7 muestra el espectro de CD de 0,1 mg/ml de Aβ42 después de 3 días de incubación (línea continua). Tanto la elipticidad negativa a 218 nm como la elipticidad positiva a 195 nm indican la presencia de estructura secundaria de láminas beta. También en la figura 7 está el espectro de CD de 0,1 mg/ml de Aβ42 en presencia de

45 0,2 mg/ml de DP-074 después de 3 días de incubación (línea de puntos) con una corrección para el espectro de péptido DP-074. La pérdida significativa de elipticidad negativa a 218 nm en presencia de DP-074 indica una pérdida de estructura de láminas beta en Aβ42. La figura 7 muestra el espectro de CD de 0,2 mg/ml de DP-074 solo (línea de puntos) con elipticidades positivas y máximos a aproximadamente 200 nm que indican un enrollamiento al azar invertido congruente con un péptido de aminoácidos, con muy poca estructura de láminas beta. También se muestra en la figura 7 por motivos de comparación el espectro de CD de 0,1 mg/ml de Aβ42 después de 3 días de incubación (línea continua).

La figura 8 muestra las elipticidades de 0,1 mg/ml de Aβ42 a 218 nm en presencia de 0,2 mg/ml de diversos péptidos 6-9meros después de 3 días de incubación y después de la corrección para las elipticidades CD de

55 diversos péptidos. Los péptidos ensayados en este caso son DP-065 a LP-081 y polilisina. Debe apreciarse que los péptidos DP-065, DP-067 y LP-081provocaron un aumento de la elipticidad negativa a 218 nm, indicando que estos péptidos sorprendentemente favorecen la formación de estructura de láminas beta de Aβ42. Se hace referencia a la figura 11 para la clasificación de la eficacia de diversos péptidos 6-9meros.

EJEMPLO 5

Rotura dependiente de la dosis de estructura secundaria de láminas beta de fibrilas de Alzheimer mediante péptidos 6-9meros según se valoró mediante espectropolarimetría CD

65 La espectropolarimetría de dicroísmo circular (CD) es otra técnica in vitro usada para determinar la eficacia de un

péptido dado para romper la estructura secundaria de láminas b de fibrilas. Los espectros de CD de Aβ42 en presencia o ausencia de péptidos 6-9meros sintéticos fueron registrados a 25ºC en un espectropolarímetro JASCO810 usando una cubeta de cuarzo de longitud de trayectoria de 0,5 mM y sobre el intervalo de 190-260 nm. El instrumento fue calibrado con una solución acuosa de ácido (+)- canforsulfónico. El instrumento fue seguidamente 5 ajustado para recoger datos a una anchura de banda de 5 nm, tiempo de respuesta de 32 segundos, ondulación de datos de 0,5 nm y velocidad de exploración de 10 nm/min. Cada espectro de CD fue una media de 5 espectros, tomados cada uno a partir de una solución duplicada por separado. Los resultados de CD fueron expresados como elipticidad de residuo molar (MRE) de Aβ42, después de la sustracción del espectro del disolvente de fondo y/o espectro de péptido del ensayo. Para este estudio se incubó Aβ42 fibrilar (0,1 mg/ml) en TPDSF (10% de TFE, NaF

10 150 nM, HNaPO4 50 mM, pH 7,4) durante 3 días a 37ºC en presencia y ausencia de diversos péptidos a relaciones de Aβ42: péptido de 1:0,1, 1:1, 1:2 y 1:10 antes de registrar los espectros de CD.

Los espectros de CD de Aβ42 solo, Aβ42 más péptido 6-9mero y péptido solo se presentan en la figura 9, con un sumario global en la figura 10.

15 La figura 9 muestra en el espectro de CD de 0,1 mg/ml de Aβ42 después de 3 días de incubación (azul). Tanto la elipticidad negativa a 218 nm como la elipticidad positiva a 195 nm indican la presencia de Estructura de láminas beta en Aβ42. También en la figura 9 está el espectro de CD de 0,1 mg/ml de Aβ42 en presencia de 0,01, 0,1, 0,2 y 0,5 mg/ml de péptido DP-074 después de 3 días de incubación (con corrección para el espectro de péptido DP-074).

20 La pérdida significativa de elipticidad negativa a 218 nm indica una pérdida de estructura de láminas beta en Aβ42. El efecto dependiente de la dosis es observado solamente a 0,2 mg/ml y valores inferiores. A 0,5 mg/ml de péptido DP-074, la tendencia se detiene e invierte su transcurso. Esto es debido quizás a la concentración muy elevada de péptido del ensayo que provoca una absorción significativa de la luz entrante. La figura 9 muestra el espectro de CD de 0,01, 0,1, 0,2 y 0,5 mg/ml de péptido DP-074 solo con elipticidades positivas máximas a aproximadamente 200

25 nm, indicando un enrollamiento al azar invertido congruente con un péptido de D-aminoácido con muy poca estructura de láminas beta. También en la figura 9 está para fines de comparación el espectro de CD de 0,1 mg/ml de Aβ42 después de 3 días de incubación (azul).

EJEMPLO 6

30 Estabilidad de péptidos en suero humano

Una característica deseable de cualquier candidato potencial de agente terapéutico o fármaco es la capacidad de resistir la degradación por enzimas en la sangre, para tener tiempo suficiente para alcanzar su diana. Uno de los

35 ensayos in vitro usados para determinar la estabilidad de los péptidos descritos en la presente memoria descriptiva es incubando estos péptidos en suero humano y determinar el nivel de los péptidos intactos (y degradación posible) a diversos valores del tiempo. Se añadieron partes alícuotas de 50 μl de diversos péptidos a 700 μl de suero humano (en muestras por triplicado. Se tomaron partes alícuotas de 100 μl a las 0, 2, 4, 6, 14 y 32 horas, seguido inmediatamente de la adición de 200 μl de etanol (o 20 μl de ácido trifluoroacético o 300 μl de metanol) y se

40 centrifugaron a 14.000 x g (Eppendorf) durante 10 minutos. El nivel de péptidos intactos en la materia sobrenadante se determinó seguidamente usando LC/MS (Agilent HPLC/MS SL 1100 Series). El MS verificó cada péptido a medida que salía de la HPLC usando una verificación de iones positivos de modo SIM a masas correspondientes a iones de péptidos de carga única, doble y triple. El pico en los cromatogramas iónicos resultantes fue integrado para obtener la abundancia de iones totales en cada muestra. La media de determinaciones por triplicado de la

45 abundancia de iones totales para cada valor de tiempo de incubación de suero fue seguidamente representado gráficamente como una función del tiempo de incubación de suero. La mayoría de las enzimas degradantes de péptidos en el cuerpo reconocen los péptidos naturales preparados a partir de los L-aminoácidos. Como los péptidos consisten en D-aminoácidos, su degradación en fluidos biológicos probablemente se retrasará como se demuestra en este ejemplo y en las figuras siguientes.

50 La figura 14 muestra el nivel de péptido DP-068 en suero humano como una función del tiempo durante un período de incubación de 32 horas. El péptido DP-068 consiste en todos los D-aminoácidos, como se muestra en la figura 14, y es resistente a la degradación en suero hasta las 32 horas inclusive.

55 La figura 15 muestra el nivel de péptido DP-074 en suero humano como una función del tiempo durante un período de incubación de 32 horas. El péptido DP-074 consiste en todos los D-aminoácidos, como se muestra en la figura 15, y es resistente a la degradación en el suero hasta las 32 horas inclusive.

Otros datos se ilustran como sigue:

60 La figura 1 muestra secuencias de péptidos y los dibujos 5-13meros DP-068 y DP-074.

La figura 2 muestra espectros de CD de Aβ42 más polilisina y DP-065 a través de DP-072 a una concentración p/p de Aβ42/péptido de (1:2)

65 La figura 3 muestra espectros de CD de Aβ 42 más DP-065 a través de DP-072 a (1:0,1, 1:1, 1:2, 1:5), con la figura 4 como resumen de la respuesta a la dosis CD de Aβ42 +/- DP-065 respecto a DP-072.

La figura 5 es un resumen de tio T de Aβ42 +/- DP65-72 (1:0,1, 1:1, 1:2, 1:5) y lisina, con la figura 6 como resumen 5 de tio T con valores de 65/72

Aspectos y utilizaciones adicionales

Una aplicación terapéutica es usar péptidos de la invención como agentes de unión o secuestradores de Aβ,

10 inhibidores de la formación de fibrilas amiloides Aβ, inhibidores del depósito de fibrilas amiloides Aβ, inhibidores de la acumulación y/o persistencia de fibrilas amiloides Aβ en enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y otros trastornos amiloides que implican fibrilogénesis de Aβ.

Un “péptido” se refiere a dos o más aminoácidos conjuntamente conectados por enlaces péptidos como es conocido

15 por los expertos en la técnica. Los péptidos preferidos son los descritos en la presente memoria descriptiva, pero pueden incluir también ventajosamente péptidos que tienen una identidad de al menos 70% y, más preferentemente, de 80-90% respecto a un péptido descrito. “% de identidad” como se usa en la presente memoria descriptiva para péptidos, significa los mismos aminoácidos en el mismo lugar. Por tanto, dos péptidos de 10 aminoácidos son un 90% idénticos si la yuxtaposición de uno respecto a otro muestra que la colocación y la identidad de cada

20 aminoácido es idéntica excepto para un aminoácido. Si un péptido de 10 aminoácidos es yuxtapuesto a otro péptido de diez aminoácidos y la colocación y la identidad de los aminoácidos es idéntica, excepto para dos aminoácidos, entonces los dos péptidos de 10 aminoácidos tienen una identidad de 80% uno respecto a otro.

Los péptidos descritos se producen mediante procedimientos sintéticos químicos. La síntesis química de péptidos es

25 un sector en rápida evolución en la técnica y los métodos de síntesis de métodos en fase sólida están bien descritos en las siguientes referencias: : Merrifield, J.Amer.Chem.Soc. 85:2149-2154, 1963; Merrifield, Science 232:341-347, 1986; Fields, Int.J.Polypeptide Prot. Res. 35, 161, 1990. Los péptidos descritos pueden ser utilizados también como reactivos y materiales de investigación para el descubrimiento de tratamiento y diagnósticos para enfermedades humanas.

30 La vía de administración incluye oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intraarticular, intranasal, intratecal, intradermal, transdermal o mediante inhalación. Una dosis eficaz de cada uno de los péptidos descritos en la presente memoria descriptiva como agentes terapéuticos potenciales para ser usados en el tratamiento de amiloidosis de Aβ en la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos es de aproximadamente 1 μg a

35 500 mg/kg de peso corporal, por administración única, que puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica. La dosificación depende de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de terapia concurrente, si la hay, y frecuencia del tratamiento. Otros límites superiores de los intervalos de dosificaciones eficaces son 100 mg/kg de peso corporal, 50 mg/kg de peso corporal, 25 mg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal.

40 Como se usan en la presente memoria descriptiva, los polipéptidos pueden consistir en L-aminoácidos o Daminoácidos o una mezcla de ambas formas. Los aminoácidos en la naturaleza consisten en L-aminoácidos. Sin embargo, la sustitución con D-aminoácidos generalmente demuestra una biodisponibilidad mejorada debido a la menor degradación en fluidos biológicos (como el plasma) y una penetración mejorada a través de la barrera sanguínea del cerebro. Los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la que se encuentra en

45 un péptido descrito, pero en los que la totalidad o parte de los L-aminoácidos han sido sustituidos con Daminoácidos son una parte del desarrollo descrito de agentes terapéuticos para tratar la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis Aβ.

Como SE usa en la presente memoria descriptiva, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y la

50 totalidad de disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, el vehículo es adecuado para una administración parenteral. Preferentemente, el vehículo es adecuado para una administración en el sistema nervioso central (por ejemplo, por vía intraespinal o intracerebral). Alternativamente, el vehículo puede ser adecuado para una administración intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. En otra

55 realización, el vehículo es adecuado para una administración oral. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esterilizadas y polvos esterilizados para una preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables esterilizadas. El uso de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en lo que se refiere a cualesquiera medios o agentes convencionales sean compatibles con el compuesto activo, su uso en las composiciones farmacéuticas está

60 contemplado. Pueden ser incorporados también compuestos complementariamente activos en las composiciones.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, “amiloidosis Aβ” se refiere a enfermedades amiloides que implican la formación depósito, acumulación y/o persistencia de Aβ (es decir, proteína β-amiloide), que incluye, pero sin limitación, Aβ que contiene 39-43 aminoácidos de longitud, pero, más preferentemente Aβ 1-40 o Aβ 1-42 y mezclas

65 o fragmentos de los mismos.

“Amiloidosis Aβ” y “ enfermedades de fibrilogénesis de Aβ” incluyen, pero sin limitación, enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, formas de amiloidosis familiar, amiloidosis cerebrovascular y hemorragia cerebral, angiopatía amiloide de cistatina C, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (tipo Dutch), hemorragia cerebral hereditaria

5 con amiloidosis (tipo islandés) y miositis de cuerpos de inclusión.

Aplicaciones terapéuticas

Los péptidos de la invención, los fragmentos, análogos y derivados de los mismos son usados como agentes terapéuticos inhibidores amiloides. Los péptidos de la invención, sus fragmentos, análogos y derivados pueden ser sintetizados por lo tanto utilizando técnicas estándar (por ejemplo, usando un sintetizador automatizado). En una realización preferida, los péptidos específicos de la invención, sus fragmentos, análogos o derivados pueden ser usados por lo tanto para unir o secuestrar Aβ amiloide, inhibir la formación, depósito, acumulación y/o persistencia de Aβ amiloide en un paciente dado. Análogamente, en otra realización preferida, los anticuerpos anti-idiotípicos

15 preparados contra los péptidos de la invención, sus fragmentos, análogos o derivados, (como se describe con anterioridad) pueden ser proporcionados a un paciente humano como agentes de unión Aβ o anticuerpos secuestrantes potenciales, que pueden romper o inhibir la formación, depósito, acumulación y/o persistencia de Aβ amiloide en el paciente dado.

Una formulación para ser usada en el tratamiento de amiloidosis Aβ comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un péptido de la invención, un fragmento, análogo o derivado del mismo, un anticuerpo anti-idiotípico o un fragmento de anticuerpo anti-idiotípico que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente otros anticuerpos o conjugados. Para una administración parenteral, las formulaciones preferidas incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas esterilizadas, que pueden 25 contener agentes o excipientes auxiliares que son conocidos en la técnica. Las formulaciones de anticuerpos antiidiotípicos pueden ser administradas usando modos convencionales de administración que incluyen, pero sin limitación, tópica, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, oral, intralinfática, intramuscular o intralumbar. La administración intravenosa es preferida. Las formulaciones farmacéuticas como comprimidos, píldoras, cápsulas, cápsulas de gelatina blandas y duras, pastillas, bolsitas, sellos, cápsulas vegetarianas, gotas líquidas, elíxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, bolsas de té, aerosoles (como un sólido o en un medio líquido), supositorios, soluciones inyectables esterilizadas, polvos envasados esterilizados pueden ser preparados según método rutinarios y son conocidos en la técnica. La administración de esta composición puede ser por vías orales o diversas parenterales como las vías subcutánea, intravenosa, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdermal, anal o bucal. La administración parenteral puede ser mediante inyección de bolos o mediante perfusión

35 gradual a los largo del tiempo. Los modos preferidos de administración de las formulaciones de péptidos de la invención, sus fragmentos análogos o derivados es mediante administración oral, intravenosa o aplicación intranasal.

Los péptidos de la invención, sus fragmentos análogos y derivados pueden ser administrados en la forma de una formulación farmacéutica por cualquier medio que consiga su finalidad prevista, por ejemplo, para tratar patologías como la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades amiloides Aβ, u otras patologías relacionadas. Las formulaciones terapéuticas pueden ser una diversidad de formas de dosificación, dependiendo la forma preferida del modo de administración y la aplicación terapéutica. La dosificación óptima, longitud, duración y modos de administración para un paciente individual pueden ser fácilmente determinados mediante protocolos convencionales,

45 conocidos por los expertos en la técnica.

Debe entenderse que la dosificación del péptido de la invención, su fragmento, análogo y derivado administrados in vivo o in vitro dependerán de la edad, sexo, salud y peso del receptor, tipo de tratamiento concurrente (si lo hay), frecuencia del tratamiento y de la naturaleza del efecto deseado. La dosificación más preferida estrá adaptada al sujeto individual, como es comprendido y determinable por un experto en la técnica, sin una experimentación excesiva.

Un régimen típico para prevenir, suprimir o tratar patologías, como amiloidosis de enfermedad de Alzheimer comprende la administración de una cantidad eficaz de un péptido de la invención, fragmento, análogo o derivado

55 del mismo, administrado durante un período de uno a varios días hasta incluir entre una semana y aproximadamente 72 meses.

La dosis total requerida para cada tratamiento puede ser administrada en dosis múltiples o en una dosis única. Un péptido de la invención, fragmento, análogo o derivado del mismo puede ser administrado solo o en combinación con otros agentes terapéuticos dirigidos a las patologías, como enfermedad de Alzheimer u otras enfermedades amiloides Aβ, como se describe en la presente memoria descriptiva.

Las cantidades eficaces de un péptido de la invención, fragmento, análogo o derivado del mismo, son de aproximadamente 0,01 μg a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal y, preferentemente, de 65 aproximadamente 10 μg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal como 0,05, 0,07, 0,09, 0,1, 0,5, 0,7, 0,9, 1,

2, 5, 10, 20, 35, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/kg.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un péptido de la invención o un anticuerpo antiidiotípico pueden incluir soluciones adecuadas para una administración por vía intravenosa, subcutánea, dermal,

5 nasal, oral, mucosal, rectal o mediante inyección o por vía oral y pueden contener de aproximadamente 0,01 a 99 %, preferentement6e de aproximadamente 20 a 75 por ciento de componente activo (es decir o anticuerpo) junto con el excipiente. Las composiciones farmacéuticas para una administración oral incluyen píldoras, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gelatina duras y blandas, pastillas, bolsitas, sellos, cápsulas vegetarianas, gotas líquidas, elixires, suspensiones, emulsiones soluciones y jarabes.

El péptido de la invención, fragmento, análogo y derivado del mismo para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis Aβ del sistema nervioso central puede ser modificado para que atraviese la barrera sanguínea del cerebro. Diversas modificaciones son conocidas en la técnica para aumentar el transporte a través de la barrera sanguínea del cerebro (para exámenes de estas modificaciones, véase, por ejemplo Pardridge W.M.

15 (1994) Trends in Biotechnol. 12:239-245; Van Bree, J. et al (1993) Pharm World Sci. 15:2-9; y Pardridge W.M. (1992) Pharmacol. Toxicol. 71:3-10). Una propuesta aumentas la lipofilicidad (log T del péptido mediante enlace covalente del amino o carboxilo terminal a un grupo ácido graso o acilo (como acetilo). Otra propuesta es conjugar el péptido a una proteína que normalmente experimenta una transcitosis mediada por absorción o transitosis mediada por receptores a través de la barrera sanguínea del cerebro. Estas proteínas incluyen ligandos para receptores endoteliales de capilaridad cerebral como un anticuerpo monoclonal para el receptor de transferrina, histonas, biotina, folato, niacina, ácido pantoténico o glicopéptidos. Otra propuesta es unir el péptido a un compuesto con carga positiva elevada como lisina, polilisina, arginina, poliarginina, péptido de glicina-arginina, putrescina, espermidina, espermina, etc., todos los cuales se conoce que facilitan el cruzamiento a través de la barrera sanguínea del cerebro, presumiblemente uniéndose a un receptor.

25 Otra propuesta para mejorar el transporte por la barrera sanguínea del cerebro de péptidos es la encapsulación en un vector portador como liposoma o microesferas polímeras, preferentemente con carga positiva por la misma razón anteriormente descrita. El vector portador puede ser modificado también para receptores dianas de transporte por la barrera sanguínea del cerebro, como el receptor de transferrina, uniendo el péptido, por ejemplo, a un anticuerpo contra el receptor de transferrina.

Otra aproximación es administrar conjuntamente el péptido con agentes que permeabilizan la barrera sanguínea del cerebro, como bradiquinina o un agonista de bradiquinina.

35 El fármaco permeable a la barrera sanguínea del cerebro es una característica deseable de los fármacos para el sistema nervioso central en general. Sin embargo, las realizaciones descritas no tienen que cumplir necesariamente los requisitos de permeabilidad por la barrera sanguínea del cerebro con el fin de cumplir las finalidades previstas (es decir, tratamiento eficaz de la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis). El secuestro principal de Aβ por los péptidos de la invención, sus fragmentos, análogos y derivados y anticuerpos anti-idiotípicos dará lugar al desplazamiento de Aβ desde el cerebro hasta la circulación periférica, agotando la Aβ cerebral, inhibiendo la formación de fibrilas amiloides de Aβ en el cerebro y/o provocando la disolución de fibrilas de Aβ amiloide cerebral. Esto es debido, como se demostró en los estudios previos, al hecho de que la Aβ atraviesa libremente la barrera sanguínea del cerebro (Poduslo et al., Neurobiol. Dis. 4:27-34, 1997; Ghilardi et al., Neuroreport 17:2607-11, 1996; Pluta et al., Neurorepbrt. 7:1261-51996, 1996; Zlokovic, Neurobiol Dis. 4:23-6, 1996).

45 El péptido de la invención, fragmento, análogo y derivado del mismo para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis Aβ del sistema nervioso central puede ser administrado de diversas formas. Los métodos de administración incluyen, pero sin limitación, la administración sistémica, administración parenteral (es decir, A través de las vías intraperitoneal, intravenosa, perioral, subcutánea, intramuscular, intraarterial, intradermal, intramuscular, intranasal epidural u oral. En una realización preferida, el compuesto del grupo de secuencias A, B o C, su fragmento, análogo o derivado puede ser directamente administrado al fluido cerebro espinal a través de inyección intraventricular. En una realización específica, puede ser deseable administrar un péptido de la invención, su fragmento, análogo y derivado localmente a la zona o tejido que necesita el tratamiento: esto se puede conseguir, por ejemplo, y sin carácter limitativo, mediante infusión local durante una cirugía por aplicación tópica, por inyección,

55 por infusión, usando una cánula con una bomba hosmótica por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de un implante.

Todavía, en otra realización de un péptido de la invención, fragmento, análogo o derivado del mismo, puede ser administrado en un sistema de liberación controlada, como una bomba osmótica bien calibrada. Todavía, en otra realización, puede ser colocado un sistema de liberación controlada en las proximidades del agente terapéutico, por ejemplo, el cerebro, requiriendo así solamente una fracción de la dosis sistémica.

Todavía, en otro aspecto, los compuestos peptidomiméticos modelados a partir de los péptidos de la invención identificados como Aβ de unión u otras proteínas amiloides, sirven como potentes inhibidores de la formación,

65 depósito, acumulación y/o persistencia de amiloides en la enfermedad de Alzheimer y otras amiloidosis Aβ. La modelación peptidomimética se realiza mediante procedimientos estándar conocidos por los expertos en la técnica. Estos compuestos peptidomiméticos pueden ser administrados con formulaciones, dosificaciones, frecuencias, longitudes y vías como se indicó anteriormente, para los fines terapéuticos de tratar la amiloidosis Aβ.

5 Aplicaciones de diagnóstico

En los métodos descritos la Aβ amiloide puede ponerse en contacto con un péptido descrito in vitro o in vivo. La expresión “ponerse en contacto” está destinada a abarcar tanto la incubación del péptido como los anticuerpos antiidiotípicos con la preparación de Aβ amiloide in vitro y el suministro del péptido y los anticuerpos anti-idiotípicos a un

10 sitio in vivo mientras está presente la Aβ amiloide. Como los péptidos y los anticuerpos anti-idiotípicos interacciónan con la Aβ amiloide, pueden ser usados para detectar Aβ amiloide, tanto in vitro como in vivo. Consecuentemente, los compuestos pueden ser usados como agentes de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de Aβ amiloide en una muestra biológica o in vivo en un sujeto. Además de ello, la detección de Aβ amiloide usando los compuestos puede ser usada para diagnosticar amiloidosis Aβ en un sujeto.

15 En una realización, se usa un compuesto in vitro para detectar y cuantificar Aβ amiloide en una muestra (como fluido cerebro espinal de un paciente de AD, paciente que se sospecha que tiene AD, una persona con un historial familiar de AD o un adulto normal). Para ayudar a la detección, el compuesto puede ser modificado con un sustrato detectable. La Aβ amiloide en la muestra puede ser inmovilizado y el compuesto con la sustancia detectable se pone

20 en contacto con la Aβ amiloide inmovilizado o muestra, como en secciones de tejidos. El compuesto sin unir restante es retirado y el compuesto unido a Aβ puede ser detectado. Alternativamente, el compuesto sin unir que es inversamente proporcional al compuesto unido y, por tanto, la cantidad de Aβ en la muestra puede ser detectada por diversos medios, como espectrometría de masas y otras determinaciones espectrométricas que incluyen fluorescencia, fosforescencia y absorbancia de diversas longitudes de onda desde UV hasta infrarrojos,

25 disminuyendo hasta radioondas como la de RMN. Por ejemplo, la sustancia detectable puede ser biotina (es decir, un péptido biotinilado con terminación amino de la invención) puede ser detectado usando avidina marcada con enzima. La enzima, a su vez, cuando es posteriormente expuesta a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de forma que se produzca un resto químico que puede ser detectado, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden ser usadas para marcar detectablemente

30 el anticuerpo incluyen, pero sin limitación malato deshidrogenasa, nucleasa estafilococal, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol de levadura deshidrogenasa, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rabanillo, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección se puede realizar mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromógeno para la enzima. La detección se

35 puede realizar mediante métodos colométricos que emplean un sustrato cromógeno para la enzima. La detección se uede realizar también mediante una comparación visual del alcance de la reacción enzimática de un sustrato con patrones análogamente producidos (véase Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988; Ausubel et al, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, N.Y. 1987, 1992).

40 Los compuestos descritos seleccionados, pueden ser usados también para detectar de forma cuantitativa o cualitativa Aβ amiloide en una muestra biológica. Esto se puede realizar mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un compuesto descrito marcado por fluorescencia acoplado a una detección microscópica de luz, citométrica de flujo o fluorométrica.

45 La detección se puede realizar usando cualquiera de una diversidad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, mediante radiomarcado del compuesto. Una buena descripción de este ensayo se puede encontrar en in Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work et al, North Holland Publishing Company, NY (1978), con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" por Chard. El isótopo radioactivo puede ser detectado por medios como el uso de un contador gamma, un contador de

50 centelleo o mediante auto-radiografía.

Está contemplado también marcar el compuesto con un compuesto fluorescente. Cuando el compuesto marcado por fluorescencia es expuesto a luz a una longitud de onda apropiada, su presencia puede ser seguidamente detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos marcadores fluorescentes más comúnmente usados están

55 isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, haloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina, que están disponibles en el comercio, por ejemplo, en la entidad (Eugene, Oregon, U.S.A.).

Los compuestos pueden ser también detectablemente marcados acoplándolos a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del compuesto etiquetado por quimioluminiscencia es seguidamente determinada detectando la

60 presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato.

Análogamente, puede ser usado un compuesto bioluminiscente para marcar el compuesto. La bioluminiscencia es 65 un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimiolumisniscente. La presencia de una proteína bioluminiscente es determinada mediante la detección de la presencia de luminiscencia. Compuestos biluminiscentes importantes para los fines de marcado son luciferina, compuestos fosforados y aecuorina.

5 Los compuestos pueden ser usados también de forma histológica, como en microscopía de inmunofluorescencia inmunoelectrónica, para la detección in situ de Aβ amiloide. La toma de una muestra histológica de un paciente y la provisión de un compuesto marcado como una muestra se puede realizar mediante detección in situ. El compuesto es preferentemente proporcionado aplicando o sobreponiendo el compuesto marcado o fragmento) a una muestra biológica. Mediante el uso de este procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de Aβ amiloide sino también su distribución en el tejido examinado. Por tanto, los expertos en la técnica apreciarán que cualquiera de una amplia diversidad de métodos histológicos (como procedimientos de tinción) pueden ser modificados con el fin de conseguir esta detección in situ.

Los compuestos que interaccionan con Aβ, o sus derivados, se describen también en la presente memoria

15 descriptiva. Los compuestos pueden ser usados para un cierto número de aplicaciones de diagnóstico y/o terapéuticas importantes, como se describe en la presente memoria descriptiva. En una aspecto, pueden ser utilizados péptidos que se unen a Aβ para un análisis de transferencia de ligandos (usando técnicas de transferencia de ligandos estándar conocidas por los expertos en la técnica) para detectar la presencia de fragmentos de proteína Aβ amiloide en tejidos humanos y en tejidos de otras especies. El análisis de transferencia de ligandos puede ser usado también para determinar el tamaño aparente de cada fragmento de proteína amiloide. Además, la transferencia de ligando seguida de densitometría de exploración (conocida por los expertos en la técnica) puede ser usada para cuantificar y comparar niveles de cada uno de los péptidos en las muestras de tejidos, fluidos biológicos

o biopsias obtenidas de individuos con enfermedades específicas (como enfermedades amiloides) en comparación

con muestras de tejidos, fluidos biológicos o biopsias obtenidas de individuos normales o testigos. Los fluidos 25 biológicos incluyen, pero sin limitación, sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, esputo, saliva, orina y heces.

En otra realización se usa un compuesto in vivo para detectar y, si se desea, cuantificar el depósito de Aβ amiloide en un sujeto, por ejemplo, para ayudar en el diagnóstico de amiloidosis Aβ en el sujeto. Para ayudar a la detección, el compuesto puede ser modificado con una sustancia detectable, preferentemente 99mTc o yodo radioactivo. Los métodos para marcar compuestos péptidos con tecnecio son conocidos en la técnica. Puede ser escogido un grupo modificador que proporcione un sitio en el que se pueda introducir un grupo quelante pata 99mTc, como un derivado de ácido cólico, que tiene un grupo amino libre. También se proporcionan péptidos de la invención marcados con yodo radioactivo a través de su aminoácido aromático, que está ya presente o es incorporado, para los fines de marcado. Cualquiera de los diversos isotípicos de yodo radioactivo puede ser incorporado para crear un agente de

35 diagnóstico. Preferentemente, puede ser usado 123I (semivida =13,2 horas) para escintigrafía corporal completa, 124I (semivida = 4 días) para 18F para tomografía de emisión de positrones (PET), 125I (semivida = 60 días) para estudios de trastornos metabólicos y 131I (semivida =8 días) para un recuento corporal completo y estudios de formación de imágenes de baja resolución retardados.

Listado de secuencias

<110> PROTEOTECH, INC

<120> PÉPTIDOS PEQUEÑOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD DE ALZHEIMER Y OTROS

TRASTORNOS DE FIBRILOGÉNESIS DE PROTEÍNA BETA-AMILOIDE 45 <130> P40769EP2/NJL

<150> US11/016,706

<151>

<150> US60/615,614

<151>

<150> US60/554,342

<151>

<150> US60/531,406

<151>

<160> 89 55 <170> PatentIn ver. 3.2

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

<210> 2

<211> 12

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<400> 2

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<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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15 <210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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<212> PRT

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Mus musculus

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<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 55 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético 15 <400> 60

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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Secuencia Artificial 10 <220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

<220>

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<220> .

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

<220>

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Péptido sintético 30 <220>

<221> VARIANT

<222> (8)..(8)

<223> /replace=""

<400> 89

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un péptido, que consiste en Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-NH2.

   5 2. El péptido de la reivindicación 1, en que el péptido está compuesto por L- o D-aminoácidos.
2. 3. El péptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que uno o más de los aminoácidos están N-metilados.

3. 4.

   Un péptido que consiste en Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-NH2 o un anticuerpo específico para un péptido de este 10 tipo para ser usado en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por fibrilogénesis de Aβ.

4. 5. El péptido o anticuerpo de la reivindicación 4, en que la enfermedad es enfermedad de Alzheimer.

5. 6.

   El péptido o anticuerpo de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el péptido está compuesto por L- o D15 aminoácidos.

6. 7. El péptido o anticuerpo de las reivindicaciones 4, 5 ó 6, en que uno o más de los aminoácidos están N-metilados.
7. 8. El péptido o anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende adicionalmente un 20 vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. 9. El péptido o anticuerpo de una cualquiera de las reinvindicaciones 4 a 8, que se formula para una administración mediante una vía seleccionada del grupo ue consiste en oral, aerosol nasal, lavado, inyección subcutánea, inyección interperitoneal, inyección intramuscular, inyección parenteral e infusión.

9. 10.

   El péptido o anticuerpo de la reinvindicación 9, que se formula como un aerosol nasal.

10. 11.

    Uso de un péptido que consiste en Arg-Val-Ala-Val-Ile-Met-Gly-NH2 o un anticuerpo específico para un péptido

    de este tipo péptido en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad caracterizada por 30 fibrilogénesis de Aβ.
11. 12. El uso de la reivindicación 11, modificado mediante las características de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.

    35 13. Una composición farmacéutica, que comprende un péptido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. 14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente un compuesto complementariamente activo.