ES2393877T3

ES2393877T3 - Derivados de epoxi-guayano y tratamiento del cáncer

Info

Publication number: ES2393877T3
Application number: ES08869946T
Authority: ES
Inventors: John A. Beutler; Ranjala Ratnayake; David Covell; Tanya R. Johnson
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2008-01-04
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2012-12-28
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: US8410292B2; AU2008347299B2; AU2008347299C1; DK2235021T3; AU2008347299A1; CA2711434C; CA2711434A1; EP2235021A1; EP2235021B1; WO2009088854A1; JP5547653B2; JP2011508779A; US20100286259A1

Abstract

Un compuesto de la fórmula (I) : o un epímero del mismo, en el que Ar es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con un alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro; X es O, NH o S; R2 y R3 son independientemente un alquilo C1-C6;R1 es isopropilo o isopropilidenilo; "a" es un enlace sencillo o un doble enlace;cuando “a”es un doble enlace, R4 es hidrógeno y R5 es halo o H;cuando “a” es un enlace sencillo,R4 se selecciona del grupo que consiste en halo, hidroxi o alcoxi C1-C6 yR5 es halo o H; y R6 es alquilo C1-C6 o hidroxialquilo C1-C6.

Description

Derivados de epoxi-guayano y tratamiento del cáncer

Antecedentes de la invención

El cáncer es una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, el cáncer renal contribuye significativamente a la

5 morbilidad y mortalidad, habiéndose estimado la notificación de 51.190 nuevos casos y 12.890 muertes en los Estados Unidos durante 2007. Se han hecho esfuerzos por identificar y aislar medicamentos procedentes de materiales vegetales para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en las regiones tropicales y subtropicales del mundo se han encontrado un gran número de especies del género Phyllanthus y algunas de ellas se han usado en la medicina tradicional.

10 Por consiguiente, existe un deseo para identificar o producir nuevos tratamientos para el cáncer, en particular para el cáncer renal.

La técnica anterior, Ratnayake R. et al., Org. Lett., 11, 57-60 (2009) divulga la englerina A y B. Además, el documento EP 1 749 830 A1 divulga determinados derivados curcumol, composiciones que comprenden los mismos y el uso de los mismos en la fabricación del medicamento.

15 Breve resumen de la invención

La invención proporciona compuestos aislados o purificados de la fórmula:

Englerina A y

20 Englerina B. La presente invención también proporciona un compuesto de la fórmula (I):

o un epímero del mismo, en el que Ar es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con un alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro;

25 X es O, NH o S; R2 y R3 son independientemente un alquilo C1-C6; R1 es isopropilo o isopropilidenilo; "a" es un enlace sencillo o un doble enlace; cuando “a” es un doble enlace, R4 es hidrógeno y R5 es halo o H;

30 cuando “a” es un enlace sencillo, R4 se selecciona del grupo que consiste en halo, hidroxi o alcoxi C1-C6 y R5 es halo

o H;

y R6 es alquilo C1-C6 o hidroxialquilo C1-C6.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de la invención. La presente invención también proporciona un compuesto y/o una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, en particular, el cáncer renal en un

5 animal, que comprende la administración al animal de una cantidad efectiva del compuesto.

Breve descripción de diferentes vistas de los dibujos

La Fig. 1A-II muestra las curvas dosis-respuesta para la englerina A frente a varias líneas celulares de cáncer en un ensayo con 60 líneas celulares de cáncer. La figa 1A muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de leucemia. La Fig. 1B muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de cáncer de pulmón no 10 microcítico. La Fig. 1C muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de cáncer de colon. La Fig. 1D muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de melanoma. La Fig. 1E muestra las curvas dosisrespuesta frente a líneas celulares de cáncer de próstata. La Fig. 1F muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de cáncer renal. La Fig. 1G muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de cáncer de mama. La Fig. 1H muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de cáncer del SNC. La Fig. 1L

15 muestra las curvas dosis-respuesta frente a líneas celulares de cáncer de ovario.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con una realización, la invención proporciona compuestos aislados o purificados de las fórmulas:

Englerina A y

Englerina B.

Los compuestos anteriores se pueden aislar o purificar de fuentes naturales, por ejemplo, de la corteza de la raíz y de la corteza del tallo de la planta Phyllanthus engleri Pax (Euphorbiaceae). Esta especie tiene una larga historia como planta tóxica. El libro "Common Poisonous Plants of East Africa" (B. Verdcourt & E.C. Trump, 1969) señala

25 que la raíz y la corteza de esta planta son tóxicas y letales cuando se fuman. Esta propiedad se ha usado para cometer suicidios. Los trabajos experimentales han descubierto que el extracto etanólico es tóxico para conejos por las vías oral e intravenosa. La corteza y la raíz son tóxicas para las ovejas y para el ganado. No se han identificado los principios tóxicos.

Los compuestos anteriores se pueden aislar de la planta mediante cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo,

30 por extracción en disolventes y cromatografía, como se ilustra en los Ejemplos. De acuerdo con una realización de la invención, el compuesto aislado o purificado tiene una pureza de al menos el 50 % o más, por ejemplo, el 60 % o más, el 70 % o más, el 80 % o más, o el 90 % o más. Por ejemplo, los compuestos o epímeros aislados o purificados pueden tener una pureza de aproximadamente el 60 % al 100 %, preferiblemente desde aproximadamente el 80 % hasta el 99 % y más preferiblemente desde aproximadamente el 90 % hasta el 100 % en peso.

35 De acuerdo con otra realización, la invención proporciona un compuesto de la fórmula (I):

o un epímero del mismo, en el que Ar es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro; X es O, NH o S;

5 R2 y R3 son independientemente un alquilo C1-C6;

R1 es isopropilo o isopropilidenilo;

"a" es un enlace sencillo o un doble enlace;

cuando “a” es un doble enlace, R4 es hidrógeno y R5 es halo o H

cuando “a” es un enlace sencillo, R4 se selecciona del grupo que consiste en halo, hidroxi o alcoxi C1-C6 yR5 es halo

10 o H; y R6 es alquilo C1-C6 o hidroxialquilo C1-C6.

En una realización específica, R6 es hidroxialquilo C1-C6, en particular hidroxialquilo C1-C3. De acuerdo con una realización, el compuesto de fórmula (I) es

15 o un epímero del mismo.

De acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones, R5 puede ser halo, es decir, fluoro, cloro, bromo o yodo, en particular cloro.

En cualquiera de las reivindicaciones de la invención, Ar puede ser fenilo, naftilo o antracenilo, fenilo opcionalmente sustituido con alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro. En una realización particular, Ar es fenilo, 20 opcionalmente sustituido con alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro.

En cualquiera de las reivindicaciones de la invención, X es preferiblemente O.

En cualquiera de las reivindicaciones de la invención, R1 es en particular isopropilo.

En cualquiera de las reivindicaciones de la invención, "a" es un doble enlace o un enlace sencillo. Cuando “a” es un doble enlace, el doble enlace puede ser E, Z o una mezcla de E y Z (es decir., E/Z). En realizaciones donde "a" es 25 un enlace sencillo, R4 es hidroxi, cloro o etoxi.

En otra realización, la invención proporciona un compuesto de fórmula (I) o un epímero del mismo, en donde R6 es alquilo C1-C6, en particular, alquilo C1-C3.

En cualquiera de las reivindicaciones de la invención, R2 y R3 son en particular metilo. Ejemplos específicos del compuesto de la fórmula I son:

2’-Cloroenglerina A,

2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímeros 1, 2, 3 ó 4),

2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímeros 1 ó 2) y

2’-Cloro, 3’-etoxidihidroenglerina A, en el que el doble enlace "a" en la 2’-cloroenglerina A puede ser E, Z o una mezcla de E y Z. 2’-cloro,3’hidroxidihidroenglerina A (epímeros 1-4) tienen la misma estructura planar pero son epímeros entre sí. 2’,3’

10 diclorodihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) tienen la misma estructura planar pero son epímeros entre sí.,

Los compuestos de fórmula I pueden prepararse mediante cualquier metodología de síntesis adecuada. Por ejemplo, en una vía semisintética, se pueden introducir varios grupos éster [Ar-C(R4)-a-C(R5)-C(=O)-O-] en el derivado guayano después de la hidrólisis de los grupos éster de origen natural. La esterificación puede llevarse a cabo en el grupo hidroxilo mediante los procedimientos conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, mediante el uso de

15 un cloruro de ácido o un anhídrido ácido y una base adecuada. Los restos éster deseados se pueden preparar a partir de restos cinamoílo adecuados. Las englerinas halogenadas pueden prepararse halogenando las englerinas aisladas o purificadas o durante el aislamiento o la purificación.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto o epímero como se ha descrito anteriormente. La invención también proporciona un

20 compuesto y/o una composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer en un animal que comprende una cantidad efectiva de un compuesto o un epímero de cualquiera de las reivindicaciones descritas anteriormente. El cáncer puede ser cualquier cáncer adecuado, por ejemplo, cáncer renal, cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer del SNC, leucemia, cáncer de próstata, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de colon o melanoma, en particular, cáncer renal, cáncer de SNC, cáncer de mama y cáncer de ovario.

25 De acuerdo con una realización de la invención, las englerinas, en particular la englerina A, la 2’-cloroenglerina A, la 2’-cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) y la 2’,3’-diclorodihidroenglerina A (epímeros 1 y 2), son activas, por ej., reduciendo el crecimiento de las líneas celulares de cáncer renal, por ej., 786-0, A-498, ACHN, CAKI-1, RXF 393, SN 12C y UO-31. La 2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímeros 3 y 4) es activa, por ej., reduciendo el crecimiento de la línea celular de cáncer renal UO-31. De acuerdo con una realización, la englerina A, la 2’

30 cloroenglerina A, la 2’-cloro,3’-hidroxi-dihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) y la 2’,3’-diclorodihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) con activas, por ej., reduciendo el crecimiento de las líneas celulares de cáncer de mama, por ej., HS 578T, NCI/ADR-RES y BT-549. De acuerdo con una realización de la invención, la englerina A, 2’-cloroenglerina A, la 2’-cloro, 3’-hidroxidihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) y la 2’,3’-diclorodihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) son activas contra las líneas celulares del SNC, por ej., SF-268, SF-295 y/o SNB-75. De acuerdo con una realización, la

35 englerina A, la 2’-cloroenglerina A, 2’-cloro, 3’-hidroxidihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) y la 2’,3’diclorodihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) son activas, por ej., disminuyendo el crecimiento de las líneas celulares de

cáncer de ovario, por ej., OVCAR-8. Por ejemplo, estos compuestos tienen un GI50 o IC50 de 1 1M o menos, preferiblemente, 0,1 1M o menos.

Como se usa en la presente invención, el término "tratar" no implica necesariamente la eliminación completa del cáncer, sino que existen varios grados de tratamiento de los cuales el experto con conocimientos comunes en la materia reconoce que tienen un efecto beneficioso o terapéutico. A este respecto, el cáncer se puede tratar en cualquier grado con el presente compuesto y/o composición farmacéutica de la presente invención. Por ejemplo, al menos el 10 % (por ej., al menos el 20 %, el 30 % o el 40 %) del crecimiento de un tumor canceroso se inhibe deseablemente con la administración de un compuesto descrito en la presente memoria. Preferiblemente, al menos el 50 % (por ej., al menos el 60 %, el 70 % o el 80 %) del crecimiento de un tumor canceroso se inhibe con la administración de un compuesto descrito en la presente memoria. Además, o alternativamente, el compuesto de la invención y/o la composición farmacéutica se pueden usar para inhibir las metástasis de un cáncer.

De acuerdo con la invención, el término "animal" incluye un mamífero, tal como, sin limitación, el orden Rodentia, tales como ratones, y el orden Lagomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos procedan del orden Carnivora, como felinos (gatos) y caninos (perros). Se prefiere mejor que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, como bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perissodactyla, como equinos (caballos). Se prefiere mejor que los mamíferos sean del orden Primates, cébidos o símidos (monos) o del orden Anthropoidea (seres humanos y simios del viejo mundo). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.

El compuesto (o epímero del mismo) puede administrarse en una dosis suficiente para tratar el cáncer. Dichas dosis son conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, the Physicians’ Desk Reference (2004)). Los compuestos se pueden administrar usando técnicas, tales como las descritas, por ejemplo, en Wasserman et al., Cancer, 36, pp. 1258-1268 (1975) y en el Physicians’ Desk Reference, 58ª ed., Thomson PDR (2004).

Las dosis adecuadas y los regímenes posológicos se pueden determinar mediante técnicas de determinación de la dosis convencionales conocidas por el experto con conocimientos comunes en la materia.

El vehículo farmacéuticamente aceptable (o excipiente) es preferiblemente uno que sea químicamente inerte frente al compuesto de la invención y que no tenga efectos secundarios detrimentales o toxicidad en las condiciones de uso. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen preferiblemente solución salina (por ej., solución salina al 0,9 %), Cremophor EL (que es un derivado del aceite de ricino y óxido de etileno de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (por ej., Cremophor EL 5 %/etanol 5 %/solución salina 90 %, Cremophor EL 10 %/solución salina 90 % o Cremophor EL 50 %/etanol 50 %), propilenglicol (por ej., propilenglicol 40 %/etanol 10 %/agua 50 %), polietilenglicol (por ej., PEG 400 40 %/solución salina 60 %) y alcohol (por ej., etanol 40 %/agua 60 %). Un vehículo farmacéutico preferido es polietilenglicol, tal como PEG 400 y en particular una composición que comprende PEG 400 40 % y agua o solución salina 60 %. La elección del vehículo vendrá determinada en parte por el compuesto en particular elegido, así como por el procedimiento en particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la presente invención.

Las siguientes formulaciones para administración oral, en aerosol, parenteral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, interperitoneal, rectal y vaginal son meros ejemplos y de ninguna manera son limitantes. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía parenteral, por ej., por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica, intratecal o intramuscular. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución del compuesto de la invención disuelto o suspendido en un vehículo aceptable adecuado para la administración parenteral, como soluciones acuosas y no acuosas, soluciones para inyectables estériles isotónicas.

En general, los requisitos para los vehículos farmacéuticamente efectivos para la administración parenteral son bien conocidos por el experto con conocimientos comunes en la materia. Ver Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ª ed., páginas 622-630 (1986). Dichas composiciones incluyen soluciones que contienen antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que dan como resultado una formulación isotónica con la sangre del receptor adecuado y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores, solubilizantes, espesantes, estabilizadores y conservantes. El compuesto se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un vehículo farmacéutico, tal como un líquido o mezcla estéril de líquidos, como agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones azucaradas relacionadas, un alcohol, tal como etanol, isopropanol (por ejemplo, en aplicaciones tópicas) o alcohol hexadecílico, glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol cetales, tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolan-4-metanol, éteres, tales como poli(etilenglicol) 400, un aceite, un ácido graso, un éster o glicérido de ácido graso o un glicérido de ácido graso acetilado con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente suspensor, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Aceites útiles para las formulaciones parenterales incluyen parafina, aceites animales, vegetales y sintéticos. Ejemplos específicos de aceites útiles en dichas formulaciones incluyen aceite de cacahuete, soja, sésamo, semilla

de algodón, maíz, oliva, vaselina y aceite mineral. Ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales son ácido oleico, ácido esteárico y ácido isosteárico. Ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados son oleato de etilo e miristato de isopropilo.

Jabones adecuados para su uso en las formulaciones parenterales incluyen sales grasas de amonio y trietanolamina de metales alcalinos y detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos, tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos, tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos y sulfosuccinatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido, (c) detergentes no iónicos, tales como, por ejemplo, aminoóxidos grasos, alcanolamidas de ácido graso y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros, tales como, por ejemplo, alquil-�-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán generalmente desde aproximadamente el 0,5 % o menos hasta aproximadamente el 25 % o más en peso de un compuesto de la invención en solución. Se pueden usar conservantes y tampones. Para minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos, con un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en dichas formulaciones variará generalmente desde aproximadamente el 5 % hasta aproximadamente el 15 % en peso. Tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácido graso de polietilensorbitán, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación del óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales pueden presentarse en envases de dosis unitarias o multidosis precintados, tales como ampollas y viales y pueden conservarse en condiciones deshidratadas por congelación (liofilizadas) que requieren sólo la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para preparaciones inyectables extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos.

Las formulaciones tópicas, como las que son útiles para la liberación transdérmica del principio activo, son bien conocidas por los expertos en la técnica y son adecuadas en el contexto de la presente invención para su aplicación a la piel.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva de un compuesto de la invención disuelto en diluyentes, tales como agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, sobres, comprimidos, pastillas para chupar, comprimidos para disolver, conteniendo cada una de ellas una cantidad predeterminada del compuesto de la invención, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y (e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y los polietilenalcoholes, con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, agente suspensor o agente emulsionante. Las formas en cápsulas pueden ser del tipo convencional de gelatina dura o blanda que contienen, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y agentes de relleno inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato cálcico y almidón de maíz. Las formas en comprimido pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma de acacia, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes tamponantes, agentes desintegrantes, agentes humectantes, conservantes, agentes saborizantes y excipientes farmacológicamente compatibles. Las formas en forma de pastilla para chupar pueden comprender el componente del compuesto en un saborizante, habitualmente sacarosa y goma de acacia o tragacanto, así como las pastillas que comprenden un compuesto de la invención en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma de acacia, emulsiones, geles y similares que contienen, además, del compuesto de la invención, dichos excipientes conocidos en la técnica.

Un compuesto o un epímero de la presente invención, solo o en combinación con otros componentes adecuados, pueden prepararse en formulaciones en aerosol, para su administración mediante inhalación. Un compuesto o un epímero de la invención se suministra en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y propelente. Los porcentajes típicos de los compuestos de la invención pueden ser desde aproximadamente el 0,01 % hasta aproximadamente el 20 % en peso, preferiblemente desde aproximadamente el 1 % hasta aproximadamente el 10 % en peso. El tensioactivo, debe ser, por supuesto, no tóxico y debe ser preferiblemente soluble en el propelente. Ejemplos representativos de estos tensioactivos son los ésteres o los ésteres parciales de ácidos grasos que contienen desde 6 hasta 22 átomos de carbono, tales como ácidos caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Se pueden emplear ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. El tensioactivo puede constituir desde aproximadamente el 0,1 % hasta aproximadamente el 20 % en peso de la composición, preferiblemente desde aproximadamente el 0,25 % hasta aproximadamente el 5 %. El equilibrio de la composición lo constituye generalmente propelente. Si se desea, también se puede incluir un vehículo, por ej., lecitina, para la administración intranasal. Estas formulaciones en aerosol pueden introducirse en propelentes presurizados adecuados, tales como diclorofluorometano, propano, nitrógeno y similares. También se pueden formular como sustancias farmacéuticas para preparaciones no presurizadas, tales como en un nebulizador o en un atomizador. Dichas formulaciones en spray pueden usarse para pulverizar la mucosa.

Además, el compuesto o epímero de la invención puede incluirse en supositorios mezclando con una variedad de bases, tales como bases emulsionantes o bases hidrosolubles. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o fórmulas en spray que contienen, además del componente del compuesto, dichos vehículos conocidos en la técnica como apropiados.

La concentración del compuesto o del epímero en las formulaciones farmacéuticas puede variar, por ej., desde menos de aproximadamente el 1 %, habitualmente a o al menos aproximadamente el 10 %, hasta del 20 % al 50 %

o más en peso y se puede seleccionar principalmente por volúmenes y viscosidades del líquido, de acuerdo con el modo particular de administración seleccionada.

Por lo tanto, una composición farmacéutica típica para la perfusión intravenosa podría contener hasta 250 ml de solución de Ringer estéril y 100 mg de al menos un compuesto de la invención. Los procedimientos actuales para la preparación de compuestos de administración parenteral de la invención son bien conocidos o evidentes para el experto en la materia y se describen más detalladamente, por ejemplo, en Remington’s Pharmaceutical Science (17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985).

El experto con conocimientos comunes en la técnica reconocerá que, además de las composiciones farmacéuticas anteriormente descritas, el compuesto de la invención se puede formular como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina o liposomas. Los liposomas pueden servir para dirigir un compuesto de la invención hasta un tejido particular, tal como tejido linfoide o células hepáticas cancerosas. Los liposomas también se pueden usar para aumentar la semivida de un compuesto de la invención. Existen muchos procedimientos para preparar liposomas, como los descritos en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) y en las patentes US-4.235.871, US-4.501.728, US-4.837.028 y US-5.019.369. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra un procedimiento de aislamiento de la englerina A y la englerina B de Phylionthus engleri de la corteza de la raíz.

La corteza de la raíz desecada se tritura y se extrae durante la noche con 1:1 (v/v) de cloruro de metileno: metanol, a continuación se lava con metanol. Los disolventes combinados se evaporan hasta sequedad in vacuo. Se obtienen 14,85 gramos de extracto a partir de 201 gramos de corteza de raíz desecada.

Fraccionamiento inicial: Se disuelven 7,1 gramos del extracto en cloruro de metileno-metanol y se recubre mediante evaporación en 70 gramos de los medios de la fase unida a diol. Este material se mezcla con hexano y se evapora adicionalmente para dar un polvo fluido exento de disolvente residual. Los medios recubiertos se empaquetan sobre un volumen similar de medios no recubiertos en un aparato de filtración en vacío y se eluyen sucesivamente con hexano, cloruro de metileno, acetato de etilo, acetona y metanol (750 ml de cada disolvente). Las fracciones sucesivas se evaporan in vacuo dando una recuperación de la masa total de 6,4 gramos (92 %). Las fracciones se ensayan para determinar la inhibición del crecimiento celular usando las líneas celulares A498/UO-31 (renal) y SF295 (SNC). La fracción de cloruro metileno (1,8 gramos) posee la actividad deseada.

Cromatografía ultrarrápida: Se disuelven 1,7 g de la fracción de cloruro de metileno del compuesto en 25 ml de cloroformo y se separa en una columna de cromatografía ultrarrápida de gel de sílice de 5 x 16, eluyendo con cloroformo (1,5 l), a continuación con una mezcla de cloroformo-metanol 4:1 (500 ml) y, por último, 1:1 cloroformometanol (500 ml) recogiendo fracciones de 25-50 ml. Las fracciones se examinan mediante cromatografía en capa fina de gel de sílice y se combinan (fracciones A-F) basándose en patrones de TLC similares (reactivo para pulverizar de vanilina-ácido sulfúrico). La fracción B (1,39 g), recogida en tubos 5-11 y la fracción C (115,0 mg) recogida en los tubos 12-15 muestran el nivel más alto de inhibición del crecimiento celular. Los principales triterpenos de la fracción B (1,39 g) se eliminan fácilmente disolviendo la fracción B en metanol y pasando a través de un cartucho de diol (SPE) y eluyendo con metanol (fracción B’). La fracción B’ y la fracción C contiene englerinas A y B como los compuestos mayoritarios.

Cromatografía líquida de alto rendimiento: Se disuelven 63 mg de la fracción C anterior en 0,9 ml de metanol y se inyectan en alícuotas de 100 1l (~7 mg/inyección) en una columna de HPLC Varian Dynamax Microsorb 60-8 C18 de 250 x 10 mm. La longitud de onda del detector es 225 nm. Condiciones de elución del disolvente (4,2 ml/min), iniciando con un 75 % de metanol, en condiciones isocráticas durante 5 minutos y cambiando a un gradiente lineal de 5 minutos desde el 75 % hasta el 85 % 10 minutos y después hasta el 100 % 20 minutos. La columna se lava con 100 % de metanol durante otros 10 minutos. Los dos picos de absorción UV principales se recogen y se evaporan in vacuo. La englerina A (35,4 mg) eluye a aproximadamente 17,7 minutos mientras que la englerina B (1,9 mg) eluye a 17,0 minutos en estas condiciones.

HPLC adicional: se usan las mismas condiciones para purificar la fracción B’ para obtener la englerina A.

Ejemplo 2

Este ejemplo muestra otro procedimiento de aislamiento de las englerinas A y B de la corteza del tallo de Phyllanthus engleri. La corteza del tallo desecada se tritura y se extrae durante la noche con 1:1 (v/v) de cloruro de metileno: metanol, a continuación se lava con metanol. Los disolventes combinados se evaporan hasta sequedad in vacuo. Se obtienen 16,57 gramos de extracto de 387 gramos de la corteza desecada.

Fraccionamiento inicial: Se disuelven 3,01 gramos del extracto en cloruro de metileno-metanol y se recubre mediante evaporación en 33 gramos de los medios de la fase unida a diol. Este material se mezcla con hexano y se evapora adicionalmente para dar un polvo fluido exento de disolvente residual. Los medios recubiertos se empaquetan sobre un volumen similar de medios no recubiertos en un aparato de filtración en vacío y se eluyen sucesivamente con hexano, cloruro de metileno, acetato de etilo, acetona y metanol. Las fracciones sucesivas se evaporan in vacuo y se ensayan para determinar la inhibición del crecimiento celular usando las líneas celulares UO-31 (renal) y SF-295 (SNC). La fracción de cloruro metileno (853 mg) posee la actividad deseada.

Cromatografía ultrarrápida: Se disuelven 0,732 g de la fracción de cloruro metileno en 10 ml de cloroformo y se separa en una columna de cromatografía ultrarrápida de gel de sílice de 5 x 14, eluyendo con cloroformo (1 l), a continuación con una mezcla de cloroformo-metanol 4:1 (500 ml) y, por último, cloroformo-metanol 1:1 (500 ml) recogiendo fracciones de 25-50 ml. Las fracciones se examinan mediante cromatografía en capa fina de gel de sílice y se combinan basándose en patrones de TLC similares (reactivo para pulverizar de vanilina-ácido sulfúrico). La fracción E (232,4 mg), que comprende los tubos 25-31, muestra el nivel más alto de inhibición de crecimiento celular.

Cromatografía líquida de alto rendimiento: 232 mg de la fracción E anterior se disuelven en 1,5 ml de dimetilsulfóxido/metanol y se inyectan en alícuotas de 250 1l (~40 mg/inyección) en una columna de HPLC Varian Dynamax Microsorb 60-8 C18 de 250 x 21,4 mm. La longitud de onda del detector es 225 nm. Condiciones de elución del disolvente (a 20 ml/min), iniciando con un 75 % de metanol, con un gradiente lineal de 5 minutos desde el 75 % hasta el 85 % 32 minutos, a continuación hasta el 100 % 36 minutos y volviendo a las condiciones iniciales 45 minutos. Los dos picos principales se recogen y se evaporan in vacuo. La englerina A eluye a aproximadamente 22 minutos y la englerina B a 25 minutos en estas condiciones. La Tabla 1 presenta los datos de 13C-RMN para las diferentes englerinas.

Ejemplo 3

Este ejemplo muestra otro procedimiento de obtención de englerinas halogenadas de la corteza de Phyllanthus engleri. La halogenación tiene lugar durante la extracción o purificación de las englerinas.

La corteza de raíz desecada se tritura y se extrae durante la noche con 1:1 (v/v) de cloruro de metileno: metanol, a continuación se lava con metanol. Los disolventes combinados se evaporan hasta sequedad in vacuo. Se obtuvieron 14,85 gramos de extracto a partir de 201 gramos de corteza de raíz desecada.

Fraccionamiento inicial: Se disuelven 2,61 gramos del extracto en cloruro de metileno-metanol y se recubre mediante evaporación en 27 gramos de los medios de la fase unida a diol. Este material se mezcla con hexano y se evapora adicionalmente para dar un polvo fluido exento de disolvente residual. Los medios recubiertos se empaquetan sobre un volumen similar de medios no recubiertos en un aparato de filtración en vacío y se eluyen sucesivamente con hexano, cloruro de metileno, acetato de etilo, acetona y metanol. Las fracciones sucesivas se evaporan in vacuo se ensayan para determinar la inhibición del crecimiento celular usando las líneas celulares UO-31 y SF-295. La fracción de cloruro metileno (612 mg) posee la actividad deseada.

Cromatografía ultrarrápida: Se disuelven 515,5 mg de la fracción de cloruro de metileno del compuesto en 10 ml de cloroformo, la cual se sospecha que contiene una impureza clorante, incluyendo HCl, y se separa en una columna de cromatografía ultrarrápida de gel de sílice de 5 x 16, eluyendo con cloroformo, a continuación con una mezcla de cloroformo-metanol 5:1 y, por último, metanol. Las fracciones se examinan mediante cromatografía en capa fina de gel de sílice y se combinan basándose en patrones de TLC similares. La Fracción E (194 mg), que comprende los tubos 15-17, muestra el nivel más alto de inhibición del crecimiento celular.

Cromatografía líquida de alto rendimiento: Se disuelven 50 mg de la fracción E anterior en 0,5 ml de dimetil sulfóxido y se inyectan en alícuotas de 10-50 microlitros en una columna de HPLC Varian Dynamax Microsorb 60-8 C18 de 10 x 250 mm. La longitud de onda del detector es 225 nm. Las condiciones de elución del disolvente comienzan con un 75 % de metanol, con un gradiente lineal 5 minutos desde el 75 % hasta el 85 % 32 minutos, posteriormente hasta el 100 % 36 minutos y de nuevo a las condiciones iniciales 40 minutos. Los picos se recogen y se evaporan in vacuo. La 2’-Cloroenglerina A eluye a aproximadamente 28 minutos en estas condiciones, mientras que la 2’-Cloro,3’hidroxidihidroenglerina A (epímeros 1 y 2) eluyen a 9 y 11 minutos, respectivamente. La 2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 1) eluye a los 23 minutos, pero no aparece completamente resuelta del resto de los componentes. De los 50 mg del material anterior, se obtienen 2,7 mg de 2’-cloroenglerina A, 1,2 mg de 2’-cloro, 3’-hidroxidihidroenglerina (epímero 1), 0,6 mg de 2’-cloro, 3’-hidroxidihidroenglerina (epímero 2) y 2,2 mg de 2’,3’-diclorodihidroenglerina A (epímero 1).

HPLC adicional: La muestra de 2’-cloroenglerina A obtenida anteriormente se purifica adicionalmente mediante HPLC usando una columna Varian Dynamax C8, eluyendo con un sistema isocrático de 80 % de acetonitrilo. Se purificaron 7,5 mg de la 2’-cloroenglerina A impura para dar 4,2 mg de 2’-cloroenglerin A pura.

Ejemplo 4

5 Este Ejemplo muestra un procedimiento de aislamiento de englerinas halogenadas de la corteza de Phyllonthus engleri. La halogenación tiene lugar durante la extracción o purificación de las englerinas.

La corteza de tallo desecada se tritura y se extrae durante la noche con 1:1 (v/v) de cloruro de metileno: metanol, a continuación se lava con metanol. Los disolventes combinados se evaporan hasta sequedad in vacuo. Se obtienen 16,57 gramos de extracto a partir de 387 gramos de corteza desecada.

10 Fraccionamiento inicial: Se disuelven 3,01 gramos del extracto en cloruro de metileno-metanol y se recubre mediante evaporación en 33 gramos de los medios de la fase unida a diol. Este material se mezcla con hexano y se evapora adicionalmente para dar un polvo fluido exento de disolvente residual. Los medios recubiertos se empaquetan sobre un volumen similar de medios no recubiertos en un aparato de filtración en vacío y se eluyen sucesivamente con hexano, cloruro de metileno, acetato de etilo, acetona y metanol. Las fracciones sucesivas se evaporan in vacuo se

15 ensayan para determinar la inhibición del crecimiento celular usando las líneas celulares UO-31 y SF-295. La fracción de cloruro metileno (853 mg) posee la actividad deseada.

Cromatografía ultrarrápida: Se disuelven 147,8 mg de la fracción de cloruro de metileno del compuesto en 2 ml de cloroformo y se separa en una columna de cromatografía ultrarrápida de gel de sílice de 2 x 16 cm, eluyendo con cloroformo, la cual también se sospecha que contiene un impureza clorante, incluyendo HCl, a continuación con una 20 mezcla de cloroformo-metanol 4:1 y, por último, metanol. Las fracciones se examinan mediante cromatografía en capa fina de gel de sílice y se combinan basándose en patrones de TLC similares (reactivo para pulverizar de vanilina-ácido sulfúrico). La Fracción (113,9 mg), que comprende los tubos 12-22, muestra el nivel más alto de inhibición de crecimiento celular. Esta fracción del compuesto se purifica mediante HPLC como en el ejemplo 1 para dar otros derivados de englerina. La Tabla 1 presenta los datos de 13C-RMN para los diversos derivados de la

25 englerina.

Los átomos de carbono de las diferentes englerinas se numeran como se indica a continuación.

2’-Cloroenglerina A, Englerina A o Englerina B (a la parte aplicable de la molécula), 2’-Cloro, 3’hidroxidihidroenglerina A (epímero 1, 2, 3 ó 4).

Tabla 1. Datos de 13C-RMN c de las englerinas (500 MHz, d4-metanol)

Nº Comp 1 Comp 2 Comp 3 Comp 4 Comp 5 Comp 6* Comp 7 Comp 8 Englerina B Englerina A

1 48,90 48,56 48,95 48,86 48,88 48,50 48,79 48,82 48,86 48,89 2 25,46 25,46 25,41 25,29 25,20 25,19 25,24 25,27 25,70 25,52 3 32,02 31,89 31,96 31,74 31,86 31,24 31,71 31,89 32,09 31,99 4 32,44 32,33 32,35 31,80 31,93 32,15 31,79 31,27 32,35 32,43 5 47,86 47,81 47,86 47,43 47,49 47,44 47,46 47,62 47,76 47,99 6 74,75 73,94 73,90 74,33 74,25 73,47 73,85 73,75 72,85 72,43 7 86,54 86,45 86,49 86,21 85,95 86,06 86,25 86,17 86,21 86,44 8 40,78 40,30 40,21 40,05 39,86 39,87 40,17 39,88 43,43 40,69 9 76,60 76,54 76,59 76,44 76,43 76,19 76,45 76,49 73,18 76,61 10 86,16 86,06 86,04 85,93 85,11 85,68 85,95 85,92 86,76 86,01 11 17,17 17,16 17,18 17,01 16,84 16,86 17,10 18,15 17,33 17,27 12 34,05 32,73 32,20 31,91 31,19 32,00 32,39 32,19 34,58 34,04 13 18,56 18,38 18,33 18,15 18,06 17,17 18,28 17,29 17,92 17,77 14 17,69 17,54 17,49 17,48 17,25 18,08 17,52 16,96 18,78 18,59 15 19,20 19,17 19,17 19,05 18,55 18,83 19,09 19,09 19,50 19,25 1' 163,45 169,13 169,06 167,23 167,05 168,70 168,27 168,17 168,37 167,26 2' 122,85 61,40 60,87 62,85 62,79 60,61 63,54 63,48 118,94 118,80

(continuación)

3'138,88 76,48 76,29 64,72 64,63 83,31 76,14 75,97 146,60 146,75 3'65,75OCH2 CH3 3'-OCH2CH3

15,05 4' 134,18 141,69 141,58 138,65 138,60 138,05 141,06 140,99 135,65 135,62 5' 131,84 128,40 128,32 129,26 129,31 128,90 128,67 128,69 129,29 129,33 6' 129,71 129,30 128,53 130,01 130,02 129,09 129,63 129,63 130,04 130,06 7' 131,60 129,40 129,35 130,59 130,67 ** 129,69 129,76 131,59 131,64 8' 129,71 129,30 128,53 130,01 130,02 129,09 129,63 129,63 130,04 130,06 9' 131,84 128,40 128,32 129,26 129,31 128,90 128,67 128,69 129,29 129,33 1" 173,97 173,96 173,98 173,93 173,95 173,46 173,95 173,95 173,94

2" 61,06 61,04 61,04 61,02 61,02 59,24 61,02 61,01 61,03

las asignaciones se hacen con ayuda de correlaciones gHMBC; ** las señales de solapamiento evitan una asignación ambigua. *Comp 1. 2’-Cloroenglerina A Comp 2. 2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímero 1) Comp 3. 2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímero 2) Comp 4. 2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 1) Comp 5. 2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 2) Comp 6. 2’-Cloro,3’-etoxidihidroenglerina A Comp 7. 2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímero 3) Comp 8. 2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímero 4)

La Tabla 2 presenta los datos de 1H-RMN de las englerinas. Tabla 2. Datos de 1H-RMN de las englerinas (500 MHz, d4-metanol)

Englerin: Comp 1 Comp 2 Comp 3 Comp 4 Comp 5

as

Nº: IH (m, J (en Hz))

1: 1,76 (m) 1,72 (m) 1,74 (m) 1,58 (m) 1,61 (m)

2a: 1,75 (m) 1,72 (m) 1,74 (m) 1,63 (m) 1,66 (m)

2b: 1,34 (m) 1,28 (m) 1,33 (m) 1,20 (m) 1,25 (m)

3a: 2,02 (m) 1,98 (m) 2,00 (m) 1,77 (m) 1,85 (m)

3b: 1,28 (m) 1,26 (m) 1,29 (m) 1,09 (m) 1,16( m)

4: 2,14 (m) 2,19 (m) 2,23 (m) 1,34 (m) 1,63 (m)

5: 1,75 (m) 1,55 (m) 1,64 (m) 1,34 (m) 1,39 (m)

6: 5,14 (d, 9,5) 5,02 (d, 10,0) 5,07 (d, 10,0) 4,80 (d, 95) 4,79 (d, 10,0)

8b: 1,89 (dd, 14,5, 3,0) 1,81 (dd, 15,0, 3,0) 1,90 (dd, 15,0, 3,0) 1,80 (dd, 14,5, 3,0) 1,82 (dd, 14,5, 3,0)

9: 5,27 (dd, 8,0, 3,0) 5,18 (dd, 8,0, 3,0) 5,23 (dd, 8,0, 3,0) 5,12 (dd, 8,0, 3,0) 5,15 (dd, 8,0, 3,0)

10

11: 0,93 (d, 7,0) 0,89 (d, 7,0) 0,93 (d, 7,0) 0,56 (d, 6,5) 0,72 (d, 7,0)

12: 1,87 (m) 1,87 (m) 1,88 (m) 1,46 (m) 1,27 (m)

13: 0,97 (d, 7,0) 0,95 (d, 7,5) 0,99 (d, 6,5) 0,84 (d, 7,0) 0,64 (d, 7,0)

14: 1,02 (d, 6,5) 0,98 (d, 7,0) 1,01 (d, 6,5) 0,89 (d, 7,0) 0,80 (d, 6,5)

15: 1,19 9 (s) 1,16 (s) 1,19 (s) 1,10 (s) 1,11 (s)

1'

2': 4,40 (d, 9,0) 4,36 (d, 9,0) 5,02 (d, 9,5) 4,98 (d, 10,0)

3': 7,94 (s) 4,88 (d, 9,0) 4,90 (d, 9,0) 5,31 (d, 9,5) 5,27 (d, 10,0)

3'-OCH2CH3

3'-OCH2CH3

5': 7,87 (da, 7,5) 7,43 (d, 7,0) 7,44 (dd, 8,0, 2,0) 7,47 (dad, 8,0, 3,0) 7,48 (dad, 7,5, 2,0)

6': 7,45 (m) 7,36 (dd, 8,0, 7,0) 7,36 (dd, 8,0, 7,0) 7,37 (m) 7,37

7': 7,45 (m) 7,31 (da, 8,0) 7,33 (d, 7,0) 7,37 (m) 7,37

8': 7,45 (m) 7,36 (dd, 8,0, 7,0) 7,36 (dd, 8,0, 7,0) 7,37 (m) 7,37

9': 7,87 (da, 7,5) 7,43 (d, 7,0) 7,44 (dd, 8,0, 2,0) 7,47 (dad, 8,0, 3,0) 7,48 (dad, 7,5, 2,0)

1''

2'' 4,15 (s)

4,13 (s) 4,13 (s) 4,12 (s)

4,12 (s)

Comp 1. 2'-Cloroenglerina A Comp 2. 2'-Cloro,3'-hidroxidihidroenglerina A (epímero 1) Comp 3. 2'-Cloro,3'-hidroxidihidroenglerina A (epímero 2) Comp 4. 2',3'-Diclorodihidroenglerina A (epímero 1) Comp 5. 2',3'-Diclorodihidroenglerina A (epímero 2)

Tabla 2 (Continuación)

Englerinas Comp 6: Comp 7 Comp 8 Englerina B Englerina A

Nº: IH (m, J (en Hz))

1: 1,74 (m) 1,61 (m) 1,62 (m) 1,70 (m) 1,73 (m)

2a: 1,74 (m) 1,18 (m) 1,67 (m) 1,70 (m) 1,71 (m)

2b: 1,32 (m) 1,60 (m) 1,21 (m) 1,18 (m) 1,30 (m)

3a: 1,99 (m) 1,76 (m) 1,86 (m) 1,94 (m) 1,98 (m)

3b: 1,28 (m) 1,05 (m) 1,18 (m) 1,24 (m) 1,25 (m)

4: 2,17 (m) 1,32 (m) 1,27 (m) 2,07 (m) 2,12 (m)

5: 1,65 (m) 1,25 (m) 1,47 (m) 1,57 (m) 1,63 (m)

8a: 2,58 (dd, 15,0, 8,5) 2,42 (dd, 15,0, 8,0) 2,40 (dd, 14,5, 8,0) 2,62 (dd, 14,0, 8,0) 2,67 (dd, 14,0, 8,0)

8b: 1,88 (dd, 15,0, 3,0) 1,81 (dd, 15,0, 3,0) 1,75 (dd, 14,5, 3,0) 1,73 (dd, 14,0, 2,5) 1,86 (dd, 14,0, 2,5)

9: 5,24 (dd, 8,5, 3,0) 5,11 (dd, 8,0, 3,0) 5,15 (dd, 8,0, 3,0) 4,02 (dd, 8,0, 2,5) 5,23 (dd, 8,0, 2,5)

10

11: 0,92 (d, 7,0) 0,62 (d, 7,0) 0,64 (d, 7,0) 0,90 (d, 7,0) 0,92 (d, 7,0)

12: 1,93 (m) 1,66 (m) 1,82 (m) 1,86 (m) 1,86 (m)

13: 1,01 (d, 7,0) 0,89 (d, 7,0) 0,77 (d, 6,5) 1,02 (d, 7,0) 1,00 (d, 7,0)

14: 1,01 (d, 7,0) 0,92 (d, 6,5) 0,78 (d, 7,0) 0,95 (d, 7,0) 0,95 (d, 7,0)

15: 1,18 (s) 1,11 (s) 1,11 (s) 1,22 (s) 1,18 (s)

3' 4,58 (d, 10,0) 4,93 (d, 8,5) 4,92 (d, 9,0) 7,67 (d, 16,0) 7,68 (d, 16,0) 3'-OCH2CH3 3,35 (c, 7,0) 3'-OCH2CH3 1,06 (c, 7,0) 4' 5' 7,39 (m) 7,39 (dd, 8,0, 2,0) 7,40 (dd, 8,0, 1,5) 7,60 (m) 7,61 (m) 6' 7,39 (m) 7,36 (dd, 8,0, 7,0) 7,35 (m) 7,39 (dad, 3,5, 3,0) 7,40 (dad, 3,5, 3,0) 7' 7,39 (m) 7,31 (d, 7,0) 7,35 (m) 7,39 (dad, 3,5, 3,0) 7,40 (dad, 3,5, 3,0) 8' 7,39 (m) 7,36 (dd, 8,0, 7,0) 7,35 (m) 7,39 (dad, 3,5, 3,0) 7,40 (dad, 3,5, 3,0) 9' 7,39 (m) 7,39 (dd, 8,0, 2,0) 7,40 (dd, 8,0, 1,5) 7,60 (m) 7,61 (m)

2" 4,13 (s) 4,12 (s) 4,11 (s) 4,14 (sa)

Comp 6. 2'-Cloro, 3'-etoxidihidroenglerina A Comp 7. 2'-Cloro, 3'-hidroxidihidroenglerina A (epímero 3) Comp 8. 2'-Cloro, 3'-hidroxidihidroenglerina A (epímero 4)

Ejemplo 5

Este Ejemplo demuestra que los compuestos o epímeros de acuerdo con las realizaciones de la invención inhiben el crecimiento celular de las líneas celulares de tumor humano.

5 La actividad biológica de las fracciones del compuesto se evalúa mediante ensayos de crecimiento celular de 2 días usando la línea renal humana sensible UO-31 y la línea celular tumoral de SNC humano no sensible SF-295. Por lo tanto, las fracciones que carecen de sensibilidad diferencial puede distinguirse fácilmente de las que son más potentes contra la línea celular renal. Los criterios de valoración principales de estos ensayos son el formazán XTT,

o alternativamente y en preferencia, la tinción de la proteína sulforhodamina B. Todas las muestras se ensayan en

10 ocho diluciones de 10 veces sin fármaco y sin controles celulares en cada placa de microvaloración. Los valores IC50 se calculan usando el software SOFTMAX™ según las instrucciones suministradas por el fabricante del lector de la

microplaca. Los resultados se presentan en la Tabla 3. Tabla 3. Datos del ensayo del crecimiento celular en líneas celulares de cáncer SF-295 y UO-31

Compuesto: SF-295 IC50 1M UO-31 IC50 1M Selectividad SF-295/UO-31

2’-Cloroenglerina A: 72 0,92 78

2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina (epímero 1): >100 0,96 >104

2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina (epímero 2): 92 8,7 11

2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 1): 90 1,2 75

2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 2): 60 0,75 80

2’-Cloro,3’-etoxidihidroenglerina A: 35 18 1,94

2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina (epímero 3): 42 0,41 102

2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina (epímero 4): 20 16 1,25

Englerina B: >100 >100 ---

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra que las englerinas y los derivados de englerina de la invención inhiben el crecimiento de células

5 de cáncer humano. Las muestras se ensayan siguiendo el protocolo estándar de las 60 líneas celulares del Instituto Nacional del Cáncer (National Cancer Institute). En primer lugar, se ensayan frente a las 60 líneas celulares en una única concentración final de 10 micromolar. A continuación, se ensayan por separado en cinco diluciones de 10 veces. La exposición al fármaco es dos días, con un criterio de valoración SRB. Los resultados se presentan en la Tabla 4.

10 Tabla 4. Potencia de varias englerinas en las líneas celulares de cáncer renal en el ensayo de 60 líneas celulares del NCI (valores GI50 1M).

Línea celular renal: 2’-Cloro-englerina A 2’-Cloro,3’-hidroxidihidro-englerina (epímero 1) 2’-Cloro,3’hidroxi-dihidroenglerina (epímero 2) 2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 1) 2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 2)

786-0: 10 1,7 11 12 12

A498: 0,028 0,18 0,66 0,14 0,049

ACHN: 0,041 0,32 1,38 0,14 0,32

CAKI-1: 0,035 0,46 9,3 0,42 0,32

RXF-393: 0,019 0,51 0,39 0,93 0,32

SN12C: 0,56 0,63 4,7 1,0 1,0

TK-10: 21 17 27 18 25

UO-31: 0,035 0,25 1,9 0,39 ---

Media: 3,96 2,58 7,07 4,09 5,55

Mediana: 0,04 0,49 3,32 0,68 0,32

Media geométrica: 0,21 0,70 3,13 0,94 0,72

Media GI-50 de las 60: 5,6 6,9 12,0 8,3 11,7

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra un procedimiento de preparación y caracterización del monoacetato de englerina B.

Una muestra (1,9 g) de englerina B se agitó en piridina (0,25 ml) y anhídrido acético (0,25 ml) durante la noche a temperatura ambiente. Los disolventes se evaporaron en vacío y el producto se extrajo en diclorometano. El producto bruto se purificó en pTLC (gel de Si 60 F254; 2 % MeOH/DCM) dando monoacetato de englerina B (2,0 mg, 95 %). Los datos de RMN se presentan en la Tabla 5. En un ensayo de 2 células, el monoacetato de englerina B mostró una selectividad de aproximadamente 400 veces frente a la línea celular de cáncer renal A498.

Tabla 5. RMN (DMSO-d6, 500 MHz) Asignaciones para el acetato de englerina B

Nº: H (m, J (Hz)) C

1: 1,68 (m) 47,1

2a: 1,64 (m) 24,1

2b: 1,17 (m)

3a: 1,93 (m) 30,5

3b: 1,15 (m)

4: 2,03 (m) 30,6

5: 1,58 (m) 45,9

6: 4,97 (d, 10,0) 70,6

7: 84,6

8a: 2,62 (dd, 14,0, 8,0) 39,4

8b: 1,72 (dd, 14,0, 1,0)

9: 5,09 (dda, 7,0) 74,3

10: 84,1

11: 0,85 (d, 7,0) 16,6

12: 1,80 (m) 32,5

13: 0,94 (d, 7,0) 17,2

14: 0,88 (d, 7,0) 18,0

15: 1,11 (s) 18,7

1’: 165,2

2’: 6,60 (d, 16,5) 117,8

3’: 7,68 (d, 16,5) 145,1

4’: 133,9

5’: 7,72 (m) 128,4

6": 7,43 (m) 128,9

7’: 7,43 (m) 130,6

8’: 7,43 (m) 128,9

9’: 7,72 (m) 128,4

1": 170,0

2": 2,05 (s) 20,8

Este ejemplo ilustra la inhibición del crecimiento de las células de cáncer renal por la englerina A, la cual mostraba 10 una excelente selectividad por la línea celular de cáncer renal en el panel celular NCI-60, teniendo 5 de las 8 líneas renales valores GI50 inferiores a 20 nM.

Tabla 6. Datos de inhibición del crecimiento celular de la englerina A

Línea celular renal: GI50, 1M

786-0: <0,01

A498: <0,01

ACHN: <0,01

CAKI-1: 15,5

RXF-393: 0,011

SN12C: 0,087

TK-10: 15,5

UO-31: <0,01

Media: 3,89

Mediana: 0,01

Media geométrica: 0,08

Media GI-50 de las 60: 2,82

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra algunas de las propiedades de la englerina A de acuerdo con una realización de la invención. La Fig. 1A-II presenta las curvas dosis-respuesta para la englerina A frente a varias líneas celulares de cáncer en un

5 ensayo de 60 líneas celulares, mostrando que el compuesto es activo contra varias líneas celulares de leucemia, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de colon, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de ovario y cáncer del SNC.

En la presente memoria se describen realizaciones preferidas de esta invención, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula (I) :

o un epímero del mismo, en el que

5 Ar es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con un alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro; X es O, NH o S; R2 y R3 son independientemente un alquilo C1-C6; R1 es isopropilo o isopropilidenilo;

10 "a" es un enlace sencillo o un doble enlace; cuando “a” es un doble enlace, R4 es hidrógeno y R5 es halo o H; cuando “a” es un enlace sencillo, R4 se selecciona del grupo que consiste en halo, hidroxi o alcoxi C1-C6 yR5 es halo o H; y R6 es alquilo C1-C6 o hidroxialquilo C1-C6.

15 2. El compuesto o el epímero de la reivindicación 1, en el que R6 es hidroxialquilo C1-C6.
3. El compuesto de la reivindicación 1 ó 2, el cual es

o un epímero del mismo.
4. El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que X es O.

20 5. El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R1 es isopropilo.
6.

El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que "a" es un doble enlace y el doble enlace es E, Z o una mezcla de E y Z.
7.

El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que "a" es un enlace sencillo.
8.

El compuesto o el epímero de la reivindicación 7, en el que R4 es hidroxi, cloro o etoxi.

25 9. El compuesto o el epímero de la reivindicación 1, el cual es:

2’-Cloroenglerina A,

2’-Cloro,3’-hidroxidihidroenglerina A (epímero 1, 2, 3 ó 4),

2’,3’-Diclorodihidroenglerina A (epímero 1 ó 2), o

2’-Cloro,3’-etoxidihidroenglerina A, en el que el doble enlace "a" en la 2’-Cloroenglerina A puede ser E, Z o E/Z.
10.

El compuesto o el epímero de la reivindicación 1, en el que R6 es alquilo C1-C6.
11.

Un compuesto de la reivindicación 1 que tiene la fórmula:

Englerina A.
12. Un compuesto de la fórmula:

Englerina B.

15 13. El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó 10, en el que Ar es fenilo, opcionalmente sustituido con un alquilo C1-C6, hidroxialquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, halo o nitro.
14.

El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 10 ó 13, en el que R2 y R3 son metilo.
15.

El compuesto o el epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 10 ó 13-14, en el que R5 es cloro.
16.

Una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto o un epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
17.

Un compuesto o un epímero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o la composición farmacéutica de 5 la reivindicación 16 para su uso en el tratamiento del cáncer en un animal.
18. El compuesto o el epímero de la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 17, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de colon, melanoma, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer del SNC y cáncer de ovario.
19.

El compuesto o el epímero de la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 17 ó 18 para el 10 tratamiento del cáncer humano.