ES2388963A1 - Desarrollo y uso de nanopartículas lipídicas conteniendo edelfosina y otros éteres de fosfolípidos en la terapia antitumoral y antiparasitaria - Google Patents

Abstract

Desarrollo y uso de nanopartículas lipídicas conteniendo edelfosina y otros éteres de fosfolípidos en la terapia antitumoral y antiparasitaria.#La presente invención proporciona composiciones que comprenden nanopartículas de origen lipídico conteniendo un éter de fosfolípidos. La invención se refiere además al uso de estas composiciones para la preparación de medicamentos para el tratamiento oral de cáncer y de la leishmaniasis. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención conllevan un notable incremento en la biodisponibilidad oral, y una mejora en el tratamiento frente al uso de un éter de fosfolípido libre, incluyendo inhibición de metástasis, lo que implica una menor dosis de tratamiento del agente antitumoral.

Description

DESARROLLO Y USO DE NANOPARTICULAS LlPIDICAS CONTENIENDO EDELFOSINA y OTROS ÉTERES DE FOSFOLíPIDOS EN LA TERAPIA ANTITUMORAL y ANTIPARASITARIA

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden nanopartículas de origen lipídico conteniendo un éter de fosfolípido y al uso de tales composiciones farmacéuticas para la preparación de medicamentos para el tratamiento oral de cáncer y de la leishmaniasis. Por lo tanto, la presente invención se engloba en el campo de la técnica de productos farmacéuticos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Dentro del grupo de los éteres de fosfolípidos, los análogos alquillisofosfolipidos sintéticos antitumorales (ALPs), de los que la edelfosina (1-0octadecil-2-0-metil-rac-glicero-3-fosfocolina, ET-18-0CH3) se ha convertido en su compuesto prototipo, representan una clase prometedora de agentes anticancerosos orales que no tienen como diana el ADN, sino que actúan a nivel de la membrana celular activando la señalización apotótica (1,2). Ejemplos de ALPs clínicamente relevantes incluyen la edelfosina, miltefosina y las nuevas moléculas perifosina y erucilfosfocolina (3,4). La edelfosina induce apoptosis selectiva en una amplia variedad de células tumorales, mientras que las células normales no se afectan, debido a que el ALP se incorpora preferentemente en la célula tumoral (1,5). Dos estructuras subcelulares, los dominios de membrana denominados "Iípíd rafts" y el retículo endoplásmico, actúan como dianas de la edelfosina, dependiendo del tipo celular. Así, la apoptosis inducida por edelfosina implica la activación intracelular del receptor de muerte Fas/CD95 y su reclutamiento, independientemente de su ligando natural FasL/CD95L, en dominios de membrana "lípíd rafts" en células leucémicas (2,5), y una respuesta de stress de retículo endoplásmico en células derivadas de tumores sólidos (6). La edelfosina se acumula en dominios "lípíd rafts" (7), promoviendo una redistribución de proteínas en estos dominios de membrana que finalmente conduce a la muerte celular. Esto ha

Ilevado a identificar la concentracion de Fas/CD95 en dominios de membrana rafts coma un nuevo modo de acci6n para farmacos antitumorales y una nueva diana en la quimioterapia del cancer (8).

Algunos ALPs han mostrado tambien actividad antiparasitaria frente a distintos tipos de Leishmania spp. En este sentido, miltefosina, registrada comercialmente coma Impavido , se ha convertido en el primer tratamiento oral efectivo de leishmaniasis visceral (9).

Una de las ventajas de la edelfosina y otros ALPs es su posibilidad de uso oral. A pesar de que la toxicidad es limitada (10), estos compuestos presentan una baja biodisponibilidad oral (11), siendo necesario administrar con una frecuencia elevada dosis de este compuesto para alcanzar niveles terapeuticos de concentracion a nivel sistemico.

El metodo de preparacion de formulaciones de liberacion controlada de medicamentos basados en excipientes lipidicos denominado Homogenizacion en caliente o "Hothomogenization"es muy interesante coma alternativa al uso de disolventes organicos, ya que no es necesario utilizar dichos disolventes,

consiguiendose asi una disminucion de la toxicidad de la formulacion final.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona composiciones que comprenden

nanoparticulas de origen lipidico conteniendo un eter de fosfolipidos, ademas del uso de estas composiciones para la preparacion de medicamentos para el tratamiento oral de cancer y de la leishmaniasis.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion conllevan un

notable incremento en la biodisponibilidad oral, y una mejora en el tratamiento frente al uso de un eter de fosfolipido libre, incluyendo inhibicion de metastasis, lo que implica una menor dosis de tratamiento del agente antitumoral.

Asimismo, otras ventajas asociadas al empleo de las composiciones de la

invencion son una menor toxicidad, un abaratamiento del tratamiento, y una reduccion en la duracion del tratamiento. Otra ventaja asociada a la invencion es que se consigue una liberacion controlada y prolongada del principio activo, reduciendo los efectos secundarios asociados al tratamiento.

Ademas, la administracion oral de las composiciones farmaceuticas de la invencion conduce a una acumulacion del eter de fosfolipido en ganglios linfaticos y en cerebro, a diferencia del eter de fosfolipido libre, lo que implica la posibilidad de tratamiento de linfomas, metastasis y tumores cerebrales.

For tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende nanoparticulas lipidicas, donde las nanoparticulas estan caracterizadas porque: tienen un tamano medio inferior a 300 nm; y comprenden al menos un eter de fosfolipido y al menos un lipido.

Una realizacion preferida de la composici6n farmaceutica comprende un eter de fosfolipido seleccionado de entre edelfosina, miltefosina erucilfosfocolina, ilmofosina, perifosina o cualquiera de sus combinaciones. Mas preferiblemente el eter de fosfolipido es edelfosina.

Otra realizacion preferida de la composici6n farmaceutica de la presente invencion comprende nanoparticulas lipidicas con un tamano medio de entre 5 nm a 270 nm, mas preferiblemente entre 20 nm y 200 nm, y aim mas preferiblemente entre 70 nm y 150 nm.

En una realizacion mas preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion, las nanoparticulas comprenden al menos un triglicerido, un glicerofosfolipido, un glicerolipido, un esfingolipido o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realizacion mas preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion, las nanoparticulas comprenden al menos compritol®

(behenato de glicerilo), precirol® (palmitostearato de glicerilo), gelucire®

(gliceridos poliglicolados), labrafac0 (trigliceridos de cadena media), labrafil® (polioxiglicerido), capryol® (caprilato de propilenglicol), lauroglycol® (laurato de propilenglicol), maisine® (monolinoleato de glicerilo), peceol® (oleato de glicerilo), transcutol® (dietilenglicol metil eter) o cualquiera de sus

combinaciones. Mas preferiblemente las nanopartfculas comprenden compritol® (behenato de glicerilo), precirol® (palmitostearato de glicerilo) o cualquiera de sus combinaciones.

La composicion farmaceutica de la presente invencion esta caracterizada

porque las nanopartfculas pueden comprender mas de un 30% en peso de lfpidos. En una realizacion mas preferida, las nanopartfculas comprenden mas de un 50% en peso de lfpidos, mas preferiblemente un 70% en peso de lfpidos, aim mas preferiblemente entre un 75% y un 95% en peso.

En otra realizacion preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion, las nanopartfculas comprenden entre un 0,1% y un 50% en peso de eter de fosfolfpido, preferiblemente entre un 5% y un 20% en peso.

Las nanopartfculas deben comprender un compuesto que tenga propiedades

tensoactivas. El eter de fosfolfpido puede actuar tambien como tensioactivo, por lo que no es necesario obligatoriamente la adicion de otro compuesto que actbe de tensioactivo, aunque preferiblemente las nanopartfculas de la presente invencion comprenden adicionalmente un tensioactivo. Preferiblemente el tensioactivo se selecciona de la lista que comprende

polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, polivinil alcohol de alto o bajo peso molecular, polivinil pirrolidona, fosfatidil colina, lecitinas, poloxameros de distintos tipos, solutol HS15, glicocolato sodico, taurocolato sodico, tauroglicocolato sodico, taurodeoxicolato sodico, hemisuccinato de colesterilo y tiloxapol. Mas preferiblemente el tensioactivo es polisorbato 80. Otra realizacion mas preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion, ademas comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable. Mas preferiblemente, la composicion farmaceutica de la invencion comprende al menos un carbohidrato. ALlin mas preferiblemente, la composicion

farmaceutica de la invencion comprende sacarosa, maltosa, trehalosa, lactosa, melibiosa o cualquiera de sus combinaciones, mas preferiblemente comprende trehalosa.

Las nanoparticulas de la composicion farmaceutica de la presente invencion pueden comprender entre un 0 y un 30% en peso de carbohidrato.

Otra realizacion mas preferida de la composici6n farmaceutica de la presente invencion comprende un diluyente.

Una realizacion aim mas preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion comprende celulosa microcristalina, lactosa o cualquiera de sus combinaciones.

En otra realizacion &lin mas preferida de la composicion farmaceutica de la presente invencion, dicha composicion esta en forma solida oral, preferiblemente en comprimidos o capsulas.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un proceso para la

manufacturacion de cualquiera de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente invencion, caracterizado porque las nanoparticulas se sintetizan por un proceso que comprende la homogenizacion en caliente (12).

En una realizacion preferida del proceso para la manufacturacion de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, la homogenizacion en caliente comprende al menos las siguientes etapas:

i) Combinar una mezcla que comprende un lipido y un eter de fosfolipido, preferiblemente a una temperatura entre 2 y 10 QC superior al punto de fusion del lipido, con una solucion acuosa que comprende entre 0 y 3% de un tensoactivo aproximadamente a la misma temperatura, y preferiblemente

dentro de un intervalo de temperatura comprendido entre 40 y 90 C.

ii) se homogeniza la mezcla obtenida, preferiblemente par sonicacion;

iii) se enfrfa la mezcla para obtener una suspension de nanopartfculas;

5 iv) se afslan la nanopartfculas, preferiblemente mediante filtracion, o mediante centrifugaci6n.

En la etapa i se mezcla el farmaco can los lfpidos, y una vez fundidos, se prepara la emulsion junto can la fase acuosa en la etapa ii. En la etapa ii se

10 forman las gotfculas que cuando se enfrfen daran lugar a las nanopartfculas, mientras que en la etapa iii las gotfculas se enfrfan, para formar las nanopartfculas. Finalmente en la etapa iv entre otras razones sirve para eliminar los excesos par ejemplo de farmaco y/o de tensioactivo no encapsulado.

15 Una realizacion aim mas preferida del proceso para la manufacturaci6n de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, ademas comprende la etapa (v), donde se liofilizan las nanopartfculas obtenidas en la etapa (iv).

20 En otra realizacion preferida del proceso para la manufacturacion de composiciones farmaceuticas de la presente invencion caracterizado porque las nanopartfculas aisladas en la etapa (iv) se resuspenden en una solucion acuosa que comprende un carbohidrato antes de Ilevar a cabo la etapa (v). Este carbohidrato puede actuar coma agente crioprotector y preferiblemente se

25 selecciona de la lista que comprende sacarosa, maltosa, trehalosa, lactosa, melibiosa y cualquiera de sus combinaciones, mas preferiblemente el carbohidrato es trehalosa.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere al uso de cualquiera de las

30 composiciones farmaceuticas descritas en la presente invencion para la preparaci6n de un medicamento.

Otro aspecto mas de la presente invencion se refiere al uso de cualquiera de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente invencion para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. Preferiblemente para el tratamiento de mieloma mUltiple, linfoma de manto,

5 leucemia linfocitica cronica, glioma, cancer de mama, cancer de prostata, y otros tumores solidos y hematologicos.

Una realizacion preferida del uso de cualquiera de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente invencion, comprende la preparacion de 10 un medicamento para el tratamiento del linfoma de manto.

ALlin otro aspecto mas de la presente invencion se ref iere al uso de cualquiera

de las composiciones farmaceuticas descritas en la presente invencion para la

preparacion de un medicamento para el tratamiento de la leishmaniasis.

15 Definiciones:

Par eter de fosfolipido segOn la presente invencion se refiere a compuestos de Formula (I):

HI —R1.

R)-0—C—IT 0

171C-0—P—O—R3

20

(I) Donde: R1 es un C12-C18 alquilo de cadena ramificada o no ramificada; R2 es C1-C8 alquilo de cadena ramificada o no ramificada;

25 yR3 es:

CH3

—CH2— CH2—N— CH3 CH3

incluyendo cualquiera de sus sales, enantiomeros y diastereomeros.

Formula (II): 5

R1-0 P-0-R2

Donde: 10 R1 es un C12-C18 alquilo de cadena ramificada o no ramificada; y R2 es:

CH3 CH2 CH;\

NCH3 CH6

N+

/ CH3

Los eteres de fosfolipidos preferidos de la presente inyencion son los analogos de la edelfosina (compuesto de formula (I)) y en especial la edelfosina (1-020 octadecil-2-0-metil-rac-glicero-3-fosfocolina, ET-18-0CH3).

Los lfpidos son un conjunto de moleculas organicas, la mayorfa de ellas presentes en los seres vivos, compuestas principalmente par carbono e hidrageno y en menor medida oxfgeno, aunque tambien pueden contener fasforo, azufre y nitrageno, que tienen coma caracterfstica principal el ser

hidrofabicas o insolubles en agua y solubles en disolventes organicos coma par ejemplo, el benceno y el cloroformo.

Ejemplos de lfpidos Utiles para la presente invencion, tanto para los que estan unidos mediante enlace tipo eter coma para los que no, son C8-C20 alquilo, can

o sin insaturaciones, acidos grasos, acilglicerido, cerido, fosfolfpidos, fosfogliceridos, fosfoesfingolfpidos, glucolfpidos, cerebrosidos, gangliosidos, terpenoides, esteroides, eicosanoides, prostaglandinas o vitaminas A, D, E y K. Entre estos lfpidos los preferidos son los seleccionados entre C8-C20 alquilo, acidos grasos, fosfolfpidos, fosfogliceridos, fosfoesfingolfpidos, y glucolfpidos.

Los lfpidos de la presente invencion deben de tener al menos un grupo capaz de ser convertido en un enlace tipo eter. Este grupo puede hallarse de forma natural en el lfpido, coma par ejemplo la presencia de un grupo alcohol, o puede haberse introducido en el lfpido mediante reacciones qufmicas pertinentes y conocidas en la tecnica.

Par lfpidos C8-C20 alquilo se entiende cadenas hidrocarbonadas que comprenden entre 8 y 20 atomos de carbono. Estas pueden ser cadena lineal o ramificada y pueden tener instauraciones, ya sean en forma de doble enlace o de triple enlace y en los que puede haber funciones hidroxilo, epoxidos o anillos

carbocfclicos. Ejemplos de estos lfpidos son octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, octadecilo y bombicol.

Par acidos grasos se entiende acidos alcanoicos de cadena lineal o ramificada que pueden Ilevar enlaces dobles o triples y en los que puede haber funciones hidroxilo, epoxidos o anillos carbocfclicos. Ejemplos de acidos grasos son el acido octanoico, el acido palmftico, el acido estearico, el acido oleico, el acido

linoleico, el acido araquidonico, el acido crepenfnico y el acido aleurftico.

For acilglicerido se entiende un grupo de moleculas que estan formadas par glicerina y uno o varios acidos grasos que forman enlaces ester can los grupos alcohol de la glicerina. Ejemplos son los monogliceridos, los digliceridos y los trigliceridos.

Par cerido se entiende un grupo de moleculas que son esteres de los acidos grasos can alcoholes de peso molecular elevado. Ejemplos son la cera de las abejas, la cera de la piel, etc.

Par fosfolipidos se entiende un grupo de moleculas que estan formadas par un lipido que contiene un grupo fosfato. Los mas abundantes son los fosfogliceridos y los fosfoesfingolipidos. Par fosfogliceridos se entiende un grupo de moleculas que estan formados par glicerina esterificada a uno o dos acidos grasos y que contiene un grupo fosfato en una de las posiciones de la

glicerina. Ejemplos son la fosfatidilcolina o lecitina, la fosfatidiletanolamina o cefalina, la fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidildiglicerol y etc. Par fosfoesfingolipidos se entiende un grupo de moleculas que estan formados par esfingosina y que contiene un grupo fosfato. Ejemplos son esfingomielina, ceramidafosforiletanolamina y esfingosina-1-fosfato.

Par glucolipidos se entiende un grupo de moleculas que estan formados par un lipido que contiene al menos un carbohidrato. Los mas abundantes son los glucoesfingolipidos que estan formados par una ceramida (acido graso + esfingosina) y un carbohidrato de cadena corta. Estos se pueden clasificar en

cerebrosidos, globosidos y gangliosidos. Par cerebrosidos se entiende par glucoesfingolipidos que contienen un Unica carbohidrato unido par una union beta-glicosidica. Ejemplos son los galactocerebrosidos que contienen galactosa coma par ejemplo la frenosina, o los glucocerebrosidos del tejido nervioso.

Los lipidos en la presente invencion, especialmente los sinteticos, actban coma agentes de liberacion controlada y su uso coma tal esta ampliamente recogido en la bibliografia (13,14). Estos lipidos son materiales solidos a temperatura

ambiente y forman una matriz inerte, de la cual el farmaco incorporado se libera lentamente en el cuerpo par erosion/difusion.

"Carbohidrato" se refiere a un derivado aldehidico o cetonico de alcoholes

polihidroxilados representados par las formulas Cn(H20)n (par ej., glucosa, C6(H20)6; sacarosa, C12(H20)11). Los carbohidratos incluyen compuestos can moleculas relativamente pequenas, tales coma los azkares simples (par ej., monosacaridos, disacaridos, etc.), asi coma sustancias macromoleculares (polimericas) coma almidon, glicogeno y polisacaridos de celulosa. Los azkares son carbohidratos (sacaridos) que tienen la composicion general (CH20)n y sus derivados simples. Si bien los azkares monomericos simples (glicosas) se describen coma polihidroxi aldehidos o cetonas, par ej., HOCH2(CHOH)4-CHO para aldohexosas (par ej., glucosa) o HOCH2-(CHOH)3-COCH2OH para 2-cetosas (par ej., fructosa), las estructuras comOnmente se escriben coma eteres ciclicos de anillo de cinco (furanosa) o seis (piranosa) miembros. Los enantiomeros D y L, asi coma los anomeros alfa y beta de los compuestos tambien estan incluidos dentro de la definicion de carbohidratos.

Los carbohidratos adecuados incluyen adonitol, arabinosa, arabitol, acido

ascorbico, quitina, D-celubiosa, 2-deoxi-D-ribosa, dulcitol, (S)-(+)-eritrulosa, fructosa, fucosa, galactosa, glucosa, inositol, lactosa, lactulosa, lixosa, maltitol, maltosa, matotriosa, manitol, manosa, melecitosa, melibiosa, celulosa microcristalina, palatinosa, pentaeritritol, rafinosa, ramnosa, ribosa, sorbitol, sorbosa, almidon, sacarosa, trehalosa, xilitol, xilosa y sus hidratos. Los

carbohidratos adecuados tambien incluyen los enantiomeros D y L, asi coma los anomeros alfa y beta de los compuestos enumerados en lo precedente. Los carbohidratos preferidos son los azkares simples (p. ej. mono-y di-sacaridos).

Ademas, en el contexto de la presente invencion, el termino "carbohidrato"

incluye no solo los propios carbohidratos sino tambien derivados de los mismos. Par ejemplo, el carbohidrato puede ser tambien un derivado tal coma un alcohol polihidrico. Ejemplos de alcoholes polihidricos adecuados incluyen etilenglicol, el cual puede ser considerado coma un derivado del monosacarido

mas simple glicolaldehfdo (CH2OH.CH0), glicerol, que es un derivado del monosacarido gliceraldehfdo (CH2OH.CHOH.CH0), pentaeritritol, que es un derivado de una aldotetrosa, alcoholes pentahfdricos tal coma xilitol, que es un derivado de la aldopentosa xilosa, y alcoholes hexahfdricos tal coma manitol, 5 que es un derivado de la aldohexosa manosa, o sorbitol, que es un derivado de cualquiera de las aldohexosas glucosa y gulosa. El carbohidrato puede ser tambien un derivado tal coma un acido de azOcar, par ejemplo acido glucuranico. Tambien se pueden usar polisacaridos o sus derivados. Ejemplo de un derivado de polisacarido adecuado son los hidrolizados de almidon, es

10 decir, jarabes de glucosa o dextrinas.

A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus

variantes no pretenden excluir otras caracterfsticas tecnicas, aditivos,

componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas

15 ycaracterfsticas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion.

20 DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Fig. 1: Evolucion de concentraciones plasmaticas de edelfosina frente al tiempo

tras la administracion de una dosis oral de 10 mg/kg de edelfosina en solucion,

en nanopartfculas lipfdicas de Precirol® ATO 5 y en nanopartfculas lipfdicas de

25 Compritol® 888 ATO a ratones BALB/c (n=6, valores medios ± D.E.)

Fig. 2: Evolucion de la concentracion plasmatica de edelfosina frente al tiempo

tras la administracion de una dosis intravenosa de 30 mg/kg de edelfosina en

nanopartfculas lipfdicas de Compritol® 888 ATO a ratones BALB/c (n=6,

30 valores medios ± D.E.)

Fig. 3: Evolucion de la concentracion plasmatica de edelfosina frente al tiempo despues de una dosis intravenosa de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 a ratones BALB/c (n=6, valores medios ± D.E.)

Fig. 4A y 4B: Biodistribucion de la edelfosina en distintos organos despues de una dosis intravenosa de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5 a ratones BALB/c (n=6)

Fig. 5A y 5B: Biodistribucion de la edelfosina en distintos organos despues de una dosis oral de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5 a ratones BALB/c (n=6).

Fig. 6: Inhibicion de crecimiento de colulas de linfoma de manta JVM-2 in vivo mediante ensayos de xenograft en ratones CB17-SCID, tras tratamiento oral (cada tres dias) can una dosis de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5 (n=7), can respecto al tratamiento diario can una dosis de 30 mg/kg de edelfosina libre (EDLF). (Fig. 6A) Los tratamientos can edelfosina libre y las nanoparticulas conteniendo edelfosina inhibieron de forma significativa (p < 0,01; desde el dia. 15 de tratamiento) el crecimiento del tumor de linfoma de manta comparado can el grupo control tratado can vehiculo (PBS, n = 10). Los datos se muestran coma valores medios ± E.D. (n = 7). (Fig. 6B) Tras el ensayo in vivo (20 dias de tratamiento), los grupos control y tratados can edelfosina libre y can nanoparticulas fueron sacrificados y el volumen del tumor aislado fue medido en los distintos ratones, observandose una reduccion significativa en el tamano del tumor en los animales tratados can edelfosina frente al grupo control sin tratar can edelfosina. Se muestran los valores medios de los volOmenes de los tumores de cada grupo experimental. Los asteriscos indican que los valores de los volOmenes de los tumores eran significativamente menores tras el

tratamiento can edelfosina libre o en nanoparticulas can p < 0,01 (**).

Fig. 7: Inhibicion de metastasis en ganglios linfaticos en modelo xenograft de colulas de linfoma de manta JVM-2 en ratones CB17-SCID, tras tratamiento

oral (cada tres dias) con una dosis de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5 (n=7), comparado con tratamiento diario de 30 mg/kg de edelfosina libre. Tras el ensayo in vivo (20 dias de tratamiento), los grupos control y tratados con 5 edelfosina libre y con nanoparticulas fueron sacrificados, los ganglios linfaticos fueron aislados y se midio el tamano de los tumores observados en dichos ganglios. Se observo una ausencia (en animales tratados con nanoparticulas conteniendo edelfosina) o gran reduccion (en animales tratados con edelfosina libre) en el tamano del tumor en los ganglios de los animales tratados con

10 edelfosina frente al grupo control sin tratar con edelfosina. Se muestran los valores medios de los volOmenes de los tumores de cada grupo experimental.

Fig. 8: Inhibicion de crecimiento de glioma C6 in vivo mediante ensayos de xenograft tras la implantacion de 105 colulas tumorales en el flanco derecho de 15 ratones inmunodeficientes NMRI-nude, tras tratamiento oral (cada tres dias) con una dosis de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 (n=7), con respecto al tratamiento diario con una dosis de 30 mg/kg de edelfosina libre, y nanoparticulas de Precirol® ATO 5 sin edelfosina. Tras 17 dias, los animales fueron sacrificados y se midio el tamano de los

20 tumores. Las nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 cargadas con edelfosina administradas cada tres dias fueron al menos tan efectivas como una administracion diaria de edelfosina en solucion.

Fig. 9: Efecto antiparasitario frente leishmaniasis cutanea tras tratamiento oral

25 en ratones BALB/c con una dosis de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 (Nano-ET) (n=6). Se muestra el efecto inhibitorio de la infecci6n en la pata del rat6n infectado con Leishmania major (parte superior) y en la carga parasitaria (parte inferior) en animales tratados con edelfosina en nanoparticulas (Nano-ET) frente a animales sin tratar (control).

30

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos describen la produccion y eficacia de nanopartfculas preparadas a base de gliceridos de origen semisintetico completamente inertes, reconocidos coma GRAS ("GenerallyRecognizedAsSafe") par autoridades alimentarias y regulados en la cuarta edicion de la Farmacopea Europea que incorporan una molecula biologicamente activa (edelfosina). Como puede apreciarse en la Fig. 1, la incorporacion de la edelfosina en nanopartfculas lipfdicas permite aumentar la absorcion de dicha molecula, ademas de

mantener niveles plasmaticos constantes y sostenidos del farmaco durante, al menos 120 horas. Del mismo modo, dichas nanopartfculas lipfdicas resultaron ser eficaces en la reduccion del creciemiento tumoral en ratones inoculados can colulas de glioma de rata.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE PREPARACION DE LAS NANOPART1CULAS DE LA INVENCION

El procedimiento para la preparacion de las nanopartfculas lipfdicas de la presente invencion esta basado en el metodo denominado Homogenizacion en caliente ("HotHomogenization") (12). El procedimiento consiste en fundir en un recipiente la cantidad adecuada de lfpidos junto con la cantidad necesaria del eter de fosfolfpido en un ban() termostatizado a una temperatura de unos 5 2C par encima de la temperatura de fusion de los lfpidos. La temperatura es controlada can un termometro de etanol sumergido en dicho bano. En otro recipiente, se calientan a la misma temperatura, es decir ± 1 2C la temperatura de la fase lipfdica, cierto volumen de una solucion acuosa de agente estabilizante o tensoactivo. Cuando ambos recipientes estan a la misma temperatura, se vierte la fase acuosa sabre la lipfdica. La mezcla se somete a una serie de ciclos de homogenizaci6n. La emulsion resultante se enfrfa rapidamente en un ban() can hielo (4 QC) hasta que el lfpido fundido solidifique y se forme una suspensi6n de nanopartfculas lipfdicas solidas. Esta suspensi6n

se ultrafiltra 3 veces can la ayuda de filtros AMICON® Ultra-15 de 10.000 Da de MWCO (MolecularWeightCut-Oft) (Millipore()) par centrifugacion a 4.500 g

durante 30 minutos anadiendo 5 mL de agua destilada tras cada centrifugacion para retirar el exceso de agente estabilizante y farmaco no encapsulado.

Si se desea, las nanopartfculas que se han retenido en el filtro tras la Ultima

centrifugacion se resuspenden en 3 mL de una solucion acuosa de trehalosa como agente crioprotector. La suspension de nanopartfculas lipfdicas se congela rapidamente en un congelador a -80°C, para su posterior liofilizacion.

PRODUCCION DE NANOPARTiCULAS LIPiDICAS CARGADAS CON EDELFOSINA

En este ejemplo concreto, el lfpido escogido para la formulacion de nanopartfculas lipfdicas cargadas con edelfosina es el PrecirolC) ATO 5 (palmitostearato de glicerilo).

Para la obtencion de nanopartfculas lipfdicas de Precirol ATO 5 (Gattefosse, lote: 28950), se pesan 300 mg de este lfpido junto con 15 mg de edelfosina en un vial (fase oleosa), que se calentara en un ban() termostatizado a 65 C. A otro vial se anaden 10 mL de una solucion de Tween 80 al 2% (fase acuosa) y se ponen a calentar junto con el vial anterior. Cuando la mezcla lfpido-farmaco esta completamente fundida y ambos viales estan a la misma temperatura, se anade la fase acuosa sobre la oleosa. La mezcla se somete a una homogenizaci6n por sonicacion a una potencia efectiva de 10 W con una sonda de ultrasonidos MicrosonTM (NY, EEUU) durante 1 minuto, manteniendo la temperatura constante de 65 QC con el ban() termostatizado, seguida de una homogenizacion por Ultraturrax T-25 (IKAC)-Werke, Alemania), a 24.000 rpm durante 1 minuto y de una homogenizacion por sonicacion a una potencia efectiva de 10 W con una sonda de ultrasonidos MicrosonTM (NY, EEUU) durante 1 minuto. La emulsion blanquecina resultante se introduce rapidamente en un bano de hielo (4 °C) para que las gotfculas de lfpido fundido solidifiquen y se forme una suspensi6n de nanopartfculas lipfdicas solidas. Esta suspensi6n se ultrafiltra 3 veces con la ayuda de filtros AMICONC) Ultra-15 de 10.000 Da de

MWCO (MolecularWeightCut-Oft) (Millipore()) por centrifugacion a 4.500 g

durante 30 minutos, anadiendo 5 mL de agua destilada tras cada centrifugacion para retirar el exceso de agente estabilizante y farmaco no encapsulado. Tras la Ultima centrifugacion, las nanoparticulas que se han retenido en el filtro pueden resuspenderse en 3 mL de una solucion acuosa de trehalosa al 10% como agente crioprotector e introducirse en un congelador a -80 QC para su posterior liofilizacion y conservacion a largo plazo. Asi, una vez que se ha conseguido una temperatura de -50 QC en la camara de carga del liofilizador se introducen los viales pretaponados, previamente congelados a -80 C. A continuacion comienza un suave y lento aporte de energia para favorecer la sublimacion del disolvente hasta alcanzar los 5 QC y a partir de este punto se incrementa la temperatura para conseguir el secado secundario del producto mediante la evaporacion de las moleculas residuales de agua. Todo el proceso se desarrolla a baja presion (9 mtorr). Una vez completado el proceso se cierran los viales mediante un dispositivo hidraulico y se rompe el vacio

(Martinez-Galan, F. "Liofilizacion de vectores adenovirales para terapia genica". Tesis doctoral, Universidad de Navarra, 2006).

CARACTERIZACION DE LAS NANOPARTiCULAS FORMULADAS POR ESTE PROCEDIMIENTO

Las nanoparticulas lipidicas fueron caracterizadas fisico-quimicamente. La caracterizacion de las nanoparticulas, como la determinacion de su tamano o carga superficial, es un factor muy importante ya que de ella dependen cuestiones, bien farmaceuticas, como la eleccion de la via de administracion, bien biologicas como su absorcion a nivel gastrointestinal. El tamano e indice de polidispersion fueron determinados por espectroscopia de correlacion fotanica con la ayuda de un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Esta tecnica determina el tamano de particula midiendo la rapidez de fluctuacion de la intensidad de la luz laser difractada por las particulas cuando se difunden a traves del fluido. La espectroscopia de correlacion fotanica es el Unica metodo no destructivo para medir el tamano de particula por debajo de pocos nanometros (M. Kaszuba, J. Nanop. Res. 1 (1999) 405). El potencial 4 fue determinado por anemometria laser-doppler, tecnica que sirve para determinar

la carga superficial de las nanoparticulas en un fluido (M. Puharic, S. Ristic, M. Kutin, Z. Adamovic, J. Russ. Laser Res. 28 (2007) 436). La eficacia de encapsulacian se determin6 par cromatografia liquida ultrarrapida acoplada a espectrometria de masas (15).

La tabla I muestra los resultados obtenidos para los dos lipidos ensayados en cuanto a las caracteristicas fisico-quimicas de las nanoparticulas.

Tabla I: Rangos de tamanos, polidispersion (PDI), potencial 4 y eficacia de 10 encapsulacian (%EE) de las nanoparticulas lipidicas formuladas par el metodo de HotHomogenization.

Taman() Potencial 4 Lipid° medio PDI %EE (mV) (nm)

Compritol®888 ATO 100 —120 0,167 —0,297 -18--23 80—100%

Precirol®ATO5 100 —130 0,21—0,28 -18--23 30 —90%

Como se aprecia en la tabla, los valores de tamanos de las nanoparticulas

15 formuladas can ambos tipos de lipido son pequenos, inferiores a 130 nm, can un indice de polidispersion inferior a 0,3 (valor par debajo del cual se considera que la formulacian posee tamanos homogeneos). Este tamano es optima para su administracian par via oral. El potencial es la fuerza dispersora que determina la probabilidad de crecimiento y la coalescencia de las particulas.

20 Cuanto mayor sea el valor en terminos absolutos, mayor estabilidad tendra la suspensi6n. El valor fue negativo y alejado de 0 para ambos tipos de formulaciones, indicando que las formulaciones son estables. El rango de porcentajes de encapsulacian en las nanoparticulas varia en funci6n de las cantidades de farmaco, lipido y tensoactivo empleados en la formulaci6n, sin

25 embargo, fue superior en el caso de las particulas formuladas can Compritol® 888 ATO, alcanzando rangos entre 80 y 100%, mientras que las particulas formuladas can Precirol® ATO 5 mostraron un rango de porcentajes de encapsulacian entre 30 y 90%.

ESTUDIOS in vitro CON LiNEA CELULAR TUMORAL DE MELANOMA MURINO (B16)

Un ensayo de proliferacion celular can MTT a 48 h can 500 colulas B16 par

5 pocillo en placa de 96 pocillos revelo que las nanoparticulas disminuyeron la IC50 (concentracion inhibitoria 50%), calculada coma la concentracion de compuesto que causa un 50% de inhibicion en la proliferacion celular, de la edelfosina desde 70 pM (correspondiente a la edelfosina en solucion) a 60 pM (edelfosina encapsulada en nanoparticulas de Compritol® 888 ATO) y a 15 pM

10 (edelfosina encapsulada en nanoparticulas de Precirol® ATO 5).

ESTUDIOS in vitro CON LiNEA CELULAR TUMORAL DE GLIOMA DE RATA (C6)

15 Un ensayo de proliferacion celular can MTT a 48h can 2000 colulas C6 par pocillo en placa de 96 pocillos revelo que las nanoparticulas disminuyeron la IC50 de la edelfosina desde 70 pM (correspondiente a la edelfosina en solucion) a 25 pM (edelfosina encapsulada en nanoparticulas de Camprital® 888 ATO) y a 15 pM (edelfosina encapsulada en nanoparticulas de Precirol® ATO 5).

20 ESTUDIOS FARMACOCINETICOS in vivo REALIZADOS CON LAS NANOPARTiCULAS LIPiDICAS

En estudios previos se determino que la farmacocinetica era lineal para los

25 rangos de dosis entre 10 y 60 mg/kg, par lo que puede utilizarse cualquier dosis de farmaco para el resto de estudios farmacocineticos siempre y cuando se encuentre en ese rango.

Se procedi6 a la administraci6n de las nanoparticulas cargadas can edelfosina

30 tanto par via intravenosa coma oral a ratones BALB/c. La dosis de edelfosina par via intravenosa estuvo comprendida entre 30 y 60 mg/kg.

La Fig. 2 muestra la evolucion de la concentracion plasmatica de edelfosina a lo largo del tiempo tras administrarla en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO.

LaFig. 3 muestra la evolucion de la concentracion plasmatica de edelfosina a lo largo del tiempo tras administrarla en nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5.

En ambas graficas, los valores plasmaticos decrecen muy rapidamente durante

las 5 primeras horas, punto a partir del cual comienzan a disminuir de una manera mas sostenida. Es interesante destacar que con una Unica administracion intravenosa de nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 podemos encontrar niveles plasmaticos de edelfosina hasta 168 h despues. Con estos datos, y con la ayuda del programa informatico de analisis de datos

farmacocineticos WinNonlin Professional Edition 2.1 (Pharsight) se estimaron los parametros farmacocineticos de la edelfosina encapsulada en nanoparticulas lipidicas. El modelo que mejor ajusto los datos experimentales fue el bicompartimental.

Latabla ll muestra un resumen de los principales parametros farmacocineticos estimados para una administracion intravenosa de edelfosina encapsulada en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5.

Tabla II. Parametros farmacocineticos de la edelfosina tras una administracion

intravenosa de una dosis comprendida entre 30 y 60 mg/kg de farmaco encapsulado en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5 a ratones BALB/c (n=6, Media ± D.E.).

Nanoparticulas Nanoparticulas

Parametros

Compritol® 888 ATO Precirol® ATO 5 ty2, (h) 0,395 ±0,124 0,505 ±0,151 ty2p (h) 16,970±5,775 23,718± 17,743

Cm„/D (pg/mL/pg) 0,290 ±0,087 0,341±0,044 k21 (f) 0,155 ±0,102 0,281±0,320 1(10 (f) 0,581±0,187 0,413±0,092 k12 (f) 1 ,349±0,682 0,857±0,370

CL (L/h/kg) 0,105 ±0,021 0,065±0,023 V„ (L/kg) 1 ,668±0,730 1 ,313±0,838 MRT (h) 17,154± 6,517 26,096±20,598 AUCinf/D (pg.h/mL/pg) 0,573±0,053 0,894± 0,399

Las constantes de velocidad k12, k21 y klo rigen la distribucion del farmaco entre

los compartimentos y su eliminacion del organismo. Un valor de k12 entre 4 y 9

veces mas elevado que el de k21 para ambos tipos de nanoparticulas nos

5 indica que la edelfosina se distribuye rapidamente a tejidos. El volumen de distribucion (V„) no presenta diferencias significativas entre ambos tipos de nanoparticulas, situandose en torno a 1,5 L/kg.

El valor del aclaramiento (CL) presenta diferencias significativas entre ambos 10 lipidos (p < 0,05), siendo menor para el Precirol® ATO 5 que para el Compritol® 888 ATO, significando que la eliminacion de este Ultimo es mas rapida.

El tiempo medio de residencia (MRT), tiempo que permanece una molecula de farmaco en el organismo, es de aproximadamente 17 h, y de 26 h para las 15 nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5, respectivamente, tras ser administradas por via intravenosa.

Para la administraci6n de nanoparticulas por via oral a ratones BALB/c se eligio una dosis inicial de 10 mg/kg de edelfosina. La Fig. 1 muestra la evolucion de la

20 concentracion plasmatica de edelfosina a lo largo del tiempo tras una administracion oral de 10 mg/kg de edelfosina en solucion, y formulada en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5.

La Fig. 1 muestra que es posible mantener niveles de edelfosina en plasma

25 durante mas de 120 h (5 dias) con una Unica administracion oral de

nanoparticulas. Esto permitiria espaciar las dosis del tratamiento, y poder administrar una dosis cada 4 o 5 dias para conseguir mantener concentraciones de edelfosina par encima de 1 pg/mL. A la vista de estos resultados tambien se calculd que la biodisponibilidad relativa de la edelfosina

5 encapsulada en nanoparticulas lipidicas par via oral can respecto a la intravenosa era de 61% y 55% de Camprital® 888 ATO (a las 24 h) y Precirol® ATO 5 (a las 168 h), respectivamente.

En un experimento posterior, se administro a una serie de ratones BALB/c una

10 dosis oral mayor de edelfosina en nanoparticulas lipidicas para calcular los parametros farmacocineticos. La tabla Ill resume los principales parametros farmacocineticos estimados para una administracion oral de aproximadamente 50 mg/kg de edelfosina encapsulado en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Preciral® ATO 5.

15 Tabla III. Parametros farmacocineticos de la edelfosina tras una administracion oral de 50 mg/kg de farmaco encapsulado en nanoparticulas lipidicas de Camprital® 888 ATO y Preciral® ATO 5 a ratones BALB/c (n=6, Media ± D.E.).

Nanoparticulas Nanoparticulas

Parametros

Camprital®888 ATO Preciral®ATO5

T1/2 (h) 37,652 ± 12,187 45,221± 14,564 t1/2Ka (h) 4,938 ± 1 ,818 4,045± 1 ,873 k01 (h-1) 0,155 ±0,048 0,206±0,093

-1

k10 (h 0,020 ±0,006 0,016±0,004

CL (L/h/kg) 0,045±0,009 0,034± 0,009 V(L/kg) 2,343±0,483 2,425 ± 1 ,274 Tmax (h) 15,890 ±2,839 14,663±4,150

Cm„/D (pg/mL/pg) 0,007±0,001 0,012±0,006 MRT (h) 39,155 ±7,656 52,919±4,068 AUCinf/D (pg.h/mUpg) 0,635 ±0,103 0,813±0,155

20

Cuando la edelfosina se administra par via oral encapsulada en nanoparticulas lipidicas, se absorbe lentamente can un valor de ty2Ka entre 4 y 5 h, alcanzandose la Cmax 15 h tras la administracion. Despues, la eliminacion es lenta, can un valor de aclaramiento muy bajo, si se compara can el valor

5 obtenido tras administrar las nanoparticulas par via intravenosa.

En este caso, el valor de MRT se ha duplicado can respecto a la administracion intravenosa de ambos tipos de nanoparticulas. Par tanto, parece evidente que la administraci6n de nanoparticulas par via oral repercute de forma significativa 10 en la eliminacion del farmaco, y que la absorcion es el factor limitante en el proceso de distribucion del mismo. A fin de analizar si la edelfosina se absorbe par via linfatica, se administro una dosis de 30 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas a ratones BALB/c. Para hacer mas visibles las vias linfaticas a la hora de la necropsia, se procedio a administrar una emulsion grasa 24 horas 15 despues. Transcurrida una hora, los ratones fueron sacrificados y se les extrajeron los ganglios linfaticos para cuantificar la cantidad de edelfosina presente. Los resultados mostraron un promedio de 16,5 pg de edelfosina par gramo de tejido linfatico. Este hecho es muy interesante, ya que en numerosas neoplasias existen metastasis linfaticas que podrian ser prevenidas can la

20 administracion de estas nanoparticulas par via oral. Del mismo modo, la administracion de nanoparticulas podria ser de utilidad en el tratamiento de la leishmaniasis ya que los nodulos linfaticos son utilizados para la diseminacion del parasito Leishmaniaspp.durante la infecci6n.

25 BIODISTRIBUCION DE EDELFOSINA EN NANOPARTiCULAS DE COMPRITOL Y PRECIROL

Tras el sacrificio de los animales se procedio a la extraccion de los distintos tejidos para cuantificar la cantidad de edelfosina presente en ellos. La Fig. 4

30 muestra la biodistribucion de la edelfosina tras ser administrada de forma intravenosa en nanoparticulas.

La grafica muestra que tras administrar una dosis de 50 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas, el farmaco se distribuye a los mismos tejidos con ambos tipos de nanoparticulas, predominando los tejidos de eliminacion higado, intestino y ririon, en el caso del Camprital® 888 ATO. Las bajas acumulaciones de farmaco

en los tejidos de los ratones tratados con nanoparticulas de Precirol® ATO 5 pueden explicarse par el largo periodo de tiempo que ha transcurrido, dando tiempo para su eliminacion, lo que tambien pone de manifiesto que las nanoparticulas no se acumulan, disminuyendo asi la posible existencia de toxicidad par acumulacion.

Tras la administraci6n de las nanoparticulas par via oral se observo el perfil de biodistribucion que se muestra en la Fig. 5.

En estas graficas se puede apreciar que, ademas de la presencia de edelfosina

en los principales organos de eliminacion, tal y coma se observaba en la administracion intravenosa, existe una elevada acumulacion de farmaco en el tejido cerebral, siendo mayor que las concentraciones encontradas en los tejidos de eliminacion en el caso de las nanoparticulas formuladas can Preciral® ATO 5. Par lo tanto las composiciones farmaceuticas de la invencion

pueden ser utilizadas para dirigir el eter de fosfolipido al tejido cerebral y poder tratar neoplasias cerebrales para los que no existe tratamiento en la actualidad, coma par ejemplo, los glioblastomas.

Comparando la distribucion tisular de edelfosina tras el tratamiento oral de las

composiciones farmaceuticas conteniendo nanoparticulas lipidicas de edelfosina (Figuras anteriores) frente a edelfosina libre (11), se observa que solo en el caso de las nanoparticulas, y especialmente tras su administracion oral, se obtiene una elevada acumulacion de edelfosina en el cerebra, lo que representa que las nanoparticulas pueden atravesar la barrera

hematoencefalica y se pueden sugerir diversas aplicaciones biomedicas en diversas enfermedades cerebrales. La edelfosina no se detecto en corazon tras tratamiento intravenoso y oral de las distintas nanoparticulas conteniendo

edelfosina (Fig. 4 y 5), asi coma can edelfosina libre (11). Este hecho, unido a

los ensayos de toxicidad con edelfosina libre que indican la ausencia de efectos cardiotaxicos (10), sugiere que el tratamiento oral de nanoparticulas conteniendo edelfosina no tendria efectos nocivos cardiacos, a diferencia de varios agentes antitumorales (ej.: doxorrubicina).

5 ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTITU MORAL in vivo

Ratones inmunodeficientes CB17-severe combined immunodeficient (SCID) (Laboratorios Charles River, Lyon, Francia), se mantuvieron y manejaron de 10 acuerdo con las directrices institucionales, cumpliendo la legislacion espanola, bajo ciclos de 12/12 h luz/oscuridad a una temperatura de 22 QC, recibiendo una dieta estandar y agua acidificada ad libitum. A los ratones CD17-SCID se les inocularon subcutaneamente 107 colulas JVM-2 en 100 ial_ PBS y 100 ial_ de matriz de membrana basal Matrigel (Becton Dickinson) en la parte dorsal 15 inferior. Cuando los tumores eran palpables, los ratones se distribuyeron al azar en grupos de 7 ratones cada uno. Cada grupo de ratones recibig por via oral una dosis de edelfosina (30 mg/kg) en nanoparticulas lipidicas de Compritol® 888 ATO y Precirol® ATO 5 cada 4 dias, asi como una dosis diaria de 30 mg/kg de edelfosina libre. Otro grupo control fue tratado diariamente con 20 un volumen igual de vehiculo (PBS). Los diametros mayor y menor del tumor fueron medidos con la ayuda de un calibre a intervalos de 5 dias, y el volumen del tumor (mm3) se calcula usando la siguiente formula estandar: (el diametro menor)2 X (el diametro mayor) x 0,5. Los animales fueron sacrificados de acuerdo con las normas institucionales transcurridos 20 dias de tratamiento, o

25 cuando el diametro de sus tumores alcanzaban los 3 cm o cuando se observaba una toxicidad significativa. El peso de los animales fue monitorizado, asi como cualquier signo de toxicidad. El tratamiento con edelfosina se mantuvo durante 20 dias, y los animales se sacrificaron 24 h despues de la Ultima administracion de compuesto. Entonces, se extirparon, pesaron y

30 midieron los tumores, y ganglios linfaticos, y se realiza el analisis del tumor y de los distintos organos en la necropsia.

Todos los valores se expresaron coma valor media ± DE. Las diferencias estadistica entre grupos se evaluaron empleando el test de Mann-Whitney o la t de Student. Un valor de p menor de 0,05 se considera estadisticamente significativo.

El tratamiento con nanoparticulas de Precirol ATO 5 o Compritol 888 ATO conteniendo edelfosina (cada 4 dias) redujo el tumor en proporciones similares al tratamiento oral diario de la edelfosina (Fig. 6).

El tratamiento con nanoparticulas de Precirol ATO 5 o Compritol 888 ATO conteniendo edelfosina (cada 4 dias) inhibig totalmente (100%) el nOmero de metastasis en ganglios (Fig. 7). El tratamiento diario con edelfosina libre tambien inhibig significativamente la metastasis, pero no consiguig bloquear la metastasis totalmente (aprox. 64%) (Fig. 7). Este hecho puede ser debido a la

acumulacion de las nanoparticulas conteniendo edelfosina en ganglios linfaticos, lo que potenciaria la capacidad antimetastatica de la edelfosina.

EFICACIA IN VIVO DE NANOPARTiCULAS DE PRECIROL® ATO 5 CARGADAS CON EDELFOSINA ADMINISTRADAS POR VIA ORAL EN UN MODELO MURINO DE XENOGRAFT DE CELULAS DE GLIOMA C6

Los experimentos se realizaron de acuerdo con la normativa vigente en la Universidad de Navarra, que incluye los principios recogidos en las guias internacionales de experimentacion animal [N. Howard-Jones, A CIOMS ethical

code for animal experimentation. WHO Chron 39 (1985) 51-56] y siguiendo un protocolo aprobado par el Comite Etico de la Universidad de Navarra (nOmero de protocolo 060-06). Se emplearon ratones inmunodeprimidos NMRI (de 2022 gramos de peso) (Janvier, Francia) en jaulas con filtro de aire, con libre acceso a alimento y agua.

Para producir los tumores, se inyectaron las colulas de glioma de rata C6 (1x105 colulas en media celular DMEM sin antibigtico ni suero bovino fetal) par

via subcutanea en ambos flancos del ratan. Los diametros mayor y menor del

tumor fueron medidos con la ayuda de un calibre a intervalos de 3 dias, y el volumen del tumor (mm3) se calculo usando la siguiente formula estandar: (el diametro menor)2 x (el diametro mayor) x 0,5. Despues de unos 7 dias, cuando el tumor alcanzo un volumen aproximado de 75 mm3, los ratones se

distribuyeron al azar en 4 grupos (8 animales por grupo) con diferentes tratamientos orales: a) PBS (control negativo); b) nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 vacias, sin edelfosina; c) 40 mg/kg de edelfosina en solucion; d) 40 mg/kg de edelfosina en nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5. Los ratones recibieron una dosis de edelfosina en nanoparticulas lipidicas cada tres dias, mientras que la administraci6n de la edelfosina en solucion fue diaria. Los grupos control de PBS y nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 vacias recibieron las dosis cada tres dias.

A lo largo del experimento, el peso de los animales fue monitorizado, asi como

cualquier signo de toxicidad. Los tratamientos se mantuvieron durante 17 dias, tiempo que necesitaron los tumores para alcanzar los 3000 mm3. Los animales fueron entonces sacrificados de acuerdo con las normas institucionales, y se extirparon, pesaron y midieron los tumores.

LaFig. 8 muestra coma un tratamiento consistente en una administracion de nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5 cargadas con edelfosina fueron al menos tan efectivas como una administracion diaria de edelfosina en solucion.

ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTI-LEISHMANIA IN VIVO

Ratones BALB/c de cuatro semanas de edad se infectaron en la pata con 1 x 106 parasitos L. major. Posteriormente, una vez que la lesion se hizo perceptible se dividieron al azar en dos grupos. Un grupo de seis ratones BALB/c de cuatro semanas de edad se trataron por via oral cada 4 dias con edelfosina (30 mg/kg) en nanoparticulas lipidicas de Precirol® ATO 5. Otro grupo control de seis ratones BALB/c de cuatro semanas de edad se trataron por via oral con nanoparticulas vacias. Cada 8 dias se evaluo el peso del animal y la medida de la inflamacion en la pata infectada. Tras 28 dias del inicio

de tratamiento, se observo una disminucion significativa en el fndice de evolucion de la infeccion, asf coma en la carga parasitaria (Fig. 9). Asimismo, el tratamiento con nanopartfculas no condujo a perdida de peso en los animales tratados.

REFERENCIAS

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1

DESARROLLO Y USO DE NANOPARTICULAS LIPIDICAS CONTENIENDO EDELFOSINA Y OTROS ETERES DE FOSFOLiPIDOS EN LA TERAPIA ANTITU MORAL Y ANTI PARASITARIA

La presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden nanopartfculas de origen lipfdico conteniendo un eter de fosfolfpido y al uso de tales composiciones farmaceuticas para la preparacion de medicamentos para el tratamiento oral de cancer y de la leishmaniasis. For lo tanto, la presente invencion se engloba en el campo de la tecnica de

productos farmaceuticos.

ESTADO DE LA TECNICA

Dentro del grupo de los eteres de fosfolfpidos, los analogos alquil

lisofosfolipidos sinteticos antitumorales (ALPs), de los que la edelfosina (1-0octadecil-2-0-metil-rac-glicero-3-fosfocolina, ET-18-0CH3) se ha convertido en su compuesto prototipo, representan una clase prometedora de agentes anticancerosos orales que no tienen como diana el ADN, sino que actban a nivel de la membrana celular activando la senalizacion apotatica (1,2). Ejemplos de ALPs clfnicamente relevantes incluyen la edelfosina, miltefosina y las nuevas moleculas perifosina y erucilfosfocolina (3,4). La edelfosina induce apoptosis selectiva en una amplia variedad de colulas tumorales, mientras que las colulas normales no se afectan, debido a que el ALP se incorpora preferentemente en la colula tumoral (1,5). Dos estructuras subcelulares, los dominios de membrana denominados "lipid rafts"y el retfculo endoplasmico, actban como dianas de la edelfosina, dependiendo del tipo celular. Asf, la apoptosis inducida por edelfosina implica la activacion intracelular del receptor de muerte Fas/CD95 y su reclutamiento, independientemente de su ligando natural FasL/CD95L, en dominios de membrana "lipid rafts" en colulas leucemicas (2,5), y una respuesta de stress de retfculo endoplasmico en colulas derivadas de tumores solidos (6). La edelfosina se acumula en dominios "lipidrafts"(7), promoviendo una redistribucion de protefnas en estos dominios de membrana que finalmente conduce a la muerte celular. Esto ha

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica que comprende nanoparticulas lipidicas, donde las nanoparticulas estan caracterizadas porque: tienen un tamano media

   5 inferior a 300 nm; y comprenden al menos un eter de fosfolipido y al menos un lipido.
2. 2. La composicion farmaceutica segOn la reivindicacion 1, caracterizada porque

   el eter de fosfolipido se selecciona entre edelfosina, miltefosina 10 erucilfosfocolina, ilmofosina, perifosina o cualquiera de sus combinaciones.
3. 3. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el eter de fosfolipido es edelfosina.

   15 4. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanoparticulas tienen un tamano media de entre 5 nm a 270 nm, preferiblemente entre 20 nm y 200 nm, y aim mas preferiblemente entre 70 nm y 150 nm.

   20 5. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanoparticulas comprenden al menos un triglicerido, un glicerofosfolipido, un glicerolipido, un esfingolipido o cualquiera de sus combinaciones.

   25 6. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanoparticulas comprenden al menos behenato de glicerilo, palmitostearato de glicerilo, gliceridos poliglicolados, trigliceridos de cadena media, polioxiglicerido, caprilato de propilenglicol, laurato de propilenglicol, monolinoleato de glicerilo, oleato de glicerilo,

   30 dietilenglicol metil eter o cualquiera de sus combinaciones.
4. 7. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanopartfculas comprenden behenato de glicerilo, palmitostearato de glicerilo o cualquiera de sus combinaciones.
5. 8. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanopartfculas comprenden mas de un 30% en peso de lfpidos.
6. 9. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones

   anteriores, caracterizada porque las nanopartfculas comprenden mas de un 50% en peso de lfpidos.
7. 10. La composici6n farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones

   anteriores, caracterizada porque las nanopartfculas comprenden mas de un 70% en peso de lfpidos, preferiblemente entre un 75% y un 95% en peso.
8. 11. La composici6n farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanopartfculas comprenden entre un 0,1 % y un 50 % en peso de eter de fosfolfpido, preferiblemente entre un 1°/0 y un

   30% en peso.
9. 12. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las nanopartfculas comprenden un tensoactivo entre polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, polivinil alcohol de alto o

   bajo peso molecular, polivinil pirrolidona, fosfatidil colina, lecitinas, poloxameros de distintos tipos, solutol HS15, glicocolato sodico, taurocolato sodico, tauroglicocolato sodico, taurodeoxicolato sodico, hemisuccinato de colesterilo y tiloxapol, preferiblemente polisorbato 80.
10. 13. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composicion farmaceutica ademas comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable.

11. 14.

    La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende al menos un carbohidrato.

12. 15.

    La composicion farmaceutica segOn la reivindicacion anterior, caracterizada

    porque comprende al menos sucrosa, maltosa, trehalosa, lactosa, melibiosa o mezclas de ellos, preferiblemente trehalosa.
13. 16. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las dos reivindicaciones

    anteriores, caracterizada porque la nanopartfcula comprende entre un 0 y un 30% en peso de carbohidrato.
14. 17. La composicion farmaceutica segOn las 4 reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende un diluyente.
15. 18. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las 5 reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende celulosa microcristalina, lactosa o cualquiera de sus combinaciones.
16. 19. La composicion farmaceutica segOn cualquiera de las reivindicaciones

    anteriores, caracterizada porque esta en forma solida oral, preferiblemente en comprimidos o capsulas.
17. 20. Un proceso para la manufacturacion de cualquiera de las composiciones farmaceuticas como se definen en cualquiera de las reivindicaciones

    anteriores, caracterizado porque las nanopartfculas se sintetizan por un proceso que comprende la homogenizacion en caliente.
18. 21. El proceso para la manufacturacion de composiciones farmaceuticas,

    segOn la reivindicacion anterior, caracterizado porque la homogenizacion en caliente comprende al menos las siguientes etapas:

    i) Combinar una mezcla que comprende un lfpido y un eter de fosfolfpido, preferiblemente a una temperatura entre 2 y 10 2 C superior al punto de fusion

    del lfpido, con una solucion acuosa que comprende entre 0 % y 3 % de un tensoactivo aproximadamente a la misma temperatura, preferiblemente a una temperatura comprendida entre 40 y 90 (2C,

    5 ii) se homogeniza la mezcla obtenida, preferiblemente par sonicacion;

    iii) se enfrfa la mezcla para obtener una suspension de nanopartfculas;

    iv) se afslan la nanopartfculas, preferiblemente mediante filtracion, o mediante 10 centrifugacion.
19. 22. El proceso para la manufacturacion de composiciones farmaceuticas, segOn la reivindicacion anterior, caracterizado porque comprende una etapa (v) en el cual se liofilizan las nanopartfculas obtenidas en la etapa (iv).

    15
20. 23. El proceso para la manufacturacion de composiciones farmaceuticas, segOn la reivindicacion anterior, caracterizado porque las nanopartfculas aisladas en la etapa (iv) se resuspenden en una solucion acuosa que comprende un carbohidrato, coma la trehalosa, antes de Ilevar a cabo la etapa

    20 (v).
21. 24. El uso de cualquiera de las composiciones farmaceuticas coma se definen en las reivindicaciones 1 a 16 para la preparacion de un medicamento.

    25 25. El uso de cualquiera de las composiciones farmaceuticas coma se definen en las reivindicaciones 1 a 16 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
22. 26. El uso de cualquiera de las composiciones farmaceuticas coma se definen

    30 en las reivindicaciones 1 a 16 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del linfoma de manta.
23. 27. El uso de cualquiera de las composiciones farmaceuticas coma se definen en las reivindicaciones 1 a 16 para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la leishmaniasis.