ES2383002T3 - Prueba pronóstica de alergia - Google Patents

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Abstract

Una prueba pronóstica de alergia para una alergia prolongada en un niño, que comprende: proporcionar suero procedente de un niño alérgico; poner en contacto el suero con al menos un epítopo lineal de un alérgeno seleccionado en condiciones que permitan que los anticuerpos específicos del epítopo, si están presentes en el suero, se unan al epítopo; y observar los niveles de anticuerpo de tipo IgE que se unen a dicho epítopo; en la que la observación de niveles estadística y significativamente elevados de anticuerpo de tipo IgE que se une a dicho epítopo con respecto a un nivel control de anticuerpo de tipo IgE que se une a dicho epítopo observado con individuos no alérgicos es indicativa de una alergia.

Description

Prueba pronóstica de alergia
5 Antecedentes de la invención
Las reacciones de hipersensibilidad a los alimentos afectan hasta al 6 % de los niños durante los primeros años de vida (Bock, SA 1987. Pediatrics 79:683-688), siendo la leche, el huevo y los cacahuetes las respuestas alérgicas más documentadas (James JM y Sampson HA. 1992. Pediatr Allergy & ImmunoI 3:67-78). En la mayoría de los niños alérgicos a la leche, la hipersensibilidad a la leche de vaca se desarrolla durante el primer año de vida y aproximadamente el 80 % de ellos “han superado” su reactividad (es decir, se convierten en clínicamente tolerantes) a los tres años de edad (Host, A. 1994. Pediatr Allergy Immunol 5:5-36). La hipersensibilidad a los huevos de gallina y a los cacahuetes se suele reconocer durante el segundo año de vida. La alergia al huevo parece ser más persistente que la alergia a la leche de vaca, mientras que la alergia a los cacahuetes muy rara vez se “supera”
15 (Bock, SA 1982. J Allergy Clin Immunol 69: 173-17; Sampson, H.A. y S.M. Scanlon. 1989. J Pediatr 115:23-27; Bock, SA y F.M. Atkins. 1989. J Allergy Clin Immunol 83:900-904). La base de estas diferencias respecto a la persistencia de la hipersensibilidad clínica a diferentes alérgenos alimentarios se desconoce.
La alergia al huevo está presente en casi dos tercios de los niños con dermatitis atópica (Sampson, H.A. J. 1997 Roy. Soc. Med. 90 (supl. 30):3-9). Cuando se somete a los niños alérgicos al huevo a una dieta desprovista de toda proteína de huevo, alrededor de un tercio desarrolla tolerancia clínica al huevo en un plazo de 2 años, aunque los anticuerpos de tipo IgE frente al huevo (pruebas de punción cutánea positivas) persisten durante varios años (Sampson 1989). El ovomucoide (Gal d 1) es el alérgeno dominante en los huevos de gallina y los niños con alergia persistente al huevo presentan concentraciones de anticuerpos de tipo IgE anti-ovomucoide significativamente
25 mayores que aquéllos que “superan” su reactividad (Bernhisel-Broadbent, J., y col. 1994. J Allergy Clin Immunol 93:1 047-1 059). El ovomucoide es una glicoproteína compuesta por 186 aminoácidos dispuestos en tres dominios en tándem que contienen nueve puentes disulfuro dentro de los dominios y cinco cadenas laterales de hidratos de carbono (Kato y col. 1987. Biochemistry 26: 193-201).
Es un objeto de la presente invención proporcionar un ensayo que incluya procedimientos y reactivos para predecir la probabilidad de que los niños superen una alergia, especialmente una alergia alimentaria.
Por tanto, la presente invención proporciona una prueba pronóstica de alergia que comprende:
35 proporcionar suero procedente de un niño alérgico; poner en contacto el suero con al menos un epítopo lineal de un alérgeno seleccionado en condiciones que permitan que los anticuerpos específicos del epítopo, si están presentes en el suero, se unan al epítopo; y observar los niveles de anticuerpo de tipo IgE que se unen a dicho epítopo; en la que la observación de niveles estadística y significativamente elevados de anticuerpo de tipo IgE que se une a dicho epítopo con respecto a un nivel control de anticuerpo de tipo IgE que se une a dicho epítopo observado con individuos no alérgicos es indicativa de una alergia
En el presente documento también se describe un procedimiento y reactivos para la detección selectiva de la presencia de anticuerpos contra epítopos conformacionales frente a lineales en muestras de pacientes.
45 Sumario de la invención
Se proporcionan procedimientos y reactivos para usar en la predicción de la probabilidad de que un niño supere una alergia, especialmente una alergia alimentaria, realizando detección selectiva de la inmunorreactividad de anticuerpos de tipo IgE con epítopos lineales en comparación con epítopos conformacionales. En primer lugar, se realiza detección selectiva del niño mediante técnicas estándar para determinar a qué antígenos es alérgico el niño. Después, las inmunoglobulinas de la muestra del paciente se caracterizan usando el antígeno natural purificado, el antígeno recombinante, el antígeno reducido y alquilado, fragmentos proteolíticos del antígeno o péptidos sintéticos de entre cuatro y 40 aminoácidos de longitud, preferentemente de seis a diez aminoácidos, que se pueden
55 inmovilizar para una detección selectiva rápida y precisa. Los anticuerpos del paciente normalmente presentes en una muestra de suero o plasma reaccionan con la proteína o los péptidos para determinar qué péptidos se unen a los anticuerpos. Después, estos anticuerpos se caracterizan para determinar si los epítopos a los que se unen son lineales o conformacionales. Los pacientes que tienen anticuerpos reactivos principalmente contra epítopos conformacionales (es decir, reactivos con la proteína nativa o los fragmentos proteolíticos, en comparación con la proteína reducida y alquilada o péptidos lineales sintéticos) normalmente superan sus alergias. Aquéllos en los que son reactivos principalmente con los epítopos lineales pueden no superar su reactividad y pueden tener que ser tratados para inducir tolerancia.
El procedimiento de detección selectiva se demuestra en un ejemplo usando sueros combinados de pacientes
65 alérgicos al huevo y solapando los decapéptidos sintéticos derivados de la secuencia del ovomucoide. Se descubrió que el ovomucoide poseía cinco epítopos de unión a IgE alergénicos. La evaluación de epítopos alergénicos con sueros de pacientes individuales reveló tres patrones de unión a epítopo: unión extensa de IgE a los decapéptidos en los tres dominios del ovomucoide, unión de IgE predominantemente a los péptidos del primer dominio y prácticamente ausencia de unión de IgE a ningún péptido sintético, lo que indica que la mayoría de los anticuerpos de tipo IgE en el último grupo reconocía epítopos conformacionales. Todos los pacientes tenían una extensa unión
5 de anticuerpos de tipo IgG a los péptidos sintéticos lineales, mientras que los controles no alérgicos al huevo solo reconocían epítopos conformacionales. Los pacientes del grupo con unión extensa de IgE a decapéptidos lineales tendían a ser de más edad y a tener síntomas alérgicos generalizados más graves tras la ingestión de huevo que el grupo de pacientes con pocos anticuerpos de tipo IgE a los péptidos sintéticos. Estos hallazgos indican que el procesamiento antigénico diferencial y el reconocimiento estructural del anticuerpo-epítopo desempeñan un papel en la evolución clínica de la sensibilidad al alérgeno.
Un procedimiento similar de la evaluación de los anticuerpos de tipo IgG o IgA se puede usar para predecir el pronóstico de ciertos trastornos inflamatorios, especialmente los que afectan al tracto gastrointestinal, tal como enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y enfermedad celíaca.
Breve descripción de las figuras
Figure 1. Puntuaciones de la DO acumulada de IgE de Gal d 1 en SPOT para cada uno de los 89 decapéptidos sintéticos solapantes generados en la membrana de SPOT. Las puntuaciones reflejan la unión total de los 17 pacientes alérgicos al huevo estudiados. Figure 2. Puntuaciones de la DO acumulada de IgG de Gal d 1 en SPOT para cada uno de los 89 decapéptidos sintéticos solapantes generados en la membrana de SPOT. Las puntuaciones reflejan la unión total de los 17 pacientes alérgicos al huevo estudiados. Figuras 3a-c. Patrones de la unión de IgE específica del ovomucoide a decapéptidos sintetizados, mostrados
25 como las puntuaciones de la DO acumulada de la IgE de Gal d 1 en SPOT: el Grupo 1; Figura 3a, poseía anticuerpos de tipo IgE frente a epítopos en los tres dominios del ovomucoide, el Grupo 2, Figura 3b, tenía anticuerpos de tipo IgE específicos del ovomucoide principalmente frente a los epítopos en el primer dominio del ovomucoide, y el Grupo 3, Figura 3c, tenía una cantidad insignificante de anticuerpos de tipo IgE frente a cualquier decapéptido sintético. Figuras 4a-e. Puntuaciones de la mediana de la DO acumulada de IgG de Gal d 1 en SPOT, pacientes alérgicos al huevo (Figuras 4a-4c) y controles no alérgicos al huevo: pacientes con dermatitis atópica sin alergia al huevo (Figura 4d) y controles normales no alérgicos (Figura 4e). Figuras 5a-b. Se comparó la proporción de anticuerpos de tipo IgE (Figura 5a) e IgG (Figura 5b) específica del ovomucoide frente al ovomucoide nativo y “linealizado” (reducido y alquilado) para cada grupo de pacientes
35 alérgicos al huevo.
Descripción detallada de la invención
En la generación de anticuerpos específicos de IgE, los linfocitos B se activan tras la unión de IgM de superficie con oligopéptidos expuestos sobre la proteína nativa. Los consiguientes anticuerpos de tipo IgE producidos pueden estar dirigidos a epítopos lineales, que representan de 8-20 aminoácidos consecutivos (secuenciales), o a epítopos conformacionales, que están compuestos por residuos de aminoácidos de diferentes regiones del alérgeno. Se han definido epítopos tanto lineales (p. ej., Phl p 1; fleo (Ball, y col., 1994. J Biol Chem 269: 28232-28242)) como conformacionales (Bet v 1; polen de abedul (Laffer, y col. 1996. J Immunol 157:4953-4962)) de linfocitos B contra
45 alérgenos aéreos inhalados, aunque se supone que los últimos son predominantes. Dado que los alérgenos alimentarios están sometidos a una extensa digestión química y proteolítica antes de la absorción y la captación por las células del tejido linfoide asociado al intestino, se ha deducido que los epítopos alergénicos de alimentos son de naturaleza predominantemente lineal. No obstante, en un estudio anterior usando sueros combinados de pacientes alérgicos al huevo, se identificaron 5 sitios de unión al anticuerpo de tipo IgE y 7 de tipo IgG a lo largo de los 186 residuos de aminoácidos que comprenden ovomucoide (Cooke y Sampson J. Immunol. 1997159, 2026-2032). La evaluación del ovomucoide reducido y alquilado, es decir “linealizado” sugirió que no todos los pacientes tenían anticuerpos anti-ovomucoide que reconocieran epítopos lineales y que algunos tenían epítopos predominantemente conformacionales.
55 En el ejemplo siguiente se usaron decapéptidos lineales solapantes y ovomucoide entero (reducido y alquilado) para comparar el reconocimiento por los anticuerpos de tipo IgE del paciente de los epítopos ovomucoides lineales. Se seleccionaron sueros de 17 niños alérgicos al huevo con niveles relativamente altos de anticuerpos de tipo IgE específicos del huevo (superiores o iguales a 35 kUA/l) para la detección selectiva de epítopos ovomucoides. Cuando se comparó la unión de IgE a los decapéptidos sintetizados pareció que había tres patrones diferentes de unión al anticuerpo. Como se representa en la Figure 3a-3c, los anticuerpos de tipo IgE de un grupo de pacientes reconoció la mayoría de los epítopos alergénicos ovomucoides identificados anteriormente (Cooke y Sampson J. Immunol. 1997 159, 2026-2032), los epítopos alergénicos reconocidos por la IgE de un grupo principalmente en el primero dominio del ovomucoide y el tercer grupo no presentó casi unión de IgE a ninguno de los decapéptidos sintetizados. En los pacientes alérgicos al huevo estudiaros, se observaron tres patrones de unión de IgE específica
65 de ovomucoide a los decapéptidos sintetizados. Como se refleja en las puntuaciones de la mediana de la DO acumulada de IgE de Gal d1 en SPOT, un grupo de pacientes (Grupo 1; Figura 3a) poseía anticuerpos de tipo IgE frente a epítopos en los tres dominios del ovomucoide, un grupo tenía anticuerpos de tipo IgE específicos del ovomucoide principalmente frente a los epítopos en el primer dominio del ovomucoide (Grupo 2; Figura 3b) y un grupo de anticuerpos de tipo IgE frente a cualquier decapéptido sintético (Grupo 3; Figura 3c).
5 Dado que las cantidades de anticuerpos de tipo IgE específicos de huevo eran similares en los tres grupos, esto sugirió que el tercer grupo de pacientes poseía anticuerpos de tipo IgE específicos de ovomucoide que reconocían principalmente epítopos conformacionales: Esta suposición estaba respaldada por hallazgos de comparación de la unión de IgE específicos de ovomucoide de pacientes a ovomucoide "nativo2 y "linealizado" (reducido y alquilado) (Figura 5ª). Aunque la unión de anticuerpos de IgE específicos de ovomucoide al ovomucoide nativo fue similar en los 3 grupos de pacientes, solo aproximadamente el 22 % de la IgE específica de ovomucoide de los tres grupos se unió al ovomucoide linealizado en comparación con la forma nativa, mientras que más del 50 % de la IgE específica de ovomucoide de los primeros grupos se unió a la forma linealizada del ovomucoide.
Estos estudios han conducido al desarrollo de un procedimiento para la determinación de la probabilidad de que un 15 niño concreto “supere” una alergia, especialmente una alergia alimentaria.
Ensayo para determinar la probabilidad de superar una alergia
Procedimiento
El procedimiento se basa en el descubrimiento de que es más probable que los niños toleren o “superen2 las alergias a los epítopos conformacionales en comparación con los epítopos lineales. Por tanto, el ensayo normalmente se realizará usando muestras de sangre o de suero de niños. Estos individuos se identifican primero realizando la detección selectiva de alergias usando ensayos convencionales, por ejemplo mediante el ensayo de la
25 punción cutánea o inyección de uno o más antígenos a diferentes títulos para determinar si el individuo es alérgico al antígeno y el grado hasta el cual el individuo es alérgico. Normalmente los anticuerpos se obtienen extrayendo una muestra de sangre del paciente, eliminando los glóbulos rojos y analizando el suero o plasma restante. Las muestras se pueden someter a detección selectiva directamente para determinar la reactividad de la IgE con epítopos definidos presentados por el antígeno (Cooke y Sampson J. Immunol. 1997 159, 2026-2032) o los anticuerpos de tipo IgE separados de los demás anticuerpos usando procedimientos conocidos para los expertos en la técnica y se someten a detección selectiva para detectar la reactividad. Opcionalmente, la muestra también se puede someter a detección selectiva de anticuerpos de tipo IgE reactivos con los epítopos.
Aunque los 17 pacientes alérgicos al huevo en el estudio descrito en el ejemplo desarrollaron hipersensibilidad al
35 huevo en los primeros dos años de vida, el primer grupo de pacientes era mayor y tenía reacciones alérgicas tras la ingestión de huevo más pronunciadas que el tercer grupo de pacientes. La unión extensa del anticuerpo de tipo IgE específico de ovomucoide del primer grupo de pacientes a numerosos epítopos alergénicos lineales es similar a la observada en los pacientes alérgicos al cacahuete a los alérgenos principales del cacahuete Ara h 1 y Ara h 2 (Stanley, y col. 1997. Arch. Biochem. & Biophysic. 342, 244-253). Los pacientes con alergia a los cacahuetes tienden a tener una reactividad "prolongada” (durante la vida) al cacahuete (Bock y Atkins 1989), lo que sugiere la posibilidad de que la hipersensibilidad alimentaria “prolongada” está asociada con el desarrollo de cantidades significativas de anticuerpos de tipo IgE frente a epítopos lineales. Cabe destacar que un individuo alérgicos al huevo de 32 años de edad, que no forma parte de los 17 inicialmente sometidos a ensayo, que ha experimentado varias reacciones anafilácticas al huevo tiene anticuerpos de tipo IgE específicos del ovomucoide con una unión extensa a los
45 decapéptidos lineales, como se ve en el primer grupo de pacientes de este estudio.
El ejemplo respalda la asociación entre la unión de IgE a la estructura del epítopo, es decir lineal frente a conformacional, y el desarrollo de hipersensibilidad alimentaria “prolongada”. Se ha demostrado que los lactantes tienen mayores niveles de proteínas alimentarias en la circulación después de las comidas, que se supone que es secundaria a un retraso en la maduración en el desarrollo de procesos digestivos, por ejemplo acidez de estómago, actividad de enzimas proteolíticas, composición de la mucina, etc., en incremento de la captación del antígeno (Hyman, y col. 1985. J Pediatr 106:467-471; Lebenthal, E. y P. C. Lee. 1980. Pediatrics 66:556-560; Shub, y col. 1983. Biochem J 215:405-411; Bresson, y col. 1984. Pediatr Res 18: 984-987). El intestino “con fugas” del lactante permitiría que cantidades significativas de proteínas alimentarias conformacionalmente intactas obtengan acceso a 55 los linfocitos B locales que tras la activación generan anticuerpos de tipo IgE específicos del ovomucoide en huéspedes genéticamente predispuestos. Con la maduración del tracto gastrointestinal, menos proteína intacta conformacionalmente sería accesible para activar el tejido linfoide asociado al intestino y los mastocitos del tejido portadores de IgE, lo que tiene como resultado la pérdida de reactividad clínica y la pérdida eventual de síntesis de anticuerpos de tipo IgE específicos del alérgeno. La exclusión completa de la dieta de la proteína del huevo estimularía adicionalmente la pérdida de reactividad clínica, mientras que la exposición continuada a cantidades de la proteína del huevo podría tener como resultado el desarrollo de anticuerpos de tipo IgE frente a los epítopos lineales del ovomucoide y la reactividad prolongada. En el intestino maduro, cantidades mínimas de proteínas inmunológicamente intactas (probablemente epítopos lineales) atraviesan la barrera gastrointestinal (Host 1994; Brunner, Mand Walzer M. 1928. Arch Intern Med 42:173-179; Wilson SJ y Walzer M. 1935. Am J Dis Child 50:49-54; 65 Husby, y col., 1985. Scand J ImmunoI22:83-92). Probablemente quedan excluidas las proteínas conformacionalmente intactas. Esto es consistente con la observación de que la probabilidad de perder reactividad
clínica está asociada con la edad del paciente en el momento del diagnóstico, el grado de evitación del alérgeno responsable y el alérgeno en cuestión (las alergias a cacahuetes, nueces y mariscos rara vez se "superan"). Los niños más pequeños producen IgE conformacional. Cuando más joven es el paciente en el momento del diagnóstico de la sensibilidad alimentaria (Bock 1982; Sampson y Scanlon 1989; Pastorello, y col. 1989. JAllergy Clin Immunol
5 84:475-483).
Alérgenos
Se puede usar cualquier antígeno para la detección selectiva como se describe en el presente documento. Los antígenos más típicos serán alérgenos alimentarios, tales como huevo, nuez, cacahuete y leche. Otros alérgenos comunes incluyen pólenes, mohos y ácaros, así como insectos, animales domésticos (perros, gatos, aves) y plantas. Los alérgenos son antígenos que proporcionan respuesta de tipo IgE.
Para analizar la reactividad con epítopos conformacionales, los alérgenos se pueden usar como la proteína intacta,
15 proteína recombinante o fragmentos proteolíticos. Las propiedades del alérgeno se pueden modificar mediante la selección del huésped de expresión, por ejemplo sistemas de expresión bacteriana normalmente no glicosilan proteínas, los sistemas de levaduras y baculovirus/insectos dan glicosilación modificada e incluso dentro de los sistemas eucariotas puede haber modificaciones en la glicosilación y fosforilación, para alterar la reactividad y caracterizar adicionalmente el epítopo.
Los epítopos lineales pueden ser fragmentos proteolíticos o péptidos cortos hechos mediante la expresión de ADN recombinante o sintéticamente usando tecnología estándar. Normalmente, los péptidos tendrán una longitud de cuatro a cuarenta aminoácidos, más preferentemente de seis a veinte, más preferentemente ocho. Estos se diseñan en base a la secuencia de aminoácidos conocida, normalmente disponible a través de una fuente pública, tal como
25 GenBank. Los péptidos se sintetizan en la realización preferida comenzando en de uno a nueve residuos aminoácidos, de dos a diez y así sucesivamente hasta el final de la proteína.
El alérgeno o la porción del mismo cuya unión se va a analizar se inmovilizan, preferentemente, por ejemplo, en una placa de 96 pocillos o en un pedazo de papel de cromatografía y después se analiza la unión tal como se ha descrito en el ejemplo. El alérgeno se puede unir a una partícula u otro medio conocido para analizar la fase en solución o analizar en un ELISA o usando una técnica fluorométrica.
Procedimientos para el tratamiento de las alergias, especialmente alergias alimentarias
35 Es más probable que los individuos que tienen principalmente IgE reactiva con los epítopos conformacionales superen la alergia que los caracterizados principalmente mediante reactividad con epítopos lineales. Esto se demuestra adicionalmente mediante los ejemplos. En lactantes predispuestos a atopia, el desarrollo de anticuerpos de tipo IgE frente a epítopos conformacionales frente a lineales puede reflejar, en parte, retraso de la maduración y/o diferencias moleculares en el procesamiento de los antígenos por el tracto gastrointestinal, inmadurez del intestino y exposición a alérgenos. En los estudios sobre la prevención de la alergia en lactantes en “riesgo alto” para desarrollar atopia se ha demostrado que la evitación completa de leche de vaca (un alérgeno alimentario mayoritario) durante al menos el primer año de vida tiene como resultado menos alergias a la leche en comparación con los lactantes sin restricciones de la dieta (Zeiger, y col. 1989. J Allergy Glin ImmunoI 84: 72-89; Halken, y col. 1992. Allergy 47:545-553).
45 En base a la información anterior, se puede desarrollar procedimientos de detección selectiva generalizados y formulaciones para detección selectiva, para ayudar en la decisión de si un paciente se somete o no a una modalidad inmunoterapéutica para inducir tolerancia en pacientes alérgicos. Las modalidades inmunoterapéuticas que se pueden prescribir en base a los resultados de la detección selectiva incluyen evitación completa del alérgeno, por ejemplo el alimento que contiene los epítopos reactivos con la IgE del paciente, o terapia de desensibilización.
El ejemplo demuestra que los pacientes con alergias al huevo prolongadas poseen grandes cantidades de anticuerpos de tipo IgE que se unen a epítopos lineales del ovomucoide, mientras que los pacientes más jóvenes poseen principalmente anticuerpos de tipo Ig E que se unen a epítopos conformacionales. Además, los pacientes
55 alérgicos al huevo desarrollan cantidades significativas de anticuerpos de tipo IgG específicos del ovomucoide frente a epítopos lineales y conformacionales, mientras que los individuos no alérgicos al huevo desarrollan IgG específicas del ovomucoide casi exclusivamente frente a epítopos conformacionales.
Como se ha indicado anteriormente, también se ven niveles elevados de anticuerpos IgG específicos de alimentos en trastornos marcados por inflamación del tracto gastrointestinal, por ejemplo enfermedad de Chron, colitis ulcerosa, enfermedad celíaca etc. (Sampson, H.A.: 199511 (6), 548-553). Se cree que los niveles elevados de anticuerpos específicos de alimentos son secundarios al incremento de la permeabilidad del intestino en estos trastornos y no son patogénicos. En trastornos intestinales inflamatorios no complicados, es probable que estos anticuerpos de tipo IgG específicos de alimentos estén dirigidos a epítopos conformacionales. No obstante, en la
65 enfermedad intestinal resistente progresiva, se cree que los anticuerpos de tipo IgG específicos de alimentos están dirigidos a epítopos lineales, lo que indica una respuesta inmunitaria anormal y un pronóstico desfavorable.
Como se muestra en el ejemplo, cuando se evaluó la unión del anticuerpo de tipo IgG específico del ovomucoide a decapéptidos lineales, se observaron diferencias significativas entre grupos de pacientes alérgicos al huevo y controles. El primer grupo de pacientes, que tenía la mayor cantidad de IgE específica del ovomucoide frente a decapéptidos lineales, tenia menos unión de anticuerpo de tipo IgG específico del ovomucoide a los decapéptidos 5 del ovomucoide que el segundo y el tercer grupo de pacientes (Figura 4a -4c). Como se refleja en las puntuaciones de la DO mediana acumulada de IgG de Gal d1 en SPOT, los pacientes alérgicos al huevo (Figures 4a -4c) presentaban una extensa unión de IgG a epítopos en los tres dominios del ovomucoide y significativamente más anticuerpos de tipo IgG específicos del ovomucoide a los decapéptidos de SPTO que los controles no alérgicos al huevo: pacientes con dermatitis atópica sin alergia al huevo (Figura 4d) y controles normales no alérgicos (Figura 4e). El segundo grupo (Figura 4b) y el tercer grupo (Figura 4c) de los pacientes alérgicos al huevo tenían significativamente más unión del anticuerpo de tipo IgG a los péptidos sintetizados que el primer grupo (Figura 4a). No obstante, no había ninguna diferencia significativa en el porcentaje de unión de IgG específica del ovomucoide al ovomucoide “linealizado” en comparación con la forma nativa (Figura 5b). Los grupos control consistentes en pacientes de dermatitis atópica que no eran alérgicos al huevo y los controles normales no alérgicos tenían
15 anticuerpos de tipo IgG significativos frente al ovomucoide nativo pero casi ningún anticuerpo de tipo IgG no específico del ovomucoide frente a los decapéptidos lineales (Figura 4d -4e). Estos resultados sugieren una diferencia cualitativa a nivel de procesamiento antigénico entre individuos alérgicos y no alérgicos a alimentos en su respuesta inmunitaria a alérgenos ingeridos.
Por tanto, es posible realizar la detección selectiva de los individuos que tienen trastornos inflamatorios que es probable que se caractericen por enfermedad intestinal resistente progresiva en comparación con trastornos intestinales inflamatorios no complicados. Los procedimientos y reactivos son similares a aquéllos para determinar la probabilidad de que in individuo supere una alergia en base a las proporciones relativas de IgE inmunorreactivas con epítopos conformacionales frente a lineales, pero analizando la inmunorreactividad de la IgG a los epítopos lineales
25 frente a conformacionales.
La presente invención se entenderá adicionalmente con referencia a los ejemplos siguientes no limitantes.
Ejemplo: Detección selectiva de muestras de pacientes para caracterizar la inmunorreactividad de IgE e IgG anti-huevo.
PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES
Abreviaturas:
35 PBS -Solución salina tamponada con fosfato SDS-PAGE= Electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida
Población de pacientes
A diecisiete niños (mediana de edad: 4 amos; intervalo: 1-15 años; 10 varones, 7 mujeres) presentados para evaluación por dermatitis atópica se les diagnosticó con hipersensibilidad al huevo mediante exposición al huevo, doble ciego y controlado con placebo, como describen Sampson, H.A. y C.C. McCaskill. 1985. J Pediatr 107:669675; y Sampson, H.A. 1992. Acta Oerm Veneorol (Stockh) Suppl. 176:34-37. Se obtuvo sangre mediante punción
45 venosa y los sueros se separaron y almacenaron congelados a -20°C hasta que se usó en el estudio. Se determinaron las concentraciones séricas de IgE específicas de huevo usando el sistema CAP-RAST FEIA™ Pharmacia Diagnostics; Uppsala, Suecia).
Preparación de ovomucoide reducido y alquilado
El ovomucoide se redujo y se alquiló disolviendo el ovomucoide completo en PBS a una concentración de 50 mg/ml, como describen Cooke y Sampson. J. Immunol. 1997.
Electroforesis en gel SDS-poliacrilamida
55 Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE como se ha publicado anteriormente (Bern hisel-Broadbent, y col. 1989. J AIlergy Clin ImmunoI84:701-709). Las concentraciones de proteína en la muestra se optimizaron para dar la señal equivalente cuando se tiñeron con negro amido y se analizaron mediante densitometría láser. Las proteínas resueltas se transfirieron después a nitrocelulosa y después se tiñeron con negro amido para buscar la transferencia de proteína total o se bloquearon con PBS-Tween con gelatina porcina al 0,5 % para sondar con sueros de paciente.
Inmunotransferencias con sonda con sueros de pacientes
Los sueros de pacientes se diluyeron a 1:10 en PBS-Tween más gelatina, se incubaron con inmunotransferencias
65 durante 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente y se desarrollaron por anticuerpos IgE e IgG como se ha descrito previamente (Cooke y Sampson 1997). Se desarrollaron inmunotransferencias con BCIP/NBT (SigmaFAST; Sigma Chemical, St. Louis, MO) y se sometieron a barrido con densitómetro láser (Ultrascan SL; Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) para determinar la cantidad de anticuerpo específico de ovomucoide unido.
Detección selectiva de epítopos de IgE e IgG
5 En este estudio, se usó la membrana SPOT™ (Genosys Biosystems; The Woodlands, TX), una membrana de celulosa derivada, para generar decapéptidos en una matriz de 8 x 12 de pequeñas manchas circulares. Usando este procedimiento se generaron 89 decapéptidos que representan la totalidad de la secuencia de Gal d 1; péptidos solapados por 8 aminoácidos, por ejemplo péptido nº 1 = aminoácidos 1-10 de Gal d 1, péptido nº 2= aminoácidos 312 de Gal d 1, péptido nº 3 = aminoácidos 5-14 de Gal d 1, etc.
Antes de la detección selectiva de los péptidos de Gal d 1 solapantes con sueros de pacientes, la membrana SPOTs se bloqueó con PBS (pH 7,2) que contiene Tween 20 al 0,01 %, gelatina porcina al 0,5 % y suero humano al 1 % (de un donante sin IgE detectable frente a proteínas del huevo). Los sueros de pacientes individuales se diluyeron a 1:12
15 en PBS con Tween 20 al 0,01 % y gelatina porcina al 0m5 % (PBS-Tween + gel), se incubaron en una plataforma de balanceo a temperatura ambiente durante 2 horas y se desarrollaron por anticuerpos IgE e IgG como se ha descrito previamente (Cooke y Sampson 1997). Para detectar anticuerpos de tipo IgG, los sueros de los pacientes de diluyeron a 1:10 en PBS-Tween+gel. Los tiempos de incubación y lavados fueron los mismos que para el anticuerpo de tipo IgE. El anticuerpo de detección usado fue IgG anti-humano de conejo-HRP (Dako Corp, Santa Barbara, CA). La membrana se desarrolló con el kit de detección quimioluminiscente de ECL HRP (Amersham, Arlington Heights, IL).
Después de desarrollar la película de rayos X, la densidad óptica (DO) de cada mancha de péptido individual se midió usando un densitómetro de reflexión (The Answer II MacBeth, Newburgh, NY). La DO de cada mancha
25 peptídica se registró como la diferencia entre la DO de la mancha peptídica real y la DO en la película de fondo. A cada uno de los 89 decapéptidos se les asignó una puntuación de DO de IgE e IgG de Gal d 1 "acumulada en SPOTS", que representaba la suma de las DO para cada uno de los 89 péptidos de Gal d 1 en SPOT para los 17 pacientes estudiados. Cada paciente recibió una puntuación de DO de IgE e IgG de Gal d1 “acumulada del paciente”, que representaba la suma de las DO para los 89 péptidos de Gal d 1 en SPOR para dicho paciente.
La membrana SPOTs se pudo regenerar y se volvió a sondar de 8 a 10 veces. Después de aclarar la membrana extensamente en agua desionizada destilada, se lavó 3 veces en urea 8M que contiene SDD 35 mM y BME al 0,1 % durante 10 minutos cada vez para raspar IgE o 30 minutos para la IgG. La membrana se lavó después tres veces (lavados de 10 minutos) en etanol al 50 % y ácido acético al 10 %, dos veces (lavados de 10 minutos) en metanol y,
35 después, se volvió a bloquear para repetir la sonda. La incubación de la membrana con el anticuerpo secundario solo (IgE o IgG anti-humano) tras el procedimiento de raspado en ausencia de suero de paciente reveló ausencia de unión inespecífica, lo que indica que el procedimiento de raspado había regenerado con éxito la membrana SPOT.
Análisis estadístico
Todos los análisis de los datos se realizaron con ensayos no paramétricos, el ensayo del signo pareado de dos muestras y el ensayo de Mann-Whitney.
RESULTADOS
45 En el estudio se usaron sueros de 17 niños con alergia al huevo confirmada por exposiciones controladas a alimento doble ciego y controladas con placebo. Todos tenían niveles séricos marcadamente elevados de IgE específica de huevo; mediana-83 Kua/l; intervalo – 35 a más de 100 kUA/l. Los sueros de cada paciente individual se usaron para sondar la membrana SPOTs de anticuerpos de tipo IgE e IgG específicos de péptido. La Figura 1 representa las puntuaciones de DO acumulada de IgE de Gal d 1 en SPOTs para cada uno de los 89 péptidos sintéticos. Los péptidos nº 1, 5, 6, 24, 25 y 57 se unieron a los anticuerpos de tipo IgE de más del 50 % de los pacientes, lo que indica que estos péptidos representan “epítopos alergénicos importantes”. Estos epítopos alergénicos importantes representan los aminoácidos 1-10 de Gal d 1 (péptido 1, AEVOCSRFPN), 9-20 (péptidos 5 y 6, PNATOKEGKOVL), 47-58 (péptidos 24 y 25, SIEFGTNISKEH) y 113-122 (péptido 57, VEQGASVOKR). Otros péptidos sintéticos con
55 puntuaciones DO de IgE de Gal d 1 significativas incluyeron los péptidos 2 (aminoácidos 3-12, VOCSRFPNAT), 4 (aminoácidos 7-16, RFPNATOKEG), 21 (aminoácidos 41-50, CLLCAYSIEF), 38 y 39 (aminoácidos 75-86, NTISEOGKVMVL), 53 (aminoácidos 105-114, ECLLCAHKVE) y 89 (aminoácidos 177-186, TLTLSHFGKC). La mayoría de estos péptidos se unieron a los anticuerpos de tipo IgE de 6 o más pacientes. La Figura 2 representa las puntuaciones de DO acumulada de IgG de Gal d 1 en SPOTs para cada uno de los 89 decapéptidos sintéticos. Había una unión más extensa de los anticuerpos de tipo IgG a los péptidos sintéticos de Gal d 1 en comparación con la unión de IgE.
Cuando la unión del anticuerpo de tipo IgE a las membranas SPOTS se compararon los decapéptidos para cada paciente, se observaron tres patrones diferentes de unión al péptido.
65 Grupo 1-Anticuerpos de tipo IgE se unieron a epítopos en dos o más dominios de Gal d 1. Grupo 2-Anticuerpos de tipo IgE específicos de péptidos principalmente en el primero dominio de Gal d 1 y Grupo 3, unión insignificante de
IgE a alguno de los decapéptidos en la membrana SPOTs. Aunque no había diferencias significativas (p< 0,4) en concentraciones séricas de IgE específicas de huevo entre los 3 grupos de pacientes (Grupo1 (n=5) -80 kUA/l, Grupo 2 (n=5) -92 kUA/l y Grupo 3 (n=7) -73 kUA/l), las puntuaciones de la mediana de DO acumulada de IgE de Gal d 1 en SPOTs para los tres grupos de pacientes diferían significativamente. Los pacientes del grupo 1 tenían 5 significativamente más unión de IgE (mediana de la DO acumulada = 27,9) a los decapéptidos de Gal d 1 sintetizados que el grupo 2 (mediana de la DO acumulada= 7,0; p< 0,05) o el grupo 3 (mediana de la DO acumulada = 2,7; p< 0,01) y el grupo 2 tenía significativamente más unión de IgE a los péptidos de Gal d 1 que el grupo 3 (p < 0,05). La mediana de la unión de IgE a decapéptidos individuales para cada grupo de pacientes se representa en la Figura 3. Es interesante el hecho de que los pacientes de los grupos 1 y 2 tendían a ser mayores con alergia al
10 huevo más duradera en comparación con los pacientes del grupo 3; mediana de edad 10 y 6 años, respectivamente, y a todos los pacientes se les diagnosticó en los primeros 2 años de vida.
La Figura 4a -4e representa la mediana de la unión de IgG a decapéptidos individuales para cada uno de los 3 grupos de pacientes y 2 conjuntos de controles. Se observaron diferencias significativas en las puntuaciones de la 15 mediana de la DO acumulada de IgG de Gal d 1 de los pacientes entre los tres grupos de pacientes y controles: Grupo 1 52,4, Grupo 2, 70,6, Grupo 3 – 69,8, controles de dermatitis atópica no alérgicos a alimentos (n= 5), 9,6, controles no alérgicos (n= 5), 11,6. Los pacientes del grupo 1 tenían significativamente menos unión del anticuerpo de tipo IgG a los decapéptidos de Gal d 1 que los grupos 2 y 3 (p < 0,01), mientras que no había diferencias significativas entre los grupos 2 y 3 (p= 0,). Los tres grupos de pacientes alérgicos al huevo tenían significativamente
20 más unión de IgG a los decapéptidos del ovomucoide que los dos grupos control no alérgicos al huevo (p < 0,01). Los pacientes control de dermatitis atópica no alérgicos al huevo y los controles no atópicos mostraron una unión similar (p= 0,4), mínima del anticuerpo tipo IgG a los 89 decapéptidos en SPOTs.
La falta de unión de IgE a los péptidos sintetizados por los pacientes alérgicos al huevo del grupo 3 sugirió que la
25 mayoría de sus anticuerpos de tipo IgE específicos del ovomucoide reconocían epítopos conformacionales. Para analizar esto, la unión del anticuerpo de tipo IgE al ovomucoide nativo y reducido y alquilado (linealizado) se comparó en los tres grupos de pacientes. Las Figuras 5a-b representan las proporciones de la unión del anticuerpo de tipo IgE (DO) al ovomucoide reducido y alquilado en comparación con la unión del anticuerpo de tipo IgE al ovomucoide nativo. La proporción de anticuerpos de tipo IgE e IgG específica del ovomucoide frente al ovomucoide
30 nativo y “linealizado” (reducido y alquilado) se comparó para cada grupo de pacientes alérgicos al huevo. Aunque las concentraciones de anticuerpo de tipo IgE frente al ovomucoide nativo eran comparables para todos los grupos, los pacientes del grupo 1, que eran mayores con alergia al huevo de larga duración, tenían significativamente más anticuerpos de tipo IgE frente al ovomucoide linealizado que los pacientes del grupo 3, que eran más jóvenes (Figura 5a). Figura 5a – medianas: 52% vs. 22% para los grupos 1 y 3, respectivamente, p<0,05). No se observaron
35 diferencias significativas en la proporción de anticuerpos de tipo IgG frente al ovomucoide nativo linealizado entre los grupos de pacientes alérgicos al huevo (Figura 5b).

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una prueba pronóstica de alergia para una alergia prolongada en un niño, que comprende:
    5 proporcionar suero procedente de un niño alérgico; poner en contacto el suero con al menos un epítopo lineal de un alérgeno seleccionado en condiciones que permitan que los anticuerpos específicos del epítopo, si están presentes en el suero, se unan al epítopo; y observar los niveles de anticuerpo de tipo IgE que se unen a dicho epítopo; en la que la observación de niveles estadística y significativamente elevados de anticuerpo de tipo IgE que se
    10 une a dicho epítopo con respecto a un nivel control de anticuerpo de tipo IgE que se une a dicho epítopo observado con individuos no alérgicos es indicativa de una alergia
  2. 2. La prueba pronóstica de alergia de la reivindicación 1, en el que el epítopo deriva de un alérgeno seleccionado del
    grupo que consiste en proteínas de alimentos, pólenes, polvo, mohos, insectos, animales y plantas. 15
  3. 3.
    La prueba pronóstica de alergia de la reivindicación 2, en el que el alérgeno deriva de alimentos.
  4. 4.
    La prueba pronóstica de alergia de la reivindicación 3, en el que el epítopo deriva de un alérgeno seleccionado del
    grupo que consiste en cacahuetes, huevos, nueces, leche, pescado y marisco. 20
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