ES2380228T3

ES2380228T3 - Retrovirus endógeno y proteínas codificadas por env como diana para el tratamiento del cancer

Info

Publication number: ES2380228T3
Application number: ES06727501T
Authority: ES
Inventors: Marianne Mangeney; Martial Renard; Therry Heidmann; Julien Pothlichet; Marie Dewannieux
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Sud; Viroxis SAS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Sud; Viroxis SAS
Priority date: 2005-03-30
Filing date: 2006-03-30
Publication date: 2012-05-09
Anticipated expiration: 2026-03-30
Also published as: EP1871391B1; DK1871391T3; ATE538802T1; EP1871391A2; WO2006103562A2; EP2402447A1; WO2006103562A3

Abstract

Utilización de una composición que comprende: - una proteína inmunosupresora codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, 5 mutada o no, o un fragmento de la misma que comprende un dominio inmunosupresor de dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o - un ácido nucleico que codifica dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o fragmento de dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o - un ligando tal como anticuerpos, pudiendo dicho ligando unirse específicamente a dicha proteína inmunosupresora codificada por el gen env, o - un ARN bicatenario, ARNip, ARNc, miARN o un ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico del retrovirus endógeno y/o de una proteína expresada por dicho retrovirus endógeno, en la que dicho retrovirus endógeno es un retrovirus endógeno humano HERV-K dicha composición a. inhibiendo la expresión de dicho retrovirus endógeno y/o b. inhibiendo la expresión, y/o disminuyendo la concentración, y/o inhibiendo la actividad de dicha proteína expresada, y/o c. estimulando una respuesta inmunitaria contra dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno para la preparación de un fármaco destinado a la prevención y/o el tratamiento del cáncer en un mamífero, en la que las células cancerosas de dicho mamífero expresan dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno.

Description

Retrovirus endógeno y proteínas codificadas por env como diana para el tratamiento del cáncer.

La presente invención se refiere a un método para la prevención y/o el tratamiento del cáncer en un mamífero, en el que las células cancerosas expresan al menos una proteína de retrovirus endógeno, particularmente proteína inmunosupresora tal como proteína codificada por el gen env de HERV-K, particularmente la proteína Np9, comprendiendo dicho método inhibir la expresión y/o la actividad de dicho retrovirus endógeno y/o dicha proteína inmunosupresora codificada por el gen env. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un ácido nucleico que puede inhibir dicha expresión, un ligando tal como anticuerpos que pueden inhibir la actividad de dicha proteína codificada por el gen env, o un inmunógeno o una composición de vacuna que puede inducir una respuesta inmunitaria, respuesta celular o humoral dirigida contra dicha proteína codificada por el gen env. La invención se refiere además a la utilización de tal proteína codificada por el gen env, mutada o no, para la fabricación de un medicamento o composición de vacuna destinada a la prevención o el tratamiento de cánceres.

El genoma humano contiene una gran fracción (aprox. el 8%) de elementos de origen retroviral, con miles de secuencias próximas a la forma proviral integrada de retrovirus infecciosos, con dos repeticiones terminales largas (LTR) bordeando regiones internas homólogas a los genes gag, pol y env (Lower et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5177-5184; Boeke et al. (1997) en Retroviruses, eds. Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York), págs. 343-436; Lander et al. (2001) Nature 409, 860-921). Estos elementos, denominados retrovirus endógenos humanos (HERV), son lo más probablemente los remanentes provirales de infecciones de línea germinal ancestrales por retrovirus activos, que se han transmitido después de manera mendeliana. Los HERV pueden agruparse según homologías de secuencia en aproximadamente 100 familias distintas, conteniendo cada una de unos cuantos a varios cientos de elementos.

Pueden deducirse fuertes similitudes entre HERV y retrovirus actuales a partir de análisis filogenéticos en el dominio transcriptasa inversa del gen pol o el resto transmembrana (TM) del gen env, que dan a conocer la intercalación de ambas clases de elementos y sugieren una historia común y ancestros compartidos (Tristem, M. (2000) J. Virol. 74, 3715-3730; Benit et al. (2001) J. Virol. 75 (11709-11719). También se observan similitudes al nivel funcional.

Como consecuencia de la estrecha relación entre HERV y retrovirus infecciosos, y a pesar del hecho de que la mayoría de HERV han acumulado mutaciones, deleciones y/o truncamientos, sigue siendo posible que algunos elementos presenten todavía funciones de retrovirus infecciosos, que el huésped puede haber desviado a su propio beneficio. En este sentido, se ha propuesto (revisado en la referencia Venables et al. (1995) Virology 211, 589-592, Harris, J. R. (1998) BioEssays 20, 307-316) que las envueltas de HERV podrían desempeñar un papel en varios procesos incluyendo i) protección contra la infección por retrovirus actuales a través de interferencia de receptores (Best et al. (1997) Trends Microbiol. 5, 313-318), ii) protección del feto contra el sistema inmunitario materno a través de un dominio inmunosupresor ubicado en la subunidad TM de la envuelta (Cianciolo et al. (1985) Science 230, 453455; Mangeney et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14920-14925) y iii) morfogénesis de la placenta a través de efectos fusogénicos que permiten la diferenciación de células citotrofoblásticas para dar el sincitiotrofoblasto (Blond et al. (2000) J. Virol. 74, 3321-3329; Mi et al. (2000) Nature 403, 785-788).

Por tanto, la proteína de la envuelta de un miembro de la familia HERV-W, sincitina, ha conservado la capacidad para interaccionar con el receptor de los retrovirus de tipo D (Blond et al. (2000) J. Virol. 74, 3321-3329; Lavillette et al. (2002) J. Virol. 76, 6442-6452) y pueden conferir infectividad en partículas retrovirales pseudotipadas (Lavillette et al. (2002); An et al. (2001) J. Virol. 75, 3488-3489).

Según un papel simbiótico para HERV, el documento WO 01/16171 da a conocer que el producto del gen de la envuelta de HERV-W (sincitina) es una glicoproteína altamente fusogénica que se expresa específicamente en la placenta y puede mediar la fusión célula-célula ex vivo. Esta envuelta de HERV-W podría utilizarse en el tratamiento del cáncer promoviendo la formación de sincitios por células cancerosas, conduciendo así a su muerte. Trastornos en la expresión de la envuelta de HERV-W podrían alterar la morfogénesis de la placenta.

El documento WO 2004/087748 da a conocer que el producto del gen de la envuelta de HERV-FRD (denominado sincitina 2) es también una glicoproteína fusogénica que se expresa esencialmente en la placenta y puede mediar la fusión célula-célula ex vivo. También da a conocer que esta envuelta de HERV-FRD es inmunosupresora y puede utilizarse para el tratamiento inmunosupresor de pacientes, tales como pacientes aquejados de alergia, enfermedad autoinmunitaria o rechazo de injerto.

Por tanto, los HERV parecen contener todavía genes activos, que lo más probablemente se han subvertido por el huésped para su propio beneficio y deben considerarse como genes humanos auténticos. También se han revisado algunos de sus rasgos característicos y posibles papeles fisiológicos, así como efectos patológicos potenciales heredados de sus ancestros retrovirales (de Parseval et al., Cytogenet Genome Res. 2005; 110(1-4):318-32).

No obstante, ha de realizarse un análisis exhaustivo de tales genes, con el fin de evaluar su posible papel fisiopatológico en enfermedades humanas incluyendo enfermedades autoinmunitarias o enfermedades cancerígenas. De hecho, recientes estudios que demuestran la expresión de ARNm de HERV en células cancerosas (Wang-Johanning et al., Cancer, 2003, 98(1), 187-197; Yi et al., Journal of General Virology, 2004, 85, 1203-1210; Armbruester et al., Clinical Cancer Research, 2002, 8, 1800-1807, J. Virol. Octubre de 2004; 78(19):10310-10319) sugieren que estas proteínas codificadas por HERV pueden presentar una función en tumorigénesis y utilizarse como marcadores.

Debido a que actualmente hay una necesidad de nuevos métodos en la lucha contra el cáncer, sería por tanto beneficioso proporcionar procedimientos específicos.

Los inventores han demostrado que los tumores presentan la capacidad de escapar de la vigilancia inmunitaria y pueden saturar el sistema inmunitario expresando la envuelta de un ERV, dando como resultado el bloqueo de la expresión de ERV un rechazo del tumor potenciado y restaurando parcialmente la expresión de la única proteína de la envuelta de ERV el grado inicial de progresión tumoral. También han demostrado que la expresión de la proteína codificada por el gen env de HERV-K tal como la proteína Np9 induce la regulación por disminución de antígenos de del CMH de clase I, un rasgo característico de células tumorales que les permite escapar de la vigilancia inmunitaria.

De ese modo, la selección como diana de tales genes mediante cualquier medio disponible contribuirá a la regresión del tumor restaurando la capacidad natural del sistema inmunitario para rechazar células tumorales, y por tanto contribuirá al tratamiento del cáncer.

Este es el objetivo de la presente invención. La presente invención proporciona la utilización de una composición que comprende:

-: una proteína inmunosupresora codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, mutada o no, o un fragmento de la misma que comprende un dominio inmunosupresor de dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o

-: un ácido nucleico que codifica para dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o fragmento de dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o

-: un ligando tal como anticuerpos, pudiendo dicho ligando unirse específicamente a dicha proteína inmunosupresora codificada por el gen env, o

-: un ARN bicatenario, ARNip, ARNc, miARN o un ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico del retrovirus endógeno y/o de una proteína expresada por dicho retrovirus endógeno,

dicha composición

-: inhibiendo la expresión de dicho retrovirus endógeno y/o

-: inhibiendo la expresión, y/o disminuyendo la concentración, y/o inhibiendo la actividad de dicha proteína expresada, y/o

-: estimulando una respuesta inmunitaria contra dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno

para la preparación de un fármaco destinado a la prevención y/o el tratamiento del cáncer en un mamífero, en la que las células cancerosas de dicho mamífero expresan dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno.

Todos los cánceres inducidos por la expresión de retrovirus endógeno o proteína endógena del mismo pueden prevenirse y/o tratarse mediante el método de la presente invención inhibiendo la expresión de dicho retrovirus endógeno y/o inhibiendo la expresión, y/o disminuyendo la concentración, y/o inhibiendo la actividad de dicha proteína expresada por las células cancerosas. Entre estos cánceres, se prefieren melanoma, neuroblastoma, tumores de células germinales, tumores de mama y leucemia, siendo melanoma y neuroblastoma los más preferidos.

En una forma de realización, el método según la presente invención se caracteriza porque la proteína de retrovirus endógeno es inmunosupresora, prefiriéndose particularmente una proteína codificada por el gen env de retrovirus endógeno. Entre estas proteínas codificadas por el gen env de retrovirus endógeno, se prefieren particularmente:

-: las proteínas ENV o análogo de las mismas; o

-: las proteínas que están codificadas por el gen env pero que no son la proteína ENV (proteína de la envuelta), tal como la proteína Np9 de HERV-K o análogo de la mismas.

Por “análogo de ENV”, pretende designarse una proteína que presenta una identidad de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o superior con una proteína ENV de retrovirus endógeno, preferiblemente HERV. Más preferiblemente, esta proteína análoga de ENV es inmunosupresora y/o puede inducir la proliferación de células cancerosas cuando se expresa en estas células.

Por “análogo de Np9”, pretende designarse una proteína que presenta una identidad de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o superior con una proteína Np9 que presenta la secuencia SEC ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos de Np9 tal como se representa en el número de registro de Genbank P61580, P61581, P61582 y P61583. Más preferiblemente, está proteína análoga a Np9 es inmunosupresora y/o puede inducir la proliferación de células cancerosas cuando se expresa en estas células.

En una forma de realización preferida, la invención se refiere a la utilización según la presente invención en la que dicho retrovirus endógeno es un retrovirus endógeno humano (HERV), seleccionado del grupo de HERV que consiste en HERV-K, HERV-FRD, HERV-H, HERV-T, HERV-R, HERV-V, HERV-P (b), HERV-E, HERV-F(c)1, HERV-F(c)2 y HERV-R(b).

La secuencia de estos HERV puede encontrarse en los documentos Blaise et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2003, 100(22):13013-8), de Parseval et al. (J. Virol. Octubre de 2003; 77(19):10414-22), Blaise et al. (Retrovirology 2005, 2(1):19); de Parseval et al. (Cytogenet Genome Res. 2005, 110(1-4):318-32 (revisión)).

En una forma de realización más preferida, el retrovirus endógeno humano es un HERV-K.

En otra realización más preferida, el retrovirus endógeno humano es un subtipo de HERV-K caracterizado porque el marco de lectura abierto que codifica para la proteína viral env codifica para una proteína Np9, preferiblemente seleccionado del grupo constituido por el subtipo de HERV-K HERV-K101, HERV-K102, HERV-K107 y HERV-K(II).

En otra realización más preferida, dicha proteína Np9 presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

-: a) la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3 o de una proteína Np9 de un subtipo de HERV-K tal como se representa en Genbank (GenPept) con el número de registro P61580, P61581, P61582 y P61583; y

-: b) una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 75% con una secuencia de aminoácidos de a) y que presenta una actividad inmunosupresora.

Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o presentan un porcentaje especificado de residuos de aminoácido que son iguales (es decir, una identidad de aproximadamente el 75%, preferiblemente una identidad del 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98%, el 99% o superior a lo largo de una región especificada cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o región designada) tal como se mide utilizando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto, o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, el sitio web de NCBI). La definición también incluye secuencias que presentan deleciones y/o adiciones, así como las que presentan sustituciones. Tal como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden explicar huecos y similares. Preferiblemente, existe identidad a lo largo de una región que presenta al menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente a lo largo de una región que presenta 25-75 aminoácidos de longitud.

Para la comparación de secuencias, normalmente una actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Preferiblemente, pueden utilizarse parámetros por defecto del programa, o pueden designarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces los porcentajes de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Se conocen bien en la materia procedimientos de alineación de secuencias para comparación. Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).

En un aspecto particular, la utilización según la presente invención se caracteriza porque la expresión del retrovirus endógeno y/o de la proteína inmunosupresora de retrovirus endógeno se inhibe por un ácido nucleico, tal como un ARN bicatenario, un ARNip (ARN de interferencia pequeño), un ARNc (ARN corto), miARN (micro ARN) o un ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico de dicho retrovirus endógeno y/o de dicha proteína inmunosupresora de retrovirus endógeno.

“�?cido nucleico” se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma o bien mono o bien bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o enlaces o residuos de estructura principal modificados, que son sintéticos, se producen de manera natural y se producen de manera no natural, que presentan propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de referencia. Los ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, ribonucleótidos de 2-Ometilo, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

Dicho ácido nucleico, tal como un ARN bicatenario, ARNip, ARNc, miARN o un ácido nucleico antisentido, se refiere a un ácido nucleico que presenta la capacidad para reducir o inhibir la expresión (transcripción y/o traducción) de secuencias de ácido nucleico diana de dicho retrovirus endógeno y/o de dicha proteína de retrovirus endógeno cuando dicho ácido nucleico se introduce o se expresa en la misma células que el ácido nucleico diana. Dicho ácido nucleico presenta identidad sustancial o completa con la secuencia complementaria del gen diana y de ese modo puede hibridarse con el mismo. Normalmente, dicho ácido nucleico presenta al menos aproximadamente 15-50 nucleótidos de longitud, de manera preferible aproximadamente 20-25 nucleótidos de longitud.

Por moléculas de ácido nucleico antisentido pretende designarse moléculas que son complementarias al ácido nucleico sentido de selección como diana o al ácido nucleico sentido que codifica para la proteína diana tal como la proteína codificada por el gen env diana, por ejemplo, complementarias a la hebra codificante de una molécula de ADNc bicatenario o complementarias a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede unirse por puentes de hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a toda una hebra que codifica para proteína, o sólo a una parte de la misma, por ejemplo, toda o parte de la región que codifica para proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico antisentido puede ser antisentido con respecto a una región no codificante de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína diana. Un oligonucleótido antisentido puede presentar, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ARNip, ARNc, miARN o ácido nucleico antisentido en el método o en la utilización de la presente invención puede construirse utilizando reacciones de ligamiento enzimáticas y síntesis química utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente utilizando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos modificados de manera diversa diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos sentido y antisentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato. Alternativamente, el ácido nucleico puede producirse biológicamente utilizando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico.

Las moléculas de ácido nucleico en el método o la utilización de la presente invención se administran normalmente a un sujeto o se generan in situ de manera que se hibridan con o se unen a ADN genómico y/o ARNm diana celular que codifica para la proteína diana para inhibir de ese modo la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. Un ejemplo de una vía de administración de moléculas de ácido nucleico para la presente invención incluye inyección directa en un sitio tisular. Alternativamente, pueden modificarse moléculas de ácido nucleico para seleccionar como diana células seleccionadas y administrarse entonces de manera sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, pueden modificarse moléculas antisentido de manera que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, uniendo las moléculas de ácido nucleico a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico también pueden administrarse a células utilizando vectores bien conocidos por el experto.

En formas de realización, las moléculas de ácido nucleico utilizadas en la presente invención pueden modificarse en el resto de base, el resto de azúcar o la estructura principal de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, puede modificarse la estructura principal de desoxirribosa fosfato de los ácidos nucleicos para generar ácidos nucleicos peptídicos (“PNA”).

En otra realización, los ácidos nucleicos utilizados en la presente invención pueden modificarse para potenciar su captación celular, uniendo grupos lipófilos u otros grupos auxiliares o mediante la utilización de liposomas u otras técnicas de administración de fármacos conocidas en la materia.

En una forma de realización, el método según la presente invención se caracteriza porque dicho ácido nucleico, tal como el ARN bicatenario, el ARNip, el ARNc, miARN o el ácido nucleico antisentido se administran a dicho mamífero.

En otra realización, el método según la presente invención se caracteriza porque vectores, en particular vectores virales, que codifican para dicho ácido nucleico tal como el ARN bicatenario, el ARNip, el ARNc, miARN o el ácido nucleico antisentido se administran a dicho mamífero.

En otro aspecto, el procedimiento según la presente invención se caracteriza porque la actividad de la proteína de retrovirus endógeno se inhibe por ligandos de dicha proteína de retrovirus endógeno.

En una forma de realización preferida, el procedimiento según la presente invención se caracteriza porque la proteína de retrovirus endógeno es una proteína codificada por el gen env y dichos ligandos pueden unirse específicamente a dicha proteína codificada por el gen env, particularmente al dominio inmunosupresor de dicha proteína codificada por el gen env.

Ventajosamente, los ligandos son anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab o F(ab)’2, polipéptidos de scFv, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, aptámeros o péptidos de unión.

Los anticuerpos útiles incluyen anticuerpos que se unen a un dominio o subdominio de la proteína diana tal como dicha proteína codificada por el gen env descrita anteriormente (por ejemplo, el dominio inmunosupresor).

Los epítopos preferidos comprendidos por el péptido antigénico para la preparación de los anticuerpos son regiones del dominio inmunosupresor de la proteína codificada por el gen env, preferiblemente un dominio inmunosupresor mutado que puede inducir anticuerpos que pueden reconocer la región inmunosupresora de tipo natural.

Normalmente, se utiliza un inmunógeno que comprende una proteína codificada por el gen env, mutada o no, para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, una proteína codificada por el gen env expresada de manera recombinante (o sintetizada químicamente). La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de proteína codificada por el gen env inmunogénica induce una respuesta de anticuerpos policlonales. Los ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab’)2 que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina.

En el procedimiento de la presente invención, pueden utilizarse anticuerpos monoclonales que se unen a dicha proteína codificada por el gen env. Adicionalmente, anticuerpos recombinantes, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden partes tanto humanas como no humanas, que pueden prepararse utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales, están dentro del alcance del método o la utilización de la presente invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la materia.

En otro aspecto, la utilización según la presente invención se caracteriza porque la proteína de retrovirus endógeno tal como se definió anteriormente, preferiblemente una proteína codificada por el gen env, es inmunosupresora y la actividad de dicha proteína de retrovirus endógeno es:

-: dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora, o un fragmento de la misma que comprende su dominio inmunosupresor, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o que codifica para dicho fragmento de la misma, o

-: una forma mutada de dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora que carece de actividad inmunosupresora, o fragmentos de la misma que comprenden un dominio inmunosupresor mutado de dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o que codifica para dicho fragmento de la misma.

En otro aspecto, la utilización según la presente invención se caracteriza porque la proteína de retrovirus endógeno, preferiblemente una proteína codificada por el gen env, es inmunosupresora y la actividad de dicha proteína de retrovirus endógeno, que da como resultado el escape de la vigilancia inmunitaria que induce la proliferación de células tumorales, se inhibe por una respuesta inmunitaria celular y/o humoral a la administración al mamífero:

-: de una proteína de retrovirus endógeno (tal como la proteína Gag, Pol, Pro, Env, Rec o Np9 codificada por dicho ERV), o un fragmento de la misma, preferiblemente una proteína inmunosupresora codificada por el gen env o un fragmento de la misma, comprendiendo dicho fragmento su dominio inmunosupresor, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína de retrovirus endógeno o un fragmento de la misma; o

-: de una forma mutada de dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora que carece de actividad inmunosupresora, preferiblemente una proteína codificada por el gen env, tal como un análogo de ENV o Np9, o un fragmento de la misma que comprende un dominio inmunosupresor mutado de dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o que codifica para un fragmento de la misma.

Los efectos inmunosupresores y el dominio inmunosupresor de la proteína de retrovirus endógeno, tal como la proteína codificada por el gen env, pueden determinarse por ejemplo utilizando el procedimiento dado a conocer en el documento WO 2005/095442 (Ejemplo 1, Métodos) y en el ejemplo 3 de la presente solicitud.

La estrategia para la identificación de la proteína ENV mutada, con actividad inmunosupresora disminuida o carente, puede ser por ejemplo la estrategia utilizada en el documento WO 2005/095442 (mediante mutagénesis dirigida al sitio y estudio del efecto inmunosupresor de la proteína mutada obtenida en comparación con la proteína de tipo natural) (véase el Ejemplo 1, Métodos y los párrafos 3 y 4 del documento WO 2005/095442).

Para la proteína de tipo Np9 codificada por el gen env, puede utilizarse el método de tipo mapeo de epítopos en el que ciertas partes de la proteína Np9 de longitud completa se someten a prueba para determinar su capacidad para inducir la regulación por disminución de antígenos del CMH de clase I (tal como se muestra en el ejemplo 3).

La identificación de una posible deleción o sustitución de la proteína de tipo Np9 codificada por el gen env con el fin de determinar una proteína de tipo Np9 mutada que presenta actividad inmunosupresora disminuida o carente y un determinante epitópico conservado que puede generar anticuerpos que reconocen específicamente la proteína Np9 de tipo natural, puede llevarse a cabo utilizando la mutagénesis dirigida al sitio asociada al estudio de la falta de regulación por disminución del efecto de antígenos del CMH de clase I en comparación con la proteína de tipo natural.

En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a un método, en el que la actividad de dicha proteína de retrovirus endógeno se inhibe por una respuesta inmunitaria celular, respuesta inmunitaria celular y/o humoral (anticuerpos) generada en respuesta a la administración al mamífero, según la invención, caracterizado porque la proteína de retrovirus endógeno es una proteína codificada por el gen env, tal como una proteína ENV o una proteína Np9.

En dicho método según la invención, se prefiere más la utilización de una forma mutada de una proteína codificada por el gen env, tal como una proteína ENV o una proteína Np9, privada de actividad inmunosupresora, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína.

En este método anterior que utiliza una forma mutada de una proteína codificada por el gen env, se prefiere más una forma mutada de una proteína codificada por el gen env de HERV, preferiblemente HERV-K, privada de actividad inmunosupresora y en el que dicha forma mutada puede generar una respuesta inmunitaria, respuesta inmunitaria celular y/o humoral (anticuerpos), que reconoce específicamente la forma no mutada de dicha proteína codificada por el gen env de HERV.

En este método anterior que utiliza una forma mutada de una proteína codificada por el gen env, también se prefiere más una forma mutada de la proteína Np9 de HERV-K.

En dicho método según la invención, se prefiere particularmente la utilización de una forma mutada de Np9 de HERV-K privada de actividad inmunosupresora cuando la forma no mutada de la proteína Np9 presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

-: a) la secuencia de aminoácidos de la proteína Np9 de un subtipo de HERV-K tal como se representa en Genbank (GenPept) con el número de registro P61580, P61581, P61582 y P61583; y

La presente invención también se refiere a la utilización según la presente invención, en la que la proteína de retrovirus endógeno es inmunosupresora y fragmentos de dicha proteína de retrovirus endógeno, que comprenden un dominio inmunosupresor, mutado o no, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o que codifica para dicho fragmento de la misma, se administran a dicho mamífero para antagonizar la interacción de dicha proteína de retrovirus endógeno con sus ligandos en el organismo de dicho mamífero.

Se prefiere para dicho método que el retrovirus endógeno sea una proteína ENV de HERV o una proteína Np9 de HERV-K.

En otro aspecto, la presente invención abarca una composición farmacéutica que comprende como principio activo un ácido nucleico, tal como un ARN bicatenario, ARNip, ARNc, miARN o ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico de un retrovirus endógeno y/o de una proteína inmunosupresora expresada por un retrovirus endógeno (tal como la proteína Gag, Pol, Pro, Env, Rec o Np9 codificada por dicho ERV) en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, siendo dicho retrovirus endógeno un retrovirus endógeno humano (HERV), seleccionado del grupo de HERV que consiste en HERV-K, HERV-FRD, HERV-H, HERV-T, HERV-R, HERV-V, HERV-P(b), HERVE, HERV-F(c)1, HERV-F(c)2 y HERV-R(b).

Puede introducirse in vivo en la célula diana ARN o ADN de vector o una molécula de ácido nucleico aislada utilizada en la presente invención mediante vías o técnicas de administración convencionales.

Preferiblemente, la composición farmacéutica según la presente invención se caracteriza porque dicho retrovirus endógeno es HERV-K.

Preferiblemente, la composición farmacéutica según la presente invención se caracteriza porque dicha proteína expresada es una proteína codificada por el gen env de HERV tal como una proteína ENV o una proteína Np9, preferiblemente una proteína codificada por el gen env de HERV que es inmunosupresora.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende como principio activo una proteína de retrovirus endógeno, tal como la proteína Gag, Pol, Pro, Env, Rec o Np9 codificada por dicho ERV, o un fragmento de la misma, siendo dicho retrovirus endógeno un retrovirus endógeno humano (HERV), seleccionado del grupo de HERV que consiste en HERV-K, HERV-FRD, HERV-H, HERV-T, HERV-R, HERV-V, HERV-P(b), HERV-E, HERV-F(c) 1, HERV-F(c)2 y HERV-R(b).

Por fragmento de la misma, pretende designarse en la presente memoria particularmente el fragmento de al menos 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 ó 100 aminoácidos que, cuando se administra al ser humano o animal huésped, puede inducir una respuesta inmunitaria celular o humoral que da como resultado la restauración de la vigilancia inmunitaria y/o la disminución o la detección de la proliferación de las células cancerosas.

En una forma de realización preferida, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende como principio activo una proteína codificada por el gen env de HERV inmunosupresora, mutada o no, o fragmento de la misma que comprende el dominio inmunosupresor de dicha proteína codificada por el gen env de HERV, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o que codifica para un fragmento de la misma, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Por proteína de retrovirus endógeno mutada, o fragmento mutado de la misma, pretende designarse una proteína, o fragmento de la misma que cuando se compara con la proteína de tipo natural, o fragmento de la misma, contiene al menos una mutación puntual (deleción, inserción o modificación de un residuo de aminoácido), preferiblemente al menos 2, 3, 4, 5, 10 ó 20 mutaciones puntuales y como máximo el 35% de mutación, preferiblemente el 30%, el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% y el 1% de mutación.

En una forma de realización también preferida, las composiciones farmacéuticas según la presente invención comprenden como principio activo una proteína de retrovirus endógeno HERV-K, más preferiblemente una proteína env de un subtipo de HERV-K caracterizada porque el marco de lectura abierto que codifica para la proteína env de HERV-K codifica para una proteína Np9, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína de retrovirus endógeno HERV-K.

Ventajosamente, el HERV-K es un subtipo de HERV-K seleccionado del grupo constituido por el subtipo de HERV-K HERV-K101, HERV-K102, HERV-K107 y HERV-K(II).

También se prefieren más las composiciones farmacéuticas según la presente invención que se caracterizan porque la proteína es una proteína Np9 que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica según la presente invención, caracterizada porque dicha composición comprende además al menos otra o preferiblemente al menos 2, 3 o todas las proteínas codificadas por dicho provirus de HERV, o una secuencia nucleica que codifica para dicha(s) otra(s) proteína(s) codificada(s) por dicho provirus de HERV, con el fin de potenciar la respuesta inmunitaria contra células que expresan proteínas de este provirus de HERV.

Se prefiere una composición farmacéutica según la presente invención, caracterizada porque dicha composición comprende además al menos otra o preferiblemente al menos 2, 3 o todas las proteínas codificadas por la secuencia nucleica del provirus HERV-K(HML2) consenso (“Phoenix”) que presenta la secuencia SEC ID NO: 4, o una secuencia nucleica que codifica para dicha(s) otra(s) proteína(s) codificada(s) por dicha secuencia nucleica que presenta la secuencia SEC ID NO: 4.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un principio activo, tal como una proteína codificada por el gen env, mutada o no, o un ácido nucleico que codifica para dichos principios activos de proteína, tal como se define en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, como un inmunógeno o como una vacuna.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición para estimular una respuesta inmunitaria, respuesta inmunitaria celular y/o humoral, contra una proteína codificada por el gen env de HERV, comprendiendo dicha composición un principio activo tal como una proteína codificada por el gen env, mutada o no, o un fragmento inmunogénico de la misma, tal como se define en las composiciones farmacéuticas según la presente invención, o un ácido nucleico que codifica para estos principios activos de proteína.

En otro aspecto, la presente invención abarca la utilización de un principio activo, tal como una proteína codificada por el gen env, mutada o no, o un fragmento inmunogénico de la misma, tal como se define en las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la fabricación de una vacuna anticancerígena.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de un principio activo tal como se define en las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la fabricación de un medicamento destinado a la prevención o el tratamiento de cánceres.

Todos los cánceres inducidos por la expresión de retrovirus endógeno o proteína endógena del mismo pueden prevenirse y/o tratarse mediante las composiciones farmacéuticas o las vacunas de la presente invención. Entre estos cánceres, se prefieren melanoma, neuroblastoma, tumores de células germinales, tumores de mama y leucemia, siendo los más preferidos melanoma y neuroblastoma.

Puede ser especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma farmacéutica unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Forma farmacéutica unitaria tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la composición farmacéutica de la presente invención se dictan por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que ha de lograrse, y de las limitaciones inherentes en la técnica de composición tal como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Para anticuerpos o proteína codificada por el gen env como inmunógeno, mutada o no, la dosificación preferida es de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal (generalmente de 10 mg/kg a 20 mg/kg). A menudo son posibles dosificaciones inferiores y administración menos frecuente. Pueden utilizarse modificaciones tales como lipidación para estabilizar anticuerpos o la proteína ENV y para potenciar la captación y penetración tisular.

Las moléculas de ácido nucleico utilizadas en el método de prevención y/o tratamiento o en las composiciones farmacéuticas de la invención pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores terapéuticos y/o de vacuna. Pueden administrarse vectores terapéuticos y/o de vacuna a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local. La preparación farmacéutica del vector terapéutico y/o de vacuna puede incluir el vector terapéutico y/o de vacuna en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está embebido el vehículo de administración de ácidos nucleicos. Alternativamente, el vector de administración de ácidos nucleicos completo, por ejemplo vector retroviral, puede producirse intacto a partir de células recombinantes.

Vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende que significa un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica o de vacuna sin provocar reacciones secundarias o que permite por ejemplo facilitar la administración de compuesto activo, un aumento en su vida útil y/o su eficacia en el organismo, aumento de su solubilidad en disolución o de nuevo una mejora en su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables se conocen bien y se adaptarán por el especialista como función de la naturaleza y el modo de administración del compuesto activo seleccionado.

Como para formulaciones de vacuna, éstas pueden comprender adyuvantes de inmunidad apropiada que conoce el especialista, tales como por ejemplo hidróxido de aluminio, un representante de la familia de péptidos de muramilo tal como uno de los derivados peptídicos de N-acetil-muramilo, un lisado bacteriano o incluso el adyuvante incompleto de Freund.

Preferiblemente, la composición inmunogénica o de vacuna según la presente invención se administrará de manera sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía intradérmica o por vía subcutánea, o por vía oral. De una forma más preferida, la composición de vacuna de la invención que comprende proteína o ácido nucleico se administrará en varias dosis, distribuidas a lo largo del tiempo.

En otro aspecto, la presente invención comprende el ácido nucleico de longitud completa del provirus HERVK(HML2) consenso (denominado provirus “Phoenix”) que presenta la secuencia SEC ID NO: 4 y su fragmento tal como el ORF que codifica para las proteínas de HERV-K(HML2) (Gag, Pro, Pol, Env y la proteína auxiliar Rec).

La invención también comprende la utilización de dicho ácido nucleico de longitud completa del provirus HERVK(HML2) consenso, o fragmento del mismo tal como el ORF que codifica para las proteínas de HERV-K(HML2) (Gag, Pro, Pol, Env y la proteína auxiliar Rec), o al menos una de la proteína codificada por esta secuencia de ácido nucleico de provirus consenso, como medicamento, preferiblemente como inmunógeno o como vacuna, más preferiblemente para la prevención o el tratamiento del cáncer.

La invención también comprende la utilización de dicho ácido nucleico de longitud completa del provirus HERVK(HML2) consenso, o fragmentos de ORF del mismo como vector de expresión o como vector de administración génica, preferiblemente para la expresión en una célula huésped de un animal o un ser humano de al menos una, preferiblemente 2, 3 o todas las proteínas codificadas por este provirus consenso, preferiblemente para la prevención o el tratamiento del cáncer, más preferiblemente para cáncer inducido por la activación de la transcripción del gen env de HERV-K en dicho ser humano o animal.

La invención también comprende la utilización del fragmento específico de dicho ácido nucleico de longitud completa del provirus HERV-K(HML2) consenso como cebador o sonda para la identificación o amplificación específica de ácido nucleico presente en una muestra biológica.

La presente invención comprende además la proteína Gag (SEC ID NO: 5), Pro (SEC ID NO: 6), Pol (SEC ID NO: 7), Env (SEC ID NO: 8) y la proteína auxiliar Rec (SEC ID NO: 9) codificadas por dicho ácido nucleico de longitud completa del provirus HERV-K(HML2) consenso de la invención y su utilización para la preparación de antígenos de vacuna en una composición destinada a la prevención o el tratamiento del cáncer.

Finalmente, la presente invención se refiere a un método in vivo para la determinación de la presencia de partículas de retrovirus endógeno HERV-K infecciosas en una muestra de fluido biológico caracterizado porque dicho método comprende la etapa de:

a) incubar el fluido biológico en presencia de células animales que no contienen de manera natural HERV-K en condiciones adecuadas para infectar dichas células animales con las partículas de retrovirus endógeno HERV-K infecciosas que se sospecha que están presentes en la muestra;

b) recuperar el ADN genómico de las células animales; c) determinar la presencia de provirus de HERV-K integrados mediante un método de amplificación de ácido nucleico, tal como un método de PCR, o análogo del mismo, utilizando el siguiente par de cebadores:

5’-GCCTTTCCCGCCCTTAATT-3’ y 5’-GCAGGGCAGCGATCATCTA-3’.

El método según la presente invención, en el que en la etapa c), la determinación se lleva a cabo mediante un método de análisis Taqman en el que la sonda Taqman es una sonda que presenta la secuencia 6FAM-ATAGTGTATGGGTACCTGGCMGBNFQ.

El método según la presente invención, en el que en la etapa a, las células animales son células BHK21 de hámster.

El método según la presente invención, en el que en la etapa a), el fluido biológico es de tejido humano, particularmente de tejido canceroso humano.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de las siguientes leyendas de las figuras y los ejemplos.

Leyendas de las figuras

Figuras 1A, 1B y 1C: Procedimiento de silenciamiento y fundamento del ensayo.

Figura 1A: Para silenciar la expresión de ERV, se construyó un vector derivado de plncx haciendo uso del vector pSUPER para generar, bajo el control del promotor de ARN H1, transcritos bicatenarios cortos para la interferencia por ARN. Se transdujeron células B16 con estos vectores de expresión, se sometieron a selección con G418 y se inyectaron las células B16 ERVKD y control resultantes por vía subcutánea en el costado de los ratones, cuyo crecimiento tumoral se monitorizó.

Figura 1B: Estructura pronosticada del ARNbc generado por los vectores de ERV y control (GFP); los números se refieren a las posiciones de nt dentro de las secuencias seleccionadas como diana respectivas (véase Métodos).

Figura 1C: Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la expresión de Gag y Env en el sobrenadante de células silenciadas para ERV (ERVKD) y control.

Figuras 2A y 2B: Las células silenciadas han conservado un fenotipo transformado.

Figura 2A: Análisis in vitro del fenotipo transformado utilizando un ensayo en agar blando. Se sembraron en placa células B16 ERVKD y control (2x103 o 2x104) sobre una capa semisólida durante 4 semanas, y entonces se contaron las colonias.

Figura 2B: Ensayo para el fenotipo transformado in vivo utilizando ratones inmunoincompetentes. Se inyectaron por vía subcutánea células B16 ERVKD y control (2x105) en el costado de ratones o bien C57B1/6 irradiados con rayos X (5 Gy) o bien SCID (2-5 experimentos independientes con 5 ratones por grupo) y se determinó el crecimiento tumoral midiendo el área tumoral.

Figuras 3A, 3B y 3C: Inhibición del crecimiento de células tumorales y aumento de la supervivencia del ratón tras el silenciamiento de ERV.

Figura 3A: Crecimiento de células tumorales de células B16 ERVKD y control injertadas en ratones C57B1/6 inmunocompetentes (22 ratones por grupo; mismas condiciones experimentales que en la figura 2B).

Figura 3B: Porcentaje de supervivientes entre los ratones injertados con células B16 ERVKD y control (10 ratones por grupo).

Figura 3C: Porcentaje de supervivientes (10 ratones por grupo) entre células B16 ERVKD transducidas con Me1ARV env (y control).

Figuras 4A y 4B: La transferencia adoptiva de células T CD4+CD25+ restaura el crecimiento tumoral de B16 ERVKD

Se purificaron las células T CD4+CD25+ a partir de esplenocitos de ratones C57B1/6 a los que se les inyectó 17 días antes células B16. Se realizó la transferencia adoptiva mediante inyección intravenosa de 0,1 ml de PBS que contenía (cuadrados) o no (círculos) 5x104 células CD4+CD25+ purificadas. Se injertaron células B16 control (símbolos negros) y ERVKD (símbolos blancos) el mismo día (10 ratones por grupo), y se monitorizaron el área tumoral (figura 4A) y el porcentaje de animales con tumor (figura 4B).

Figura 5: Inmunotinción para la detección de proteínas de la envuelta de ERV. Se marcaron células B16 control, ERVKD y ERVKD +env con el anticuerpo 9B6 (dirigido contra la proteína de la envuelta MelARV; donación de E. Gorelik, Cancer Res 1988; 48:4954-4958) revelado mediante un anticuerpo de cabra anti-ratón-FITC (Caltag, Burlingame, EE.UU.). Se realizó análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro Facscalibur.

Figuras 6A y 6B: La administración sistémica in vivo de ARNip reduce la progresión de células tumorales.

Se adquirieron ARNip sintéticos dirigidos a las secuencias de ERV y control (GFP) de 19 nt a las que se hace referencia en la figura 1b y Materiales y métodos de MWG Biotech. Se inyectaron por vía intraperitoneal (3 Ig de ARNip en 50 Il de PBS), el día 12 tras antes el injerto de 2x105 células B16 en el costado derecho de los ratones. Se monitorizaron el área tumoral (figura 6A) y el porcentaje de supervivientes (figura 6B) (5 ratones por grupo en dos experimentos independientes).

Figura 7: Análisis de transferencia de tipo Southern de secuencias provirales de MLV ecotrópico en tejido normal de ratón A/J y células Neuro-2a

Se extrajo ADN genómico de hígado de ratón A/J y células Neuro-2a. Se digirió el ADN (30 Ig) de cada muestra mediante EcoRI, HindIII y PvuII y se separó en un gel de agarosa al 0,7% durante 24 horas. Tras la transferencia, se hibridaron las membranas con la sonda específica de env de MLV ecotrópico. Los números a la derecha se refieren a marcadores de tamaño molecular (en kilobases). Las flechas indican la banda específica de Emv-1.

Figuras 8A a 8C: Caracterización de partículas derivadas de Neuro-2a

Figura 8A: Ensayo de actividad transcriptasa inversa (RT). Se sometió a ensayo la actividad RT en sobrenadantes de células Neuro-2a (NeRV) en presencia de Mn2+ o Mg2+ utilizando un método basado en PCR con ARN del bacteriófago MS2 como molde de transcripción inversa, tal como se describe.(13) Se utilizaron los sobrenadantes de células NIH/3T3 infectadas (MoMLV) o no (simulado) por MoMLV como controles positivos y negativos, respectivamente.

Figura 8B: Inmunodetección de proteína viral. Se separaron proteínas del material particulado recogido de sobrenadantes de células Neuro-2a mediante SDS-PAGE, se transfirieron y se detectaron proteínas NeRV con antisueros de cabra anti-Gag y anti-Env. Se indican los pesos moleculares a la derecha.

Figura 8C: Ensayo de infectividad. Se expusieron células Melan-a (NeRV+) o no (NeRV-) a sobrenadante de células Neuro-2a. Seis días después, se analizó la expresión de proteínas Gag retrovirales por las células diana mediante inmunotransferencia de tipo Western como en la figura 8B.

Figuras 9A y 9B: Variaciones de secuencia entre Emv-1 y NeRV

Figura 9A: Mapa del ORF de gag, pol y env de NeRV. Los asteriscos indican la posición de nucleótidos divergentes entre Emv-1 y NeRV, con la posición del ORF de p30 gag delineada por líneas discontinuas.

Figura 9B: Alineación de secuencias de la región 1279 a 2067 de los genes gag de Emv-1 y NeRV; los aminoácidos divergentes están recuadrados.

Figuras 10A a 10E: Reducción del crecimiento tumoral y aumento de la supervivencia del ratón tras el silenciamiento de NeRV

Figuras 10A: Procedimiento de silenciamiento y fundamento del ensayo. Para silenciar la expresión de NeRV, se construyó un vector derivado de plncx haciendo uso del vector pSUPER para generar, bajo el control de promotor de ARN H1, transcritos bicatenarios cortos para la interferencia por ARN (véase la figura 10B). Se transdujeron células Neuro-2a con estos vectores de expresión, se sometieron a selección con neomicina, y se inyectaron por vía subcutánea las células Neuro-2a NeRVKD y control resultantes en el costado de los ratones, cuyo crecimiento tumoral se monitorizó.

Figuras 10B: Secuencia del ARNbc generado por los vectores de expresión de iARN de NeRV y control (GFP); los números se refieren a las posiciones de nt dentro de las secuencias seleccionadas como diana respectivas.

Figuras 10C: Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de proteínas Gag y Env presentes en el material particulado recogido del sobrenadante de células NeRVKD y control.

Figuras 10D: Papel de NeRV en el crecimiento de células tumorales in vivo. Se inyectaron por vía subcutánea células Neuro 2a control y NeRVKD en el costado de ratones A/J inmunocompetentes (17 ratones por grupo) o de ratones A/J inmunocomprometidos irradiados con rayos X (5 Gy) (5 ratones por grupo, inserto). Se determinó el crecimiento tumoral midiendo el área tumoral (control: barras y círculos negros; NeRVKD: barras y círculos blancos; p = 0,00046).

Figuras 10E: Porcentaje de supervivientes entre los ratones injertados con células Neuro-2a control y NeRVKD (17 ratones por grupo; p = 0,022).

Figura 11: La administración sistémica in vivo de ARNip reduce la progresión de células tumorales. Se adquirieron ARNip sintéticos que seleccionan como diana las secuencias de NeRV y control (GFP) de 19 nt a las que se hace referencia en la figura 10A de MWG Biotech. Estos ARNip sintéticos (0,2 nmol de ARNip en 500 Il de PBS) se inyectaron por vía intraperitoneal cada 2-3 días en ratones inmunocompetentes que llevaban un tumor de Neuro-2a palpable (8 ratones por grupo). Se realizó la primera inyección de ARNip 6 días tras el injerto de 5x106 células Neuro-2a (control: barras y círculos negros; NeRVKD: barras y círculos blancos; p = 10-6).

Figuras 12A y 12B

Figura 12A: Representación esquemática del provirus de HERV-K101. Se indican los marcos de lectura abiertos que codifican para las proteínas virales Gag, Prt y Pol. El marco de lectura de env codifica para Np9. Los dos exones del gen de np9 están destacados. El tipo de provirus mostrado no puede codificar para Rec, debido a la deleción específica de tipo 1de 292 pb representados. (B) Proteína Np9. Se representan las posiciones de las tres supuestas NLS.

Figura 12B: Se alineó la secuencia nucleotídica de Np9 (SEC ID NO: 2), que comienza con el primer exón en la posición de nt 6451 en la secuencia de HERV-K (HML-2.HOM). Las posiciones de los cebadores de PCR directo e inverso utilizados para construir phCMV-Np9 están subrayadas. Se muestra la secuencia de aminoácidos deducida y las supuestas NLS están recuadradas.

Figura 13: Regulación por disminución de la expresión de HLA de clase I por células 293T cotransfectadas con vectores que expresan Np9.

La figura demuestra la regulación por disminución de la expresión de HLA de clase I por células 293T cotransfectadas con 5 Ig de vector de expresión de Np9 (phCMV-Np9) y 3 Ig de vectores de expresión de HLA-A2, HLA-B27 o HLA-Cw3 (los tres como fragmentos genómicos de EcoRI en pBR 328). Se midió la expresión de HLA de clase I mediante FACS con anticuerpo anti-CMH I humano acoplado a PE W6/32 (eBioscience) 72 h tras la transfección.

Figura 14: Regulación por disminución dependiente de la dosis de la expresión de HLA de clase I por células 293T cotransfectadas con las cantidades variables indicadas (en Ig) de vector de expresión de Np9 (phCMV-Np9) y una cantidad fija (2 Ig) de vector de expresión de HLA-Cw3. Se midió la expresión de HLA de clase I mediante FACS con anticuerpo anti-HLA de clase I humano acoplado a PE W6/32 (eBioscience) 72 h tras la transfección.

Figuras 15A y 15B: “Endogenización” de HERV-K(HML2) y provirus humanos actuales.

Figura 15A: Esquema evolutivo para la entrada de HERV-K(HML2) e invasión del genoma de primates.

Figura 15B: Mapa de los provirus HERV-K(HML2) específicos de ser humano de 9,4 kb de largo de longitud completa y comparación con la secuencia consenso diseñada por ingeniería genética in silico (SEC ID No:4). Cada provirus está representado por una línea negra continua, con las sustituciones de aminoácidos en Gag, Pro, Pol y Env en comparación con el elemento consenso indicado por debajo de la línea, y las inserciones/deleciones y codones de terminación prematura (estrellas rojas) indicados por encima de la línea. Se muestra el mapa de ORF del provirus consenso, con gag en verde, pro en rosa, pol en azul, env en naranja y amarillo, el rec bipartito en naranja y las dos LTR como recuadros grises. (Obsérvese que el primer exón codificante de rec pertenece al ORF de env). Los transcritos responsables de la expresión de las proteínas virales, con los correspondientes dominios cortados y empalmados (líneas discontinuas) están esquematizados por debajo del mapa de ORF.

Figuras 16A a 16E: Microscopía electrónica de las partículas de tipo viral generadas por el provirus Phoenix. Se transfectaron células 293T humanas con un vector de expresión para Phoenix y se observaron 48 h tras la transfección.

Figura 16A: Partículas ensambladas en la membrana celular a bajo aumento.

Figura 16B: Imagen representativa de partículas que salen por gemación de la membrana plasmática.

Figura 16C: Dos partículas a gran aumento, una de las cuales (parte inferior) da a conocer una morfología madura con un núcleo condensado, mientras que la otra parece ser todavía inmadura con dos anillos periféricos oscuros rodeando un núcleo translúcido.

Figura 16D: Partícula a gran aumento con espículas prominentes, correspondientes a la proteína Env.

Figura 16E: Imagen de una partícula tras su marcaje con un anticuerpo específico para la proteína de la envuelta de HERV-K, y un anticuerpo secundario unido a perlas de oro, obtenida mediante microscopía inmunoelectrónica. Escala: (a): 200 nm, (b-e): 100 nm.

Figuras 17A a 17C: Caracterización de Phoenix

Figura 17A: Análisis de inmunotransferencia de los productos de Phoenix presentes en los lisados de células 293T transfectadas de manera transitoria, o en el sobrenadante concentrado. Se transfectaron células con (1) un plásmido control (pCMV-l), (2) un vector de expresión para Phoenix o (3) un vector de expresión para un promutante. Se hibridaron las membranas con un anticuerpo dirigido contra la proteína Gag (izquierda) o la proteína Env (derecha).

Figura 17B: Estudio de inmunofluorescencia de células 293T transfectadas con Phoenix. Gag se marca en rojo, Env en verde y los núcleos se tiñen en azul. Obsérvese la localización conjunta de las dos proteínas, especialmente en la membrana que separa las dos células marcadas adyacentes.

Figura 17C: Detección de la actividad RT en el sobrenadante concentrado de células 293T transfectadas con Phoenix y una serie de vectores provirales y control. Se utilizaron viriones concentrados como fuente de actividad RT para transcribir de manera inversa ARN de MS2 sintético. Se reveló la presencia de ADNc mediante una amplificación por PCR utilizando cebadores apropiados. (1: pCMV-l; 2: Phoenix; 3: Phoenix mutado en RT; 4: quimera de K109-K115; 5: quimera de K109-K113; 6: quimera de K109-K108; 7: proteínas de núcleo de MLV).

Figuras 18A y 18B: Propiedades infecciosas de partículas codificadas por Phoenix.

Figura 18A: Infectividad de las partículas retrovirales de HERV-K. Se indica el título viral aparente observado con el provirus HERV-K(HML2) marcado con neo para un panel de líneas celulares diana, junto con el obtenido con un mutante para el dominio RT. El fundamento del ensayo está esquematizado en la parte superior.

Figura 18B: Infección de células por partículas Phoenix. A la izquierda, dos partículas maduras parecen interaccionar con la membrana celular de la célula más cercana, con un engrosamiento de la membrana en el punto exacto de interacción con la partícula. En el medio y a la derecha, se presentan dos imágenes sugerentes de una infección células a célula, con una partícula todavía saliendo por gemación de su célula progenitora ya en contacto con la célula vecina.

Figura 19: Estructura de tres sitios de integración de novo de provirus Phoenix, y comparación con la estructura de inserciones de provirus de HERV-K naturales.

Se realizó la caracterización completa de elementos Phoenix insertados y sitios de inserción utilizando clones individuales de células SH-SY5Y humanas tras la infección y selección con G418. En la parte superior están esquematizados una inserción de provirus y el correspondiente sitio vacío. Se muestran las secuencias de tres inserciones de novo de Phoenix caracterizadas más adelante, con el ADN flanqueante en mayúsculas y las secuencias provirales en minúsculas; se encuentran en todos los casos duplicaciones de sitios diana de 5/6 pb (TSD), asociados con LTR de longitud completa. Para comparación, se presentan en la parte inferior las correspondientes estructuras de dos provirus de HERV-K residentes con una inserción polimórfica en seres humanos (9).

Figura 20: Ensayo para la “retrotransposición” de Phoenix.

Parte superior: Fundamento del ensayo. Se marcó Phoenix con el gen indicador neoTNF para la retrotransposición (31), en la que neo se activa sólo tras un ciclo de retrotransposición completo (es decir, transcripción, transcripción inversa e integración), y se introdujo el elemento marcado mediante transfección en células humanas SH-SY5Y permisivas para la infección por Phoenix. Entonces se amplificaron las células, y se sometieron a selección con G418 durante 2 semanas; el número de clones de G418R (varios de los cuales se sometieron a ensayo mediante PCR para demostrar el corte y empalme del intrón dentro del gen indicador neo) produjo la tasa aparente de retrotransposición de los elementos marcados. Parte inferior: La “retrotransposición” es dependiente de la presencia de un gen env funcional, o bien presente dentro del provirus Phoenix nativo (Phoenix TN) o bien añadido en trans a un provirus Phoenix mutado en env (Phoenix Stop Env) mediante cotransfección de las células con un vector de expresión de env (CMV Env).

Figura 21: Puede generarse un retrovirus HERV-K(HML2) infeccioso mediante recombinación in vitro a partir de locus de HERV-K clonados. Estructura de los provirus HERV-K(HML2) clonados y de la quimera construida in vitro (véase Materiales y métodos), con las actividades RT en el sobrenadante de células 293T transfectadas con los correspondientes plásmidos medidas como en la figura 3C, y las eficacias de infección asociadas medidas mediante PCR cuantitativa en el ADN genómico de células diana (células BHK21, véase métodos).

Figura 22: �?cido nucleico anotado (SEC ID NO: 4) y secuencias de aminoácidos (SEC ID NO. 5 a 9) del provirus Phoenix consenso.

EJEMPLO 1: Se requiere la expresión de retrovirus endógeno para el crecimiento de tumor de melanoma murino in vivo

Los tumores son el resultado final de una serie de acontecimientos genéticos, que incluyen no sólo transformación celular per se sino también modificaciones de las interacciones entre las células transformadas y el huésped. En particular, se reconoce ahora que los tumores en desarrollo surgen de la fracción de células transformadas que han adquirido la capacidad de escapar de la vigilancia inmunitaria (revisado en las referencias 1 a 3). Las bases moleculares para la adquisición de un fenotipo resistente al sistema inmunitario no se entienden completamente, aunque se han descrito varios mecanismos, incluyendo la regulación por disminución de antígenos del CMH de clase I (2) y la regulación por incremento de factores de inhibición de la apoptosis (3). En este sentido, se ha mostrado previamente que la introducción de un vector de expresión para el gen de la envuelta (env) de un retrovirus murino infeccioso puede inducir el escape de la vigilancia inmunitaria, en células por lo demás rechazadas tras el injerto en ratones inmunocompetentes (4). Se observaron efectos similares con el gen env de un retrovirus endógeno humano (ERV) (5). Los ERV, que ocupan una gran fracción de genomas de mamíferos, son las trazas genómicas de antiguas infecciones retrovirales que alcanzaron la línea germinal, transmitiéndose entonces los provirus integrados de manera mendeliana (revisado en las referencias 6 y 7). La mayoría de estas secuencian han acumulado deleciones y mutaciones puntuales, pero todavía hay cientos de elementos provirales de longitud completa en los genomas humano y de ratón, conteniendo todavía algunos de ellos genes codificantes responsables, por ejemplo, de la observación de partículas de tipo viral en algunos tumores (6, 8). Por consiguiente, se planteó la hipótesis de que la expresión de retrovirus endógenos podría estar implicada en la progresión tumoral in vivo, subvirtiendo la respuesta inmunitaria. En este ejemplo, se usó una línea celular de tumor de melanoma murino espontáneo y se demostró que un ERV, el retrovirus asociado a melanoma (MelARV), cuya expresión se induce espontáneamente en melanoma de origen C57B1/6 (9), es necesario para un escape inmunitario mediado por células T reguladoras de las células tumorales in vivo.

A Materiales y métodos

Ratones y líneas celulares

Se obtuvieron ratones C57BL/6 y SCID, de 8-12 semanas de edad, de Janvier (Francia). Se mantuvieron B16 (línea celular de melanoma murino de origen C57BL/6, EACC 94042254) y 293T (células de riñón embrionario humano, ATCC CRL11268) en DMEM complementado con el 10% de suero de ternero fetal inactivado por calor y antibióticos.

Construcciones

Se han construido vectores de expresión PlncxHl derivados del plncx (10) y el pSUPER (11) para generar transcritos cortos dirigidos contra MelARV (dirigidos al transcrito genómico dentro de la secuencia gag; posiciones de nt 12201238 desde el codón de iniciación), o contra el transcrito de proteína fluorescente verde (posición de nt 215-233 desde el codón de iniciación) como control. Se obtuvieron insertando en primer lugar oligonucleótidos de 64 meros apareados (secuencias en la figura 1) en pSUPER abierto en los sitios BglII y HindIII, seguido por la introducción del fragmento de BamHI-HindIII a partir de estos constructos en plncx abierto en los correspondientes sitios. Se construyeron el vector de expresión para la envuelta de MelARV (pDFG MelARVenv) y el control (sin pDFG) introduciendo (o no) un producto de RT-PCR, generado a partir del ARN viral de MelARV utilizando un cebador que contenía AgeI en el extremo 5’ de la envuelta y un cebador que contenía XhoI en el extremo 3’ de la envuelta, en un vector de pDPG que contenía higromicina (4) abierto en los mismos sitios.

Establecimiento de células tumorales B16 ERVKD

Se cotransfectaron 7,5x105 células 293T con el vector plncxH1 (1,75 Ig) y vectores de expresión para las proteínas de MLV (0,55 Ig para el vector de la envuelta de MLV anfotrópico y 1,75 Ig para el vector de gag y pol de MLV, véase la referencia 12). Treinta y seis horas tras la transfección, se recogieron los sobrenadantes virales para la infección de las células tumorales B16 (2,5 ml de sobrenadante para 5x105 células, con Polybrene 8 Ig/ml). Se mantuvieron las células en medio selectivo (neomicina 1 mg/ml) durante tres semanas. En algunos experimentos, se introdujo adicionalmente el vector de expresión de pDPG MelARVenv (o sin pDFG control) en las células utilizando el mismo protocolo y se seleccionaron las células infectadas con 300 unidades/ml de higromicina.

Expresión de proteínas de MelARV

Se realizó el análisis de la expresión de MelARV mediante 30 análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se recogieron los sobrenadantes de 107 células, se centrifugaron durante 10 min. a 100xg, se filtraron y se concentraron mediante ultracentrifugación en un rotor SW41 Beckman (150.000xg, 1 hora, 4ºC). Se resuspendieron los sedimentos en tampón de lisis, se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron y se revelaron con un AcM anti-Env (13) y un suero de cabra anti-Gag (Viromed Biosafety Labs).

Ensayo de transformación in vitro:

Se sembraron en placa células B16 tanto control como ERVKD en agar blando para determinar la eficacia del crecimiento independiente de anclaje. Se sembraron en placa células (se sembraron en placa 2x103 o 2x104 en 5 ml de agar al 0,33% en DMEM con el 10% de suero bovino fetal recubierto sobre una capa sólida de agar al 0,5% en DMEM complementado con el 10% de suero bovino fetal). Se mantuvo el cultivo durante 4 semanas, se tiñeron las colonias con disolución INT (Sigma-Aldrich) y entonces se contaron.

Progresión tumoral in vivo

Para ensayos in vivo, se lavaron las células tumorales tres veces con PBS, se rasparon sin tripsinización y se inocularon por vía subcutánea en la zona afeitada del costado derecho de los ratones. Se determinó el establecimiento del tumor mediante palpación y se determinó el área tumoral midiendo diámetros tumorales perpendiculares.

Purificación de células T CD4+CD25+ y transferencia adoptiva en ratones C57BL/6 singénicos

Se aislaron de manera reciente células CD4+CD25+ de bazos de ratones C57BL/6 injertados con 2x105 células B16 17 días antes. Se purificaron las células mediante un procedimiento de dos etapas de selecciones negativa y positiva, utilizando perlas magnéticas MACS (kit de aislamiento de células T reguladoras de ratón, Miltenyi Biotech), según las instrucciones del fabricante. Se transfirieron cincuenta mil linfocitos purificados por vía intravenosa en ratones C57BL/6 sin tratar. Se expusieron los ratones receptores el mismo día a 2x105 células B16 control o ERVKD en el costado derecho.

B El silenciamiento de ERV no modifica el fenotipo transformado de células de melanoma B16

Se ha utilizado un enfoque de interferencia por ARN basado en vectores estables que producen ARN bicatenario (ARNbc) corto dirigido contra el genoma viral del elemento MelARV y el gen gfp irrelevante como control. El fundamento del procedimiento y la estructura de los plásmidos utilizados se ilustran en las figuras 1A, 1B. La figura 1C muestra claramente que el vector de ARNbc específico de ERV suprimió casi completamente la expresión de ERV en las células B16 transducidas (células B16 ERVKD), con una reducción de > 10 veces en la cantidad de las proteínas virales Env y Gag en comparación con las células transducidas control (células B16 control). Como siguiente etapa, se sometió a ensayo el fenotipo transformado de las células B16 ERVKD y control tanto in vitro como in vivo. In vitro, se midió la tasa de crecimiento independiente de anclaje tras la siembra en placa en medios semisólidos (ensayo de agar blando). Tal como se ilustra en la figura 2A, la línea celular B16 ERVKD dio lugar a un número similar de colonias que las células B16 control. In vivo, se analizó la tasa de crecimiento de las dos poblaciones celulares tras el injerto en ratones irradiados con rayos X o SCID. Tal como se ilustra en la figura 2B, ambas poblaciones celulares presentan un fenotipo transformado, con tasas de crecimiento similares. Conjuntamente, estos resultados muestran que el silenciamiento del retrovirus endógeno MelARV no presenta efecto sobre el estado transformado de las células de melanoma.

C El silenciamiento de ERV inhibe el crecimiento de células tumorales B16 in vivo y aumenta la supervivencia de huéspedes inmunocompetentes

Para investigar si las células tumorales pueden saturar la respuesta antitumoral in vivo a través de un mecanismo dependiente de ERV, se exploró el impacto del silenciamiento de MelARV sobre la progresión tumoral inyectando a ratones inmunocompetentes C57BL/6 las células B16 control y ERVKD. Tal como se ilustra en la figura 3A, el crecimiento de células B16 control, tal como se esperaba, condujo a tumores grandes en la mayoría de los animales, mientras que las células B16 ERVKD produjeron tumores de un tamaño limitado y en sólo un pequeño número de ratones injertados. La diferencia en el crecimiento de células tumorales también se confirma claramente por el grado de supervivencia de los animales (figura 3b): ya en el día 70, el 90% de los ratones injertados con las células B16 control habían fallecido debido a su tumor, mientras que el 80% de los ratones injertados con células B16 ERVKD estaban vivos y libres de tumor (y todavía así en el día 130). En un intento por identificar los genes de MelARV implicados en los efectos observados, se introdujo de nuevo en las células B16 ERVKD un vector de expresión (que carecía de la secuencia seleccionada como diana por el ARNbc) para el único gen env de MelARV. Entonces se injertaron las células B16 ERVKD +env (o control) doblemente transducidas resultantes en ratones C57BL/6. Tal como se ilustra en la figura 3C, esto dio como resultado la reversión parcial del efecto de silenciamiento, falleciendo todavía el 50% de los ratones injertados con las células que expresan Env para el día 70. Esta reversión indica que el gen env es, al menos en parte, responsable del escape inmunitario del tumor. El efecto parcial de la reversión se explica lo más probablemente por la expresión inferior (figura 5) de la proteína ENV cuando se expresa por el tumor exógeno.

D La transferencia adoptiva de linfocitos T reguladores CD4+CD25+ restaura la progresión tumoral de células B16 ERVKD

Se ha notificado que el crecimiento tumoral de B16 in vivo requiere la presencia de células T reguladoras (14, 15). Por otro lado, también se ha mostrado que virus de la leucemia murina estrechamente relacionados con MelARV inducen células T reguladoras (16, 17). Por tanto, puede plantearse la hipótesis de que la expresión de ERV por el melanoma B16 es directamente responsable de la inducción de células T reguladoras, dando como resultado por tanto la progresión tumoral. Para someter a prueba esta cuestión, se intentó complementar la progresión tumoral reducida de las células B16 ERVKD mediante transferencia adoptiva de las células T reguladoras CD4+CD25+ aisladas de ratones C57BL/6 injertados con células B16 de tipo natural. Tal como se muestra en la figura 4, la transferencia de estas células CD4+CD25+ no tuvo ningún efecto sobre la progresión tumoral de células B16 control injertadas (figuras 4A izquierda y 4B), pero potenció el crecimiento de células tumorales B16 ERVKD hasta niveles similares a los de las células B16 de control (figuras 4A derecha y 4B). Estos resultados sugieren por tanto fuertemente que las células T reguladoras son los intermediarios necesarios del efecto mediado por ERV.

Los presentes datos demuestran que los tumores pueden saturar el sistema inmunitario expresando la envuelta de un ERV. El bloqueo de la expresión de ERV dio como resultado un rechazo tumoral potenciado, y la expresión de la única proteína de la envuelta de ERV restauró parcialmente el grado inicial de progresión tumoral. Se demuestra también que las células T reguladoras con suficientes para permitir que una línea celular tumoral carente de expresión de ERV progrese para dar un tumor. Más generalmente, los resultados también sugieren que las células tumorales se someten probablemente a inmunoedición, un concepto desarrollado por Dunn et al. (1) y relacionado con la vigilancia inmunitaria descrita por Burnet y Thomas (18). De hecho, se ilustra que el desarrollo tumoral no sólo implica mutaciones dentro de proto o anti-oncogenes clásicos, sino también procesos activos dirigidos a genes imprevistos que no presentan ningún efecto sobre el estado de transformación per se, tal como el gen de MelARV identificado en la presente memoria. En combinación con quimio o radioterapias clásicas, la selección como diana de tales genes por cualquier medio disponible (incluyendo la inyección de ARNip no vectorizado) puede contribuir a la regresión tumoral restaurando la capacidad natural del sistema inmunitario para rechazar células tumorales, y por tanto contribuir al tratamiento del cáncer. En este sentido, es de interés que una primera serie de experimentos utilizando ARNip sintético dirigido a MelARV, e inyectado por vía intraperitoneal 12 días tras el injerto de células B16 en ratones inmunocompetentes, dio como resultado realmente 1/3 de inhibición del crecimiento tumoral en comparación con ratones a los que se les inyectó ARNip control y, tal como se ilustra en las figuras 6, un aumento moderado (aunque reproducible) en el retraso de supervivencia. Finalmente, merece la pena destacar que en seres humanos la expresión de genes env de ERV, principalmente restringida a placenta y testículos en tejidos normales, puede observarse en varios tipos de tumor tales como seminomas y melanomas (8, 19, 20). Además, varios de los genes env completamente codificantes que pueden identificarse en el genoma humano son inmunosupresores in vivo en un ensayo de modelo de ratón (5), y por tanto podrían actuar como el gen env de MelARV para promover el escape del tumor.

Resumen

El desarrollo tumoral es un proceso de múltiples etapas en el que acontecimientos tanto genéticos como epigenéticos cooperan para la aparición de un clon maligno. Se ha propuesto la posibilidad de que retrovirus endógenos promuevan la expansión de un clon neoplásico subvirtiendo la vigilancia inmunitaria, pero sigue siendo esquivo. En la presente memoria, se muestra que el silenciamiento (mediante interferencia por ARN) de un retrovirus endógeno inducido espontáneamente en el melanoma murino B16 da como resultado el rechazo de las células tumorales en ratones inmunocompetentes, en condiciones en las que células de melanoma control crecen para dar tumores letales. El silenciamiento no modifica el fenotipo transformado de las células, tal como se mide tanto in vitro mediante un ensayo de agar blando como in vivo mediante la proliferación de células tumorales en ratones inmunoincompetentes (irradiados con rayos X y SCID). El rechazo del tumor puede revertirse tras la transferencia adoptiva de células T reguladoras a partir de ratones injertados con melanoma control, así como tras la reexpresión del único gen de la envuelta del retrovirus endógeno en las células silenciadas. Estos resultados demuestran que los retrovirus endógenos pueden ser esenciales para una subversión mediada por células T reguladoras de la vigilancia inmunitaria y podrían ser relevantes para tumores humanos en los que se inducen tales elementos (y especialmente su gen de la envuelta).

Referencias para el ejemplo 1

1.: Dunn et al. Nat Immunol 2002;3: 991-998.

2.: Garcia-Lora et al. J Cell Physiol 2003; 195: 346-355,

3.: Smyth et al. Immunity 2003; 18: 1-6.

4.: Mangeney et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 14920-14925.

5.: Mangeney et al. J Gen Virol 2001; 82: 2515-2518.

6.: Lower et al. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 5177-5184.

7.: Stoye et al. Curr Biol 2001; 11: R914-6.

8.: Bieda et al. J Gen Virol 2001; 82: 591-596.

9.: Li et al. J Virol 1999; 73: 9178-86.

10.: Miller et al. Biotechniques 1989; 7: 989-90.

11.: Brummelkamp et al. Science 2002; 296: 550-3.

12.: Blaise et al. J Virol 2004; 78: 1050-1054.

13.: Cianciolo et al. J Exp Med 1984; 1 S9: 964- 969.

14.: Sutmuller et al. J Exp Med 2001; 194:823-32.

15.: Turk et al. J Exp Med 2004;200: 771-82. 16. Dittmer et al. Immunity 2004; 20: 293-303.

17.: He et al. J Virol 78: 11641-7, 2004.

18.: Burnet et al. Brit Med J 1: 841-847,1957.

19.: Muster et al. Cancer Res 63: 8735-41, 2003.

20.: Schiavetti et al. Cancer Res 62: 5510-5516, 2002.

EJEMPLO 2: Un retrovirus endógeno recombinante amplificado en un neuroblastoma de ratón está implicado en el crecimiento tumoral in vivo

Abreviaturas: ARNbc, ARN bicatenario; gfp, proteína fluorescente verde; MelARV, retrovirus asociado a melanoma; MLV, virus de la leucemia murina; NeRV, retrovirus asociado a Neuro-2a; RT, transcriptasa inversa; ARNip, ARN de interferencia pequeño.

Se demuestra que el tumor Neuro-2a (un neuroblastoma de ratón A/J espontáneo) produce un retrovirus de origen endógeno que se caracteriza. El silenciamiento (mediante interferencia por ARN) de la expresión de este elemento retroviral da como resultado un crecimiento tumoral retrasado y una supervivencia del animal prolongada, sin ningún efecto sobre el fenotipo transformado de las células. Estos resultados identifican un papel dependiente del sistema inmunitario de los retrovirus endógenos en la tumorigénesis.

Resumen

La teoría de la inmunoedición postula que las células tumorales presentan una inmunogenicidad reducida para escapar de la erradicación por el sistema inmunitario del huésped. Se ha propuesto que retrovirus endógenos (siempre que sean activos) podrían desempeñar un papel en este proceso, mediante el dominio inmunosupresor portado por su proteína de la envuelta. En la presente memoria, se demuestra que la línea celular tumoral Neuro-2a (que se origina a partir de un neuroblastoma de ratón A/J espontáneo) produce un retrovirus infeccioso que lo más probablemente resulta de un acontecimiento de recombinación entre dos elementos retrovirales endógenos de ratón. Este retrovirus recombinante asociado a Neuro-2a se deriva del provirus ecotrópico único ubicado en el locus Emv1, pero con una secuencia de gag que confiere tropismo B, permitiendo así su alto nivel de amplificación en células Neuro-2a. Se muestra que el silenciamiento (mediante interferencia por ARN) de este retrovirus endógeno en células Neuro-2a no presenta ningún efecto sobre el fenotipo transformado de las células, sino que da como resultado un crecimiento tumoral retrasado y una supervivencia del animal prolongada, tras el injerto de las células en ratones inmunocompetentes. La recombinación entre retrovirus endógenos, la amplificación del elemento resultante y la expresión a alto nivel de su actividad inmunosupresora son por tanto etapas probables de un proceso de inmunoedición que conduce a un tumor invasor.

Introducción

Aunque varias pruebas apoyan la idea de la vigilancia inmunitaria del cáncer en ratones y seres humanos, (1, 2) algunos individuos con un sistema inmunitario intacto todavía desarrollan cáncer. Esto puede explicarse por un fallo de la inmunidad del huésped para erradicar específicamente las células transformadas. El término “inmunoedición del cáncer” se ha acuñado para enfatizar la interacción entre el sistema inmunitario del huésped y el tumor, que algunas veces conduce a “escape del tumor” (2, 3). La base molecular y celular de este proceso no se ha dilucidado aún. La alta incidencia de tumores espontáneos en algunas cepas de ratones consanguíneas se ha relacionado con la expresión sostenida de virus de leucemia murina (MLV) endógenos de manera temprana en la vida (4). Está bien establecido ahora que estos elementos pueden desempeñar un papel en el proceso de transformación mediante mutagénesis por inserción (5). También podrían estar implicados no en el proceso de transformación per se, sino en la progresión tumoral in vivo, subvirtiendo la respuesta inmunitaria. De hecho, la proteína de la envuelta de retrovirus (incluyendo los MLV) poseen una actividad inmunosupresora, que puede revelarse mediante un ensayo in vivo (6-8). Además, se ha mostrado recientemente que se requiere absolutamente un retrovirus endógeno específicamente producido por un melanoma murino para el crecimiento tumoral en ratones inmunocompetentes, precisamente debido a que su actividad inmunosupresora subvierte la vigilancia inmunitaria del huésped. De hecho, en este modelo de tumor de melanoma, el silenciamiento (mediante interferencia por ARN) del retrovirus endógeno dio como resultado el rechazo de las células tumorales injertadas, sin ninguna alteración en el fenotipo transformado de las células (9).

Se analiza otra clase de tumores de ratón espontáneos, es decir, neuroblastoma, utilizando la línea celular Neuro-2a como modelo (10), para determinar si están implicados retrovirus endógenos de manera similar en el proceso tumoral. Se muestra que el neuroblastoma Neuro-2a expresa un retrovirus endógeno funcional. Se demuestra (mediante un enfoque de interferencia por ARN) que esta expresión, tal como se observa para los tumores de melanoma, está implicada en el crecimiento tumoral in vivo. Además, se presentan pruebas de que este retrovirus endógeno resulta lo más probablemente de un acontecimiento de recombinación entre el provirus N-trópico ubicado en el locus genético Emv-1 y un MLV endógeno B-trópico, que permite la amplificación del elemento recombinante en células de origen de ratón A/J. Estos acontecimientos genéticos y la expresión a alto nivel resultante de retrovirus endógenos que ejercen una actividad inmunosupresora podrían contribuir al proceso de inmunoedición.

A Materiales y métodos

Ratones y líneas celulares

Se obtuvieron ratones A/J, de 8-12 semanas de edad, de Harlan (Gannat, Francia). Se mantuvieron células Neuro2a (una línea celular de neuroblastoma murino de origen A/J; ATCC CCL-131) y NIH/3T3 (ATCC CRL-1658) en DMEM complementado con el 10% de suero de ternero fetal inactivado por calor y antibióticos. Se mantuvieron melanocitos melan-a (11) (una donación de L. Larue, Instituto Curie, Orsay) en RPMI 1640 complementado con el 10% de suero de ternero fetal inactivado por calor, antibióticos y 13-acetato de 12-O-tetradecanoilforbol (TPA, 200 nmol por litro) en una atmósfera con el 10% de CO2.

Análisis de transferencia de tipo Southern

Se digirió ADN genómico de células Neuro-2a y de hígado de ratón A/J hasta el final con EcoRI, HindIII o PvuII (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), y se cargaron 30 Ig de ADN y se separaron en geles de agarosa al 0,7%. Tras la transferencia, se hibridaron membranas durante la noche a 65ºC en SDS al 7%, 1 mmol de EDTA por litro y 0,5 mmol de Na2HPO4 (pH 7) por litro, utilizando un fragmento de env marcado con 32P (nt 6006-6514) específico para retrovirus ecotrópicos tal como se describe en las referencias (12, 13) y obtenido mediante amplificación por PCR utilizando pDFGMelARVenv (9) como molde y los cebadores pEcB4F/R (tabla 1). Entonces se lavaron las transferencias dos veces con 2X SSC más SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 min. Se detectó en primer lugar el marcaje utilizando un aparato PhosphorImager (FLA-3000 scanner, Molecular Dynamics) y finalmente se expusieron las membranas a una película de rayos X a -80ºC durante 2 semanas.

Caracterización de provirus de Emv-1

Se realizó la identificación del ADN flanqueante de Emv-1 mediante PCR inversa. Se digirieron cinco Ig de ADN genómico de ratones A/J hasta el final con PvuII (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia). Se purificó el ADN mediante extracción con fenol, y entonces se autoligó en 500 Il con 1200 U de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, Hitchin, Inglaterra). Entonces se utilizó el ADN como molde para una PCR inversa con el sistema Expand Long Template (Roche, Penzberg, Alemania) con tampón 1 ó 3 según las instrucciones del fabricante. Tras una etapa de desnaturalización inicial a 93ºC (2 min.), se llevaron a cabo 45 ciclos de amplificación (10 s a 93ºC, 30 s a 65ºC, 15 min. a 68ºC) con cebadores divergentes (tabla 1). Se aisló el producto de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa, se purificó (extracto de Nucleospin, Macherey-Nagel, Düren, Alemania), se clonó en el vector pGEM-T easy (Promega, Charbonnières-les-bains, Francia) y se secuenció utilizando el kit de secuenciación de ciclo BigDye terminator v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) con los cebadores T7 y SP6 patrón. Se mapeó la secuencia resultante en la banda de cromosoma de ratón A/J 5qB1 (cro. 5: 28664818) utilizando el sitio web de UCSC genome bioinformatic (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), que permitía el diseño de cebadores flanqueantes en 5’ y 3’ para amplificar el provirus de Emv-1 completo como dos fragmentos solapantes, utilizando dos cebadores internos (tabla 1). Entonces se secuenció completamente el provirus de Emv-1 tal como se describe a continuación para los ADNc del virus Neuro-2a.

Aislamiento y secuenciación de ARN viral

Se obtuvieron virus mediante ultracentrifugación de los sobrenadantes recogidos a partir de 107 células Neuro-2a, en un rotor SW41 Beckman (Fullerton, CA) (150.000 X g, 1 hora, 4ºC). Se aisló el ARN viral utilizando el microkit de aislamiento de ARN RNeasy (QIAGEN, Courtaboeuf, Francia). Se obtuvo ADNc tal como se describe (14). Se diseñaron diez conjuntos de cebadores (tabla 1) para producir amplicones solapantes. Se realizó la reacción de PCR con el sistema Expand Long Template (Roche, Penzberg, Alemania) con tampón 2 según las instrucciones del fabricante. Tras una etapa de desnaturalización inicial a 93ºC (2 min.), se llevaron a cabo 55 ciclos de amplificación (10 s a 93ºC, 30 s a 63ºC, 1 min. a 68ºC). Se separaron los productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, se purificaron (extracto de Nucleospin, Macherey-Nagel, Düren, Alemania) y se secuenciaron directamente utilizando el kit de secuenciación de ciclo BigDye terminator v1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y los cebadores utilizados para la PCR.

Ensayo de actividad transcriptasa inversa (RT)

Se realizó el ensayo de actividad RT utilizando ARN genómico de bacteriófago MS2 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) como molde de transcripción inversa, y el oligonucleótido sintético RT-1 (5’-CCATAGGTCAAACCTCCTAGGAAG-3’) como cebador, tal como se describe (15). Se preparó el cebador/molde mezclando ARN de MS2 (0,28 pmol) con el cebador RT-1 (9 pmol), calentando a 95ºC durante 5 min., apareando a 37ºC durante 30 min., y enfriando la mezcla sobre hielo durante 5 min. Entonces se añadió a la mezcla de reacción la muestra de prueba para medir la actividad RT o 50 U de RT del virus de la leucemia murina de Moloney (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizado como control positivo. Se llevó a cabo la transcripción inversa a 37ºC durante 5 horas. Entonces se amplificaron los ADN obtenidos mediante PCR con los cebadores RT-2 (5’-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3’) y RT-1. Finalmente, se analizó el producto mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%.

Ensayo de proteína de retrovirus Neuro-2a

Se realizó el análisis de la expresión de proteína viral Neuro-2a mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western en preparaciones virales. Tras la ultracentrifugación, se resuspendieron los sedimentos virales en tampón de lisis (62,5 mmol de Tris-HCl (pH 6,8) por litro, 715 mmol de l-mercaptoetanol por litro, SDS al 2%, glicerol al 10% y azul de bromofenol al 0,01%), se sometieron a ebullición durante 10 min. a 95ºC, se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana y se revelaron con antisueros de cabra anti-Env y anti-Gag generados contra gp70 SU y p30 CA del virus de la leucemia de Rausher (Viromed Biosafety Labs, Nueva Jersey) utilizando el kit de quimioluminiscencia (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, PIERCE, Rockford).

Ensayo de infectividad de la partícula Neuro-2a

Para estudiar la infectividad de la partícula Neuro-2a, se expusieron 2x105 células melan-a (una línea celular melanocítica de origen de ratón C57BL/6 susceptible a infección por MLV B-trópico) (16) a medio de cultivo (control)

o sobrenadante de Neuro-2a filtrado a través de membranas de tamaño de poro de 0,45 Im, en presencia de 4 Ig de Polybrene/ml durante 24 h. Entonces se reemplazó el medio por el medio de cultivo de melan-a normal. Cinco días después, se lisaron las células con tampón MacDougal (20 mmol de Tris-HCl (pH 8) por litro, 120 mmol de NaCl por litro, 0,2 mmol de EGTA por litro, desoxicolato de sodio al 0,2%, Nonidet P-40 al 0,5%) que contenía un cóctel inhibidor de proteasas (complete mini; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se analizó la expresión de proteínas Gag retrovirales mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describió anteriormente.

Establecimiento de células tumorales NeRV KD

Se construyeron vectores de expresión plncxH1 derivados de los vectores plncx (17) y pSUPER (18), para generar transcritos cortos dirigidos contra la Neuro-2a de retrovirus NeRV (que selecciona como diana el transcrito genómico dentro de la secuencia gag; posiciones de nt 1220-1238 desde el codón de iniciación de gag), o contra el transcrito génico que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) (posiciones de nt 215-233 desde el codón de iniciación) como control. Se obtuvieron los vectores insertando en primer lugar oligonucleótidos de 64 meros apareados en pSUPER abierto en los sitios BgIII y HindIII, seguido por la introducción del fragmento de BamHI-HindIII a partir de estos constructos en plncx abierto en los correspondientes sitios. Entonces se utilizaron estos vectores para obtener las poblaciones de células Neuro-2a NeRVKD (NeRV “silenciado”) y control mediante transfección con 2 Ig de cada vector utilizando el kit de transfección de Lipofectamine (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia). Se mantuvieron las células en medio selectivo (neomicina 3 mg/ml) durante tres semanas.

Progresión tumoral in vivo

Para ensayos in vivo, se desprendieron células tumorales de frascos de cultivo tisular utilizando tripsina-EDTA (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), se lavaron tres veces con PBS y se inocularon por vía subcutánea en una zona afeitada del costado derecho de los ratones. En algunos experimentos, se adquirió ARNip sintético dirigido contra los 19 nt de las secuencias de NeRV y control (GFP) a las que se hace referencia en la figura 10, de MWG Biotech (Ebersberg, Alemania). Se inyectaron por vía intraperitoneal (0,2 nmol de ARNip en 500 Il de PBS) cada 2-3 días tras haberse establecido el tumor. Se determinó el aspecto del tumor mediante palpación y se calculó el área tumoral multiplicando dos diámetros perpendiculares.

Análisis estadístico

Se realizó la estadística utilizando el software NCSS 2004 (Gerry Hintze, Kaysville, Utah). Se realizaron comparaciones para variables cuantitativas utilizando ANOVA con medidas repetidas, incluyendo ARNip dirigido contra NeRV o GFP control como factor “entre” y el tiempo como factor “dentro”. Se sometieron a prueba las diferencias entre grupos según el tiempo mediante el término de interacción. Se realizó el análisis de la supervivencia utilizando curvas de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos.

Tabla 1. Secuencias y posiciones de los cebadores utilizados

Secuencias de cebadores (5’-3’) Cebadores para la amplificación de ADN R: 6403-TGGGGTTGCCTGGTCTGAGGTTA-6381 flanqueante en 3’ de Evm-1a F: 8250-TCCAATAAAGCCTTTTGCTGTTGCA-8274

Cebadores para la amplificación del provirus de F1 flanqueante: CGCAGCACCTGGAGACAG

Emv-1a R1 interno: 4749-GCTTGCCTTGGAAGACCC-4732 F2 interno: 3664-TCCTAACTGCCCCCGC-3679 R2 flanqueante: TGGTCCCTTCCTTCCACC

Cebadores para la amplificación de ADNc de F1: 1-GCGCCAGTCCTCCGATA-17

NeRVb R1: 1038-GGGGGTAAGAGCAGGGTAA-1020 F2: 836-AGGTGTTCTCTCCTGGTCCC-855 R2: 1923-GATCCTTTCGGCTTCTCTCA-1904 F3: 1793-CTGGGCAAGAAACGAATGTAT-1813 R3: 2816-TCCTGTGACATGGGGTATTGT-2796 F4: 2685-GCTTTCCGACTTTCCCCA-2702 R4: 3775-GCCAAGGTCCCAGTTTTTG-3757 F5: 3662-TCCTAACTGCCCCCGC-3677 R5: 4747-GCTTGCCTTGGAAGACCC-4730 F6: 4636-ACCCCATATACGCCTGCC-4653 R6: 5630-CGCACCCACACGGAGTC-5614 F7: 5484-TAATAGCCCATCTCTCCAAGC-5504 R7: 6397-GTTGCCTGGTCTGAGGTTAGA-6377 F8: 6136-AGGAGCCCCTGACTTCATATAC-6157 R8: 7176-CTCGTCTTTCAAATTGGTGGTA-7155 F9: 7057-CTCCCTGTATCTCAACCACCA-7077 R9: 8149-CAGAAGCGAGAAGCGAGC-8132 F10: 7881-GCATGGGAAAATACCAGAGC-7900 R10: 8273-TGCAACAGCAAAAGGCTTT-8255 R11: 150-CCCCCAAATGAAAGAC-135

Cebadores utilizados para la sonda de env pEcB4F: 6006-CTCTGTATGTTGGCCCTCC-6024 ecotrópicab pEcB4R: 6514-GAGACGTATAGGCGCAATC-6496 a Las posiciones de cebadores se numeran tomando la primera posición del dominio R de Emv-1 de LTR en 5’ como posición 1. b Las posiciones de cebadores se numeran tomando la primera posición del dominio R de NeRV de LTR en 5’ como posición 1.

B Caracterización de un retrovirus asociado a Neuro-2a

5 Tal como se muestra en la transferencia de tipo Southern de la figura 7, la hibridación con una secuencia específica de MLV ecotrópico (nt 6006-6514, a partir de las referencias 12, 13) revela una única banda en el ADN de células de hígado normales a partir de ratones A/J, pero numerosas bandas en el de células tumorales Neuro-2a. Esto concuerda con una fuerte amplificación en células Neuro-2a del provirus ecotrópico detectable en ADN genómico de ratón A/J (figura 7). Tal amplificación resulta lo más probablemente de la retrotransposición en curso y/o de la

10 autoinfección de las células por las copias de provirus identificadas, que podrían por tanto ser todavía activas. Por consiguiente, se sometieron a ensayo los sobrenadantes a partir de las células Neuro-2a para determinar la actividad transcriptasa inversa (RT). Se utilizaron sobrenadantes de células NIH/3T3 infectadas o no con un retrovirus de leucemia murina de Moloney como controles positivo y negativo, respectivamente. Se concentró material particulado en sobrenadantes libres de células a partir de 107 células mediante ultracentrifugación, y se

15 analizó la actividad RT tal como se describe en Pyra et al. (15). Tal como se muestra en la figura 8A, los sobrenadantes de células Neuro-2a contienen una actividad RT detectable, que se encuentra que es dependiente de Mn2+. Entonces se analizaron los sobrenadantes para detectar la presencia de proteínas retrovirales Env y Gag específicas de MLV mediante inmunotransferencias de tipo Western, utilizando antisueros de cabra anti-Env y anti-Gag. Tal como se muestra en la figura 8B, pueden detectarse proteínas Gag y Env completamente procesadas, lo

20 que concuerda con su incorporación dentro de partículas retrovirales auténticas. Se denominó este retrovirus NeRV para retrovirus asociado a Neuro-2a. Se caracterizaron adicionalmente partículas de NeRV mediante un ensayo de infectividad, utilizando células melan-a murinas como diana (véase el esquema en la figura 8C). De manera sistemática, el análisis de las células diana 6 días tras la infección por las partículas de NeRV contenidas en el sobrenadante de células Neuro-2a reveló transcritos virales (mediante RT-PCR utilizando cebadores para la

25 secuencia de env específica ecotrópica; datos no mostrados) y proteínas retrovirales (véase la inmunotransferencia de tipo Western para Gag en la figura 8C), ambos no observados en células infectadas de manera simulada. Conjuntamente, estos resultados muestran que las células Neuro-2a contienen secuencias que generan proteínas retrovirales y partículas infecciosas. Para caracterizar adicionalmente estas partículas, se secuenció su contenido en ARN. Se transcribió de manera inversa in vitro el ARN viral, y se amplificó mediante PCR el ADNc utilizando una

30 serie de cebadores para generar amplicones solapantes (véase Materiales y métodos) y se realizó la secuenciación directamente, sin clonación. La secuencia resultante (número de registro de Genbank por asignar, y véase la figura 9A) da a conocer marcos de lectura abiertos para los tres genes retrovirales gag, pol y env, con la organización canónica de retrovirus MLV, y la firma ecotrópica del gen env (nt 5838-6727). Este resultado concuerda con la liberación de partículas de NeRV infecciosas por células Neuro-2a.

Tal como se mostró previamente (Jenkins et al. (19) y transferencia de tipo Southern en la figura 7), los ratones A/J presentan un provirus ecotrópico único, denominado Emv-1 (19), que es por tanto un candidato probable como progenitor de las múltiples secuencias ecotrópicas encontradas en las células Neuro-2a y partículas virales liberadas. Sin embargo, su secuencia de nucleótidos completa no se había determinado anteriormente. Por tanto, se caracterizó el locus Emv-1 de la cepa A/J utilizando una estrategia de PCR inversa que permitió la identificación del sitio de integración del provirus y la determinación de su secuencia de nucleótidos completa (número de registro de Genbank por asignar). La comparación de las secuencias de Emv-1 y NeRV muestra una divergencia de sólo el 0,9% al nivel de nucleótidos (76/8275), ubicándose la mayoría de las diferencias entre las dos secuencias en el gen gag (figura 9). El gen gag codifica para la proteína de la cápsida viral que contiene los determinantes para el tropismo N y B (20). De manera interesante, Emv-1 contiene, en las posiciones de codón 323-324, los aminoácidos QR característicos de la proteína de la cápsida de virus N-trópicos, mientras que NeRV contiene en su lugar el par de aminoácidos PE específico para virus B-trópicos (figura 9B). Estos resultados sugieren fuertemente que NeRV se origina a partir de un acontecimiento de recombinación entre la secuencia de Emv-1 completa y un segmento de la secuencia de gag derivada de otro retrovirus MLV con tropismo B. Los ratones A/J son Fv1b/b (21) y, como tales, son resistentes a la replicación de retrovirus N-trópicos pero permisivos para la de retrovirus B-trópicos. Por tanto, los datos sugieren que el acontecimiento de recombinación ha sido la base molecular para la amplificación de un retrovirus derivado de Emv-1 activo en células de neuroblastoma Neuro-2a.

Papel del retrovirus asociado a Neuro-2a sobre el crecimiento de células tumorales in vivo

Para demostrar el papel de NeRV en el crecimiento tumoral in vivo, se utilizó un enfoque de interferencia por ARN basado en la expresión estable en células Neuro-2a de vectores que producen ARN bicatenario corto (ARNbc) dirigido contra el genoma viral (o el gen gfp irrelevante como control, figuras 10A y 10B). La figura 10C muestra claramente que el vector de expresión de ARNbc específico de retrovirus suprimía casi completamente la expresión de NeRV en células Neuro-2a transfectadas de manera estable (denominado NeRVKD para células NeRV “silenciadas”), con una reducción de >10 veces en la cantidad de ambas proteínas virales Env y Gag en comparación con células control transfectadas con el vector de expresión de ARNbc específico de gfp (células control). Entonces, se exploró el impacto del silenciamiento de NeRV sobre la progresión tumoral inyectando por vía subcutánea a ratones inmunocompetentes A/J células control o NeRVKD (2x105 células por ratón). Tal como se esperaba, comenzó a poder detectarse nódulos tan pronto como en el día 18 tras la inyección de células Neuro-2a control, y crecieron rápidamente para dar tumores grandes en la mayoría de los animales produciéndose letalidad tras el día 27 (figuras 10D y 10E). Tras la inyección de células NeRVKD, también se observaron tumores, pero de tamaño reducido y en una fracción más pequeña de los ratones injertados. Al crecimiento tumoral más lento le acompañaba de manera sistemática una supervivencia prolongada de los animales (figura 10E). En paralelo, se inyectaron células NeRVKD y control en ratones A/J inmunocomprometidos. Tal como se ilustra en la figura 10D (inserto), ambas poblaciones de células presentaban tasas de crecimiento similares en ratones irradiados con rayos X, demostrando así que la expresión de NeRV no presenta ningún impacto sobre el fenotipo transformado per se. Conjuntamente, los resultados indican que la expresión de NeRV está implicada en el crecimiento tumoral mediante una actividad dependiente del sistema inmunitario, lo más probablemente relacionada con la misma actividad inmunosupresora que la descrita anteriormente para otro retrovirus endógeno (9), concretamente el retrovirus asociado a melanoma MelARV, (22, 23) que se encuentra que se expresa a un alto nivel en el modelo de tumor de melanoma B 16 (9, 22, 23).

Finalmente, para determinar si la extinción de NeRV podría inducir la regresión tumoral restaurando la capacidad natural del sistema inmunitario para rechazar células tumorales, se inyectaron directamente ARNip sintéticos, dirigidos contra las mismas secuencias que las seleccionadas como diana por los vectores de expresión de ARNbc descritos anteriormente. Se inyectaron estos ARNip sintéticos en ratones inmunocompetentes 6 días tras el injerto de células Neuro-2a, es decir, en un momento en el que los animales ya habían desarrollado tumores detectables. Entonces se repitieron las inyecciones de ARNip a intervalos de 2-3 días. En este contexto, tal como se ilustra en la figura 11, pudo observarse una inhibición del crecimiento tumoral de al menos el 45% con los ARNip dirigidos contra la secuencia de NeRV, en comparación con los ARNip control.

Utilizando la línea celular Neuro-2a como modelo de neuroblastoma murino espontáneo, se muestra que un retrovirus endógeno expresado por células tumorales, que se caracteriza completamente en la presente memoria a nivel molecular, desempeña un papel esencial en el proceso tumorigénico reduciendo significativamente la respuesta inmunitaria antitumoral del ratón. De hecho, el silenciamiento de la expresión del retrovirus asociado a Neuro-2a mediante interferencia por ARN, utilizando cualquier vector de expresión estable para ARN bicatenarios o la inyección i.p. directa de ARNip sintéticos, ambos dirigidos contra el transcrito viral, da como resultado un crecimiento reducido de células tumorales in vivo y una supervivencia potenciada de los ratones. El efecto de silenciamiento es específico ya que no se observa utilizando ARN bicatenarios irrelevantes, y no afecta ni las propiedades de crecimiento intrínsecas ni el fenotipo transformado de células Neuro-2a (tasas de crecimiento tumoral idénticas en ratones irradiados con rayos X). Consecuente con la naturaleza del retrovirus asociado a Neuro-2a (véase a continuación) cuyo dominio inmunosupresor es idéntico al 100% con el de los retrovirus MLV sometidos a prueba anteriormente (6, 9), el efecto anterior debe estar mediado por la actividad inmunosupresora de la proteína de la envuelta de NeRV. Ésta última puede detectarse de hecho fácilmente mediante inmunotransferencia de tipo Western en sobrenadantes de células Neuro-2a, y es también responsable de la infectividad demostrada de partículas de NeRV.

La implicación directa de un retrovirus endógeno en el crecimiento tumoral in vivo es un resultado bastante imprevisto si se considera que el efecto observado no es relevante para ninguna alteración directa del genoma celular (por ejemplo, mediante mutagénesis por inserción), sino que en su lugar depende de la modulación epigenética de las interacciones tumor-huésped mediadas por la única expresión de una actividad inmunosupresora por el tumor. Realmente, los presentes resultados son estrechamente análogos a los que se obtuvieron anteriormente para un melanoma de ratón, en el que pudo mostrarse que la proteína de la envuelta de un retrovirus endógeno asociado (MelARV) (23) (que da a conocer una identidad del 98,8% (680/688 Aa) con la de NeRV) está también implicada en el crecimiento de células tumorales (9). En consecuencia, el hallazgo de un papel común de retrovirus endógenos en dos clases diferentes de tumores de ratón sugiere fuertemente que estos elementos podrían ser agentes esenciales en el proceso tumorigénico. Esta suposición no es totalmente inesperada si se recuerda que los retrovirus endógenos y los retrovirus de animales “clásicos” son entidades biológicas estrechamente relacionadas (24-26), estando estos últimos directamente implicados de manera inequívoca en la generación de patologías, con pruebas de disfunciones del sistema inmunitario del huésped (27). Esta relación, por tanto, lo más probablemente va más allá de similitudes en la organización génica y los ciclos de replicación, y se extiende a los mecanismos de sus efectos patológicos. En este sentido, merece destacarse que pueden encontrarse retrovirus endógenos en todos los mamíferos, y en particular en seres humanos, en los que se han identificado elementos con genes env intactos que dan a conocer una actividad inmunosupresora (8). Por tanto, es tentador especular que tales elementos podrían estar implicados de manera similar en la tumorigénesis en seres humanos. Además, se ha mostrado que varios retrovirus endógenos humanos son activos transcripcionalmente en algunos tumores, tales como tumores de la línea germinal y melanoma, con pruebas en algunos casos de expresión de partículas similares a virus (28-30).

Otro resultado importante del presente estudio se refiere a la caracterización molecular del virus NeRV expresado por células Neuro-2a, que proporciona consejos para “reconstruir” una historia molecular que conduce a la generación del tumor Neuro-2a invasor, completamente transformado. De hecho, la secuenciación completa del ARN de NeRV viral muestra que este elemento se ha generado lo más probablemente mediante un acontecimiento de recombinación, un proceso que es una característica bastante común para retrovirus infecciosos. Este proceso implica lo más probablemente el empaquetamiento conjunto de dos transcritos virales distintos dentro de una única partícula retroviral, y saltos de la transcriptasa inversa entre las hebras en el transcurso de la replicación viral (3133). De manera interesante, en el presente caso pudo identificarse de manera inequívoca el progenitor genómico de NeRV, concretamente la copia de MLV ecotrópico única que puede encontrarse en el genoma del ratón A/J (véase la transferencia de tipo Southern en la figura 7) y que corresponde al locus Emv-1 en la referencia 19. Además, la secuenciación completa de este elemento permitió mapear el acontecimiento de recombinación para la generación del virus NeRV dentro del gen gag, con la adquisición de parte de la secuencia de gag a partir de un MLV B-trópico. Este acontecimiento molecular ha sido lo más probablemente de gran importancia, puesto que convierte una copia del retrovirus ecotrópico endógeno único del genoma del ratón A/J de un retrovirus N-trópico a un retrovirus Btrópico, permitiendo así la retrotransposición y/o la reinfección dentro de las células de ratón A/J restringidas a Ntrópicas. Por consiguiente, ahora las células Neuro-2a tanto dan a conocer una alta carga de copias de MLV ecotrópico (véase la figura 7) como expresan a un nivel detectable partículas de MLV activas (figura 8). Aunque el tumor primario no está disponible (y en consecuencia sigue siendo difícil evaluar de manera inequívoca si tuvo lugar amplificación dentro del tumor primario y no durante el cultivo in vitro), es probable que los acontecimientos moleculares mencionados anteriormente hayan desempeñado un papel importante en la historia tumoral. En este sentido, es de destacar que en el estudio paralelo mencionado anteriormente que se llevó a cabo en un melanoma de ratón C57BL/6 (en el que también se encontró que el MLV ecotrópico B-trópico, MelARV, se expresaba a un alto nivel (22, 23) también se ha observado un cambio en el tropismo del virus, asociado con su amplificación y adquisición de una actividad inmunosupresora asociada a la proteína de la envuelta por el tumor (9).

En conclusión, el presente ejemplo tanto enfatiza el papel de retrovirus endógenos en la tumorigénesis, mediante un efecto imprevisto de su actividad inmunosupresora que actúa sobre el sistema inmunitario del huésped, como disecciona acontecimientos moleculares importantes que han hecho posible de manera precisa que este efecto se desarrolle por completo. En este sentido, el neuroblastoma Neuro-2a puede constituir un modelo valioso de “inmunoedición”, y abre importantes perspectivas para el estudio de tumores humanos, para los que ya hay pruebas de que se induce al menos la expresión de retrovirus endógenos definidos en algunos tumores primarios in situ (revisado en las referencias 24 a 26).

Referencias para el ejemplo 2

1.: Smyth et al. 2001;2:293-9.

2.: Dunn et al. Immunity 2004; 21:137-48.

3.: Dunn et al. Nat Immunol 2002; 3:991-8.

4.: Massey et al. J Virol 1994;68:3773-83.

5.: Mikkers et al. Adv Cancer Res 2003; 88:53-99.

6.: Mangeney et al. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:14920-5.

7.: Blaise et al. J Gen Virol 2001; 82(7):1597-600.

8.: Mangeney et al. J Gen Virol 2001; 82(10):2515-8.

9.: Mangeney et al. Cancer Res 2005; 65:2588-91.

10.: Sandler et al. Cancer Res 2003; 63(2):394-9.

11.: Bennett et al. Int J Cancer 1987; 39(3):414-8.

12.: Chan et al. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77(10):5779-83.

13.: Chattopadhyay et al. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77(10):5774-8.

14.: de Parseval et al. J Virol 2003; 77(19):10414-22.

15.: Pyra et al. Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:1544-8.

16.: Li et al. Int J Cancer 1998; 76(3):430-6.

17.: Miller et al. biotechniques 1989; 7(9):989-90.

18.: Brummelkamp et al. Science 2002; 296(5567):550-3.

19.: Jenkins et al. J Virol 1982; 43(1):26-36.

20.: Goff et al. Mol Cell 2004; 16:849-59.

21.: Pincus et al. J Exp Med 1971; 133(6):1219-33.

22.: Li et al. Cancer Res 1996; 56(19):4464-74.

23.: Li et al. J Virol 1999; 73(11):9178-86.

24.: Lower et al.. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93(11):5177-84.

25.: Bannert et al. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 13:14572-9.

26.: de Parseval et al. Cytogenet Genome Res 2005; 110(1-4):318-32.

27.: Dittmer et al. infection. Immunity 2004; 20(3):293-303.

28.: Bieda et al. J Gen Virol 2001; 82:591-6.

29.: Muster et al. Cancer Res 2003; 63(24):8735-41.

30.: Buscher et al. Cancer Res 2005; 65:4172-80.

31.: Hu et al.. Science 1990; 250(4985):1227-33.

32.: Zhang et al.. J Virol 2000; 74(5):2313-22.

33.: Telesnitsky et al. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997:121-60.

EJEMPLO 3: Actividad inmunosupresora de la proteína Np9 codificada por el gen env del provirus de HERV-K 101

A Clonación de los genes que codifican para Np9

Se amplificó por PCR Np9 con la polimerasa Pfx Platinum de alta fidelidad (Invitrogen), utilizando phCMV K108-Env como molde (Dewannieux et al. 2005 (J Virol. 2005; 79(24):15573-7) y los siguientes cebadores:

5’-ata cat ctc gag atg aac cca tcg gag atg caa aga aaa ggg cct cca cgg aga tgt ctg cag gtg tac cca aca gc-3’ y 5’-atg tat acg cgt tta aca cat aac aaa atg-3’

Se purificó el producto de amplificación, se digirió con Xho-I y Mlu-I y se ligó en el vector phCMV (Blaise et al. 2003, PNAS, 100(22): 13013-18) abierto con las mismas enzimas.

Secuencia de phCMV-Np9 (SEC ID NO: 1), con el ORF de Np9 subrayado

B Regulación por disminución de la expresión de HLA de clase I inducida por células 293T cotransfectadas con Np9

Tal como puede observarse en las figuras 13 y 14, la expresión de HLA de clase I se regula por disminución por células 293T cotransfectadas con vectores que expresan Np9 y vectores de expresión de HLA-A2, -B27, -Cw3.

La figura demuestra la regulación por disminución de la expresión de HLA de clase I por células 293T cotransfectadas con 5 Ig de vector de expresión de Np9 (phCMV-Np9) y 3 Ig de vectores de expresión de HLA-A2, HLA-B27 o HLA-Cw3 (los tres como fragmentos genómicos de EcoRI en pBR 328). Se midió la expresión de HLA de clase I mediante FACS con anticuerpo anti-CMH-I humano acoplado a PE W6/32 (eBioscience) 72 h tras la transfección.

De este modo, estos resultados demuestran que la expresión de la proteína Np9 codificada por el gen env de HERV-K induce la regulación por disminución de antígenos del CMH de clase I, un rasgo característico de las células tumorales que les permite escapar de la vigilancia inmunitaria.

EJEMPLO 4: Phoenix, un progenitor infeccioso para los retrovirus endógenos humanos móviles HERVK(HML2)

INTRODUCCIÓN

Cerca del 8% del genoma humano está compuesto por secuencias de origen retroviral. La mayoría de ellas son redundantes, o bien debido a recombinación entre las dos LTR de provirus, o a mutaciones que interrumpen los

marcos de lectura abiertos (ORF) retrovirales. El gen env parece estar bastante conservado (con 18 genes intactos que conservan una capacidad codificante completa en el genoma humano (1-3)), posiblemente debido a sus posibles papeles en la fisiología humana. La familia HERV-K(HML2) de retrovirus endógenos es una excepción a esta regla general, puesto que algunas copias todavía contienen OFR completos para los otros genes retrovirales (4, 5 5). Esta familia incluye los retrovirus endógenos amplificados más recientemente, la mayoría de los cuales se han integrado en el genoma hace menos de 5 millones de años, mostrando algunas inserciones polimorfismo dentro de la población humana (6-11). Algunos de estos provirus integrados recientemente son responsables de la síntesis de partículas retrovirales que pueden observarse en líneas celulares derivadas de teratocarcinoma y melanoma (12-16), y posiblemente en placenta humana (17-19). Debido a esta “actividad”, la familia HERV-K(HML2) ha sido objeto de 10 numerosos estudios en los últimos años, con la descripción de alelos con provirus casi intactos y capacidad codificante completa (9, 20, 21). A pesar de estos esfuerzos, todavía no se han descrito provirus funcionales que puedan producir partículas infecciosas. Aunque se han identificado varios locus que contienen ORF completos y a pesar de la disponibilidad de la secuencia completa del genoma humano, la búsqueda de un provirus funcional está dificultada por el polimorfismo significativo que puede detectarse en cada locus de HERV-K (HML2) dentro de la

15 población humana. Para superar esta limitación, se utilizó una estrategia inversa y se generó un provirus de HERVK(HML2) consenso, “resucitando” por tanto Phoenix, el probable progenitor de la última explosión de amplificación de HERVK( HML2) específico humano.

A Materiales y métodos 20

Diseño por ingeniería genética in silico y reconstrucción in vitro del provirus de HERV-K(HML2) consenso

Para generar la secuencia del provirus de HERV-K(HML2) consenso, se tomaron las secuencias de nucleótidos de las 9 clases de provirus de longitud completa, específicas de ser humano, de 9,4 kb, que pueden encontrarse en las

25 publicaciones y bases de datos de secuencias, y se alinearon utilizando ClustalW para generar la secuencia consenso (véase la figura 22, SEC ID NO: 4 y la tabla de apoyo 1). Para obtener una estructura principal para el vector de expresión de provirus Phoenix, se subclonaron los provirus K108 y K109 digiriendo clones BAC comerciales RP11-33P21 y RP11-152J15 (BACPAC Resources), y se generaron constructos quiméricos para acercarse a la secuencia consenso. Se colocaron fragmentos de estos constructos quiméricos en el plásmido

30 pALTER-1 (Promega) y se sometieron a rondas sucesivas de mutagénesis dirigida al sitio utilizando el sistema de mutagénesis Altered Sites II in vitro (Promega) y cebadores apropiados. Cuando se han introducido todas las mutaciones esperadas, se reensambló el provirus Phoenix en el plásmido pBluescript, y se comprobó el constructo completo mediante secuenciación. Para generar el vector de expresión de CMV, se aisló la región promotora de CMV de pCMVl (Clonetech, fragmento de EcoRI – SacI) y se utilizó para reemplazar la parte U3 de la LTR en 5’

35 (utilizando PCR) para mantener el sitio de inicio de la transcripción sin cambios.

Tabla de apoyo 1 Nombre Número de registro Primera posición Última posición Orientación

de GenBank K104 AC116309 123.567 114.122 - K108-1 AC072054 47.417 37.947 - K108-2 AC072054 38.914 29.443 - K109 AC055116 139.321 148.740 + K113 AY037928 1 9.472 + K115 AY037929 1 9.463 +

Y178333 1 8.629 + AP000776 101.084 110.549 + AC025420 37.159 46.615 +

Esta tabla de apoyo 1 proporciona las coordenadas de GenBank de las copias de HERV-K endógeno humano 40 utilizadas para generar el provirus Phoenix.

Se introdujeron mutaciones puntuales dentro de los motivos de proteasa y RT (desde LVDTGA hasta LVaaaA y desde YIDD hasta aIaa, respectivamente) utilizando el sistema de mutagénesis Altered Sites II in vitro (Promega) y cebadores apropiados. Se logró la inactivación del gen gag a través de una deleción en fase entre los sitios únicos

45 foI y PshAI, y se alteró el gen env insertando un ligador sintético pequeño que contiene codones de terminación en los 6 marcos en el sitio StuI único.

Construcción de provirus de HERV-K quiméricos

50 Para generar los provirus de HERV-K quiméricos, se construyó en primer lugar un vector de expresión para la copia de HERV-K109, reemplazando la parte U3 de su LTR en 5’ por la región promotora de CMV. La parte en 3’ de este provirus se reemplazó por las secuencias correspondientes de los provirus K113 y K115 (desde el sitio SexAI único hasta el final) o K108-1 (desde el sitio SacI hasta el final). Para la triple quimera K109-K115-K108, se reemplazó el dominio en 3’ de K109-K115 por la parte correspondiente del provirus K108-1 (desde el sitio XbaI hasta el final).

Producción de anticuerpos – Análisis de inmunotransferencia de tipo Western y estudios de inmunofluorescencia

Se desarrolló un antisuero policlonal anti-Gag de HERV-K inmunizando conejos con una mezcla de proteínas recombinantes purificadas producidas en bacterias, cubriendo la proteína Gag de HERV-K113 completa. Se comprobaron los sueros resultantes mediante análisis de inmunotransferencia y se purificaron mediante afinidad antes de su utilización (Agrobio, Francia). El monoclonal anticuerpo dirigido contra la subunidad SU de la proteína de la envuelta de HERV-K ya se ha descrito (26).

Para el análisis de la expresión y escisión de proteínas retrovirales, se lisaron células 293T transfectadas de manera transitoria con los vectores de expresión de provirus (utilizando Lipofectamine y +Reagent; Invitrogen) en tampón Laemmli 48 h tras la transfección y se separaron directamente las proteínas del lisado mediante SDS-PAGE, seguido por transferencia sobre membranas de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell) e incubación con el anticuerpo apropiado y con un anticuerpo secundario unido a peroxidasa del rábano. Para el análisis de los sobrenadantes celulares, se transfectaron células 293T mediante el método de fosfato de calcio utilizando el kit comercial MBS (Stratagene). Se concentró el material particulado en el medio mediante ultracentrifugación en un colchón de sacarosa al 20% 48 h tras la transfección, y se lisaron los viriones en tampón Laemmli antes del análisis de proteínas virales mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia.

Se llevó a cabo el análisis de inmunofluorescencia de la ubicación intracelular de Gag y Env en células 293T transfectadas de manera transitoria con el vector de expresión Phoenix. Se fijaron las células 30 h tras la transfección, se permeabilizaron y se tiñeron con un suero policlonal de conejo anti-Gag y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Env. Se utilizaron anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con Alexa 546 y anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con Alexa 488 como anticuerpos secundarios (Molecular probes); se tiñeron los núcleos con Dapi y Topro3 (Molecular probes).

Microscopía electrónica

Para los estudios morfológicos, se fijaron las células en tampón fosfato pH 7,2, glutaraldehído al 3% durante 1 h, y se fijaron posteriormente en tampón cacodilato 0,1 M, tetróxido de osmio al 1% durante 2 h. Tras enjuagarse durante 5 min. en agua y 15 min. en tampón cacodilato 0,1 M, se transfirieron las células a tampón cacocilato 0,2 M durante 30 min. Se lavaron las células en metanol al 30% durante 10 min., se tiñeron en acetato de uranilo al 2% en tampón cacodilato al 0,1 M – metanol al 30% durante 1 h, y se lavaron en metanol al 30%. Entonces de deshidrataron las células a través de una serie de etanol-óxido de propileno graduales y se incrustaron en Epon 812.

Para los experimentos de microscopía inmunoelectrónica, se fijaron las células transfectadas durante 1 h a 4ºC con

o bien formaldehído al 4% o bien glutaraldehído al 1,6% en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,3). Durante la fijación, se rasparon las células de las placas y se centrifugaron. Se deshidrataron los sedimentos en concentraciones crecientes de metanol y se incrustaron en Lowicryl K4M a baja temperatura. Se llevó a cabo la polimerización durante 5 días a -30ºC bajo luz UV de longitud de onda larga. Se recogieron secciones ultrafinas de material incrustado en Lowicryl sobre rejillas de oro recubiertas con carbono Formvar (200 de malla) y se utilizaron para marcar con un antisuero de conejo específico para la subunidad SU de la proteína de la envuelta de HERV-K seguido por incubación con un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con partículas de oro, de 10 nm de diámetro.

Para la observación, se contrastaron las secciones con citrato de plomo y acetato de uranilo al 4% y se examinaron con un microscopio Zeiss 902 a 80 Kv.

Ensayo de RT

Se realizaron ensayos para determinar la presencia de actividad RT en sobrenadantes celulares utilizando células 293T transfectadas de manera transitoria. En el día 2 tras la transfección, se recogió el medio, se filtró a través de membranas de 0,45 Im de tamaño de poro y se concentró el material particulado mediante ultracentrifugación en un colchón de sacarosa al 20%. Se lisaron los viriones en Tampón A (Tris 25 mM, EDTA 0,25 mM, KCl 50 mM, DTT 5 mM, Triton X-100 al 0,025%, glicerol al 50%) y se utilizaron como fuente de RT para la transcripción inversa de ARN de MS2 comercial. Entonces se sometió a ensayo la síntesis de ADNc mediante PCR (ensayo PERT, véase la referencia 24). En estos ensayos, se utilizaron vectores de expresión para las proteínas núcleo de MLV y VIH como controles positivos, y CMV-l (Clonetech) como control negativo.

Ensayos de infección y retrotransposición

Para los ensayos de infección, se utilizaron células 293T como células productoras, tras la transfección transitoria con el provirus consenso, utilizando el método de fosfato de calcio (kit comercial MBS de Stratagene). Se sembraron líneas celulares diana (SH-SY5Y, BHK21, G355.5, HeLa y WOP) el día antes de la infección en placas de 6 pocillos. El día de la infección, se recogieron los sobrenadantes de las células 293T, se filtraron a través de membranas de 0,45 Im de tamaño de poro y se añadieron a células diana (1 ml por pocillo, con Polybrene 4 Ig/ml). Se infectaron células BHK21 de hámster diana con la muestra que iba a someterse a prueba en presencia de Polybrene (4 Ig/ml), se sometieron a espinoculación (centrifugación durante 2h 30’, 1200 g, 25ºC) y a una incubación durante la noche antes de cambiar el medio. En el día 2 tras la infección, se lavaron las células BHK21 con ADNasaI (20 min. 37ºC), se dividieron, y se recubrió el ADN genómico en el día 6 tras la infección utilizando un protocolo de extracción con fenol-cloroformo convencional. Entonces se sometieron a ensayo para determinar la presencia de provirus de HERV-K integrados mediante análisis de Taqman. Para esto, se utilizan 500 ng de ADN genómico como molde en cada reacción, utilizando los siguientes cebadores (5’-GCCTTTCCCGCCCTTAATT-3’ y 5’-GCAGGGCAGCGATCATCTA-3’) a una concentración final de 1 IM y una sonda Taqman MGB (Applied Biosystems, 6FAM-ATAGTGTATGGGTACCTGGC-MGBNFQ) a una concentración final de 0,25 IM.

Para los ensayos de retrotransposición, se sembraron 7,5x105 células SH-SY5Y en placas de 60 mm el día antes de la transfección. Se realizó la transfección utilizando 8 Il de Plus Reagent (Invitrogen), 12 Il de Lipofectamine (Invitrogen) y 3 Ig de ADN (2,5 Ig de vector de expresión derivado de Phoenix y 0,5 Ig de plásmido de expresión de env o plásmido de control).

Se hicieron crecer las células durante una semana antes de la siembra en placas de 10 cm y la posterior selección con G418. Los resultados se facilitan como frecuencias de transposición relativas en comparación con Phoenix marcado con neoTNF (cuya frecuencia de transposición absoluta es de 10-5 clones por célula sembrada en estas condiciones).

Caracterización de sitios de inserción de novo de HERV-K(HML2)

Se analizaron los sitios de integración mediante PCR inversa utilizando clones de G418R individuales esencialmente tal como se describe (30). En resumen, se digirieron 5 Ig de ADN de cada clon con PvuII y o bien (i) con DraI, o (ii) con SspI, o (iii) con una mezcla de XbaI, AvrII y Spel, o bien (iv) con ApoI solo. Tras la eliminación de la enzima, se diluyó el ADN y se autoligó durante la noche. Se precipitó con etanol, se disolvió en 20 Il de Tris 10 mM, y se sometió a una ronda (o en algunos casos dos) de PCR con conjuntos de cebadores divergentes ubicados dentro del gen neo y diseñados para la amplificación del extremo 5’ o 3’ y secuencias flanqueantes de los provirus recién insertados. Los ADN amplificados se purificaron en gel, se clonaron y se secuenciaron, dando así las secuencias del sitio diana. Las secuencias de cebadores están disponibles a petición.

Precauciones de seguridad

Todos los experimentos que implican producción y manipulación de virus se realizaron en cabinas de seguridad biológica de flujo laminar con contención BL2 utilizando prácticas BL3.

B Regeneración de Phoenix, el retrovirus HERV-K (HML2) ancestral

Para construir un provirus de HERV-K(HML2) consenso, se ensamblaron todas las copias completas del provirus de 9,4 kb que son específicas humanas (excluyendo las que presentaban la deleción de 292 nt al comienzo del gen env) y se alinearon sus secuencias de nucleótidos para generar la secuencia consenso in silico, tomando para cada posición el nucleótido más frecuente. La secuencia de provirus resultante contiene, tal como se esperaba, ORF para todas las proteínas codificadas por HERV-K(HML2) (Gag, Pro, Pol, Env y la proteína auxiliar Rec), así como las señales de traducción esperadas, con motivos de cambio de marco canónicos entre gag, pro y pol. Es de interés que este provirus consenso es distinto de cada una de las secuencias utilizadas para generarlo, con al menos 20 cambios de aminoácidos en las secuencias globales (figura 15).

Basándose en esta reconstrucción in silico, se generó entonces un clon molecular correspondiente a la secuencia proviral de ADN consenso que se denominó Phoenix, utilizando los provirus K108 y K109 relacionados (que se habían clonado previamente a partir de una biblioteca de BAC comercial de ser humano) como estructura principal, y un kit comercial para introducir mutaciones de nucleótidos únicos en cada posición requerida para coincidir con el consenso. Puesto que las LTR de HERV-K(HML2) no son funcionales en todas las líneas celulares (22, 23), también se reemplazó la parte U3 de la LTR en 5’ por el promotor de CMV, colocando su sitio de inicio para conservar la secuencia de nucleótidos esperada en el transcrito retroviral nativo. También se introdujo un sitio de clonación en el sentido de 3’ del gen env en la región U3 no codificante de la LTR en 3’, para marcar posiblemente (con el gen neo) el transcrito retroviral sin alterar su capacidad codificante.

C Phoenix codifica para partículas retrovirales auténticas

En un primer ensayo, se introdujo el vector de expresión Phoenix en células 293T humanas, y se buscaron partículas retrovirales mediante microscopía electrónica de transmisión. Tal como se ilustra en las figuras 16A y 16B, esto dio como resultado la síntesis de partículas que salen por gemación de la membrana plasmática (no observadas con un vector control), con una morfología de tipo C. Pudieron observarse dos clases de partículas, o bien con un interior hueco rodeado por un anillo denso de tinción correspondiente a partículas inmaduras, o bien con un núcleo hexagonal condensado correspondiente lo más probablemente a la forma madura del virus (figura 16C), en la que las poliproteínas se escinden para dar los productos finales. De manera sistemática, un provirus con una mutación introducida en el sitio activo de la proteasa (Pro) también produce partículas, pero todas ellas dan a conocer una morfología inmadura (no mostrado). En todos los casos, las partículas están rodeadas por espículas prominentes (figura 16D) que pueden marcarse en experimentos de microscopía inmunoelectrónica con un anticuerpo dirigido contra la subunidad SU de la proteína de la envuelta de HERV-K(HML2) (figura 16E). Conjuntamente, estas características sugieren que Phoenix puede dirigir la síntesis de partículas retrovirales completas.

Como confirmación, se realizaron análisis de inmunotransferencia de las células 293T transfectadas con el vector proviral. Tal como se ilustra en la figura 17A, Phoenix (así como su promutante) promueve la síntesis de un precursor de Gag de aproximadamente 80 kDa en los lisados celulares, así como algunos productos escindidos (no observados con el promutante). También pudieron observarse productos de escisión en el sobrenadante de las células transfectadas, excepto por el promutante que sólo expresa el precursor de Gag. De manera similar, utilizando un anticuerpo dirigido contra el componente SU de la proteína de la envuelta de HERV-K(HML2), se detectó en los sobrenadantes una proteína de un tamaño (55 kDa) consecuente con el de la subunidad SU procesada, pero no se pudo detectar la proteína Env en los lisados celulares, lo más probablemente debido a un nivel de expresión demasiado bajo. No obstante, pudo observarse la expresión de la proteína de la envuelta mediante análisis de inmunofluorescencia utilizando células HeLa y 293T transfectadas de manera transitoria con Phoenix (figura 17B). En estas células, puede observarse además que Gag y Env se localizan conjuntamente en algunos dominios subcelulares comunes, incluyendo, tal como se esperaba, la membrana plasmática.

D Phoenix es un retrovirus infeccioso

Para profundizar en la funcionalidad de este virus ancestral, se buscó entonces una actividad transcriptasa inversa en el sobrenadante de las células transfectadas. Utilizando el ensayo de transcriptasa inversa potenciada por producto (PERT) sensible descrito anteriormente (24), pudo detectarse de hecho una actividad RT en el sobrenadante de células infectadas con Phoenix, no observada con un provirus en el que se había introducido una mutación dentro del sitio catalítico del dominio RT (figura 17C). Para estudiar adicionalmente el potencial de infectividad de partículas derivadas de Phoenix, se infectó entonces un panel de líneas celulares de mamífero con el sobrenadante de células 293T transfectadas con un provirus Phoenix marcado con neo, y se sometieron a selección con G418. Se obtuvieron clones de G418R para varias células diana, incluyendo células BHK21 de hámster, células G355.5 de felino y, de manera destacable, las células humanas SH-SY5Y y 293, lo que indica que Phoenix es completamente funcional e infeccioso (figura 18A). En el mismo ensayo, las células humanas HeLa y las células murinas WOP parecían ser resistentes a la infección, lo más probablemente debido a la ausencia del receptor apropiado para la proteína Env en la superficie celular. Se garantizó entonces que los clones de G418R que se obtenían eran el resultado de infección auténtica. Su aparición depende realmente de la presencia de genes gag, pro, pol y env intactos, puesto que la inactivación de cualquiera de las proteínas codificadas produce las partículas derivadas de provirus no infecciosas (figura 18A y datos no mostrados). Incluso para las líneas celulares permisivas para la infección, el título aparente de Phoenix es bastante bajo. Un ensayo cuantitativo mediante PCR en tiempo real en el ADN genómico de células BHK21 infectadas con partículas generadas por Phoenix, marcadas o no mediante el gen neo, indicó que la presencia de neo dentro del provirus, es, al menos en parte, responsable de este bajo título. Otra posible explicación es que la infección con Phoenix se produce más eficazmente a través de interacción célula-célula, tal como se observa para VLTH y en algunos casos para VIH, lo que concuerda con algunas imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica en las que las partículas que salen por gemación parecen capturarse directamente por una célula receptora (figura 18B).

Entonces, se caracterizaron adicionalmente los clones de G418R que se aislaron, y se determinaron los sitios de inserción del provirus utilizando una estrategia de PCR inversa. En todos los casos, se encontraron LTR completas y duplicaciones de sitio diana (TSD) de 5/6 pb bordeando los provirus recién insertados en las células SH-SY5Y humanas (figura 19), confirmando así que el proceso de infección es canónico, y consecuente con las estructuras observadas para las copias endógenas de HERV-K(HML2) en el genoma humano.

E Amplificación del provirus de HERV-K (HML2) a través de reinfección

A continuación, para profundizar en el posible mecanismo fisiológico responsable de la amplificación de la familia de HERV-K(HML2) de retrovirus endógenos, se analizó la eficacia relativa de retrotransposición intracelular frente a reinfección por Phoenix. Para hacer esto, se marcó Phoenix con un gen indicador neo específico (neoTNF) en el que neo se activa sólo una vez que el elemento marcado se ha transcrito, se ha sometido a transcripción inversa y se ha integrado. El elemento marcado se introdujo mediante transfección en diversas líneas celulares, permisivas (o no) de infección. En estas condiciones, se obtuvieron de manera reproductiva clones de G418R sólo con las líneas celulares permisivas de infección (es decir, las células G355.5 de felino, las células BHK21 de hámster y las células SH-SY5Y humanas; figura 20 y datos no mostrados). Esto sugiere que el proceso de amplificación debe, en algún estadio, implicar al receptor de la proteína de la envuelta, y por tanto debe producirse a través de un proceso de reinfección extracelular. Para confirmar esta hipótesis, se realizó el mismo experimento que anteriormente, pero con un provirus defectuoso para el gen env, utilizando células permisivas SH-SY5Y. En estas condiciones, no se observó amplificación del provirus mutante marcado. Como control, la adición de un vector de expresión para la proteína de la envuelta restableció (al menos parcialmente) la movilidad del provirus defectuoso en env (figura 20). Conjuntamente, los resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que la amplificación de HERV-K(HML2) en el genoma humano tenía lugar a través de un proceso de reinfección (posiblemente en la línea germinal del embrión en desarrollo), un proceso consecuente tanto con los datos evolutivos que indican que el gen env de HERV-K(HML2) se ha sometido a la misma selección de purificación que los otros genes retrovirales durante la amplificación de esta familia (25), y con la presencia de partículas retrovirales en placenta humana y en tumores de línea germinal, morfológicamente idénticas a las producidas por Phoenix (13, 14, 17-19).

F La “recombinación” de locus de HERV-K (HML2) endógenos humanos puede generar un retrovirus infeccioso

Finalmente, aprovechando el conocimiento actual sobre el “ancestro” de la familia de HERV-K(HML2), se lanzó la pregunta de si un “genoma humano promedio” todavía podría generar partículas retrovirales completamente infecciosas. Con los provirus que se utilizaron para ensamblar la secuencia consenso, se construyó un conjunto de elementos quiméricos que podían surgir espontáneamente a través de recombinación entre alelos humanos definidos, y podían expresar todos los genes retrovirales. Tal como se describe en Materiales y métodos de apoyo, “se pidió prestada” la parte en 5’ del elemento HERV-K109, y el extremo 3’ de K108, K113 o K115 (figura 21). Se sometieron a ensayo estos tres provirus para determinar la actividad RT asociada a viriones en el sobrenadante de células 293T humanas tras su transfección transitoria y, sorprendentemente, se encontró que la quimera K109/K115 era positiva (figuras 17C y 21). Sin embargo, este constructo no es infeccioso por sí mismo, lo más probablemente debido a los defectos en el gen env de HERVK115 (que no es infeccioso en experimentos de pseudotipo, en discrepancia con el gen env de K108, referencia 26). Por tanto, se generó una “triple quimera” reemplazando la región env en el constructo anterior por la de K108, y se sometió a ensayo para determinar la infección. Con este elemento, pudo detectarse la integración específica del provirus en las células BHK21 mediante PCR cuantitativa (no observada con Phoenix mutado en el dominio de RT, utilizado como control), a un nivel de sólo 5-10 veces inferior al observado con Phoenix (figura 21). Esto indica que, tal como se observó en ratones AKR en los que un proceso de recombinación de múltiples etapas genera de manera reproductiva nuevos retrovirus infecciosos (27, 28), algunos individuos podían reconstituir provirus de HERV-K (HML2) funcionales, o bien a través de un acontecimiento de recombinación de tres fragmentos, o bien más probablemente a través de un único acontecimiento de recombinación entre 2 copias de HERV-K (por ejemplo K109 y K115) con complementación en trans mediante una proteína de la envuelta intacta (por ejemplo K108). De hecho, se han producido acontecimientos de recombinación frecuentemente entre provirus de HERV-K(HML2) (29). De este modo, o incluso utilizando alelos funcionales (pero todavía sin caracterizar) que podrían estar presentes en algunos individuos, la familia de HERV-K(HML2) podía repetir su ciclo vital, y generar elementos funcionales que podrían ser, a su vez, los iniciadores de acontecimientos de amplificación venideros.

La presente investigación, con la reconstrucción de un provirus de HERV-K(HML2) funcional que se demuestra que es un retrovirus infeccioso auténtico i) proporciona un escenario molecular que puede explicar la amplificación observada de estos elementos en genomas de primate, ii) da acceso de facto a un retrovirus activo “ancestral” de primates, gracias al hecho de que los HERV se han “congelado” en cierto modo mediante su “endogenización”, lo que transformó su estado viral en el de un locus genómico del huésped (reduciendo así drásticamente su tasa evolutiva), y iii) proporciona un elemento viral activo para evaluar el papel de tales elementos en una serie de patologías humanas (tales como tumores de línea germinal y melanoma), en las que se activan transcripcionalmente.

Los retrovirus endógenos humanos son las trazas genómicas de infecciones de ancestros de primates por retrovirus auténticos que se han “endogenizado” y transmitido de manera mendeliana. Entre las numerosas familias de copias provirales presentes en primates, la familia de HERV-K(HML2) es una de las amplificadas más recientemente, con pruebas de polimorfismo de inserciones de provirus entre seres humanos. Sin embargo, ninguna de las copias provirales conocidas en la actualidad puede generar un retrovirus funcional. Para identificar el retrovirus “progenitor” ancestral, se derivó un elemento consenso in silico, y luego se construyó. En la presente memoria se muestra que el provirus resultante produce un retrovirus genuino, que da lugar a partículas virales de tipo C con actividad transcriptasa inversa e infecciosas para varias células diana humanas y no humanas. Este retrovirus ancestral genera copias integradas en las células infectadas con la firma observada para las múltiples copias de HERV-K actualmente presentes en el genoma humano, consecuente con rondas de reinfecciones en el transcurso de la evolución de primates. Además, se demuestra que la distancia entre el consenso y estas múltiples copias es suficientemente pequeña para una recombinación in vitro entre elementos endógenos clonados para generar un provirus que también demuestra ser infeccioso. Conjuntamente, los presentes resultados conducen a la idea de que las células humanas todavía presentan potencial para producir retrovirus, y proporcionan además un clon molecular (Phoenix) para recapitular los acontecimientos genéticos que han conducido a su amplificación en el transcurso de la evolución de primates, y para evaluar su posible papel en patologías humanas (tales como tumores de línea germinal y melanoma) en las que algunos de estos elementos son transcripcionalmente activos.

Referencias para el ejemplo 4

1.: Benit et al. (2001) J Virol 75, 11709-19.

2.: de Parseval et al. (2003) J. Virol. 77, 10414-10422.

3.: Villesen et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5177-5184.

5.: Bannert et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 13, 14572-14579.

6.: Steinhuber et al. (1995) Hum Genet 96, 188-92.

7.: Medstrand et al., (1998) J. Virol. 72, 9782-9787.

8.: Barbulescu et al. J. (1999) Curr. Biol. 9, 861-868.

9.: Turner et al., J. (2001) Curr. Biol. 11, 1531-1535.

10.: Hughes et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101, 1668-1672.

11.: Belshaw et al. (2005) J Virol 79, 12507-14.

12.: Bieda, K et al. (2001) J. Gen. Virol. 82, 591-596.

13.: Boller et al. (1993) Virology 196, 349-353.

14.: Löwer et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4480-4484.

15.: Muster et al. (2003) Cancer Res. 63, 8735-8741.

16.: Buscher et al. (2005) Cancer Res 65, 4172-80.

17.: Kalter et al. (1973) J. Natl. Cancer Inst. 50, 1081-1084.

18.: Dirksen et al. (1977) J. Nat. Cancer Inst. 59, 1187-1192.

19.: Wilkinson et al. (1994) en The retroviridae, ed. Levy, J. A. (Plenum Press, Nueva York), vol. 3, págs. 465-535.

5 20. Mayer et al. (1999) Nat. Genet. 21, 257-258.

21.: Reus et al. (2001) Genomics 72, 314-320.

22.: Ruda et al. (2004) Virus Res 104, 11-6.

23.: Lavie et al. (2005) J. Virol. 79, 876-83.

24. Pyra et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91, 1544-8. 10 25. Belshaw et al. (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 25, 25.

26.: Dewannieux et al. (2005) J Virol 79, 15573-15577.

27.: Stoye et al. (1991) J. Virol. 65, 1273-85.

28.: Boeke et al. (1997) en Retroviruses, eds. Coffin, J. M., Hughes, S. H. & Varmus, H. E. (Cold Spring Harbor

Laboratory Press, págs. 343-435. 15 29. Hughes et al. (2005) Genetics 12, 12.

30. Dewannieux et al. (2003) Nat. Genet. 35, 41-48. 31. Esnault et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30, e49.

Listado de secuencias

20 <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS) UNIVERSITE PARIS SUD INSTITUT GUSTAVE-ROUSSY Marianne MANGENEY Martial RENARD

25 Thierry HEIDMANN Julien POTHLICHET Marie DEWANNIEUX

<120> Retrovirus endógeno y proteínas codificadas por el gen env como diana para el tratamiento del cáncer

30 <130> D24324

<150> Documento US 60/666.178

<151>

<160> 9

<170> PatentIn versión 3.3

40 <210> 1

<211> 5035

<212> ADN

<213> secuencia artificial

45 <220>

<223> secuencia nucleica del plásmido phCMV-Np9

<400> 1

<210> 2

<211> 225

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> secuencia nucleica que codifica para Np9 de HERV-K (HML-2.HOM) Np9

<400> 2

<210> 3

<211> 74

<212> PRT

<213> secuencia artificial 10

<220>

<223> secuencia de aminoácidos de Np9 de HERV-K (HML-2.HOM)

<210> 4

<211> 9472

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia nucleica consenso del provirus Phoenix

25 <400> 4

<210> 5

<213> secuencia artificial

<220>

<223> proteína Gag codificada por la secuencia nucleica consenso del provirus Phoenix 10

<400> 5

<210> 6

<211> 334 5 <212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223>: Proteína Pro codificada por la secuencia nucleica consenso del provirus Phoenix 10

<400> 6

<210> 7

<213> secuencia artificial

<220>

<223>: Proteína Pol codificada por la secuencia nucleica consenso del provirus Phoenix 10

<400> 7

<210> 8 <211> 699

<212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Proteína Env codificada por la secuencia nucleica consenso del provirus Phoenix

<400> 8

<210> 9

<211> 105 5 <212> PRT

<213> secuencia artificial

<220>

<223> proteína Rec codificada por la secuencia nucleica consenso del provirus Phoenix 10

<400> 9

Claims

REIVINDICACIONES

1. Utilización de una composición que comprende:

-

una proteína inmunosupresora codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, mutada o no, o un fragmento de la misma que comprende un dominio inmunosupresor de dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o

-

un ácido nucleico que codifica dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o fragmento de dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno, o

-

un ligando tal como anticuerpos, pudiendo dicho ligando unirse específicamente a dicha proteína inmunosupresora codificada por el gen env, o

-

un ARN bicatenario, ARNip, ARNc, miARN o un ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico del retrovirus endógeno y/o de una proteína expresada por dicho retrovirus endógeno,

en la que dicho retrovirus endógeno es un retrovirus endógeno humano HERV-K

dicha composición

a.

inhibiendo la expresión de dicho retrovirus endógeno y/o

b.

inhibiendo la expresión, y/o disminuyendo la concentración, y/o inhibiendo la actividad de dicha proteína expresada, y/o

c.

estimulando una respuesta inmunitaria contra dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno

para la preparación de un fármaco destinado a la prevención y/o el tratamiento del cáncer en un mamífero, en la que las células cancerosas de dicho mamífero expresan dicha proteína codificada por el gen env de un retrovirus endógeno.
2.

Utilización según la reivindicación 1, en la que HERV-K es un subtipo de HERV-K caracterizado porque el marco de lectura abierto que codifica la proteína viral ENV codifica una proteína Np9.
3.

Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que HERV-K es un subtipo de HERV-K caracterizado porque dicho subtipo de HERV-K se selecciona del grupo constituido por el subtipo de HERV-K HERV-K1 01, HERV-K1 02, HERV-K1 07 y HERV-K(II).
4.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que HERV-K es un subtipo de HERV-K caracterizado porque el marco de lectura abierto codifica una proteína Np9 que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por:

a.

la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3 o de una proteína Np9 de un subtipo de HERV-K tal como se representa en Genbank (GenPept) con el número de registro, P61580, P61581, P61582 y P61583; y

b.

una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 75% con una secuencia de aminoácidos de a) y que presenta una actividad inmunosupresora.
5.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la expresión de dicho retrovirus endógeno y/o de dicha proteína inmunosupresora de retrovirus endógeno se inhibe mediante un ARN bicatenario, un ARNip, un ARNc, un miARN o un ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico de dicho retrovirus endógeno y/o de dicha proteína inmunosupresora de retrovirus endógeno.
6.

Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicha proteína es:

a.

dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora, o un fragmento de la misma, que comprende su dominio inmunosupresor, o

b.

una forma mutada de dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora que carece de actividad inmunosupresora, o fragmentos de la misma que comprenden un dominio inmunosupresor mutado de dicha proteína de retrovirus endógeno inmunosupresora.
7. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicha forma mutada de una proteína inmunosupresora codificada por el gen env de HERV-K privada de actividad inmunosupresora puede generar una respuesta inmunitaria, respuesta inmunitaria celular y/o humoral

-

contra células que expresan la forma no mutada de dicha proteína codificada por el gen env de HERV (respuesta inmunitaria celular) o

-

contra la forma no mutada de dicha proteína codificada por el gen env de HERV (respuesta inmunitaria humoral).
8.

Utilización según la reivindicación 1, en la que dicho ligando, tal como anticuerpo, puede unirse específicamente a dicha proteína inmunosupresora codificada por el gen env de un retrovirus endógeno.
9.

Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho ligando es un anticuerpo, en particular anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, tal como fragmentos Fab o F(ab)’2, polipéptidos de scFv, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, aptámeros o péptidos de unión.
10.

Composición farmacéutica que comprende como principio activo un ARN bicatenario, ARNip, ARNc, miARN o un ácido nucleico antisentido que selecciona como diana secuencias de ácido nucleico de un retrovirus endógeno y/o de una proteína inmunosupresora expresada por un retrovirus endógeno, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, siendo dicho retrovirus endógeno un retrovirus endógeno humano HERV-K.
11.

Composición farmacéutica según la reivindicación 10, en la que la proteína es una proteína inmunosupresora codificada por el gen env de HERV, tal como la proteína ENV o una proteína Np9.
12.

Composición farmacéutica que comprende como principio activo una proteína inmunosupresora expresada por un retrovirus endógeno, o un fragmento de la misma, siendo dicho retrovirus endógeno un retrovirus endógeno humano HERV-K.
13.

Composición farmacéutica según la reivindicación 12, que comprende como principio activo una proteína inmunosupresora de una proteína codificada por el gen env de HERV-K, mutada o no, o un fragmento de la misma que comprende el dominio inmunosupresor de dicha proteína codificada por el gen env de HERV-K, o ácido nucleico que codifica dicho principio activo, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14.

Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que el retrovirus endógeno es un subtipo de HERV-K caracterizado porque el marco de lectura abierto que codifica la proteína viral env codifica una proteína Np9.
15.

Composición farmacéutica según la reivindicación 13 ó 14, en la que HERV-K es un subtipo de HERV-K seleccionado del grupo constituido por el subtipo de HERV-K HERV-K101, HERV-K1 02, HERV-K1 07 y HERV-K(II).
16.

Composición farmacéutica según la reivindicación 15, en la que HERV-K es un subtipo de HERV-K, caracterizado porque el marco de lectura abierto que codifica la proteína viral env codifica para una proteína Np9 que presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por

a.

la secuencia de aminoácidos SEC ID NO: 3 o de una proteína Np9 de un subtipo de HERV-K tal como se representa en Genbank (GenPept) con el número de registro, P61580, P61581, P61582 y P61583; y

b.

una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos el 75% con una secuencia de aminoácidos de a) y que presenta una actividad inmunosupresora.
17.

Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizada porque dicha composición comprende además como principio activo otra proteína de HERV codificada por la secuencia nucleica de dicho provirus de HERV, o un ácido nucleico que codifica dicha otra proteína de HERV.
18.

Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizada porque dicha composición comprende además como principio activo al menos una proteína, preferiblemente al menos dos, tres o todas las proteína codificadas por la secuencia nucleica del provirus HERV-K(HML2) consenso (“Phoenix”), presentando dicha secuencia nucleica del provirus HERV-K(HML2) consenso la secuencia SEC ID NO: 4, o un ácido nucleico que codifica dicha al menos una proteína.