ES2378685A1 - Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico. - Google Patents
Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico. Download PDFInfo
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Abstract
Método y sistema de
retro-iluminación y análisis digital de imagen para
la valoración de placas de ensayo colorimétrico.
Método de valoración de pruebas diagnósticas
colorimétricas consistente en tomar una fotografía digital de una
placa y aplicar al fichero obtenido un programa informático que
analiza y cuantifica las componentes de color de los píxeles
correspondiente a cada uno de los pozuelos de la placa. El tipo de
tinte determina las componentes de color adecuadas para cada caso.
El programa requiere del usuario la ubicación de las referencias
positivas y negativas, calcula la localización de los pozuelos con o
sin intervención del usuario, y determina los parámetros de análisis
colorimétrico en función del tipo de tinte con o sin intervención
del usuario.
Sistema de iluminación para tornar la fotografía
digital por retro-iluminación con una lámina
electroluminiscente.
Description
Método y sistema de
retro-iluminación y análisis digital de imagen para
la valoración de placas de ensayo colorimétrico.
La presente invención se refiere a un método y a
un sistema para la valoración de placas de ensayo colorimétrico
mediante técnicas de análisis digital de imágenes. La invención se
encuadra dentro de los métodos y sistemas de análisis de imagen
digital para la realización de diagnósticos clínicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tests colorimétricos permiten determinar la
concentración de una solución de cierta sustancia a partir de la
intensidad del color resultante de una reacción. Este principio se
emplea en diagnóstico inmunológico, genético, pruebas de
paternidad, medicina forense, detección de alergenos alimentarios, y
en supervisión del medio ambiente. La herramienta de diagnóstico
inmunológico denominada "ensayo enzimático inmunoespecífico"
(ELISA) es probablemente el test colorimétrico más usado. Es
específica para la detección de sustancias de naturaleza proteica, y
evalúa la compatibilidad antígeno-anticuerpo en la
que uno de los reaccionantes está ligado a una enzima (peroxidasa de
rábano picante ó HRP) capaz de modificar el color de un tinte. Este
tipo de pruebas constituyen desde su introducción en 1987 una
herramienta fundamental en inmunología clínica para la detección de
microorganismos o de anticuerpos en fluidos corporales y se emplean
en las campañas de erradicación de enfermedades. Se fundamentan en
la elevada especificidad de la reacción
antígeno-anticuerpo, y no precisan sustancias
tóxicas ni radioactivas, siendo el resultado un cambio de color en
los reactivos. La posibilidad de conocer de forma casi inmediata el
resultado de un ensayo colorimétrico permite al clínico determinar
el grado de exposición al agente patógeno y así poder tomar
decisiones sobre tratamientos o medidas de policía sanitaria, sin
exponer a otros sujetos susceptibles.
La reacción, y por tanto la intensidad del color
resultante, son proporcionales a la concentración del producto a
detectar en la muestra. Se determina por fotometría, midiendo la
absorbancia a una longitud de onda específica para el tinte
empleado, que suele ser 450 nm por tratarse de tetrametil benzidina
(TMB) en medio ácido, ó 650 nm en medio alcalino. Se emplea también
sulfonato de azino bietil benzotiazolina (ABTS), con absorbancia
máxima a 405 nm, que corresponde al color verde. En el pasado se ha
usado diaminobenzeno (OPD), con un pico de absorción a 490 nm, pero
se ha abandonado su uso por ser cancerígeno.
Las pruebas de ensayo colorimétrico se realizan
habitualmente en placas de 8 cm x 12 cm de poliestireno con una
matriz de 8 x 12 pozuelos de 1 cm de profundidad y 0.7 cm de
diámetro, aunque también existen en el mercado placas con pozuelos
de menor tamaño dispuestos en una matriz de 384 (16 x 24) ó de 1536
(32 x 48). En el caso de las pruebas ELISA, los pozuelos están
recubiertos interiormente con sustancias inmunológicamente activas y
se llenan con una muestra fluida de analito, se aclaran y se
vuelven a rellenar con un reactivo antes de leer el resultado del
test. Existen varios tipos de prueba ELISA, en función del tipo de
recubrimiento del pozuelo y del reactivo empleado:
- ELISA indirecto, para determinar
concentraciones de anticuerpos, pozuelos recubiertos con antígeno, y
reactivo con anticuerpo conjugado a enzima y específicamente afín
para el anticuerpo sérico a detectar.
- ELISA sándwich, para detectar proteínas,
pozuelos recubiertos con un anticuerpo específico para la proteína,
y reactivo con anticuerpos conjugados a enzima específicos para el
antígeno.
- ELISA competitivo, para determinar
concentraciones de anticuerpos, se recubre el pozuelo con antígeno,
el analito se incuba con antígeno, el reactivo contiene un
anticuerpo específico para el anticuerpo sérico y está conjugado a
la enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incluyen en cada placa pozuelos con muestras
positivas y negativas de control como referencia. Estas pruebas se
desarrollaron originalmente con el objetivo de ser evaluados de
forma subjetiva por el operario, pero tal práctica se ha abandonado
por presentar una elevada dependencia ambiental (del grado de
entrenamiento y de la iluminación) así como muy baja precisión y
falta de repetibilidad. Actualmente se emplean espectrofotómetros
para medir la intensidad de la luz a una determinada longitud de
onda. Pese a que las pruebas colorimétricas están basadas en
elementos (reactivos y placas) de bajo coste, los espectrofotómetros
que se emplean para determinar la absorbancia suelen estar entre los
equipos más costosos del laboratorio de análisis. Son demasiado
voluminosos para ser transportados con facilidad, y no suelen
ofrecer la posibilidad de documentar las lecturas realizadas.
El dispositivo "micro ELISA reader",
recogido en la patente US2004087010, aborda alguna de las
limitaciones citadas para el sistema clásico de lectura de placas
ELISA y puede mejorar la productividad del método, pero presenta
notables inconvenientes. Al estar basado en la exploración
secuencial de los pozuelos, dicho dispositivo solo acepta un
determinado tipo de placas. Por el contrario, la presente propuesta
realiza una lectura simultánea de todos lo pozuelos, para cualquier
número de pozuelos, lo que evita interferencias temporales y explota
adecuadamente la resolución gráfica alcanzable con cámaras de imagen
digital muy ubicuas y asequibles, en un dispositivo sencillo, libre
de mecanismos y de transporte sencillo. El "micro ELISA
reader" recurre a dispositivos mecánicos que requieren
protección contra la entrada de partículas, siendo susceptible de
sufrir los problemas asociados a la presencia de partes móviles así
como un deterioro progresivo. Se trata de un dispositivo empotrado
en un ordenador personal por lo que no se presta al uso en
condiciones de campo, sin facilitar especialmente la transmisión de
datos dada la gran variedad de medios -incluidos los inalámbricos-
de que se dispone actualmente para ello. Por último, la presencia de
reactivos líquidos que pueden verterse con facilidad impide su
empleo en condiciones de baja estabilidad, con el operador de pie ó
a bordo de un vehículo.
\vskip1.000000\baselineskip
David S. Hage, "Immunoassays",
Anal. Chem., 71 (1999) 294R-304R.
Tsai Chung-Hua, "Micro
ELISA reader", patente: US2004087010 publicada el
2004-05-06.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención tiene como objeto evaluar
placas de ensayo colorimétrico mediante un sistema de
retro-iluminación y análisis digital de imagen.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se describirán ejemplos del
método y sistema, y el aspecto del aparato inventado, con
referencias a las siguientes figuras:
Figura 1: Muestra la planta del sistema con
cortes sucesivos. 1- Dispositivo emisor de luz. 2- Placa. 3-
Elemento difusor. 4- Guía del borde da la placa. 5- Pozuelos. 6-
Soporte.
Figura 2: Muestra un corte transversal del
iluminador con un filtro difusor opcional. 1- Dispositivo emisor de
luz. 3- Elemento difusor. 5- Pozuelos. 7- Sustancia coloreada.
Figura 3: Muestra la configuración espacial de
los elementos iluminadores y las dimensiones globales. Dimensiones
en mm. (1) Iluminadores. (2) Soporte.
Figura 4: Indica el esquema eléctrico del
sistema de retro-iluminación basado en lámina EL con
inversor y elemento de control. 1- Dispositivo emisor de luz. 7-
Inversor. 8- Control del inversor.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de valoración de las pruebas
diagnósticas colorimétricas consiste en tomar una fotografía digital
de una placa y aplicar al fichero obtenido un programa informático
que analiza y cuantifica las componentes de color de los pixeles
correspondiente a cada uno de los pozuelos de la placa. El programa
requiere del usuario la ubicación de las referencias positivas y
negativas, calcula la localización de los pozuelos con o sin
intervención del usuario, y determina los parámetros de análisis
colorimétrico en función del tipo de tinte con o sin intervención
del usuario. El tipo de tinte determina la componente de color
adecuada para cada caso, que corresponde a la componente azul del
formato de pixel RGB en el caso de tintes con absorbancia máxima a
450 nm, y a la componente roja en el caso de tintes de absorbancia
máxima a 650 nm, o combinaciones lineales de los canales. A
continuación se determina la media censurada de componente del color
en los pixeles correspondientes a cada uno de los pozos. El
resultado se expresa en una escala porcentual en los dos formatos
habituales: en forma de relación M/N como el cociente entre el valor
medio de la componente de color de cada pozo y el valor medio en los
pozos de referencia negativa, y en formato IRPC como el cociente de
la diferencia entre el valor de la muestra y el de las referencias
negativas, y la diferencia entre las referencias negativas y las
positivas. Se generan también parámetros estadísticos de dispersión
y de separación de referencias para indicar la fiabilidad del
resultado.
El sistema de iluminación que se emplee para
tomar la fotografía digital se separa del sistema de análisis y
cuantificación. Se emplea retro-iluminación, más
adecuado para la aplicación ya que elimina reflejos y sombras
propios de la iluminación directa, y facilita el proceso de análisis
y cuantificación de los niveles de luz. Por otra parte, el sistema
no requiere controlar la influencia del tipo de luz empleado sobre
su temperatura de color -como ocurre cuando la iluminación es
directa- y sus características de uniformidad sobre la placa. Es
necesario reducir las distorsiones de la información que se pretende
conseguir: el color del contenido de los pozuelos. Esta distorsión
de la información está causada por la presencia de errores de
paralaje en la fotografía y por la presencia de brillos y reflejos
en paredes y fondo del material plástico con que están construidos
los pozuelos. Para ello el sistema utiliza un elemento difusor de
luz opcional se situará, si la iluminación ambiental produce
reflejos, por encima de los pozuelos, tal y como se indica en el
corte vertical que se muestra en la Figura 2. El dispositivo de
emisión de luz (1) está situado en la parte inferior, y sobre él se
sitúa la placa (2) que es objeto de análisis. La luz atraviesa cada
uno de los pozuelos transparentes (5) que contienen la sustancia
coloreada (7) y el elemento difusor opcional (5). En la Figura 1 se
muestra la planta del sistema con cortes sucesivos en la que se
observa: el dispositivo emisor de luz (1), la placa (2) y el
contorno de los pozuelos (5), el elemento difusor opcional (3), y el
soporte (6) con unas marcas guía opcionales para el borde de la
placa (4).
El sistema de generación de luz se realiza de
forma que la luz producida contenga la o las longitudes de onda
objeto de análisis. La implementación recurre al empleo de láminas o
hilos electro luminiscentes (EL) para generar la luz necesaria para
el iluminador, siendo preferible el empleo de láminas por
simplificar notablemente el montaje del conjunto y eliminar la
restricción a una determinada disposición de la matriz de pozos. Las
láminas EL tienen un bajo espesor y son capaces de producir luz
blanca o coloreada en un área suficiente como para cubrir toda la
extensión de la placa. Las láminas EL se alimentan mediante una
tensión alterna algo superior a los 100 V y a una frecuencia de
algunos cientos de hertzios por lo que el sistema de
retro-iluminación tendrá un esquema eléctrico como
el que se muestra en la Figura 4 que incluye el inversor (7) que
recibe en su entrada una tensión continua y produce la tensión
alterna suficiente como para alimentar la lámina EL (1) desde una
batería o desde una fuente de alimentación. El sistema se completa
con el control del inversor (8) que permite activarlo para encender
la lámina EL, e incluye elementos de temporización y de protección
frente a polaridades inversas.
Claims (4)
1. Sistema de retro-iluminación
para fotografiar placas de ensayo colorimétrico constituido por una
lámina electroluminiscente de tamaño suficiente como para cubrir
toda la extensión de los pozuelos, y caracterizado por situar
la placa de ensayo colorimétrico sobre la lámina
electroluminiscente.
2. Sistema de retro-iluminación
para fotografiar placas de ensayo colorimétrico, según la
reivindicación 1, caracterizado por disponer en el difusor
de unas marcas guía para el borde de la placa de ensayo
colorimétrico.
3. Sistema de retro-iluminación
para fotografiar placas de ensayo colorimétrico, según la
reivindicación 1 y 2, caracterizado por situar un elemento
difusor de luz inmediatamente encima de la placa de ensayo
colorimétrico.
4. Método para la valoración de placas de ensayo
colorimétrico que, utilizando el sistema de retroiluminación
descrito en las reivindicaciones 1, 2 y 3, comprende las siguientes
etapas:
- a)
- obtención de una fotografía digital de la placa;
- b)
- aplicación de un programa informático al fichero correspondiente a la fotografía obtenida, que:
- c)
- localiza los pozuelos (con o sin intervención del usuario),
- d)
- cuantifica el color del contenido de cada pozuelo mediante el análisis de la distribución de las componentes de color de los pixeles correspondientes a cada pozuelo;
- e)
- identifica referencias positivas y negativas mediante la intervención del usuario;
- f)
- determina los parámetros de análisis colorimétrico en función del tipo de tinte y su absorbancia máxima (con o sin intervención usuario);
- g)
- expresa el resultado de forma numérica, en los formatos habituales, con indicación de la fiabilidad del resultado, y generando un informe y una imagen de la placa analizada con el resultado sobreimpuesto sobre cada pozuelo.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2378685 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20130222 |