ES2378685B1

ES2378685B1 - Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico.

Info

Publication number: ES2378685B1
Application number: ES201000164A
Authority: ES
Inventors: Jesús BARO DE LA FUENTE
Original assignee: Universidad de Valladolid
Current assignee: Universidad de Valladolid
Priority date: 2010-02-05
Filing date: 2010-02-05
Publication date: 2013-02-22
Anticipated expiration: 2030-02-05
Also published as: ES2378685A1

Abstract

Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico.#Método de valoración de pruebas diagnósticas colorimétricas consistente en tomar una fotografía digital de una placa y aplicar al fichero obtenido un programa informático que analiza y cuantifica las componentes de color de los píxeles correspondiente a cada uno de los pozuelos de la placa. El·tipo de tinte determina las componentes de color adecuadas para cada caso. El programa requiere del usuario la ubicación de las referencias positivas y negativas, calcula la localización de los pozuelos con o sin intervención del usuario, y determina los parámetros de análisis colorimétrico en función del tipo de tinte con o sin intervención del·usuario.#Sistema de iluminación para tornar la fotografía digital por retro-iluminación con una lámina electroluminiscente.

Description

Método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico.

Campo de la invención

La presente invención se reﬁere a un métodoyaun sistema para la valoración de placas de ensayo colorimétrico mediante técnicas de análisis digital de imágenes. La invención se encuadra dentro de los métodos y sistemas de análisis de imagen digital para la realización de diagnósticos clínicos.

Estado de la técnica

Los tests colorimétricos permiten determinar la concentración de una solución de cierta sustancia a partir de la intensidad del color resultante de una reacción. Este principio se emplea en diagnóstico inmunológico, genético, pruebas de paternidad, medicina forense, detección de alergenos alimentarios, y en supervisión del medio ambiente. La herramienta de diagnóstico inmunológico denominada “ensayo enzimático inmunoespecíﬁco” (ELISA) es probablemente el test colorimétrico más usado. Es especíﬁca para la detección de sustancias de naturaleza proteica, y evalúa la compatibilidad antígeno-anticuerpo en la que uno de los reaccionantes está ligado a una enzima (peroxidasa de rábano picante ó HRP) capaz de modiﬁcar el color de un tinte. Este tipo de pruebas constituyen desde su introducción en 1987 una herramienta fundamental en inmunología clínica para la detección de microorganismos o de anticuerpos en ﬂuidos corporales y se emplean en las campañas de erradicación de enfermedades. Se fundamentan en la elevada especiﬁcidad de la reacción antígeno-anticuerpo, y no precisan sustancias tóxicas ni radioactivas, siendo el resultado un cambio de color en los reactivos. La posibilidad de conocer de forma casi inmediata el resultado de un ensayo colorimétrico permite al clínico determinar el grado de exposición al agente patógeno y así poder tomar decisiones sobre tratamientos o medidas de policía sanitaria, sin exponer a otros sujetos susceptibles.

La reacción, y por tanto la intensidad del color resultante, son proporcionales a la concentración del producto a detectar en la muestra. Se determina por fotometría, midiendo la absorbancia a una longitud de onda especíﬁca para el tinte empleado, que suele ser 450 nm por tratarse de tetrametil benzidina (TMB) en medio ácido, ó 650 nm en medio alcalino. Se emplea también sulfonato de azino bietil benzotiazolina (ABTS), con absorbancia máxima a 405 nm, que corresponde al color verde. En el pasado se ha usado diaminobenzeno (OPD), con un pico de absorción a 490 nm, pero se ha abandonado su uso por ser cancerígeno.

Las pruebas de ensayo colorimétrico se realizan habitualmente en placas de 8 cm x 12 cm de poliestireno con una matriz de 8 x 12 pozuelos de 1 cm de profundidad y 0.7 cm de diámetro, aunque también existen en el mercado placas con pozuelos de menor tamaño dispuestos en una matriz de 384 (16 x 24) ó de 1536 (32 x 48). En el caso de las pruebas ELISA, los pozuelos están recubiertos interiormente con sustancias inmunológicamente activas y se llenan con una muestra ﬂuida de analito, se aclaran y se vuelven a rellenar con un reactivo antes de leer el resultado del test. Existen varios tipos de prueba ELISA, en función del tipo de recubrimiento del pozuelo y del reactivo empleado:

-: ELISA indirecto, para determinar concentraciones de anticuerpos, pozuelos recubiertos con antígeno, y reactivo con anticuerpo conjugado a enzima y especíﬁcamente afín para el anticuerpo sérico a detectar.

-: ELISA sándwich, para detectar proteínas, pozuelos recubiertos con un anticuerpo especíﬁco para la proteína, y reactivo con anticuerpos conjugados a enzima especíﬁcos para el antígeno.

-: ELISA competitivo, para determinar concentraciones de anticuerpos, se recubre el pozuelo con antígeno, el analito se incuba con antígeno, el reactivo contiene un anticuerpo especíﬁco para el anticuerpo sérico y está conjugado a la enzima.

Se incluyen en cada placa pozuelos con muestras positivas y negativas de control como referencia. Estas pruebas se desarrollaron originalmente con el objetivo de ser evaluados de forma subjetiva por el operario, pero tal práctica se ha abandonado por presentar una elevada dependencia ambiental (del grado de entrenamiento y de la iluminación) así como muy baja precisión y falta de repetibilidad. Actualmente se emplean espectrofotómetros para medir la intensidad de la luz a una determinada longitud de onda. Pese a que las pruebas colorimétricas están basadas en elementos (reactivos y placas) de bajo coste, los espectrofotómetros que se emplean para determinar la absorbancia suelen estar entre los equipos más costosos del laboratorio de análisis. Son demasiado voluminosos para ser transportados con facilidad, y no suelen ofrecer la posibilidad de documentar las lecturas realizadas.

El dispositivo “micro ELISA reader”, recogido en la patente US2004087010, aborda alguna de las limitaciones citadas para el sistema clásico de lectura de placas ELISA y puede mejorar la productividad del método, pero presenta notables inconvenientes. Al estar basado en la exploración secuencial de los pozuelos, dicho dispositivo solo acepta un determinado tipo de placas. Por el contrario, la presente propuesta realiza una lectura simultánea de todos lo pozuelos, para cualquier número de pozuelos, lo que evita interferencias temporales y explota adecuadamente la resolución gráﬁca alcanzable con cámaras de imagen digital muy ubicuas y asequibles, en un dispositivo sencillo, libre de mecanismos y de transporte sencillo. El “micro ELISA reader” recurre a dispositivos mecánicos que requieren protección contra la entrada de partículas, siendo susceptible de sufrir los problemas asociados a la presencia de partes móviles así como un deterioro progresivo. Se trata de un dispositivo empotrado en un ordenador personal por lo que no se presta al uso en condiciones de campo, sin facilitar especialmente la transmisión de datos dada la gran variedad de medios -incluidos los inalámbricos-de que se dispone actualmente para ello. Por último, la presencia de reactivos líquidos que pueden verterse con facilidad impide su empleo en condiciones de baja estabilidad, con el operador de pie ó a bordo de un vehículo.

Bibliografía

David S. Hage, “Immunoassays”, Anal. Chem., 71 (1999) 294R-304R.

Tsai Chung-Hua, “Micro ELISA reader”, patente: US2004087010 publicada el 2004-05-06.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La presente invención tiene como objeto evaluar placas de ensayo colorimétrico mediante un sistema de retroiluminación y análisis digital de imagen.

Descripción de las ﬁguras

A continuación se describirán ejemplos del método y sistema, y el aspecto del aparato inventado, con referencias a las siguientes ﬁguras:

Figura 1: Muestra la planta del sistema con cortes sucesivos. 1-Dispositivo emisor de luz. 2-Placa. 3-Elemento difusor. 4-Guía del borde da la placa. 5-Pozuelos. 6-Soporte.

Figura 2: Muestra un corte transversal del iluminador con un ﬁltro difusor opcional. 1-Dispositivo emisor de luz. 3-Elemento difusor. 5-Pozuelos. 7-Sustancia coloreada.

Figura 3: Muestra la conﬁguración espacial de los elementos iluminadores y las dimensiones globales. Dimensiones en mm. (1) Iluminadores. (2) Soporte.

Figura 4: Indica el esquema eléctrico del sistema de retro-iluminación basado en lámina EL con inversor y elemento de control. 1-Dispositivo emisor de luz. 7-Inversor. 8-Control del inversor.

Descripción detallada de la invención

El método de valoración de las pruebas diagnósticas colorimétricas consiste en tomar una fotografía digital de una placa y aplicar al ﬁchero obtenido un programa informático que analiza y cuantiﬁca las componentes de color de los pixeles correspondiente a cada uno de los pozuelos de la placa. El programa requiere del usuario la ubicación de las referencias positivas y negativas, calcula la localización de los pozuelos con o sin intervención del usuario, y determina los parámetros de análisis colorimétrico en función del tipo de tinte con o sin intervención del usuario. El tipo de tinte determina la componente de color adecuada para cada caso, que corresponde a la componente azul del formato de pixel RGB en el caso de tintes con absorbancia máxima a 450 nm, y a la componente roja en el caso de tintes de absorbancia máxima a 650 nm, o combinaciones lineales de los canales. A continuación se determina la media censurada de componente del color en los pixeles correspondientes a cada uno de los pozos. El resultado se expresa en una escala porcentual en los dos formatos habituales: en forma de relación M/N como el cociente entre el valor medio de la componente de color de cada pozo y el valor medio en los pozos de referencia negativa, y en formato IRPC como el cociente de la diferencia entre el valor de la muestra y el de las referencias negativas, y la diferencia entre las referencias negativas y las positivas. Se generan también parámetros estadísticos de dispersión y de separación de referencias para indicar la ﬁabilidad del resultado.

El sistema de iluminación que se emplee para tomar la fotografía digital se separa del sistema de análisis y cuantiﬁcación. Se emplea retro-iluminación, más adecuado para la aplicación ya que elimina reﬂejos y sombras propios de la iluminación directa, y facilita el proceso de análisis y cuantiﬁcación de los niveles de luz. Por otra parte, el sistema no requiere controlar la inﬂuencia del tipo de luz empleado sobre su temperatura de color -como ocurre cuando la iluminación es directa-y sus características de uniformidad sobre la placa. Es necesario reducir las distorsiones de la información que se pretende conseguir: el color del contenido de los pozuelos. Esta distorsión de la información está causada por la presencia de errores de paralaje en la fotografía y por la presencia de brillos y reﬂejos en paredes y fondo del material plástico con que están construidos los pozuelos. Para ello el sistema utiliza un elemento difusor de luz opcional se situará, si la iluminación ambiental produce reﬂejos, por encima de los pozuelos, tal y como se indica en el corte vertical que se muestra en la Figura 2. El dispositivo de emisión de luz (1) está situado en la parte inferior, y sobre él se sitúa la placa (2) que es objeto de análisis. La luz atraviesa cada uno de los pozuelos transparentes (5) que contienen la sustancia coloreada (7) y el elemento difusor opcional (5). En la Figura 1 se muestra la planta del sistema con cortes sucesivos en la que se observa: el dispositivo emisor de luz (1), la placa (2) y el contorno de los pozuelos (5), el elemento difusor opcional (3), y el soporte (6) con unas marcas guía opcionales para el borde de la placa (4).

El sistema de generación de luz se realiza de forma que la luz producida contenga la o las longitudes de onda objeto de análisis. La implementación recurre al empleo de láminas o hilos electro luminiscentes (EL) para generar la luz necesaria para el iluminador, siendo preferible el empleo de láminas por simpliﬁcar notablemente el montaje del conjunto y eliminar la restricción a una determinada disposición de la matriz de pozos. Las láminas EL tienen un bajo espesor y son capaces de producir luz blanca o coloreada en un área suﬁciente como para cubrir toda la extensión de la placa. Las láminas EL se alimentan mediante una tensión alterna algo superior a los 100Vyauna frecuencia de algunos cientos de hertzios por lo que el sistema de retro-iluminación tendrá un esquema eléctrico como el que se muestra en la Figura 4 que incluye el inversor (7) que recibe en su entrada una tensión continua y produce la tensión alterna suﬁciente como para alimentar la lámina EL (1) desde una batería o desde una fuente de alimentación. El sistema se completa con el control del inversor (8) que permite activarlo para encender la lámina EL, e incluye elementos de temporización y de protección frente a polaridades inversas.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Sistema de retro-iluminación para fotograﬁar placas de ensayo colorimétrico constituido por una lámina electroluminiscente de tamaño suﬁciente como para cubrir toda la extensión de los pozuelos, y caracterizado por situar la placa de ensayo colorimétrico sobre la lámina electroluminiscente.
2.

Sistema de retro-iluminación para fotograﬁar placas de ensayo colorimétrico, según la reivindicación 1, caracterizado por disponer en el difusor de unas marcas guía para el borde de la placa de ensayo colorimétrico.
3.

Sistema de retro-iluminación para fotograﬁar placas de ensayo colorimétrico, según la reivindicación 1 y 2, caracterizado por situar un elemento difusor de luz inmediatamente encima de la placa de ensayo colorimétrico.
4.

Método para la valoración de placas de ensayo colorimétrico que, utilizando el sistema de retroiluminación descrito en las reivindicaciones 1,2y3, comprende las siguientes etapas: a) obtención de una fotografía digital de la placa; b) aplicación de un programa informático al ﬁchero correspondiente a la fotografía obtenida, que: c) localiza los pozuelos (con o sin intervención del usuario), d) cuantiﬁca el color del contenido de cada pozuelo mediante el análisis de la distribución de las componentes de color de los pixeles correspondientes a cada pozuelo; e) identiﬁca referencias positivas y negativas mediante la intervención del usuario; f) determina los parámetros de análisis colorimétrico en función del tipo de tinte y su absorbancia máxima (con o sin intervención usuario);

g) expresa el resultado de forma numérica, en los formatos habituales, con indicación de la ﬁabilidad del resultado, y generando un informe y una imagen de la placa analizada con el resultado sobreimpuesto sobre cada pozuelo.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201000164

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 05.02.2010

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

A A A A

DE 4103429 A1 (FORSCHUNGSGESELLSCHAFT FUER DR) 06.08.1992 WO 9810371 A2 (PHILIPS ELECTRONICS NV et al.) 12.03.1998 WO 9613709 A1 (BYK GARDNER USA) 09.05.1996 US 4830501 A (TERASHITA TAKAAKI) 16.05.1989 1 1 1 1

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 28.03.2012

Examinador M. C. González Vasserot Página 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

Nº de solicitud: 201000164

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

G01N21/25 (2006.01) H04N1/46 (2006.01) H04N1/54 (2006.01) G01J3/00 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

G01N, H04N, G01J

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

INVENES, EPODOC, WPI

Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201000164

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 28.03.2012

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-4 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-4 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

OPINIÓN ESCRITA

Nº de solicitud: 201000164

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

DE 4103429 A1 (FORSCHUNGSGESELLSCHAFT FUER DR) 06.08.1992

D02

WO 9810371 A2 (PHILIPS ELECTRONICS NV et al.) 12.03.1998

D03

WO 9613709 A1 (BYK GARDNER USA) 09.05.1996

D04

US 4830501 A (TERASHITA TAKAAKI) 16.05.1989
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

Los documentos citados solo muestran el estado general de la técnica, y no se consideran de particular relevancia. Así, la invención reivindicada se considera que cumple los requisitos de novedad, actividad inventiva y aplicación industrial. 1.-El objeto de la presente solicitud de patente consiste en un método y sistema de retro-iluminación y análisis digital de imagen para la valoración de placas de ensayo colorimétrico mediante técnicas de análisis digital de imágenes, se encuadra dentro de los métodos y sistemas de análisis de imagen digital para la realización de diagnósticos clínicos. Los tests colorimétricos permiten determinar la concentración de una solución de cierta sustancia a partir de la intensidad del color resultante de una reacción. La reacción y la intensidad del color resultante son proporcionales a la concentración del producto a detectar en la muestra. 2.-El problema planteado por el solicitante es eliminar reflejos y sombras propios de la iluminación directa, y facilitar el proceso de análisis y cuantificación de los niveles de luz empleando retro-iluminación. El sistema de iluminación que se emplea para tomar la fotografía digital se separa del sistema de análisis y cuantificación. Por otra parte, el sistema no requiere controlar la influencia del tipo de luz empleado sobre su temperatura de color – como ocurre cuando la iluminación es directa – y sus características de uniformidad sobre la placa. Es necesario reducir las distorsiones de la información que se pretende conseguir: el color del contenido de los pozuelos. Esta distorsión de la información está causada por la presencia de errores de paralaje en la fotografía y por la presencia de brillos y reflejos en paredes y fondo del material plástico con que están construidos los pozuelos. Para ello el sistema utiliza un elemento difusor de luz opcional que se situará, si la iluminación ambiental produce reflejos, por encima de los pozuelos. El documento D1 puede considerarse como el representante del estado de la técnica más cercano ya que en este documento confluyen la mayoría de las características técnicas reivindicadas.

Análisis de las reivindicación independiente 1

D1 se diferencia del documento de solicitud de patente en que no emplea un sistema de retro-iluminación para fotografiar placas de ensayo colorimétrico con una lámina electroluminiscente de tamaño suficiente para cubrir toda la extensión de los pozuelos situando la placa de ensayo colorimétrico sobre la lámina electroluminiscente. La reivindicación 1 es nueva (Art. 6.1 LP 11/1986) y tiene actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986).

Análisis del resto de los documentos

De este modo, ni el documento D1, ni ninguno del resto de los documentos citados en el Informe del Estado de la Técnica, tomados solos o en combinación, revelan la invención en estudio tal y como es definida en las reivindicaciones independientes, de modo que los documentos citados solo muestran el estado general de la técnica, y no se consideran de particular relevancia. Además, en los documentos citados no hay sugerencias que dirijan al experto en la materia a una combinación que pudiera hacer evidente la invención definida por estas reivindicaciones y no se considera obvio para una persona experta en la materia aplicar las características incluidas en los documentos citados y llegar a la invención como se revela en la misma.

Informe del Estado de la Técnica Página 4/4