ES2377349T3

ES2377349T3 - Modificación de la superficie

Info

Publication number: ES2377349T3
Application number: ES08839931T
Authority: ES
Inventors: Heinrich Jehle
Original assignee: Greiner Bio One GmbH Germany
Current assignee: Greiner Bio One GmbH Germany
Priority date: 2007-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2012-03-26
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: WO2009049838A2; AT505883B1; US20100234240A1; ATE536943T1; US8795787B2; EP2252410B1; AT505883A1; EP2252410A2; WO2009049838A3

Abstract

Procedimiento para la modificacion al menos por zonas de una superficie de un soporte de al menos un sustrato mediante deposicion de un recubrimiento mediante polimerizacion por plasma, generandose el recubrimiento al menos por zonas con espacios libres para acomodar al menos una solucion realizandose antes de o durante la polimerizacion por plasma una activacion de la superficie del sustrato en el plasma y generandose al menos por zonas un polimero de plasma hinchable, asi como formandose mediante el recubrimiento una estructura tridimensional, caracterizado porque en la activacion se realiza un acoplamiento de potencia de 5 a 20 veces mayor que en la polimerizacion por plasma.

Description

Modificacion de la superficie

La presente invencion describe el uso de un soporte de al menos un sustrato que presenta al menos por zonas un recubrimiento fabricado por polimerizacion por plasma de modulos individuales, asi como un procedimiento para su fabricacion.

En sistemas para la microfluidica o en productos de micromatrices para el analisis de muestras biologicas, el soporte o la superficie o la calidad de la superficie del soporte tiene una gran importancia. Los analisis de este tipo son frecuentemente muy laboriosos y requieren mucho tiempo y, por tanto, es especialmente importante que los ensayos usados para esto sean sensibles y fidedignos. Un cambio ventajoso para el uso puede conseguirse especialmente mediante modificaciones de la superficie como, por ejemplo, por cambio de la funcionalidad quimica.

Las superficies quimicamente modificas son indispensables, por ejemplo, en la industria farmaceutica para el desarrollo de sistemas de prueba biologicos, ya que mediante la provision especifica de la plataforma con capas definidas de unidades funcionales quimicas puede controlarse la interaccion superficie/biomolecula. La tecnologia de micromatrices tambien se basa en el uso de superficies quimicamente modificadas para la inmovilizacion de ADN (superficie de amina) o proteinas (superficie de aldehido, epoxidica) [M. Pirrung, Angew. Chem. 2002, 41, 1276. - N. Zammatteo y col., Analytical Biochemistry 2000, 280, 143. - M. Shena: Microarrays, A practical approach, Oxford University Press 1999.]

Los analisis del genoma incluyen el uso de material biologico que comprende acidos nucleicos y proteinas, pudiendo realizarse en paralelo muchos analisis. Normalmente se inmovilizan biomoleculas por acoplamiento quimico o adsorcion. Actualmente se fabrican matrices con biomoleculas depositando alicuotas de muestra bajo condiciones que permiten que las moleculas se unan o sean unidas a la superficie de la matriz. Alternativamente o adicionalmente, las biomoleculas pueden sintetizarse sobre la superficie de la matriz o inmovilizarse directamente o indirectamente. El numero de muestras diferentes que se aplican sobre una matriz individual puede ser muy alto. La aplicacion puede facilitarse por impresoras de matriz. Las matrices son normalmente productos de un solo uso, por lo que en su produccion se desea conseguir un alto grado de reproducibilidad y un minimo de errores.

Para conseguir los efectos deseados se sabe manipular quimicamente soportes con muchas cavidades o dispositivos de microfluidica para mejorar la afinidad o retencion de moleculas seleccionadas en su superficie. A este respecto se desea unir la superficie tratada con la molecula diana con alta afinidad y retencion sin influir negativamente al mismo tiempo en su actividad biologica, de manera que pueda realizarse un ensayo reproducible.

Por el documento WO 01/031339 A1 se conoce la aplicacion de la polimerizacion por plasma. En ella, una pelicula de polimero reticulado ultrafina de aproximadamente 200 nm se deposita sobre un sustrato con funcionalidad quimica controlable. A este respecto, las propiedades del sustrato permanecen en gran medida sin afectar. Los plasmas o los gases ionicos se excitan normalmente por un campo electrico. Se trata de un medio quimico extraordinariamente reactivo que comprende iones, electrones, particulas neutras y radiacion electromagnetica. A presion reducida pueden alcanzarse condiciones a las que la temperatura de los electrones se diferencia claramente de la de los iones y las particulas neutras. H. K. Yasuda, Plasma Polymerisation, Academic Press, Londres, 1985, describieron que compuestos organicos (monomeros) se polimerizan puros o junto con otros gases, por ejemplo, argon, recubriendose tanto superficies en contacto con el plasma como tambien aguas abajo de la descarga. La polimerizacion por plasma es una ruta eficaz para la generacion libre de disolventes de finas capas (>5 nm). La generacion de un plasma frio se produce a vacio por una descarga electrica, por la que se genera un entorno muy reactivo constituido por iones, radicales, electrones y particulas metaestables. Mediante la eleccion de condiciones de reaccion adecuadas como activacion, presion, entrada de potencia, gases portadores y compuestos de partida organicos (monomeros) puede conseguirse una polimerizacion del correactante y la deposicion del polimero de plasma formado sobre sustratos. Los polimeros de plasma se diferencian principalmente drasticamente de los polimeros convencionales debido a la falta de una unidad de repeticion continua, asi como de un alto grado de reticulacion. Un motivo de esto es la presencia de multiples especies reactivas en el plasma y de una menor selectividad resultante en comparacion con las rutas de sintesis convencionales. La condicion basica para el uso de posibles monomeros es la introduccion de precursores principalmente liquidos en la fase gaseosa bajo las condiciones de reaccion seleccionadas.

Asi, en el documento DE 603 04 163 T2 se describe una modificacion de la superficie por polimerizacion por plasma por la que se fabrica una superficie que es irregular y define zonas de la superficie locales. Esta superficie presenta una elevada afinidad por moleculas biologicas que estan expuestas a la superficie. Esto se consigue extrayendo una parte del plasma por una abertura. Alternativamente, un plasma puede excitarse en la punta o en un microcapilar.

Es objetivo de la presente invencion un soporte para inmovilizar acidos nucleicos con al mismo tiempo minimizacion de uniones no especificas de proteinas, asi como facilitar un procedimiento para su fabricacion.

El objetivo de la invencion se alcanza respectivamente independientemente por un soporte con un recubrimiento, presentando el recubrimiento al menos por zonas espacios libres para acomodar una solucion, y un procedimiento, generandose el recubrimiento al menos por zonas con espacios libres para acomodar la solucion.

Como espacios libres en relacion con la invencion se entiende tanto estructuras bi como tambien tridimensionales que presentan una alta capacidad de union para acidos nucleicos con al mismo tiempo union de proteinas minimizada. Para este modo de accion es decisiva tanto la estructura por las condiciones de sintesis que produce una matriz hinchable porosa como tambien las unidades funcionales quimicas aproticas polares para ayudar en la repelencia de proteinas unidas a modulos quimicos polares contiguos para la inmovilizacion selectiva de acidos nucleicos. La ventaja de la matriz hinchable porosa funcional en la inmovilizacion de los acidos nucleicos es la combinacion de a) componentes de union quimicos adecuados en la capa funcional con b) la elevacion de la capacidad de union debido a la penetracion del componente de union en la capa y, por tanto, tambien la inmovilizacion en la capa y no solo sobre la capa y c) la optimizacion de la tasa de inmovilizacion debido a la evaporacion retardada y, por tanto, tiempo de reaccion prolongado de las soluciones de la matriz. La ventaja de la matriz hinchable porosa funcional en la repelencia de proteinas es la combinacion de la formacion de la capa de hidrato del nanogel en contacto con soluciones tampon con modulos de sintesis aproticos incluidos que no participan en la union de proteinas. Por tanto, con la invencion se consigue un efecto sinergico con union de ADN mejorada y al mismo tiempo repelencia de proteinas.

Como solucion, en relacion con la invencion se entiende un liquido que puede interaccionar con los grupos funcionales de las finas capas generadas por plasma. Por esta se entiende, por ejemplo, un liquido que contiene ADN, ARN, PNA, LNA, etc.

La capa asi generada puede ser ventajosa para todas las aplicaciones que quieran unir acidos nucleicos, como ADN, ARN, PNA, LNA o una forma mixta de los mismos, y a este respecto se minimiza al mismo tiempo la union de proteinas como, por ejemplo, enzimas, anticuerpos, antigenos. Este es el caso en muchas reacciones de deteccion en las que se usan acidos nucleicos como sondas de captura. Las enzimas mas frecuentemente usadas son peroxidasa de rabano picante (HRP), glucosa-oxidasa o fosfatasa alcalina, usandose estas tanto para reacciones de deteccion colorimetricas como tambien de quimioluminiscencia y fluorescencia. En el transcurso del analisis primero se usan analitos que estan marcados con un hapteno como, por ejemplo, biotina, antigeno, se hibridan, por ejemplo, con sondas de ADN. A continuacion se lava y una enzima que esta acoplada a una molecula de captura complementaria al hapteno, por ejemplo, estreptavidina, anticuerpo, se une al complejo analito-sonda. Despues de otra etapa de lavado, la enzima se anade al sustrato y se detecta el producto de reaccion. Por tanto, puede conseguirse ventajosamente que solo aquellas moleculas que encuentran un componente de union con un sitio de union especifico se adhieran al soporte y no se formen senales por depositos no especificos de reactantes necesarios para la reaccion de deteccion.

Los espacios libres o cavidades pueden extenderse tanto en direccion bi como tambien tridimensional. De esta manera puede formarse una estructura de red. El recubrimiento presenta preferiblemente una estructura tridimensional y forma una matriz tridimensional o mediante el recubrimiento se forma una estructura tridimensional, por lo que se evita en gran medida la union de proteinas.

Ademas, se muestra ventajosamente que con el soporte segun la invencion que presenta un recubrimiento hinchable o con el procedimiento, generandose como recubrimiento un polimero de plasma al menos por zonas hinchable, se pone a disposicion un funcionalizacion de la superficie economica para la generacion de capas funcionales ya que los materiales de base convencionales pueden proveerse de novedosas propiedades mediante la rentable mejora del sustrato y, por tanto, abrirse nuevas aplicaciones.

La capa hinchable puede presentar una capa de hidrato o puede formar una capa de hidrato despues de la aplicacion de un medio predominantemente acuoso, por lo que se consigue la alta capacidad de union para acidos nucleicos con al mismo tiempo union de proteinas minimizada y, por tanto, representa una optimizacion de la reaccion en lo referente a la sensibilidad, ruido y tambien consumo de muestras.

El recubrimiento formado presenta angulos de contacto de un intervalo con un limite inferior de 35° y un limite superior de 65° con agua como liquido de medida, por lo que muestra un comportamiento caracteristico de materiales hinchables en contacto con soluciones de reaccion. En la aplicacion de la muestra sobre el soporte se forma brevemente una fase estacionaria de una gota que se asienta sobre la superficie hidrofila que a continuacion difunde rapidamente en la superficie.

Se preve que el recubrimiento presente un espesor seleccionado de un intervalo con un limite inferior de 4 nm,

preferiblemente 10 nm, y un limite superior de 300 nm, preferiblemente 40 nm. Ademas, el recubrimiento formado esta libre de defectos, reticulado y es estable a largo plazo y no perjudica las principales caracteristicas requeridas de los sustratos procesados como, por ejemplo, la transparencia o resistencia a disolventes.

El material del sustrato del soporte esta formado por plastico, por un grupo que comprende un polimero a base de carbono o silicio, por un grupo que comprende poliestireno (PS), polietileno (PE), poli(tereftalato de etileno) (PET, PETP, PBTP), polipropileno (PP), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poliamidas, nitrocelulosa, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), estireno-acrilonitrilo (SAN), policarbonato (PC), copolimeros de cicloolefina (COC) como copolimero de ciclopenteno-polietileno, copolimero de ciclohexano-polietileno, copolimero de ciclohepteno-polietileno, asi como polimeros de cicloolefina (COP) o similares, pentoxido de ditantalio, vidrio, metal o combinaciones de los mismos, por lo que los materiales conocidos por el estado de la tecnica como tambien los nuevos materiales pueden proveerse de propiedades que permiten una union de acidos nucleicos con al mismo tiempo ninguna union de proteinas o union de proteinas minima. Tambien se muestran especialmente ventajosos hibridos de materiales de plastico y vidrio.

El sustrato tambien puede configurarse como membrana, con lo que pueden modificarse multiples soportes. Ademas, el sustrato que va a recubrirse no esta limitado a cuerpos base planos, sino que tambien pueden recubrirse superficies estructuradas o porosas.

Ademas, se preve que los modulos individuales esten formados por al menos una especie de monomero, pudiendo conseguirse un recubrimiento lo mas uniforme posible mediante el uso de una especie del compuesto de partida en caso de necesidad. La adicion de modulos individuales conduce a la formacion de polimeros de plasma.

La especie de monomero se selecciona de un grupo que comprende aminas, amidas, dialquiloxietano, pudiendo presentar la especie monomerica respectiva restos de un grupo que comprende H, alquilo o arilo, por lo que se obtiene un recubrimiento con propiedades optimas para la union de acidos nucleicos con al mismo tiempo union de proteinas minimizada. Como restos R pueden servir H, alquilo, arilo, usandose preferiblemente restos con 1 a 8 atomos de carbono, especialmente 1 a 3 atomos de carbono.

Antes de o durante la polimerizacion por plasma puede realizarse una activacion de la superficie del sustrato en el plasma, produciendo el control de la sintesis de la polimerizacion por plasma sin un tratamiento previo una buena capacidad de union de acidos nucleicos con al mismo tiempo repelencia de proteinas. Ventajosamente, mediante una sintesis de dos etapas constituida por tratamiento con plasma para la activacion seguido de una polimerizacion por plasma se deposita una capa que puede vencer las limitaciones de hasta la fecha referentes a la rentabilidad y, por tanto, la utilidad en el diagnostico medico que combina la capacidad de union de ADN con al mismo tiempo la minimizacion de la union no especifica de proteinas. El rendimiento en un proceso de dos etapas es claramente mejor. Mediante una activacion pre-conectada tambien pueden eliminarse impurezas del sustrato o en la superficie del sustrato.

La activacion puede realizarse con una mezcla de reaccion que comprende un gas portador y un gas de reaccion en un reactor, siendo el gas portador un gas inerte y seleccionandose el gas de reaccion de un grupo que comprende oxigeno, amoniaco, H2, N2, CO2, C2H2, por lo que pueden usarse gases rentables para la produccion economica de superficies polimerizadas por plasma.

En un perfeccionamiento se preve que entre la activacion y la polimerizacion por plasma se introduzca al reactor un gas de lavado, preferiblemente un gas inerte, especialmente a la camara de reaccion, por lo que, por ejemplo, los productos interferentes con la polimerizacion por plasma se evacuan de la camara de reaccion. Mediante la activacion de los sustratos mediante gases de soporte y de reaccion como, por ejemplo, plasmas de O2/Ar o NH3/Ar tambien se generan sitios de union con mayor acoplamiento de potencia.

La activacion y/o la polimerizacion por plasma puede realizarse a un acoplamiento de potencia de un intervalo con un limite inferior de 0,1 W, preferiblemente 2 W, especialmente 5 W, y un limite superior de 2500 W, preferiblemente 300 W, especialmente 20 W. En una sintesis de dos etapas, la activacion de los sustratos se realiza preferiblemente a un acoplamiento de potencia de 5 a 20 veces, preferiblemente de 9 a 18 veces, mayor acoplamiento de potencia que en la polimerizacion por plasma. En la sintesis de dos etapas, la activacion se realiza preferiblemente a una potencia de plasma de un intervalo con un limite inferior de 2 W y un limite superior de 2500 W y la polimerizacion por plasma se realiza a una potencia de plasma de un intervalo con un limite inferior de 0,1 W y un limite superior de 400 W. La entrada de potencia elegida hace posible garantizar el mayor mantenimiento posible de las propiedades estructurales y funcionales de los monomeros.

Mediante la formacion del recubrimiento por plasmas pulsados tambien se hace posible mantener las propiedades estructurales y funcionales de los monomeros.

La al menos una especie de monomero puede introducirse liquida o en forma gaseosa, pudiendo pulverizarse los monomeros liquidos directamente en el reactor y convertirse en la fase gaseosa bajo las condiciones de presion alli prevalecientes o evaporandose fuera y dosificandose como gas. No es necesaria una purificacion previa de los monomeros mediante ciclos de desgasificacion/gasificacion o congelacion/desgasificacion pre-conectados repetidos.

La presion durante la activacion y/o polimerizacion por plasma se selecciona de un intervalo con un limite superior de 1,5 mbar (150 Pa), preferiblemente 0,5 mbar (50 Pa), y un limite inferior de 0,05 mbar (5 Pa), preferiblemente 0,2 mbar (20 Pa), por lo que se facilitan relaciones de presion optimas para la polimerizacion por plasma.

La activacion se realiza durante un periodo de tiempo con un limite inferior de 1 min, preferiblemente, 5 min, y un limite superior de 15 min, preferiblemente 10 min, y/o la polimerizacion por plasma durante un periodo de tiempo con un limite inferior de 1,5 min, preferiblemente 10 min, y un limite superior de 60 min, preferiblemente 20 min, por lo que se consiguen resultados optimos en lo referente a la union de acidos nucleicos minimizando al mismo tiempo la union de proteinas.

Para facilitar la extraccion del soporte de la camara de reaccion y para mantener la carga por malos olores tan baja como sea posible, el reactor, especialmente la camara de reaccion, se lava con aire despues de la polimerizacion y la camara se ventila.

A continuacion se representan los resultados de los analisis del objeto o procedimiento segun la invencion:

Muestran:

Fig. 1: Espectro de FITR de un soporte de polimero de cicloolefina recubierto segun el Ejemplo de realizacion 1 en comparacion con un soporte sin recubrir

Fig. 2: Analisis de ToF SIMS de un perfilado de profundidad y determinacion del espesor de capa del Ejemplo de realizacion 1

Fig. 3: Ejemplo de aplicacion de un diagnostico de POC sobre un soporte segun la invencion

Fig. 4: Comparacion de la inmovilizacion de ADN de superficies funcionalizadas conocidas por el estado de la tecnica con la superficie funcionalizada segun la invencion

Fig. 5: Comparacion de las propiedades de union de la superficie funcionalizada segun la invencion con una superficie sin funcionalizar

Cabe observar a modo de introduccion que en los ejemplos de realizacion se proveen partes diferentemente descritas con las mismas designaciones, pudiendo transferirse las revelaciones contenidas en toda la descripcion en terminos de significado a las mismas partes con las mismas designaciones. Los datos de posicion elegidos en la descripcion como, por ejemplo, arriba, abajo, lateral, etc., tambien se refieren a la figura inmediatamente descrita, asi como representada, y estos pueden transferirse a un cambio de posicion en terminos de significado a la nueva posicion. Ademas, tambien pueden representarse caracteristicas individuales o combinaciones de caracteristicas de los diferentes ejemplos de realizacion mostrados y descritos para soluciones independientes, inventivas o segun la invencion.

Debe entenderse que todas las indicaciones a intervalos de valores en esta descripcion comprenden todos y cada uno de los intervalos parciales de los mismos, por ejemplo, la indicacion 1 a 10 debe entenderse que comprende todos los intervalos parciales, a partir del limite inferior 1 y del limite superior 10, es decir, todos los intervalos parciales empiezan con un limite inferior de 1 o superior y terminan en un limite superior de 10 o inferior, por ejemplo, 2 a 9 o 4 a 7 o 5 a 6.

La capacidad de la camara de reaccion para el procedimiento descrito a continuacion y segun la invencion comprende entre 0,01 m3 y 0,8 m3.

El tratamiento con plasma de los sustratos mediante plasmas de O2/Ar o NH3/Ar a mayor acoplamiento de potencia sirve para la activacion mediante la generacion de sitios de union. La adicion de reactantes inmediatamente posterior de las clases de sustancias I a III citadas acontinuacion conduce a la formacion de polimeros de plasma. Como restos R pueden servir H, alquilo, arilo, pudiendo ser los restos de una clase de sustancias o bien igual o bien diferente. En la clase de sustancias I, n se selecciona preferiblemente entre 1 y 5, consiguiendose muy buenos resultados con n=1.

Entre la etapa de activacion y la etapa de polimerizacion puede usarse un gas de lavado (por ejemplo, argon) para la eliminacion de los reactantes. En la realizacion preferida no es necesario un lavado del reactor.

El sustrato que va a recubrirse puede estar constituido por un polimero a base de carbono o silicio, vidrio, pentoxido de ditantalio, metal, o por membranas y no esta limitado a cuerpos base planos. Tambien pueden procesarse combinaciones de materiales.

El gas portador puede ser argon u otro gas inerte; los gases de reaccion pueden ser oxigeno, amoniaco, H2, N2, CO2 o representantes similares.

La potencia de plasma se extiende preferiblemente en el intervalo de 0,1 W a 2500 W, preferiblemente 2 W a 300 W, en la realizacion especialmente preferida de 5 W a 20 W.

Pueden usarse fuentes de plasma como se conocen por el estado de la tecnica.

Los monomeros liquidos pueden pulverizarse directamente en el reactor o introducirse como aerosoles y convertirse en la fase gaseosa bajo las condiciones de presion alli prevalecientes o evaporarse fuera y dosificarse como gas. No es necesaria una purificacion previa de los monomeros mediante ciclos de desgasificacion/gasificacion o congelacion/desgasificacion pre-conectados repetidos.

Los intervalos de presion durante la polimerizacion se encuentran preferiblemente entre 0,05 mbar (5 Pa) y 1,5 mbar (150 Pa), en una realizacion preferida entre 0,2 mbar (20 Pa) y 0,5 mbar (50 Pa).

La deposicion de capas produce en funcion del cuerpo base una superficie hidrofila con intervalos de angulos de contacto preferidos de 35° a 65° con agua como liquido de medida.

El tiempo de reaccion de la activacion puede encontrarse en el intervalo de 1 min a 15 min; en la realizacion preferida en el intervalo de 5 min a 10 min.

Los tiempos de reaccion de la polimerizacion por plasma se encuentran en el intervalo de 1,5 min a 60 min y en una realizacion preferida en el intervalo de 10 min a 20 min.

El espesor de capa de los polimeros de plasma asciende a 4 nm a 300 nm, en la realizacion preferida a 10 nm a 40 nm.

Despues de la polimerizacion, la camara de reaccion se lava con aire durante un periodo de tiempo de 1 min a 5 min, la camara se ventila y se extraen los cuerpos base recubiertos.

En funcion del dimensionado del reactor o de la camara de reaccion puede ser necesario adaptar los valores anteriormente citados correspondientemente al dimensionado elegido, lo que se encuentra en el juicio rutinario del experto.

Las capas resultantes destacan por un comportamiento caracteristico de materiales hinchables en contacto con soluciones de reaccion formandose brevemente (1-2 s) en la aplicacion de una gota una fase estacionaria de una gota que se asienta sobre la superficie que a continuacion difunde rapidamente en la superficie. Este hinchamiento genera una capa de hidrato que evita una adhesion de proteinas y esta bien documentado, por ejemplo, para superficies mezcladas por quimica humeda con polietilenglicol (PEG) o polisacarido (K. Emoto, Anal. Chem. 1996, 68, 3751 -C. Brink, Colloid Surf 1992, 66, 149 -Y.S. Lin, Colloids and Surf. B: Biointerfaces 1994, 3, 49 -E. Uchida, Langmuir 1994, 10, 481). Una mezcla de derivados de PEG con clasificaciones de balance hidrofilo-lipofilo entre 5 y 8 con polimeros de base como poliestireno esta documentada en el documento WO 1998/017407 A1 para alcanzar un rechazo de proteinas.

Ejemplo de realizacion 1:

Se usan argon 5.6, NH3 y N,N-dimetilacrilamida como se obtienen del fabricante, por ejemplo, Aldrich, Fluca.

Cuerpos base de poliestireno, polimero de cicloolefina y vidrio se colocan en la camara de reaccion y la presion se reduce a 0,1 mbar (10 Pa). Se realiza la dosificacion de argon y NH3 bajo un ajuste de presion a 0,5 mbar (50 Pa) y el acoplamiento de potencia de 180 W durante 10 min. Despues de detener el proceso de activacion, la presion se regula a 0,1 mbar (10 Pa), se eleva a 0,35 mbar (35 Pa) mediante la adicion de argon y N,N-dimetilacrilamida y la polimerizacion por plasma se realiza en una etapa de potencia de 15 W durante 15 min.

Ejemplo de realizacion 2:

Se usan argon 5.6, NH3 y N,N-dimetilalilamina como se obtienen del fabricante. Cuerpos base de poliestireno, polimero de cicloolefina y vidrio se colocan en la camara de reaccion y la presion se reduce a 0,1 mbar (10 Pa). Se realiza la dosificacion de argon y NH3 bajo un ajuste de presion a 0,5 mbar (50 Pa) y el acoplamiento de potencia de 100 W durante 10 min. Despues de detener el proceso de activacion, la presion se regula a 0,1 mbar (10 Pa), se eleva a 0,5 mbar (50 Pa) mediante la adicion de argon y N,N-dimetilalilamina y la polimerizacion por plasma se realiza en una etapa de potencia de 15 W durante 20 min.

Ejemplo de realizacion 3:

Se usan argon 5.6, NH3 y N,N-dimetilalilamina como se obtienen del fabricante. Cuerpos base de poliestireno, polimero de cicloolefina y vidrio se colocan en la camara de reaccion y la presion se reduce a 0,1 mbar (10 Pa). Se realiza la dosificacion de argon y NH3 bajo un ajuste de presion a 0,5 mbar (50 Pa) y el acoplamiento de potencia de 1700 W durante 10 min. Despues de detener el proceso de activacion, la presion se regula a 0,1 mbar (10 Pa), se eleva a 0,5 mbar (50 Pa) mediante la adicion de argon y N,N-dimetilalilamina y la polimerizacion por plasma se realiza en una etapa de potencia de 200 W durante 20 min.

Ejemplo de realizacion 4:

Se usan argon y dimetoxietano como se obtienen del fabricante. Cuerpos base de poliestireno, polimero de cicloolefina y vidrio se colocan en la camara de reaccion y la presion se reduce a 0,1 mbar (10 Pa). Se realiza la dosificacion de argon y dimetoxietano bajo un ajuste de presion a 0,6 mbar (60 Pa) y el acoplamiento de potencia de 6 W durante 40 min.

Debido a los espacios libres preparados, el rechazo de proteinas de las superficies fabricadas segun la invencion es mucho mayor que en superficies convencionalmente fabricadas descritas como, por ejemplo, en el estado de la tecnica. Las propiedades de union de la superficie funcionalizada se comprueban con ayuda de una prueba de ELISA competitiva, pudiendo detectarse una propiedad de union un factor de 10 veces mas baja para las superficies segun la invencion en comparacion con superficies convencionales.

Ademas, pudo mostrarse una inmovilizacion de ADN mejorada de las capas resultantes del procedimiento segun la invencion, por lo que se redujeron, por una parte, el consumo de acido nucleico de las sondas que iban a inmovilizarse y, por otra parte, el consumo de muestra. La capacidad de union para ADN es al menos el 40� superior a la de las superficies sin funcionalizar o funcionalizadas conocidas por el estado de la tecnica.

El motivo estructural en gran medida intacto C(=O)N puede detectarse a 1680 cm-1 mediante las bandas de carbonilo caracteristicas para amidas como se muestra en el espectro de FITR en la Fig. 1, resultando el pico a 1680 cm-1 de la superficie del soporte funcionalizada segun la invencion, mientras que las superficies sin funcionalizar no presentan picos a 1680 cm-1.

Un perfilado de profundidad y la determinacion del espesor de capa mediante la composicion quimica de las capas mediante ToF SIMS proporciona en la realizacion preferida del Ejemplo 1 un espesor de capa de aproximadamente 11 nm, como se representa en la Fig. 2. Para determinar la distribucion de elementos en funcion de la profundidad se crean perfiles de profundidad. En el perfilado de profundidad por ToF-SIMS en el llamado �Modo de haz doble� (�Dual-Beam-Mode�), la superficie de la muestra se atomiza continuamente con un haz de iones (aqui: Cs�), mientras que un segundo haz de iones (aqui: Bi3�) se usa para la caracterizacion de la composicion quimica de la base de crater asi formada. La atomizacion masiva necesaria para el perfilado dana el material solido, de manera que en este tipo de analisis la mayoria de las veces solo puede registrarse la distribucion de elementos en funcion de la profundidad.

Los resultados de investigaciones de �PS en muestras de los ejemplos de realizacion tambien muestran una composicion claramente modificada en comparacion con referencias sin recubrir. Para las mediciones se uso un aparato PHI �uantera S�P: radiacion de excitacion: AlK�; lugar de analisis: 200 x 200 �m2.

En la siguiente Tabla 1 se reproduce la comparacion de las concentraciones de elementos en porcentaje de atomos de poliestireno (PS) transparente y blanco y adicionalmente se especifican las relaciones de concentracion. Los resultados para ambas muestras son muy similares entre si. En total, en los aproximadamente 10 nm superiores de

las muestras se encuentran 11,6 por ciento de atomos (� de atomos) de N y 13,7� de atomos de O (poliestireno transparente) o 15,8� de atomos de N y 16,6� de atomos de O (poliestireno blanco).

Tabla: 1: Concentraciones de elementos en porcentaje de atomos y relaciones de concentracion

C: O N C/O C/N

PS, transparente: 74,7 13,7 11,6 5,4 6,4

PS, blanco: 67,7 16,6 15,8 4,1 4,3

La siguiente Tabla 2 muestra las proporciones en porcentaje de los desplazamientos quimicos del pico C 1s; (C1s alifatico/aromatico: 284,8 eV; C-O/C-N: 286,2 eV; C=/O-C-O: 287,5 eV)

El pico de oxigeno O 1s se encuentra a 531 eV (correspondientemente a enlaces O-C) y el pico N 1s a 399,5 eV (correspondientemente a enlaces N-C).

Si se comparan ambas tablas, entonces puede concluirse que aproximadamente el 33� del carbono (correspondientemente el 24� de atomos) no esta unido como C-C. Por tanto, en el 13� de atomos de O y en el 11� de atomos de N practicamente no pueden estar presentes enlaces de C con 2 oxigenos. Por tanto, el motivo estructural C(=O)N sigue siendo decisivo incluso despues de la polimerizacion por plasma y se excluye en gran medida una fragmentacion del monomero.

Tabla 2: Proporciones en porcentaje de los desplazamientos quimicos del pico C 1s

C-C/C-H alifatico/aromatico: C-O/C-N C=O/O-C-O

PS, transparente: 67 20 13

PS, blanco: 68 16 16

Por tanto, la presencia de una capa de la superficie modificada puede confirmarse mediante diferentes analisis.

Los soportes segun la invencion pueden usarse, por ejemplo, para sistemas de matrices para la deteccion de analitos o para estructuras microfluidicas. Posibilidades de aplicacion tipicas son matrices de hibridacion de acidos nucleicos con generacion de senales, debiendo realizarse aqui con procedimientos conocidos por el estado de la tecnica una etapa de bloqueo que cubra los sitios de union a proteinas de la superficie del soporte con una capa que no se une a las proteinas, ya que si no resultaria una senal por el ruido. Esta etapa de bloqueo se suprime con el soporte segun la invencion.

Mediante la elevacion de la capacidad de union de acidos nucleicos a la superficie del soporte segun la invencion tambien puede conseguirse una mejora de la sensibilidad de los ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y, por tanto, mejorarse el limite de deteccion.

El soporte segun la invencion tambien es adecuado para inmunoensayos ya que no produce union no especifica de proteinas a la superficie y de esta manera puede evitarse un ruido interferente para la senal.

Mediante el procedimiento segun la invencion tambien pueden hidrofilizarse superficies, especialmente superficies de plastico, de manera que se haga posible un transporte de muestras en microcanales. El procedimiento permite la modificacion de superficies con cavidades, por lo que tambien es adecuado para superficies estructuradas.

Posibles sectores de aplicacion en el diagnostico de punto de cuidado (�Point of Care�) (POC)

Como tecnica dominante hasta la fecha en las aplicaciones de POC es de mencionar el llamado ensayo de flujo lateral (�Lateral Flow Assay�) (LFA). Los LFA se basan en el mismo principio que otros ensayos inmunologicos (ELISA, ensayo de perlas magneticas (�Magnetic Bead Assays�), etc.) aprovechando el efecto de la reaccion anticuerpo-antigeno. Adicionalmente, tienen propiedades cromatograficas, ya que los anticuerpos estan unidos sobre una membrana. La muestra que va a analizarse (solucion) se extiende sobre toda la tira debido a las fuerzas capilares y conduce a un resultado rapidamente visible. Por los motivos mencionados, el LFA tambien se designa inmunocromatografia. La muestra la soporta un soporte de muestra que separa las impurezas (particulas de suciedad) de la muestra. Bajo el soporte de muestra se encuentra el soporte del conjugado en el que se encuentra

el conjugado (anticuerpo primario). A este respecto se trata de anticuerpos dirigidos contra los analitos que van a medirse (por ejemplo, ricina) que estan unidos a oro coloidal. Cuando esta contenido en la muestra, el analito reacciona sobre el soporte del conjugado con el anticuerpo unido al oro coloidal. Despues, la muestra circula sobre la membrana de nitrocelulosa. Alli estan aplicadas dos zonas consecutivas. En el caso de la primera zona se trata de un anticuerpo secundario que esta dirigido contra los analitos y reconoce un epitope diferente al conjugado (sitio de reconocimiento del anticuerpo). La otra linea contiene un anticuerpo anti-especie que reacciona con el conjugado no unido. El liquido en exceso con las particulas de oro no unidas a la linea de prueba o de control sigue circulando por el sistema de membrana hasta que es absorbido por un papel de filtro y, por tanto, se evita un reflujo. Las membranas de nitrocelulosa son las membranas mas adecuadas para un LFA. Las propiedades del polimero de nitrocelulosa junto con la estructura microporosa hacen que la membrana sea un material de soporte ideal para la mayoria de los ensayos de flujo lateral (�Lateral Flow Assays�). Una buena membrana posee las siguientes propiedades: (i) alta capacidad de union, (ii) velocidad capilar definida y precisa, (iii) superficie de la membrana homogenea que esta libre de polvo y defectos, (iv) espesor homogeneo de la membrana, (v) calidad homogenea entre los distintos lotes. Se ha demostrado ventajosamente en la aplicacion del soporte segun la invencion en comparacion con el ensayo LIF del estado de la tecnica que (i) no es necesario el uso de una membrana �externa�,

(ii) no es necesaria ninguna carga, entre otras cosas, con conjugados de oro, (iii) hace posible la fluidica del transporte de liquidos y materia y (iv) la quimica de la superficie garantiza una buena inmovilizacion con baja union no especifica (dado el caso no se necesita ninguna otra etapa de trabajo de saturacion).

En la Fig. 3 se ilustra un ejemplo de una aplicacion de POC con una superficie funcional segun la invencion cuya sintesis se esquematiza a continuacion:

Despues de la inmovilizacion de sondas de ADN especificas se realiza una hibridacion con una muestra compleja. Las secuencias de ADN inmovilizadas se ponen en contacto con un tampon de hibridacion que dado el caso contiene las secuencias complementarias de las sondas. A estas se une la enzima peroxidasa de rabano picante (Horseradish peroxidase, HRP) mediante una proteina conjugada. Esta enzima pertenece al grupo de las peroxidasas y, por tanto, cataliza la oxidacion en presencia de un peroxido. Asi, la tetrametilbencidina se convierte en presencia de peroxido de hidrogeno de la forma reducida incolora (TMBH2) en la forma oxidada azul (TMB).

Los nuevos procedimientos de deteccion aqui usados se basan en esta reaccion de color enzimatica. Despues de la adicion de TMB y peroxido de hidrogeno, despues de la hibridacion se realiza la reaccion de color con un precipitado de color azul. De esta manera, el sistema puede usarse como deteccion de la hibridacion. El resultado cualitativo del ensayo puede evaluarse a simple vista (Fig. 3). La intensidad del precipitado puede evaluarse mediante escaneo de los ensayos y posterior lectura en escala de grises. De esta manera pueden sacarse conclusiones sobre la densidad de inmovilizacion, la capacidad de union y la accesibilidad de las sondas (Fig. 4). Estas dependen de las propiedades de inmovilizacion de la superficie. La union de proteinas no especifica minimizada se ilustra en un experimento adicional (Fig. 5).

La Fig. 3 muestra un ejemplo de aplicacion del diagnostico de punto de cuidado (�Point of Care�) con identificacion de secuencias especificas de una muestra compleja con minimizacion de union de proteinas no especifica. Las bandas coloreadas demuestran la inmovilizacion especifica de ADN en la muestra con una sensibilidad diagnosticamente relevante. La region sin colorear entre las bandas demuestra una union no especifica minimizada.

La Fig. 4 muestra la intensidad de senal de la inmovilizacion de ADN de la Fig. 3 en comparacion con rutas convencionales de la funcionalizacion de la superficie (MF = superficie funcionalizada fotoquimica mediante sistemas de quinoide; COR = plasma a baja presion; 3 D = motivos estructurales dendriticos para aumentar la superficie y capacidad de union maxima -actualmente el estandar de oro). La superficie de POC3.3 es una superficie segun la invencion y se deposita satisfactoriamente en comparacion con otros procedimientos de funcionalizacion.

La Fig. 5 muestra el resultado de una investigacion de las propiedades de union de la superficie funcionalizada segun la invencion con ayuda de una prueba de ELISA competitiva. Un ELISA (enzimoinmunoanalisis de adsorcion, de �Enzyme-Linked Immunosorbent Assay�) o EIA (prueba de inmunoadsorcion acoplada a enzima) se basa en una reaccion de color enzimaticamente desencadenada. Con ayuda de esta prueba pueden detectarse biomoleculas como, por ejemplo, peptidos, proteinas, virus, hormonas o toxinas. El antigeno (IgG humana) se inmoviliza por adsorcion durante la noche sobre la superficie. La solucion con antigeno en exceso se elimina en una primera etapa de lavado.

La posterior reaccion inmunoquimica se realiza segun el principio de competencia. Los anticuerpos marcados y sin marcar compiten por los sitios de union libres en los antigenos inmovilizados. La peroxidasa de rabano picante (HRP, Horseradish peroxidase) sirve aqui de enzima marcadora. Los anticuerpos sin unir en exceso se eliminan mediante una segunda etapa de lavado. El sustrato anadido en la siguiente etapa tetrametilbencidina (TMB) lo escinde la enzima HRP y se libera un colorante azul turquesa. La reaccion de color se detiene y se fija con acido sulfurico (viraje de color a amarillo). La intensidad de la reaccion de color se mide con un fotometro mediante la absorcion y asi da informacion sobre el comportamiento de union de la superficie investigada. A este respecto, alta absorcion significa alto numero de antigenos unidos y viceversa. A este respecto puede detectarse que en comparacion con cuerpos base sin funcionalizar tiene lugar una reduccion significativa de la adhesion de proteinas.

5 Los ejemplos de realizacion muestran posibles variantes de realizacion para la fabricacion del soporte segun la invencion, siendo aqui de mencionar que la invencion no se limita a las variantes de realizacion especialmente representadas de la misma, sino que mas bien tambien son posibles diversas combinaciones de las variantes de realizacion individuales entre si y esta posibilidad de variacion se encuentra dentro de la capacidad del experto que trabaja en este campo tecnico debido a las ensenanzas de la presente invencion para la actividad tecnica. Por

10 tanto, el alcance de la invencion tambien comprende todas las variantes de realizacion concebibles que son posibles por combinaciones de detalles individuales de las variantes de realizacion representadas y descritas.

El objetivo en el que se basan las soluciones inventivas independientes puede extraerse de la descripcion. 10

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Procedimiento para la modificacion al menos por zonas de una superficie de un soporte de al menos un sustrato mediante deposicion de un recubrimiento mediante polimerizacion por plasma, generandose el recubrimiento al menos por zonas con espacios libres para acomodar al menos una solucion realizandose antes de o durante la polimerizacion por plasma una activacion de la superficie del sustrato en el plasma y generandose al menos por zonas un polimero de plasma hinchable, asi como formandose mediante el recubrimiento una estructura tridimensional, caracterizado porque en la activacion se realiza un acoplamiento de potencia de 5 a 20 veces mayor que en la polimerizacion por plasma.
2.- Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque la activacion se realiza con una mezcla de reaccion que comprende un gas portador y un gas de reaccion en un reactor, siendo el gas portador un gas inerte y seleccionandose el gas de reaccion de un grupo que comprende oxigeno, amoniaco, H2, N2, CO2, C2H2.
3.- Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque entre la activacion y la polimerizacion por plasma se introduce en el reactor un gas de lavado, especialmente en la camara de reaccion.
4.- Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado porque el gas de lavado es un gas inerte.
5.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la activacion y/o la polimerizacion por plasma se realiza a un acoplamiento de potencia de un intervalo con un limite inferior de 0,1 W y un limite superior de 2500 W
6.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la activacion y/o la polimerizacion por plasma se realiza a un acoplamiento de potencia de un intervalo con un limite inferior de 2 W, especialmente 5 W, y un limite superior de 1700 W, especialmente 300 W.
7.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la activacion se realiza preferiblemente a una potencia de plasma de un intervalo con un limite inferior de 2 W y un limite superior de 2500 W y la polimerizacion por plasma a una potencia de plasma de un intervalo con un limite inferior de 0,1 W y un limite superior de 400 W.
8.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el recubrimiento se deposita por medio de plasmas pulsados.
9.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la polimerizacion por plasma se realiza mediante la adicion de al menos una especie de monomero.
10.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la adicion de la al menos una especie de monomero se realiza en forma liquida y/o en forma gaseosa.
11.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la presion durante la activacion y/o la polimerizacion por plasma se selecciona de un intervalo con un limite superior de 1,5 mbar (150 Pa), preferiblemente 0,5 mbar (50 Pa), y un limite inferior de 0,05 mbar (5 Pa), preferiblemente 0,2 mbar (20 Pa).
12.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la activacion se realiza durante un periodo de tiempo con un limite inferior de 1 min, preferiblemente, 5 min, y un limite superior de 15 min, preferiblemente 10 min.
13.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque la polimerizacion por plasma se realiza durante un periodo de tiempo con un limite inferior de 1,5 min, preferiblemente, 10 min, y un limite superior de 60 min, preferiblemente 20 min.
14.- Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el reactor, especialmente la camara de reaccion, se lava con aire despues de la polimerizacion y se ventila la camara.
15.- Uso de un soporte de al menos un sustrato que presenta al menos por zonas un recubrimiento fabricado por polimerizacion por plasma de modulos individuales que presenta al menos por zonas uno o varios espacios libres para acomodar al menos una solucion, es hinchable al menos por zonas y presenta al menos por zonas una estructura tridimensional, formando la capa hinchable una capa de hidrato para inmovilizar acidos nucleicos rechazando al mismo tiempo proteinas.
16.- Uso de un soporte segun la reivindicacion 15, caracterizado porque el recubrimiento formado presenta angulos de contacto de un intervalo con un limite inferior de 35° y un limite superior de 65° con agua como liquido de medida.
17.- Uso de un soporte segun la reivindicacion 15 o 16, caracterizado porque el recubrimiento presenta un espesor seleccionado de un intervalo con un limite inferior de 4 nm, preferiblemente 10 nm, y un limite superior de 300 nm, preferiblemente 40 nm.

5 18.- Uso de un soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque el material del sustrato esta formado preferiblemente por plastico, por un grupo que comprende un polimero a base de carbono o silicio, por un grupo que comprende poliestireno (PS), polietileno (PE), poli(tereftalato de etileno) (PET, PETP, PBTP), polipropileno (PP), poli(cloruro de vinilo) (PVC), poliamidas, nitrocelulosa, poli(metacrilato de metilo) (PMMA), estireno-acrilonitrilo (SAN), policarbonato (PC), copolimeros de cicloolefina (COC) como copolimero de

10 ciclopenteno-polietileno, copolimero de ciclohexano-polietileno, copolimero de ciclohepteno-polietileno, asi como polimeros de cicloolefina (COP) o similares, pentoxido de ditantalio, vidrio, metal o combinaciones de los mismos.
19.- Uso de un soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque el sustrato esta configurado como membrana.
20.- Uso de un soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque los modulos individuales de

15 al menos una especie de monomero se seleccionan de un grupo que comprende aminas, amidas, dialquiloxietano, presentando la especie de monomero restos de un grupo que comprende H, alquilo o arilo.
21.- Uso del soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 20 para sistemas de matrices.
22.- Uso del soporte segun una de las reivindicaciones 15 a 21 para componentes microfluidicos.