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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Bioanalyse- oder Biokulturgefäß, umfassend mindestens eine Oberfläche, die eine Funktionalbeschichtung aus polymerisiertem, insbesondere plasmapolymerisiertem, Morpholin aufweist, ein Verfahren zur Herstellung der Funktionalbeschichtung und eine Verwendung von polymerisiertem, insbesondere plasmapolymerisiertem, Morpholin als Funktionalbeschichtung von mindestens einer Oberfläche eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes.
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Biotechnologische Analyse- und Kulturverfahren sind wertvolle Hilfsmittel zur Identifikation und Untersuchung von Wirkstoffen, insbesondere pharmazeutischen Wirkstoffen zur Durchführung toxikologischer Studien oder zur Analyse von diagnostischen oder therapeutischen Verfahren. Derartige Verfahrensweisen benötigen Bioanalyse- oder Biokulturgefäße, in denen diese Verfahren durchgeführt werden können. Die Entwicklung verbesserter Bioanalyse- oder Biokulturgefäße ermöglicht die Bereitstellung verbesserter Bioanalyse- und Kulturverfahren.
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Das Auffinden von grundlegenden Zusammenhängen, insbesondere Wechselwirkungen, zwischen biologischen Organismen beziehungsweise Biomolekülen und Materialgrenzflächen sowie die Steuerung der Bioverträglichkeit und des Funktionsprofils von Materialgrenzflächen durch gezielte Grenzflächengestaltung nimmt ständig an Bedeutung zu. Die Kultivierung von biologischen Agenzien, z. B. von Zellen, Geweben, aber auch die Analyse und Inkubation von Biomolekülen, wie Proteinen, Peptiden oder Nucleinsäuren, ist häufig problematisch, da biologische Agenzien, insbesondere Zellen vielzelliger Organismen, in vivo in dreidimensionale Strukturen eingebettet sind. Sie sind daher einer Vielzahl von Umgebungssignalen physikalischer, chemischer und biochemischer Art ausgesetzt. Die Inkubation und Kultivierung derartiger biologischer Agenzien in vitro stellt daher eine komplexe Herausforderung an die Biotechnologie dar, insbesondere auch an die Entwicklung von Oberflächen von Bioanalyse- und Biokulturgefäßen. In diesem Zusammenhang wurden im Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Modifizierung, insbesondere Beschichtung, von etablierten Basismaterialien entwickelt.
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So sind Beschichtungen von Oberflächen von Bioanalyse- oder Biokulturgefäßen mit Proteinen, beispielsweise Kollagen, Fibronektin, Laminin oder Lysin bekannt. Bekannt ist es auch, die Oberflächeneigenschaften von Kulturgefäßen physikalisch oder nasschemisch zu modifizieren (Franchina et al., Macromolecules, 1991, 24(11), 3045-3049).
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Im Stand der Technik sind auch bereits funktionelle Oberflächen für die Kultivierung und/oder Immobilisierung von Biomolekülen durch die Anwendung einer Monomerpolymerisation in der Gasphase hergestellt worden. Unter anderem wurden dadurch hydrophobe oder proteinabweisende funktionelle Oberfläche zur Verfügung gestellt (Leu et al., Surf. Coat. Technol., 2003, 173-174, 928;
DE 102 11 664 A1 ). Als geeignet haben sich auch Beschichtungen mit „point of care“ herausgestellt (
EP 2 252 410 ).
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Aus
EP 2 040 077 A1 sind Morpholinderivat-beschichtete Oberflächen eines Substrats für einen Biosensor und aus
WO 2005/003405 A2 nanoskalierte Morpholin-beschichtete Teilchen zur Verwendung als Katalysator, Poliermittel oder Dieelektrikum bekannt.
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Nach wie vor besteht ein Bedarf an Bioanalyse- und Biokulturgefäßen, die eine Analyse, Inkubation und Kultivierung von biologischen Agenzien ermöglichen und eine verbesserte Interaktion der biologischen Agenzien mit der Oberfläche des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes, das heißt des Substrates, erlauben.
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Die vorliegende Erfindung beruht daher auf dem technischen Problem, Bioanalyse- und Biokulturgefäße bereitzustellen, die insbesondere die vorgenannten Nachteile überwinden, insbesondere eine verbesserte Steuerung der Wechselwirkung von biologischen Agenzien und dem Bioanalyse- oder Biokulturgefäß ermöglichen.
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Die vorliegende Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung der Lehren der unabhängigen Patentansprüche, insbesondere durch die Bereitstellung eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes mit mindestens einer Oberfläche, die eine aus polymerisiertem Morpholin aufgebaute Funktionalbeschichtung aufweist.
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Die Erfindung löst das ihr zugrundeliegende technische Problem auch durch die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung derartiger Bioanalyse- und Biokulturgefäße, durch die Verwendung von polymerisiertem Morpholin als Funktionalbeschichtung von mindestens einer Oberfläche eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes sowie durch Verfahren zur Analyse, Inkubation oder Kultivierung von einem biologischen Agens, wobei dieses in einem Bioanalyse- oder Biokulturgefäß gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wird.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Inkubation“ das Einwirkenlassen von bestimmten Umgebungsfaktoren auf ein biologisches Agens verstanden, beispielsweise der Aufenthalt in einem Kulturmedium, der Aufenthalt in einem Reaktionsmedium, ggf. unter Durchführung von Analysen und/oder Reaktionen oder chemischen, physikalischen oder biologischen Wechselwirkungen.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Bioanalysegefäß“ ein Gefäß verstanden, das bestimmungsgemäß der Analyse von biologischen Agenzien dient, beispielsweise dem Screenen von Substanzen, dem Identifizieren und Charakterisieren von Substanzen, dem Zuordnen von Funktionen zu Substanzen oder von Substanzen zu Reaktionen, dem Identifizieren und Bestimmen von Wechselwirkungen von Substanzen untereinander oder zu Oberflächen und dergleichen.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Biokulturgefäß“ ein Gefäß verstanden, in dem biologische Agenzien, insbesondere lebende biologische Agenzien, inkubiert, insbesondere kultiviert, und ggf. analysiert werden, insbesondere auch gezüchtet, vermehrt, gelagert werden.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „Bioreaktionsgefäß“ zusammenfassend für Bioanalyse- und Biokulturgefäße verwendet.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „biologischen Agens“ eine Substanz, ein Substanzengemisch, ein Virus, ein Viroid, Pilze, Sporen, Proben, z. B. Blut-, Sperma-, Speichelproben, eine Zelle, ein Zellbestandteil, ein Zellverband, ein Gewebe, ein mehrzelliger Organismus oder dergleichen verstanden. Die biologischen Agenzien können lebend oder tot sein. Insbesondere wird unter dem Begriff „Substanz“ eine Substanz verstanden, die in biologischen Systemen hergestellt, genutzt oder verbraucht wird, insbesondere ein Polymer, beispielsweise eine Polynucleotidsequenz, z. B. DNA oder RNA, ein Protein, ein Peptid, ein Antikörper, ein Antikörperfragment, Proteolipide, Lipoproteine, ein Glycoprotein, Proteoglycan oder dergleichen verstanden. Unter einer Zelle werden prokaryotische oder eukaryotische Zellen verstanden, wobei eukaryotische Zellen auch in Form von Zelllinien, primären Zellen, Stammzellen, z. B. adulte oder embryonale Stammzellen, immortalisierten Zellen oder dergleichen vorkommen können.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Morpholin“ Tetrahydro-1 ,4-oxazin verstanden.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „polymerisiertem Morpholin“ ein Polymer verstanden, das durch Polymerisation von Morpholin als Monomer hergestellt wurde. Eine derartige Polymerisation kann als radikalische Polymerisation, kationische Polymerisation, anionische Polymerisation, stereospezifische Polymerisation, Koordinationspolymerisation oder Plasmapolymerisation, insbesondere als Plasmapolymerisation ausgeführt sein. Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform die Verwendung plasmapolymerisierten Morpholins.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Oberfläche“ eines Bioreaktionsgefäßes, insbesondere Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes, eine Oberfläche eines solchen Gefäßes verstanden, die bestimmungsgemäß mit dem zu inkubierenden, insbesondere analysierenden oder kultivierenden, biologischen Agens in physikalischen Kontakt tritt, insbesondere die den Inkubations-, insbesondere Reaktions- oder Kulturraum, des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes zum Agens hin gerichtet definiert. Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, dass diese Oberfläche vollständig oder teilweise eine erfindungsgemäße Funktionalbeschichtung aufweist.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Steuerung der Wechselwirkung eines biologischen Agens mit der Oberfläche“ verstanden, dass die Funktionalbeschichtung mit dem Zweck eingesetzt wird, die Wechselwirkung des biologischen Agens mit der Oberfläche zu beeinflussen, insbesondere zu modifizieren, insbesondere wobei die Auswahl der Funktionalbeschichtung, insbesondere die Auswahl der vorliegenden Funktionalbeschichtung für das Bioreaktionsgefäß mit der Absicht erfolgt, die Wechselwirkung zwischen dem biologischen Agens und der Oberfläche zu beeinflussen, insbesondere zu modifizieren, das heißt gezielt zu steuern. Der vorliegenden Erfindung liegt daher auch als wesentliches technisches Element die Lehre und der Auswahlschritt zugrunde, eine Funktionalbeschichtung aus polymerisiertem Morpolin für den genannten Zweck einzusetzen.
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Die erfindungsgemäß der ausgewählten Funktionalbeschichtung zuzuordnende Steuerbarkeit der Wechselwirkung des biologischen Agens mit der Oberfläche kann ein Modifizieren der Wechselwirkung umfassen, kann aber auch bedeuten, dass Wechselwirkungen eines biologischen Agens mit der Oberfläche im Verlauf einer Inkubation keine Änderung erfahren, insbesondere dann, wenn üblicherweise ohne Auswahl und Einsatz der eingesetzten erfindungsgemäßen Funktionalbeschichtung eine solche Änderung der Wechselwirkung auftritt.
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Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Modifizieren“ insbesondere ein Verändern, insbesondere ein Verändern der Wechselwirkung zwischen einem biologischen Agens und der Oberfläche eines Bioreaktionsgefäßes, verstanden, insbesondere eine Reduktion oder Erhöhung des Ausmaßes der Wechselwirkung, wobei diese im Vergleich zu einer nicht mit einer Funktionalbeschichtung aus polymerisiertem Morpholin versehenen Oberfläche festgestellt wird, insbesondere im Vergleich mit einer unbeschichteten Oberfläche eines Bioreaktionsgefäßes.
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Die vorstehend genannte Reduktion oder Erhöhung des Ausmaßes der Wechselwirkung kann auch ein völliger Wegfall einer Wechselwirkung oder eine Induktion einer ohne die erfindungsgemäße Funktionalbeschichtung nicht bestehenden Wechselwirkung sein.
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Erfindungsgemäß ist das technische Problem insbesondere durch ein Bioanalyse- und Biokulturgefäß gelöst, umfassend mindestens eine Oberfläche, die eine Funktionalbeschichtung aus polymerisiertem Morpholin aufweist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioanalyse- oder Biokulturgefäß, wobei die Funktionalbeschichtung aus plasmapolymerisiertem Morpholin aufgebaut ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioanalyse- oder Biokulturgefäß, wobei das Bioanalyse- oder Biokulturgefäß eine Multiwellplatte, einen Chip- oder Arrayträger, eine Mikroplatte, eine Petrischale, eine Kontaktschale, eine Zellkulturflasche, ein Gefrier-, Reaktions-, Kultur- oder Lagerröhrchen, eine Küvette, eine Pipette, eine Rollerflasche oder eine Zellkulturschale ist.
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Erfindungsgemäß ist das technische Problem insbesondere durch ein Verfahren zur Herstellung einer mit einer Funktionalbeschichtung versehenen Oberfläche eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes gelöst, wobei in einem ersten Verfahrensschritt Morpholin und eine Oberfläche eines zu beschichtenden Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes bereitgestellt und in einem zweiten Verfahrensschritt das Morpholin in einem Polymerisationsverfahren auf der Oberfläche des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes so abgeschieden wird, dass ein Bioanalyse- oder Biokulturgefäß mit mindestens einer mit einer Funktionalbeschichtung aus polymerisiertem Morpholin versehenen Oberfläche erhalten wird.
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In besonders bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein derartiges Verfahrens, wobei das Polymerisationsverfahren ein Plasmapolymerisationsverfahren ist.
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Die vorliegenden erfindungsgemäßen Bioreaktionsgefäße können aus Kunststoff hergestellt sein, insbesondere Polystyrol, Cycloolefinpolymer, Polypropylen, Polyethylen und Polycarbonat.
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Die vorliegenden erfindungsgemäßen Bioreaktionsgefäße, das heißt das Bioanalyse- oder Biokulturgefäß, können aus Glas hergestellt sein.
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Erfindungsgemäß ist das technische Problem insbesondere durch eine Verwendung von polymerisiertem Morpholin als Funktionalbeschichtung von mindestens einer Oberfläche eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes gelöst.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei das polymerisierte Morpholin ein plasmapolymerisiertes Morpholin ist.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei durch die Funktionalbeschichtung die Wechselwirkung des biologischen Agens mit der Oberfläche gesteuert, insbesondere modifiziert wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei durch die Funktionalbeschichtung eine Kultivierung und/oder Immobilisierung eines biologischen Agens modifiziert wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei durch die Funktionalbeschichtung die biologischen und/oder chemisch-physikalischen Eigenschaften des biologischen Agens während ihrer Kultivierung und/oder Immobilisierung beibehalten werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei das biologische Agens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Geweben, Zellen, Zellbestandteile, Viren, Viroiden, Proteinen, Peptiden oder Nucleinsäuren.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei durch die Funktionalbeschichtung eine Differenzierung von undifferenzierten Zellen oder eine De- oder Redifferenzierung von differenzierten Zellen während ihrer Kultivierung und/oder Immobilisierung verhindert wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei die undifferenzierten Zellen Stammzellen und/oder primäre Zellen sind.
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Die vorliegende Erfindung betrifft in bevorzugter Ausführungsform ein erfindungsgemäßes Bioreaktionsgefäß und eine erfindungsgemäße Verwendung, wobei das Bioanalyse- oder Biokulturgefäß eine Multiwellplatte, Chip- oder Arrayträger, eine Mikroplatte, eine Petrischale, eine Kontaktschale, eine Zellkulturflasche, ein Gefrier-, Reaktions-, Kultur- oder Lagerröhrchen, eine Pipette, eine Küvette, eine Rollerflasche oder eine Zellkulturschale ist.
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Das Aufbringen einer polymerisierten, insbesondere plasmapolymerisierten, Schicht aus Morpholin auf mindestens einer Oberfläche eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht in vorteilhafter und überraschender Weise eine gezielte Grenzflächengestaltung dieses Gefäßes. Auf mindestens einer Oberfläche eines Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes aufgebrachtes polymerisiertes Morpholin ermöglicht bevorzugt eine gezielte Beeinflussung der Wechselwirkung von biologischen Agenzien mit den Materialoberflächen und damit eine gezielte Steuerung der Bioverträglichkeit der Funktionsprofile und der biologischen sowie chemisch-physikalischen Beeinflussung des biologischen Agens durch die Oberfläche. Darüber hinaus wurde überraschenderweise festgestellt, dass das auf Oberflächen aufgebrachte polymerisierte Morpholin eine gute Sterilisierbarkeit, insbesondere ohne Funktionsverlust, aufweist, was ein wesentliches Kriterium für die Bereitstellung von Bioanalyse- und Biokulturgefäßen ist.
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Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Biokulturgefäße zur Zellkultivierung eingesetzt, da sie gegenüber dem Stand der Technik eine deutliche Verbesserung aufzeigen, insbesondere eine synthetische und sterilisierbare Funktionalbeschichtung aufweisen. Die Aufbringung einer erfindungsgemäßen Funktionalbeschichtung ist wirtschaftlicher und weniger umweltbelastend als eine nasschemisch aufgebrachte Funktionalbeschichtung. In bevorzugter Ausführungsform kann das biologische Agens in einem Medium, beispielsweise einer Lösung, Suspension oder Emulsion, vorliegen, insbesondere einem Reaktions- oder Zellkulturmedium, einer wässrigen Lösung oder einer physiologischen Kochsalzlösung.
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In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass lediglich ein biologisches Agens in dem Bioreaktionsgefäß vorliegt, es kann jedoch auch vorgesehen sein, dass mindestens ein biologisches Agens, beispielsweise zwei, drei, mehr oder viele, biologische Agenzien gleichzeitig in dem Bioreaktionsgefäß vorliegen oder nacheinander hinzugegeben werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Schichtdicke der Funktionalbeschichtung so groß, dass die biologischen Agenzien allein mit der Funktionalbeschichtung wechselwirken und eine Wechselwirkung mit dem Trägermaterial des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes, auf dem die Funktionalbeschichtung aufgebracht wurde, nicht auftritt.
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In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Schichtdicke der Funktionalbeschichtung gezielt gesteuert und/oder gezielt auf der Oberfläche des Bioreaktionsgefäßes eingesetzt, das heißt eine bestimmte Dicke der Funktionalbeschichtung so ausgewählt, dass damit eine gewünschte Wechselwirkung erzielt wird. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die gezielte Einstellung der Schichtdicke der Funktionalbeschichtung zur Steuerung, insbesondere Modifikation, einer Wechselwirkung eines biologischen Agens mit einer Oberfläche eines Bioreaktionsgefäßes.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 %, bevorzugt mindestens 70 %, bevorzugt mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, bevorzugt mindestens 95 %, besonders bevorzugt 100 % der mit dem zu analysierenden oder kultivierenden biologischen Agens während der Analyse oder Kultivierung des biologischen Agens in Kontakt stehenden Oberfläche des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes die erfindungsgemäße Funktionalbeschichtung auf.
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In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Funktionalbeschichtung die einzige Funktionalbeschichtung auf der Oberfläche des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes, die bestimmungsgemäß mit dem zu analysierenden oder kultivierenden biologischen Agens in Wechselwirkung tritt, insbesondere in Form von physikalischen Kräften und/oder chemischen Bindungen.
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Das erfindungsgemäß bevorzugt zur Herstellung der Funktionsbeschichtung eingesetzte Plasmapolymerisationsverfahren ist eine spezielle Form der sogenannten CVD-Prozesse (Chemical Vapor Deposition), das heißt des chemischen Gasphasenabscheidungsverfahrens.
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Das erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzte Plasmapolymerisationsverfahren ist ein Plasma assistiertes Niederdruck- und Niedertemperatur-CVD-Verfahren. Bei diesem CVD-Verfahren wird bevorzugt ein bei einem niedrigen Druck gezündetes Plasma bei niedrigen Temperaturen, bevorzugt < 40 ℃, besonders bevorzug t von 20 bis 30 ℃ induziert. Vorteil dieser niedrigen Temperatu ren ist es, dass unterschiedlichste organische Monomere genutzt werden können, welche durch die milden Umgebungsbedingungen nicht unkontrolliert zersetzt werden. Somit ist bevorzugt eine selektivere Oberflächenchemie möglich. Ein weiterer Vorteil der niedrigen Temperaturen ist es, dass eine chemische Funktionalisierung von kunststoffbasierten Oberflächen erreicht wird, welche bei einem herkömmlichen CVD-Verfahren, das bei Temperaturen von > 100 ℃ durchg eführt wird, thermisch abgebaut werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Plasmapolymerisation mit einem nicht kontinuierlichen Plasma, insbesondere einem Plasma, gepulsten, insbesondere Plasmen, durchgeführt. Vorteilhaft ist in diesem Fall, dass eine besonders schonende Durchführung möglich ist, da durch die Nutzung gepulster Plasmen die zerstörende Fragmentierung der Monomere zusätzlich zu dem verwendeten Niederdruck- und Niedertemperatur-CVD-Verfahren noch weiter minimiert werden kann.
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Im Rahmen der erfindungsgemäß bevorzugten Plasmapolymerisierung wird dampfförmiges, monomeres Morpholin in einer Prozesskammer zunächst durch eine angelegte Hochspannung und/oder Plasma angeregt und aktiviert. Durch diese Aktivierung entstehen ionisierte Moleküle und es bilden sich unter anderem in der Gasphase erste Molekülfragmente in Form von Clustern oder Ketten aus. Die anschließende Kondensation dieser Fragmente auf der Oberfläche des Bioanalyse- oder Biokulturgefäßes, bewirkt anschließend unter Einwirkung von Temperatur, Elektronen- und lonenbeschuss die Polymerisation und somit die Bildung einer geschlossenen Funktionalbeschichtung.
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In die Prozesskammer, das heißt den Entladungsraum, werden bevorzugt keine stickstoffbasierten Trägergase wie Ammoniak oder Hydrazin eingeleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren der Plasmapolymerisierung somit frei von stickstoffbasierten Trägergasen, insbesondere Ammoniak-frei.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird Argon als Trägergas verwendet. Die Verwendung von stickstoffbasierten Trägergasen ist in einer bevorzugten Ausführungsform nicht notwendig, da das eingesetzte Monomer Morpholin alle notwendigen Funktionalitäten für die Funktionalbeschichtung bereits aufweist.
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Ein Verfahren zur Herstellung plasmapolymerisierten Morpholins wird in Hirotsu, J. Macromol. Sci.-Chem. A15(4), Seiten 633 bis 641 (1981) beschrieben.
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Die Struktur des entstehenden plasmapolymerisierten Morpholins ist vergleichbar mit stark vernetzten Polymeren. Es bildet sich bevorzugt ein weitgehend statistisch verteiltes, kovalent gebundenes, dreidimensionales Polymer aus. Eine Abscheidung von kettenförmigen Polymeren ist durch eine Plasmapolymerisation im Gegensatz zu anderen im Stand der Technik gekannten Polymerisationsarten nicht möglich.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Funktionalbeschichtung gemäß der vorliegenden Erfindung nach dem Sterilisationsverfahren mit einer Energiedosis von bevorzugt 8 bis 20 kGy unverändert im Vergleich zur Funktionalbeschichtung vor einem Sterilisationsverfahren.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt eine oder mehrere erfindungsgemäße Ausführungsformen mit einer oder mehreren bevorzugten Ausführungsformen kombinierbar.
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Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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Die folgenden Beispiele und die dazugehörigen Figuren erläuteren die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
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Die 1 zeigt die IR-Spektren von Zellkulturschalen (Träger), die mit einer aus plasmapolymerisiertem Morpholin hergestellten nicht-sterilisierten Funktionalbeschichtung überzogen wurden gemäß den Ausführungsbeispielen 1 und 2 und von einer Referenz-Zellkulturschale. Als Referenz-Zellkulturschale dient eine unbehandelte, das heißt keine Funktionalbeschichtung aufweisende Zellkulturschale.
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Die 2 zeigt, dass die Struktur der aufgebrachten Funktionalbeschichtung nach der Sterilisierung (steril) im Vergleich zu deren Zustand vor der Sterilisierung (unsteril) im Wesentlichen unverändert bleibt und die erfindungsgemäße Funktionalbeschichtung daher eine Sterilisierung gemäß dem Stand der Technik ohne weiteres übersteht. Als Referenz dient eine aus dem Stand der Technik bekannte Funktionalbeschichtung.
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Beispiele
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1. Herstellung der Funktionalbeschichtung
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1.1 Ausführungsbeispiel 1 (Versuch 1)
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Argon 5.6 und Morpholin werden wie vom Hersteller bezogen eingesetzt. Die Funktionalbeschichtung wird auf Trägern aus Polysterol, Cycloolefinpolymer und/oder Glas aufgebracht. Diese Träger werden in der Reaktionskammer platziert und der Druck auf 0,3 mbar reduziert. Durch die Zugabe von Argon und Morpholin über eine Verdampferflasche wird der Druck auf 0,5 mbar erhöht und die Plasmapolymerisation bei einer Leistungsstufe von 2 Watt für 10 Minuten durchgeführt.
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1.2 Ausführungsbeispiel 2 (Versuch 2)
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Argon 5.6 und Morpholin werden wie vom Hersteller bezogen eingesetzt. Die Funktionalbeschichtung wird auf Trägern aus Polysterol, Cycloolefinpolymer und/oder Glas aufgebracht. Diese Träger werden in der Reaktionskammer platziert und der Druck auf 0,3 mbar reduziert. Durch die Zugabe von Argon und Morpholin über eine Verdampferflasche wird der Druck auf 0,5 mbar erhöht und die Plasmapolymerisation bei einer Leistungsstufe von 50 Watt für 15 Minuten durchgeführt.
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2. Durchführung einer Zellkultivierung
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Die Zellen HEK 293 wurden in serumhaltigem Medium kultiviert, abtrypsiniert, abzentrifugiert und in serumfreies Medium (RPMI-1640; Roswell Park Memorial Institute Medium) umgesetzt. Es wurde eine Zellsuspension in serumfreiem Medium hergestellt. Die gemäß den Ausführungsbeispielen 1 und 2 hergestellten Träger (mit/ohne Sterilisation) und der Referenzträger, ein aus dem Stand der Technik bekannter Träger mit Funktionalbeschichtung, wurden jeweils mit einer Zellsuspension angeimpft.
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Diese Träger wurden 2 Tage bei 37 ℃ und 5% CO2 inkubiert.
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Die Zellen wurden anschließend mit Kristallviolett gefärbt. Nach dem Trocknen wurde bei 590 nm im Photometer (Safire, Tecan) die optische Dichte (OD) bestimmt. Die optische Dichte (OD) verändert sich mit der vorhandenen Zellzahl.
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Gemäß 2 ist klar erkennbar, dass sich der gemessene OD-Wert bei einer sterilisierten und einer nicht-sterilisierten erfindungsgemäßen Funktionalbeschichtung nicht unterscheidet. Dies bedeutet, dass sich die erfindungsgemäße Funktionalbeschichtung durch das Sterilisationsverfahren nicht verändert hat. Darüber hinaus wird auch eine deutlich verbesserte Kultivierung von Zellen gegenüber der Referenz gezeigt.
