JP2008008721A - 生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 - Google Patents
生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008008721A JP2008008721A JP2006178503A JP2006178503A JP2008008721A JP 2008008721 A JP2008008721 A JP 2008008721A JP 2006178503 A JP2006178503 A JP 2006178503A JP 2006178503 A JP2006178503 A JP 2006178503A JP 2008008721 A JP2008008721 A JP 2008008721A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- physiologically active
- active substance
- solid phase
- immobilizing
- phase carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【解決手段】プラスチックからなる固相担体の固相表面に、ホスホリルコリン基を有する高分子物質及び生理活性物質を固定化する為の分子を有し、該分子がビオチン又はビオチン誘導体と反応しうる分子であることを特徴とする生理活性物質固定化用固相担体であり、好ましくは生理活性物質を固定化する為の分子がアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジンである生理活性物質固定化用固相担体。
【選択図】 なし
Description
糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多く,生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は細胞間情報伝達,タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
(1)プラスチックからなる固相担体の固相表面に、ホスホリルコリン基を有する高分子物質及び生理活性物質を固定化する為の分子を有し、該分子がビオチン又はビオチン誘導体と反応しうる分子であることを特徴とする生理活性物質固定化用固相担体。
(2)固相担体の形態が、平板状基板、マイクロウェルプレート、微細流路を有する基板、又はマイクロビーズである(1)記載の生理活性物質固定化用固相担体。
(3)前記ホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である(1)又は(2)記載の生理活性物質固定化用固相担体。
(4)生理活性物質を固定化する為の分子がアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジンである(1)〜(3)いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体。
(5)生理活性物質を固定化する為の分子が、固相担体表面に導入されたビオチン又はビオチン誘導体に結合していることを特徴とする(1)〜(4)いずれか記載の生理活性物質固定化用担体。
(6)生理活性物質を固定化する為の分子を固相担体表面に固定化する為のビオチン又はビオチン誘導体が、固相担体にあらかじめ導入された官能基と共有結合していることを特徴とする(5)記載の生理活性物質固定化用担体。
(7)生理活性物質を固定化する為の分子が、固相担体にあらかじめ導入された官能基と共有結合していることを特徴とする(1)〜(4)いずれか記載の生理活性物質固定化用担体。
(8)生理活性物質を固定化する為の分子が、固相担体に吸着していることを特徴とする(1)〜(4)いずれか記載の生理活性物質固定化用担体。
(9)前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも1種である(1)〜(8)いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体。
(10)(1)〜(9)いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体に生理活性物質を固定化した固相担体。
(11)前記生理活性物質が、糖鎖、複合糖質、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチド、及び脂質から選択された少なくとも1種である(10)記載の固相担体。
(12)前記生理活性物質がビオチン又はビオチン誘導体が導入されたものである(10)又は(11)記載の固相担体。
(13)(1)〜(9)いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法であって、
(a)固相表面に生理活性物質を固定化する工程、
(b)該生理活性物質と特異的に反応する別の物質を作用させる工程、及び
(c)該生理活性物質と特異的に反応した別の物質又は特異的に反応した該生理活性物質を蛍光、発光又は発色を用いて検出する工程、を含む生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
(14)前記生理活性物質と特異的に反応する別の物質が、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチド、糖鎖、複合糖質、及び脂質から選択された少なくとも1種である(13)記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
(15)前記生理活性物質と特異的に反応する別の物質が、蛍光、発光、発色で検出可能な分子である(13)又は(14)記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
(16)前記生理活性物質と特異的に反応する別の物質が、蛍光、発光、発色で検出可能な分子と反応しうる物質である(13)〜(15)いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
本発明に使用するホスホリルコリン基を有する高分子物質は、ホスホリルコリン基を有する単量体を重合して得られる高分子物質であることが好ましい。更にホスホリルコリン基以外に他の官能基や分子を含んでもよく、ホスホリルコリン基を有する単量体とブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体が好ましい。
本発明の生理活性物質固定化用固相担体の製造方法の工程の一例を下記に示す。
(a)プラスチック固相担体を準備する。
プラスチック固相担体表面は、プラズマ処理等によりカルボキシル基、水酸基、アミノ基等の官能基が表面に導入されていることが好ましい。
(b)生理活性物質を固定化する分子を導入する為、予め別の分子を導入する。
別の分子はビオチン又はビオチンヒドラジド等のビオチン誘導体であることが好ましい。例えばビオチンヒドラジドを使用した場合、プラスチック固相担体表面のカルボキシル基等と共有結合する。
(c)ホスホリルコリン基を有する高分子物質を塗布する。
(d)生理活性物質を固定化するための分子を導入する。
該分子は、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンであることが好ましい。これらのアビジン系分子は、予め導入されたビオチン系分子と結合する。
本発明の固相担体は、固相材質がプラスチックであることを特徴とする。
プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂を用いることができるが、熱可塑性樹脂の方が製造効率の観点から好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、例えばポリエチレンやポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等が挙げられる。耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα―オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
これら樹脂は単独で用いてもよく、2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、樹脂成分以外に繊維状、球状その他の形状を有する無機物あるいは有機物充填材、または各種添加剤成分を含んでもよい。
固相担体の形状としては、平板状基板、マイクロウェルプレート、マイクロビーズ、微細流路形状を有した基板等が挙げられる。
マイクロビーズ表面に生理活性物質を固定化させた担体の場合、基板やプレートに固定化させた場合に比べ生理活性物質を固定化できる表面積が大幅に増加するため、結果的に多くの検出目的となる、生理活性物質と特異的に反応する物質を捕獲でき、S/N比の増加が可能となる。
また微細流路内に生理活性物質を固定化した場合、生理活性物質が検出目的となる物質を捕獲できる頻度が相対的に増加するため、反応時間の短縮ができる。
さらには、生理活性物質を固定化したマイクロビーズを微細流路内に封入した場合、前記の利点の両方が達成できる。
本発明において生理活性物質を固相上に固定化する際には、生理活性物質を溶解又は分散させた液体を付着する方法が好ましい。生理活性物質を溶解又は分散した液体のpHは6.0〜8.0であることが好ましく、pH6.5〜7.5がより好ましい。この範囲外だと、生理活性物質や生理活性物質を固定化する分子が変性・分解する恐れがある。
生理活性物質付着後は、固相表面のホスホリルコリン基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、生理活性物質と反応しうる別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。しかし、生理活性物質と反応しうる別の物質に固相表面の分子と反応しうるビオチン又はビオチン誘導体が含まれる場合、生理活性物質を固定化した以外の固相表面に残存する分子の不活性化処理を、ビオチン又はビオチン誘導体を有する他の化合物で行うことが好ましい。
固定化する生理活性物質にビオチン又はビオチン誘導体を導入する事で、基材表面に固定化された分子によって、効果的に目的の生理活性物質を固定化する事が可能となる。より反応性を高める為に、ビオチン又はビオチン誘導体の導入位置は生理活性物質の末端や外側であることが望ましい。生理活性物質の合成法が進歩してきた事で、任意の位置にビオチン又はビオチン誘導体を導入できるようになってきており、生理活性を発現する為に重要な部位に影響を及ぼさないような位置で生理活性物質を担体表面に固定化することが可能である。
(a)生理活性物質固定化用固相担体を準備する。
固相担体表面には生理活性物質を固定化するための分子としてアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンが導入されていることが好ましい。
(b)生理活性物質(A)を固定化する。
生理活性物質(A)は、予めビオチン又はビオチン誘導体が導入されていることが好ましい。
(c)生理活性物質(A)と特異的に反応する別の物質(B)を作用させる。
別な物質(B)は、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチド、糖鎖、複合糖質、及び脂質から選択された少なくとも1種であることが好ましい。
(d)生理活性物質(A)と特異的に反応した別の物質(B)、又は特異的に反応した生理活性物質(A)を蛍光、発光又は発色を用いて検出する。
これにより、生理活性物質(B)を検出することが出来る。
(実施例)
表面にカルボキシル基が直接結合した、ポリスチレン樹脂製の96ウェルマイクロプレート(住友ベークライト製 ELISA用プレートカルボ MS-8796F)を用いた。純水を用いて調製した10mg/mlのWSC溶液100mlを各ウェルに添加し、37℃で4時間反応させた。純水でウェルを洗浄し、リン酸緩衝液を用いて200mg/mlに希釈し、pHが5.8に調整されたビオチンヒトラジド溶液100mlをウェルに添加して、37℃で一晩静置してビオチンを担体表面に固定化させた後に、純水で洗浄を行った。その後、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート共重合体の0.3重量%エタノール溶液100ml加え、30分静置した。溶液を回収しウェルを風乾した後に、0.05%TritonX-100含有リン酸緩衝液で3回洗浄した。5.0mg/mlに希釈したストレプトアビジン(ケミコン社製、SA101)100mlをウェルに添加して1時間静置してストレプトアビジンを固定化した。プレートを乾燥させた後に0.05%TritonX-100含有リン酸緩衝液で3回洗浄した。市販のビオチン標識ペルオキシダーゼ(ZYMED Laboratories社製、43−2040)をPBS(−)で0.5mg/mlに希釈して、ストレプトアビジンを固定化したウェルと固定化していないウェルにそれぞれ100ml添加して30分静置して固定化し酵素標識した。また同時に、市販のペルオキシダーゼ標識抗体(DAKO社製、P0260)をPBS(−)で0.5mg/mlに希釈して、ストレプトアビジンを固定化したウェルに100ml添加して30分静置した。0.05%TritonX-100含有リン酸緩衝液で3回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト社製 ML−1120T)を用いて、過酸化水素を基質とする発色反応を行い、発色基質として用いたTMBZ(3,3’,5,5’テトラメチルベンチジン)の吸光度を測定した。ストレプトアビジンを固定化したウェルにビオチン標識ペルオキシダーゼを加えたウェルの吸光度をシグナル値、ストレプトアビジンを固定化していないウェルにビオチン標識ペルオキシダーゼを加えたウェルの吸光度をバックグラウンド値(A)、ペルオキシダーゼ標識抗体を加えたウェルの吸光度をバックグラウンド値(B)として、その際のシグナル値、バックグラウンド値(A)(B)を表1に示す。各工程の概略を表2に示す。
表面にカルボキシル基が直接結合した、ポリスチレン樹脂製の96ウェルマイクロプレート(住友ベークライト製 ELISA用プレートカルボ MS-8796F)を用いた。純水を用いて調製した10mg/mlのWSC溶液100mlを各ウェルに添加し、37℃で4時間反応させた。純水でウェルを洗浄し、リン酸緩衝液を用いて200mg/mlに希釈し、pHが5.8に調整されたビオチンヒトラジド溶液100mlをウェルに添加して、37℃で一晩静置してビオチンを担体表面に固定化させた後に、純水で洗浄を行った。その後、5.0mg/mlに希釈したストレプトアビジン(ケミコン社製、SA101)100mlをウェルに添加して1時間静置してストレプトアビジンを固定化した。プレートを乾燥させた後に0.05%TritonX-100含有リン酸緩衝液で3回洗浄した。市販のビオチン標識ペルオキシダーゼ(ZYMED Laboratories社製、43−2040)をPBS(−)で0.5mg/mlに希釈して、ストレプトアビジンを固定化したウェルと固定化していないウェルにそれぞれ100ml添加して30分静置して固定化し酵素標識した。また同時に、市販のペルオキシダーゼ標識抗体(DAKO社製、P0260)をPBS(−)で0.5mg/mlに希釈して、ストレプトアビジンを固定化したウェルに100ml添加して30分静置した。0.05%TritonX-100含有リン酸緩衝液で3回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ用発色キット(住友ベークライト社製 ML−1120T)を用いて、過酸化水素を基質とする発色反応を行い、発色基質として用いたTMBZ(3,3’,5,5’テトラメチルベンチジン)の吸光度を測定した。ストレプトアビジンを固定化したウェルにビオチン標識ペルオキシダーゼを加えたウェルの吸光度をシグナル値、ストレプトアビジンを固定化していないウェルにビオチン標識ペルオキシダーゼを加えたウェルの吸光度をバックグラウンド値(A)、ペルオキシダーゼ標識抗体を加えたウェルの吸光度をバックグラウンド値(B)として、その際のシグナル値、バックグラウンド値(A)(B)を表1に示す。各工程の概略を表3に示す。
実施例と比較例のバックグラウンド値(B)を比べると、比較例ではペルオキシダーゼ標識抗体が非特異吸着しているのに対して、実施例はペルオキシダーゼ標識抗体の非特異吸着を効果的に抑制している事が分かる。またシグナル値とバックグラウンド値(A)とを比較すると、固定化したストレプトアビジンの効果により、ビオチン標識ペルオキシダーゼが固定化されていることが分かる。
Claims (16)
- プラスチックからなる固相担体の固相表面に、ホスホリルコリン基を有する高分子物質及び生理活性物質を固定化する為の分子を有し、該分子がビオチン又はビオチン誘導体と反応しうる分子であることを特徴とする生理活性物質固定化用固相担体。
- 固相担体の形態が、平板状基板、マイクロウェルプレート、微細流路を有する基板、又はマイクロビーズである請求項1記載の生理活性物質固定化用固相担体。
- 前記ホスホリルコリン基が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項1又は2記載の生理活性物質固定化用固相担体。
- 生理活性物質を固定化する為の分子がアビジン又はストレプトアビジン又はニュートラアビジンである請求項1〜3いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体。
- 生理活性物質を固定化する為の分子が、固相担体表面に導入されたビオチン又はビオチン誘導体に結合していることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の生理活性物質固定化用担体。
- 生理活性物質を固定化する為の分子を固相担体表面に固定化する為のビオチン又はビオチン誘導体が、固相担体にあらかじめ導入された官能基と共有結合していることを特徴とする請求項5記載の生理活性物質固定化用担体。
- 生理活性物質を固定化する為の分子が、固相担体にあらかじめ導入された官能基と共有結合していることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の生理活性物質固定化用担体。
- 生理活性物質を固定化する為の分子が、固相担体に吸着していることを特徴とする請求項1〜4いずれか記載の生理活性物質固定化用担体。
- 前記プラスチックがポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、及びそれらの共重合体よりなる群より選択された少なくとも1種である請求項1〜8いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体。
- 請求項1〜9いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体に生理活性物質を固定化した固相担体。
- 前記生理活性物質が、糖鎖、複合糖質、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチド、及び脂質から選択された少なくとも1種である請求項10記載の固相担体。
- 前記生理活性物質がビオチン又はビオチン誘導体が導入されたものである請求項10又は11記載の固相担体。
- 請求項1〜9いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法であって、
(a)固相表面に生理活性物質を固定化する工程、
(b)該生理活性物質と特異的に反応する別の物質を作用させる工程、及び
(c)該生理活性物質と特異的に反応した別の物質又は特異的に反応した該生理活性物質を蛍光、発光又は発色を用いて検出する工程、を含む生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。 - 前記生理活性物質と特異的に反応する別の物質が、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、ペプチド、糖鎖、複合糖質、及び脂質から選択された少なくとも1種である請求項13記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
- 前記生理活性物質と特異的に反応する別の物質が、蛍光、発光、発色で検出可能な分子である請求項13又は14記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
- 前記生理活性物質と特異的に反応する別の物質が、蛍光、発光、発色で検出可能な分子と反応しうる物質である請求項13〜15いずれか記載の生理活性物質固定化用固相担体の使用方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006178503A JP2008008721A (ja) | 2006-06-28 | 2006-06-28 | 生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006178503A JP2008008721A (ja) | 2006-06-28 | 2006-06-28 | 生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008008721A true JP2008008721A (ja) | 2008-01-17 |
Family
ID=39067070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006178503A Pending JP2008008721A (ja) | 2006-06-28 | 2006-06-28 | 生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2008008721A (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002153272A (ja) * | 2000-11-24 | 2002-05-28 | Inst Of Physical & Chemical Res | 生体分子マイクロアレイ |
JP2005037331A (ja) * | 2003-07-18 | 2005-02-10 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 生体由来物検出用基板及びその製造方法 |
-
2006
- 2006-06-28 JP JP2006178503A patent/JP2008008721A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002153272A (ja) * | 2000-11-24 | 2002-05-28 | Inst Of Physical & Chemical Res | 生体分子マイクロアレイ |
JP2005037331A (ja) * | 2003-07-18 | 2005-02-10 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 生体由来物検出用基板及びその製造方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20190285623A1 (en) | Detection and assay devices and methods of making and using the same | |
Sola et al. | Synthesis of clickable coating polymers by postpolymerization modification: applications in microarray technology | |
EP2339342A2 (en) | Biomaterial structure, method of producing the same and uses thereof | |
Sung et al. | Toward immunoassay chips: Facile immobilization of antibodies on cyclic olefin copolymer substrates through pre-activated polymer adlayers | |
JP4530895B2 (ja) | ペプチド固定化用固相担体及びその使用方法 | |
Ma et al. | Fabricating a cycloolefin polymer immunoassay platform with a dual-function polymer brush via a surface-initiated photoiniferter-mediated polymerization strategy | |
Dyukova et al. | Hydrogel glycan microarrays | |
Moschallski et al. | Printed protein microarrays on unmodified plastic substrates | |
ES2377349T3 (es) | Modificación de la superficie | |
JP4706533B2 (ja) | 生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 | |
Herrmann et al. | Bioorthogonal in situ hydrogels based on polyether polyols for new biosensor materials with high sensitivity | |
Qi et al. | Facile surface functionalization of cyclic olefin copolymer film with anhydride groups for protein microarray fabrication | |
JP2004198402A (ja) | マイクロアレイ及びその製造方法 | |
JP4197279B2 (ja) | 生体由来物検出用基板及びその製造方法 | |
JP4534817B2 (ja) | 蛋白質の検出方法及びペプチドの検出方法 | |
JP2008008721A (ja) | 生理活性物質固定化用固相担体及びその使用方法 | |
JP5614179B2 (ja) | 医療材料用高分子化合物および該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 | |
JP2007279028A (ja) | 孔を有する生体物質構造体及びその製造方法、並びに、それを用いた生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及びセンサーチップ | |
US20070154888A1 (en) | Method for the covalent immobilization of probe biomolecules on organic surfaces | |
JP2007121278A (ja) | 分析チップおよび分析方法 | |
US20060084159A1 (en) | Method for manufacturing of three dimensional composite surfaces for microarrays | |
JP2008215894A (ja) | 蛋白質の検出方法及びペプチドの検出方法 | |
WO2005036171A1 (en) | Method and system for detection of a target analyte | |
Tanaka et al. | Porous Protein‐Based Nanoparticle Hydrogel for Protein Chips with Improved Sensitivity | |
JP2004198260A (ja) | 固相担体およびその利用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20081110 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
A977 | Report on retrieval |
Effective date: 20100826 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20100831 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20101101 |
|
A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20110215 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |