ES2372391A1 - Método de diagnóstico de la enfermedad de farber. - Google Patents
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Abstract
Método de diagnóstico de la enfermedad de
Farber.
La presente invención se refiere a una familia
de compuestos con un núcleo estructural de derivados de aminoalcohol
y a su uso para la detección de la enfermedad de Farber aplicando un
método de diagnóstico fuera del cuerpo humano en el que se emplean
dichos compuestos unidos a un fluoróforo, cromóforo o luminóforo
como sustratos de la enzima ceramidasa ácida, cuya funcionalidad se
encuentra disminuida en pacientes con dicha enfermedad. Además la
presente invención se refiere a un kit que comprende al menos uno de
estos compuestos para utilizar en el diagnóstico de la enfermedad a
partir de una muestra biológica aislada de un individuo.
Description
Método de diagnóstico de la enfermedad de
Farber.
La presente invención se refiere a una familia
de compuestos con un núcleo estructural de derivados de aminoalcohol
y a su uso para la detección de la enfermedad de Farber aplicando un
método de diagnóstico fuera del cuerpo humano en el que se emplean
dichos compuestos unidos a un fluoróforo, cromóforo o luminóforo
como sustratos de la enzima ceramidasa ácida, cuya funcionalidad se
encuentra disminuida en pacientes con dicha enfermedad. Por tanto la
presente invención se engloba dentro de la química y más
específicamente de la química aplicada al diagnóstico de
enfermedades y la determinación de actividades enzimáticas.
\vskip1.000000\baselineskip
La enfermedad de Farber, también llamada
lipogranulomatosis, es un desorden hereditario de almacenamiento de
lípidos caracterizado por una acumulación de ceramidas en los
lisosomas, debido a una carencia de la actividad enzimática que la
degrada, la ceramidasa ácida. Esta enfermedad presenta una tríada de
síntomas comunes: inflamación de las articulaciones, nódulos
subcutáneos y ronquera. Algunas veces pueden aparecer
hepatoesplenomegalia y malfuncionamiento del sistema nervioso. Se
trata de una enfermedad muy grave en la que los pacientes mueren
generalmente antes de los dos años de edad (Levade T, Sandhoff K,
Schulze H, Medin JA. Acid ceramidase deficiency: Farber
lipogranulomatosis (2009) in D. Valle et al. (eds): Scriver's
OMMBID (Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease),
New York, McGraw-Hill).
Actualmente, el diagnóstico de la enfermedad de
Farber se realiza básicamente por tres tipos de métodos:
- i)
- Determinación de la actividad ceramidasa ácida. Esto se ha realizado principalmente utilizando N-oleoil o N-lauroil esfingosinas marcadas radioactivamente sobre homogeneizados celulares. Estos sustratos se caracterizan por ser muy poco solubles y los ensayos deben realizarse en el seno de mezclas complejas de detergentes. Además, la separación y cuantificación de productos suponen un proceso largo y tedioso: extracción de lípidos, migración por cromatografía de capa fina (CCF), lectura de las placas en un radiochromatoscanner para la identificación de los productos y posterior separación de la sílice del soporte y cuantificación por centelleo líquido. Otro inconveniente de estos ensayos es que estas ceramidas pueden ser degradadas por otras ceramidasas no lisosomales, que no son deficientes en la enfermedad de Farber.
- ii)
- Loading tests o tests de carga. Estos consisten en la adición directa de esfingolípidos marcados radioactivamente al medio de cultivo celular, para el posterior análisis de su metabolismo. Las moléculas utilizadas en estos tests han sido la ceramida, el cerebrósido sulfato y la esfingomielina. Esta última ha demostrado ser la más adecuada para este fin puesto que las otras moléculas son metabolizadas parcialmente o casi totalmente por enzimas no lisosomales, mientras que la esfingomielina se dirige principalmente al lisosoma. Así pues, en este compartimento la esfingomielina es degradada a ceramida y mediante el estudio de los perfiles lipídicos se puede observar una potencial acumulación de este lípido en células de enfermos de Farber. El análisis de estos perfiles requiere el mismo proceso de separación y cuantificación que el método anterior, pero este test presenta la ventaja de necesitar menos cantidad de material biológico. Los inconvenientes de estos test son que estas moléculas radioactivas no están disponibles comercialmente y que las moléculas pueden ser degradadas parcialmente por enzimas no lisosomales.
- iii)
- Cuantificación de los niveles de ceramida. Estos métodos tienen como objetivo medir la acumulación de ceramida que se produce en los lisosomas de las células de enfermos de Farber. Algunos autores han utilizado la derivatización de la ceramida, presente en fluidos corporales o tejidos, para dar lugar a moléculas que pueden ser detectadas, separadas y cuantificadas por cromatografía líquida (HPLC) o de gases (GCL) acoplada a detector de masas (MS). Otro método conocido para medir el almacenamiento de ceramida utiliza el enzima diacilglicerol quinasa (DAGk). Este enzima, además de fosforilar el diacilglicerol, tiene una gran afinidad por la ceramida. Aprovechando esto, la ceramida presente en el extracto lipídico se hace reaccionar con la DAGk en presencia de [^{32}P]-\gamma-ATP, para dar lugar a ceramida-1-fosfato. La fase orgánica de esta reacción se hace migrar por CCF y la placa se expone a una película fotográfica o directamente se visualiza en un escáner que detecta el [^{32}P]. La ceram ida-1-fosfato producida refleja la cantidad de ceramida acumulada en los lisosomas de las células. La ventaja de este método es que tanto el ATP radioactivo como el enzima están disponibles comercialmente, pero el ensayo es largo y laborioso.
\vskip1.000000\baselineskip
Así pues, los métodos existentes para el
diagnóstico de la enfermedad de Farber utilizan en su mayoría
moléculas radioactivas y tienen en común la complejidad de la
extracción y separación de lípidos para su análisis, ya sea por CCF,
HPLC o GLC. Todas estas desventajas hacen que el diagnóstico de la
enfermedad de Farber esté reservado a un número limitado de
laboratorios especializados.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención describe una serie de
compuestos y un método para determinar si un individuo padece la
enfermedad de Farber que está basado en la hidrólisis enzimática de
estos compuestos que son sustrato de la enzima ceramidasa ácida,
enzima implicada en las disfunciones que provocan los síntomas de
dicha enfermedad.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un compuesto de fórmula (I)
\vskip1.000000\baselineskip
donde
R_{1} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{24}, alquenilo
C_{2}-C_{24}, alquinilo
C_{2}-C_{24} o un grupo
-R_{2}-Y-R_{3}, donde
Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O),
S(O_{2}), C(O), NHC(O), C(O)NH,
C(O)O, OC(O),
R_{2}, se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{a}, alquenilo
C_{2}-C_{a}, alquinilo
C_{2}-C_{a},
R_{3} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{b}, alquenilo
C_{2}-C_{b}, alquinilo
C_{2}-C_{b}, siendo a+b\leq24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo,
con la condición de que cuando X es umbeliferona
y m es 2, R_{1} es distinto de
-(CH_{2})_{14}CH_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "alquilo" se refiere, en la
presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales
o ramificadas, que tienen de 1 a 24 átomos de carbono,
preferiblemente de 10 a 12, y que se unen al resto de la molécula
mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo, n-butilo,
terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo,
n-hexilo, decilo, dodeciloetc. Los grupos alquilo
pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes
tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo,
carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonil, amino, nitro, mercapto y
alquiltio.
El término "alquenilo" se refiere a
radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que
contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles,
por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo,
2-butenilo, 1,3-butadienilo etc. Los
radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno
o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo,
carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro,
mercapto y alquiltio.
El término "alquinilo" se refiere a
radicales de cadenas hidrocarbonada, lineal o ramificada, que tiene
uno o más triples enlaces carbono-carbono y que está
unido al resto de la molécula por un enlace simple por ejemplo,
etinilo, 1-propinilo, etc. El grupo alquinilo puede
estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes tales
como halógeno, hidroxilo, azido, alcoxilo, carboxilo, ciano,
carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y
alquiltio.
"Fluoróforo" se refiere a un grupo químico
de pequeño tamaño que forma parte de una molécula mayor, el cual
puede ser excitado por la luz para emitir fluorescencia. En algunas
realizaciones, los fluoróforos producen fluorescencia eficientemente
por excitación con luz de longitud de onda desde unos 200 nanómetros
a unos 800 nanómetros. La intensidad y la longitud de onda de la
radiación emitida dependen del fluoróforo y del entorno químico del
mismo. El fluoróforo puede ser seleccionado, sin limitación, de
entre acridina, antracenos, aloficocianina, BODIPY, cianinas,
cumarinas, fluorescamina, fluoresceina, FAM (carboxifluoresceina),
HEX (hexaclorofluoresceina), JOE
(6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxi-fluoresceina),
Oregon Green, ficocianina, ficoeritirina, rodamina, ROX
(carboxi-X-rodamina), TAMRA
(carboxitetrametilrodamina), TET
(tetracloro-fluoresceina), Texas red,
tetrametilrodamina y xanthinas.
"Luminóforo" se refiere a un átomo o grupo
químico que emite luz que no deriva del aumento de temperatura, y
puede estar causada por cambios químicos, bioquímicos o
cristalográficos. El luminóforo puede ser seleccionado, sin
limitación, de entre rodol, rodamina, resorufína o derivados de los
mismos.
"Cromóforo" se refiere a un grupo químico
que absorbe energía de excitación y la emite en un rango de
longitudes de onda que produce color. El cromóforo puede ser
seleccionado, sin limitarse a, arstocianinas, carotenos, licopenos,
colorantes azoicos, fotocromos etc.
Preferiblemente, m es un valor entre 2 y 4. Más
preferiblemente m es 2.
Preferiblemente, R_{1} es un alquilo
-(CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n es un valor entre 1 y 24.
Más preferiblemente n es 10.
Preferiblemente X es umbeliferona. La
umbeliferona o 7-hidroxicumarina es un compuesto
orgánico derivado de la cumarina por sustitución de su átomo de
hidrógeno en posición 7 por un grupo hidroxilo, que tiene la
siguiente estructura:
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere a un método de diagnóstico para determinar si un individuo
padece la enfermedad de Farber que comprende:
- a)
- obtención de una muestra biológica aislada del individuo,
- b)
- adición de un compuesto de fórmula (I):
- donde
- R_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{24}, alquenilo C_{2}-C_{24}, alquinilo C_{2}-C_{24} o un grupo -R_{2}-Y-R_{3}, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O_{2}), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O), R_{2}, se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{a}, alquenilo C_{2}-C_{a}, alquinilo C_{2}-C_{a}, R_{3} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{b}, alquenilo C_{2}-C_{b}, alquinilo C_{2}-C_{b}, siendo a+b\leq24,
- m es un valor entre 1 y 10,
- X es un grupo fluorogénico, cromogénico o luminogénico a la muestra obtenida en (a),
- c)
- incubación de la mezcla obtenida en (b)
- d)
- oxidación de la mezcla obtenida en (c)
- e)
- detección de la señal (fluorescencia, color o luminiscencia) emitida en la mezcla obtenida en (d).
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, R_{1} es un
alquilo -(CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n es un valor entre
1 y 24.
En una realización más preferida, n es 10.
En otra realización preferida, m es un valor
entre 2 y 4. En una realización más preferida, m es 2.
En una realización preferida, X es
umbeliferona.
En una realización preferida, la etapa (c) de
incubación se puede detener mediante la adición de metanol seguida
de una oxidación que puede ser realizada añadiendo mezclas oxidantes
conocidas, tal como, pero sin limitarse a, NaIO_{4} disuelto en
disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6.
Preferiblemente, la muestra obtenida en la etapa
(a) es un fluido corporal y más preferiblemente, el fluido es
sangre. De la sangre se pueden extraer leucocitos y linfocitos
mediante técnicas conocidas y realizar las modificaciones requeridas
para utilizar estos extractos para la realización del método
descrito.
Preferiblemente, la muestra obtenida en la etapa
(a) es tejido epitelial. La obtención de la muestra de tejido y de
las células se realiza por métodos estándar conocidos por cualquier
experto en la materia.
En una realización preferida, el tiempo de
incubación en el paso (c) es entre 0,5 y 5 horas.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico
de la enfermedad de Farber que comprende la comparación de los datos
obtenidos mediante el método según se ha descrito anteriormente con
una muestra control.
El método de detección de la enfermedad de
Farber descrito en la presente invención se basa en una reacción
enzimática de hidrólisis sobre un compuesto de fórmula (I) como se
ha descrito anteriormente. Estos compuestos son sustratos de la
enzima ceramidasa ácida, que se encuentra mutada en individuos que
padecen esta enfermedad, por lo que su funcionalidad en las células
es mínima o nula. En un primer paso del método, se obtiene una
muestra biológica del individuo (sangre, tejido etc.) de la que se
han extraído las células adecuadas para determinar la actividad de
la ceramidasa por los métodos habituales. Este extracto celular se
pone en contacto con el sustrato de fórmula (I) y se incuba la
mezcla durante un tiempo variable de entre 1 a 5 horas. En caso de
que la enzima ceramidasa sea funcional, se producirá la hidrólisis
de la cadena N-acilo presente en el compuesto de
fórmula (I). Este cambio estructural hace que, después de una
reacción de oxidación, el fluoróforo emita fluorescencia, que puede
ser medida por los métodos conocidos, tal como un espectrofotómetro
adecuado. En caso de que la ceramidasa esté mutada y no sea
funcional, la muestra no presentará fluorescencia o ésta será
mínima. En base a está relación entre la actividad ceramidasa y los
datos de fluorescencia obtenidos, un experto en la materia puede
proceder a determinar si el individuo problema padece la enfermedad
de Farber.
Preferiblemente, es recomendable determinar
también la actividad ceramidasa en al menos una muestra control que
puede ser un extracto celular del mismo tipo de células procedente
de un individuo normal para el mismo experimento y el mismo día.
Así, la probabilidad de que un individuo padezca la enfermedad de
Farber aumenta cuando la actividad de ceramidasa en la muestra
problema es aproximadamente un 25% menor a la actividad ceramidasa
determinada en la muestra control.
El método descrito en la presente invención
posee una serie de ventajas respecto a los métodos conocidos en la
actualidad:
- \sqbullet
- El sustrato utilizado no es radioactivo, por lo tanto, no se requieren instalaciones ni equipos específicos ni autorizaciones especiales.
- \sqbullet
- El sustrato utilizado es soluble en disoluciones acuosas a las concentraciones necesarias, con lo que no se requiere el uso de detergentes para su solubilización.
- \sqbullet
- El sustrato utilizado es estable en condiciones adecuadas de almacenamiento.
- \sqbullet
- El sustrato utilizado es específico para la ceramidasa ácida y, por lo tanto, para el diagnóstico de la enfermedad de Farber al no presentar interferencias con otras amido hidrolasas.
- \sqbullet
- La detección se basa en la medida de fluorescencia, color o luminiscencia mediante instrumental común y asequible en los laboratorios.
- \sqbullet
- No se necesita separar el producto del sustrato, con lo que se evitan procedimientos tediosos de extracción y de separación (CCF, HPLC, GCL).
- \sqbullet
- Se evita el uso de disolventes orgánicos halogenados, con lo que el método genera menos residuos contaminantes que los otros descritos y suponen un menor riesgo ocupacional.
- \sqbullet
- El ensayo es muy sensible, con un límite de detección de 50 pmoles de producto formado, y requiere muy poca cantidad de proteína (10-20 \mug).
\newpage
- \sqbullet
- El ensayo puede ser miniaturizado y utilizado para el cribado masivo de muestras y para la realización de múltiples medidas de forma simultánea.
- \sqbullet
- El ensayo puede aplicarse a varios tipos de muestras biológicas, como por ejemplo linfocitos de sangre y fibroblastos de piel.
- \sqbullet
- El ensayo es rápido, requiriéndose menos de 4 horas desde la preparación de la muestra hasta la obtención de los resultados.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de un compuesto de fórmula (I):
donde
R_{1} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{24}, alquenilo
C_{2}-C_{24}, alquinilo
C_{2}-C_{24} o un grupo
-R_{2}-Y-R_{3}, donde Y se
selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O_{2}),
C(O), NHC(O), C(O)NH,
C(O)O, OC(O), R_{2}, se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{a}, alquenilo
C_{2}-C_{a}, alquinilo
C_{2}-C_{a}, R_{3} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{b}, alquenilo
C_{2}-C_{b}, alquinilo
C_{2}-C_{b}, siendo a+b\leq24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es un grupo fluorogénico, cromogénico o
luminogénico,
para el diagnóstico de la enfermedad de Farber
en una muestra biológica aislada de un individuo.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferiblemente, R_{1} es un alquilo
-(CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n es un valor entre 1 y 24.
Más preferiblemente, n es 10.
Preferiblemente, m es 2.
En una realización preferida, X es
umbeliferona.
En un último aspecto, la presente invención se
refiere a un kit útil para determinar si un individuo padece la
enfermedad de Farber a partir de una muestra aislada de dicho
individuo, que comprende el compuesto de fórmula (I) y al uso de
este kit para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una
muestra biológica aislada de un individuo. Otros componentes del kit
pueden ser disoluciones amortiguadoras, conservantes, oxidantes y en
general, componentes que contribuyan a la adecuada conservación de
los reactivos y a que la reacción base del ensayo se realice de la
forma más eficiente posible.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1. Muestra la actividad enzimática sobre
los compuestos 2-7, después de 3 horas de incubación
de las células en cultivo (línea FD1 AcCer10X) con 40 \muM de
sustrato. Los resultados son representativos de dos experimentos
independientes con triplicados. S se refiere al sustrato
descrito en Bedia et al., Chembiochem. 2007, 8,
642-8.
Fig. 2. Muestra la actividad enzimática sobre
los compuestos 2-7, después de 3 horas de incubación
de las células en cultivo (línea FD1 AcCer10X) con distintas
concentraciones de cada sustrato. Los resultados son representativos
de dos experimentos independientes con triplicados.
Fig. 3. Muestra el efecto de la concentración de
proteína en la hidrólisis del sustrato 5, después de 3 horas de
incubación a 37ºC en presencia de 20 \muM de sustrato y diferentes
cantidades de sobrenadante de homogeneizados celulares (línea FD1
AcCer10X). Los resultados son representativos de dos experimentos
independientes.
Fig. 4. Muestra la hidrólisis del sustrato 5 en
función del tiempo de incubación, en presencia de 20 \muM de
sustrato y de 25 \mug de proteína del homogeneizado celular (línea
FD1 AcCer10x). Los datos son representativos de dos experimentos
independientes.
Fig. 5. Muestra la hidrólisis del sustrato 5 en
función del pH de la mezcla de reacción, en los homogeneizados
celulares de tres líneas celulares con diferente grado de actividad
ceramidasa ácida: FD1 AcCer10X (sobreexpresan ceramidasa ácida),
linfoblastos normales y fibroblastos FD1 (Farber). Los ensayos se
realizaron a 37ºC durante 3 horas en presencia de 20 \muM de
sustrato y de 10-25 \mug de proteína. Para la
incubación se utilizaron diferentes disoluciones amortiguadoras sin
detergentes: disolución amortiguadora de glicina-HCl
(pH 2,5 a 3), disolución amortiguadora de acetato (pH 3,5 a 5,5),
disolución amortiguadora de fosfato sódico (pH 6 a 8,1) y disolución
amortiguadora de glicina-NaOH (pH 8,9 a 9,8). Los
resultados son representativos de 4 experimentos independientes.
Fig. 6. Muestra el análisis cinético de la
hidrólisis del sustrato 5. Diferentes concentraciones del sustrato
de 2,5 a 80 \muM fueron incubadas en presencia de
10-25 \mug de proteína del homogeneizado celular
(línea FD1 AcCer10x), en el seno de una disolución amortiguadora de
acetato pH 4,5 durante 3 horas a 37ºC. En la figura se muestra la
representación de Lineweaver-Burk y los parámetros
cinéticos resultantes, los cuales son el promedio de cinco
experimentos independientes.
Fig. 7. Muestra la medición de la actividad
ceramidasa ácida en diferentes líneas de fibroblastos Farber y
fibroblastos control. Todas las mediciones han sido realizadas con
el sustrato 5 y una cantidad fija de proteína, en las condiciones
estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3 experimentos
independientes.
Fig. 8. Muestra la medición de la actividad
\beta-galactosidasa lisosomal en diferentes líneas
de fibroblastos Farber y fibroblastos control. Todas las mediciones
han sido realizadas con el sustrato 5 y una cantidad fija de
proteína, en las condiciones estándar descritas. Los resultados son
el promedio de 3 experimentos independientes.
Fig. 9. Muestra la medición de la actividad
ceramidasa ácida en diferentes líneas de linfoblastos Farber y
linfoblastos control. Todas las mediciones han sido realizadas con
el sustrato 5 y una cantidad fija de proteína, en las condiciones
estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3 experimentos
independientes.
Fig. 10. Muestra la medición de la actividad
\beta-galactosidasa lisosomal en diferentes líneas
de linfoblastos Farber y linfoblastos control. Todas las mediciones
han sido realizadas con una cantidad fija de proteína, en las
condiciones estándar descritas. Los resultados son el promedio de 3
experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se ilustrará la invención
mediante ejemplos y ensayos realizados por los inventores, sin ser
limitativos, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad
del método de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Metodología general: A una disolución del
aminodiol cumarínico 1 (56 mg, 0.2 mmol), obtenido tal como de
describe en la literatura [Bedia et al., Chembiochem. 2007,
8, 642-8.], y NEt_{3} (60 \muL/0.4 mmol), en 4
mL de CH_{2}Cl_{2} bajo atmósfera de argón a temperatura
ambiente, se adiciona una disolución del correspondiente ácido
activado en 4 mL de CH_{2}Cl_{2}. Dicho ácido activado se
prepara previamente disolviendo en CH_{2}Cl_{2} ECD/HOBt/ácido
en proporciones 0.32 mmol:0.25 mmol:0.25 mmol). La reacción se
controla por cromatografía en capa fina eluyendo con
CH_{2}Cl_{2}/MeOH 9:1) observándose tras 1 h la desaparición
total del producto partida. La mezcla de reacción se lava con 2 mL
de una disolución acuosa saturada de NaHCO_{3}, el
CH_{2}Cl_{2} se evapora y el crudo resultante se purifica por
cromatografía en columna flash utilizando un gradiente de 0 a 10% de
MeOH en CH_{2}Cl_{2} para obtener los productos en forma de
sólidos blancos (rendimientos 74-80%). Un esquema de
este procedimiento se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H RMN (400 MHz; CDCl_{3}) 5 7.62 (d, 1H,
J = 9.5 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 7.5 Hz),
6.85-6.82 (m, 2H), 6.48 (d, 1H, J = 8 Hz),
6.24 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 4.34-4.16 (m, 2H),
4.06 (dd, 2H, J_{1} = 3.3 y J_{2} = 8.0 Hz), 3.92
(m, 1H), 3.86-3.72 (m, 2H), 3.18 (brs, 1H), 2.22 (t,
2H, J = 7.0 Hz), 2.04 (m, 2H), 1.68 (sext, J = 7.5,
2H), 0.95 (t, 3H, J = 7.5 Hz).
^{13}C RMN (75 MHz; CDCl_{3}) \delta
174.2, 162.2, 161.7, 155.7, 143.9, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6,
101.5, 70.0, 65.8, 62.2, 54.7, 38.7, 33.5, 19.3, 13.8.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H RMN (400 MHz; CDCl_{3}) 5 7.63 (d, 1H,
J = 9.5 Hz), 7.34 (d, 1H, J = 7.5 Hz),
6.85-6.76 (m, 2H), 6.53 (d, 1H, J = 8 Hz),
6.22 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 4.30-4.14 (m, 2H),
4.06 (brd, 2H, J = 9.6 Hz), 3.93 (m, 2H),
3.84-3.76 (m, 1H), 3.41 (brs, 1H), 2.24 (t, 2H,
J = 7.0 Hz), 2.04 (m, 2H), 1.68 (quint, J = 7.5, 2H),
1.38-1.16 (br, 8H), 0.86 (t, 3H, J = 7.5
Hz).
^{13}C RMN (75 MHz; CDCl_{3}) \delta
174.4, 162.2, 161.7, 155.7, 143.9, 128.9, 113.1, 112.8, 112.6,
101.4, 69.9, 65.7, 62.2, 54.7, 36.9, 33.5, 31.7, 29.3, 29.1, 25.9,
22.7, 14.2.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H RMN (400 MHz; CDCl_{3}) 5 7.64 (d, 1H,
J = 9.0 Hz), 7.37 (d, 1H, J = 8.0 Hz),
6.84-6.82 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.36 (d, 1H,
J = 8 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 9.5 Hz),
4.32-4.14 (m, 2H), 4.06 (brd, 2H, J = 9.6
Hz), 3.92 (sext, 1H, J = 3.5 Hz), 3.82 (brd, 1H), 3.43 (brd,
1H, J = 5.5 Hz), 2.75 (brs, 1H), 2.25 (t, 2H, J = 8.0
Hz), 2.05 (m, 2H), 1.70-1.52 (4H),
1.38-1.16 (br, 12H), 0.87 (t, 3H, J = 7.0
Hz).
^{13}C RMN (75 MHz; CDCl_{3}) \delta
174.4, 162.2, 161.7, 155.7, 143.8, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6,
101.5, 70.0, 65.8, 62.3, 54.7, 36.9, 33.5, 31.9, 29.6, 29.5, 29.4,
29.4, 25.9, 22.8, 14.2.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H RMN (400 MHz; CDCl_{3}) 5 7.63 (d, 1H,
J = 9.0 Hz), 7.36 (d, 1H, J = 8.0 Hz),
6.84-6.82 (m, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.41 (d, 1H,
J = 8 Hz), 6.24 (d, 1H, J = 9.0 Hz),
4.32-4.14 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.92 (sext, 1H,
J = 3.5 Hz), 3.82 (dd, 1H, J,= 11.5 Hz, J¿= 3.5 Hz), 2.24 (t,
2H, J = 8.0 Hz), 2.05 (m, 2H), 1.64 (quint, 2H, J = 7
Hz), 1.38-1.18 (br, 16H), 0.87 (t, 3H, J =
7.0 Hz).
^{13}C RMN (75 MHz; CDCl_{3}) \delta
174.4, 162.2, 161.7, 155.7, 143.8, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6,
101.5, 70.0, 65.8, 62.2, 54.7, 36.9, 33.5, 32.0, 29.7, 29.7, 29.6,
29.5, 29.4, 25.9, 22.8, 14.2.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H RMN (400 MHz; CDCl_{3}) 5 7.63 (d, 1H,
J = 9.0 Hz), 7.37 (d, 1H, J = 8.0 Hz),
6.84-6.82 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.34 (d, 1H,
J = 8 Hz), 6.26 (d, 1H, J = 9.0 Hz),
4.32-4.14 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.92 (sext, 1H,
J = 3.5 Hz), 3.82 (m, 1H), 3.40 (t, 1H, J = 6.0 Hz),
2.70 (brs, 1H), 2.24 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.06 (m, 2H), 1.65
(quint, 2H, J = 7 Hz), 1.38-1.18 (br, 20H),
0.88 (t, 3H, J = 7.0 Hz).
^{13}C RMN (75 MHz; CDCl_{3}) \delta
174.3, 162.2, 161.7, 155.7, 143.8, 128.9, 113.1, 112.9, 112.6,
101.5, 70.1, 65.8, 62.3, 54.7, 36.9, 33.5, 32.0, 29.8, 29.7, 29.6,
29.5, 29.5, 29.4, 25.9, 22.8, 14.2.
\vskip1.000000\baselineskip
^{1}H RMN (400 MHz; CDCl_{3}) 5 7.63 (d, 1H,
J = 9.6 Hz), 7.37 (d, 1H, J = 8.0 Hz),
6.84-6.82 (m, 1H), 6.83 (s, 1H), 6.34 (d, 1H,
J = 7.2 Hz), 6.26 (d, 1H, J = 9.6 Hz),
4.34-4.15 (m, 2H), 4.07 (m, 2H), 3.92 (sext, 1H,
J = 3.5 Hz), 3.81 (m, 1H), 3.41 (d, 1H, J = 6 Hz),
2.81 (m, 1H), 2.73 (m, 1H), 2.25 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 2.06
(m, 2H), 1.65 (quint, 2H, J = 7 Hz),
1.38-1.18 (br, 40H), 0.88 (t, 3H, J = 7.0
Hz).
^{13}C RMN (75 MHz; DMSO) \delta 172.2,
161.9, 160.1, 155.3, 144.1, 129.3, 112.5, 112.2, 112.1, 101.1, 67.0,
65.6, 60.6, 55.0, 35.4, 32.8, 31.1, 29.8, 29.8, 29.6, 29.5, 25.2,
21.9, 13.7.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
Esta actividad se puede medir in vitro
con homogeneizados celulares y sobre células vivas intactas.
Para la medición de la actividad ceramidasa
ácida in vitro, las células son recolectadas y se lavan dos
veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden 100 \mul
de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los
homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g
y se guardan los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar
las proteínas de cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo
de actividad ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de
proteína. El ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocillos. Cada
pocillo contiene 74 \mul de disolución amortiguadora de acetato de
sodio/ácido acético, 0,5 \mul de la disolución de sustrato de la
ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20
\muM; concentración final de etanol 0,5%), y una cantidad de
proteína fija (entre 10 y 25 \mug) en un volumen de 25 \mul de
sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 37ºC durante 3 horas sin
agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la
adición en cada pocillo de 50 \mul de metanol y después 100 \mul
de una disolución de NaIO_{4} de 2,5 mg/ml en disolución
amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6. La placa se mantiene a
37ºC protegida de la luz durante dos horas y posteriormente se mide
la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de
excitación 340 nm, emisión 460 nm).
Las líneas celulares utilizadas para
caracterizar el sustrato son FD1 (línea celular Farber con actividad
ceramidasa ácida nula) y FD1 AcCer10X (línea Farber corregida para
sobreexpresar la ceramidasa ácida). Las demás líneas celulares
Farber y líneas control, ya sean fibroblastos como linfoblastos
(Epstein-Barr virus-transformed
lymphoid cell lines), proceden del Laboratoire de Biochimie
Métabolique, Institut Federatif de Biologie, CHU Purpan, Toulouse,
France.
Para la medición de la actividad ceramidasa
ácida en células en cultivo, las células se siembran a una densidad
de 200000 células/ml (0.1 ml/pocillo). Después de 24 h, se añade el
sustrato disuelto en etanol o en DMSO (0.1 \mul, 40 mM) para tener
una concentración final de 40 \muM. Se incuba a 37ºC durante 3 h
en el incubador de CO_{2} y luego se añaden secuencialmente 25
\mul de MeOH y 100 \mul de una disolución de NaIO_{4} de 2,5
mg/ml en disolución amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6. La
placa se mantiene a 37ºC protegida de la luz durante dos horas y
posteriormente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas
(longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
Las muestras blanco se preparan añadiendo el sustrato inmediatamente antes de la adición de MeOH y NaIO_{4}.
Las muestras blanco se preparan añadiendo el sustrato inmediatamente antes de la adición de MeOH y NaIO_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos se pueden realizar en células
en cultivo. Para ello, las células se siembran a una densidad de
200000 células/ml (0.1 ml/pocillo). Después de 24 h, se añaden los
sustratos disueltos en etanol o en DMSO (0.1 \mul, 40 mM). El
experimento se puede realizar a una concentración fija final de
sustrato (por ejemplo, 40 \muM) o variable, entre 1 y 100 \muM.
Se incuba a 37ºC durante 3 h en el incubador de CO_{2} y luego se
añaden secuencialmente 25 \mul de MeOH y 100 \mul de una
disolución de NaIO_{4} 2,5 mg/ml en disolución amortiguadora de
glicina/NaOH de pH 10,6. La placa se mantiene a 37ºC protegida de la
luz durante dos horas y posteriormente se mide la fluorescencia en
un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm,
emisión 460 nm). Las muestras blanco se preparan añadiendo el
sustrato inmediatamente antes de la adición de MeOH y
NaIO_{4}.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el efecto de la concentración de
proteína sobre la hidrólisis del sustrato, las células en cultivo de
la línea FD1 AcCer10X son recolectadas y se lavan dos veces con PBS.
Sobre los precipitados celulares se añaden 100 \mul de una
disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados
celulares se centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y se guardan
los sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas
de cada muestra, y el ensayo de actividad ceramidasa ácida se
realiza a diferentes cantidades de sobrenadante de homogeneizados
celulares. El ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocillos. Cada
pocillo contiene 74 \mul de disolución amortiguadora de acetato de
sodio/ácido acético, 0,5 \mul de la disolución de sustrato de
ceramidasa ácida 4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20
\muM; concentración final de etanol 0,5%), y distintas cantidades
de proteína entre 2.5 y 180 \mug en un volumen de 25 \mul de
sacarosa 0,2 M. La placa se mantiene a 37ºC durante 3 horas sin
agitación. Pasado este tiempo, la reacción se para mediante la
adición de 50 \mul de metanol y 100 \mul de una disolución de
2,5 mg/ml de NaIO_{4} en disolución amortiguadora de glicina/NaOH
de pH 10,6 en cada pocillo. La placa se protege de la luz durante
dos horas y posteriormente se lee en un fluorímetro de placas
(longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la hidrólisis del sustrato en
función del tiempo de incubación, las células en cultivo son
recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados
celulares se añaden 100 \mul de una disolución acuosa de sacarosa
0,2 M y se sonican. Los homogeneizados celulares se centrifugan
durante 3 minutos a 15000 g y guardamos los sobrenadantes. Estos se
utilizan para cuantificar las proteínas de cada muestra, y después
de los cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza
a cantidades iguales de proteína. La mezcla de incubación del ensayo
se lleva a cabo en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contiene 74
\mul de disolución amortiguadora de acetato de sodio/ácido
acético, 0,5 \mul de la disolución de sustrato de ceramidasa ácida
4 mM en etanol (concentración final de sustrato 20 \muM;
concentración final de etanol 0,5%), y 25 \mug de proteína en un
volumen de 25 \mul de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a 37ºC
durante distintos tiempos sin agitación. Pasado este tiempo, la
reacción se para mediante la adición de 50 \mul de metanol y 100
\mul de una disolución de 2,5 mg/ml de NaIO_{4} en disolución
amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocillo. La placa
se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se se mide
la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de
excitación 340 nm, emisión 460 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la hidrólisis del sustrato en
función del pH de la disolución amortiguadora de reacción, se
utilizan tres líneas celulares con diferente grado de actividad
ceramidasa ácida: FD1 AcCer10X (sobreexpresan ceramidasa ácida),
linfoblastos normales y fibroblastos FD1 (Farber). Las células en
cultivo son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los
precipitados celulares se añaden 100 \mul de una disolución acuosa
de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se
centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y guardamos los
sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de
cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad
ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. La
mezcla de incubación del ensayo se lleva a cabo en placas de 96
pocillos. Cada pocillo contiene 74 \mul de diferentes disoluciones
amortiguadoras sin detergentes: disolución amortiguadora de
glicina-HCl (pH 2,5 a 3), disolución amortiguadora
de acetato (pH 3,5 a 5,5), disolución amortiguadora de fosfato
sódico (pH 6 a 8,1) y disolución amortiguadora de
glicina-NaOH (pH 8,9 a 9,8), 0,5 \mul de la
disolución de sustrato de ceramidasa ácida 4 mM en etanol
(concentración final de sustrato 20 \muM; concentración final de
etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y 25 \mug)
en un volumen de 25 \mul de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a
37ºC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción
se para mediante la adición de 50 \mul de metanol y 100 \mul de
una disolución de 2,5 mg/ml de NaIO_{4} en disolución
amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocillo. La placa
se protege de la luz durante dos horas y posteriormente se mide la
fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de
excitación 340 nm, emisión 460 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Para efectuar el análisis cinético de la
hidrólisis del sustrato, las células en cultivo (línea FD1 AcCer10x)
son recolectadas y se lavan dos veces con PBS. Sobre los
precipitados celulares se añaden 100 \mul de una disolución acuosa
de sacarosa 0,2 M y se sónica. Los homogeneizados celulares se
centrifugan durante 3 minutos a 15000 g y se guardan los
sobrenadantes. Estos se utilizan para cuantificar las proteínas de
cada muestra, y después de los cálculos, el ensayo de actividad
ceramidasa ácida se realiza a cantidades iguales de proteína. El
ensayo se lleva a cabo en placas de 96 pocillos. Cada pocillo
contiene 74 \mul de disolución amortiguadora de acetato de
sodio/ácido acético, 0,5 \mul de la disolución de sustrato de
ceramidasa ácida a distintas concentraciones en etanol
(concentración final de sustrato de 2.5 a 80 \muM); concentración
final de etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y
25 \mug) en un volumen de 25 \mul de sacarosa 0,2 M. La placa se
incuba a 37ºC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la
reacción se para mediante la adición de 50 \mul de metanol y 100
\mul de una disolución de 2,5 mg/ml de NaIO_{4} en disolución
amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocillo. La placa
se protege de la luz durante dos horas y posterior-
mente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
mente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células en cultivo son recolectadas y se
lavan dos veces con PBS. Sobre los precipitados celulares se añaden
100 \mul de una disolución acuosa de sacarosa 0,2 M y se sónica.
Los homogeneizados celulares se centrifugan durante 3 minutos a
15000 g y se guardan los sobrenadantes. Estos se utilizan para
cuantificar las proteínas de cada muestra, y después de los
cálculos, el ensayo de actividad ceramidasa ácida se realiza a
cantidades iguales de proteína. El ensayo se lleva a cabo en placas
de 96 pocillos. Cada pocillo contiene 74 \mul de disolución
amortiguadora de acetato de sodio/ácido acético, 0,5 \mul de la
disolución de sustrato de ceramidasa ácida 4 mM en etanol
(concentración final de sustrato 20 \muM; concentración final de
etanol 0,5%), y una cantidad de proteína fija (entre 10 y 25 \mug)
en un volumen de 25 \mul de sacarosa 0,2 M. La placa se incuba a
37ºC durante 3 horas sin agitación. Pasado este tiempo, la reacción
se para mediante la adición de 50 \mul de metanol y 100 \mul de
una disolución de 2,5 mg/ml de NaIO_{4} en disolución
amortiguadora de glicina/NaOH de pH 10,6 en cada pocillo. La placa
se protege de la luz durante dos horas y posterior-
mente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
mente se mide la fluorescencia en un fluorímetro de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460 nm).
La actividad
\beta-galactosidasa lisosomal se mide con los
mismos extractos proteicos utilizados para la medición de la
actividad ceramidasa ácida. El ensayo se basa en el método
fluorogénico ya publicado en la literatura^{2} con algunas
modificaciones con el fin de adaptarlo al formato de placas de 96
pocillos. Así pues, una cantidad fija de proteína (entre 5 y 10
\mug) en un volumen de 10 \mul, se mezcla en un pocillo junto
con 20 \mul de disolución amortiguadora de ácido acético/acetato
de sodio 0,5 M pH 4,5, 20 \mul de EDTA 20 mM, 40 \mul del
sustrato
4-metilumbelliferil-\beta-D-galactopiranósido
3 mM (concentración final 400 \muM) y 10 \mul de agua ultra
pura. Esta mezcla se incuba a 37ºC durante 30 minutos y seguidamente
se añaden 100 \mul de disolución amortiguadora de glicina/NaOH a
pH 10,6. Posteriormente la fluorescencia se mide en un fluorímetro
de placas (longitud de onda de excitación 340 nm, emisión 460
nm).
Claims (24)
1. Compuesto de fórmula
donde
R_{1} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{24}, alquenilo
C_{2}-C_{24}, alquinilo
C_{2}-C_{24} o un grupo
-R_{2}-Y-R_{3}, donde Y se
selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O_{2}),
C(O), NHC(O), C(O)NH,
C(O)O, OC(O), R_{2}, se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{a}, alquenilo
C_{2}-C_{a}, alquinilo
C_{2}-C_{a}, R_{3} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{b}, alquenilo
C_{2}-C_{b}, alquinilo
C_{2}-C_{b}, siendo a+b\leq24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo,
con la condición de que cuando X es umbeliferona
y m es 2, R_{1} es distinto de
-(CH_{2})_{14}CH_{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Compuesto según la reivindicación 1 donde m
es un valor entre 2 y 4.
3. Compuesto según la reivindicación 2 donde m
es 2.
4. Compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 donde R_{1} es un alquilo
-(CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n es un valor entre 1 y
24.
5. Compuesto según la reivindicación 4 donde n
es 10.
6. Compuesto según las reivindicaciones
anteriores donde X es umbeliferona.
7. Método de diagnóstico para determinar si un
individuo padece la enfermedad de Farber que comprende:
- a)
- Obtención de una muestra biológica aislada de un individuo
- b)
- adición de un compuesto de fórmula (I):
\newpage
- donde
- R_{1} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{24}, alquenilo C_{2}-C_{24}, alquinilo C_{2}-C_{24} o un grupo -R_{2}-Y-R_{3}, donde Y se selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O_{2}), C(O), NHC(O), C(O)NH, C(O)O, OC(O), R_{2}, se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{a}, alquenilo C_{2}-C_{a}, alquinilo C_{2}-C_{a}, R_{3} se selecciona entre alquilo C_{1}-C_{b}, alquenilo C_{2}-C_{b}, alquinilo C_{2}-C_{b}, siendo a+b\leq24,
- m es un valor entre 1 y 10,
- X es un fluoróforo, cromóforo o luminóforo
- a una muestra biológica aislada de un individuo,
- c)
- incubación de la mezcla obtenida en (b)
- d)
- oxidación de la mezcla obtenida en (c)
- e)
- detección de la fluorescencia producida en la mezcla obtenida en (d).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según la reivindicación 7 donde m es
un valor entre 2 y 4.
9. Método según la reivindicación 8 donde m es
2.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9 donde R_{1} es un alquilo
-(CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n es un valor entre 1 y
24.
11. Método según la reivindicación 10 donde n es
10.
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 11 donde X es umbeliferona.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12 donde la muestra biológica aislada es un
fluido corporal.
14. Método según la reivindicación 13 donde el
fluido corporal es sangre.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 12 donde la muestra biológica aislada es tejido
epitelial.
16. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 15 donde el tiempo de incubación en el paso (b)
es entre 0,5 y 5 horas.
17. Uso de un compuesto de fórmula (I):
donde
R_{1} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{24}, alquenilo
C_{2}-C_{24}, alquinilo
C_{2}-C_{24} o un grupo
-R_{2}-Y-R_{3}, donde Y se
selecciona entre S, O, N, NH, S(O), S(O_{2}),
C(O), NHC(O), C(O)NH,
C(O)O, OC(O), R_{2}, se selecciona entre
alquilo C_{1}-C_{a}, alquenilo
C_{2}-C_{a}, alquinilo
C_{2}-C_{a}, R_{3} se selecciona entre alquilo
C_{1}-C_{b}, alquenilo
C_{2}-C_{b}, alquinilo
C_{2}-C_{b}, siendo a+b\leq24,
m es un valor entre 1 y 10,
X es fluoróforo, cromóforo o luminóforo,
para el diagnóstico de la enfermedad de Farber
en una muestra biológica aislada de un individuo.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Uso según la reivindicación 17 donde m es un
valor entre 2 y 4.
19. Uso según la reivindicación 18 donde m es
2.
20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 19 donde R_{1} es un alquilo
-(CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n es un valor entre 1 y
24.
21. Uso según la reivindicación 20 donde n es
10.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
17 a 21 donde X es umbeliferona.
23. Un kit útil para determinar si un individuo
padece la enfermedad de Farber a partir de una muestra aislada de
dicho individuo, que comprende el compuesto de fórmula (I).
24. Uso de un kit según la reivindicación 23
para el diagnóstico de la enfermedad de Farber en una muestra
biológica aislada de un individuo.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201031008A ES2372391B1 (es) | 2010-06-29 | 2010-06-29 | Método de diagnóstico de la enfermedad de farber. |
| PCT/ES2011/070444 WO2012001191A1 (es) | 2010-06-29 | 2011-06-20 | Método de diagnóstico de la enfermedad de farber |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES201031008A ES2372391B1 (es) | 2010-06-29 | 2010-06-29 | Método de diagnóstico de la enfermedad de farber. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2372391A1 true ES2372391A1 (es) | 2012-01-19 |
| ES2372391B1 ES2372391B1 (es) | 2012-11-27 |
Family
ID=45401424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES201031008A Withdrawn - After Issue ES2372391B1 (es) | 2010-06-29 | 2010-06-29 | Método de diagnóstico de la enfermedad de farber. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2372391B1 (es) |
| WO (1) | WO2012001191A1 (es) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3925949A1 (en) * | 2020-06-19 | 2021-12-22 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Azido compounds and method for monitoring acid ceramidase activity in intact cells using them |
-
2010
- 2010-06-29 ES ES201031008A patent/ES2372391B1/es not_active Withdrawn - After Issue
-
2011
- 2011-06-20 WO PCT/ES2011/070444 patent/WO2012001191A1/es active Application Filing
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BEDIA, C. et al. 'Synthesis of a NovelCeramide Analogue and its Use in a High-ThroughputFluorogenic Assay for Ceramidases'. ChemBioChem,2007, Vol. 8, páginas 642-648. Ver páginas643, columnas 1 y 2, Figura 3; página 647,columna 2, párrafos 2 y 3. * |
| GRIJALVO, S. et al. 'Design, synthesisand activity as acid ceramidase inhibitorsof 2-oxooctanoyl and N-oleoylethanolamine analogues'.Chemistry and Physics of Lipids, 2006, Vol.144, páginas 69-84. Ver página 69, resumen;páginas 79 y 80, Resultados, Esquemas 1 y 2. * |
| KUDOH, T. et al. 'Diagnosis of MetachromaticLeukodystrophy, Krabbe Disease, and FarberDisease after Uptake of Fatty Acid-labeledCerebroside Sulfate into Cultured Skin Fibroblast'.The Journal of Clinical Investigation, 1982,Vol. 70, Páginas 89-97. Ver página 89, Resumen. * |
| NIEWENHUIZEN, W. F. et al. 'Synthesisod a novel fluorescent ceramide analogue andits use in the characterization of recombinatceramidase from Pseudomonas aeruginosa PA01'.Chemistry and Physics of Lipids, 2002, Vol.114, páginas 181-191. Ver página 183, Figura1, compuesto 10; página 182, resumen; página183, columna 1, párrafos 4-6; página 189, Discusión. * |
| TANI, M. et al. 'Specific and SensitiveAssay for Alkaline and Neutral CeramidasesInvolving C12-NBD-Ceramide'. The Journal ofBiochemistry, 1999, Vol. 125, N. 4, páginas746-749. Ver página 746, Resumen. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2372391B1 (es) | 2012-11-27 |
| WO2012001191A1 (es) | 2012-01-05 |
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