ES2367563T3 - Procedimiento mejorado para purificar tfpi y analogos de tfpi. - Google Patents

Abstract

Una preparación purificada que comprende una pluralidad de moléculas del TPFI o análogos del TPFI, en la que menos del 12% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI son especies modificadas, en la que las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula del TFPI o análogo del TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula del TFPI o análogo del TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas del TFPI o análogo del TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula del TFPI o análogo del TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes.

Description

La presente solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales en trámite de Nº de serie 60/494.546 presentada el 13 de agosto de 2003, Nº de serie 60/509.277 presentada el 8 de octubre de 2003 y Nº de serie 60/512.199 presentada el 20 de octubre de 2003.

Campo de la invención

La invención se refiere a la producción del TFPI purificado.

Antecedentes de la invención

El inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) tiene una longitud de 276 aminoácidos y funciona como un inhibidor de la coagulación sanguínea mediada por el factor tisular. Véase Patente de EE.UU. 4.966.852. El extremo amino terminal del TFPI está cargado negativamente, y el extremo carboxi terminal está cargado positivamente. La proteína TFPI contiene tres dominios inhibidores enzimáticos de tipo Kunitz. El TFPI contiene 18 restos de cisteína y forma 9 puentes disulfuro cuando se pliega correctamente. La secuencia primaria contiene tres sitios de glicosilación de consenso unidos a N (Asn-X-Ser/Thr). Los restos de asparagina de los sitios de glicosilación están localizados en las posiciones 145, 195 y 256. El TFPI también se conoce como inhibidor de la coagulación asociado a lipoproteínas (LACI), inhibidor del factor tisular (TFI), e inhibidor de la vía extrínseca (EPI).

Se ha propuesto el uso del TFPI para el tratamiento de diversas indicaciones, que incluyen la sepsis (Patente de EE.UU. 6.063.764 y documento WO 93/24143), la trombosis venosa profunda (Patente de EE.UU. 5.563.123, Patente de EE.UU. 5.589.359 y documento WO 96/04378), la isquemia (Patente de EE.UU. 5.885.781, Patente de EE.UU. 6.242.414 y documento WO 96/40224), la reestenosis (Patente de EE.UU. 5.824.644 y documento WO 96/01649), y el cáncer (documentos U.S. 5.902.582 y WO 97/09063). Se ha demostrado que una variante del TFPI, que difiere del TFPI por la adición de un resto de alanina en el extremo amino terminal (“ala-TFPI”), es eficaz en modelos animales para el tratamiento de la sepsis. Carr y col., Circ. Shock 44(3): 126-137, 1994.

El documento WO 03/032904 describe el tratamiento de la neumonía a través de la administración del TFPI o un análogo del TFPI.

En la técnica existe una necesidad continua del TFPI biológicamente activo, purificado y de los procedimientos para obtenerlo.

Resumen de la invención

La invención proporciona al menos las siguientes formas de realización.

Una forma de realización de la invención proporciona una preparación purificada que comprende una pluralidad de moléculas del TFPI o análogos del TFPI. Menos del 12% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI son especies modificadas. Las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula del TFPI o análogo del TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula del TFPI o análogo del TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula del TFPI o análogo del TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas del TFPI o análogo del TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula del TFPI o análogo del TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes.

Otra forma de realización de la invención es una formulación farmacéutica que comprende una pluralidad de moléculas de ala-TFPI. Menos del 12% de las moléculas de ala-TFPI son especies modificadas. Las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula de ala-TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula de ala-TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula de ala-TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula de ala-TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas de ala-TFPI agregadas, según se detecta por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula de ala-TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes.

Otra forma de forma de realización de la invención proporciona un procedimiento para producir TFPI o análogo del TFPI purificado. El procedimiento comprende las siguientes etapas: (1) expresar el TFPI o análogo del TFPI en una célula huésped de E. coli resistente a la rifampicina, (2) aislar los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI o análogo del TFPI de células huésped de E. coli, (3) aislar el TFPI o análogo del TFPI de los cuerpos de inclusión para obtener TFPI o análogo del TFPI aislado, (4) replegar el TFPI o análogo del TFPI aislado para formar TFPI o análogo del TFPI replegado, (5) purificar el TFPI o análogo del TFPI replegado por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose en presencia de Mg++ para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado,

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(6) concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado, (7) purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI por cromatografía de alta resolución (HP, por su sigla en inglés) en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (8) purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (9) purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP-Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, y (10) concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificado, en la que menos del 12% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI son especies modificadas. El TFPI o análogo del TFPI está codificado en un plásmido que comprende los siguientes elementos: (a) un promotor de la transcripción; (b) un sitio de unión del ribosoma junto al promotor de la transcripción; (c) una secuencia de nucleótidos codificadora, que codifica el TFPI o el análogo del TFPI adyacente al sitio de unión al ribosoma; (d) un terminador de la transcripción adyacente a la secuencia de nucleótidos codificadora; (e) un replicón; (f) un gen de resistencia a los antibióticos; y (g) un gen que codifica una enzima que elimina la metionina del extremo N-terminal.

Otra forma de forma de realización de la invención es un procedimiento para producir TFPI o análogo del TFPI purificado. El procedimiento comprende las siguientes etapas: (1) purificar el TFPI o análogo del TFPI replegado por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificada, (2) concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado, (3) purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (4) purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, (5) purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP-Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado, y (6) concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificadas, en la que aproximadamente menos del 12% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI son especies modificadas.

En el presente documento también se da a conocer un procedimiento para expresar el TFPI o un análogo del TFPI que comprende cultivar una célula huésped de E. coli resistente a la rifampicina en un medio de fermentación. La célula huésped de E. coli comprende un plásmido que tiene los siguientes elementos: (a) un promotor de la transcripción, (b) un sitio de unión del ribosoma junto al promotor de la transcripción reclac, (c) una secuencia de nucleótidos codificadora, que codifica el TFPI o análogo del TFPI adyacente al sitio de unión del ribosoma, (d) un terminador de la transcripción adyacente a la secuencia de nucleótidos codificadora, (e) un replicón, (f) un gen de resistencia a los antibióticos, y (g) un gen que codifica una enzima que elimina la metionina del extremo N-terminal. Un litro de medio de fermentación comprende dextrosa 41 g, (NH4)2SO4 2,5 g, polifosfato de sodio 4,0 g, K2SO4 7,0 g, MgSO4·7H2O 1.63 g, metionina 2,0 g, glicerol 2,0 g, H3BO4 0,5 mg, cloruro de cobalto 0,5 g, CuSO46·H2O 0,13 g, FeCl3·6H2O 54,0 g, MnSO4·H2O 11,0 g, Na2MoO4·2H2O 0,5 g, NaSeO3 0,02 g, ZnSO4·7H2O 22,0 g, H2SO4 concentrado 0,01 ml y antiespumante UCON 0,55 ml.

En el presente documento también se da a conocer una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de moléculas de ala-TFPI y citrato de sodio 20 mM, L-arginina 300 mM y metionina 5 mM, pH 5,5. Menos del 12% de las moléculas de ala-TFPI son especies modificadas. Las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula de ala-TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula de ala-TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico; una molécula de ala-TFPI desamidada, según se detecta por medio de un kit ISOQUANT® de Promega; una molécula de ala-TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos; moléculas de ala-TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula de ala-TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Mapa del plásmido pMON37621.

Figura 2. Comparación de dos lotes de preparaciones recombinantes de ala-TFPI (rTFPI) por cromatografía de intercambio catiónico (CEX HPLC). Se aplicaron diez µg de la muestra a una columna de intercambio catiónico Mono S 5/5 de Pharmacia y se separó usando un gradiente lineal de cloruro de amonio 0,2-0,85 M en acetonitrilo al 30% y acetato de sodio 0,02 M. El eluyente de la columna se controló por mediciones de absorbancia UV a 214 nm. El cromatograma superior es del lote PB5806 (preparado según el Proceso C, que se define a continuación); el cromatograma inferior es del lote MAECM014 (preparado según los procedimientos descritos en el Proceso B, que se define a continuación).

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Figura 3. Comparación de dos lotes de preparaciones de rTFPI por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC HPLC). Se aplicaron diez µg de la muestra a una columna Bio-Sil SEC 250-5 de BioRad y se separó usando un eluyente isocrático que contenía acetonitrilo al 40% y ácido trifluoroacético al 0,75%. El eluyente de la columna se controló por medio de mediciones de absorbancia UV a 280 nm. El cromatograma superior es del lote PB5806 (preparado según el Proceso C); el cromatograma inferior es del lote NA0182 (preparado según el Proceso B).

Figura 4. SDS-PAGE de muestras de rTFPI reducidas y no reducidas. Las muestras se analizaron usando un gel de Tris-glicina al 14% y se visualizaron usando la tinción de Coomassie. Se aplicaron aproximadamente 3 µg de muestra en cada carril. La electroforesis de las muestras en los carriles 1-6 se llevó a cabo bajo condiciones reductoras; la de las muestras en los carriles 8-12 se realizó bajo condiciones no reductoras. Las muestras se cargaron de la siguiente manera: carril 1, los patrones de peso molecular; carriles 2 y 8, muestra del lote NA0182 (preparado según el Proceso B, que se define a continuación); carriles 3 y 9, muestras del lote MAECM014 (preparado según el Proceso B); y carriles 4 y 10, 5 y 11, y 6 y 12, muestras de los lotes PB5666, PB5806 y PB6096, respectivamente (preparados según el Proceso C).

Figura 5. SDS-PAGE utilizando el análisis de tinción de plata. Las muestras se redujeron con DTT y se analizaron con un gel de al Tris-glicina 14%. Se aplicaron aproximadamente 0,5 mg de muestra de rTFPI (preparado según el Proceso C) a cada carril. Las muestras incluyeron los patrones de peso molecular (carril 1), muestra de un lote de referencia PB5806 (preparado según el Proceso C) (carriles 2 y 3), albúmina de suero bovino (66 kDa) 2 ng y anhidrasa carbónica (31 kDa) 0,25 ng (carril 4), albúmina de suero bovino (66 kDa) 5 ng y anhidrasa carbónica (31 kDa) 0,25 ng (carril 5), y muestras por triplicado de un lote de PB6636 (carriles 6-8) y de un lote de PB6770 (carriles 9-11) (preparados según el Proceso C). El carril 12 está en blanco.

Figura 6. Espectro de masas por electrovaporización con deconvolución que muestra las masas moleculares de la proteína intacta. Figura 6A, lote de rTFPI MAECM014 (preparado según el Proceso B). Figura 6B, lote de rTFPI PB5806 (preparado según el Proceso C). Las masas observadas de los principales componentes son compatibles con la masa molecular teórica de 32.004 Dalton.

Figura 7. Cromatogramas UV registrados durante el análisis CL-EM de de péptidos Asp-N no reducidos. Se sometieron muestras no reducidas de los lotes MAECM014 (Figura 7A) y PB5806 (Figura 7B) a digestión de Asp-N y se realizó el análisis CL-EM. Las masas moleculares de los picos identificados se muestran en la Tabla 8.

Figura 8. Cromatogramas UV registrados durante el análisis CL-EM de péptidos Asp-N no reducidos. Se sometió una muestra no reducida del lote PC1058 a digestión de Asp-N y se realizó el análisis CL-EM.

Figura 9. Cromatogramas UV registrados durante el análisis CL-EM de péptidos trípticos RCM. Figura 9A, rTFPI lote MAECM014. Figura 9B, rTFPI lote PB5806.

Figura 10. Secuencia de aminoácidos de rTFPI que representa las tres regiones Kunitz y los enlaces disulfuro predichos. Las flechas indican los sitios de escisión resultantes de la digestión de rTFPI preparado según el Proceso C con Asp-N en condiciones no desnaturalizantes. Se observó escisión en sitios Asp-N indicadas por medio de flechas continuas entre las regiones Kunitz, que dieron como resultado siete péptidos principales. La escisión en las regiones Kunitz, indicada por flechas discontinuas, dio como resultado péptidos que se mantuvieron unidos por puentes disulfuro. La adición de una molécula de agua en los sitios de escisión en los péptidos escindidos internamente dio como resultado masas moleculares que resultaron 18 Dalton más altas que los péptidos no escindidos previstos. Los sitios específicos de escisión interna, que se muestran por medio de las flechas discontinuas, se basan en trabajos anteriores. Los péptidos Asp-N observados son coherentes con la estructura secundaria/terciaria predicha de rTFPI.

Figura 11. CN HPLC del fármaco rTFPI. Figura 11A, materiales preparados según el Proceso B. Figura 11 B, materiales preparados según el Proceso C. Se aplicaron diez µg de muestra a una columna Zorbax 300SB-CN y se separó utilizando un gradiente que contenía acetonitrilo y ácido trifluoroacético al 0,2%. El eluyente de la columna se controló por medio de la medición de absorbancia UV a 214 nm. Los picos menores son de rTFPI que contiene un resto de metionina oxidado (1), rTFPI que contiene una sustitución de leucina por norvalina (2) y rTFPI que contiene un resto acetilado o carbamilado (3).

Figura 12. Cromatograma UV parcial de los péptidos RCM trípticos del lote PB5806. Figura 12A, las flechas continuas indican péptidos que contienen norvalina, la flecha discontinua indica el péptido normal correspondiente T (88-108). Figura 12B, Cromatograma SIM para el péptido T (88-108) m/z 1293,6. Figura 12C, Cromatograma SIM para el péptido T (88-108) con incorporación errónea de norvalina m/z 1286,6 donde nV 90 y nV 100 corresponden a la norvalina en las posiciones de los restos 90 y 100, respectivamente.

Figura 13. Ensayo intraproceso de muestras de HP SP-Sepharose usando CEX-HPLC. La muestra superior representa la carga de la columna y la muestra inferior representa la combinación de la columna después de realizar la cromatografía utilizando SP-Sepharose FF.

Figura 14. Cromatogramas UV registrados durante el análisis CL-EM de fase inversa con gradiente lento. Figura 14A, lote MAECM014. Figura 14B, lote PB5806. Figura 14C, lote PB6096. Figura 14D, lote PB6770. Las líneas sombreadas indican las regiones de los cromatogramas UV que se caracterizaron por los espectros de masas con deconvolución. La región que eluyó prematuramente se identificó como rTFPI que contenía sulfóxido de metionina en proporciones aproximadamente iguales en materiales preparados según el Proceso B, y los preparados según el Proceso C. La región que eluyó más tarde se identificó como rTFPI que contenía restos acetilados en materiales preparados según el Proceso B.

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Figura 15. Secuencia de nucleótidos de la casete de expresión en pMON9197 (la secuencia de nucleótidos superior se muestra en la ID SEC Nº 43). Esta secuencia incluye el promotor de la transcripción, el sitio de unión del ribosoma, el gen de ala-TFPI con iniciación de la traducción reducida tanto en Met39 como en Met75, y el terminador de la transcripción. Los nucleótidos por encima de la línea son los que están presentes en pMON6875 o pMON6655 en esas posiciones. Las sustituciones se realizaron para reducir la iniciación de la traducción interna, y no afectan a la secuencia de la proteína ala-TFPI codificada. Los nucleótidos por encima de la línea cerca de los codones de terminación de la traducción están presentes en pMON6655 en esa región. El codón de parada utilizado en pMON6655 es TAG. Los símbolos ^^^ después del codón TAG representan una deleción de 64 nucleótidos que incluye un sitio de reconocimiento para CIaI y EcoRI. La secuencia en pMON6655 después del sitio de HindIII es idéntica a la de pMON9197 (excepto por la inserción del gen de MAP en pMON9197).

Figura 16. Diagramas de supervivencia de Kaplan-Meier. El eje X corresponde a la supervivencia; el eje Y corresponde al tiempo (horas).

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un procedimiento mejorado para purificar TFPI o un análogo del TFPI (se define a continuación). El procedimiento de purificación es capaz de producir preparaciones de moléculas del TFPI o análogos del TFPI en las que menos del 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de la preparación consiste en “especies modificadas”. “Especies modificadas” son TFPI o análogos TFPI oxidados, carbamilados, desamidados, acetilados, agregados o mal plegados.

El procedimiento es particularmente adecuado para preparar a gran escala preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas, por ejemplo, 200-300 g, 500 g, 400-600 g, 750 g, 600-900 g, 800 g, 800-1.200 g, 1,2 kg o 2,4 kg del TFPI o análogo del TFPI purificadas tal como se define a continuación.

TFPI o análogo del TFPI

El “TFPI” es el TFPI no glicosilado que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en ID SEC Nº 1. Los “análogos del TFPI” tienen una estructura primaria de aminoácidos diferente del TFPI como se muestra en la ID SEC Nº 1 (es decir, una o más sustituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos), manteniendo una o más de las actividades biológicas del TFPI como se analiza a continuación. Los análogos del TFPI tienen al menos un 70%, de preferencia al menos aproximadamente 80%, de más preferencia al menos aproximadamente 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos del TFPI (ID SEC Nº 1). Los análogos del TFPI incluyen muteínas, moléculas quiméricas y fragmentos del TFPI. Cualquiera de estas moléculas puede tener una o más sustituciones de metionina por norleucina o de leucina por norvalina.

El porcentaje de homología entre un análogo del TFPI y la secuencia de aminoácidos del TFPI (ID SEC Nº 1) se determina utilizando el programa de alineación BLAST2 (Blosum62, expectativa de 10, código genético patrón, apertura de huecos de 11, extensión de hueco de 1, caída de alineación de hueco x (gap x_dropoff) de 50, y filtro de baja complejidad). Resultan de preferencia las sustituciones conservadoras, en las que un aminoácido se intercambia por otro de similares características. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen, pero no se limitan a, Gly ↔ Ala, Val ↔ Ile ↔ Leu, Asp ↔ Glu, Lys ↔ Arg, Asn ↔ Glu, y Phe ↔ Trp ↔ Tyr. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos suelen estar en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos). Se pueden añadir otros aminoácidos en cualquier posición en la molécula, en particular, en el extremo amino terminal o en el extremo carboxi terminal. Las adiciones de aminoácidos pueden ser de 1, 2, 5, 10, 25, 100 o más aminoácidos adicionales. Las proteínas de fusión están incluidas dentro de la definición de análogos. Resulta evidente que cualquier modificación realizada en el ADN que codifica un análogo del TFPI no debe colocar a la secuencia fuera del marco de lectura y de preferencia no creará regiones complementarias que podrían producir estructura secundaria de ARNm. Las directrices para la determinación de qué restos de aminoácidos pueden ser sustituidos, insertados o delecionados sin abolir la actividad biológica o inmunológica se pueden encontrar utilizando programas informáticos muy conocido en la técnica, tales como el programa DNASTAR, o en Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC).

Un análogo del TFPI preferido es N-L-alanil-TFPI (“ala-TFPI”), que tiene un resto de alanina adicional en el extremo amino terminal de ID SEC Nº 1.

Los análogos incluyen “muteínas del TFPI ” que tienen de 1 a 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos en relación con ID SEC Nº 1. Las muteínas preferidas tienen sustituciones que no modifican sustancialmente la conformación de la molécula. En algunos casos, las muteínas del TFPI (1) tienen sustituciones de aminoácidos que eliminar uno o más de los tres sitios de glicosilación ligada a N, (2) tienen de 1 a 5 sustituciones de aminoácidos que cambian un resto del TFPI (ID SEC Nº 1) a un resto correspondiente del TFPI -2, (3) tienen sustituciones de aminoácidos en los sitios reactivos P1 en uno o más dominios tipo Kunitz, o (4) tienen sustituciones de aminoácidos en posiciones dentro de 5 aminoácidos de los sitios reactivos P1 en uno o más dominios tipo Kunitz. En una muteína del TFPI , el resto de lisina en el sitio reactivo P1 del primera dominio tipo Kunitz del TFPI (ID SEC Nº 1) se sustituye con arginina.

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En la Patente de EE.UU. Nº 5.589.359 se describen moléculas de “TFPI quimérico” que contienen diversas porciones del TFPI (ID SEC Nº 1).

Los fragmentos son análogos del TFPI que consisten en porciones del TFPI (ID SEC Nº 1). Un fragmento puede tener una longitud de, por ejemplo, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250 o 275 aminoácidos consecutivos. Ejemplos de fragmentos incluyen los dominios Kunitz 1, 2 o 3; los dominios Kunitz 1 y 2 o 2 y 3, y las deleciones del extremo N terminal, C terminal, o de ambos. Directrices importantes para producir tales análogos se encuentran en el documento U.S. 5.106.833.

Actividad biológica del TFPI , análogos del TFPI o del TFPI o análogos TFPI modificados

Las actividades biológicas del TFPI o TFPI modificado (como se define a continuación) incluyen la unión al complejo factor VIIa/TF y al factor Xa y la inhibición de la actividad amidolítica de ambos, también incluye actividad anticoagulante, según se mide en un ensayo del tiempo de protrombina (TP). Los análogos del TFPI , incluidos los análogos modificados del TFPI como se definen a continuación, de preferencia se pueden unir a uno o a ambos de entre el complejo factor VIIa/TF y el factor Xa. Los análogos del TFPI , incluidos los análogos modificados del TFPI , de preferencia poseen una cantidad sustancial de actividad anticoagulante, por ejemplo 10%, 30%, 50%, 60%, 80%, 90% o más de la actividad anticoagulante del TFPI (ID SEC Nº 1) según se mide en el ensayo de TP que se describe a continuación.

Preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas

Las preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas de la invención contienen moléculas del TFPI o análogos del TFPI de las cuales menos de un 12% son especies modificadas según se detectan por medio de uno o más de los ensayos que se describen a continuación. Las “especies modificadas del TFPI o análogos del TFPI ” son moléculas con una o más de las siguientes modificaciones post-traduccionales: oxidación (restos de metionina oxidados), aductos de cisteína, modificaciones de aminoácidos (metionina N-terminal residual, desamidación, acetilación y carbamilación), agregación (que forma oligómeros del TFPI o análogos del TFPI ) y mal plegamiento.

De preferencia, menos de aproximadamente el 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI en una preparación purificada de la invención están oxidadas, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa (CN HPLC , que se describe a continuación). De preferencia, menos de aproximadamente el 3, 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI en una preparación purificada de la invención están carbamiladas, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico (CEX HPLC, que se describe a continuación). En otras preparaciones purificadas más, menos de aproximadamente el 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI en una preparación del TFPI o análogo del TFPI purificada están desamidadas, según las mediciones realizadas usando un kit Promega ISOQUANT®. De preferencia, menos de aproximadamente el 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI en una preparación purificada de la invención tienen aductos de cisteína según se determina por el análisis de aminoácidos. En otras preparaciones del TFPI o análogos del TFPI de preferencia, menos de aproximadamente el 3, 2, 1, 0,5%, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI están agregadas, según se detectado por medio de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC HPLC) o están mal plegadas, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras (como se describe a continuación).

De preferencia, las preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas no contienen niveles de especies acetiladas del TFPI o análogos del TFPI detectables por espectroscopia de masas (como se describe a continuación). Las preparaciones purificadas de la invención también están, de preferencia, sustancialmente libres de proteínas de E. coli, es decir, menos de 2 ng/mg de proteína en una preparación del TFPI o análogo del TFPI purificada detectable en un gel de poliacrilamida con SDS con tinción de plata es proteína de E. coli.

Otras preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas de preferencia contienen menos de aproximadamente el 4% de especies oxidadas del TFPI o análogos del TFPI , menos de aproximadamente el 1% de especies carbamiladas del TFPI o análogos del TFPI , menos de aproximadamente el 5% de especies desamidadas del TFPI o análogos del TFPI y menos de aproximadamente el 3 % de especies agregadas y/o mal plegadas del TFPI o análogos del TFPI .

Cualquiera de las preparaciones purificadas del TFPI de la invención puede contener una o más sustituciones de metionina por norleucina o de leucina por norvalina.

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Ensayos

Los ensayos que se describen a continuación se utilizan para determinar la pureza, la estabilidad o la actividad biológica de las preparaciones del TFPI o análogos del TFPI .

Pureza por cromatografía de fase inversa (CNHPLC)

Se utilizó un procedimiento de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (CN HPLC) para detectar especies modificadas del TFPI o análogos del TFPI , es decir, moléculas del TFPI o análogos del TFPI con modificaciones tales como restos de metionina oxidados y modificaciones de aminoácidos tales como la metionina N-terminal residual, carbamilación, desamidación y acetilación. La CN HPLC también puede detectar especies del TFPI o análogos del TFPI que tienen sustituciones de metionina por norleucina; como se señaló anteriormente, sin embargo, tales especies no son “especies modificadas del TFPI o análogos del TFPI ” y pueden estar presentes en las preparaciones purificadas de la invención.

El procedimiento de CN HPLC utiliza una columna de fase inversa con ciano unido de manera estable y la fase móvil que contiene acetonitrilo y ácido trifluoroacético al 0,2%. Se controló la elución para detectar proteínas por medio de la absorbancia a 214 nm. Los resultados de las muestras se compararon con un patrón de referencia. La pureza se evaluó por medio del área por ciento del pico principal.

Según las mediciones por CN HPLC, menos de aproximadamente el 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI en una preparación del TFPI o análogos del TFPI purificada tienen un resto de metionina oxidada.

Cuantificación de cisteína libre por el análisis de aminoácidos

Puede utilizarse cualquier procedimiento de análisis de aminoácidos que permita la cuantificación de cisteína libre para cuantificar las moléculas del TFPI o análogos del TFPI que tienen un aducto de cisteína. Por ejemplo, véanse los procedimientos descritos en Barkholt & Jensen, Anal Biochem. 1989 Mar; 177 (2): 318-322; Hoogerheide & Campbell, Anal Biochem. 14 de febrero de 1992, 201 (1): 146-151; Atherton y col. Anal Biochem. Julio de 1993; 212 (1): 98-105, Hale y col. Anal Biochem. enero de 1994; 216 (1) : 61-66; Manneberg y col. Anal Biochem. 1 de noviembre de 1995, 231(2): 349-353; Thannhauser y col. J Protein Chem. 17 de enero de 1998; (1): 37-43; Yan y col. J Chromatogr A. 10 de julio de 1998, 813(1): 187-200; patente de EE.UU. 4.670.403; y la patente de EE.UU.

4.784.962. Por lo general, se cuantifica la cisteína libre que se libera después de la reducción de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI .

Según se determina por el análisis de aminoácidos, menos de aproximadamente el 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogos del TFPI en una preparación purificada de la invención tienen un aducto de cisteína; de más preferencia, las preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas no contienen niveles detectables de aductos de cisteína.

Ensayo de desamidación

Se utilizó el kit Promega ISOQUANT® (Boletín Técnico Promega Nº TBI001 kit de detección de isoaspartato, revisión 8/99) o su equivalente para determinar la desamidación del TFPI o análogo del TFPI a través de la medición indirecta de ácido isoaspártico. En resumen, el kit utiliza la proteína isoaspartil metil transferasa (PIMT), que cataliza la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil-L-metionina (SAM) al ácido isoaspártico. Esta reacción genera el subproducto S-adenosil-homocisteína (SAH), que posteriormente se analiza por medio de cromatografía de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC, por su sigla en inglés) (Carlson & Riggin, Analytical Biochemistry 278, 150155, 2000) con el fin de cuantificar el nivel de desamidación de las proteínas.

Según la medición por este ensayo, menos de aproximadamente el 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI en una preparación del TFPI o análogo del TFPI purificada están desamidadas.

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC HPLC)

Se utilizó la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC HPLC) para detectar monómeros del TFPI o análogos del TFPI de oligómeros del TFPI o análogos del TFPI (es decir, las formas agregadas). El procedimiento utiliza una columna Bio-Sil SEC 250-5 de BioRad y una fase móvil que contiene acetonitrilo al 40% y ácido trifluoroacético al 0,75%. Se controló la elución para detectar proteínas por medio de la absorbancia a 214 nm. Los monómeros y oligómeros se resolvieron en función de su radio hidrodinámico. La pureza se evaluó por el porcentaje del área.

Pueden usarse dos procedimientos de cromatografía de exclusión por tamaño para detectar las formas agregadas del TFPI o análogos del TFPI . Un procedimiento utiliza un tampón de ACN al 40%, ATF al 0,75%, MgCI2 50 mM como eluyente y un detector de UV configurado en 220 nm. El otro procedimiento utiliza una disolución tampón (Larginina 300 mM, citrato de sodio 20 mM, pH 5,5) como eluyente y un detector de fluorescencia configurado para excitación a 280 nm y emisión a 320 nm, el equilibrio de masas a través de la columna SEC con este sistema es del 85%.

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Según la medición por medio de SEC HPLC, menos de aproximadamente el 3, 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI en una preparación del TFPI o análogo del TFPI purificada están agregadas.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PA GE) (tinción con azul de Coomassie, no reducida)

Se utilizó la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) realizada bajo condiciones no reductoras y con tinción con azul de Coomassie para detectar especies del TFPI o análogos del TFPI mal plegadas. El procedimiento utiliza un gel de acrilamida al 14% y tinción con Coomassie coloidal. Las muestras reducidas y no reducidas se compararon con el patrón de referencia. Bajo las condiciones no reductoras, las formas mal plegadas del TFPI o análogos del TFPI tienen una movilidad electroforética ligeramente mayor que el TFPI o análogo del TFPI , mientras que en condiciones reductoras no hay diferencias en la movilidad electroforética. Los resultados se compararon con un patrón de referencia para determinar el porcentaje de especies agregadas y/o mal plegadas en una preparación purificada.

Según la medición por SDS-PAGE, menos de aproximadamente el 3, 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI en una preparación purificada de la invención están mal plegadas.

SDS-PA GE (tinción de plata)

Se utilizó SDS-PAGE realizado bajo condiciones de desnaturalización y usando tinción de plata para identificar las proteínas de E. coli que no fueron extraídas durante el proceso de purificación. Las muestras se sometieron a reducción antes de la aplicación a un gel de acrilamida al 14%. Los resultados de las muestras se compararon con un patrón de referencia.

Las preparaciones del TFPI o análogos del TFPI purificadas están sustancialmente libres de proteínas de E. coli, es decir, menos de 2 ng/mg de la proteína en una preparación purificada de la invención detectable en un gel de poliacrilamida con SDS teñido con plata es proteína de E. coli.

CEX HPLC

Se utilizó cromatografía de intercambio catiónico (CEX HPLC) para detectar la presencia de especies del TFPI o análogos del TFPI carbamilados o relacionados con la carga. El procedimiento de CEX-HPLC utiliza una columna de vidrio Mono-S HR 5/5 de Pharmacia. La columna se equilibró en tampón A al 80% (acetato de sodio trihidrato 20 mM : disolución de acetonitrilo (70 : 30 v/v) a pH 5,4) y tampón B al 20% (acetato de sodio trihidrato 20 mM, disolución de cloruro de amonio 1,0 M y acetonitrilo (70 : 30 v/v) a pH 5.4). Una vez inyectada la muestra, se aplicó un gradiente para eluir el TFPI a un caudal de 0,7 ml/min a partir de tampón B al 20% hasta tampón B al 85% en 21 minutos. Los picos de proteínas se detectaron por la absorbancia a 280 nm o por fluorescencia usando una excitación a 280 nm y emisión a 320 nm.

Según la medición por medio de HPLC CEX, menos de aproximadamente el 3, 2, 1, 0,5, 0,25 o 0,13% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI en una preparación purificada de la invención están carbamiladas.

Espectroscopia de masas

Los procedimientos de espectroscopía de masas se describen en los ejemplos específicos, a continuación. Las preparaciones del TFPI purificadas de la invención de preferencia no contienen niveles detectables de especies del TFPI acetiladas según los ensayos realizados por espectroscopía de masas.

Ensayo de tiempo de protrombina

El ensayo de TP se realizó en un instrumento Coag-A-Mate MTX II (Organon Teknika). Las muestras del TPFI o análogo del TFPI primero se diluyeron hasta 150 μg/ml con tampón (urea 2 M, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 250 mM, pH 7,2), después hasta 30 μg/ml con tampón TBSA (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, albúmina de suero bovino 1 mg/ml, pH 7,5) y finalmente de 12 a 15 μg/ml por medio de tampón TBSA. Para el ensayo, primero se mezclaron 10 μl de muestra diluida con 90 μl de Verify I combinado (Organon Teknika, Nº Cat. 59566), se cargaron en una bandeja de pruebas (Organon Teknika, Nº Cat. 35014) y se colocaron en el Coag-A-Mate. A continuación se añadieron 200 μl de Simplastin Excel (Organon Teknika, Nº Cat. 52001) para iniciar el proceso de coagulación. El tiempo de coagulación se convirtió en la concentración del TFPI o análogo del TFPI de salida comparando con un diagrama patrón del logaritmo del tiempo de coagulación en segundos frente al logaritmo de la concentración del TFPI o análogo del TFPI en los patrones. La potencia relativa se calculó mediante la comparación de la actividad inhibidora del TFPI o análogo del TFPI en las muestras de prueba a la actividad inhibidora del TFPI o análogo del TFPI de control.

Visión general del procedimiento de purificación

El procedimiento de purificación de la invención (“Proceso C”) por lo general incluye las siguientes etapas: (1) expresión del TFPI o análogo del TFPI en E. coli, (2) aislamiento de cuerpos refringentes, (3) disolución de los cuerpos refringentes y replegamiento del TFPI o análogo del TFPI expresado, (4) cromatografía de flujo rápido (FF) en SP-Sepharose, (5) una primera etapa de concentración y diafiltración, (6) cromatografía HP en Q-Sepharose, (7) cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) con butilo, (8) cromatografía HP en SP-Sepharose, y (9) una segunda etapa de concentración y diafiltración. Opcionalmente, puede incluirse una etapa de concentración y diafiltración entre las etapas de cromatografía HIC con butilo y cromatografía HP en SP-Sepharose.

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El procedimiento de purificación de la invención produce preparaciones de moléculas del TFPI o análogo del TFPI que contienen menos especies modificadas del TFPI o análogo del TFPI que los procedimientos de purificación anteriores descritos en Gustafson y col. Protein Expression and Purification 5, 233-241,1994, documento WO 96/40784, patente de EE.UU. 6.319.896; y patente de EE.UU. 6.323.326 (“Proceso de B”).

La purificación del TFPI o análogos del TFPI se logra principalmente después de la etapa de plegamiento por una secuencia de operaciones de cromatografía. Aparte de la columna de captura de SP Sepharose, que utiliza una etapa de elución, el resto de las etapas de cromatografía utilizan todas la recogida de fracciones y el análisis para determinar las fracciones que deben combinarse. Desde una perspectiva práctica de fabricación, las fracciones deben cumplir determinados requisitos mínimos para la combinación. No obstante, si se desea, se puede obtener un mayor nivel de pureza si se recogen solamente las fracciones de los picos y se hacen pasar a través de las posteriores operaciones de cromatografía. Al eliminar estas formas modificadas del TFPI , este procedimiento de purificación es capaz de producir preparaciones de moléculas del TFPI o análogos del TFPI en las que menos de aproximadamente el 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5% de la preparación consiste en especies modificadas.

La tabla 1 compara la pureza de ala-TFPI recombinante producido usando el Proceso B y utilizando el procedimiento de la invención. Además, el sistema de expresión, la estrategia de control de la fermentación y los procedimientos de aislamiento de los cuerpos refringentes que se describen a continuación dan lugar a un aumento mayor de cinco veces la cantidad del TFPI o análogo del TFPI producido en comparación con los procedimientos de producción anteriores.

Tabla 1.

Característica

Proceso B 22 lotes Proceso C 6 lotes

Actividad de TP, control %

97-122 103-111

pureza por medio de SDS PAGE (reducido), %1

>98% >98

pureza por medio de CEX HPLC, %1

>97 >99

pureza por medio de SEC HPLC, %1

>98 >98

pureza por medio de CN HPLC, %1

75% 90%

identidad por medio de EM-EV

32.006 32.007

norleucina, %2

<0,6% <0,3%

metionina N terminal, %

<2% <2%

aducto de cisteína, %

1% no detectado

norvalina, %3

<0,2% 2-3%

acetilación observada

Si No

carbamilación observada

Si Si

oxidación de metionina

Si Si

1 Valores expresados como monómero % (SDS PAGE) o pico principal (HPLC). 2 Expresado como sustitución de norleucina por mol de metionina, en %. 3 Expresado como sustitución de norvalina por mol de leucina, en %.

Ciertos aspectos de este procedimiento, como por ejemplo la etapa de HIC con butilo, el uso del agente quelante DTPA durante la recogida de células, la cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose (sobre todo en presencia de Mg++) y los procedimientos mejorados de fermentación, son generalmente adecuados para proteínas diferentes del TFPI o los análogos del TFPI .

A continuación se describe una forma de realización de preferencia de este procedimiento de purificación, adecuada para la producción a escala comercial del TFPI o análogos del TFPI .

Expresión del TFPI o análogos del TFPI

Secuencias codificadoras del TFPI o análogos del TFPI

La secuencia de aminoácidos de tipo natural del TFPI se muestra en ID SEC Nº 1. Se puede utilizar cualquier secuencia de nucleótidos que codifica el TFPI o análogos del TFPI como se definió anteriormente para codificar el TFPI o análogo del TFPI a expresar. Una secuencia codificadora de preferencia para ala-TFPI se muestra en la Figura 15.

Producción del TFPI o análogos del TFPI

Se puede producir TFPI o análogos del TFPI recombinantes en cualquier célula huésped adecuada, tal como una levadura o una célula huésped de mamífero (por ejemplo, CHO, HepG2, hepáticas Chang, o células de hepatoma SK), como es bien sabido en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.212.091, 6.103.500 y

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6.323.326. Tales TFPI o análogos del TFPI recombinantes se pueden purificar mediante los procedimientos de la invención como se describe a continuación.

Célula huésped de E. coli

5 El TFPI o los análogos del TFPI se producen de preferencia en una célula huésped de E.coli. La cepa preferida de

E. coli utilizada para la producción del TFPI se denomina “MON210”, que fue depositada en la American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, EE.UU. el 8 de octubre de 2003 (Nº de acceso PTA-5564) en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest. MON210 se generó a partir de la cepa W3110 de

E. coli de tipo natural (Bachman, Bacteriological Reviews 36, 525-557, 1996) a través de un proceso de varias 10 etapas que incluyen la secuencia W3110 → MON105 → LBB358 → MON210.

La cepa MON210 de E. coli fue generada a partir de la cepa LBB358 a través de varias etapas. Se introdujo la mutación recA56 en la cepa LBB358 por transducción de P1 (Csonka and Clark, J. Bacteriol. 143, 529-530,1980) para reducir la formación de concatémeros del plásmido de producción, lo que da como resultado la cepa LBB358recA-. A continuación se eliminó el gen de resistencia a la tetraciclina que se encuentra en Tn10 de

15 LBB358recA- por selección con ácido fusárico, lo que produce la cepa LBB358recA-T10. Para seleccionar las tasas alteradas de aparición espontánea de elongación de la transcripción asociada con la resistencia a la rifampicina, se introdujo el plásmido pMON26335rop+ en la cepa LBB358recA-T10 para producir la cepa LBB358recAT10/pMON26335rop+. Se seleccionó una cepa resistente a la rifampicina que demostró niveles aumentados de producción del TFPI y se curó del plásmido pMON26335rop+. El cultivo resultante fue designado MON210.

20 Plásmido

Los plásmidos a utilizar para expresar el TFPI o análogo del TFPI en una células huésped de E. coli tienen los siguientes elementos genéticos: un promotor de la transcripción, un sitio de unión del ribosoma, una secuencia codificadora del TFPI o análogo del TFPI , un terminador de la transcripción, un replicón, un gen de resistencia a antibióticos y una enzima que elimina una metionina del extremo N terminal. Los elementos particulares de

25 preferencia se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2.

Elemento genético

Elemento de preferencia

Promotor de la transcripción

reclac (Patente de EE.UU. Nº 5.212.091), un promotor sintético compuesto del promotor recA con dos cambios de bases posicionadas secuencia arriba del operador lac. La transcripción de genes bajo el control del promotor reclac puede ser inducida por la adición de IPTG al cultivo.

Sitio de unión de ribosomas

sitio de unión de ribosomas (RBS, por la sigla en inglés) del gen 10 del bacteriófago T7 (Olins y col., Gene 73, 227-235, 1998).

Secuencia codificadora del TFPI o análogo del TFPI

Véase FIGURA 15

Terminador de la transcripción

terminador canónico de la transcripción designado 2254 (AGCGTCGACACTCCCGTTCT GGATAATGTT; ID SEC Nº 42; véase documento US Nº de serie 09/044.369)

Replicón

origen de la replicación (ori) desde pBR322 (Covarrubias y col., 1981) y rop, el gen de control de número de copias de pBR322 (Polisky, Cell 55, 929-932, 1988).

Gen de resistencia a antibióticos

gen de la estreptomicina adeniltransferasa, que codifica una proteína que confiere resistencia a la estreptomicina y espectinomicina (Fling y col., Nucl. Acid. Res. 13, 7095, 1985).

Enzima que elimina metionina N terminal

gen que codifica la metionina aminopeptidasa de E. coli (MAP) (Ben-Bassat y col., J. Bacteriol. 169, 751-757, 1987)

El plásmido “pMON37621” contiene cada uno de los elementos preferidos. El mapa del plásmido de pMON37621 se muestra en la Figura 1. El plásmido contiene un gen estructural optimizado que codifica ala-TFPI y los elementos 30 reguladores útiles para la producción de alto nivel de proteínas en E. coli. El plásmido pMON37621 se generó a partir de pMON9197 sin alteración de la región codificadora de ala-TFPI.

Construcción de pMON37621

El plásmido PMON37621 se construyó a partir del plásmido pMON9197. pMON9197 contenía el gen optimizado que codifica ala-TFPI, así como el sitio de unión de ribosomas del gen 10 (Olins y col. Gene 73, 227-235, 1988), el gen 35 de resistencia a la espectinomicina (Fling y col. Nucleic Acid Research 13, 7095,1985), el gen de MAP (Ben-Bassat,

J. Bacteriol. 169, 751-757,1987) y el origen de replicación de pBR327 (Bolivar, Gene 2, 95-113, 1977). El promotor

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reclac (véase Patente de EE.UU. 5.212.091) se insertó en pMON9197 para reemplazar el promotor tac original para obtener el plásmido pMON26335.

El promotor reclac (Patente de EE.UU. Nº 5.212.091) se utilizó para dirigir la transcripción del gen de ala-TFPI. El sitio de unión de ribosomas proviene del gen 10 del bacteriófago T7. El terminador de la transcripción se basa en 5 una secuencia canónica de terminador y es designado 2254. El origen de replicación es de pBR322. Para controlar mejor el número de copias del plásmido de producción, se insertó el gen rop de pBR322 (Polisky, Cell 55, 929932,1988) en pMON26335, lo que dio como resultado el plásmido pMON26335rop+. La etapa final en la construcción de pMON37621 fue sustituir el terminador de la transcripción designado 2254 (ID SEC Nº 42; véase ID SEC Nº 3 del documento US Nº de serie 09/044.369) por el terminador del bacteriófago P22. El plásmido PMON37621 también

10 porta el gen de la aminoglucósido nucleotidiltransferasa que confiere al huésped la resistencia a la estreptomicina y la espectinomicina, y el gen de la metionina amino peptidasa (MAP) de E. coli para mejorar la eliminación de la metionina N terminal.

Preparación de la cepa de producción MON210/pMON37621

La cepa de producción MON210/pMON37621 se produjo mediante la transformación de MON210 con pMON37621.

15 La transformación puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la técnica. Se pueden preparar reservas de MON210/pMON37621 transformado en glicerol y utilizar para establecer los bancos de células primarios y de trabajo.

Preparación de los bancos de células primarios y de trabajo

Los bancos de células primarios y de trabajo se prepararon a partir de las cepas de producción de la siguiente

20 manera. Para preparar un banco de células primario, se descongela un vial congelado de células MON210/pMON37621 precursoras y se cultivan en un matraz oscilante durante aproximadamente 9 generaciones en el medio de siembra de producción definido con espectinomicina. Los viales de células con glicerol al 10% pueden a continuación congelarse y mantenerse a -70 ºC. Los bancos de células de trabajo se pueden preparar descongelando un vial de reserva primario y cultivando las células como se describe para el banco de células

25 primario.

Condiciones de fermentación

El proceso de fermentación de la fabricación comprende tres etapas: (1) Siembra 1 en matraz oscilante, (2) Siembra 2 en fermentador, y (3) fermentador de producción de 10.000 litros. La composición de los medios utilizados durante el proceso de fermentación se presenta en la Tabla 3. KOH y H2SO4 se utilizan para ajustar el pH del medio de los

30 medios de Siembra 1 y Siembra 2. NH4OH y H2SO4 se utilizan para ajustar el pH del medio del fermentador. NH4OH también se utiliza para controlar el pH durante la fermentación.

Durante todo el proceso de fermentación se utiliza agua purificada USP. El antibiótico de selección espectinomicina se utiliza en la preparación del banco de células de trabajo y no se utiliza durante la preparación del inóculo ni durante el proceso de fermentación.

35 Tabla 3. Composición y concentración de los medios de fermentación

Concentración

Componente

Siembra 1 g/l Siembra 2 g/l Fermentador1 g/l

Dextrosa

4,0 4,0 412

(NH4)2SO4

2,5 2,5 2,5

polifosfato de sodio

6,5 6,5 4,0

K2SO4

3,5 3,5 7,0

MgSO4·7H2O

1,23 1,23 1,63

metionina

ND ND 2,0

glicerol

ND ND 2,0

(continuación)

mg/l

mg/l mg/l

H3BO4

0,5 0,5 0,5

CoCl2·6H2O

0,5 0,5 0,5

CuSO4·6H2O

0,13 0,13 0,13

FeCl3·6H2O

54,0 54,0 54,0

MnSO4·H2O

11,0 11,0 11,0

Na2MoO4·2H2O

0,5 0,5 0,5

NaSeO3

0,02 0,02 0,02

ZnSO4·7H2O

22,0 22,0 22,0

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H2SO4 (concentrado)

0,01 ml/l 0,01 ml/l 0,01 ml/l

UCON (antiespumante)3

ND 0,3 ml/l 0,55 ml/l

1 El volumen inicial del fermentador es de 6400 l. 2 La concentración real de glucosa al comienzo es de 34-42 g/l debido al contenido de humedad (<9%) de Cerelosa.3 Se añadieron 3,5 l de antiespumante UCON al comienzo. Puede añadirse más antiespumante (hasta 12,5 l) durante la fermentación.

Siembra 1 – Matraz oscilante

El proceso de fermentación se inició descongelando un vial congelado de un banco de células de trabajo. El contenido de este vial (1 ml) se utilizó para inocular 0,5 l de medio de siembra 1 en el matraz oscilante. El matraz se

5 incubó a 37 ± 2 ºC y se mezcló a 200 RPM. El cultivo se dejó crecer durante aproximadamente 9 generaciones hasta alcanzar una densidad celular con una DO de 0,9 a 1,7. A continuación se transfirió el cultivo de Siembra 1 al fermentador de Siembra 2.

Siembra 2 - Fermentador de 30 l

Los 30 litros de medio de Siembra 2 se inocularon con el contenido de 0,5 l del cultivo de siembra 1. El medio de

10 siembra 2 es esencialmente el mismo que el medio de Siembra 1, excepto por la adición de antiespumante Ucon 0,1 ml/l. La fermentación de Siembra 2 se lleva a cabo de preferencia a una temperatura de 37 ± 2 ºC, con una aspersión de aire de 6 ± 2 LPM. El pH inicial del medio es de preferencia de 7,2 ± 0,2.

Una vez que las células crecieron aproximadamente 6 generaciones hasta una densidad celular de DO 0,9 a 1,7, se transfirió el cultivo de Siembra 2 al fermentador de 10.000 litros.

15 Fermentador de producción de 10.000 litros

Se transfirió la totalidad del contenido del fermentador de Siembra 2 al fermentador de 10.000 litros que contenía aproximadamente 6.400 litros de medio de producción. La composición del medio de producción se muestra en la Tabla 3. El fermentador de producción se controló por los siguientes parámetros. La temperatura de la fase de crecimiento de preferencia es de 37 ± 2 ºC. El ajuste de temperatura se cambió de 37 ºC a 30 ºC aproximadamente 20 0,5 horas antes de la inducción de la expresión del TFPI o análogo del TFPI , y la temperatura de la fase de expresión de preferencia es de 30 ± 2 ºC. El pH se controló por la adición de NH4OH concentrado para mantenerlo, de preferencia, en 6,9 ± 0,2. Se produce un aumento temporal del pH hasta un pH de aproximadamente 7,4 ± 0,2 cuando se agota el suministro inicial de glucosa y justo antes del inicio de la carga de nutrientes. Por último, el oxígeno disuelto (de preferencia 0,1-0,5 atm) se controló mediante el ajuste de la velocidad de agitación, la tasa de

25 aspersión y la proporción de oxígeno en los gases de aspersión.

El crecimiento de las células en la fermentación de producción de 10.000 l comienza como un cultivo discontinuo simple, utilizando la glucosa del medio de partida. La glucosa se agota cuando la densidad celular alcanza aproximadamente una DO de 40, según lo indica un aumento de pH hasta 7,4 ± 0,2. En ese momento, se inicia una carga de glucosa/nutrientes. La carga de nutrientes contiene glucosa 550 g/l, polifosfato de sodio 18 g/l, sulfato de

30 magnesio 6,65 g/l y metionina 4 g/l. La velocidad de carga de nutrientes aumenta de manera exponencial.

Una vez que la densidad celular alcanzó una DO de aproximadamente 100, se indujo el cultivo para producir TFPI o análogo del TFPI por la adición de IPTG (por ejemplo, 187 +/- 3 g de IPTG por fermentación, volumen nominal =

9.500 l) y se redujo la velocidad de carga de glucosa/nutrientes para limitar el nivel de glucosa durante la fase de expresión. El ajuste de la temperatura se cambió para que el cultivo alcanzara los 30 ± 2 ºC en el plazo de una hora

35 después de la inducción. El cultivo se recogió aproximadamente 12 horas después de la inducción. La concentración del TFPI o análogo del TFPI en la recogida fue de aproximadamente TFPI 5 g/l según la determinación realizada por medio del análisis SDS-PAGE.

Recogida de células, disolución de cuerpos refringentes y replegamiento de la recogida celular del TFPI expresado

Para recoger las células, se ajustó el pH del caldo de fermentación a 5,5-6 y se interrumpió el suministro de oxígeno

40 y glucosa. Se redujo la agitación y la temperatura del caldo se bajó hasta 5-10 ºC. Se añadió el quelante DTPA a una concentración final de 1 mM. La adición de DTPA se realizó usando una disolución de reserva a la que se había ajustado el pH a 5,5-6,0 con ácido cítrico. Se cargó el cultivo recogido en una centrífuga BTUX-510 que funciona a un caudal adecuado para minimizar la pérdida de sólidos en el sobrenadante. Los sólidos que contienen las células recogidas se bombearon de manera continua a un tanque hasta vaciar el fermentador. Se añadió agua purificada a

45 las células recogidas hasta un volumen de aproximadamente 10.000 litros, se añadió DTPA hasta una concentración final de 1 mM y se procesó por medio de la centrífuga BTUX-510 como se describió anteriormente. Esta etapa de lavado se repitió dos veces en total.

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Aislamiento de cuerpos refringentes (CR)

Después de la etapa de lavado de las células, comienza la recuperación de los cuerpos refringentes (CR, también conocidos como cuerpos de inclusión). La recuperación comprende la repetición de etapas de homogeneización, centrifugación y adición de volumen a los sólidos hasta que se obtienen los cuerpos refringentes esencialmente limpios, libres de residuos de la célula huésped. Se hizo funcionar el homogeneizador a una presión constante de aproximadamente 612 atm (9000 psig), y se utilizó una centrífuga BTUX-510 o su equivalente a un caudal adecuado para minimizar la pérdida de sólidos en el sobrenadante.

Reducción de volumen

Durante la primera etapa del proceso de centrifugación continua y adición de volumen (diacentrifugación), el volumen se redujo de aproximadamente 5000 l a 2500 l. Se desechó el sobrenadante de la centrifugación y se recogieron los sólidos. La concentración de DTPA para esta etapa y para las posteriores era de 10 mM.

Diacentrifugación discontinua 1

La siguiente etapa en el proceso de aislamiento de los CR es una diacentrifugación discontinua. Durante esta etapa, la suspensión bruta de CR preparada en la etapa anterior se homogeneizó (en un modo continuo) y centrifugó (en un modo discontinuo) de manera repetida hasta que la suspensión final de CR estuvo en gran parte libre de contaminación de material celular. Normalmente, se usan tres etapas de proceso por lotes con una centrífuga BTUX510 o su equivalente para alcanzar la pureza deseada de los CR. Los parámetros de centrifugación utilizados para la diacentrifugación discontinua son los mismos que los indicados para la reducción de volumen.

Diacentrifugación discontinua 2

Al final de la segunda etapa de diacentrifugación discontinua, se usó un tampón de lavado de citrato de sodio para eliminar las impurezas no deseadas de la fermentación, tales como los ácidos nucleicos y los metales. Al final de esta etapa, se añadió citrato de sodio hasta una concentración final de 150 mM a un pH de aproximadamente 5,56,0.

Diacentrifugación discontinua 3

Se usó una centrífuga SC-35 o su equivalente para una tercera etapa de diacentrifugación discontinua. La diacentrifugación discontinua 3 comenzó con un volumen de suspensión de CR de aproximadamente 2500 l. Se desechó el sobrenadante y se recogieron los sólidos por separado. Durante esta etapa, el volumen de sólidos recogidos se redujo al mínimo a fin de que el volumen final no fuera superior a 500 litros antes de la inactivación de la célula huésped.

Inactivación de la célula huésped

La suspensión de CR recogida en la etapa anterior contenía las células bacterias recombinantes residuales (aproximadamente 103 a 105 células/ml). Estas células viables se inactivaron antes de distribuir la suspensión de CR en los contenedores. Las células de E. coli residuales se inactivaron por contacto con 1-octanol (al 0,2% v/p para una suspensión que contiene aproximadamente 50% de sólidos) durante 30 minutos a 5-10 ºC.

Distribución y almacenamiento de la suspensión de CR

Después de la inactivación, se distribuyó la suspensión de CR (“intermedio de CR”) en partes iguales y se congeló. Por ejemplo, la suspensión de CR inactivada se congeló de manera conveniente a una temperatura inferior a -20 ºC en alícuotas de 7,5 l cada una.

Disolución y replegamiento

La reacción de replegamiento que se describe a continuación se puede completar en un día, incluso a escala comercial de 10.000 litros. La cantidad del TFPI o análogo del TFPI en la etapa de replegamiento es de 20.000 g. La concentración del TFPI o análogo del TFPI es de 2 g/l durante la reacción de replegamiento. La química de replegamiento incluye la oxidación acoplada a cistina y catalizada con cobre para formar enlaces disulfuro correctos.

Se transfirió el intermedio de CR descongelado a un tanque que contenía urea 6 M, polifosfato 2 g/l, Tris 50 mM, glicina 50 mM, pH 10, se homogeneizó utilizando una mezcladora de cizallamiento, y se redujo por la adición de una disolución madre de DTT. La disolución de CR reducida, homogeneizada se transfirió a un tanque de plegamiento que, después de la transferencia, contenía aproximadamente urea 3,5 M, Tris 50 mM, glicina 50 mM, polifosfato 2 g/l y DTT 1 mM, pH 10,2. El plegamiento se inició por la adición de cloruro cúprico 0,2 µM y cistina 0,6 mM. Después de aproximadamente 24 horas, se añadió cloruro cúprico 10 µM. Después de aproximadamente una hora, se añadió cloruro de magnesio hasta una concentración final de 50 mM, y el pH de la combinación plegada se ajustó a 5,5 con una disolución de ácido acético al 47,5%. Si se desea, la combinación plegada ajustada puede mantenerse durante aproximadamente dos días, lo que permite retirar porciones de la combinación y procesarlas en sublotes a través de las etapas de purificación siguientes.

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Cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose

Se usó cromatografía de intercambio catiónico de flujo rápido (FF, por su sigla en inglés) con resina SP-Sepharose para la etapa inicial de captura. La capacidad de carga de la columna es de 40 g/l de proteína total. La columna se equilibró con citrato de sodio 20 mM, urea 3 M, pH 6. La combinación plegada ajustada se filtró a través de un filtro de profundidad y un filtro de 0,45 µM y se aplicó a la columna. Después de la carga, se lavó la columna con tampón de equilibrado seguido por un lavado salino intermedio (citrato de sodio, aproximadamente 150 mM). La proteína se eluyó usando citrato de sodio aproximadamente 190 mM. Un aumento en el trazado a A280 durante la etapa de elución inició la combinación. La combinación continuó durante aproximadamente 3 volúmenes de columna o hasta que el trazado a A280 volviera a la línea inicial. Después de la elución, se regeneró la columna con una disolución de NaOH 0,5 N y se volvió a equilibrar para procesar los sublotes adicionales o se lavó con NaOH 0,1 N para su almacenamiento. La absorbancia de la combinación se midió a 278 nm para determinar la concentración de proteínas y la recuperación de la columna.

Primera concentración/diafiltración

La combinación de SP se ajustó a pH 4,5-5,0 con ácido acético 6N, se concentró hasta 12-14 g/l y se diafiltró utilizando una membrana de 10 kDa con 8 volúmenes de tampón de diafiltración que contenía ácido acético 20 mM, NaCl 15 mM, urea 3 M, pH 4,25. La disolución diafiltrada se drenó del sistema y se determinó la concentración a 278 nm (intervalo típico de 10 a 12 g/l) para determinar la recuperación de la etapa. La combinación diafiltrada se filtró a continuación a través de un filtro de 0,2 µm en una bolsa estéril y de este modo se puede mantener a 2-8 ºC durante al menos 3 meses hasta que se lleve a cabo la etapa de cromatografía HP en Q-Sepharose.

Cromatografía HP en Q-Sepharose

La combinación de SP concentrada, diafiltrada se ajustó a una concentración final de aproximadamente urea 4 M, NaCl 20 mM, Tris 20 mM, pH 7,6 a 8,5 y se cargó a una columna Q-Sepharose HP. Se equilibró la columna con tampón que contenía urea 4 M, cloruro de sodio 20 mM, Tris 20 mM, pH 8. Después de cargar, se lavó la columna con tampón de equilibrado, seguido por el tampón de equilibrado que contenía cloruro de sodio 50 mM. El TFPI se eluyó con un gradiente de 10 volúmenes de columna de cloruro de sodio 50-80 mM en tampón. Las fracciones que contenían TFPI podían combinarse sobre la base del análisis de las fracciones por SDS PAGE y el análisis HPLC para verificar la inclusión de las fracciones apropiadas.

Después de la elución del TFPI o análogo del TFPI , se lavó la columna con tampón de cloruro de sodio 150 mM, a continuación se regeneró con una disolución que contenía NaOH 0,5 N y NaCl 1 M. Los sublotes pudieron ser procesados después de equilibrar la columna como se describió anteriormente. Las columnas se pueden almacenar en NaOH 0,1 N. La absorbancia de la combinación a 278 nm se utilizó para determinar la concentración de proteínas y la recuperación de la columna.

Cromatografía HIC con butilo

La combinación de la etapa de cromatografía HP en Q-Sepharose se ajustó a NaCl 2,5 M, urea 2 M, citrato de sodio 100 mM, pH 6 y se cargó a una columna 650 M de butilo. Después de la carga, la columna se lavó con 3 volúmenes de columna de NaCl 1,7 M, urea 2 M, citrato de sodio 100 mM, pH 6. El producto se eluyó con un gradiente de 10 volúmenes de columna de NaCl 1,7 M hasta NaCl 0 M en un tampón que contenía urea 2 M y citrato de sodio 100 mM, pH 6. La columna se hizo funcionar en un modo de “unión y elución”. Las fracciones se recogieron y se analizaron por análisis de HPLC para verificar la inclusión de las fracciones apropiadas en la combinación. Después de la elución, la columna se lavó con tampón que no contenía sal. La regeneración de la columna se realizó con NaOH 0,5 N. La columna se podía equilibrar nuevamente si se iban a procesar otros sublotes o lavar en NaOH 0,1 N para su almacenamiento. La absorbancia de la combinación se midió a 278 nm para determinar la concentración de proteínas y la recuperación de la columna.

Cromatografía HP en SP-Sepharose

Se utilizó una etapa de cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento como etapa de limpieza para eliminar TFPI carbamilado o especies del TFPI mal plegadas. La combinación de la etapa con butilo se diluyó aproximadamente 5 veces con un tampón que contenía urea 3,9 M a pH 5,5 con una conductividad de aproximadamente 15,6 a 2-8 ºC. La combinación de butilo ajustada se cargó en una columna HP de SP-Sepharose equilibrada con citrato de sodio 20 mM de, urea 3 M, pH 5,5. Después de la carga, la columna se lavó con 1,5 volúmenes de columna de tampón que contenía NaCl 400 mM, urea 3M, citrato de sodio 20 mM, pH 5,5. La proteína se eluyó con un gradiente de 17 volúmenes de columna de NaCl 400-650 mM en urea 3 M, citrato de sodio 20 mM, pH 5,5.

Las fracciones se recogieron cuando se presentó un aumento en la absorbancia UV. El material carbamilado y mal plegado eluyó en la parte ascendente del pico de elución. Después de la elución de la proteína, la columna se regeneró con cloruro de sodio 1 M en urea 3 M, citrato de sodio 20 mM, pH 5,5, seguido por una disolución que contenía NaOH 0,5 N. La columna se lavó y se almacenó en NaOH 0,1 N. Las fracciones se analizaron por CEX HPLC y SDS-PAGE para determinar la pureza.

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Las fracciones que contenían más del 95% de su material como el pico principal que contenía TFPI o análogo del TFPI podían combinarse para producir una combinación HP en SP-Sepharose. De preferencia, las fracciones contenían más del 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% del TFPI o análogo del TFPI . Podía llevarse a cabo un ensayo intraproceso adicional (concentración de proteínas por absorbancia a 278 nm) para determinar el rendimiento de esta etapa de purificación.

Segunda concentración/diafiltración

La segunda (y última) etapa de concentración/diafiltración también utiliza una membrana de 10 kDa. La combinación de la etapa HP en SP-Sepharose se concentró hasta aproximadamente 12 g/l de proteínas y se diafiltró con 8 volúmenes de un tampón que contenía L-arginina 300 mM de y citrato de sodio 20 mM, pH 5,5. Se recuperó la disolución diafiltrada y se midió la concentración de proteínas a 278 nm para determinar el rendimiento de esta etapa. Normalmente, la concentración final de proteínas es de aproximadamente 10 mg/ml después de vaciar la unidad.

La sustancia farmacológica se puede filtrar a través de un filtro estéril de 0,2 µm y se almacena, de preferencia a temperaturas <60 ºC durante al menos 24 meses.

Formulación farmacéutica

El TFPI o análogo del TFPI producido según el procedimiento descrito anteriormente es adecuado para la administración terapéutica. En una forma de realización de preferencia, una formulación farmacéutica contiene 0,15 mg de ala-TFPI/ml en citrato de sodio 20 mM, L-arginina 300 mM y L-metionina 5 mM, pH 5,5. Véanse también las formulaciones descritas en los documentos con Nº de serie 60/438.519, 60/494.577, 60/509.260, 60/512.090, 60/438.524, 60/494.547, 60/509.276 y 60/512.092.

La divulgación anterior describe en general la presente invención. Los ejemplos específicos de esta divulgación se proporcionan para fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Análisis de aminoácidos y determinación de la composición de aminoácidos

Se hidrolizaron alícuotas por triplicado de cada lote de la sustancia farmacológica ala-TFPI recombinante (rTFPI), cada una con aproximadamente 600 picomoles (aproximadamente 20 µg) de proteínas, en vacío a 110 ºC durante 22 horas en 100 µl de HCl en ebullición constante contenía fenol al 1%. Las muestras de las preparaciones obtenidas después de la reducción y carboximetilación de los restos de cisteína fueron tratados de la misma manera. Los aminoácidos libres fueron separados por cromatografía de intercambio iónico usando un analizador de aminoácidos Beckman Modelo 6300, operado con el programa del fabricante para el análisis de los hidrolizados de proteínas con tampones de sodio. Después de la derivatización post-columna con ninhidrina, se realizó la cuantificación de aminoácidos a 570 nm para determinar aminas primarias o a 440 nm para prolina. La calibración del sistema se logró mediante el uso de una mezcla estándar de aminoácidos de Beckman. Todas las muestras fueron “enriquecidas” con norleucina (Nle) como patrón interno.

Cuantificación de norvalina y homocitrulina por medio de un procedimiento de intercambio iónico

La norvalina y la homocitrulina fueron cuantificadas por medio de un analizador de aminoácidos Beckman 6300, utilizando modificaciones del protocolo de elución con tampón de sodio para facilitar la resolución de norvalina y homocitrulina de la valina. Se utilizaron dos tampones en el protocolo de resolución: tampón Na-F de Beckman, que se valoró hasta pH de 3,75, con HCl 6 N y tampón Na-D de Beckman, que no se alteró en su pH ni en su concentración. El programa utilizó Na-F como el primer eluyente y la temperatura de la columna fue de 25 ºC. El flujo se mantuvo durante 40 minutos con un aumento de la temperatura de la columna hasta los 75 ºC después de 30 minutos de elución isocrática. A los cuarenta minutos después de la inyección, se utilizó Na-D durante otros 15 minutos de elución isocrática. Este programa dio la separación inicial de norvalina, valina y homocitrulina y la separación mantenida de los aminoácidos básicos.

La hidrólisis de las proteínas se realizó según lo descrito anteriormente. La calibración del sistema se logró mediante el uso de una mezcla estándar de aminoácidos de Beckman. La norvalina se cuantificó en relación con un patrón gravimétrico obtenido de Sigma. La homocitrulina se adquirió de ICN Biomedicals de Ohio y se preparó un patrón gravimétrico para la calibración del sistema (véase a continuación). Las muestras se “sobrecargaron” en la columna y se cuantificó la histidina, un aminoácido de baja incidencia en el rTFPI (tres moles por mol de proteína), para definir el número de moles de rTFPI presentes en la muestra para el cálculo del nivel de incorporación sobre la base del contenido de leucina (norvalina) y lisina (homocitrulina) de la proteína.

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Cuantificación de homocitrulina por medio de un procedimiento de RP-HPLC

La homocitrulina fue cuantificada usando el procedimiento de análisis de aminoácidos AccQ●Tag de Waters. Las proteínas se hidrolizaron en HCl 6 N que contenía fenol al 1% durante 22 a 24 horas a 110 ºC; los aminoácidos libres se derivatizaron con carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidilo (AQC) a un pH elevado en presencia de tampón borato. Tanto las aminas primarias como las secundarias se convirtieron de ese modo en derivados fluorescentes estables, que se resolvieron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa. Los experimentos de control indicaron que el 25% del análogo de aminoácido se convirtió en lisina durante la hidrólisis ácida. Se aplicó un factor de corrección a los datos para explicar esta reacción. Como en el caso de la cuantificación de norvalina, la histidina se cuantificó para definir el número de moles de rTFPI presentes en la muestra para el cálculo del nivel de modificación en función del contenido de lisina de la proteína.

Análisis de secuencias de aminoácidos del extremo N-terminal por degradación de Edman

El análisis de la secuencia N-terminal de los lotes del producto rTFPI a granel se realizó por medio de la degradación de Edman. Durante cada ciclo del análisis de secuencias, la muestra de proteína se expuso a una base volátil, un reactivo de acoplamiento (fenilisotiocianato) y un ácido anhidro para liberar el derivado feniltiohidantoína (PTH) de los restos de aminoácidos del extremo N terminal, que produce una proteína con un resto menos en el extremo N terminal. Los derivados PTH-aminoácido libres fueron identificados por HPLC de fase inversa.

El análisis de la secuencia se realizó con un secuenciador de proteínas Procise 494 de Perkin-Elmer Biosystems (PEB). Se diluyó en agua una alícuota de 1,5 µl de cada lote de rTFPI en una dilución 1:10, que contenía aproximadamente 50 picomoles de proteína, y se cargó directamente en una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF), utilizando el sistema ProSorb (PEB) para eliminar los excipientes. Los programas, protocolos y reactivos fueron proporcionados por el fabricante del instrumento.

Reducción y carboximetilación (RCM) de grupos sulfhidrilo

Se transfirieron las muestras a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con tapas o-ring y se secaron por centrifugación al vacío en un concentrador Speed-Vac de Savant. Cada muestra se disolvió en 250 µl de tampón de reducción y carboximetilación (RCM) que contenía tris (hidroximetil) aminometano (Tris) 0,2 M, clorhidrato de guanidina 6,0 M, ácido etilendiaminotetraacético 0,003 M, pH 8,5, y se añadieron 15 µl de DTT 1,0 M para reducir los puentes disulfuro. Los tubos se lavaron con gas argón y se taparon con fuerza para eliminar el oxígeno. Las muestras se incubaron a 60 ºC durante una hora en un Thermomixer. Se preparó una disolución de yodoacetato de sodio (IAA) fresca (0,25 g/ml, 1,2 M) en una alícuota diluida cuatro veces del tampón de RCM y se añadieron 26 µl de la disolución de IAA a cada muestra de rTFPI. Los tubos se lavaron con gas argón y se taparon con fuerza para eliminar el oxígeno. La reacción de carboximetilación se llevó a cabo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. La mezcla de reacción se desaló en columnas NAP-5. Se cuantificaron alícuotas del producto final de cada reacción por análisis de aminoácidos de verificar la concentración de proteínas.

Desalación de proteínas

En algunos casos, la proteína fue desalada antes del análisis o la digestión enzimática. Se utilizó un cartucho de guarda C4 Vydac (4,6 x 20 mm, tamaño de partícula 5 micrómetros) para separar las proteínas de los excipientes, tales como urea, arginina o clorhidrato de guanidina, que pudieran interferir con el análisis de una serie de tipos. Las muestras de uno a dos miligramos de proteína se inyectaron en la columna equilibrada en ácido trifluoroacético (ATF) al 0,1% en agua (tampón A). La proteína eluyó del cartucho con un caudal de 1,0 ml por minuto con el siguiente gradiente (puntos finales) con el tampón B (de acetonitrilo al 80% : ATF al 0,1% en agua): 0 minutos = 0% de B; 5 minutos = 0% de B, 15 minutos = 90% de B, 18 minutos = 90% de B, 20 minutos = 0% de B. El eluido se controló a una longitud de onda de 220 nm en una sensibilidad o intervalo de escala total de unidades de absorbancia (AUFS) de 2,0. Todos los excipientes eluyeron en los primeros 5 minutos de elución. El pico de rTFPI se recogió de forma manual y los disolventes volátiles se eliminaron por concentración en vacío.

Digestión con endoproteinasas: generación de fragmentos peptídicos no reducidos

Se digirieron diez microlitros de rTFPI del lote MAECM014 150 µl de Tris-HCI 100 mM, pH 6,8, con 0,8 µg de Asp-N (Boehringer Mannheim). Se digirieron diez microlitros de rTFPI en 150 µl de Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, con acetato de cinc 1,8 mM. La digestión de Asp-N se llevó a cabo a 37 ºC durante 18 horas. La digestión se detuvo por la adición de 150 µl de disolución de clorhidrato de guanidina 8 M y las muestras fueron almacenadas a -80 ºC antes del análisis.

Digestión con tripsina; generación de fragmentos peptídicos RCM

Se transfirieron alícuotas de 80 µl de cada rTFPI después de la reducción y carboximetilación (RCM) a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para la digestión con tripsina. Se disolvió tripsina porcina (20 µg) de Promega en ácido acético 0,05 M (40 µl) y se añadieron 1,6 µl de la disolución de tripsina (0,5 mg/ml) a cada muestra de rTFPI. La concentración final de rTFPI era de 0,4 mg/ml en Tris 35 mM (pH 8) con una relación de tripsina / TFPI de 1/50 (p/p).

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La digestión con tripsina se llevó a cabo a 37 ºC durante 18 horas. La digestión se detuvo por congelamiento de las muestras, que fueron almacenadas a -80 ºC antes del análisis.

Subdigestión con endoproteinasa Glu-C del péptido Asp-N no reducido de +42/43 Dalton

Los péptidos aislados de HPLC se secaron por medio de centrifugación en vacío. Cada muestra se volvió a disolver en 50 microlitros de disolución de acetato de amonio 30 mM, a pH 4. Se añadió aproximadamente medio microgramo de endoproteinasa Glu-C a cada muestra de péptido. Se dejó proceder la digestión a temperatura ambiente durante la noche. El pH se ajustó a 8 por la adición de tampón Tris-HCl 1 M a pH 8; a continuación se redujo con 0,5 µl de DTT 1 M durante 30 minutos a 60 ºC antes del análisis por CL-EM.

Subdigestión con endoproteinasa Arg-C de péptidos Glu-C en condiciones reductoras

Los péptidos aislados por HPLC se secaron mediante centrifugación en vacío. El tampón de digestión era Tris-HCl 150 mM y cloruro de calcio 15 mM a pH 7,5. El tampón de de activación de la enzima se preparó inmediatamente antes de la digestión mediante la adición de 300 µl de agua al material liofilizado suministrado en el kit (Boehringer Mannheim). La disolución de la enzima endoproteinasa Arg-C se preparó por reconstitución de 5 µg de enzima liofilizada en 250 µl de agua. Cada muestra se volvió a disolver en 7 µl de tampón de digestión, además de 3 µl de tampón de activación y 1 µl de disolución de enzima Arg-C. Se dejó proceder la digestión a 37 ºC durante 2 horas, antes del análisis por espectrometría de masas de láser por desorción/ionización asistida por matriz basada en la duración de la trayectoria del ión (MALDI-TOF-MS).

CL-EM de gradiente rápido; medición de la masa molecular del rTFPI intacto

Las mediciones de la masa molecular del rTFPI intacto se realizaron usando un sistema de HPLC Michrom Ultrafast Microprotein Analyzer (UMA) con interfaz a un espectrómetro de masas Sciex API 100 de Perkin-Elmer (CL-EM). Las muestras (aproximadamente 2 µg de cada una) se inyectaron en una columna de fase inversa (RP) (Zorbax Cyano, de 1 mm x 150 mm). El disolvente A era acetonitrilo al 5% en agua y ATF al 0,1% y el disolvente B era acetonitrilo que contenía ATF al 0,09%. Se realizó el gradiente de elución desde B al 5% hasta B al 95% en 10 minutos con un caudal de 50 µl/minuto. El efluente se separó en una proporción de 10:1 después de la celda de flujo, dirigiendo aproximadamente 5 µl/minuto hacia la fuente de iones por electrovaporización del espectrómetro de masas API 100. El voltaje de vaporización de iones se estableció en 4,5 kvoltios, y el voltaje del orificio se fijó en 50 voltios. El instrumento se calibró con los iones generados a partir de una mezcla de polipropilenglicol (PPG) suministrada por el fabricante.

Durante la ionización por electrovaporización, los péptidos o proteínas se introducen en la fuente de iones del espectrómetro de masas a pH bajo. Los sitios básicos de las proteínas y los péptidos (átomos de nitrógeno en las cadenas laterales de arginina, lisina e histidina, así como los grupos alfa amino de los restos del extremo N terminal) se protonan en diversos grados, lo que da como resultado iones moleculares de múltiples estados de carga (por ejemplo, [M + H]+ y [M + 2H]2+ dependiendo del número de sitios accesibles para la protonación. El detector registra la relación de masa a carga (m/z) de los iones moleculares, a partir de la cual se puede calcular la masa molecular mediante un algoritmo del software. La precisión de la masa de las mediciones en este modo fue del 0,01% de la masa molecular de rTFPI (+/-3 Dalton).

CL-EM de gradiente lento; mediciones de masa molecular intacta de rTPFI individual. Componentes

Se analizaron muestras de cinco µg por medio de una columna de fase inversa (RP) (Zorbax Cyano, de 1 mm x 150 mm). El disolvente A era acetonitrilo al 5% en agua y ácido trifluoroacético (ATF) al 0,1% y el disolvente B era acetonitrilo que contenía ATF al 0,09%. Se realizó el gradiente de elución desde B al 27% hasta B al 32% en 30 minutos con un caudal de 50 µl/minuto. La operación del espectrómetro de masas con ionización por electrovaporización se realizó como se describió anteriormente.

CL-EM de péptidos no reducidos digeridos; medición de la masa de los péptidos

Se sometieron alícuotas de diez microlitros de la digestión Asp-N al análisis de CL-EM utilizando un sistema de HPLC Michrom Ultrafast Microprotein Analyzer (UMA) con interfaz a un espectrómetro de masas Sciex API 100 de Perkin-Elmer. Las muestras se inyectaron en una columna de fase inversa (RP) para CL-EM utilizando una columna Vydac C 18, Reliasisl C 18 o Zorbax Cyano (de 1 mm x 150 mm, 5 µm de tamaño de partícula y 300 Angstrom de tamaño de poro). El disolvente A era acetonitrilo al 5% en agua con ácido trifluoroacético (ATF) al 0,1% y el disolvente B era acetonitrilo que contenía ATF al 0,09%. Se preparó el gradiente de elución desde disolvente B al 5% hasta 25% en 25 minutos y desde B al 25% hasta 36% en 30 minutos con un caudal de 50 µl/minuto. Para la digestión con tripsina, se realizó el gradiente de elución desde B al 5% hasta 45% en 80 minutos. El efluente se separó en una proporción de 10:1 después de la celda de flujo, dirigiendo aproximadamente 5 µl/minuto hacia la fuente de iones por electrovaporización del espectrómetro de masas API 100. El voltaje de vaporización de iones se estableció en 4,5 kvoltios y el voltaje del orificio se fijó en 50 voltios. El instrumento se calibró con los iones generados a partir de una mezcla de polipropilenglicol (PPG) suministrada por el fabricante. La precisión de la masa de la medición de la masa molecular por CL-EM fue ± 1 Dalton en el intervalo de masas de los péptidos rTFPI.

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EM MALDI-TOF; medición de la masa exacta de los péptidos

Los espectros de masas de MALDI-TOF fueron adquiridos en un instrumento Bruker Reflex equipado con un láser de nitrógeno (337 nanómetros, pulso de 4 nanosegundos) y una fuente de iones de extracción retardada. Las muestras para el análisis se prepararon añadiendo 1 µl a 1µl de una disolución saturada de ácido alfa-ciano-4hidroxicinámico. La mezcla se agitó por medio de vórtex y se cargó 1 µl en la diana de la muestra. La mezcla de muestra/matriz secada al aire se introdujo en el espectrómetro de masas por medio de un cierre de vacío. Los espectros se registraron utilizando un voltaje de aceleración de 20 kV y un voltaje del espejo de iones o reflectrón de 21,5 kV. Para la extracción retardada de iones, se aplicó una diferencia de potencial de 6 kV entre la sonda de la muestra y la lente de extracción. Los espectros se calibraron usando una mezcla de péptidos conocidos como patrón de calibración externo. La precisión de la masa de la medición del peso molecular por medio de EM de MALDI-TOF con extracción retardada fue de ± 0,5 Dalton utilizando calibración externa. En algunos casos, los espectros se calibra con un péptido conocido en la muestra. En este caso, la precisión de la masa era de ± 0,02 Dalton en masas de péptidos de 2000 Dalton o menos (aproximadamente 10 ppm).

EM nanoEV y EM/EM; identificación de las modificaciones de los péptidos

Los experimentos se realizaron en un instrumento de triple cuadrupolo Sciex API-III de Perkin Elmer equipado con una fuente de iones personalizada (Wilm and Mann, EMBL, Heidelberg, Alemania) y una versión actualizada de la celda de colisión a alta presión. Se cargó aproximadamente 1 µl de cada muestra en una aguja capilar de vidrio recubierta de oro y se colocó en la fuente del espectrómetro de masas con la ayuda de un microscopio estereoscópico. Los espectros de masas se registraron en el intervalo de m/z apropiado para el péptido objeto del análisis, a 8 segundos/exploración, usando un tamaño de paso de 0,1 Dalton. El instrumento se calibró con los iones generados a partir de una mezcla de PPG, suministrada por el fabricante.

Se obtuvieron los espectros de masas tándem con disociación inducida por colisión de baja energía (EM/EM DIC) en el modo de iones positivos. Las muestras se introdujeron en la fuente de iones del espectrómetro de masas como anteriormente. El segundo cuadrupolo se exploró en un intervalo de m/z de 50 para m/z del ión original a 5-10 segundos/exploración usando un tamaño de paso de 1 Dalton. El potencial del orificio se fijó en 40 voltios y la energía de la colisión era de aproximadamente 60 electrón voltios. En la espectrometría de masas en tándem, el ión molecular de interés, en una mezcla de péptidos, pueden ser introducido selectivamente en la celda de colisión. El bombardeo con un gas inerte en la celda de colisión da como resultado la fragmentación del péptido en los enlaces amida. Los fragmentos producidos en la celda de colisión son analizados por el segundo espectrómetro de masas. El espectro de masas en tándem proporciona información de la secuencia de aminoácidos que incluye la posición de cualquier modificación covalente.

Asignaciones de masas; masas monoisotópicas

En el análisis de los péptidos por EM de MALDI-TOF con extracción retardada de iones, el espectro de masas de un péptido puro posee una serie de picos en alta resolución, correspondiendo cada uno de los picos al péptido con una abundancia de isótopos específicos. La masa monoisotópica de un compuesto es la suma de las masas de los isótopos estables más ligeros para los elementos en el compuesto (por ejemplo, el carbono tiene 12,0000 Da; abundancia del 98,90%). Debido a que existe un isótopo estable del carbono con una masa de 13,0034 Da con una abundancia natural de 1,10%, cualquier compuesto orgánico con 100 átomos de carbono o más posee uno o más isómeros carbono-13. Los principales iones en el espectro de masas de un péptido son el resultado de la adquisición simple de un protón; el uso del software de calibración da una masa monoisotópica para los componentes del espectro, utilizando asignaciones para los isómeros carbono-12. La masa molecular monoisotópica se obtiene por el análisis del EM cuando los picos isotópicos se pueden resolver a nivel de isómeros, por ejemplo, en los valores de masa más bajos o mediante el uso de un instrumento de alta resolución.

Asignaciones de masas, valores promedio

La masa molecular media de un péptido o proteína es la suma de las masas químicas medias de cada elemento en la molécula. La masa química media de un elemento es la suma de las masas de todos los isótopos estables (por ejemplo, para el carbono es de 12,0111 Da), ponderada por la abundancia relativa. La masa molecular media se obtiene por el análisis del EM cuando los picos monoisotópicos no se puede resolver (por ejemplo, en los valores de masa altos).

Ejemplo 2

Liberación de la sustancia farmacológica, pruebas de los materiales de referencia

La comparación de la pureza del rTFPI preparado según el Proceso B y los preparados según el Proceso C, según la evaluación por CEX HPLC y SEC HPLC, se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente. El análisis de SDSPAGE con tinción de Coomassie o tinción de plata se muestra en las Figuras 4 y 5, respectivamente. Estos datos muestran la comparabilidad entre las sustancias farmacológicas del Proceso B y del Proceso C por medio de estos ensayos de liberación. En la Figura 11 se muestra la comparación de los mismos materiales por CN HPLC.

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Caracterización física de los componentes principales

Composición de aminoácidos

La composición de aminoácidos determinada para el rTFPI preparado según el Proceso C se muestra en la Tabla 4. Las recuperaciones de aminoácidos se normalizaron a restos por molécula. Los valores teóricos se predijeron a 5 partir de la secuencia de nucleótidos del gen de rTFPI. Los restos de ácido aspártico y asparagina se recuperaron en forma de ácido aspártico (Asx); los restos de ácido glutámico y glutamina se recuperaron en forma de ácido glutámico (Glx, todos los enlaces amida son hidrolizados por el tratamiento con ácido). Los valores para la cisteína se determinaron por la cuantificación de carboximetil-cisteína en las preparaciones de la proteína con RCM. El triptófano no se determinó (ND) ya que se destruye en las condiciones de hidrólisis convencionales. Las

10 recuperaciones de isoleucina fueron bajas debido a que los enlaces formados por este resto se hidrolizan sólo parcialmente en 22-24 horas. Los valores de cisteína indican reactividad completa con el reactivo de ácido yodoacético, dentro del error del procedimiento. La composición de aminoácidos de la proteína en los dos lotes de referencia es coherente con la secuencia prevista de la proteína.

Tabla 4. Composiciones de aminoácidos de las preparaciones de rTFPI

Aminoácido

Teoría Referencia Procedimiento B Referencia Procedimiento C

Asx

34 34,2 34,5

Thr

16 15,1 15,3

Ser

11 10,6 10,1

Glx

37 36,5 35,8

Pro

11 10,6 10,1

Gly

21 22,0 21,2

Ala

10 9,8 10,0

Val

6 6,4 6,5

Met

5 4,7 5,2

Ile

16 14,0 14,1

Leu

15 15,6 15,3

Tyr

10 10,0 10,0

Phe

21 20,8 21,2

His

3 3,1 3,0

Lys

25 24,8 25,1

Arg

17 16,9 19,5

Cys

18 17,4 17,2

Las muestras se sometieron a reducción y carboximetilación. Los resultados están expresados como moles de resto de aminoácido por mol de proteína. No se determinó Trp Asx = Asp + Asn; Glx = Glu + Gln

15

Extremo N terminal

Los resultados del análisis de la secuencia del extremo N terminal por degradación de Edman se presentan en la Tabla 5. Los rendimientos que se muestran son las recuperaciones brutas de los derivados PTH-aminoácidos correspondientes en cada ciclo de degradación. Las identidades se dedujeron de las recuperaciones relativas de 20 cada ciclo: el mayor incremento en el caso de restos no repetidos, un alto rendimiento sostenido (sin grandes aumentos de otros derivados) en el caso de los restos repetidos. Las diferencias en el rendimiento del ciclo reflejan una disparidad en la recuperación de la proteína a partir de los dos lotes en la membrana de PVDF durante el depósito de la muestra. Los lotes proporcionaron resultados equivalentes: una secuencia predominante de quince restos que estaba de acuerdo exactamente con la predicha a partir de la secuencia de nucleótidos del gen del rTFPI.

25

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Tabla 5. Análisis de secuencia de los lotes de referencia

Ciclo

Resto Rendimiento bruto del ciclo *

MAECM014

BP5806

1

Ala 28 17

2

Asp 16 10

3

Ser 10 5

4

Glu 11 5

5

Glu 17 7

6

Asp 9 3

7

Glu 12

7

8

Glu 12 7

9

His 4 1

10

Thr 5 2

11

Ile 5 2

12

Ile 9 5

13

Thr 6 4

14

Asp 4 2

15

Thr 7 4

* Rendimiento del ciclo en picomoles de PTH-aminoácido

Masa molecular

5 El análisis del rTFPI intacto por CL-EM mostró que el componente principal de cada lote posee la masa molecular predicha por la secuencia del gen (masa molecular teórica de 34.004 Da, con nueve puentes disulfuro), lo que indica que toda la proteína es expresada por la línea celular recombinante. La Figura 6 muestra los espectros de masas con electrovaporización deconvolucionados de un lote de rTFPI preparado según el Proceso B (MAECM014) y de un lote de rTFPI preparado según el Proceso C (PB5806). También se observaron componentes de rTFPI de menor

10 importancia y más detalles de estas estructuras se presentan en otros lugares. La Tabla 6 presenta las masas de los principales iones moleculares de rTFPI observados durante el análisis CL-EM.

Tabla 6. Masas moleculares medias de rTFPI intactos medidas por medio de CL-EM

Número de lote

Proceso Masa molecular observada (Da)1 Masa molecular teórica (Da)

MAECM014

Proceso B 32.006 32.004

PB5806

Proceso C 32.007 32.004

PB5666

Proceso C 32.005 32.004

PB6096

Proceso C 32.007 32.004

PB6376

Proceso C 32.006 32.004

1 Precisión de masa, aproximadamente +/- 3 Da

Estructura primaria

15 La secuencia completa del rTFPI fue confirmada por una combinación de análisis de un mapa peptídico con endoproteinasa Asp- N de la proteína no reducida (nativa) y un mapa de péptidos trípticos de la proteína RCM por CL-EM para los lotes MAECM014 y PB5806. Utilizando CL-EM, se obtiene tanto un mapa peptídico convencional como las masas moleculares de los péptidos en el cromatograma en un solo experimento. Los mapas peptídicos Asp-N y trípticos proporcionaron información acerca de las regiones de superposición de la secuencia de la proteína

20 para la confirmación de la estructura primaria. La Figura 7 muestra los cromatogramas UV, registrados durante el análisis CL-EM, de los péptidos digeridos con Asp-N para los lotes MAECM014 y PB5806 de rTFPI no reducido. La Tabla 7 presenta los péptidos identificados en el mapa peptídico Asp-N mediante la comparación de la relación m/z medida de los iones moleculares con los valores de m/z teóricos predichos para los péptidos digeridos con Asp-N. La Figura 8 muestra los cromatogramas UV, registrados durante el análisis CL-EM, de los péptidos trípticos para los

25 lotes MAECM014 y PB5806 de rTFPI RCM. La Tabla 8 presenta los péptidos identificados en los mapas de péptidos trípticos mediante la comparación de la relación m/z medida de los iones moleculares con los valores de m/z teóricos predichos para péptidos trípticos de rTFPI. La combinación de los resultados de CL-EM de los mapas peptídicos con Asp-N y trípticos explica el 100% de la secuencia de la proteína (277 de 277 restos) y confirma la estructura primaria de la proteína en ambos lotes.

30 Los resultados de los mapas de péptidos confirmaron no sólo la estructura primaria del rTFPI producido según el Proceso C, sino también la eliminación de las impurezas de rTFPI carbamilado. Se identificó que la modificación de rTFPI de +42 Da que se produce cuando se usa el procedimiento del Proceso B pertenece a la región de la proteína asociada con el tercer dominio Kunitz (restos 206-258). El análisis de las digestiones de Asp N y trípticos de rTFPI preparado según el Proceso C muestra que los péptidos que corresponden a este dominio tienen masas que son coherentes con la masa teórica del rTFPI sin modificar, lo que indica que el rTPFI producido en el proceso revisado ha sido purificado de las especies carbamiladas. Además, no se presentaron niveles detectables de homocitrulina durante este análisis, en consonancia con la ausencia de restos de lisina carbamilada en la muestra de rTFPI.

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Tabla 7. Péptidos identificados mediante CL-EM de la digestión con Asp-N de los lotes MAECM014 y PB5806 de rTFPI no desnaturalizado

Pico de HPLC

Masa observada MAECM014 Masa observada PB5806 Masa teórica* Extensión de restos Secuencia de aminoácidos

1

956,4 956,6 956,5 6-13 DEEHTIIT (ID SEC. Nº 2)

2

1008,6 1008,6 1008,5 270-277 EEIFVKNM (ID SEC. Nº 3)

3

10031,8 10032,5 10031,7 183-269 Kunitz 3 EFHGPSWCLTPADRGL CRANENRFYYNSVIGK CRPFKYSGCGGNENN FTSKQECLRACLLGFIQ RISKGGLIKTKRKRKKQ RVKIAY (ID SEC. Nº 4)

4

10049,8 10050,5 10049,7 183-269 (+H2O) Kunitz 3 cortado EFHGPSWCLTPA/DRG LCRANENRFYYNSVIG KCRPFKSGCGGNENN FTSKQECLRACKKGFI QRISKGGLIKTKRKRKK QRVKIAY (ID SEC. Nº 5)

5

2708,7 2709,1 2709,0 158-182 DNYGTQLNAVNNSLTP QSTKVPSLF (ID SEC Nº 6)

6

9110,4 9111,0 9109,2 80-157 Kunitz 2 DNANRIIKTTLQQEKPD FCFLEEDPGICRGYITR YFYNNQTKQCERFKYG GCLGNMNNFETLEECK NICEDPGNGFQV (ID SEC Nº 7)

7

7764,1 7764,3 7764,0 14-79 (+H2O) Kunitz 1 cortado DTELPPLKLMHSFCAF KA/DDGPCKAIMKRFFF NIFTRQCEEFIYGGCEG NQNRFESLEECKKMCT R (ID SEC Nº 8)

* Masas monisotópicas inferiores a 1500 Da, masas moleculares medias superiores a 1500 Da. Los picos 4 y 7 de la HPLC contenían cada uno dos péptidos unidos juntos por los enlaces disulfuro en la región Kunitz.

Tabla 8. Péptidos identificados mediante CL-EM a partir de la digestión con tripsina de los lotes MAECM014 y PB5806 de rTFPI RCM

Pico de HPLC

Masa observada MAECM014 Masa observada PB5806 Masa teórica* Extensión de restos Secuencia de aminoácidos

1

588,4 588,4 588,26 80-84 R <DNANR> I (ID SEC Nº 9)

2

592,2 592,2 592,23 122-125 K <QCER> F (ID SEC Nº 10)

3

567,4 567,2 567,21 76-79 K <MCTR> D (ID SEC Nº 11)

4

461,2 461,2 461,27 38-41 K <AIMK> R (ID SEC Nº 12)

5

705,6 705,4 705,31 234-238 K <QECLR> A (ID SEC Nº 13)

6

608,4 608,2 608,33 109-113 R <GYITR> Y (ID SEC Nº 14)

7

486,4 486,4 486,32 251-255 K <GGLIK> T (ID SEC Nº 15)

8

707,6 707,4 707,34 215-219 K <CRPFK> Y (ID SEC Nº 16)

9

1535,3 1535,2 1535,56 220-233 K <YSGCGGNENNFTSK> Q (ID SEC Nº 17)

10

619,4 619,4 619,34 243-247 K <GFIQR> I (ID SEC Nº 18)

11

747,4 747,4 747,44 242-247 K <KGFIQR> I (ID SEC Nº 19)

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12

1076,7 1076,6 1076,49 114-121 R <YFYNNQTK> Q (ID SEC Nº 20)

13

1169,6 1169,6 1169,53 67-75 K <FESLEECKK> M (ID SEC Nº 21)

14

1041,8 1041,6 1041,43 67-74 R <FESLEECK> K (ID SEC Nº 22)

15

1962,1 1962,4 1963,05 51-66 R <QCEEFIYGGCGEGNQNR> F (ID SEC Nº 23)

16

1089,6 1089,6 1089,55 206-214 R <FYYNSVIGK> C (ID SEC Nº 24)

17

1140,6 1140,5 1140,51 22-30 K <LMHSFCAFK> A (ID SEC Nº 25)

18

1110,6 1110,5 1110,60 267-275 K <IAYEEIFVK> N (ID SEC Nº 26)

19

3498,0 3497,8 3497,72 146-177 K <NICEDGPNGFQVDNYGTQL NAVNNSLTPQSTK> V (ID SEC Nº 27)

20

2138,8 2138,0 2138,34 128-145 K <YGGCLGNMNNFETLEECK> N (ID SEC Nº 28)

21

2381,8 2382,3 2382,52 1-21 <ADSEEDEEHTIITDTELPPLK> L (ID SEC Nº 29)

22

2585,8 2585,0 2585,86 88-108 K <TTLQQELPDFCFLEEDPGIC R> G (ID SEC Nº 30)

23

5618,1 5618,9 5618,04 128-177 K <YGGCLGNMNNFETLEECKNI CEDGPNGFQVDNYGEQLNAVN NSLTPQSTK> V (ID SEC Nº 31)

24

2216,9 2216,8 2217,5 178-196 K <VPSLFEFHGPSWCLTPADR> G (ID SEC Nº 32)

25

1090,7 1090,6 1090,56 43-50 R <FFFNIFTR> Q (ID SEC. Nº 33)

* Masas monisotópicas inferiores a 1500 Da, masas moleculares medias superiores a 1500 Da.

Estructura secundaria/terciaria

La estructura secundaria y terciaria del rTFPI fue confirmada por el análisis del mapa de péptidos con endoproteinasa Asp-N de los lotes MAECM014 y PB5806, en los que se observaron los dominios Kunitz intactos 5 (Figura 11 y Tabla 8). La Figura 9 ilustra la estructura del rTFPI, indicando los tres dominios Kunitz y los sitios de escisión de Asp-N. Bajo condiciones no desnaturalizantes, se observaron siete péptidos resultantes de la escisión con Asp-N entre los dominios Kunitz. Dos de estos péptidos también se escindieron internamente, pero los péptidos resultantes se mantienen unidos por puentes disulfuro (Figura 9). Los datos son coherentes con la presencia de puentes disulfuro dentro de los dominios Kunitz y la ausencia de puentes disulfuro entre los dominios Kunitz, como

10 se predijo para la estructura secundaria y terciaria de la proteína nativa.

Ejemplo 3

Identificación y caracterización de los componentes menores

Evaluación de la pureza por CNHPLC

Una comparación de los cromatogramas de CN HPLC del rTFPI preparado según el Proceso B (A) y preparado

15 según el Proceso C (B) se muestra en la Figura 10. El Proceso C produce material con un aumento en la pureza por CN HPLC. Todos los picos que son separados por medio de este ensayo contienen rTFPI. El análisis de los picos usando EM-EV ha determinado que el material del Proceso B contenía aproximadamente un 75% de rTFPI que tenía la masa teórica, un 5-10% de rTFPI que tenía una masa que estaba aumentada en 16 uma y que se cree que contiene un resto de metionina oxidado (pico 1), y aproximadamente un 15% de rTFPI que tenía una masa que

20 estaba aumentada en 42 o 43 uma, y que se cree que contiene restos de lisina acetilados (pico 3). El material preparado según el Proceso C contenía el pico principal de aproximadamente 90% de rTFPI y un 5-10% de rTFPI que contenía un resto de metionina oxidado (pico 1). A diferencia del proceso anterior, el proceso de la invención no parece producir niveles apreciables de rTFPI acetilado. El patrón de referencia para el proceso de la invención (pico 2, Figura 10) muestra un pequeño pico muy poco definido, que eluye inmediatamente antes del pico principal de

25 rTFPI y que fue identificado como rTFPI que contenía sustituciones de leucina por norvalina como se describe en las secciones siguientes.

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Identificación de la incorporación errónea de norvalina

Se ha identificado una sustitución de leucina por norvalina en proteínas heterólogas expresadas en E. coli y se cree que se producen a través de una incorporación errónea a nivel del ARNt (Apostol y col. J. Biol. Chem. 272, 2898028988, 1997). El rTFPI contiene 15 restos de leucina y la incorporación de norvalina en lugar de leucina fue

5 identificada en cuatro posiciones de los restos 90, 100, 181 y 191. El nivel de incorporación errónea en sitios específicos de los lotes de rTFPI preparados según el Proceso B (MAECM014) y según el Proceso C (PB5806) se calculó mediante la comparación de las áreas de los picos UV, registrados durante la CL-EM, de los péptidos trípticos normales de RCM rTFPI con los correspondientes péptidos trípticos que contenían norvalina. La cantidad total de norvalina se cuantificó por medio del análisis de aminoácidos.

10 Identificación de norvalina en el pico poco definido recogido de la CN HPLC

La masa molecular media de rTFPI en el pico poco definido del ensayo de CN HPLC fue identificado como 31.989 Da por CL-EM. Este valor es 15 Da +/-3 Da inferior a la masa molecular predicha para rTFPI (32.004 Da). Para identificar la naturaleza de la modificación, se redujo y se carboximetiló la proteína del pico 2 (Figura 10) y a continuación se digirió con tripsina. Los péptidos tríptico fueron analizados por CL-EM y se recogieron para la

15 medición de la masa exacta por medio de EM de MALDI-TOF. Cuatro de las seis fracciones recogidas mostraron masas moleculares monoisotópicas que eran 14 Da más bajas que los péptidos predichos (Tabla 9). Se secuenciaron los péptidos por nanoEV y EM/EM y por degradación de Edman. La modificación se identificó como la incorporación de norvalina en las posiciones predichas de los restos de leucina 90, 100, 181 y 191 y se confirmó por el tiempo de retención del PTH-aminoácido durante el análisis de secuencia de Edman.

20 Tabla 9. Péptidos trípticos RCM que contienen norvalina identificados por masa exacta con EM de MALDI-TOF, NanoEV EM/EM y análisis de secuencia de Edman

Fracción

Masa observada Masa teórica Extensión de restos Secuencia de aminoácidos

1

2571,1 2585,2 88-108; nV 100 TTLQQEKPDFCFnVEEDPGICR (ID SEC Nº 34)

2

2571,0 2585,2 88-108; nV 90 TTnVQQEKPDFCFLEEDPGICR (ID SEC Nº 35)

3

2585,1 2585,2 88-108 TTLQQEKPDFCFLEEDPGICR (ID SEC Nº 36)

4

2203,0 2117,0 178-196; nV 181 VPSnVFEFHGPSWCLTPADR (ID SEC Nº 37)

5

2202,8 2117,0 178-196; nV 191 VPSLFEFHGPSWCnVTPADR (ID SEC Nº 38)

6

2216,8 2117,0 178-196 VPSLFEFHGPSWCLTPADR (ID SEC Nº 39)

(Los péptidos trípticos del pico 2 de la CN HPLC del lote PB6096 fueron aislados mediante CL-EM. La norvalina está abreviada como nV, y se presenta en negrita en las secuencias de péptidos. nV 100, nV 90, nV 181 y nV 191 indican la incorporación errónea en las posiciones 100, 90, 181 y 191, respectivamente.

Cuantificación de la incorporación errónea de norvalina en sitios específicos por CL-EM

Debido a que el pico poco definido de la RP HPLC sólo podía contener una fracción de rTFPI con incorporación

25 errónea de norvalina, se analizó material de referencia no fraccionado preparado según el Proceso C para la cuantificación de los péptidos que contenían norvalina. El lote PB5806 se redujo, se alquiló y posteriormente se sometió a digestión con tripsina. Se realizaron análisis de CL-EM por cuadruplicado para la cuantificación de los péptidos que contenían norvalina. Los datos fueron adquiridos utilizando el modo de exploración completa para la identificación de la masa molecular y monitorización selectiva de iones (SIM) para la detección con mayor

30 sensibilidad de los péptidos que contenían norvalina.

La Figura 12A muestra el cromatograma UV registrado entre 30 y 60 minutos durante la CL-EM. El pico de elución aproximadamente a los 51 minutos, fue identificado como el péptido tríptico T(88-108) con una masa molecular media de 2585,2 Da. El cromatograma SIM para el péptido T(88-108) se muestra en la Figura 12B. Cabe destacar que hay un ligero retardo entre la detección de los péptidos por el detector de UV y la detección en el espectrómetro 35 de masas en la CL-EM, debido al tiempo que tarda el eluyente en pasar entre los dos detectores. Los picos de menor importancia que eluyen aproximadamente a los 48 minutos y 49 minutos fueron identificados como el péptido T(88-108) con incorporación errónea de norvalina en la posición del resto 100 (péptido nV 100) y en la posición del resto 90 (péptido nV 90), respectivamente (masa molecular media 2571,2 Da; masa teórica 2571,2 Da). Los sitios de incorporación de norvalina se obtuvieron en base a la comparación con los péptidos del pico poco definido de la RP

40 HPLC en el lote PB6096 de rTFPI identificados anteriormente por medio del análisis por degradación de Edman y nanoEV EM/EM.

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La figura 12C muestra el cromatograma SIM para los péptidos nV 100 y nV 90, en el que los dos péptidos se pueden observar claramente. La proporción de los péptidos T(88-108), nV 100 y nV 90 se calculó a partir de la áreas de los picos en el cromatograma UV (Figura 12A) y los valores obtenidos a partir de cuatro análisis por separado. Se utilizó un enfoque similar para cuantificar el grado de sustitución de norvalina en los péptidos trípticos que contienen los

5 restos 178-196.

La Tabla 10 muestra la cuantificación de la incorporación errónea de norvalina en las posiciones de los restos 90, 100, 181 y 191 en análisis de CL-EM por cuadruplicado. Se integraron las áreas de los picos a 215 nm para los péptidos que se muestran en las ID SEC Nº 34-39. Se sumaron las áreas de los picos para los péptidos 1, 2 y 3 y se calculó la relación de cada pico a la suma y se muestra en la tabla. Lo mismo se realizó para el péptido 4, el péptido

10 5 y el péptido 6. La norvalina está abreviada como nV, y se muestra en negrita en las secuencias de péptidos. Se calcularon las cantidades relativas de incorporación errónea mediante la comparación de las áreas de los picos UV de los péptidos que contenían norvalina con el péptido correspondiente no sustituido.

Estos resultados compuestos muestran que tuvo lugar una sustitución de norvalina en el lote de referencia PB5806 (preparado según el Proceso C) en las posiciones de los restos 90, 100, 181 y 191. El nivel de incorporación en

15 estos sitios es del 3,3%, 4,3%, 2,8% y 1,4%, respectivamente, que corresponde a un nivel molar de incorporación errónea en PB5806 de al menos 11,8%. Por el contrario, la incorporación errónea de norvalina en el lote de referencia preparado según el Proceso B (MAECM014) sólo se detectó en un nivel mínimo, posiblemente en el resto 100, y se estimó en <0,2%.

Tabla 10.

Análisis HPLC

Péptido Péptido Péptido Péptido Péptido Péptido

1

4,4% 3,1% 92,5% 3,0% 1,5% 95,5%

2

4,2% 3,8% 92,0% 2,8% 1,4% 95,8%

3

4,1% 2,9% 93,0% 2,8% 1,3% 95,8%

4

4,4% 3,4% 92,1% 2,8% 1,3% 95,9%

Promedio de 4

4,3% 3,3% 92,4% 2,8% 1,4% 95,8%

* La identidad de los péptidos se muestra a continuación:

20

Péptido 1: 88-108 TTLQQEKPDFCFnVEEDPGICR (ID SEC Nº 34)

Péptido 2: 88-108 TTnVQQEKPDFCFLEEDPGICR (ID SEC Nº 35)

Péptido 3: 88-108 TTLQQEKPDFCFLEEDPGICR (ID SEC Nº 36)

Péptido 4: 178-196 VPSnVFEFHGPSWCLTPADR (ID SEC Nº 37)

25 Péptido 5: 178-196 VPSLFEFHGPSWCnVTPADR (ID SEC Nº 38)

Péptido 6: 178-196 VPSLFEFHGPSWCLTPADR (ID SEC Nº 39)

Cuantificación de la incorporación errónea total de norvalina por medio del análisis de aminoácidos

La Tabla 11 resume los resultados de la cuantificación de norvalina en las preparaciones de rTPFI por medio del

análisis de aminoácidos por intercambio iónico. Los resultados se expresan como el porcentaje de restos de leucina 30 incorporados erróneamente como norvalina en una base molar. Con este procedimiento de análisis, no existe una

cantidad detectable de norvalina en el rTFPI del lote MAECM014 (Proceso de referencia B). Sin embargo, el

Proceso de referencia C (PB5806) y los otros lotes preparados por el nuevo proceso contienen un promedio de

2,64% de norvalina por mol de leucina. Si la incorporación errónea de norvalina por leucina se produce de manera

aleatoria, y si hay un promedio de una norvalina por molécula de rTFPI, esto que indica que hasta un 40% de la 35 moléculas de rTFPI tendrán una sustitución de norvalina. Estos resultados confirman las predicciones de contenido

relativo generadas partir de los datos de CL-EM.

Tabla 11.

Lote

Contenido de norvalina (%)

MAECM014

No se detecta

PB5806

2,52

PB6376

2,45

PB5666

3,03

PB6096

2,54

imagen23

Efecto de la sustitución de norvalina sobre la actividad in vitro

La Tabla 12 resume la actividad biológica en el tiempo de protrombina (TP) in vitro para los materiales preparados según el Proceso B y los preparados según el Proceso C. La presencia de norvalina no tiene un efecto negativo sobre la actividad biológica del rTFPI in vitro. La actividad en el TP se mantuvo constante a pesar de que la pureza según CN HPLC se incrementó sustancialmente, lo que indica que esta heterogeneidad tiene un efecto mínimo sobre la actividad.

Tabla 12.

Lotes de productos farmacológicos

Proceso de la sustancia farmacológica Sustitución de norvalina (%) Pureza por CN HPLC (Pico principal %) Actividad en TP (%)

MAJPN002

Proceso B ND 76 102

NA1246

Proceso B ND 78 74

NA4721

Proceso B ND 78 117

NA0182

Proceso B ND 77 104

PA1408

Proceso B ND 80 108

PB6095

Proceso C 2,5% 92 98

ND, no se determinó. La actividad en TP se expresa como % del control; la especificación de liberación es del 50-150%

Ejemplo 4

10 Componentes de menor importancia en la evaluación de pureza por HPLC de intercambio catiónico

La Figura 13 muestra una comparación de rTFPI antes y después de realizar la cromatografía HP en SP-Sepharose. La pureza del pico principal aumentó del 89% (carga) hasta el 100% (combinación) después de la etapa de cromatografía HP en SP-Sepharose.

Ejemplo 5

15 Análisis de la sustancia farmacológica rTFPI no fraccionada intacta

Se realizó el análisis del rTFPI intacto por CL-EM para demostrar la identidad del material producido según el Proceso C. La masa observada del componente principal fue de 32.007 Da, que es coherente con la masa teórica de 32.004 Da para rTFPI. Estos resultados indican que la proteína completa es expresada por la línea celular recombinante.

20 CL-EM de gradiente lento

Se analizaron los lotes de rTPFI no fraccionado MAECM014 (preparado según el Proceso B) y PB5806, PB6096 y PB6770 (preparados según el Proceso C) por CL-EM de gradiente lento para confirmar la asignación de los picos de elución temprana y tardía.

La Figura 14 muestra los cromatogramas UV, registrados durante la CL-EM, en los que se observa el pico de elución

25 temprana en todos los lotes de rTFPI, pero el pico de elución tardía sólo se observa en el lote de referencia MAECM014. Los cromatogramas son similares a los observados en el ensayo de evaluación de pureza, con la excepción de que los picos están menos resueltos por CL-EM debido a la utilización de un procedimiento de columna microbore en este análisis. Los espectros de masas deconvolucionados del pico de elución temprana en todas las muestras determinó que el ión molecular más importante observado en todo el espectro es coherente con

30 el rTFPI que contiene sulfóxido de metionina.

Los materiales preparados según el Proceso C también contienen un ión molecular con una masa 28 Da inferior al TFPI normal. Esto es coherente con las moléculas del TFPI que contienen dos sitios de incorporación de norvalina por molécula en los restos de leucina previstos. Se determinó que el espectro de masas deconvolucionado para el pico de elución tardía en el lote MAECM014 contiene un componente que es una especie con +42/43 Da. Los

35 espectros de masas deconvolucionados de la misma región en los cromatogramas UV de los nuevos lotes muestran cantidades significativamente más bajas del componente con +42/43 Da. Esta observación es coherente con la identificación del rTFPI acetilado en el material de referencia preparado según el Proceso B pero no en el material preparado según el Proceso C.

CL-EM de gradiente rápido

40 El espectro de masas de la referencia del Proceso B muestra un componente de menor importancia con una masa molecular 42/43 Da mayor que el rTFPI normal (aproximadamente con abundancia relativa del 15%). Se identificaron dos péptidos menores aislados del lote MAECM014 de rTFPI por digestión secuencial con Asp-N y ArgC como péptidos acetilados, sobre la base de medición de la masa exacta por EM de MALDI-TOF y el análisis de la secuencia por nanoEV EM/EM (DTELPPLKLMHSFCAFKA, ID SEC Nº 40 y FESLEECKKMCTR, ID SEC Nº 41). Los péptidos aislados no permiten identificar la proporción de especies +42/43 en el lote MAECM014 de rTFPI intacto que poseen la modificación +42 Da (acetilado). Sin embargo, tomados en conjunto con los datos de CEX-HPLC y la

imagen24

5 CL-EM de gradiente lento, es probable que el componente de menor importancia con +42/43 Da detectado en el lote de referencia del Proceso B por HPLC CN sea principalmente rTFPI acetilado.

Ejemplo 6

Eliminación de las proteínas de E. coli

Para la comparación de las cantidades relativas de proteínas de E. coli en las preparaciones de rTFPI producidas 10 según el Proceso B y en las preparaciones de rTFPI producidas según el Proceso de C, se analizaron muestras de este último procedimiento mediante un ensayo ELISA con anticuerpos generados contra proteínas de E. coli.

Los resultados de la Tabla 13 muestran que el proceso de purificación es eficiente en la eliminación de las supuestas impurezas de E. coli por debajo del nivel de detección de este ensayo.

Tabla 13.

Número de lote

Proceso PEC (ng/mg)

MAECM014

2 <2

PB5666

3 <2

PB5806

3 <2

PB6096

3 <2

15

Ejemplo 7

Sustitución de norleucina

Está bien documentado que el análogo de la metionina, norleucina puede sustituir a la metionina en las proteínas bacterianas. Esta sustitución puede ser especialmente frecuente en células de E. coli sometidas a condiciones de

20 estrés para la sobreproducción de una proteína recombinante. El ala-TFPI recombinante tiene cinco restos metionilo, incluyendo uno en el extremo carboxilo terminal. El procedimiento descrito en el presente documento mejora el nivel de expresión sin aumentar la cantidad de aminoácidos sustituidos.

Se prepararon tres lotes de rTFPI según el Proceso C y se realizaron pruebas para verificar la sustitución de norleucina. Los resultados se muestran en la Tabla 14, en la que la norleucina se expresa como un porcentaje de la

25 metionina total.

Tabla 14. Detección de norleucina en rTFPI aislado a partir de cuerpos de inclusión producidos mediante el Proceso B y el Proceso C

Número de lote

Proceso Norleucina

XAEFL012

Proceso B 0,6%

BNA078

Proceso C 0,3%

BNA079

Proceso C 0,2%

BNA086

Proceso C 0,3%

El nivel de norleucina en estos materiales fue ligeramente inferior al nivel presente en los materiales preparados

30 según el Proceso B. El límite de cuantificación era del 1%; por consiguiente, ambos niveles están por debajo del nivel de cuantificación exacta del presente ensayo.

Ejemplo 8

Medición de la desamidación

Preparación del patrón de calibración. Se prepararon patrones de S-adenosil-homocisteína (SAH) para el análisis

35 de HPLC mediante la dilución de la disolución madre patrón de SAH de Promega SAH (15,1 µM) hasta concentraciones de 0,625, 1,25, 2,50 y 3,75 µM utilizando agua Milli-Q. Las muestras se mantuvieron a 2-8 ºC antes del análisis por HPLC.

Preparación de las muestras de rTFPI. Antes de la preparación de las muestras, se diluyeron muestras de la sustancia farmacológica rTFPI a granel (10,0 mg/ml) hasta 0,15 mg/ml utilizando tampón de formulación de rTFPI. A 40 continuación se prepararon las muestras de rTFPI para la incubación mediante la adición de 87 µl del TFPI a una

imagen25

mezcla de reacción que contenía 30 µl de 5X tampón de reacción Promega, 3 µl de S-adenosil-L-metionina y 30 µl de PIMT. Después de una breve agitación con vórtex, las muestras se incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 30 ºC. Después de la incubación, se añadieron 30 µl de disolución de parada NR Promega a cada muestra seguida por una breve agitación con vórtex. Las muestras se mantuvieron a 2-8 ºC antes del análisis por HPLC.

5 RP-HPLC. La medición de la SAH se llevó a cabo mediante un procedimiento de RP-HPLC modificado desarrollado por Carlson y Riggin2. El análisis de las muestras se realizó usando un sistema de HPLC de Waters Alliance equipado con una columna YMC ODS-AQ 5 µm, 120 A, de 4,6 x 250 mm (Waters P/N AQ12S052546WT). El Eluyente A estaba compuesto por KH2PO4 25 mM, ácido 1-octanosulfónico 10 mM y metanol al 10%, mientras que el Eluyente B era metanol al 100%. El sistema se equilibró con Eluyente B al 10% con un caudal de 1,0 ml/min. La

10 columna se mantuvo a temperatura ambiente con detección controlada a 260 nm. Después de la inyección de la muestra (40 µl para los patrones de SAH y 100 µl para las muestras del TFPI ), la separación se realizó utilizando un gradiente de Eluyente B del 10 al 60% durante 15 minutos seguido por un lavado de la columna con Eluyente B al 90% durante 3 minutos. La columna se equilibró nuevamente con las condiciones iniciales (Eluyente B al 10%) durante 9 minutos antes de la siguiente inyección.

15 Análisis de datos. Después de generar una curva de calibración para la serie de patrones de SAH, se determinó el nivel de SAH en pmol para cada muestra del TFPI . A continuación se determinaron los niveles de desamidación para cada muestra del TFPI utilizando la siguiente fórmula:

pmol deSAH

Desamidación(%)  100

pmol deTPFI inyectado

Estabilidad del producto farmacéutico rTFPI. Como indica la Tabla 15, los niveles relativos de desamidación

20 aumentan en función del tiempo de almacenamiento y la temperatura. La serie de muestras de estabilidad para el lote QA0477 mostró los siguientes niveles de desamidación en el punto final: 5,2% (-60 ºC, 22 meses), 26% (+8 ºC, 24 meses) y 57% (+25 ºC, 6 meses).

Estabilidad de la sustancia farmacológica rTFPI a granel. El análisis de los cuatro lotes de fármaco a granel almacenados a - 60 ºC durante aproximadamente 24 para meses reveló que los niveles de desamidación variaron

25 del 4,6% al 7,6% con una media del 5,8% (Tabla 15). El nivel de desamidación fue muy similar al del producto farmacológico TFPI (5,2%) almacenado en condiciones equivalentes.

Muestras de reintroducción clínica. Como revela la Tabla 15, el análisis de los tres lotes destinados a la reintroducción clínica almacenados a +5 ºC durante aproximadamente 2 años, mostró niveles de desamidación del 15,9% en promedio. Estos resultados fueron muy similares a los de las muestras retenidas para operaciones

30 analíticas (AnOps) almacenadas en condiciones idénticas (desamidación del 15,4%).

Tabla 15. Resultados para la medición de ácido isoaspártico en las muestras del producto farmacológico rTFPI y de la sustancia farmacológica rTFPI a granel

AID Información Lote Orientación Temp. Meses Desamidación de la muestra %

41731 Reintroducción PC0895A Vertical +5 ºC 24,8 14,5 clínica ID#202008 41728 Reintroducción QA4321C Vertical +5 ºC 20,5 15,3 clínica ID#227085 41734 Reintroducción QA4322B Vertical +5 ºC 20,4 18,0 clínica ID#228782 41737 Retenida para PC0895 Vertical +5 ºC 24,8 16,2 AnOps 41743 Retenida para OA4321 Vertical +5 ºC 20,5 15,3 AnOps 41740 Retenida para OA4322 Vertical +5 ºC 20,4 14,6 AnOps 41716 Producto QA0477 Vertical -60 ºC 22,3 5,2 farmacológico TFPI 41704 Producto QA0477 Invertido +8 ºC 6,0 8,2 farmacológico TFPI 41707 Producto QA0477 Invertido +8 ºC 12,0 15,3 farmacológico TFPI 41710 Producto QA0477 Invertido +8 ºC 18,0 20,2 farmacológico TFPI

imagen26

41713 Producto QA0477 Invertido +8 ºC 24,0 26,1 farmacológico TFPI 41719 Producto QA0477 Invertido +25 ºC 3,0 33,7 farmacológico TFPI 41722 Producto QA0477 Invertido +25 ºC 4,5 46,2 farmacológico TFPI 41725 Producto QA0477 Invertido +25 ºC 6,1 57,3 farmacológico TFPI 41750 Sustancia PC0522 Vertical -60 ºC 26,0 4,6 farmacológicaTFPI a granel 41759 Sustancia PC0788 Vertical -60 ºC 25,8 5,3 farmacológicaTFPI a granel 41756 Sustancia PC1058 Vertical -60 ºC 25,6 5,6 farmacológicaTFPI a granel 41753 Sustancia PC1611 Vertical -60 ºC 24,8 7,6 farmacológicaTFPI a granel

Por consiguiente, el procedimiento ISOQUANT® de Promega es un medio simple y relativamente rápido de medición de los niveles relativos de desamidación en muestras de rTFPI. Los resultados mostraron que la desamidación relativa en rTFPI aumenta en función del tiempo de almacenamiento y de la temperatura; las muestras de

5 reintroducción clínica de rTFPI y las muestras AnOps retenidas mostraron niveles similares de desamidación; y tanto la sustancia farmacológica a granel como el producto farmacológico de rTFPI mostraron ambos niveles similares de desamidación.

Ejemplo 9

Descripción de la prolongación del tiempo de protrombina por el TFPI. El ensayo del tiempo de protrombina es

10 un ensayo basado en la coagulación del plasma en el que la coagulación se inicia por la adición de factor tisular (TF) y calcio (Innovin) al plasma. El TFPI prolonga el tiempo de protrombina en una forma dependiente de la dosis. Las muestras de prueba del TFPI o análogos del TFPI se pueden comparar con patrones del TFPI o análogos del TFPI en este ensayo.

Protocolo: El programa completo del ensayo de tiempo de protrombina (PT) se ejecutó en el coagulómetro Electra

15 9000 de MLA. La reacción se inició por medio del instrumento con la adición de µl de Innovin a las muestras de plasma. Se registró el tiempo hasta la formación del coágulo. Diez µl de tampón arg/fosfato, añadidos a 100 µl de plasma, dieron un tiempo de coagulación similar al plasma sin adiciones, 10,9 y 11,0 segundos, respectivamente. Las actividades de las muestras de prueba se compararon con un patrón de rTFPI, utilizando una curva estándar de 0-4,5 µg/ml de rTFPI. Los valores medios de los análisis por triplicado se muestran en la Tabla 16.

20 Tabla 16. Actividad funcional por ciento en relación al patrón según se determina por la prolongación del tiempo de protrombina

AID

Descripción Lote Nº Temp. ºC Tiempo, meses Prom. Desviación estándar

41598

Estabilidad del PF QA0477 8 6 120 145 130 131,7 12,6

41618

Estabilidad del PF QA0477 8 12 99 108 110 105,7 5,9

41623

Estabilidad del PF QA0477 8 18 115 130 135 126,7 10,4

41633

Estabilidad del PF QA0477 8 24 113 121 125 119,7 6,1

41638

PF congelado QA0477 <-60 22 126 141 121 129,3 10,4

41593

Estabilidad acel. del PF QA0477 25 3 109 119 112 113,3 5,1

41603

Estabilidad acel. del PF QA0477 25 4,5 102 100 108 103,3 4,2

41608

Estabilidad acel. del PF QA0477 25 6,1 108 114 111 111,0 3,0

41646

Reintroducción clínica del PF QA4321C 5 20,5 112 130 123 121,7 9,1

41651

Reintroducción clínica del PF PC0895A 5 24,8 119 132 132 127,7 7,5

41656

Reintroducción clínica del PF QA4322B 5 20,4 128 141 129 132,7 7,2

imagen27

AID

Descripción Lote Nº Temp. ºC Tiempo, meses Prom. Desviación estándar

41675

PF retenido para AnOps PC0895 5 24,8 121 119 135 125,0 8,7

41681

PF retenido para AnOps QA4322 5 20,4 121 134 133 129,3 7,2

41687

PF retenido para AnOps QA4321 5 20,5 120 125 119 121,3 3,2

41660

SF congelada PC0789 <-60 25 105 110 111 108,7 3,2

41665

Alícuota del PF a partir de AMD QA4322 5 20 110 117 125 117,3 7,5

41669

Alícuota del PF a partir de AMD PC0891 5 25 133 112 116 120,3 11,2

Ejemplo 10

Estudios de supervivencia

Se realizó una ligadura cecal y un estudio de punción en múridos para comparar un lote de rTFPI recién preparado,

5 de grado clínico (TFPI 92) con material de grado clínico que estaba parcialmente desamidado y oxidado (TFPI 78). Este modelo produce una infección polimicrobiana intraperitoneal y sistémica por contaminación fecal directa y necrosis cecal, que imitan de manera muy parecida a la sepsis intra-abdominal humana. Opal y col., Critical Care Medicine 29, 13-18, 2001.

Ambas preparaciones del TFPI se prepararon según el Proceso C. Se administró rTFPI 78, rTFPI 92 o control de

10 diluyente en forma ciega durante más de 48 horas (por vía subcutánea cada 12 horas x cuatro dosis). Antes y 48 horas después del procedimiento quirúrgico, se extrajo sangre para determinar el nivel cuantitativo de bacteriemia, endotoxinas y citocinas (factor de necrosis tumoral alfa e interleucina 6). Los animales se evaluaron diariamente y se registraron muertes a medida que se producían. Todos los animales fueron sometidos a evaluación por necropsia en busca de pruebas histológicas de lesiones de órganos y bacteriología cuantitativa al final del período experimental.

15 Los diagramas de supervivencia de Kaplan-Meier se muestran en la Figura. 16. Hubo una ventaja significativa de supervivencia en los ratones que recibieron el rTFPI recién preparado en comparación con la forma parcialmente oxidada, desamidada de rTFPI. Ambos grupos con rTFPI tuvieron mejor respuesta que los ratones que recibieron el diluyente en el grupo control. Como era de esperar, los ratones sometidos a la operación simulada (intervención quirúrgica con identificación del ciego, pero sin ligadura ni punción) sobrevivieron al período de estudio de siete días.

20 No hubo diferencias significativas en los criterios de valoración secundarios de bacteriemia, endotoxemia o producción de citocinas entre los dos grupos tratados con rTFPI.

Este estudio demuestra que el TFPI parece ofrecer una ventaja de supervivencia a través de un mecanismo no explicado por los niveles de bacterias, endotoxinas o citocinas. El TFPI desamidado y oxidado ofreció menos protección que el TFPI recién preparado.

25 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Chiron Corporation

<120> Procedimiento mejorado para purificar TFPI y análogos del TFPI

<130> 012441.00051

<150> US 60/494.546 <151> 13-08-2003

30 <150> US 60/509.277 <151> 08-10-2003

<150> US 60/512.199 <151> 20-10-2003

<160> 44

<170> FastSEQ para Windows Version 4.0

<210> 1

35 <211> 276

imagen28

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

imagen29

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 8

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<212> PRT <213> Homo sapiens

imagen30

<400> 3

<210> 4

<211> 87

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 87

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

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imagen29

imagen29

imagen29

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<400> 6

imagen29

<210> 7

<211> 78

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

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<210> 8

<211> 66

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

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<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 6

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<212> PRT <213> Homo sapiens

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<400> 10

<210> 11

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 7

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<212> PRT <213> Homo sapiens

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<400> 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

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<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

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<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 11

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Claims (33)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una preparación purificada que comprende una pluralidad de moléculas del TPFI o análogos del TPFI, en la que menos del 12% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI son especies modificadas, en la que las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes:

   una molécula del TFPI o análogo del TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa;

   una molécula del TFPI o análogo del TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio catiónico;

   una molécula del TFPI o análogo del TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico;

   una molécula del TFPI o análogo del TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de aminoácidos;

   moléculas del TFPI o análogo del TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y

   una molécula del TFPI o análogo del TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes.

2. 2.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 9% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están oxidadas.

3. 3.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 3% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están carbamiladas.

4. 4.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 9% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están desamidadas.

5. 5.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 2% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI comprenden un aducto de cisteína.

6. 6.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 3% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están agregadas.

7. 7.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que menos del 3% de las moléculas del TPFI o análogo del TPFI están mal plegadas.

8. 8.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que los miembros de la pluralidad de moléculas del TPFI tienen la secuencia de aminoácidos que se muestra en ID SEC Nº 1.

9. 9.

   La preparación purificada de la reivindicación 1, en la que las moléculas de análogo del TPFI son moléculas de ala-TPFI.

10. 10.

    Una formulación farmacéutica que comprende: una pluralidad de moléculas de ala-TPFI, en la que menos del 12% de las moléculas de ala-TPFI son especies

    modificadas, en la que las especies modificadas incluyen una o más de las siguientes: una molécula de ala-TFPI oxidada, según se detecta por medio de cromatografía de fase inversa; una molécula de ala-TFPI carbamilada, según se detecta por medio de cromatografía de intercambio

    catiónico;

    una molécula de ala-TFPI desamidada, según se detecta por medio de la medición indirecta de ácido isoaspártico; una molécula de ala-TFPI que comprende un aducto de cisteína, según se determina por el análisis de

    aminoácidos;

    moléculas de ala-TFPI agregadas, según se detectan por medio de cromatografía de exclusión por tamaño; y una molécula de ala-TFPI mal plegada, según se detecta por medio de electroforesis en gel de

    poliacrilamida con SDS en condiciones no desnaturalizantes, en la que la formulación farmacéutica comprende citrato de sodio 20 mM, L-arginina 300 mM y metionina 5 mM, pH 5,5.

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11. 11. Un procedimiento para producir moléculas del TPFI o análogos del TPFI purificadas, que comprende las etapas de:

    (1)

    expresar el TFPI o análogo del TFPI en una célula huésped de E. coli resistente a la rifampicina, en la que el TFPI o análogo del TFPI está codificado en un plásmido que comprende los siguientes elementos:

    (a)

    un promotor de la transcripción;

    (b)

    un sitio de unión del ribosoma adyacente al promotor de la transcripción reclac;

    (c)

    una secuencia de nucleótidos codificadora, que codifica el TFPI o el análogo del TFPI adyacente al sitio de unión del ribosoma;

    (d)

    un terminador de la transcripción adyacente a la secuencia de nucleótidos codificadora;

    (e)

    un replicón;

    (f)

    un gen de resistencia a los antibióticos; y

    (g)

    un gen que codifica una enzima que elimina la metionina del extremo N-terminal.

    (2)

    aislar los cuerpos de inclusión que contienen el TFPI o análogo del TFPI de las células huésped de E. coli;

    (3)

    aislar el TFPI o análogo del TFPI de los cuerpos de inclusión para obtener el TFPI o análogo del TFPI aislado;

    (4)

    replegar el TFPI o análogo del TFPI aislado para formar el TFPI o análogo del TFPI replegado;

    (5)

    purificar el TFPI o análogo del TFPI replegado por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose en presencia de Mg++ para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (6)

    concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (7)

    purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (8)

    purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (9)

    purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP-Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado; y

    (10)

    concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificadas, en la que menos de aproximadamente el 12% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI son moléculas del TPFI o análogo del TPFI modificadas.

12. 12.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el promotor de la transcripción es un promotor reclac.

13. 13.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el sitio de unión del ribosoma es el sitio de unión del ribosoma del gen 10 del bacteriófago T7.

14. 14.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la secuencia de nucleótidos codificadora codifica ala-TPFI.

15. 15.

    El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la secuencia de nucleótidos codificadora es ID SEC Nº 44.

16. 16.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el terminador de la transcripción comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en ID SEC Nº 42.

17. 17.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el replicón comprende un origen de replicación de pBR322.

18. 18.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el replicón comprende un gen de control del número de copias rop del pBR322.

19. 19.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el gen de resistencia a los antibióticos es el de la estreptomicina adeniltransferasa.

20. 20.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la enzima que elimina la metionina del extremo N terminal es la metionina aminopeptidasa de E. coli.

21. 21.

    El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula huésped de E. coli es MON210 (Nº de acceso ATCC PTA-5564).

22. 22.

    Un procedimiento para purificar moléculas del TPFI o análogo del TPFI, que comprende las etapas de:

    (1)

    purificar las moléculas del TFPI o análogo del TFPI producidas de manera recombinante por cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose para formar una primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (2)

    concentrar la primera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (3)

    purificar la primera preparación concentrada del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en Q-Sepharose para formar una segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (4)

    purificar la segunda preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HIC con butilo para formar una tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (5)

    purificar la tercera preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado por cromatografía HP en SP-Sepharose para formar una cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado;

    (6)

    concentrar la cuarta preparación del TFPI o análogo del TFPI purificado para formar una segunda preparación concentrada de moléculas del TFPI o análogo del TFPI purificadas, en la que menos de aproximadamente el 12% de las moléculas del TFPI o análogo del TFPI son moléculas del TPFI o análogo del TPFI modificadas.

23. 23.

    El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la cromatografía de flujo rápido en SP-Sepharose se lleva a cabo en presencia de Mg++.

24. 24.

    El procedimiento de la reivindicación 22, en el que las moléculas del TFPI o análogo del TPFI se producen en células de levadura.

25. 25.

    El procedimiento de la reivindicación 22, en el que las moléculas del TPFI o análogo del TPFI se producen en células de mamífero, tales como las células CHO, células HepG2, células hepáticas Chang o células de hepatoma SK.

26. 26.

    La preparación purificada de la reivindicación 1 o la formulación farmacéutica de la reivindicación 10, que comprende al menos 200 gramos del TPFI o análogo del TPFI.

27. 27.

    La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 1,2 kilogramos o 2,4 kilogramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI.

28. 28.

    La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 200-300 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI.

29. 29.

    La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 400-600 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI.

30. 30.

    La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 600-900 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI.

31. 31.

    La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 26, que comprende 800-1200 gramos de inhibidor de la vía del factor tisular (TPFI) o análogo del TPFI.

32. 32.

    La preparación purificada o la formulación de la reivindicación 1 o 10, en la que la medición indirecta de ácido aspártico comprende analizar un subproducto S-adenosil-homocisteína (SAH) por RP-HPLC, en la que el subproducto es generado a partir de la transferencia de un grupo metilo de la S-adenosil-L-metionina (SAM) al ácido aspártico, catalizada por la Proteína Isoaspartil Metil Transferasa (PIMT).

33. 33.

    Una formulación farmacéutica que comprende una preparación purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o 26-32.