ES2362990T5

ES2362990T5 - Métodos de tratamiento de medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor

Info

Publication number: ES2362990T5
Application number: ES08770870.7T
Authority: ES
Inventors: Joe Zhou; Felix M. Solamo
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2007-06-15
Filing date: 2008-06-12
Publication date: 2017-07-20
Anticipated expiration: 2028-06-12
Also published as: CA2690673C; EP2173861A1; CA2690673A1; ZA201000144B; DK2173861T3; IL202542A0; CN101821381B; KR20100036319A; MX2009013762A; ES2362990T3; US20100203610A1; PT2173861E; JP5579599B2; PL2173861T3; EP2173861B1; HK1143184A1; JP2010529856A; EA201000020A1; BRPI0813368A2; DE602008006410D1

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

DESCRIPCION

Metodos de tratamiento de medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor Antecedentes de la invencion

1. Campo de la invencion

La invencion se refiere a metodos para tratar medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor usando luz ultravioleta C (UVC) y filtracion.

2. Antecedentes de la invencion

La contaminacion viral de sobrenadantes y medios celulares plantea un gran desaffo para los fabricantes biofarmaceuticos en todo el mundo. Se han empleado varios metodos para inactivar y/o eliminar partmulas virales de ADN o ARN, con envuelta o sin envuelta (o “desnudas”) grandes o pequenas, de sobrenadantes celulares. Los ejemplos de estos enfoques incluyen la tecnologfa de filtracion de 20 nm, cromatograffa sobre membrana Q y tecnologfa del filtro de profundidad. Sin embargo, estos metodos se han usado principalmente como medios para la inactivacion viral (es decir, aclaramiento viral) de medios y sobrenadantes recogidos de lmeas celulares o tejidos (es decir, aguas abajo de la produccion de protemas).

No se han usado tales metodos de aclaramiento viral para tratar medios de cultivo celular antes de su exposicion a lmeas celulares o tejidos (es decir, aguas arriba de la produccion de protemas) por varias razones. En primer lugar, el empleo de tales tecnicas para el tratamiento de medios celulares a gran escala, en los que se procesan hasta 20.000 l de medios celulares al dfa, puede ser prohibitivo en cuanto a tiempo y costes. En segundo lugar, tales metodos se han empleado historicamente para eliminar contaminantes de sobrenadantes celulares a gran escala como etapa preliminar en la purificacion de productos proteicos terapeuticos de sobrenadantes celulares a gran escala antes de la administracion de los productos proteicos terapeuticos a los pacientes. En tercer lugar, no se ha requerido ni documentado la necesidad en la tecnica de la inactivacion o eliminacion de partmulas virales en el procedimiento aguas arriba de la produccion de protemas. Finalmente, los biorreactores y fermentadores no estan equipados frecuentemente con la maquinaria requerida para llevar a cabo estas tecnicas, y el coste de adecuacion del equipo existente para anadir tal maquinaria puede ser exorbitadamente alto.

Ademas de las tecnicas anteriores, se ha usado la luz ultravioleta para tratar preparaciones de protemas a gran escala antes de la purificacion de estas protemas procedentes de sobrenadantes celulares. Sin embargo, como con otros metodos de tratamiento de sobrenadantes celulares a gran escala antes de la purificacion y el aislamiento de productos proteicos terapeuticos a partir de los sobrenadantes celulares, se ha usado principalmente la exposicion a luz ultravioleta aguas abajo de la produccion de protemas. En otras palabras, no existe ningun metodo de la tecnica anterior en el que se haya usado luz ultravioleta (solo o en combinacion con otros metodos de purificacion o tratamiento) para tratar medios de cultivo celular antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. Por tanto, existe una necesidad en la tecnica de metodos para tratar medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor. Tales metodos senan particularmente utiles para proteger lmeas celulares valiosas frente a la contaminacion viral, ahorrar costes perdidos como resultado de medios contaminados e inservibles, y aumentar la eficiencia de la produccion de protemas mediante tales lmeas celulares. Por tanto, el desarrollo de tales metodos tendna amplia aplicacion en la fabricacion de productos biofarmaceuticos.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona metodos de tratamiento de medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor que comprende exponer los medios de cultivo celular a luz UVC; hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro de profundidad; hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro esteril; e introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor.

Realizaciones espedficas preferidas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de la siguiente descripcion mas detallada de determinadas realizaciones preferidas y las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra la relacion entre la longitud de onda de la luz y el dano al ADN/ARN viral.

La figura 2 muestra la eficiencia de la eliminacion de virus de la leucemia murina (VLMu) o virus diminuto del raton (VDR) de medios de cultivo celular usando dos tipos de filtros de profundidad.

La figura 3 muestra la eficiencia de la eliminacion de parvovirus porcino (PVP) y reovirus 3 (Reo-3) de medios de cultivo celular usando dos tipos de filtros de profundidad.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona metodos de tratamiento de medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor que

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

comprende exponer los medios de cultivo celular a luz UVC; hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro de profundidad; hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro esteril; e introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor.

En los metodos de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. La expresion “luz ultravioleta” se refiere a una seccion del espectro electromagnetico de la luz que se extiende desde la region de los rayos X (100 nm) hasta la region visible (400 nm). En particular, la luz ultravioleta generalmente se divide en cuatro fracciones: (1) luz ultravioleta de vacfo, que tiene una longitud de onda de 100 a 200 nm, (2) ultravioleta C (UVC), que tiene una longitud de onda de 200 a 280 nm, (3) ultravioleta B (UVB), que tiene una longitud de onda de 280 a 315 nm, y (4) ultravioleta A (UVA), que tiene una longitud de onda de 315 a 400 nm (vease la figura 1).

En una realizacion de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC que tiene una longitud de onda de entre 200 y 280 nm antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En otra realizacion de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC que tiene una longitud de onda de 254 nm antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En otras realizaciones de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC que tiene una longitud de onda de 254 nm +/- 1 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 2 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 3 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 4 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 5 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 6 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 7 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 8 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 9 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 10 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 15 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 20 nm, o una longitud de onda de 254 nm +/- 25 nm.

En los metodos de la invencion, se usa luz UVC para inactivar partmulas virales sin envuelta danando el ADN o ARN viral. El dano del acido nucleico inactiva los virus e impide su posterior replicacion. Un dispositivo tfpico, o reactor de UVC, para exponer disoluciones a luz UVC utiliza flujo espiral hidraulico junto con una fuente de irradiacion que genera vortices de Dean en una corriente de fluido que permite que se administren dosis de irradiacion UVC de manera uniforme en toda la disolucion. Cuando se usa luz UVC para inactivar partmulas virales sin envuelta, la inactivacion viral generalmente se produce tras aproximadamente cinco minutos de exposicion.

Tal como se describe en el presente documento, se han usado metodos de aclaramiento viral conocidos en la tecnica casi exclusivamente aguas abajo de la produccion de protemas. Ademas de consideraciones de costes y tiempo, se han usado tales metodos casi exclusivamente aguas abajo de la produccion de protemas porque el objetivo de tales metodos ha sido inactivar y/o eliminar partmulas virales en sobrenadantes celulares a gran escala antes de la purificacion y el aislamiento de productos proteicos terapeuticos de los sobrenadantes celulares. Con respecto al uso de la luz UVC para inactivar partmulas virales en bioprocesos a gran escala, una razon de la falta de procedimientos de la tecnica anterior que emplean exposicion a luz UVC aguas arriba de la produccion de protemas ha sido la alta absorcion de luz UVC por los medios de cultivo celular a 254 nm, y los efectos de esta alta absorcion sobre la capacidad de tales medios para sostener un crecimiento celular eficaz. Los metodos de la invencion evitan este problema aumentando la energfa de la luz UVC que va a usarse.

El termino “energfa” se refiere a la cantidad de radiacion ultravioleta en Julios/metros2 a la que se exponen los medios de cultivo celular tratados. En una realizacion de la invencion, se exponen los medios de cultivo celular a luz UVC a una densidad de energfa de 120-320 J/m2 antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En otra realizacion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC a una densidad de energfa de 238 J/m2 antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En otras realizaciones de la invencion, se exponen los medios de cultivo celular a luz UVC a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 1 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 2 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 3 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m +/- 4 J/m , o a una densidad de energfa de 238 J/m +/- 5 J/m , o a una densidad de energfa de 238 J/m +/- 10 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 15 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 20 J/m , o a una densidad de energfa de 238 J/m +/- 25 J/m , o a una densidad de energfa de 238 J/m +/- 30 J/m , o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 40 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 50 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 60 J/m2, o a una densidad de energfa de 238 J/m2 +/- 70 J/m2.

Los metodos de la invencion pueden usarse para procedimientos de inactivacion a escala de laboratorio, pero mas significativamente para el tratamiento a gran escala de medios de cultivo celular antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En una realizacion de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC a una velocidad de flujo de 1-12 litros por hora antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En otra realizacion de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC a una velocidad de flujo de 6 litros por hora antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. En otras realizaciones de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a luz UVC a una velocidad de flujo de 6 litros por hora +/- 1 litro por hora, o a una velocidad de flujo de 6 litros por hora +/- 2 litros por hora, o a una velocidad de flujo de 6 litros por hora +/- 3 litros por hora, o a una velocidad de flujo de 6 litros por hora +/- 4 litros por hora, o a una velocidad de flujo de 6 litros por hora +/- 5 litros por hora.

“Valor de reduccion logantmica” (VRL) es una medicion de la eficiencia de retencion de filtracion que es equivalente a la razon del logaritmo de la concentracion de exposicion dividida entre la concentracion del filtrado (VRL = Log10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

exposicion/filtrado). En la presente invencion, la concentracion de exposicion se refiere a la concentracion de materiales virales en los medios de cultivo celular. Para los fines de la invencion, se considera que un filtrado (es decir, medios de cultivo celular) es esteril si tiene un VRL de al menos 4,85, y se prefieren filtrados que tienen VRL de entre 6 y 7. En una realizacion de la invencion, se obtiene un valor de reduccion logantmica mayor de o igual a 4,85 tras el tratamiento de los medios de cultivo celular. En otra realizacion, se obtiene un valor de reduccion logantmica de entre 6 y 7 tras el tratamiento de los medios de cultivo celular.

En los metodos de la invencion, se someten los medios de cultivo celular a etapas de filtracion tras exponerse a luz UVC. La expresion “filtracion esteril” o “filtro esteril” se refiere a la eliminacion de microplasma y otros posibles contaminantes de los medios de cultivo celular mediante el uso de un filtro esteril biologico convencional. En una realizacion de la invencion, se hacen pasar medios de cultivo celular a traves de un filtro esteril que tiene poros con un tamano maximo de 200 nm antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor.

En los metodos de la invencion, se hacen pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro de profundidad. La expresion “filtro de profundidad” se refiere a un filtro que tiene multiples capas de filtracion, siendo cada capa responsable de la filtracion de materia particulada de diferentes tamanos y densidades. Este tipo de procedimiento de filtracion es similar a la exclusion por tamanos. El material ligero se afsla en la parte superior del lecho del filtro. Los medios se vuelven progresivamente mas finos y mas densos en las capas inferiores. Se eliminan partfculas suspendidas mas grandes en las capas superiores, mientras que se eliminan partfculas mas pequenas en las capas inferiores.

La capacidad de los filtros de profundidad para eliminar determinados tipos de partfculas virales depende del pH de la disolucion que va a filtrarse. Por ejemplo, cuando se hacen pasar medios de cultivo celular que tienen un pH inferior a traves de un filtro de profundidad, pueden aclararse mas eficientemente las partfculas virales sin envuelta de los medios. Los medios de cultivo celular normalmente tienen una alta conductividad de aproximadamente 15 a 20 mS/cm y pH 7,4, que ayuda en la captura de partfculas virales con envuelta. La realizacion de la filtracion en condiciones de pH neutro asegurana por tanto mayores VRL para los virus con envuelta, que tienen pi de 6,0-7,8. En una realizacion de la invencion, se hacen pasar los medios de cultivo celular a traves del filtro de profundidad a un pH acido. En otra realizacion de la invencion, se hacen pasar los medios de cultivo celular a traves del filtro de profundidad a pH 5,0. En otras realizaciones de la invencion, se hacen pasar los medios de cultivo celular a traves del filtro de profundidad a un pH de entre 4,0-5,0, o a un pH de entre 5,0-6,0, o a un pH de entre 6,0-7,0.

Pueden usarse los metodos de la invencion para inactivar partfculas virales que pueden estar presentes en medios de cultivo celular antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. Pueden usarse los metodos de la invencion para eliminar tambien partfculas virales (que incluyen partfculas virales que pueden no haberse inactivado por la exposicion a luz UVC). En el metodo de la invencion, se exponen medios de cultivo celular a UVC que tiene una longitud de onda o energfa, o a una velocidad de flujo, suficiente para danar los acidos nucleicos de cualquier virus sin envuelta en los medios de cultivo celular. Ademas, se hacen pasar medios de cultivo celular a traves de un filtro de profundidad que tiene un tamano de poro, o a una velocidad de flujo, suficiente para eliminar cualquier virus con envuelta de los medios de cultivo celular.

En los metodos de la invencion, se tratan medios de cultivo celular antes de introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor. El termino “biorreactor” se refiere a un dispositivo o sistema para su uso en el crecimiento a gran escala de lmeas celulares o tejidos para la preparacion de productos biofarmaceuticos. Por ejemplo, puede usarse un biorreactor tfpico para generar de 200 a 20.000 l de sobrenadante celular (que contiene el subproducto pretendido del bioproceso, una protema biofarmaceutica). En los metodos de la invencion, puede usarse el biorreactor para sostener el crecimiento de celulas para la produccion a gran escala de, por ejemplo, anticuerpos.

La presente invencion proporciona un metodo para inactivar y/o eliminar partfculas virales de medios de cultivo celular aguas arriba de la introduccion de los medios de cultivo celular en un biorreactor. Uno de los beneficios de la presente invencion es que tratando los medios de cultivo celular aguas arriba de su introduccion en el biorreactor, puede reducirse el riesgo de contaminacion en el punto de inoculacion, creando de ese modo un mejor entorno para un maximo crecimiento celular y una maxima produccion de protemas (por ejemplo, tftulo de anticuerpos). Ademas, puede usarse la presente invencion para disminuir el riesgo de costes de produccion perdidos (por ejemplo, asociado con una parada de mantenimiento de un procedimiento de fabricacion biofarmaceutico tras la contaminacion viral).

Pueden usarse los medios de cultivo celular tratados para sostener el crecimiento de varios tipos diferentes de celulas. En una realizacion de la invencion, se usan los medios de cultivo celular tratados para sostener el crecimiento de celulas de mairnferos. En otra realizacion de la invencion, las celulas de mamfferos pueden producir anticuerpos. En aun otra realizacion de la invencion, se usan los medios de cultivo celular tratados para sostener el crecimiento de celulas de insectos.

Los ejemplos que siguen son ilustrativos de realizaciones espedficas de la invencion, y diversos usos de las mismas. Se exponen solo con fines explicativos, y no deben tomarse como limitativos de la invencion.

EJEMPLO 1

Caracteristicas de los medios de cultivo celular

Pueden usarse los metodos de la invencion para tratar medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor. Se analizaron tres tipos de medios de cultivo celular para determinar su osmolalidad, conductividad a 25°C y absorbancia a 254 nm (vease la tabla I).

5 Tabla I

Tipo de medios: Osmolalidad (mOsm/kg) Conductividad (mS/cm)25°C Absorbancia D.O. 254 nm

A: 296,33 12,19 4,8

B: 296,67 11,05 11,7

C: 854,67 12,11 64

EJEMPLO 2

Inactivacion viral con luz UVC

Se han llevado a cabo estudios para determinar la inactivacion de varios virus mediante luz UVC. La tabla II muestra los virus modelo que se eligieron: virus xenotropico de la leucemia murina (x-VLMu), virus diminuto del raton (VDR), 10 parvovirus porcino (PVP) y reovirus 3 (Reo 3).

Tabla II

Modelo: Familia Propiedades pI

x-VLMu: Retroviridae Con envuelta, ARN mc, 80-120 nm, baja resistencia 6,0-6,7

VDR: Paroviridae Sin envuelta, ADN mc y, 18-26 nm, alta resistencia 5,0

PVP: Herpesviridae Con envuelta, ADN bc y, 120-200 nm, resistencia baia-media 7,4-7,8

Reo 3: Reoviridae Sin envuelta, ARN bc, 50-70 nm, resistencia media 3,9

Se realizo la inactivacion de VDR(i) y VDR(p) en medios de produccion a diversas velocidades de flujo. La inactivacion se logro con un VRL superior a 4,85 para VDR(p) (vease la tabla III) y un VRL superior a 3,35 para VDR(i) (vease la tabla IV).

15 Tabla III

Perfil de inactivacion de VDRp usando luz UVC

A254nm: Unidad a escala de laboratorio de velocidad de flujo (l/h) Lampara de UVC cubierta (%) Fluidez espera2da (J/m2) Inactivacion de VDRp [VRL] Velocidad de flujo (ml/min) Tiempo para recogida de medios (min/250 ml) Escala de tratamiento (l/h)

12: 10 0 143,1 3,93, 4,09, 4,09 166,7 1,5 1000 2000

12: 8 0 178,9 4,76, 4,76, 4,76 133,3 1,9 1000 2000

12: 6 0 238,5 >4,85, >4,85, >4,85 100 2,5 1000 2000

Tabla IV

Perfil de inactivacion de VDRi usando luz UVC

A254nm: Unidad a Lampara Fluidez Inactivacion Velocidad Tiempo para Escala de

: escala de laboratorio de velocidad de flujo (l/h) de UVC cubierta (%) espera2da (J/m2) de VDRi [VRL] de flujo (ml/min) recogida de medios (min/250 ml) tratamiento (l/h)

12: 10 0 143,1 >3,35, 166,7 1,5 1000-




: >3,35, 2000




: >3,35

12: 8 0 178,9 >3,35, 133,3 1,9 1000-




: >3,35, 2000




: >3,35

12: 6 0 238,5 >3,35, 100 2,5 1000-




: >3,35, 2000




: >3,35

Estos ensayos se repitieron para la inactivacion de VLMu a partir de ambos medios de produccion y medios de alimentacion. Los resultados de estos ensayos (es decir, VRL inferior a 1) sugieren que una etapa de inactivacion o eliminacion adicional puede potenciar adicionalmente los metodos de la invencion (veanse las tablas V y VI).

5 Tabla V

Perfil de inactivacion de VLMu usando luz UVC (medios de produccion)

A254nm: Unidad a escala de laboratorio de velocidad de flujo (l/h) Lampara de UVC cubierta (%) Fluidez espera2da (J/m2) Inactivacion de VDRp [VRL] Velocidad de flujo (ml/min) Tiempo para la recogida de medios (min/250 ml) Escala de tratamiento (l/h)

12: 10 0 143,1 0, 0, 0 166,7 1,5 1000 2000

12: 8 0 178,9 0, 0, 0 133,3 1,9 1000 2000

12: 6 0 238,5 0, 0, 0 100 2,5 1000 2000

Tabla VI

Perfil de inactivacion de VLMu usando luz UVC (medios de alimentacion)

A254nm: Unidad a escala de laboratorio de velocidad de flujo (l/h)) Lampara de UVC cubierta (%) Fluidez espera2da (J/m2) Inactivacion de VLMu [VRL] Velocidad de flujo (ml/min) Tiempo para la recogida de medios (min/250 ml) Escala de tratamiento (l/h)

64: 2 0 62 0, 0, 0 33,3 7,5 1000 2000

64: 2 0 62 0, 0, 0 33,3 7,5 1000 2000

64: 2 0 62 0, 0, 0 33,3 7,5 1000 2000

EJEMPLO 3

Eliminacion viral usando filtracion de profundidad

Se han llevado a cabo estudios sobre la eliminacion de partfculas virales con envuelta asf como otros materiales 10 celulares no deseados de los medios de cultivo celular usando un filtro de profundidad. La tabla VII muestra la inactivacion viral de tres virus con envuelta asf como un virus sin envuelta. Los VRL determinados a partir de estos estudios muestran que el filtro de profundidad puede eliminar eficazmente partfculas virales con envuelta de medios de cultivo celular.

Tabla VII

Metodo de eliminacion: PVP x-VLMu VDR Reo3

Filtro de profundidad: 3,17 >4,23 4,13 >5,01

Filtro de 20 nm: >5,04 >4,87 4,47 5,35

Membrana Q: 3,89 >4,24 4,47 5,35

Se sometieron a prueba dos tipos de filtro de profundidad para determinar su eficiencia en la eliminacion de partfculas virales (veanse las figuras 2 y 3).

Los tttulos de las secciones usados en el presente documento son con fines de organizacion solamente y no han de 5 interpretarse como limitativos del contenido descrito. Toda la bibliograffa citada en esta solicitud se incorpora expresamente como referencia al presente documento.

Claims

1.
2.
3.

10 4.
5.
6.

15 7.
8. 9.

20 10.
11.

REIVINDICACIONES

Metodo de tratamiento de medios de cultivo celular para su uso en un biorreactor que comprende

(a) exponer los medios de cultivo celular a luz ultravioleta C (UVC);

(a2) hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro de profundidad;

(b) hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro esteril; y

(c) introducir los medios de cultivo celular en un biorreactor.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la luz UVC tiene una longitud de onda de 254 nm.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se exponen los medios de cultivo celular a luz UVC a una velocidad de flujo de 1-12 litros por hora, preferiblemente 6 litros por hora.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el valor de reduccion logantmica es mayor de o igual a 4,85, preferiblemente, el valor de reduccion logantmica es de 6-7.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se exponen los medios de cultivo celular a luz UVC a una densidad de energfa de 120-320 J/m2, preferiblemente 238 J/m2

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el filtro esteril tiene poros con un tamano maximo de 200 nm.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de exponer los medios de cultivo celular a luz UVC es suficiente para danar los acidos nucleicos de cualquier virus sin envuelta en los medios de cultivo celular.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se usan los medios de cultivo celular tratados para sostener el crecimiento de celulas de mairnferos o celulas de insectos.

Metodo segun la reivindicacion 8, en el que las celulas de mamfferos son capaces de producir anticuerpos.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que se hacen pasar los medios de cultivo celular a traves del filtro de profundidad a un pH acido, preferiblemente pH 5,0.

Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la etapa de hacer pasar los medios de cultivo celular a traves de un filtro de profundidad es suficiente para eliminar cualquier virus con envuelta de los medios de cultivo celular.

25