ES2361800A1 - Metodos y productos para genotipado in vitro de variaciones genicas humanas asociadas a antigenos eritrocitarios humanos. - Google Patents
Metodos y productos para genotipado in vitro de variaciones genicas humanas asociadas a antigenos eritrocitarios humanos. Download PDFInfo
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Abstract
Métodos y productos para genotipado in vitro de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos.El método de genotipado se basa en la combinación de un diseño experimental de DNA-chips de genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados por dichos DNA-chips de genotipado basado en el aumento de la señal de hibridación, lo que garantiza unos elevados niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de los resultados, que permiten que dichos DNA-chips puedan ser utilizados como herramientas fiables de diagnóstico genético clínico; en particular, en la detección de variaciones génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas al genotipado de antígenos eritrocitarios humanos de interés.
Description
Métodos y productos para genotipado in
vitro de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos
eritrocitarios humanos.
La invención se adscribe al sector
técnico-industrial del diagnóstico in vitro,
extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante
DNA-chips, para la detección de variaciones génicas,
por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas al
genotipado de antígenos eritrocitarios.
En el año 2001, el Consorcio para el Proyecto
Genoma Humano y la empresa privada Celera presentaron un primer
borrador completo del genoma humano con 30.000 genes. A partir de
este momento se iniciaba la posibilidad del estudio del genoma
completo o estudios a gran escala (high-throughput).
Los denominados "DNA-chips", también
denominados "microarrays", "DNAarrays" o
"bio-chips de DNA" son herramientas que la
Genómica Funcional puede usar para los estudios a gran escala que se
plantean en la actualidad. La Genómica Funcional estudia los cambios
en la expresión de los genes debidos al ambiente al que está
sometido el individuo y a las características genéticas del mismo.
La secuencias de los genes presentan pequeñas variaciones
interindividuales de un único nucleótido que reciben el nombre de
SNP ("single nucleotide polymorphism") que en un pequeño tanto
por ciento están implicados en cambios en la expresión de los genes
que causan determinadas patologías. La mayoría de los estudios que
aplican DNA-chips son de expresión génica aunque
también se utilizan en la detección de SNPs.
El primer DNA-chip fue el
"Southern blot" en el que moléculas de ácidos nucleicos
marcadas se utilizaban para interrogar moléculas de ácidos nucleicos
unidas a un soporte sólido. El soporte sobre el que se llevaba a
cabo la interrogación en los primeros DNA-chips eran
membranas de nylon. Aunque se partía de una buena idea, la técnica
era todavía muy laboriosa.
Dos avances marcaron el arranque definitivo de
los DNA-chips. Por una parte, el uso de un soporte
sólido no poroso, como el vidrio, que facilitó la miniaturización y
la detección basada en fluorescencia. Por otra parte, la adaptación
de técnicas fotolitográficas utilizadas en la elaboración de
semiconductores para la producción de DNA-chips
conteniendo cada uno de ellos más de 400.000 oligonucleótidos
distintos, en una región de aproximadamente 20 \mum^{2}, los
denominados DNA-chips de alta densidad.
Concretamente un DNA-chip es un
soporte sólido que contiene cientos de fragmentos de secuencias de
genes diferentes representadas en forma de DNA, cDNA u
oligonucleótidos inmovilizadas o unidas en su superficie en
posiciones fijas. Los soportes son generalmente portaobjetos de
vidrio para microscopio, membranas de nylon o "chips" de
silicio. Es importante que estas secuencias o sondas estén unidas al
soporte en un orden fijo ya que la localización robotizada de cada
uno de ellos determina el gen cuya expresión se está midiendo. En
función de la tecnología empleada para la producción de los
DNA-chips se pueden clasificar en:
- DNA-chips de alta densidad:
Los oligonucleótidos que se encuentran en la superficie del
portaobjetos de vidrio han sido sintetizados "in situ",
mediante una metodología denominada fotolitografía.
- DNA-chips de baja densidad: En
este caso los oligonucleótidos, cDNA o fragmentos de PCR son
depositados en forma de nanogotas en la superficie del cristal
mediante un robot que imprime esas secuencias de DNA en el
portaobjetos. Existen pocos ejemplos de DNA-chips de
baja densidad y, al contrario que en los de alta densidad, son pocas
las variaciones génicas detectadas: un DNA-chip para
la detección de 5 mutaciones puntuales en el gen de la tirosinasa,
un DNA-chip para la detección de mutaciones en p53 y
k-ras, un DNA-chip para la detección
de 12 mutaciones causantes de cardiomiopatía hipertrófica, un
DNA-chip para el genotipado de cepas de
Escherichia coli o DNA-chips para la
detección de patógenos tales como Cryptosporidium parvum o
rotavirus.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la estrategia de diseño de los
oligonucleótidos se puede hablar de:
- "Standard tiling": Se diseñan 4
oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia de
referencia excepto en la posición central donde se interrogan las 4
posibilidades: A, C, G y T; un ejemplo ilustrativo de esta
estrategia es el DNA-chip para el genotipado de
HIV-1 (Affymetrix). La posición central asegura
máxima especificidad.
- "Alternative tiling": En este caso son 5
los oligonucleótidos diseñados, de forma que el quinto interroga una
posible deleción en la secuencia; un ejemplo ilustrativo de esta
estrategia es el DNA-chip para la detección de
mutaciones en p53 (Affymetrix).
- "Block tiling": Se diseñan 4
oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia normal y
otros 4 totalmente complementarios a la secuencia mutante; el
nucleótido que cambia se coloca en la posición central, pero 2
nucleótidos antes o después se coloca un "missmatch" que puede
ser una de las cuatro bases (A, C, T o G).; un ejemplo ilustrativo
de esta estrategia es el DNA-chip para la detección
de mutaciones en el citocromo p450 (Affymetrix). Dentro de esta
última estrategia ["block tiling"] Affymetrix usa el
"missmatch" para aumentar la especificidad de la hibridación no
sólo en una posición sino en las posiciones -4, -1, 0, +1 y +4 para
identificar el cambio producido en la posición central ó 0. Esta
estrategia se denomina "Alternative block tiling" y un claro
ejemplo es el DNA-chip para la detección de 1.500
SNPs (Affymetrix).
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En el caso de estudios de expresión génica, las
sondas depositadas en el vidrio se hibridan con los cDNAs
sintetizados a partir de los mRNAs extraídos del tejido que se
quiere analizar. Estas moléculas de cDNA han sido marcadas con un
fluoróforo al sintetizarse; cuanto mayor sea el número de moléculas
que se unen a su secuencia complementaria en el
DNA-chip, mayor será la cantidad de fluoróforo que
se detecta y mide tras excitarlo con un láser. Esta medida es, por
tanto, reflejo del número de moléculas de cada mRNA que había en el
tejido analizado y, consecuentemente, reflejo del nivel de expresión
de cada gen representado en el DNA-chip, lo que se
denomina un patrón de expresión de la célula. Estos
DNA-chips de expresión contienen también sondas que
representan genes de control ("house-keeping
genes"), lo que permite normalizar los resultados y comparar
múltiples experimentos de forma cuantitativa. Con un
DNA-chip, se pueden determinar en un solo
experimento los niveles de expresión de cientos o miles de genes de
una célula. El cDNA de la muestra problema y de la muestra control
se pueden marcar con dos fluoróforos distintos por lo que en el
mismo DNA-chip se pueden estudiar las diferencias
entre la expresión de los genes en la muestra control y en la
muestra problema.
Los DNA-chips para la detección
de polimorfismos genéticos, cambios o mutaciones en general,
variaciones génicas, en la secuencia de DNA, comprenden unas
superficies sólidas, típicamente de cristal, en las que está
depositado un elevado número de secuencias génicas complementarias
de cada una de las variaciones génicas que se desea estudiar. Una de
las estrategias utilizadas para detectar variaciones génicas
consiste en la hibridación de las secuencias que reconocen
específicamente al alelo normal y al mutado con fragmentos de DNA
procedentes de la muestra que se va a analizar, amplificados
mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y marcados con una molécula fluorescente. Al iluminar el
DNA-chip con el láser se identifican aquellas
secuencias que se han unido a la muestra problema y así se
discrimina específicamente un paciente normal de un heterocigoto o
un homocigoto mutante. Otra estrategia básica de detección de
variaciones génicas con DNA-chips de genotipado
consiste en llevar a cabo una reacción de amplificación o extensión
sobre el propio DNA-chip.
Dentro de la estrategia de hibridación se puede
hacer una subclasificación en función del método de análisis de la
información para el genotipado:
- Aumento de la señal de hibridación: Esta
estrategia compara la señal de hibridación de las sondas
complementarias a los alelos normales y a los alelos mutantes. En
general, las muestras mutadas deben presentar una mayor señal de
hibridación en las sondas complementarias a los alelos mutantes que
en el caso de los individuos normales.
- Pérdida de la señal de hibridación: Los
cambios en la secuencia entre una muestra control y una muestra a
estudio se pueden identificar por una caída en la señal de
hibridación de los oligonucleótidos totalmente complementarios con
la secuencia de referencia. En los individuos homocigotos se produce
una pérdida completa de señal mientras que en los heterocigotos se
produce una pérdida del 50% de la señal. En los
DNA-chips para interrogar todas las bases de una
secuencia de "n" nucleótidos ("oligonucleótido") de
longitud en ambas hebras es necesario un mínimo de "2n"
oligonucleótidos que solapan con el oligonucleótido anterior en toda
la secuencia salvo en un nucleótido. Este diseño de los
oligonucleótidos recuerda a los orígenes de los
DNA-chips en membranas de nylon pero, en este caso,
el tamaño de los oligonucleótidos es de 25 nucleótidos y no de 8
nucleótidos. El elevado número de oligonucleótidos empleados para
reconstruir la secuencia hace que los errores derivados de la
fluctuación en la señal de hibridación que se producen en la
estrategia de ganancia de señal se minimicen. Por el contrario, el
cambio exacto en la secuencia no se puede identificar con esta
metodología; es necesario secuenciar posteriormente para conocer la
mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda estrategia para la detección de
variaciones génicas mediante el empleo de DNA-chips
de genotipado, consistente en la amplificación o extensión sobre el
propio DNA-chip, se aborda con tres
aproximaciones:
- "Minisequencing": Un cebador específico
de la mutación es inmovilizado en el portaobjetos y, después de una
reacción de extensión con didesoxinucleótidos fluorescentes, se
captura la imagen del DNA-chip con un escáner.
- "Primer extensión": Se inmovilizan dos
oligonucleótidos por mutación y la reacción de extensión se lleva a
cabo con un nucleótido fluorescente y los demás naturales siendo el
material de partida RNA o el producto de una PCR.
- "Tag arrays". La reacción de extensión se
lleva a cabo en solución con cebadores específicos que llevan una
determinada secuencia o "tag" en 5'. El uso de
DNA-chips con oligonucleótidos complementarios a
esas secuencias o "tags" permite la captura de los productos
resultantes de la extensión. Ejemplos ilustrativos de esta
aproximación incluyen el DNA-chip de alta densidad
"Gene-Flex" (Affymetrix), aunque también
existen DNA-chips de baja densidad.
\vskip1.000000\baselineskip
A la hora del diseño de herramientas para el
diagnóstico genético, la sencillez experimental debe ser tenida muy
en cuenta. Se debe analizar, por tanto, la complejidad técnica que
supone para el usuario final el análisis de
DNA-chips basados en hibridación diferencial frente
a los basados en la metodología de extensión. La necesidad de un
mayor número de reacciones de amplificación y purificación supone
una desventaja de la estrategia basada en técnicas de extensión o
amplificación frente a la estrategia basada en la hibridación.
Sin embargo, en lo relativo a la especificidad y
sensibilidad de los DNA-chips, la hibridación
diferencial no consigue los valores tan altos asociados con la
amplificación sobre el portaobjetos de vidrio. Es por ello necesario
el desarrollo de algoritmos matemáticos que aumenten la
especificidad y sensibilidad de la estrategia basada en el empleo de
la metodología de hibridación (Cutler DJ, Zwick ME, Carrasquillo MN,
Yohn CT, Tobi KP, Kashuk C, Mathews DJ, Shah N, Eichler EE,
Warrington JA, Chakravarti A. Genome Research;
11:1913-1925 (2001). Dentro de esta tecnología y de
los DNA-chips de baja densidad, la elección es sin
duda el uso de oligonucleótidos diferentes para detectar al alelo
normal y al mutante ("aumento de la señal de hibridación").
La inutilidad de los DNA-chips
existentes en la actualidad para detectar simultáneamente la
presencia o ausencia de un número elevado de variaciones génicas, de
manera sensible, específica y reproducible, ha impedido su
aplicación como herramientas de uso rutinario para el diagnóstico
clínico de enfermedades humanas. Los inventores han desarrollado un
método secuencial de procesamiento e interpretación de los datos
experimentales generados por DNA-chips de genotipado
basado en el aumento de la señal de hibridación (algoritmo). Este
método se basa en un novedoso diseño experimental, que asegura unos
altos niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de
los resultados, que permiten que los DNA-chips
desarrollados en base a este método, puedan ser utilizados, por
ejemplo, como herramientas fiables de diagnóstico genético
clínico.
\vskip1.000000\baselineskip
La sangre de cada persona es tan característica
que puede servir como medio de identificación casi tan preciso como
las huellas dactilares, sólo los gemelos idénticos poseen
características sanguíneas iguales. El fenotipado de individuos en
base a la determinación de los grupos sanguíneos es particularmente
conveniente en diferentes ámbitos de la medicina como la práctica de
las transfusiones sanguíneas, la relativamente frecuente aparición
de enfermedades hemolíticas en fetos y recién nacidos, las
aplicaciones médico-legales y su conexión con otros
genes cuya repercusión más inmediata puede estar en los transplantes
de órganos.
La mayor parte de las transfusiones pueden
considerarse como seguras y alcanzan su objetivo; sin embargo, de
vez en cuando se producen reacciones leves y muy rara vez reacciones
graves e incluso fatales. Las reacciones más frecuentes son fiebre y
alergias (hipersensibilidad), que ocurren en el 1-2%
de las transfusiones, pero existen incompatibilidades más graves que
ocasionan la destrucción de los glóbulos rojos que se han
suministrado poco después de la transfusión (reacción hemolítica
intravascular). Dentro de estas reacciones es muy conocida la
enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido (EHPN) que es una
afección inmunológica aloinmune, en la cual la supervivencia del
hematíe fetal y del recién nacido se ve reducida debido a la acción
de anticuerpos maternos que pasan a través de la placenta y que son
específicos contra antígenos de origen paterno presentes en las
células rojas fetales y del recién nacido. Desde entonces hasta la
fecha han ocurrido grandes progresos en el conocimiento de los
grupos sanguíneos que han permitido precisar que la EHPN no sólo se
debe a anticuerpos contra el antígeno D, sino que también están
involucrados otros antígenos del sistema Rh, el sistema ABO y de
otros sistemas antigénicos.
Lo anteriormente descrito permite suponer la
importancia que tiene en la medicina de la transfusión el correcto
genotipado de los grupos sanguíneos (incluidos los alelos raros o
poco frecuentes).
Los grupos sanguíneos están constituidos por
aloantígenos presentes en la superficie de la membrana de los
eritrocitos o glóbulos rojos, que se transmiten hereditariamente de
padres a hijos según las leyes de la genética mendeliana. Su
importancia clínica se debe a sus propiedades sensibilizantes, es
decir, son capaces de provocar la formación de anticuerpos e inducir
una reacción inmune.
La Sociedad Internacional de Transfusión de
Sangre (ISBT) ha clasificado en más de 26 los grupos sanguíneos
humanos. La mayoría de ellos han sido definidos a nivel genético e
incluyen polimorfismos de un único nucleótido (SNPs), deleciones
génicas, conversiones y otros eventos que resultan de la hibridación
génica. Los antígenos de los grupos sanguíneos pueden ser
clasificados en dos grandes grupos:
A. Antígenos dependientes de carbohidratos
B. Antígenos dependientes de proteínas.
\newpage
Este grupo sanguíneo es de primordial
importancia clínica en la medicina de las transfusiones y los
transplantes, ya que causa la mayoría de las reacciones de
incompatibilidad en las transfusiones y rechazo en transplantes de
órganos. La base bioquímica del grupo ABO depende de la actividad de
una transferasa N-acetilgalactosamina en los
individuos del grupo sanguíneo A y una galactosil transferasa en el
grupo sanguíneo B; mientras que los individuos pertenecientes al
grupo O carecen de actividad transferasa. La base genética de los
fenotipos ABO son las sustituciones de aminoácidos en el gen ABO de
la glicosiltransferasa. El tamaño de este gen es de 19.514 pares de
bases (pb) y codifica una enzima de unión de la membrana que utiliza
GalNAc o UDP-Gal como sustrato. Cuatro cambios de
aminoácido codificados por los exones 6 y 7 del gen ABO son los
responsables de la especificidad de sustrato de las transferasas A y
B respectivamente, entre ellos los cambios Gly235Ser y Leu266Met son
cruciales. La mayoría de los individuos del grupo O presentan
deleción de un único nucleótido (A261G) que da lugar a un cambio en
la pauta de lectura y, por tanto, a una inactivación de la
transferasa. Sin embargo, existe un número creciente de alelos O
(unos 20) que dan como resultado la no expresión de las transferasas
A o B. Los alelos raros del subgrupo ABO, como A3, Ax, Ael, B3Bx y
Bel han sido descritos mediante análisis genómico y de secuencias de
transcripción. Estos alelos han surgido de recombinaciones genéticas
a partir de los diferentes alelos del grupo ABO.
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La incompatibilidad Rh está demostrada en una
amplia porción de reacciones de transfusión y es la principal causa
de la enfermedad hemolítica de los recién nacidos y fetos (HDNF).
Los antígenos Rh surgen de dos proteínas relacionadas entre sí (Rh
CcEe y D) codificadas por el locus Rh
(1p34-36.2) que contiene los genes RHD y RHCE (70
Kb). Posiblemente los haplotipos D positivo presentan una
configuración de los genes RHD-RHCE en la misma
orientación, mientras que los haplotipos D negativos presentan una
orientación reversa. El fenotipo D negativo, común en las
poblaciones antiguas europeas, es causado por una deleción del gen
RHD. Este evento parece haber sido generado por un sobrecruzamiento
desigual entre los genes RHCE y RHD implicando 9 Kb altamente
homologas de los extremos del gen RHD. En población africana un
pseudogen del RHD es el alelo D negativo predominante, pero su
frecuencia disminuye entre los afroamericanos y afrocaribeños.
Reordenamientos entre los genes RHCE y RHD causan híbridos raros que
causan una expresión parcial del antígeno D. Estos antígenos poco
frecuentes en algunas ocasiones se han identificado como
clínicamente significativos. Algunos antígenos D parciales y todos
los débiles son causados por mutaciones de pérdida de sentido en el
gen RHD.
Las proteínas Rh CcEe y Rh D se coexpresan con
una glicoproteína homologa (36% identidad), la glicoproteína
asociada Rh (RhAG). Este complejo específico eritrocitario es
posiblemente un heterotetrámero implicado en el transporte
bidireccional del amonio. Las mutaciones en RhAG son las causantes
de la enfermedad regulatoria Rh nula, asociada con defectos del
transporte de la membrana de los eritrocitos, deficiencias en CD47 y
una total ausencia de ICAM-4. Estas mutaciones
ocurren en el dominio de la membrana de la proteína y varía entre
diferentes especies. Más aun, genes relacionados con RHAG, RHBG y
RHCG, han sido localizados en las regiones 1q21.3 y 15q25
respectivamente. Estos genes se expresan de diferente forma en
diferentes tejidos humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos Kidd (JK) expresados por el
transportador de urea hUT-B1 de las células rojas.
La implicación del antígeno Kidd en el transporte de la urea es
conocido desde hace dos décadas cuando se descubrió que las células
rojas JK (a^{-}b^{-}) eran resistentes a la lisis en urea 2 M.
La base molecular de la expresión del antígeno Kidd es un SNP en el
nucleótido 838 (G-A) causante del cambio Asp280Asn
(JK*A-JK*B). El fenotipo Kidd nulo, JK
(a^{-}b^{-}) es debido a mutaciones en lugares de
splicing, mutaciones de pérdida de sentido, de parada y
deleciones parciales en el gen SLC14A1. El significado funcional del
transporte de urea en los eritrocitos está pendiente de ser
descrito; parece que podría proteger de la lisis a los eritrocitos
en el ambiente hiperosmótico de la médula renal, o limitando la
pérdida de urea en la médula donde la concentración de urea es muy
alta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos del grupo sanguíneo Diego son las
proteínas más abundantes de la superficie de las células rojas (1.1
millón de copias por células), y facilitan el intercambio
cloro-bicarbonato, crucial para el transporte del
CO_{2} y la hemostasia ácido-base. A principios de
los 90 se determinó que los antígenos del sistema Di varían debido a
múltiples SNPs presentes en el gen SLC4A1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos CO (Coa, Cob y CO3) son expresados
por la molécula de transporte AQP-1, la proteína de
membrana eritrocitaria mejor caracterizada. Los antígenos
(Coa-Cob) son producidos por un SNP en
AQP-1 que produce el cambio en el codón 45 de
alanina a valina. Los individuos nulos para Co reducen la
permeabilidad osmótica del agua y el ciclo vital de las células
rojas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los antígenos del sistema Kell son muy
importantes en la medicina de la transfusión, el antígeno k es la
segunda mayor causa de enfermedad hemolítica en recién nacidos. La
glicoproteína Kell es una proteína de membrana tipo II y funciona
como una metaloproteínasa de membrana unida a zinc. La región
catalítica C-terminal de la proteína procesa grandes
endotelinas, que son potentes vasoconstrictores. La cisteína 72 de
la glicoproteína Kell forma un puente disulfuro con la proteína Kx,
lo cual podría explicar porque los eritrocitos nulos Kell (Ko)
muestran activación de los niveles de antígeno Kx. El antígeno de
este sistema con mayor significado clínico, K (KEL1), está asociado
con el cambio Met193Thr que posibilita el motivo
Asn-X-Thr
N-glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las variantes Doa/Dob se deben a un SNP en el
gen DOK1, que codifica una enzima ADP ribosiltransferasa que afecta
al codón 265 (Asn-Asp). La ADP ribosiltransferasa de
las células rojas podría servir para eliminar el NAD+ del suero,
pero también se ha observado que participa en la modificación
post-transcripcional de otras proteínas. El motivo
RGD y Dob participa en la adhesión celular. Curiosamente la variante
alélica DO*B es más frecuente entre la población africana y asiática
y podría ser una ventaja evolutiva contra la invasión eritrocitaria
de Plasmodium falciparum que expresa RGD proteínas en su
proceso de infección.
\vskip1.000000\baselineskip
La función de la glicoproteína Fy como citoquina
receptora de las células rojas es acelerar la señal de citoquinas
proinflamatorias. La glicoproteína Fy es el receptor eritrocitario
del parásito de la malaria Plasmodium vivax y como
consecuencia los individuos Fy negativos (Fy a-b-)
son muy frecuentes en poblaciones donde este parásito habita (Oeste
africano). Existen tres alelos mayoritarios del FY: FY*A, FY*B y
FY*A y B que difieren por un SNP que altera el codón 42, mientras
que el fenotipo FY (a^{-}b^{-}) en africanos es causado por un
SNP (C-T) en el promotor del gen FY que da lugar a
la ausencia de la glicoproteína Fy en los eritrocitos.
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Los antígenos MN se generan contra la
glicoporina A, mientras que los antigenos Ss contra la glicoporina
B. Los genes GYPA y GYPB se alinean en tándem en el locus
4q28-31, pero no están relacionados con las
glicoporinas C y D. Dos cambios de aminoácido en extremo n de GPA
son los responsables del grupo sanguíneo M-N y un
cambio de aminoácido en GPB determina el grupo sanguíneo
S-s. Existe un amplio número de alelos MNS causados
por reordenamientos génicos, conversiones génicas o SNPs.
Los grupos sanguíneos humanos anteriormente
descritos han sido definidos a nivel genético para la mayoría de los
antígenos con significado clínico. Existen otros grupos sanguíneos,
aunque éstos son los que presentan una mayor relevancia clínica y
los que mejor se encuentran descritos actualmente. Sin embargo, el
genotipado de las células rojas presenta aún un uso limitado
principalmente a la determinación prenatal de los grupos sanguíneos
en casos de enfermedad hemolítica de los recién nacidos y fetos.
Actualmente la compatibilidad de las
transfusiones de sangre entre donantes y receptores es evaluada
mediante técnicas serológicas (reacciones
anticuerpo-antígeno). La utilización de estas
técnicas puede resultar fallida, obteniéndose un fenotipo incompleto
de los grupos sanguíneos, lo que puede dar lugar a una potencial
reacción inmunológica adversa en el receptor (paciente). No existen
tests serológicos para un elevado número de los denominados
antígenos débiles y en diversas ocasiones los anticuerpos empleados
no resultan lo suficientemente específicos. Las únicas vías capaces
de atajar problemáticas de este tipo son aquéllas basadas en el
genotipado molecular completo tanto del donante, como del
receptor.
Las tecnologías actuales de genotipado de SNPs
permitirán tanto que estas determinaciones se hagan a gran escala,
como la inclusión en el genotipado de los alelos raros de los grupos
sanguíneos que con las técnicas actuales no se determinan. La
aparición de nuevos alelos de ciertos grupos sanguíneos (por
ejemplo, Rh) continuará y será, por tanto, necesaria una tecnología
capaz de evolucionar y ser monitorizada de forma constante. De hecho
el proyecto Genoma Humano ha identificado nuevos SNPs en muchas
proteínas implicadas en los grupos sanguíneos, aunque falta por
definir serológicamente si estos SNPs resultan en la expresión de
antígenos relacionados con grupos
sanguíneos.
sanguíneos.
Actualmente los análisis genéticos moleculares
son muy habituales en la medicina de la transfusión. Por ejemplo, la
detección de contaminación vírica, tal como la detección del virus
de la hepatitis C (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV) o el virus de la hepatitis B (HBV), a partir de volúmenes
pequeños de plasma mediante metodología basada en la PCR es una
práctica habitual en la Unión Europea (UE) desde 1999. Los
diagnósticos basados en PCR prácticamente han suplantado a los
serológicos en la determinación del HLA (antígeno leucocitario
humano); y actualmente se utiliza de forma rutinaria en los centros
de transfusión implicados en la identificación para los transplantes
de médula ósea.
Uno de los principales descubrimientos del
Proyecto Genoma Humano fue la alta frecuencia de polimorfismos de un
único nucleótido (SNPs) encontrados en el DNA humano. Se localizó
aproximadamente un SNP por cada kilobase. Este hallazgo ha impulsado
el desarrollo de técnicas de diagnóstico rápido de genotipado de
SNPs, por ejemplo, mediante el empleo de DNA-chips.
Estas nuevas tecnologías pueden ser aplicadas al propósito de
desarrollar un método de genotipado de los grupos sanguíneos para
una rápida definición de los genotipos de los grupos sanguíneos en
toda la población. El uso de esta tecnología puede ser aplicado a
ambos grupos, pacientes y donantes.
Se han descrito diversos métodos de diagnóstico
para determinados grupos sanguíneos. A modo ilustrativo, la patente
norteamericana US 5804379 describe un método molecular de
diagnóstico y un kit para la determinación de los genotipos del
grupo de sangre Kell y la patente norteamericana US 5723293 describe
un método y un kit para determinar los genotipos del grupo de sangre
Rh. Se ha descrito, además, un test de diagnóstico serológico para
clasificar los grupos sanguíneos a partir de sangre o suero.
Asimismo, se han descrito variaciones génicas nuevas del grupo de
sangre Duffy así como un método para el genotipado de este grupo
sanguíneo.
Sin embargo, no se ha descrito ningún método
basado en la tecnología de DNA-chips capaz de ser
una plataforma abierta de genotipado de todas las variantes alélicas
de los grupos sanguíneos con mayor relevancia clínica (incluidas las
variantes raras) que pueda ser utilizada como método de diagnóstico
a gran escala en la población.
Un DNA-chip que permita la
detección simultánea, sensible, específica y reproducible de
variaciones génicas asociadas a determinados antígenos
eritrocitarios, podrá ser utilizado clínicamente para el genotipado
de los antígenos de los eritrocitos sanguíneos a gran escala en la
población y, por tanto, para la determinación de grupos sanguíneos
en humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los autores de la presente invención han
desarrollado un método de detección simultánea, sensible, específica
y reproducible de variaciones génicas y su empleo para el desarrollo
de productos para genotipado. Dicho método se basa en la combinación
de un novedoso diseño experimental de DNA-chips de
genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de
procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados
por dichos DNA-chips de genotipado basado en el
aumento de la señal de hibridación (algoritmo), lo que garantiza
unos altos niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad
de los resultados, que permiten que dichos DNA-chips
puedan ser utilizados, por ejemplo, como herramientas fiables de
diagnóstico genético clínico.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de facilitar la comprensión de la
presente invención, a continuación se incluye la definición de
algunos términos:
El término "polimorfismo" se refiere a una
variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde
cada secuencia posible está presente en una proporción igual o
superior a un 1% en una población; en un caso particular, cuando
dicha variación es la secuencia nucleotídica ocurre en un sólo
nucleótido (A, C, T o G) se denomina SNP.
El término "mutación génica" se refiere a
una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico
donde cada secuencia posible está presente en una proporción
inferior al 1% en una población.
Los términos "variante alélica" o
"alelo" se usan indistintamente en la presente descripción y se
refieren a un polimorfismo que ocurre en un mismo locus en una misma
población.
El término "variación génica" o "variante
génica", tal y como se utiliza en la presente descripción,
incluye a las mutaciones, polimorfismos y variantes alélicas. Una
variación o variante génica se encuentra entre individuos dentro de
las poblaciones y entre las poblaciones dentro de las especies.
\newpage
Por tanto, la invención proporciona un método
in vitro, extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de
múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes
de un sujeto, en adelante método de la invención, que comprende:
- -
- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;
- -
- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;
- -
- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y
- -
- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, tras el proceso de hibridación,
puede llevarse a cabo sobre el propio soporte una reacción de
amplificación, por ejemplo, mediante "primer extensión", o,
alternativamente, una reacción de ligación, por ejemplo, mediante un
ensayo de ligación de oligonucleótidos (Oligonucleotide Ligation
Assay u "OLA"), cuando dicho soporte es una superficie sólida,
tal como un soporte de vidrio, plástico, una membrana, etc. En caso
de seguir alguna de estas alternativas, el marcaje de los productos
que contienen las variaciones génicas a identificar se lleva a cabo
en esta etapa y no durante la reacción de amplificación ni durante
el proceso de fragmentación.
La extracción del ácido nucleico (DNA o RNA) a
partir de una muestra biológica que lo contiene procedente de un
sujeto, tal como un ser humano, se puede llevar a cabo por métodos
convencionales utilizando, opcionalmente, productos comerciales
útiles para extraer dicho ácido nucleico. Prácticamente cualquier
muestra biológica que contiene ácido nucleico puede ser utilizada
para la puesta en práctica de la invención; a modo ilustrativo, no
limitativo, dicha muestra biológica puede ser una muestra de sangre,
plasma, suero, secreciones, tejido, etc.
En una realización particular, el ácido nucleico
a extraer es DNA. En otra realización particular, el ácido nucleico
a extraer es RNA, típicamente, RNA total; esta última alternativa
puede ser utilizada en caso de que la variación génica a estudiar
esté situada en la secuencia codificante de un gen; en este caso, el
método de la invención incluye una etapa de obtención del cDNA
correspondiente. La obtención de dicho cDNA se lleva a cabo por
métodos convencionales, por ejemplo, mediante retrotranscripción
utilizando los cebadores apropiados el RNA y como molde para la
retrotranscripción.
Las etapas posteriores del método de la
invención se llevan a cabo sobre el DNA extraído o sobre el cDNA
correspondiente al RNA extraído. El término DNA, tal como se utiliza
de aquí en adelante incluye tanto DNA como cDNA.
Las regiones de DNA que contienen las
variaciones génicas a identificar (regiones DNA diana) se someten a
una reacción de amplificación para obtener unos productos de
amplificación que contienen las variaciones génicas a identificar.
Aunque puede utilizarse cualquier técnica o método que permita la
amplificación de todas las secuencias de DNA que contienen las
variaciones génicas a identificar, en una realización particular,
dichas secuencias se amplifican mediante una PCR multiplex. Para la
realización de una PCR multiplex se requiere el empleo de unos pares
de oligonucleótidos cebadores o iniciadores capaces de amplificar
dichas regiones DNA diana que contienen las variaciones génicas a
identificar. Prácticamente puede utilizarse cualquier par de
oligonucleótidos cebadores que permita la amplificación específica
de dichas regiones DNA diana, preferentemente, pares de
oligonucleótidos cebadores que permitan dicha amplificación en el
menor número posible de reacciones PCR. De este modo, utilizando los
pares de oligonucleótidos cebadores y las condiciones apropiadas, se
pueden amplificar todas las regiones DNA diana necesarias para el
genotipado de las variaciones génicas a analizar en el
DNA-chip con el mínimo número posible de
reacciones.
Opcionalmente, si se desea, durante la reacción
de amplificación, puede llevarse a cabo el marcaje de los productos
de amplificación con el fin de poder detectar posteriormente la
hibridación entre las sondas inmovilizadas en el soporte y los
fragmentos de DNA diana que contienen las variaciones génicas a
detectar. El marcaje de los productos de amplificación puede
realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, incorporando un
nucleótido marcado durante la reacción de amplificación o bien
utilizando cebadores marcados. Dicho marcaje puede ser directo, para
lo cual pueden utilizarse fluoróforos, por ejemplo, Cy3, Cy5,
fluoresceína, alexa, etc., enzimas, por ejemplo, fosfatasa alcalina,
peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, por ejemplo, ^{33}P,
^{125}I, etc., o cualquier otro marcador conocido por el experto
en la materia. Alternativamente, dicho marcaje puede ser indirecto
mediante el empleo de métodos químicos, enzimáticos, etc.; a modo
ilustrativo, el producto de amplificación puede incorporar un
miembro de un par de unión específica, por ejemplo, avidina o
estreptavidina conjugada con un fluorocromo (marcador), y la sonda
se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo,
biotina (indicador), efectuándose la lectura mediante fluorimetría,
etc., o bien, el producto de amplificación puede incorporar un
miembro de un par de unión específica, por ejemplo, un anticuerpo
anti-digoxigenina conjugado con una enzima
(marcador), y la sonda se une al otro miembro del par de unión
específica, por ejemplo, digoxigenina (indicador), etc.,
transformándose el sustrato de la enzima en un producto luminiscente
o fluorescente y, efectuándose la lectura mediante
quimio-luminiscencia, fluorimetría, etc.
En una realización particular, el marcaje del
producto de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de un
nucleótido marcado directa o indirectamente con uno o más
fluoróforos. En otra realización particular, el marcaje del producto
de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de cebadores
marcados directa o indirectamente con uno o más fluoróforos.
Los productos de amplificación, opcionalmente
marcados, se someten posteriormente a una reacción de fragmentación
con el fin de aumentar la eficiencia de la hibridación posterior,
obteniéndose de este modo unos productos de fragmentación que
contienen las variaciones génicas a identificar. La fragmentación de
los productos de amplificación puede llevarse a cabo por cualquier
método convencional, por ejemplo, poniendo en contacto los productos
de amplificación con una Dnasa.
En caso de que los productos de amplificación no
hubieran sido marcados previamente durante la reacción de
amplificación, y en caso de que, tras el proceso de hibridación, no
se lleve a cabo una reacción de amplificación o ligación
directamente en el soporte, los productos resultantes de la reacción
de fragmentación (productos de fragmentación) se someten a un
marcaje bien directo utilizando, por ejemplo, fluoróforos, enzimas,
isótopos radiactivos, etc. o bien indirecto utilizando, por ejemplo,
pares de unión específica que incorporan fluoróforos, enzimas, etc.,
mediante métodos convencionales. En una realización particular, los
productos de amplificación no han sido marcados previamente durante
la reacción de amplificación, y los productos de fragmentación se
someten a un marcaje directo o indirecto con uno o varios
marcadores, por ejemplo, uno o varios fluoróforos, aunque pueden
utilizarse otros marcadores conocidos por los expertos en la
materia.
A continuación, los productos de fragmentación
se ponen en contacto con las sondas capaces de detectar las
variaciones génicas correspondientes bajo condiciones que permiten
la hibridación entre dichos productos de fragmentación y dichas
sondas. Dichas sondas están depositadas en un soporte sólido
siguiendo una disposición predeterminada, constituyendo un
DNA-chip (DNA-chip de la invención),
cuyo diseño y desarrollo debe cumplir una serie de requisitos para
poder ser utilizado en el método de la invención en cuanto al diseño
de las sondas, el número de sondas a depositar por variación génica
a detectar, el número de réplicas de sondas a depositar, la
distribución de las sondas sobre el soporte, etc. Las
características propias de dicho DNA-chip de la
invención se describen detalladamente más adelante.
La hibridación de los productos de fragmentación
con las sondas capaces de detectar las variaciones génicas
correspondientes depositadas en un soporte (DNA-chip
de la invención) se lleva a cabo por métodos convencionales
utilizando dispositivos convencionales. En una realización
particular, la hibridación se lleva a cabo en una estación
automática de hibridación. Para llevar a cabo la hibridación, los
productos de fragmentación se ponen en contacto con dichas sondas
(DNA-chip de la invención) bajo condiciones que
permiten la hibridación entre dichos productos de fragmentación y
dichas sondas. Unas condiciones de hibridación estables permiten
establecer la hebra y la longitud apropiada de las sondas con el fin
de maximizar la discriminación, tal como se menciona más
adelante.
Como se ha mencionado previamente, si se desea,
cuando dicho soporte es un soporte sólido, tras el proceso de
hibridación, se puede llevar a cabo una reacción de amplificación,
por ejemplo, mediante "primer extensión", o, alternativamente,
una reacción de ligación, por ejemplo, mediante un ensayo de
ligación de oligonucleótidos (OLA), al mismo tiempo que se realiza
el marcaje de los oligonucleótidos depositados en el soporte. El
marcaje de dichos oligonucleótidos puede ser un marcaje directo
utilizando, por ejemplo, fluoróforos, enzimas, isótopos radiactivos,
etc. o indirecto utilizando, por ejemplo, pares de unión específica
que incorporan fluoróforos, enzimas, etc., mediante métodos
convencionales, tal como se ha mencionado previamente en relación
con el marcaje de los productos de amplificación o de
fragmentación.
En caso de que se desee llevar a cabo una
reacción de amplificación post-hibridación
utilizando, por ejemplo, la metodología "primer extensión",
tras la hibridación, se lleva a cabo una reacción de extensión
(amplificación) de los oligonucleótidos hibridados sobre el soporte
(portaobjetos de cristal). La extensión, con nucleótidos marcados o
a través de un marcaje indirecto, sólo se producirá si el extremo 3'
del oligonucleótido híbrida perfectamente con el producto de
amplificación.
Asimismo, en caso de que se desee realizar una
reacción de ligación post-hibridación utilizando,
por ejemplo, la metodología "OLA", tras la hibridación, se
lleva a cabo una reacción de ligación de los oligonucleótidos
hibridados sobre el soporte (portaobjetos de cristal) con los
oligonucleótidos marcados diseñados para hibridar de forma
adyacente. La ligación sólo se producirá si el extremo 3' de la
sonda depositada sobre el soporte híbrida perfectamente con el
producto de amplificación.
Finalizado el proceso de hibridación, o, en su
caso, dichas reacciones de amplificación o ligación
post-hibridación, se procede a la captura de la
imagen y a su cuantificación. Para ello, la imagen del
DNA-chip hibridado y revelado es recogida con un
dispositivo apropiado, por ejemplo, un escáner, procediéndose, a
continuación, a cuantificar los valores absolutos de fluorescencia
de cada sonda así como del ruido de fondo. Por tanto, en una
realización particular, tras la hibridación, o tras las reacciones
de amplificación o ligación post-hibridación, el
DNA-chip hibridado y revelado se introduce en un
escáner donde es sometido a un escaneado para cuantificar la
intensidad del marcaje en los puntos donde se ha producido la
hibridación. Aunque prácticamente cualquier escáner puede ser
utilizado, en una realización particular, dicho escáner es un
escáner de fluorescencia confocal. En este caso, el
DNA-chip se introduce en el escáner y se escanea la
señal emitida por el marcaje al ser excitado por un láser,
cuantificándose la intensidad de los puntos en donde se ha producido
la hibridación. En una realización particular, dicho escáner es un
escáner de luz blanca. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
escáneres que pueden ser utilizados según la presente invención son
escáneres de Axon, Agilent, Perkin Elmer, etc.
A continuación se procede al análisis de los
datos y a su interpretación, lo que se lleva a cabo mediante el
empleo del software de genotipado y algoritmo desarrollado por los
inventores.
El análisis de los datos y su interpretación se
lleva cabo, en general, mediante el empleo de programas informáticos
(software); sin embargo, no todos los programas son apropiados
requiriéndose programas que mejoren la calidad de la información
obtenida. Los inventores han desarrollado un método secuencial de
procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados
por los DNA-chips de la invención que permite
detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad,
especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación
clínica del método de la invención, en base a la obtención de tres
funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos
posibles, tal como se describe a continuación. El algoritmo y
software informático desarrollado por los inventores permite
facilitar y automatizar la aplicación del método de la
invención.
La ejecución del algoritmo y software
informático desarrollado por los inventores para procesar
secuencialmente e interpretar los datos experimentales generados por
los DNA-chips de la invención comprende la
realización de serie de etapas para caracterizar cada uno de las
variaciones génicas de interés, concretamente:
- -
- en primer lugar, a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas se les resta su propio ruido de fondo;
- -
- a continuación, se agrupan las réplicas correspondientes a cada una de las 4 sondas utilizadas para caracterizar cada variación génica;
- -
- el valor medio de intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes;
- -
- conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las sondas, se calcula el ratio 1 y el ratio 2, en donde
- Ratio 1 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 2 que detecta la variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Ratio 1 =
\frac{\text{Intensidad media sonda 1}}{\text{Intensidad media sonda
1 + Intensidad media sonda
2}}
\vskip1.000000\baselineskip
- Ratio 2 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 4 que detecta la variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Ratio 2 =
\frac{\text{Intensidad media sonda 3}}{\text{Intensidad media sonda
3 + Intensidad media sonda
4}}
\newpage
- -
- dichos ratios (ratio 1 y ratio 2) se sustituyen en tres funciones lineales, que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles:
- AA
- Función 1
- AB
- Función 2
- BB
- Función 3
- en donde
- AA representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica A;
- AB representa el genotipo de un sujeto heterocigoto para las variaciones génicas A y B;
- BB representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica B;
- Función 1 es la Función Lineal que caracteriza a los pacientes con el genotipo AA y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- Función 2 es la Función Lineal para el genotipo AB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- Función 3 es la Función Lineal para el genotipo BB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- en donde las combinaciones lineales están formadas por constantes y cofactores que acompañan a las variables ratio 1 y ratio 2; y
- -
- la función que presente un valor absoluto mayor determina el genotipo que presenta el paciente para la variación génica analizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Las tres funciones lineales que caracterizan a
cada uno de los tres genotipos se corresponden con las tres
combinaciones lineales de los ratios 1 y 2 que maximizan la
discriminación entre un grupo de sujetos homocigotos AA,
heterocigotos AB y homocigotos BB mediante el cálculo de sus
correspondientes ratios 1 y 2. El número mínimo de sujetos para
calcular unas funciones fiables es 5. Por tanto, en una realización
particular, la obtención de dichas funciones se lleva a cabo
mediante el análisis de un mínimo de 5 pacientes por cada uno de los
tres posibles genotipos de la variación génica (AA, AB, BB). Con los
resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 15 pacientes.
Estos ratios sirven como variables de clasificación de los tres
grupos para generar las funciones lineales. Con estas tres funciones
lineales se evalúa la capacidad discriminatoria de las dos parejas
de sondas diseñadas. En caso de que la capacidad de discriminación
no sea del 100%, las sondas serían rediseñadas. Nuevos pacientes
caracterizados para cada uno de los tres genotipos constituyen
nuevos ratios 1 y 2 para perfeccionar las combinaciones lineales de
los mismos que constituyen las funciones lineales y, en definitiva,
mejorar la capacidad discriminatoria del algoritmo basado en estas
tres funciones.
En una realización particular en la que el
escáner utilizado es un escáner de fluorescencia confocal, siempre
que (i) los ratios 1 y 2 se encuentren dentro del rango de los
ratios usados para construir las funciones lineales, (ii) la
intensidad de fluorescencia media de las 4n réplicas (dónde "n"
es el número de réplicas de cada sonda, es decir 6, 8 ó 10), por
ejemplo, 40 réplicas con respecto al ruido de fondo sea mayor de 5 y
(iii) el coeficiente de variación de las réplicas esté por debajo de
0,25, el resultado clasificatorio de las funciones lineales se
considera correcto. Las 3 funciones lineales para cada genotipo se
construyen a partir de los 15 ratios 1 y 15 ratios 2 obtenidos del
análisis con el DNA-chip de 5 pacientes (en una
realización particular) por genotipo (5 AA, 5 AB y 5 BB); al
analizar un nuevo paciente, se calcularán los ratios 1 y 2 y se
sustituirán dichos ratios en las funciones; la función de mayor
valor absoluto determina el genotipo. Además, los ratios 1 y 2 del
nuevo paciente, por ejemplo AA, deben estar incluidos en los 5
ratios 1 y 2 que permitieron construir la función lineal que
determina el grupo AA (se trata, pues, de una doble
comprobación).
Asimismo, cuando se utiliza un escáner de
fluorescencia confocal, para dar por buena una hibridación completa
es necesario que (a) la relación intensidad frente a ruido de fondo
de todas las sondas del DNA-chip esté por encima de
15; (b) la media de todos los ratios debe superar 0,6 como control
de especificidad y sensibilidad; (c) el coeficiente de variación de
todas las réplicas debe ser inferior a 0,25; (d) el ratio del
control externo debe estar por encima de 0,6 y (e) el control
negativo nunca debe ser superior a 3 veces el ruido de fondo. Todas
las condiciones (a)-(e) deben ser cumplidas simultáneamente para dar
por buena la hibridación completa utilizando un escáner de
fluorescencia confocal.
Por tanto, según la invención, el genotipado de
cada una de las variaciones génicas se lleva a cabo a partir de la
media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada
una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación génica,
en la que se eliminan los valores extremos ("outliers"); en una
realización particular, dichos valores extremos eliminados
constituyen entre el 10% y el 50% de los valores obtenidos.
Asimismo, el algoritmo desarrollado por los inventores para el
genotipado de cada una de dichas variaciones génicas sujetas a
estudio permite detectar cada una de las variaciones génicas en base
a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada
uno de los tres genotipos posibles (AA, AB y BB). Dicho algoritmo
comprende una secuencia con los siguientes pasos: utilización de 4
sondas replicadas 6, 8 ó 10 veces; cálculo de la media acotada para
calcular la intensidad media de las réplicas; cálculo de los ratios
1 y 2 correspondientes a las 2 parejas de sondas (para la detección
de las variaciones génicas A y B); sustitución de los ratios 1 y 2
obtenidos en las ecuaciones lineales obtenidas a partir de los
ratios 1 y 2 que discriminaron los "n" pacientes control con
genotipo AA, los "n" pacientes control con genotipo AB y los
"n" pacientes control con genotipo BB de cada variación génica
(en una realización particular "n" es 5); y determinar el
genotipo de cada paciente para cada variación génica incluida en el
DNA-chip en base al mayor valor absoluto. Por último
se comprueba que los ratios se corresponden con los ratios de los
"n" pacientes control que determinan cada genotipo. Se han
probado otros análisis como por ejemplo, no usar réplicas, no
calcular la media acotada, agrupar las réplicas, etc. y se ha
observado que no funciona, tener en cuenta sólo los ratios hace que
el análisis informático sea más lento, sin embargo, las funciones
agilizan el análisis y permiten discriminar más y
mejor.
mejor.
El método de la invención constituye, por tanto,
un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado
simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples
variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un
sujeto. El método de la invención permite identificar cambios de
nucleótidos, inserciones, duplicaciones, deleciones, etc. y
determinar el genotipo de un sujeto para una variación génica
dada.
Para la puesta en práctica del método de la
invención se han desarrollado unos DNA-chips de
genotipado útiles para detectar variaciones génicas, cuyas
características se mencionan más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
La utilización clínica del método de la
invención en la detección de variaciones génicas humanas asociadas a
antígenos eritrocitarios humanos de interés requiere la validación
previa de los DNA-chips de genotipado utilizados en
la puesta en práctica del método de la invención, los cuales
presentan un diseño característico.
En general, un DNA-chip de
genotipado adecuado para la puesta en práctica del método de la
invención, en adelante DNA-chip de la invención,
comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad
de sondas útiles para detectar variaciones génicas humanas presentes
en uno o más genes asociadas a antígenos eritrocitarios humanos, en
donde, por cada variación génica, hay 4 sondas, de las cuales 2
sondas detectan una primera variación génica y las otras 2 detectan
una segunda variación génica, en donde el número de réplicas de cada
una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas y las dos sondas no
tienen porqué ser iguales. Dichas sondas están depositadas siguiendo
un patrón determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2
áreas que constituyen el DNA-chip pero no agrupadas
por variación génica a detectar, es decir, que están distribuidas a
lo largo y ancho del chip y además no agrupadas dentro de una misma
variación génica.
El DNA-chip de la invención
también puede contener, si se desea, unos oligonucleótidos
depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y
negativos de las reacciones de amplificación y/o hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de disminuir al máximo la tasa de
falsos positivos y negativos se diseñan dos parejas de sondas para
detectar cada variación génica. Cada pareja de sondas está
constituida por una sonda específica para la detección de una
variación génica (e.g., el alelo normal) y por otra sonda diseñada
para la detección de otra variación génica (e.g., el alelo mutante).
En el caso de mutaciones puntuales, la base que difiere entre el
alelo normal y el mutante (base a interrogar) se coloca en la
posición central de la sonda, lo que asegura la máxima especificidad
en la hibridación. En el caso de inserciones, duplicaciones o
deleciones son varias las bases que se pueden interrogar. Sin
embargo, el diseño se hace completamente equivalente considerando
como posición central el primer nucleótido que es diferente en la
secuencia normal con respecto a la secuencia mutada.
La capacidad de las sondas específicas de
variaciones génicas para discriminar entre las variaciones génicas
(e.g., el alelo normal y el alelo mutante) depende de las
condiciones de hibridación, de la secuencia que flanquea a la
mutación y de la estructura secundaria de la secuencia en la que se
quiere detectar la mutación. Unas condiciones de hibridación
estables permiten establecer la hebra y la longitud apropiada de las
sondas con el fin de maximizar la discriminación. Partiendo de
sondas de 25 nucleótidos que detectan una variación génica (e.g., el
alelo normal) y otra variación génica (e.g., el alelo mutante) en
ambas hebras (hebra sentido y hebra antisentido), se requiere, en
general, una media de 8 sondas ensayadas experimentalmente para
quedarse con las dos parejas definitivas.
\newpage
En una realización particular, para cada
variación génica a detectar mediante el DNA-chip de
la invención, las sondas diseñadas interrogan ambas hebras, con
longitudes típicamente comprendidas entre 19 y 27 nucleótidos, y la
temperatura de hibridación varía entre 75ºC y 85ºC.
En caso de que el método de la invención incluye
el empleo de la metodología "primer extensión" u "OLA", se
diseñan igualmente 4 sondas, 2 de dichas sondas detectan una
variación génica (e.g., el alelo normal) y las otras 2 sondas
detectan la otra variación génica (e.g., el alelo mutante). En este
caso, la base interrogada no se coloca en la posición central sino
en la posición 3' de la sonda. En el caso de la metodología
"OLA", se diseñan unos oligonucleótidos marcados directa o
indirectamente que hibridan a continuación de las sondas depositadas
en el soporte sólido para permitir la reacción de ligación.
Dado que el método de la invención puede ser
utilizado para la detección de variaciones génicas humanas asociadas
a antígenos eritrocitarios humanos de interés, la naturaleza de las
sondas presentes en el DNA-chip de la invención
puede variar dentro de un amplio intervalo ya que, en cada caso, se
pueden seleccionar las sondas adecuadas para las variaciones génicas
que se desean detectar; en particular, dichas sondas son unas sondas
útiles para la detección de variaciones génicas humanas asociadas a
determinados antígenos eritrocitarios humanos. En la Tabla 1 se
incluye una relación de variaciones génicas humanas asociadas a
antígenos eritrocitarios humanos; no obstante, se pueden ir
incorporando en los DNA-chips de la invención sondas
que permitan la identificación de otras variaciones génicas
asociadas con el reconocimiento de antígenos de interés a medida que
se vayan identificando.
\vskip1.000000\baselineskip
Según la invención, se usan 4 sondas (es decir,
2 parejas de sondas) por cada variación génica a detectar que se
depositan sobre el soporte sólido siguiendo un patrón determinado de
forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas
por variación génica a caracterizar. Dos de dichas sondas detectan
una variación génica (e.g., el alelo normal) y las otras dos sondas
detectan otra variación génica (e.g., el alelo mutante). El número
de réplicas de cada una de dichas sondas en el
DNA-chip de la invención es de 10, 8 ó 6 réplicas.
En una realización particular, el DNA-chip de la
invención comprende 10 réplicas de cada una de las 4 sondas
utilizadas para detectar cada variación génica; en otra realización
particular, el DNA-chip de la invención comprende 8
réplicas de cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada
variación génica; y, en otra realización particular, el
DNA-chip de la invención comprende 6 réplicas de
cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación
génica.
La disposición (colocación) de las sondas en el
soporte está predeterminada. En una realización particular, las
sondas depositadas en el soporte, aunque mantienen una disposición
predeterminada, no están agrupadas por variación génica sino que
tienen una distribución al azar, la cual, si se desea, puede ser
siempre la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
El DNA-chip de la invención
también puede contener, si se desea, unos oligonucleótidos
depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y
negativos de las reacciones de amplificación y/o hibridación.
En una realización particular, el
DNA-chip de la invención comprende unos
oligonucleótidos depositados sobre el soporte útiles como controles
positivos y negativos de las reacciones de hibridación. En general,
cada uno de los sub-arrays, típicamente 16, que
constituyen un DNA-chip, está flanqueado por unos
controles externos de hibridación que permiten localizar fácilmente
los puntos sobre el soporte. Aunque con la misma secuencia, el
DNA-chip dispone de dos controles externos de
hibridación marcados, por ejemplo, con un fluoróforo (e.g., Cy3,
Cy5, etc.), que sirven para evaluar la calidad de la hibridación en
ambos canales. En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos del control externo es la siguiente (5'->3'):
- CEH:
- GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGAGTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA y las secuencias de los oligonucleótidos para su detección son las siguientes:
- ON1:
- CTTGACGACTCCTGAACGG
- ON2:
- CTTGACGACACCTGAACGG
\vskip1.000000\baselineskip
El soporte sobre el que están depositadas la
pluralidad de sondas puede ser cualquier superficie sólida sobre la
que se puedan unir oligonucleótidos. Prácticamente cualquier soporte
sobre el que pueda unirse o inmovilizarse un oligonucleótido,
utilizado en la producción de DNA-chips, puede ser
utilizado para la puesta en práctica de esta invención. A modo
ilustrativo, dicho soporte puede ser un soporte no poroso, por
ejemplo, un soporte de cristal, silicio, plástico, etc., o bien un
soporte poroso, por ejemplo, membranas (naylon, nitrocelulosa,
etc.), micropartículas, etc. En una realización particular, dicho
soporte es un portaobjetos (porta) de cristal.
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas se inmovilizan (unen) sobre el
soporte utilizando técnicas convencionales de inmovilización de
oligonucleótidos sobre la superficie de los soportes. Dichas
técnicas dependen, entre otros factores, de la naturaleza del
soporte utilizado [porosa (membranas, micropartículas, etc.) o no
porosa (cristal, plástico, silicio, etc.)]. En general, las sondas
pueden inmovilizarse sobre el soporte mediante el empleo de técnicas
de inmovilización no covalentes o bien mediante el empleo de
técnicas de inmovilización basadas en la unión covalente de las
sondas a la superficie del soporte mediante procedimientos
químicos.
La preparación de soportes no porosos (e.g.,
cristal, silicio, plástico, etc.) requiere, en general, un
tratamiento previo con grupos reactivos (e.g., amino, aldehído,
etc.) o bien recubrir la superficie del soporte con un miembro de un
par de unión específica (e.g., avidina, estreptavidina, etc.).
Asimismo, en general, resulta conveniente activar previamente las
sondas a inmovilizar mediante grupos tiol, amino, etc., o biotina,
etc., con el fin de conseguir una inmovilización específica de las
sondas sobre el soporte.
La inmovilización de las sondas en el soporte
puede llevarse a cabo por métodos convencionales, por ejemplo,
mediante técnicas basadas en la síntesis in situ de las
sondas sobre el propio soporte (e.g., fotolitografía, síntesis
química directa, etc.), o mediante técnicas basadas en el empleo de
brazos robotizados que depositan la sonda correspondiente
presintetizada (impresión sin contacto, impresión por contacto,
etc.), etc.
La disposición (colocación) de las sondas en el
soporte está predeterminada. En una realización particular, las
sondas depositadas en el soporte sólido, aunque mantienen una
disposición predeterminada, no están agrupadas por variación génica
sino que tienen una distribución al azar, la cual, si se desea,
puede ser siempre la misma.
En una realización particular, el soporte es un
portaobjetos de cristal, y, en este caso, las sondas, en el número
de réplicas establecido (6, 8 ó 10), se imprimen en portas de
cristal previamente tratados, por ejemplo, aminosilanizados, usando
un equipo de producción automática de DNA-chips por
deposición de los oligonucleótidos en el portaobjetos de cristal
("microarrayer") bajo condiciones apropiadas, por ejemplo,
mediante entrecruzamiento con radiación ultravioleta y horneado
(80ºC), manteniendo controlada la humedad y temperatura durante el
proceso de deposición, típicamente entre 40-50% de
humedad relativa y 20ºC de temperatura.
Las réplicas (sondas) se distribuyen en las
placas de impresión, que contienen los oligonucleótidos en solución,
de forma que las impriman un número de puntas distintas igual a la
mitad de las réplicas. Las réplicas se distribuyen homogéneamente
entre las áreas o sectores (sub-arrays) que
constituyen el DNA-chip. El número de réplicas así
como su homogénea distribución a lo largo y ancho del
DNA-chip minimizan la variabilidad experimental
proveniente de los procesos de impresión e hibridación. Asimismo, se
imprimen controles positivos y negativos de hibridación. En general,
cada uno de los sub-arrays que constituyen el
DNA-chip está flanqueado por unos controles externos
de hibridación que permiten localizar fácilmente los puntos sobre el
soporte. Aunque con la misma secuencia, el DNA-chip
dispone de dos controles externos de hibridación marcados, por
ejemplo, con un fluoróforo (e.g., Cy3, Cy5, etc.), que sirven para
evaluar la calidad de la hibridación en ambos canales. En una
realización particular, la secuencia de nucleótidos del control
externo es la identificada previamente como "CEH" y las
secuencias de los oligonucleótidos para su detección son las
identificadas previamente como ON1 y ON2.
Para controlar la calidad del proceso de
fabricación del DNA-chip en términos de señal de
hibridación, ruido de fondo, especificidad, sensibilidad,
reproducibilidad de cada réplica (coeficiente de variación) así como
del tamaño y forma de los puntos impresos (sondas) se puede utilizar
un DNA comercial. A modo ilustrativo, como control de calidad de la
impresión de los DNA-chips de la invención, se lleva
a cabo la hibridación con un DNA comercial (e.g., k562 DNA High
Molecular Weight, Promega) de uno de cada un número determinado de
soportes cargados con las sondas, por ejemplo, cada 20 soportes
impresos. En primer lugar, se analiza la forma y tamaño de los
puntos impresos. En esta hibridación se controlan los mismos
parámetros que se han explicado previamente para aceptar un
genotipado con el DNA-chip de la invención en cuanto
a la relación entre la intensidad y el ruido de fondo del
DNA-chip, especificidad - sensibilidad media y
reproducibilidad de las réplicas (coeficiente de variación).
Asimismo se comprueba el correcto genotipado de ese DNA control.
Los DNA-chips de la invención
pueden ser utilizados, en combinación con el método de la invención,
para detectar variaciones génicas humanas asociadas a antígenos
eritrocitarios humanos de interés, para lo cual se utilizarán las
sondas adecuadas para las variaciones génicas que se desean
detectar. Una ventaja de los DNA-chips de la
invención radica en que pueden incorporar sondas que permitan la
identificación de otras variaciones génicas asociadas con el
reconocimiento de antígenos eritrocitarios humanos a medida que se
vayan identificando tales variaciones génicas; para ello, se deberán
diseñar las sondas y los DNA-chips de acuerdo con
las enseñanzas de la presente invención, tal como se ha mencionado
previamente.
Los inventores han diseñado, producido y
validado la utilización clínica del método de la invención en la
detección de variaciones génicas humanas asociadas a determinados
antígenos eritrocitarios humanos mediante el desarrollo (diseño y
producción) del DNA-chip correspondiente. Por tanto,
en una realización particular, el DNA-chip de la
invención es:
\newpage
- un DNA-chip que permite la
detección simultánea, sensible, específica y reproducible de
variaciones génicas asociadas a determinados antígenos
eritrocitarios; ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas asociadas a antígenos eritrocitarios que pueden
ser identificados se recogen en la Tabla 1; no obstante, la relación
de variaciones génicas contenida en dicha tabla puede incrementarse
con otras variaciones génicas que vayan identificándose
posteriormente y que estén asociadas a antígenos eritrocitarios.
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Las secuencias de todos los genes mencionados en
la Tabla 1 son conocidas y están recogidas, entre otras, en las
siguientes páginas webs: GeneBank (NCBI), GeneCard (Weizmann
Institute of Sciences) y Snpper.chip.org (Innate Immunity PGA).
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En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit para la puesta en práctica del método de la invención, en
adelante kit de la invención, que comprende:
- -
- un DNA-chip de la invención que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas que permiten la detección de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos presentes en uno o más genes;
- -
- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en el método de la invención que comprende el empleo de un algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente,
- -
- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación del método de la invención.
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El kit de la invención puede contener, además,
si se desea, unos controles positivos y negativos de la reacción de
hibridación.
Las características del DNA-chip
de la invención, método de la invención y algoritmo proporcionado
por esta invención ya han sido descritas previamente.
El kit de la invención puede ser utilizado para
la detección de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos
eritrocitarios humanos de interés, para lo cual se seleccionarán las
sondas adecuadas para las variaciones génicas que se desean
detectar.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit para la identificación in vitro de grupos sanguíneos
humanos, o el genotipado in vitro de grupos sanguíneos
humanos, que comprende:
- -
- un DNA-chip de la invención que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas que permiten la detección de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos;
- -
- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en el método de la invención que comprende el empleo de un algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente,
- -
- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación del método de la invención para detectar variaciones génicas humanas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos.
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En una realización concreta, el kit de la
invención comprende un DNA-chip de la invención que
comprende, depositadas sobre un soporte siguiendo un patrón
determinado, unas sondas que permiten la detección de variaciones
génicas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos, en donde
dichas variaciones génicas humanas asociadas a antígenos
eritrocitarios humanos se seleccionan del grupo de variaciones
génicas mencionadas en la Tabla 1 y combinaciones de las mismas.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
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Se diseñó y fabricó un DNA-chip
para detectar variaciones génicas humanas asociadas a algunos
antígenos eritrocitarios que permite la detección simultánea,
sensible, específica y reproducible de variaciones génicas asociadas
a antígenos eritrocitarios humanos. Ejemplos ilustrativos de dichas
variaciones génicas humanas asociados a antígenos eritrocitarios
humanos que pueden ser determinados utilizando este
DNA-chip se mencionan en la Tabla 1.
En este caso concreto, el
DNA-chip diseñado y fabricado consta de un soporte
(portaobjetos de cristal) que contiene sobre su superficie una
pluralidad de sondas que permiten la detección de las variaciones
génicas mencionadas anteriormente. Estas sondas son capaces de
hibridar con las secuencias diana amplificadas de los genes que
codifican los antígenos eritrocitarios cuya variación génica se
desea estudiar. Las secuencias de DNA de cada una de las sondas
utilizadas son las siguientes [en general, se indica el nombre del
gen, la mutación (cambio de nucleótido, "ins": inserción,
"del": deleción), el genotipo y el exón).
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Las sondas capaces de detectar las distintas
variaciones génicas identificadas previamente se imprimen en el
soporte (portaobjetos de cristal) aminosilanizado empleando DMSO
como tampón de impresión. La impresión se lleva a cabo con un
spotter o impresor de oligonucleótidos (sondas) controlando la
temperatura y la humedad relativa.
La unión de las sondas al soporte (portaobjetos
de cristal) se lleva a cabo mediante entrecruzamiento con radiación
ultravioleta y horneado tal y como se describe en la documentación
aportada por el fabricante (Por ejemplo, Corning Lifesciences
http://www.corning.com). La humedad relativa durante el
proceso de deposición se mantiene entre el 40-50% y
la temperatura en torno a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrae DNA del individuo a partir de una
muestra de sangre mediante un protocolo estándar de filtración (Por
ejemplo, kits comerciales de Macherey Nagel, Quiagen, etc).
Se amplifican todos los exones e intrones de
interés mediante PCR multiplex utilizando las parejas de
oligonucleótidos cebadores apropiadas. Prácticamente puede
utilizarse cualquier par de oligonucleótidos cebadores que permita
la amplificación específica de fragmentos génicos en los que pueda
existir la variación génica a detectar, ventajosamente, aquellos
pares de oligonucleótidos cebadores que permitan dicha amplificación
en el menor número posible de reacciones PCR; en particular, se
seleccionaron unos oligonucleótidos cebadores que permitían
amplificar, en tan sólo 3 reacciones de PCR multiplex, los 36
fragmentos necesarios para el genotipado de las 94 variaciones
génicas previamente mencionadas analizadas utilizando el
DNA-chip de la invención para la detección de
variaciones génicas asociadas a antígenos eritrocitarios.
Los oligonucleótidos cebadores útiles para
llevar a cabo la PCR multiplex para la detección de variaciones
génicas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos pueden ser
diseñados por los expertos en la materia utilizando las secuencias
de los genes correspondientes tal y como se describen en GenBank
usando por ejemplo los softwares:
Primer 3
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3
www.cgi) o
Web Primer
(http://seg.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer).
Las PCR multiplex se llevan a cabo
simultáneamente bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura
que permiten la amplificación específica de los fragmentos de los
genes en los que pueda existir la variación génica a detectar.
Finalizada la PCR multiplex se comprueba, en gel de agarosa, que ha
tenido lugar reacción de amplificación.
A continuación, la muestra a hibridar (producto
de la amplificación) se somete a fragmentación con una Dnasa y los
productos resultantes del proceso de fragmentación se someten a una
reacción de marcaje indirecto. Una transferasa terminal incorpora un
nucleótido unido a un miembro de un par de unión específica, por
ejemplo, biotina, al final de estos pequeños fragmentos.
Antes de aplicar la muestra sobre el
DNA-chip se procede a desnaturalizar la muestra
mediante calentamiento a 95ºC durante 5 minutos y, posteriormente,
se añade el tampón de hibridación "ChipMap Kit Hybridization
Buffer" (Ventana Medical System).
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La hibridación se lleva a cabo de forma
automática en la estación de hibridación Ventana Discovery (Ventana
Medical Systems), desarrollada para tal fin.
Se realiza una prehibridación o bloqueado del
portaobjetos con BSA. A continuación, se aplica la muestra junto con
la solución de hibridación [ChipMap Kit Hybridization Buffer
(Ventana Medical System)] y se mantiene durante 1 hora a 45ºC
siguiendo el protocolo Ventana 9.0 Europe (Ventana Medical System).
Finalmente, el portaobjetos se somete a la acción de diferentes
soluciones de lavado [ChipMap hybridisation Kit Buffers (Ventana
Medical System)]. Una vez finalizado el proceso de hibridación se
procede al lavado final y secado del portaobjetos.
Finalizada la hibridación, el revelado con
estreptavidina-Cy3 marca los puntos (sondas) en los
que se ha producido la hibridación.
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Se introduce el portaobjetos en el escáner de
fluorescencia confocal, por ejemplo Axon escáner 4100A, y se procede
a escanear la señal emitida por el marcaje estándar al ser excitado
por el láser.
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El software del propio escáner permite la
cuantificación en la imagen obtenida de la señal de los puntos donde
se ha producido hibridación.
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A partir de la señal que se obtiene con las
sondas que detectan las diferentes variaciones génicas se establece
el genotipo del individuo. Para ello, brevemente, en primer lugar, a
los valores absolutos de intensidad de todas las sondas se les resta
su propio ruido de fondo; a continuación, se agrupan las réplicas
correspondientes a cada uno de las 4 sondas que se usan para
caracterizar cada variación génica. El valor medio de intensidad
para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de
las réplicas para eliminar los puntos aberrantes. Conocidos los
valores medios de intensidad para cada una de las sondas se calculan
dos ratios (ratio 1 y ratio 2):
Ratio 1
=\frac{\text{Intensidad media sonda 1}}{\text{Intensidad media
sonda 1 + Intensidad media sonda
2}}
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Ratio 2 =
\frac{\text{Intensidad media sonda 3}}{\text{Intensidad media sonda
3 + Intensidad media sonda
4}}
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Estos ratios se sustituyen en tres funciones
lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos
posibles:
- AA
- Función 1
- AB
- Función 2
- BB
- Función 3
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La función que presente un valor absoluto mayor
determina el genotipo que presenta el paciente.
En este caso, la obtención de dichas funciones
lineales se lleva a cabo mediante el análisis de 5 sujetos por cada
uno de los tres posibles genotipos de la variación génica (AA, AB,
BB). Con los resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 15
sujetos. Estos ratios sirven como variables de clasificación de los
tres grupos para generar las funciones lineales. Con estas tres
funciones lineales se evalúa la capacidad discriminatoria de las dos
parejas de sondas diseñadas. En caso de que la capacidad de
discriminación no sea del 100%, las sondas serían rediseñadas.
Nuevos sujetos caracterizados para cada uno de los tres genotipos
constituyen nuevos ratios 1 y 2 para perfeccionar las combinaciones
lineales de los mismos que constituyen las funciones lineales y, en
definitiva, para mejorar la capacidad discriminatoria del algoritmo
basado en estas tres funciones.
Siempre que los ratios 1 y 2 se encuentren
dentro del rango de los ratios usados para construir los grupos, la
intensidad de fluorescencia media de las 40 réplicas con respecto al
ruido de fondo sea mayor de 5 y el coeficiente de variación de todas
las réplicas del DNA-chip esté por debajo de 0,25
(utilizando un escáner de fluorescencia confocal) el resultado de
las funciones lineales se considera correcto.
Para dar por buena una hibridación completa es
necesario que la relación intensidad frente a ruido de fondo de
todas las sondas del DNA chip esté por encima de 15. Asimismo, la
media de todos los ratios debe superar 0,6 como control de
especificidad y sensibilidad. El ratio del control externo debe
estar por encima de 0,6 y el control negativo nunca debe ser
superior a 3 veces el ruido de fondo. Estos parámetros son
consistentes con la realización particular de un escáner de
fluorescencia confocal.
Resumiendo, cada mutación presenta en el
portaobjetos 4 sondas (repetidas 10 veces) para su detección. Dos de
dichas sondas detectan una variación génica y las otras dos la otra
variación génica. La base interrogada se localiza siempre en la
posición central.
En el caso de un sujeto homocigoto para la
variación génica A, este no presentará variación génica B; por
consiguiente, en la imagen que se obtiene del soporte de cristal las
sondas que detectan la variación génica B presentan una señal de
hibridación notablemente inferior a la presentada por la variación
génica A y viceversa; en este caso, los ratios 1 y 2 tenderán a 1 y
los sujetos serán asignados como homocigotos AA por el software de
análisis.
Por otro lado, un sujeto heterocigoto para una
variación génica determinada presenta ambos la variaciones génicas;
por tanto, las sondas que los detectan presentan una señal de
hibridación equivalente. Los ratios 1 y 2 tenderán a 0,5 y los
sujetos serán asignados como heterocigotos AB por el software de
análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevó a cabo la extracción del DNA por
métodos convencionales de 15 donantes de sangre que respondían a los
grupos serológicos A y 0. El análisis genético mediante
secuenciación de la región de interés corroboró que 5 de los
donantes presentaban genotipo 188G189C (determinación serológica A),
otros 5 donantes presentaban genotipo 188GA189CT (determinación
serológica 0) y los restantes 5 donantes presentaban genotipo
188A189T (determinación serológica 0).
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron 4 sondas para la detección del
polimorfismo ABO G188A/C189T genotipo ABO O1v, tal y como se ha
descrito previamente en la descripción de la invención, cuyas
secuencias se recogen a continuación (Ejemplo 1):
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas diseñadas se imprimieron en el
portaobjetos de cristal con un microarrayer tal y como se describe
en el Ejemplo 1.2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó, mediante PCR multiplex utilizando
cebadores específicos, la región del gen ABO que permitía el
análisis de la variación génica de interés (ABO G188A/C189T genotipo
ABO O1v). El producto de la amplificación fue fragmentado y marcado
tal y como se indica en el Ejemplo 1.3.1.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación se llevó a cabo en una estación
automática de hibridación, tal y como se ha descrito previamente en
el Ejemplo 1.3.2.
\vskip1.000000\baselineskip
El portaobjetos se introdujo en el escáner y se
procedió a escanear la señal emitida por el marcaje estándar al ser
excitado por el láser (Ejemplo 1.3.3) y a cuantificar la imagen
obtenida de la señal de los puntos donde se ha producido hibridación
(Ejemplo 1.3.4).
El análisis de los resultados se llevó a cabo
utilizando el algoritmo previamente descrito en el Ejemplo 1.3.5. El
empleo de dicho algoritmo permitió caracterizar esta variación
génica para los 15 sujetos con una coincidencia del 100% con
respecto a los métodos serológicos y de secuenciación.
La Figura 1 muestra la representación de los
ratios 1 y 2 y permite caracterizar a los 15 pacientes.
Las funciones lineales para los tres grupos se
exponen en la Tabla 2, en donde el número de réplicas de las 4
sondas usadas fue 10; "X" es el ratio 1; "Y" es el ratio
2; "0" se corresponde con el genotipo 188A189T; "1" se
corresponde con el genotipo 188GA189CT; y "2" se corresponde
con el genotipo 188G189C.
Un donante con genotipo 188G189C presentó unos
ratios 1 y 2 de 0,77 y 0,82, respectivamente. Al sustituir estos
ratios en las funciones lineales, se observa que la función 2
presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda demostrado
cómo el algoritmo proporcionado por esta invención clasifica
perfectamente a los donantes para 10 réplicas de cada una de las 4
sondas.
Las funciones lineales obtenidas para 8 réplicas
de cada una de las 4 sondas, se recogen en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El mismo donante con genotipo 188G189C presentó
igualmente unos ratios 1 y 2 de 0,77 y 0,82, respectivamente. Al
sustituir estos ratios en las funciones lineales, se observa que la
función 2 presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda
demostrado cómo el algoritmo proporcionado por esta invención
clasifica perfectamente a los pacientes para 8 réplicas de cada una
de las 4 sondas.
Las funciones lineales obtenidas para 6 réplicas
de cada una de las 4 sondas, se recogen en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El mismo donante con genotipo 188G189C presentó
igualmente unos ratios 1 y 2 de 0,77 y 0,82, respectivamente. Al
sustituir estos ratios en las funciones lineales, se observa que la
función 2 presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda
demostrado cómo el algoritmo proporcionado por esta invención
clasifica perfectamente a los pacientes para 6 réplicas de cada una
de las 4 sondas.
Claims (5)
1. Un DNA-chip adecuado para la
puesta en práctica de un método in vitro, extracorpóreo, para
el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas
presentes en uno o más genes de un sujeto asociadas a antígenos
eritrocitarios humanos,
comprendiendo dicho método:
- -
- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;
- -
- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;
- -
- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y
- -
- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles,
comprendiendo dicho DNA-chip un
soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas
útiles para detectar variaciones génicas humanas presentes en uno o
más genes asociadas a antígenos eritrocitarios humanos, en donde,
por cada variación génica a detectar, hay 4 sondas, de las cuales 2
sondas detectan una primera variación génica y las otras 2 detectan
una segunda variación génica, en donde el número de réplicas de cada
una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas, depositadas siguiendo
una patrón determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2
áreas que constituyen el DNA-chip pero no agrupadas
por variación génica a detectar, y, opcionalmente, unos
oligonucleótidos depositados sobre el soporte útiles como controles
positivos y negativos de las reacciones de hibridación, y
en donde dichas variaciones génicas humanas
asociadas a antígenos eritrocitarios se seleccionan del grupo
formado por el polimorfismo GG87_88insG (Genotipo O4) (BC008) en el
exón 2 del gen ABO, el polimorfismo G188A+C189T (Genotipo O1v)
(BC012) en el exón 4 del gen ABO, los polimorfismos 261delG
(Genotipo O1/O1v) (BC001), C322T (Genotipo O5) (BC009) en el exón 6
del gen ABO, los polimorfismos C467T (P156L) (Genotipo A2) (BC014),
G542A (Genotipo O8) (BC013), T646A (Genotipo Ax/O1v) (BC015), G703A
(Genotipo G235S) (B) (BC002), C796A (Genotipo L266M) (B) (BC003),
G802A (Genotipo O2) (BC004), G803C (Genotipo G268A) (B,
cisAB-1) (BC005), 798-804insG
(Genotipo O3, Ael) (BC007), C893T (Genotipo O6) (BC010), C927A
(Genotipo O7) (BC011), 1059-1061delC (D FS354+21aa)
(Genotipo A2) (BC006) en el exón 7 del gen ABO, los polimorfismos
C8G (S3C) (Genotipo weak D type 3) (BC040), G48A (W16X) (Genotipo
RHD W16X) (BC046), C121T (Q41X) (Genotipo RHD Q41X) (BC047) en el
exón 1 del gen RHD, los polimorfismos A178C, G203A, T307C (exon
scanning) (BC016, BC017, BC018), T161C (L54P) (Genotipo DMH)
(BC033), G270A (W90X) (Genotipo RHD W90X) (BC047), T329C (L110P)
(Genotipo DVII) (BC028) en el exón 2 del gen RHD, los polimorfismos
C340T (Genotipo weak D type 17) (BC043), C410T (Genotipo DIIIiv)
(BC059), C446A (A149D) (Genotipo weak D type 5) (BC041), A455C
(Genotipo DIIIa, DIIIiv, DIVa) (BC060), IVS3+1G>A (Genotipo alelo
negativo) (BC049) en el exón 3 del gen RHD, los polimorfismos
488del4 (Genotipo alelo negativo) (BC050), A497C (H166P) (Genotipo
DFW) (BC030), T509C (M170T) (Genotipo DOL) (BC027), A514T (Genotipo
DFRI) (BC065), T544A, G577A, A594T (Genotipo DVI-I
weak D type 4) (exon scanning), (BC019, BC020, BC021) en el exón 4
del gen RHD, polimorfismos G635T (G212V) (Genotipo RHD G212V)
(BC051), T667G (Genotipo DIIIa, weak D type 4, Dva, DAR, DOL, DCS)
(BC061), G676C (Genotipo DCS, G686A (Genotipo DHR) (BC031), G697C
(E233Q), (Genotipo G712A (M238V) (DVI I, weak D type 4, DV, DCS)
(BC022, BC023),A712G (genotipo alelo negativo) (BC023) en el exón 5
del gen RHD, polimorfismos T807G (Genotipo pseudogene) (BC044),
T809G (Genotipo weak D type 1) (BC038), G845A (G282D) (Genotipo weak
D type 15, DIM) (BC037), C848T (T283I) (Genotipo DHMI) (BC029),
G854A (C285Y) (Genotipo DIM) (BC032), G885T (M295I) (Genotipo alelo
negativo M295I) (BC053), 906insGGCT (Genotipo alelo negativo)
(BC054), G916A, A932G (consenso exon scanningconsenso exon scanning
exon scanning) (BC062, BC063), IVS6+1del4 (Genotipo alelo negativo)
(BC055) en el exón 6 del gen RHD, polimorfismos G941T (G314V)
(Genotipo alelo negativo) (BC056), C990G (Y330X) (Genotipo alelo
negativo) (BC057), G1016A (G339E) (Genotipo weak D type 7) (BC042),
T1025C (I342T) (exon scanning) (BC024), G1048C (Genotipo DIVa, DIVb)
(BC094), G1057A (G353R) (Genotipo DNU) (BC034), C1061A (A354N)
(Genotipo DII) (BC036), G1063A (G355S) (Genotipo DNB) (BC026),
T1073C (Genotipo DWI) (BC035) en el exón 7 del gen RHD, polimorfismo
IV8+1G>A (Genotipo alelo negativo) (BC058) en el exón 8 del gen
RHD, G1154C (G385A) (Genotipo weak D type 2) (BC039), A1193T
(Genotipo DIVb) (BC064), G1227A (K409K) (Genotipo K409K) (BC045)
polimorfismos en el exón 9 del gen RHD, los polimorfismos G106A
(A36T) (Genotipo Cx) (BC068), A122G (Q41R) (Genotipo Cw) (BC067) en
el exón 1 del gen RHCE, el polimorfismo T307C (S103P) (Genotipo Rhc)
(BC066) en el exón 2 del gen RHCE, el polimorfismo C410T (A137V)
(BC059) en el exón 3 del gen RHCE, los polimorfismos C676G (P226A)
(Genotipo Ee) (BC025, BC069), C733G (L245V) (Genotipo VS) (BC070) en
el exón 5 del gen RHCE, el polimorfismo G1006T (G336C) (Genotipo
VS-/VS+) (BC071) en el exón 7 del gen RHCE, los polimorfismos A697T
(Genotipo Kk) (BC073), C698T (T193M) (Genotipo Kk) (BC072) en el
exón 6 del gen KELL, los polimorfismos T961C (R281W) (Genotipo
KpaKpb) (BC074), G962A (R281Q) (Genotipo KpbKpc) (BC075) en el exón
8 del gen KELL, el polimorfismo G1208A (S363N) (Genotipo
Kmod-1) (BC077) en el exón 10 del gen KELL, el
polimorfismo C1910T (L597P) (Genotipo JsaJsb) (BC076) en el exón 17
del gen KELL, el polimorfismo I5AG>AA (Genotipo JknulI) (BC079)
en el exón 6 del gen SLC14A1 (grupo sanguíneo KIDD), los
polimorfismos G838A (D280N) (Genotipo JkaJkb) (BC078), T871C (S291P)
(Genotipo JknulI) (BC080) en el exón 9 del gen SLC14A1 (grupo
sanguíneo KIDD), los polimorfismos T-33C (Genotipo
FyGATA) (BC082), G125A (D42G) (Genotipo FyaFyb) (BC081), C265T
(R89C) (Genotipo Fyx) (BC083) en el gen DARC (grupo sanguíneo
DUFFY), los polimorfismos C59T, G71A, T72G (S20L, G42E, G42E)
(Genotipo MN) (BC084, BC085) en el exón 2 del gen GYPA, el
polimorfismo T143C (M48T) (Genotipo Ss) (BC086) en el exón 4 del gen
GYPB, los polimorfismos C790A (Genotipo GpMUR MilII) (BC089), C850G
(Genotipo GpMUR MilII) (BC090) en el exón 3 del gen GYPE, los
polimorfismos C230T (Genotipo U) (BC087), I5+5GT (Genotipo U)
(BC088) en el exón 5 del gen GYPB, el polimorfismo T2561C (P854L)
(Genotipo DiaDib) (BC091) en el exón 19 del gen SLC4A1 (grupo
sanguíneo DIEGO), el polimorfismo A793G (Genotipo DoaDob) (BC092) en
el exón 2 del gen DOMBROCK, el polimorfismo C134T (A45V) (Genotipo
CoaCob) (BC093) en el exón 1 del gen COLTON y combinaciones de los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
2. DNA-chip según la
reivindicación 1, en el que cada una de dichas 4 sondas para la
detección de cada variación génica presentan la base a interrogar en
la posición central y tiene una longitud comprendida entre 19 y 27
nucleótidos.
3. Uso de un DNA-chip según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el genotipado
simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples
variaciones génicas humanas asociadas con antígenos eritrocitarios
humanos.
4. Un kit adecuado para la puesta en práctica de
un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado
simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno
o más genes de un sujeto asociadas a antígenos eritrocitarios
humanos que comprende:
- -
- un DNA-chip según las reivindicaciones 1 ó 2;
- -
- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en un método que comprende:
- a)
- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;
- b)
- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;
- c)
- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;
- d)
- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;
\newpage
- e)
- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y
- f)
- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles; y, opcionalmente,
- -
- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Uso de un kit según la reivindicación 4 para
la identificación in vitro de grupos sanguíneos humanos, o el
genotipado in vitro de grupos sanguíneos humanos.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901845A ES2361800B1 (es) | 2009-09-11 | 2009-09-11 | Metodos y productos para genotipado in vitro de variaciones genicas humanas asociadas a antigenos eritrocitarios humanos. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901845A ES2361800B1 (es) | 2009-09-11 | 2009-09-11 | Metodos y productos para genotipado in vitro de variaciones genicas humanas asociadas a antigenos eritrocitarios humanos. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2361800A1 true ES2361800A1 (es) | 2011-06-22 |
| ES2361800B1 ES2361800B1 (es) | 2012-04-04 |
Family
ID=44123078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200901845A Active ES2361800B1 (es) | 2009-09-11 | 2009-09-11 | Metodos y productos para genotipado in vitro de variaciones genicas humanas asociadas a antigenos eritrocitarios humanos. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2361800B1 (es) |
-
2009
- 2009-09-11 ES ES200901845A patent/ES2361800B1/es active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HASHMI G. et al. "A flexible array format for large-scale, rapid blood group DNA typing". Transfusion. May. 2005. Vol. 45, Nº. 5, paginas 680-688. ISSN 0041-1132 (print). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2361800B1 (es) | 2012-04-04 |
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