ES2326708B1 - Metodos y productos para genotipado in vitro. - Google Patents
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Abstract
Métodos y productos para genotipado in
vitro.
El método de genotipado se basa en la
combinación de un diseño experimental de DNA-chips
de genotipado y en el desarrollo de un sistema secuencial de
procesamiento e interpretación de los datos experimentales generados
por dichos DNA-chips de genotipado basado en el
aumento de la señal de hibridación, lo que garantiza unos elevados
niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de los
resultados, que permiten que dichos DNA-chips
puedan ser utilizados, por ejemplo, como herramientas fiables de
diagnóstico genético clínico. De aplicación en el diagnóstico in
vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante
DNA-chips, para la detección de variaciones
génicas, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas
con enfermedades, o asociadas al genotipado de antíqenos de
interés, o asociadas con la resistencia a tratamientos
farmacológicos.
Description
Métodos y productos para genotipado in
vitro.
La invención se adscribe al sector
técnico-industrial del diagnóstico in vitro,
extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante
DNA-chips, para la detección de variaciones génicas
por ejemplo, polimorfismos o mutaciones génicas asociadas con
enfermedades, o asociadas al genotipado de antígenos de interés, o
asociadas con la resistencia a tratamientos farmacológicos.
En el año 2001, el Consorcio para el Proyecto
Genoma Humano y la empresa privada Celera presentaron un primer
borrador completo del genoma humano con 30.000 genes. A partir de
este momento se iniciaba la posibilidad del estudio del genoma
completo o estudios a gran escala (high-throughput).
Los denominados "DNA-chips", también
denominados "microarrays", "DNAarrays" o
"bio-chips de DNA" son herramientas que la
Genómica Funcional puede usar para los estudios a gran escala que
se plantean en la actualidad. La Genómica Funcional estudia los
cambios en la expresión de los genes debidos al ambiente al que
está sometido el individuo y a las características genéticas del
mismo. La secuencias de los genes presentan pequeñas variaciones
interindividuales de un único nucleótido que reciben el nombre de
SNP ("single nucleotide polymorphism") que en un pequeño tanto
por ciento están implicados en cambios en la expresión de los genes
que causan determinadas patologías. La mayoría de los estudios que
aplican DNA-chips son de expresión génica aunque
también se utilizan en la detección de SNPs.
El primer DNA-chip fue el
"Southern blot" en el que moléculas de ácidos nucleicos
marcadas se utilizaban para interrogar moléculas de ácidos nucleicos
unidas a un soporte sólido. El soporte sobre el que se llevaba a
cabo la interrogación en los primeros DNA-chips
eran membranas de nylon. Aunque se partía de una buena idea, la
técnica era todavía muy laboriosa.
Dos avances marcaron el arranque definitivo de
los DNA-chips. Por una parte, el uso de un soporte
sólido no poroso, como el vidrio, que facilitó la miniaturización y
la detección basada en fluorescencia. Por otra parte, la adaptación
de técnicas fotolitográficas utilizadas en la elaboración de
semiconductores para la producción de DNA-chips
conteniendo cada uno de ellos más de 400.000 oligonucleótidos
distintos, en una región de aproximadamente 20 \mum^{2}, los
denominados DNA-chips de alta densidad.
Concretamente un DNA-chip es un
soporte sólido que contiene cientos de fragmentos de secuencias de
genes diferentes representadas en forma de DNA, cDNA u
oligonucleótidos inmovilizadas o unidas en su superficie en
posiciones fijas. Los soportes son generalmente portaobjetos de
vidrio para microscopio, membranas de nylon o "chips" de
silicio. Es importante que estas secuencias o sondas estén unidas al
soporte en un orden fijo ya que la localización robotizada de cada
uno de ellos determina el gen cuya expresión se está midiendo. En
función de la tecnología empleada para la producción de los
DNA-chips se pueden clasificar en:
- DNA-chips de alta densidad:
Los oligonucleótidos que se encuentran en la superficie del
portaobjetos de vidrio han sido sintetizados "in situ",
mediante una metodología denominada fotolitografía.
- DNA-chips de baja densidad: En
este caso los oligonucleótidos, cDNA o fragmentos de PCR son
depositados en forma de nanogotas en la superficie del cristal
mediante un robot que imprime esas secuencias de DNA en el
portaobjetos. Existen pocos ejemplos de DNA-chips
de baja densidad y, al contrario que en los de alta densidad, son
pocas las variaciones génicas detectadas: un
DNA-chip para la detección de 5 mutaciones
puntuales en el gen de la tirosinasa, un DNA-chip
para la detección de mutaciones en p53 y k-ras, un
DNA-chip para la detección de 12 mutaciones
causantes de cardiomiopatía hipertrófica, un
DNA-chip para el genotipado de cepas de
Escherichia coli o DNA-chips para la
detección de patógenos tales como Cryptosporidium parvum o
rotavirus.
Según la estrategia de diseño de los
oligonucleótidos se puede hablar de:
- "Standard tiling": Se diseñan 4
oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia de
referencia excepto en la posición central donde se interrogan las 4
posibilidades: A, C, G y T; un ejemplo ilustrativo de esta
estrategia es el DNA-chip para el genotipado de
HIV-1 (Affymetrix). La posición central asegura
máxima especificidad.
- "Alternative tiling": En este caso son 5
los oligonucleótidos diseñados, de forma que el quinto interroga
una posible deleción en la secuencia; un ejemplo ilustrativo de
esta estrategia es el DNA-chip para la detección de
mutaciones en p53 (Affymetrix).
- "Block tiling": Se diseñan 4
oligonucleótidos totalmente complementarios a la secuencia normal y
otros 4 totalmente complementarios a la secuencia mutante; el
nucleótido que cambia se coloca en la posición central, pero 2
nucleótidos antes o después se coloca un "missmatch" que puede
ser una de las cuatro bases (A, C, T o G).; un ejemplo ilustrativo
de esta estrategia es el DNA-chip para la detección
de mutaciones en el citocromo p450 (Affymetrix). Dentro de esta
última estrategia ["block tiling"] Affymetrix usa el
"missmatch" para aumentar la especificidad de la hibridación
no sólo en una posición sino en las posiciones -4, -1, 0, +1 y +4
para identificar el cambio producido en la posición central ó 0.
Esta estrategia se denomina "Alternative block tiling" y un
claro ejemplo es el DNA-chip para la detección de
1.500 SNPs (Affymetrix).
En el caso de estudios de expresión génica, las
sondas depositadas en el vidrio se hibridan con los cDNAs
sintetizados a partir de los mRNAs extraídos del tejido que se
quiere analizar. Estas moléculas de cDNA han sido marcadas con un
fluoróforo al sintetizarse; cuanto mayor sea el número de moléculas
que se unen a su secuencia complementaria en el
DNA-chip, mayor será la cantidad de fluoróforo que
se detecta y mide tras excitarlo con un láser. Esta medida es, por
tanto, reflejo del número de moléculas de cada mRNA que había en el
tejido analizado y, consecuentemente, reflejo del nivel de
expresión de cada gen representado en el DNA-chip,
lo que se denomina un patrón de expresión de la célula. Estos
DNA-chips de expresión contienen también sondas que
representan genes de control ("house-keeping
genes"), lo que permite normalizar los resultados y comparar
múltiples experimentos de forma cuantitativa. Con un
DNA-chip, se pueden determinar en un solo
experimento los niveles de expresión de cientos o miles de genes de
una célula. El cDNA de la muestra problema y de la muestra control
se pueden marcar con dos fluoróforos distintos por lo que en el
mismo DNA-chip se pueden estudiar las diferencias
entre la expresión de los genes en la muestra control y en la
muestra problema.
Los DNA-chips para la detección
de polimorfismos genéticos, cambios o mutaciones en general,
variaciones génicas, en la secuencia de DNA, comprenden unas
superficies sólidas, típicamente de cristal, en las que está
depositado un elevado número de secuencias génicas complementarias
de cada una de las variaciones génicas que se desea estudiar. Una
de las estrategias utilizadas para detectar variaciones génicas
consiste en la hibridación de las secuencias que reconocen
específicamente al alelo normal y al mutado con fragmentos de DNA
procedentes de la muestra que se va a analizar, amplificados
mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
y marcados con una molécula fluorescente. Al iluminar el
DNA-chip con el láser se identifican aquellas
secuencias que se han unido a la muestra problema y así se
discrimina específicamente un paciente normal de un heterocigoto o
un homocigoto mutante. Otra estrategia básica de detección de
variaciones génicas con DNA-chips de genotipado
consiste en llevar a cabo una reacción de amplificación o extensión
sobre el propio DNA-chip.
Dentro de la estrategia de hibridación se puede
hacer una subclasificación en función del método de análisis de la
información para el genotipado:
- Aumento de la señal de hibridación: Esta
estrategia compara la señal de hibridación de las sondas
complementarias a los alelos normales y a los alelos mutantes. En
general, las muestras mutadas deben presentar una mayor señal de
hibridación en las sondas complementarias a los alelos mutantes que
en el caso de los individuos normales.
- Pérdida de la señal de hibridación: Los
cambios en la secuencia entre una muestra control y una muestra a
estudio se pueden identificar por una caída en la señal de
hibridación de los oligonucleótidos totalmente complementarios con
la secuencia de referencia. En los individuos homocigotos se
produce una pérdida completa de señal mientras que en los
heterocigotos se produce una pérdida del 50% de la señal. En los
DNA-chips para interrogar todas las bases de una
secuencia de "n" nucleótidos ("oligonucleótido") de
longitud en ambas hebras es necesario un mínimo de "2n"
oligonucleótidos que solapan con el oligonucleótido anterior en toda
la secuencia salvo en un nucleótido. Este diseño de los
oligonucleótidos recuerda a los orígenes de los
DNA-chips en membranas de nylon pero, en este caso,
el tamaño de los oligonucleótidos es de 25 nucleótidos y no de 8
nucleótidos. El elevado número de oligonucleótidos empleados para
reconstruir la secuencia hace que los errores derivados de la
fluctuación en la señal de hibridación que se producen en la
estrategia de ganancia de señal se minimicen. Por el contrario, el
cambio exacto en la secuencia no se puede identificar con esta
metodología; es necesario secuenciar posteriormente para conocer
la
mutación.
mutación.
La segunda estrategia para la detección de
variaciones génicas mediante el empleo de DNA-chips
de genotipado, consistente en la amplificación o extensión sobre el
propio DNA-chip, se aborda con tres
aproximaciones:
- "Minisequencing": Un cebador específico
de la mutación es inmovilizado en el portaobjetos y, después de una
reacción de extensión con didesoxinucleótidos fluorescentes, se
captura la imagen del DNA-chip con un escáner.
- "Primer extensión": Se inmovilizan dos
oligonucleótidos por mutación y la reacción de extensión se lleva a
cabo con un nucleótido fluorescente y los demás naturales siendo el
material de partida RNA o el producto de una PCR.
- "Tag arrays". La reacción de extensión se
lleva a cabo en solución con cebadores específicos que llevan una
determinada secuencia o "tag" en 5'. El uso de
DNA-chips con oligonucleótidos complementarios a
esas secuencias o "tags" permite la captura de los productos
resultantes de la extensión. Ejemplos ilustrativos de esta
aproximación incluyen el DNA-chip de alta densidad
"Gene-Flex" (Affymetrix), aunque también
existen DNA-chips de baja densidad.
A la hora del diseño de herramientas para el
diagnóstico genético, la sencillez experimental debe ser tenida muy
en cuenta. Se debe analizar, por tanto, la complejidad técnica que
supone para el usuario final el análisis de
DNA-chips basados en hibridación diferencial frente
a los basados en la metodología de extensión. La necesidad de un
mayor número de reacciones de amplificación y purificación supone
una desventaja de la estrategia basada en técnicas de extensión o
amplificación frente a la estrategia basada en la hibridación.
Sin embargo, en lo relativo a la especificidad y
sensibilidad de los DNA-chips, la hibridación
diferencial no consigue los valores tan altos asociados con la
amplificación sobre el portaobjetos de vidrio. Es por ello necesario
el desarrollo de algoritmos matemáticos que aumenten la
especificidad y sensibilidad de la estrategia basada en el empleo
de la metodología de hibridación (Cutler DJ, Zwick ME, Carrasquillo
MN, Yohn CT, Tobi KP, Kashuk C, Mathews DJ, Shah N, Eichler EE,
Warrington JA, Chakravarti A. Genome Research;
11:1913-1925 (2001). Dentro de esta tecnología y de
los DNA-chips de baja densidad, la elección es sin
duda el uso de oligonucleótidos diferentes para detectar al alelo
normal y al mutante ("aumento de la señal de
hibridación").
La inutilidad de los DNA-chips
existentes en la actualidad para detectar simultáneamente la
presencia o ausencia de un número elevado de variaciones génicas,
de manera sensible, específica y reproducible, ha impedido su
aplicación como herramientas de uso rutinario para el diagnóstico
clínico de enfermedades humanas. Los inventores han desarrollado un
método secuencial de procesamiento e interpretación de los datos
experimentales generados por DNA-chips de genotipado
basado en el aumento de la señal de hibridación (algoritmo). Este
método se basa en un novedoso diseño experimental, que asegura unos
altos niveles de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de
los resultados, que permiten que los DNA-chips
desarrollados en base a este método, puedan ser utilizados, por
ejemplo, como herramientas fiables de diagnóstico genético
clínico.
Los autores de la presente invención han
desarrollado un método de detección simultánea, sensible,
específica y reproducible de variaciones génicas y su empleo para
el desarrollo de productos para genotipado. Dicho método se basa en
la combinación de un novedoso diseño experimental de
DNA-chips de genotipado y en el desarrollo de un
sistema secuencial de procesamiento e interpretación de los datos
experimentales generados por dichos DNA-chips de
genotipado basado en el aumento de la señal de hibridación
(algoritmo), lo que garantiza unos altos niveles de especificidad,
sensibilidad y reproducibilidad de los resultados, que permiten que
dichos DNA-chips puedan ser utilizados, por ejemplo,
como herramientas fiables de diagnóstico genético clínico.
Con el fin de facilitar la comprensión de la
presente invención, a continuación se incluye la definición de
algunos términos:
El término "polimorfismo" se refiere a una
variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico donde
cada secuencia posible está presente en una proporción igual o
superior a un 1% en una población; en un caso particular, cuando
dicha variación es la secuencia nucleotídica ocurre en un sólo
nucleótido (A, C, T o G) se denomina SNP.
El término "mutación génica" se refiere a
una variación en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico
donde cada secuencia posible está presente en una proporción
inferior al 1% en una población.
Los términos "variante alélica" o
"alelo" se usan indistintamente en la presente descripción y
se refieren a un polimorfismo que ocurre en un mismo locus en una
misma población.
El término "variación génica" o "variante
génica", tal y como se utiliza en la presente descripción,
incluye a las mutaciones, polimorfismos y variantes alélicas. Una
variación o variante génica se encuentra entre individuos dentro de
las poblaciones y entre las poblaciones dentro de las especies.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un método in vitro, extracorpóreo, para el
genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas
presentes en uno o más genes de un sujeto, en adelante método de la
invención, que comprende:
- -
- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;
- -
- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;
- -
- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y
- -
- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles.
Opcionalmente, tras el proceso de hibridación,
puede llevarse a cabo sobre el propio soporte una reacción de
amplificación, por ejemplo, mediante "primer extensión", o,
alternativamente, una reacción de ligación, por ejemplo, mediante un
ensayo de ligación de oligonucleótidos (Oligonucleotide Ligation
Assay u "OLA"), cuando dicho soporte es una superficie sólida,
tal como un soporte de vidrio, plástico, una membrana, etc. En caso
de seguir alguna de estas alternativas, el marcaje de los productos
que contienen las variaciones génicas a identificar se lleva a cabo
en esta etapa y no durante la reacción de amplificación ni durante
el proceso de fragmentación.
La extracción del ácido nucleico (DNA o RNA) a
partir de una muestra biológica que lo contiene procedente de un
sujeto, tal como un ser humano, se puede llevar a cabo por métodos
convencionales utilizando, opcionalmente, productos comerciales
útiles para extraer dicho ácido nucleico. Prácticamente cualquier
muestra biológica que contiene ácido nucleico puede ser utilizada
para la puesta en práctica de la invención; a modo ilustrativo, no
limitativo, dicha muestra biológica puede ser una muestra de
sangre, plasma, suero, secreciones, tejido, etc.
En una realización particular, el ácido nucleico
a extraer es DNA. En otra realización particular, el ácido nucleico
a extraer es RNA, típicamente, RNA total; esta última alternativa
puede ser utilizada en caso de que la variación génica a estudiar
esté situada en la secuencia codificante de un gen; en este caso, el
método de la invención incluye una etapa de obtención del cDNA
correspondiente. La obtención de dicho cDNA se lleva a cabo por
métodos convencionales, por ejemplo, mediante retrotranscripción
utilizando los cebadores apropiados el RNA y como molde para la
retrotranscripción.
Las etapas posteriores del método de la
invención se llevan a cabo sobre el DNA extraído o sobre el cDNA
correspondiente al RNA extraído. El término DNA, tal como se
utiliza de aquí en adelante incluye tanto DNA como cDNA.
Las regiones de DNA que contienen las
variaciones génicas a identificar (regiones DNA diana) se someten a
una reacción de amplificación para obtener unos productos de
amplificación que contienen las variaciones génicas a identificar.
Aunque puede utilizarse cualquier técnica o método que permita la
amplificación de todas las secuencias de DNA que contienen las
variaciones génicas a identificar, en una realización particular,
dichas secuencias se amplifican mediante una PCR multiplex. Para la
realización de una PCR multiplex se requiere el empleo de unos pares
de oligonucleótidos cebadores o iniciadores capaces de amplificar
dichas regiones DNA diana que contienen las variaciones génicas a
identificar. Prácticamente puede utilizarse cualquier par de
oligonucleótidos cebadores que permita la amplificación específica
de dichas regiones DNA diana, preferentemente, pares de
oligonucleótidos cebadores que permitan dicha amplificación en el
menor número posible de reacciones PCR. De este modo, utilizando
los pares de oligonucleótidos cebadores y las condiciones
apropiadas, se pueden amplificar todas las regiones DNA diana
necesarias para el genotipado de las variaciones génicas a analizar
en el DNA-chip con el mínimo número posible
de
reacciones.
reacciones.
Opcionalmente, si se desea, durante la reacción
de amplificación, puede llevarse a cabo el marcaje de los productos
de amplificación con el fin de poder detectar posteriormente la
hibridación entre las sondas inmovilizadas en el soporte y los
fragmentos de DNA diana que contienen las variaciones génicas a
detectar. El marcaje de los productos de amplificación puede
realizarse por métodos convencionales, por ejemplo, incorporando un
nucleótido marcado durante la reacción de amplificación o bien
utilizando cebadores marcados. Dicho marcaje puede ser directo,
para lo cual pueden utilizarse fluoróforos, por ejemplo, Cy3, Cy5,
fluoresceína, alexa, etc., enzimas, por ejemplo, fosfatasa
alcalina, peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, por ejemplo,
^{33}P, ^{125}I, etc., o cualquier otro marcador conocido por el
experto en la materia. Alternativamente, dicho marcaje puede ser
indirecto mediante el empleo de métodos químicos, enzimáticos,
etc.; a modo ilustrativo, el producto de amplificación puede
incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo,
avidina o estreptavidina conjugada con un fluorocromo (marcador), y
la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por
ejemplo, biotina (indicador), efectuándose la lectura mediante
fluorimetría, etc., o bien, el producto de amplificación puede
incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, un
anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con una
enzima (marcador), y la sonda se une al otro miembro del par de
unión específica, por ejemplo, digoxigenina (indicador), etc.,
transformándose el sustrato de la enzima en un producto luminiscente
o fluorescente y, efectuándose la lectura mediante
quimio-luminiscencia, fluorimetría, etc.
En una realización particular, el marcaje del
producto de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de un
nucleótido marcado directa o indirectamente con uno o más
fluoróforos. En otra realización particular, el marcaje del producto
de amplificación se lleva a cabo mediante el empleo de cebadores
marcados directa o indirectamente con uno o más fluoróforos.
Los productos de amplificación, opcionalmente
marcados, se someten posteriormente a una reacción de fragmentación
con el fin de aumentar la eficiencia de la hibridación posterior,
obteniéndose de este modo unos productos de fragmentación que
contienen las variaciones génicas a identificar. La fragmentación de
los productos de amplificación puede llevarse a cabo por cualquier
método convencional, por ejemplo, poniendo en contacto los
productos de amplificación con una Dnasa.
En caso de que los productos de amplificación no
hubieran sido marcados previamente durante la reacción de
amplificación, y en caso de que, tras el proceso de hibridación, no
se lleve a cabo una reacción de amplificación o ligación
directamente en el soporte, los productos resultantes de la
reacción de fragmentación (productos de fragmentación) se someten a
un marcaje bien directo utilizando, por ejemplo, fluoróforos,
enzimas, isótopos radiactivos, etc. o bien indirecto utilizando, por
ejemplo, pares de unión específica que incorporan fluoróforos,
enzimas, etc., mediante métodos convencionales. En una realización
particular, los productos de amplificación no han sido marcados
previamente durante la reacción de amplificación, y los productos de
fragmentación se someten a un marcaje directo o indirecto con uno o
varios marcadores, por ejemplo, uno o varios fluoróforos, aunque
pueden utilizarse otros marcadores conocidos por los expertos en la
materia.
A continuación, los productos de fragmentación
se ponen en contacto con las sondas capaces de detectar las
variaciones génicas correspondientes bajo condiciones que permiten
la hibridación entre dichos productos de fragmentación y dichas
sondas. Dichas sondas están depositadas en un soporte sólido
siguiendo una disposición predeterminada, constituyendo un
DNA-chip (DNA-chip de la invención),
cuyo diseño y desarrollo debe cumplir una serie de requisitos para
poder ser utilizado en el método de la invención en cuanto al
diseño de las sondas, el número de sondas a depositar por variación
génica a detectar, el número de réplicas de sondas a depositar, la
distribución de las sondas sobre el soporte, etc. Las
características propias de dicho DNA-chip de la
invención se describen detalladamente más adelante.
La hibridación de los productos de fragmentación
con las sondas capaces de detectar las variaciones génicas
correspondientes depositadas en un soporte (DNA-chip
de la invención) se lleva a cabo por métodos convencionales
utilizando dispositivos convencionales. En una realización
particular, la hibridación se lleva a cabo en una estación
automática de hibridación. Para llevar a cabo la hibridación, los
productos de fragmentación se ponen en contacto con dichas sondas
(DNA-chip de la invención) bajo condiciones que
permiten la hibridación entre dichos productos de fragmentación y
dichas sondas. Unas condiciones de hibridación estables permiten
establecer la hebra y la longitud apropiada de las sondas con el fin
de maximizar la discriminación, tal como se menciona más
adelante.
adelante.
Como se ha mencionado previamente, si se desea,
cuando dicho soporte es un soporte sólido, tras el proceso de
hibridación, se puede llevar a cabo una reacción de amplificación,
por ejemplo, mediante "primer extensión", o, alternativamente,
una reacción de ligación, por ejemplo, mediante un ensayo de
ligación de oligonucleótidos (OLA), al mismo tiempo que se realiza
el marcaje de los oligonucleótidos depositados en el soporte. El
marcaje de dichos oligonucleótidos puede ser un marcaje directo
utilizando, por ejemplo, fluoróforos, enzimas, isótopos radiactivos,
etc. o indirecto utilizando, por ejemplo, pares de unión específica
que incorporan fluoróforos, enzimas, etc., mediante métodos
convencionales, tal como se ha mencionado previamente en relación
con el marcaje de los productos de amplificación o de
fragmentación.
En caso de que se desee llevar a cabo una
reacción de amplificación post-hibridación
utilizando, por ejemplo, la metodología "primer extensión",
tras la hibridación, se lleva a cabo una reacción de extensión
(amplificación) de los oligonucleótidos hibridados sobre el soporte
(portaobjetos de cristal). La extensión, con nucleótidos marcados o
a través de un marcaje indirecto, sólo se producirá si el extremo 3'
del oligonucleótido hibrida perfectamente con el producto de
amplificación.
Asimismo, en caso de que se desee realizar una
reacción de ligación post-hibridación utilizando,
por ejemplo, la metodología "OLA", tras la hibridación, se
lleva a cabo una reacción de ligación de los oligonucleótidos
hibridados sobre el soporte (portaobjetos de cristal) con los
oligonucleótidos marcados diseñados para hibridar de forma
adyacente. La ligación sólo se producirá si el extremo 3' de la
sonda depositada sobre el soporte hibrida perfectamente con el
producto de amplificación.
Finalizado el proceso de hibridación, o, en su
caso, dichas reacciones de amplificación o ligación
post-hibridación, se procede a la captura de la
imagen y a su cuantificación. Para ello, la imagen del
DNA-chip hibridado y revelado es recogida con un
dispositivo apropiado, por ejemplo, un escáner, procediéndose, a
continuación, a cuantificar los valores absolutos de fluorescencia
de cada sonda así como del ruido de fondo. Por tanto, en una
realización particular, tras la hibridación, o tras las reacciones
de amplificación o ligación post-hibridación, el
DNA-chip hibridado y revelado se introduce en un
escáner donde es sometido a un escaneado para cuantificar la
intensidad del marcaje en los puntos donde se ha producido la
hibridación. Aunque prácticamente cualquier escáner puede ser
utilizado, en una realización particular, dicho escáner es un
escáner de fluorescencia confocal. En este caso, el
DNA-chip se introduce en el escáner y se escanea la
señal emitida por el marcaje al ser excitado por un láser,
cuantificándose la intensidad de los puntos en donde se ha producido
la hibridación. En una realización particular, dicho escáner es un
escáner de luz blanca. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
escáneres que pueden ser utilizados según la presente invención son
escáneres de Axon, Agilent, Perkin Elmer, etc.
A continuación se procede al análisis de los
datos y a su interpretación, lo que se lleva a cabo mediante el
empleo del software de genotipado y algoritmo desarrollado por los
inventores.
El análisis de los datos y su interpretación se
lleva cabo, en general, mediante el empleo de programas
informáticos (software); sin embargo, no todos los programas son
apropiados requiréndose programas que mejoren la calidad de la
información obtenida. Los inventores han desarrollado un método
secuencial de procesamiento e interpretación de los datos
experimentales generados por los DNA-chips de la
invención que permite detectar cada una de las variaciones génicas
con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que
permiten la aplicación clínica del método de la invención, en base
a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada
uno de los tres genotipos posibles, tal como se describe a
continuación. El algoritmo y software informático desarrollado por
los inventores permite facilitar y automatizar la aplicación del
método de la invención.
La ejecución del algoritmo y software
informático desarrollado por los inventores para procesar
secuencialmente e interpretar los datos experimentales generados
por los DNA-chips de la invención comprende la
realización de serie de etapas para caracterizar cada uno de las
variaciones génicas de interés, concretamente:
- -
- en primer lugar, a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas se les resta su propio ruido de fondo;
- -
- a continuación, se agrupan las réplicas correspondientes a cada una de las 4 sondas utilizadas para caracterizar cada variación génica;
- -
- el valor medio de intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes;
- -
- conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las sondas, se calcula el ratio 1 y el ratio 2, en donde
- Ratio 1 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 2 que detecta la variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Ratio 1 =
\frac{Intensidad \ media \ sonda \ 1}{Intensidad \ media \ sonda \
1 \ + \ Intensidad \ media \ sonda \
2}
- Ratio 2 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 4 que detecta la variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Ratio 2 =
\frac{Intensidad \ media \ sonda \ 3}{Intensidad \ media \ sonda \
3+ \ Intensidad \ media \ sonda \
4}
- -
- dichos ratios (ratio 1 y ratio 2) se sustituyen en tres funciones lineales, que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles:
- AA
- Función 1
- AB
- Función 2
- BB
- Función 3
- en donde
- AA representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica A;
- AB representa el genotipo de un sujeto heterocigoto para las variaciones génicas A y B;
- BB representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica B;
- Función 1 es la Función Lineal que caracteriza a los pacientes con el genotipo AA y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- Función 2 es la Función Lineal para el genotipo AB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- Función 3 es la Función Lineal para el genotipo BB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- en donde las combinaciones lineales están formadas por constantes y cofactores que acompañan a las variables ratio 1 y ratio 2; y
- -
- la función que presente un valor absoluto mayor determina el genotipo que presenta el paciente para la variación génica analizada.
Las tres funciones lineales que caracterizan a
cada uno de los tres genotipos se corresponden con las tres
combinaciones lineales de los ratios 1 y 2 que maximizan la
discriminación entre un grupo de sujetos homocigotos AA,
heterocigotos AB y homocigotos BB mediante el cálculo de sus
correspondientes ratios 1 y 2. El número mínimo de sujetos para
calcular unas funciones fiables es 5. Por tanto, en una realización
particular, la obtención de dichas funciones se lleva a cabo
mediante el análisis de un mínimo de 5 pacientes por cada uno de
los tres posibles genotipos de la variación génica (AA, AB, BB).
Con los resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 15
pacientes. Estos ratios sirven como variables de clasificación de
los tres grupos para generar las funciones lineales. Con estas tres
funciones lineales se evalúa la capacidad discriminatoria de las
dos parejas de sondas diseñadas. En caso de que la capacidad de
discriminación no sea del 100%, las sondas serían rediseñadas.
Nuevos pacientes caracterizados para cada uno de los tres genotipos
constituyen nuevos ratios 1 y 2 para perfeccionar las combinaciones
lineales de los mismos que constituyen las funciones lineales y, en
definitiva, mejorar la capacidad discriminatoria del algoritmo
basado en estas tres funciones.
En una realización particular en la que el
escáner utilizado es un escáner de fluorescencia confocal, siempre
que (i) los ratios 1 y 2 se encuentren dentro del rango de los
ratios usados para construir las funciones lineales, (ii) la
intensidad de fluorescencia media de las 4n réplicas (dónde
"n" es el número de réplicas de cada sonda, es decir 6, 8 ó
10), por ejemplo, 40 réplicas con respecto al ruido de fondo sea
mayor de 5 y (iii) el coeficiente de variación de las réplicas esté
por debajo de 0,25, el resultado clasificatorio de las funciones
lineales se considera correcto. Las 3 funciones lineales para cada
genotipo se construyen a partir de los 15 ratios 1 y 15 ratios 2
obtenidos del análisis con el DNA-chip de 5
pacientes (en una realización particular) por genotipo (5 AA, 5 AB
y 5 BB); al analizar un nuevo paciente, se calcularán los ratios 1
y 2 y se sustituirán dichos ratios en las funciones; la función de
mayor valor absoluto determina el genotipo. Además, los ratios 1 y
2 del nuevo paciente, por ejemplo AA, deben estar incluidos en los
5 ratios 1 y 2 que permitieron construir la función lineal que
determina el grupo AA (se trata, pues, de una doble
comprobación).
Asimismo, cuando se utiliza un escáner de
fluorescencia confocal, para dar por buena una hibridación completa
es necesario que (a) la relación intensidad frente a ruido de fondo
de todas las sondas del DNA-chip esté por encima de
15; (b) la media de todos los ratios debe superar 0,6 como control
de especificidad y sensibilidad; (c) el coeficiente de variación de
todas las réplicas debe ser inferior a 0,25; (d) el ratio del
control externo debe estar por encima de 0,6 y (e) el control
negativo nunca debe ser superior a 3 veces el ruido de fondo. Todas
las condiciones (a)-(e) deben ser cumplidas simultáneamente para
dar por buena la hibridación completa utilizando un escáner de
fluorescencia confocal.
Por tanto, según la invención, el genotipado de
cada una de las variaciones génicas se lleva a cabo a partir de la
media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada
una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación génica,
en la que se eliminan los valores extremos ("outliers"); en una
realización particular, dichos valores extremos eliminados
constituyen entre el 10% y el 50% de los valores obtenidos.
Asimismo, el algoritmo desarrollado por los inventores para el
genotipado de cada una de dichas variaciones génicas sujetas a
estudio permite detectar cada una de las variaciones génicas en
base a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a
cada uno de los tres genotipos posibles (AA, AB y BB). Dicho
algoritmo comprende una secuencia con los siguientes pasos:
utilización de 4 sondas replicadas 6, 8 ó 10 veces; cálculo de la
media acotada para calcular la intensidad media de las réplicas;
cálculo de los ratios 1 y 2 correspondientes a las 2 parejas de
sondas (para la detección de las variaciones génicas A y B);
sustitución de los ratios 1 y 2 obtenidos en las ecuaciones
lineales obtenidas a partir de los ratios 1 y 2 que discriminaron
los "n" pacientes control con genotipo AA, los "n"
pacientes control con genotipo AB y los "n" pacientes control
con genotipo BB de cada variación génica (en una realización
particular "n" es 5); y determinar el genotipo de cada paciente
para cada variación génica incluida en el DNA-chip
en base al mayor valor absoluto. Por último se comprueba que los
ratios se corresponden con los ratios de los "n" pacientes
control que determinan cada genotipo. Se han probado otros análisis
como por ejemplo, no usar réplicas, no calcular la media acotada,
agrupar las réplicas, etc. y se ha observado que no funciona, tener
en cuenta sólo los ratios hace que el análisis informático sea más
lento, sin embargo, las funciones agilizan el análisis y permiten
discriminar más y mejor.
El método de la invención constituye, por tanto,
un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado
simultáneo, sensible, específico y reproducible de múltiples
variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un
sujeto. El método de la invención permite identificar cambios de
nucleótidos, inserciones, duplicaciones, deleciones, etc. y
determinar el genotipo de un sujeto para una variación génica
dada.
Para la puesta en práctica del método de la
invención se han desarrollado unos DNA-chips de
genotipado útiles para detectar variaciones génicas, cuyas
características se mencionan más adelante.
\vskip1.000000\baselineskip
La utilización clínica del método de la
invención en la detección de variaciones génicas humanas asociadas
a enfermedades o a antígenos de interés requiere la validación
previa de los DNA-chips de genotipado utilizados en
la puesta en práctica del método de la invención, los cuales
presentan un diseño característico.
En general, un DNA-chip de
genotipado adecuado para la puesta en práctica del método de la
invención, en adelante DNA-chip de la invención,
comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad
de sondas útiles para detectar variaciones génicas humanas
presentes en uno o más genes, en donde, por cada variación génica,
hay 4 sondas, de las cuales 2 sondas detectan una primera variación
génica y las otras 2 detectan una segunda variación génica, en donde
el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6
réplicas y las dos sondas no tienen porqué ser iguales. Dichas
sondas están depositadas siguiendo un patrón determinado y
distribuidas homogéneamente entre las 2 áreas que constituyen el
DNA-chip pero no agrupadas por variación génica a
detectar, es decir, que están distribuidas a lo largo y ancho del
chip y además no agrupadas dentro de una misma variación
génica.
El DNA-chip de la invención
también puede contener, si se desea, unos oligonucléotidos
depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y
negativos de las reacciones de amplificación y/o hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de disminuir al máximo la tasa de
falsos positivos y negativos se diseñan dos parejas de sondas para
detectar cada variación génica. Cada pareja de sondas está
constituida por una sonda específica para la detección de una
variación génica (e.g., el alelo normal) y por otra sonda diseñada
para la detección de otra variación génica (e.g., el alelo
mutante). En el caso de mutaciones puntuales, la base que difiere
entre el alelo normal y el mutante (base a interrogar) se coloca en
la posición central de la sonda, lo que asegura la máxima
especificidad en la hibridación. En el caso de inserciones,
duplicaciones o deleciones son varias las bases que se pueden
interrogar. Sin embargo, el diseño se hace completamente equivalente
considerando como posición central el primer nucleótido que es
diferente en la secuencia normal con respecto a la secuencia
mutada.
La capacidad de las sondas específicas de
variaciones génicas para discriminar entre las variaciones génicas
(e.g., el alelo normal y el alelo mutante) depende de las
condiciones de hibridación, de la secuencia que flanquea a la
mutación y de la estructura secundaria de la secuencia en la que se
quiere detectar la mutación. Unas condiciones de hibridación
estables permiten establecer la hebra y la longitud apropiada de
las sondas con el fin de maximizar la discriminación. Partiendo de
sondas de 25 nucleótidos que detectan una variación génica (e.g., el
alelo normal) y otra variación génica (e.g., el alelo mutante) en
ambas hebras (hebra sentido y hebra antisentido), se requiere, en
general, una media de 8 sondas ensayadas experimentalmente para
quedarse con las dos parejas definitivas.
En una realización particular, para cada
variación génica a detectar mediante el DNA-chip de
la invención, las sondas diseñadas interrogan ambas hebras, con
longitudes típicamente comprendidas entre 19 y 27 nucleótidos, y la
temperatura de hibridación varía entre 75ºC y 85ºC.
En caso de que el método de la invención incluye
el empleo de la metodología "primer extensión" u "OLA",
se diseñan igualmente 4 sondas, 2 de dichas sondas detectan una
variación génica (e.g., el alelo normal) y las otras 2 sondas
detectan la otra variación génica (e.g., el alelo mutante). En este
caso, la base interrogada no se coloca en la posición central sino
en la posición 3' de la sonda. En el caso de la metodología
"OLA", se diseñan unos oligonucleótidos marcados directa o
indirectamente que hibridan a continuación de las sondas depositadas
en el soporte sólido para permitir la reacción de ligación.
Dado que el método de la invención puede ser
utilizado para la detección de variaciones génicas humanos
asociados a enfermedades o antígenos de interés, la naturaleza de
las sondas presentes en el DNA-chip de la invención
puede variar dentro de un amplio intervalo ya que, en cada caso, se
pueden seleccionar las sondas adecuadas para las variaciones
génicas que se desean detectar; Por ejemplo, dichas sondas pueden
ser unas sondas útiles para la detección de variaciones génicas
asociadas a diversas enfermedades, tales como la enfermedad
inflamatoria intestinal (IBD), así como para la detección de
variaciones génicas asociadas a determinados antígenos
eritrocitarios humanos y a reacciones adversas a fármacos. En las
Tablas 1-3 se incluye una relación de variaciones
génicas asociadas a IBD, a antígenos eritrocitarios humanos y a
reacciones adversas a fármacos, respectivamente; no obstante, se
pueden ir incorporando en los DNA-chips de la
invención sondas que permitan la identificación de otras
variaciones génicas asociadas con dichas enfermedades o con el
reconocimiento de antígenos de interés a medida que se vayan
identificando.
identificando.
Según la invención, se usan 4 sondas (es decir,
2 parejas de sondas) por cada variación génica a detectar que se
depositan sobre el soporte sólido siguiendo un patrón determinado
de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no
agrupadas por variación génica a caracterizar. Dos de dichas sondas
detectan una variación génica (e.g., el alelo normal) y las otras
dos sondas detectan otra variación génica (e.g., el alelo mutante).
El número de réplicas de cada una de dichas sondas en el
DNA-chip de la invención es de 10, 8 ó 6 réplicas.
En una realización particular, el DNA-chip de la
invención comprende 10 réplicas de cada una de las 4 sondas
utilizadas para detectar cada variación génica; en otra realización
particular, el DNA- chip de la invención comprende 8 réplicas de
cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación
génica; y, en otra realización particular, el
DNA-chip de la invención comprende 6 réplicas de
cada una de las 4 sondas utilizadas para detectar cada variación
génica.
La disposición (colocación) de las sondas en el
soporte está predeterminada. En una realización particular, las
sondas depositadas en el soporte, aunque mantienen una disposición
predeterminada, no están agrupadas por variación génica sino que
tienen una distribución al azar, la cual, si se desea, puede ser
siempre la misma.
El DNA-chip de la invención
también puede contener, si se desea, unos oligonucléotidos
depositados sobre el soporte útiles como controles positivos y
negativos de las reacciones de amplificación y/o hibridación.
En una realización particular, el
DNA-chip de la invención comprende unos
oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles
positivos y negativos de las reacciones de hibridación. En general,
cada uno de los sub-arrays, típicamente 16, que
constituyen un DNA-chip, está flanqueado por unos
controles externos de hibridación que permiten localizar fácilmente
los puntos sobre el soporte. Aunque con la misma secuencia, el
DNA-chip dispone de dos controles externos de
hibridación marcados, por ejemplo, con un fluoróforo (e.g., Cy3,
Cy5, etc.), que sirven para evaluar la calidad de la hibridación en
ambos canales. En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos del control externo es la siguiente (5'->3'):
- CEH:
- GTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGAGTCGTCAAGATGCTACCGTTCAGGA
\vskip1.000000\baselineskip
y las secuencias de los oligonucleótidos para su
detección son las siguientes:
- ON1:
- CTTGACGACTCCTGAACGG
- ON2:
- CTTGACGACACCTGAACGG
\vskip1.000000\baselineskip
El soporte sobre el que están depositadas la
pluralidad de sondas puede ser cualquier superficie sólida sobre la
que se puedan unir oligonucleótidos. Prácticamente cualquier
soporte sobre el que pueda unirse o inmovilizarse un
oligonucleótido, utilizado en la producción de
DNA-chips, puede ser utilizado para la puesta en
práctica de esta invención. A modo ilustrativo, dicho soporte puede
ser un soporte no poroso, por ejemplo, un soporte de cristal,
silicio, plástico, etc., o bien un soporte poroso, por ejemplo,
membranas (naylon, nitrocelulosa, etc.), micropartículas, etc. En
una realización particular, dicho soporte es un portaobjetos
(porta) de cristal.
Las sondas se inmovilizan (unen) sobre el
soporte utilizando técnicas convencionales de inmovilización de
oligonucleótidos sobre la superficie de los soportes. Dichas
técnicas dependen, entre otros factores, de la naturaleza del
soporte utilizado [porosa (membranas, micropartículas, etc.) o no
porosa (cristal, plástico, silicio, etc.)]. En general, las sondas
pueden inmovilizarse sobre el soporte mediante el empleo de
técnicas de inmovilización no covalentes o bien mediante el empleo
de técnicas de inmovilización basadas en la unión covalente de las
sondas a la superficie del soporte mediante procedimientos
químicos.
La preparación de soportes no porosos (e.g.,
cristal, silicio, plástico, etc.) requiere, en general, un
tratamiento previo con grupos reactivos (e.g., amino, aldehído,
etc.) o bien recubrir la superficie del soporte con un miembro de un
par de unión específica (e.g., avidina, estreptavidina, etc.).
Asimismo, en general, resulta conveniente activar previamente las
sondas a inmovilizar mediante grupos tiol, amino, etc., o biotina,
etc., con el fin de conseguir una inmovilización específica de las
sondas sobre el soporte.
La inmovilización de las sondas en el soporte
puede llevarse a cabo por métodos convencionales, por ejemplo,
mediante técnicas basadas en la síntesis in situ de las
sondas sobre el propio soporte (e.g., fotolitografía, síntesis
química directa, etc.), o mediante técnicas basadas en el empleo de
brazos robotizados que depositan la sonda correspondiente
presintetizada (impresión sin contacto, impresión por contacto,
etc.), etc..
La disposición (colocación) de las sondas en el
soporte está predeterminada. En una realización particular, las
sondas depositadas en el soporte sólido, aunque mantienen una
disposición predeterminada, no están agrupadas por variación génica
sino que tienen una distribución al azar, la cual, si se desea,
puede ser siempre la misma.
En una realización particular, el soporte es un
portaobjetos de cristal, y, en este caso, las sondas, en el número
de réplicas establecido (6, 8 ó 10), se imprimen en portas de
cristal previamente tratados, por ejemplo, aminosilanizados, usando
un equipo de producción automática de DNA-chips por
deposición de los oligonucleótidos en el portaobjetos de cristal
("microarrayer") bajo condiciones apropiadas, por ejemplo,
mediante entrecruzamiento con radiación ultravioleta y horneado
(80ºC), manteniendo controlada la humedad y temperatura durante el
proceso de deposición, típicamente entre 40-50% de
humedad relativa y 20ºC de temperatura.
Las réplicas (sondas) se distribuyen en las
placas de impresión, que contienen los oligonucleótidos en
solución, de forma que las impriman un número de puntas distintas
igual a la mitad de las réplicas. Las réplicas se distribuyen
homogéneamente entre las áreas o sectores
(sub-arrays) que constituyen el
DNA-chip. El número de réplicas así como su
homogénea distribución a lo largo y ancho del
DNA-chip minimizan la variabilidad experimental
proveniente de los procesos de impresión e hibridación. Asimismo,
se imprimen controles positivos y negativos de hibridación. En
general, cada uno de los sub-arrays que constituyen
el DNA-chip está flanqueado por unos controles
externos de hibridación que permiten localizar fácilmente los puntos
sobre el soporte. Aunque con la misma secuencia, el
DNA-chip dispone de dos controles externos de
hibridación marcados, por ejemplo, con un fluoróforo (e.g., Cy3,
Cy5, etc.), que sirven para evaluar la calidad de la hibridación en
ambos canales. En una realización particular, la secuencia de
nucleótidos del control externo es la identificada previamente como
"CEH" y las secuencias de los oligonucleótidos para su
detección son las identificadas previamente como ON1 y ON2.
Para controlar la calidad del proceso de
fabricación del DNA-chip en términos de señal de
hibridación, ruido de fondo, especificidad, sensibilidad,
reproducibilidad de cada réplica (coeficiente de variación) así
como del tamaño y forma de los puntos impresos (sondas) se puede
utilizar un DNA comercial. A modo ilustrativo, como control de
calidad de la impresión de los DNA-chips de la
invención, se lleva a cabo la hibridación con un DNA comercial
(e.g., k562 DNA High Molecular Weight, Promega) de uno de cada un
número determinado de soportes cargados con las sondas, por
ejemplo, cada 20 soportes impresos. En primer lugar, se analiza la
forma y tamaño de los puntos impresos. En esta hibridación se
controlan los mismos parámetros que se han explicado previamente
para aceptar un genotipado con el DNA-chip de la
invención en cuanto a la relación entre la intensidad y el ruido de
fondo del DNA-chip, especificidad - sensibilidad
media y reproducibilidad de las réplicas (coeficiente de
variación). Asimismo se comprueba el correcto genotipado de ese DNA
control.
Los DNA-chips de la invención
pueden ser utilizados, en combinación con el método de la
invención, para detectar prácticamente cualquier variación génica
humana de interés, por ejemplo, variaciones génicas humanas
asociadas a enfermedades o antígenos de interés, tales como
variaciones génicas humanas asociadas a IBD, variaciones génicas
asociadas a antígenos eritrocitarios, o variaciones génicas
asociadas a reacciones adversas a fármacos, para lo cual se
utilizarán las sondas adecuadas para las variaciones génicas que se
desean detectar. Una ventaja de los DNA-chips de la
invención radica en que pueden incorporar sondas que permitan la
identificación de otras variaciones génicas asociadas con dichas
enfermedades o con el reconocimiento de antígenos de interés a
medida que se vayan identificando tales variaciones génicas; para
ello, se deberán diseñar las sondas y los DNA-chips
de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, tal como se
ha mencionado previamente.
Los inventores han diseñado, producido y
validado la utilización clínica del método de la invención en la
detección de variaciones génicas asociadas a IBD, así como en la
detección de variaciones génicas asociadas a determinados antígenos
eritrocitarios humanos y a reacciones adversas a fármacos mediante
el desarrollo (diseño y producción) de los
DNA-chips correspondientes.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas asociadas a IBD que pueden ser identificados se
recogen en la Tabla 1; no obstante, la relación de variaciones
génicas contenida en dicha tabla puede incrementarse con otras
variaciones génicas que vayan identificándose posteriormente y que
estén asociadas a IBD;
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas asociadas a antígenos eritrocitarios que pueden
ser identificados se recogen en la Tabla 2; no obstante, la
relación de variaciones génicas contenida en dicha tabla puede
incrementarse con otras variaciones génicas que vayan
identificándose posteriormente y que estén asociadas a antígenos
eritrocitarios.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas asociadas a reacciones adversas a fármacos que
pueden ser identificados se recogen en la Tabla 3; no obstante, la
relación de variaciones génicas contenida en dicha tabla puede
incrementarse con otras variaciones génicas que vayan
identificándose posteriormente y que estén asociadas a reacciones
adversas a fármacos.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- el polimorfismo G2677T/A/C Ala893Ser,Thr/Pro del gen Multidrug resistance protein (MDR1);
- \quad
- el polimorfismo C3435T del gen Multidrug resistance protein (MDR1);
- \quad
- los polimorfismos R702W, G908R, 1007insC en el gen CARD15;
- \quad
- el polimorfismo T612C Y113H en el gen Microsomal epoxide hydrolase (EPXH1);
- \quad
- el polimorfismo -(-2518)G/A del gen Monocyte chemotactic protein 1 (MCP1);
- \quad
- los polimorfismos (-1082) G/A y G15R G43A en el gen Interleucina 10 (IL10);
- \quad
- el polimorfismo (-295)T/C en el gen Interleucina 16 (IL16);
- \quad
- el polimorfismo (-843)C/T en el gen Fas ligando;
- \quad
- los polimorfismos 94delATTG y -263A/G en el gen Nuclear factor kappa-B (NFKB1);
- \quad
- polimorfismo en 3'UTR (G/A) del gen Nuclear factor kappa-B inhibitor alpha: (NFKBIA);
- \quad
- el polimorfismo G2964A en el gen Signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6);
- \quad
- el polimorfismo TCA/TCC del codón 35 en el gen Interleucina 18 (IL18);
- \quad
- los polimorfismos E474E, Q476Q, D510D, P588P, -177A/G, A165A, R202Q en el gen Mediterranean fever gene (MEFV);
- \quad
- el polimorfismo 113G/A (R30Q) en el gen Discs, large homolog 5 (DLG5);
- \quad
- el polimorfismo A2033T en el gen Colony stimulating factor receptor 1 (CSFR1);
- \quad
- el polimorfismo 1672C/T (L503F) en el gen Organic cation transporter (OCTN1, SLC22A4);
- \quad
- el polimorfismo (-207G/C) en el gen Organic cation transporter (OCTN2, SLC22A5);
- \quad
- los polimorfismos Asp299Gly y Thr399Ile en el gen Toll-like receptor 4 (TLR4);
- \quad
- los polimorfismos (-511)A/C y 3954 TaqI RFLP en el gen Interleucina 1 beta (IL1\beta);
- \quad
- el polimorfismo Ala16Val en el gen Superoxide dismutase 2 (SOD2);
- \quad
- el polimorfismo Pro12Ala en el gen Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG);
- \quad
- los polimorfismos K469E, R241G en el gen Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM1);
- \quad
- los polimorfismos IGR2060a_1, IGR2198a_1, IGR3096a_1 en el locus IBD5;
- \quad
- el polimorfismo 1267A/G (GIn351 Gln) en el gen Heat shock protein 70 (HSP70-2);
- \quad
- el polimorfismo 1237C/T en el gen Toll-like receptor 9 (TLR9);
- \quad
- el polimorfismo C677T V222A en el gen Methylenetetrahydrofolate reductase (MTFHR);
- \quad
- los polimorfismos (-590)C/T, (-34)C/T en el gen Interleucina 4 (IL4);
- \quad
- los polimorfismos Gly54Asp (A/G), Gly57Glu (A/G), Arg52Cys (C/T) en el gen Mannan-binding lectin (MBL);
- \quad
- el polimorfismo (-6) A/T en el gen Angiotensinogen precursor (AGT);
- \quad
- el polimorfismo 4G/5G en el gen Plasminogen activator inhibitor (PAI);
- \quad
- los polimorfismos (-857C/T), (-308G/A), (-238 G/A) en el gen Tumor necrosis factor alpha (TNF \alpha);
- \quad
- los polimorfismos G238C, G460A, A719G en el gen TPMT;
\newpage
TABLA 1
(continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- los polimorfismos Trp14Gly, Thr24Ala, Met129Val, Lys173Glu, Gly175Ser del gen MICA que discriminan a los alelos MICA*007 y MICA*008;
- \quad
- el polimorfismo de la región promotora (-377 a -222) característico del alelo 7 del gen SLC11A1=NRAMP1;
- \quad
- el polimorfismo (-159)T/C del gen CD14;
- \quad
- el polimorfismo G4985T (Val158Phe) del gen CD16A=FCGR3A;
- \quad
- el polimorfismo -25385C/T del gen NR1I2;
- \quad
- el polimorfismo (T/A) Cys10Stop del gen TUCAN/CARD8/CARDINAL;
- \quad
- el polimorfismo 738T/C Cys224Arg del gen IKBL;
- \quad
- los polimorfismos G593A y T620C del gen TNFRSF1 B=TNFR2;
- \quad
- el polimorfismo Asp643Asn del gen MEKK1;
- \quad
- los polimorfismos 159G/A/C y 282C/T del gen HLA-DQ para la identificación de los alelos DQB1*0401 y DQB1*0402;
- \quad
- los polimorfismos 109T/C, 119T/C/G/A, 122A/C/G/T, 129A/G, 161G/A/T, 175A/T/C/G, 184A/C/delA, 286C/A/T, 305C/G para la identificación de alelos DR2, DR9, DRB1*0103, DR4, DR7, DRB3*0301 y DR3 del gen HLA-DRB1;
- \quad
- los polimorfismos 2018T/C y 2073C/T del gen IL1RN; y
- \quad
- el polimorfismo 3954 C/T (TAQI) del gen ILR1B
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- el polimorfismo GG87_88insG (Genotipo O4) (BC008) en el exón 2 del gen ABO,
- \quad
- el polimorfismo G188A+C189T (Genotipo O1v) (BC012) en el exón 4 del gen ABO,
- \quad
- los polimorfismos 261delG (Genotipo O1/O1v) (BC001), C322T (Genotipo O5) (BC009) en el exón 6 del gen ABO,
- \quad
- los polimorfismos C467T (P156L) (Genotipo A2) (BC014), G542A (Genotipo O8) (BC013), T646A (Genotipo Ax/O1v) (BC015), G703A (Genotipo G235S) (B) (BC002), C796A (Genotipo L266M) (B) (BC003), G802A (Genotipo O2) (BC004), G803C (Genotipo G268A) (B, cisAB-1) (BC005), 798-804insG (Genotipo O3, Ael) (BC007), C893T (Genotipo O6) (BC010), C927A (Genotipo O7) (BC011), 1059-1061delC (D FS354+21aa) (Genotipo A2) (BC006) en el exón 7 del gen ABO,
- \quad
- los polimorfismos C8G (S3C) (Genotipo weak D type 3) (BC040), G48A (W16X) (Genotipo RHD W16X) (BC046), C121T (Q41X) (Genotipo RHD Q41X) (BC047) en el exón 1 del gen RHD,
- \quad
- los polimorfismos A178C, G203A, T307C (exon scanning) (BC016, BC017, BC018), T161C (L54P) (Genotipo DMH) (BC033), G270A (W90X) (Genotipo RHD W90X) (BC047), T329C (L110P) (Genotipo DVII) (BC028) en el exón 2 del gen RHD,
- \quad
- los polimorfismos C340T (Genotipo weak D type 17) (BC043), C410T (Genotipo DIIIiv) (BC059), C446A (A149D) (Genotipo weak D type 5) (BC041), A455C (Genotipo DIIIa, DIIIiv, DIVa) (BC060), IVS3+1G>A (Genotipo alelo negativo) (BC049) en el exón 3 del gen RHD,
- \quad
- los polimorfismos 488del4 (Genotipo alelo negativo) (BC050), A497C (H166P) (Genotipo DFW) (BC030), T509C (M170T) (Genotipo DOL) (BC027), A514T (Genotipo DFRI) (BC065), T544A, G577A, A594T (Genotipo DVI-I weak D type 4) (exon scanning), (BC019, BC020, BC021) en el exón 4 del gen RHD,
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- los polimorfismos G635T (G212V) (Genotipo RHD G212V) (BC051), T667G (Genotipo DIIIa, weak D type 4, Dva, DAR, DOL, DCS) (BC061), G676C (Genotipo DCS, G686A (Genotipo DHR) (BC031), G697C (E233Q), (Genotipo G712A (M238V) (DVII, weak D type 4, DV, DCS) (BC022, BC023), A712G (genotipo alelo negativo) (BC023) en el exón 5 del gen RHD,
- \quad
- los polimorfismos T807G (Genotipo pseudogene) (BC044), T809G (Genotipo weak D type 1) (BC038), G845A (G282D) (Genotipo weak D type 15, DIM) (BC037), C848T (T2831) (Genotipo DHMI) (BC029), G854A (C285Y) (Genotipo DIM) (BC032), G885T (M295I) (Genotipo alelo negativo M295I) (BC053), 906insGGCT (Genotipo alelo negativo) (BC054), G916A, A932G (consenso exon scanningconsenso exon scanning exon scanning) (BC062, BC063), IVS6+ldel4 (Genotipo alelo negativo) (BC055) en el exón 6 del gen RHD, polimorfismos G941T (G314V) (Genotipo alelo negativo) (BC056), C990G (Y330X) (Genotipo alelo negativo) (BC057), G1016A (G339E) (Genotipo weak D type 7) (BC042), T1025C (I342T) (exon scanning) (BC024), G1048C (Genotipo DIVa, DIVb) (BC094), G1057A (G353R) (Genotipo DNU) (BC034), C1061A (A354N) (Genotipo DII) (BC036), G1063A (G355S) (Genotipo DNB) (BC026), T1073C (Genotipo DWI) (BC035) en el exón 7 del gen RHD,
- \quad
- el polimorfismo IV8+1G>A (Genotipo alelo negativo) (BC058) en el exón 8 del gen RHD,
- \quad
- los polimorfismos G1154C (G385A) (Genotipo weak D type 2) (BC039), A1193T (Genotipo DIVb) (BC064), G1227A (K409K) (Genotipo K409K) (BC045) en el exón 9 del gen RHD,
- \quad
- los polimorfismos G106A (A36T) (Genotipo Cx) (BC068), Al22G (Q41R) (Genotipo Cw) (BC067) en el exón 1 del gen RHCE,
- \quad
- el polimorfismo T307C (S103P) (Genotipo Rhc) (BC066) en el exón 2 del gen RHCE,
- \quad
- el polimorfismo C410T (A137V) (BC059) en el exón 3 del gen RHCE,
- \quad
- los polimorfismos C676G (P226A) (Genotipo Ee) (BC025, BC069), C733G (L245V) (Genotipo VS) (BC070) en el exón 5 del gen RHCE,
- \quad
- el polimorfismo G1006T (G336C) (Genotipo VS-/VS+) (BC071) en el exón 7 del gen RHCE,
- \quad
- los polimorfismos A697T (Genotipo Kk) (BC073), C698T (T193M) (Genotipo Kk) (BC072) en el exón 6 del gen KELL,
- \quad
- los polimorfismos T961C (R281W) (Genotipo KpaKpb) (BC074), G962A (R281Q) (Genotipo KpbKpc) (BC075) en el exón 8 del gen KELL,
- \quad
- el polimorfismo G1208A (S363N) (Genotipo Kmod-1) (BC077) en el exón 10 del gen KELL,
- \quad
- el polimorfismo C1910T (L597P) (Genotipo JsaJsb) (BC076) en el exón 17 del gen KELL,
- \quad
- el polimorfismo I5AG>AA (Genotipo Jknull) (BC079) en el exón 6 del gen SLC14A1 (grupo sanguíneo KIDD),
- \quad
- los polimorfismos G838A (D280N) (Genotipo JkaJkb) (BC078), T871C (S291P) (Genotipo Jknull) (BC080) en el exón 9 del gen SLC14A1 (grupo sanguíneo KIDD),
- \quad
- los polimorfismos T-33C (Genotipo FyGATA) (BC082), G125A (D42G) (Genotipo FyaFyb) (BC081), C265T (R89C) (Genotipo Fyx) (BC083) en el gen DARC (grupo sanguíneo DUFFY),
- \quad
- los polimorfismos C59T, G71 A, T72G (S20L, G42E, G42E) (Genotipo MN) (BC084, BC085) en el exón 2 del gen GYPA,
- \quad
- el polimorfismo T143C (M48T) (Genotipo Ss) (BC086) en el exón 4 del gen: GYPB,
- \quad
- los polimorfismos C790A (Genotipo GpMUR Milll) (BC089), C850G (Genotipo GpMUR Milll) (BC090) en el exón 3 del gen GYPE,
- \quad
- los polimorfismos C230T (Genotipo U) (BC087), I5+5GT (Genotipo U) (BC088) en el exón 5 del gen GYPB,
- \quad
- el polimorfismo T2561 C (P854L) (Genotipo DiaDib) (BC091) en el exón 19 del gen SLC4A1 (grupo sanguíneo DIEGO),
- \quad
- el polimorfismo A793G (Genotipo DoaDob) (BC092) en el exón 2 del gen DOMBROCK,
- \quad
- el polimorfismo C134T (A45V) (Genotipo CoaCob) (BC093) en el exón 1 del gen COLTON.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- el polimorfismo Arg389Gly en el Receptor adrenérgico beta 1 (ADRB1),
- \quad
- los polimorfismos Arg16Gly y Gln27Glu en el Receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2),
- \quad
- el polimorfismo Ser9Gly del Receptor dopaminérgico D3 (DRD3),
- \quad
- los polimorfismos His452Tyr y T102C del Receptor serotonérgico 2A (HTR2A),
- \quad
- el polimorfismo Val108Met de Catecol-O-metiltransferasa (COMT),
- \quad
- el polimorfismo Ile105Val de Glutation S transferasa clase 1 (GSTP1),
- \quad
- el polimorfismo Gly460Trp de Aducina 1 (ADD1),
- \quad
- el polimorfismo Arg399Gln de la Proteína de reparación de DNA XRCC1,
- \quad
- el polimorfismo Ile462Val del citocromo P450 1A1 (CYP1A1),
- \quad
- el polimorfismo A1166C del Receptor tipo 1 de angiotensina II (AGTR1),
- \quad
- el polimorfismo C-58T del receptor B2 de bradikinina (BDKRB2),
- \quad
- el polimorfismo Met235Thr de Angiotensinógeno (AGT),
- \quad
- los polimorfismos C430T, A1075C, 818de1A, T1076C y C1080G del citocromo P450 2C9 (CYP2C9),
- \quad
- los polimorfismos H324P, V136V, V11M, C882G, C1038T, G4180C, A1847G, C-1584G, C100T, 138insT, C1023T, G1659A, 1707T/del, G1758A/T, 1863ins9bp, 1973insG, 2539delAACT, 2549A/del, 2613delAGA, C2850T, G3183A, C3198G, T3277C, G4042A y 4125insGTGCCCACT del citocromo P450 2D6 (CYP2D6),
- \quad
- los polimorfismos A805T, G416A, A1196G y C792G del citocromo P450 2C8 (CYP2C8),
- \quad
- los polimorfismos T341C, C481T, A803G, C282T, G590A, G857A y G191A de N-acetiltransferasa 2 (NAT2),
- \quad
- los polimorfismos G636A, G681A, C680T, A1G, IVS5+2T>A, T358C, G431A y C1297T del citocromo P450 2C19 (CYP2C19),
- \quad
- el polimorfismo C2664T del receptor de glutamatérgico ionotrópico N-metil D-aspartato (NMDA) 2B (GRIN2B),
- \quad
- el polimorfismo C3435T de la glicoproteína P (ABCB1),
- \quad
- los polimorfismos A719G y G238C de Tiopurinmetiltransferasa (TPMT),
- \quad
- el polimorfismo C677T de 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (TPMT),
- \quad
- los polimorfismos Asp70Gly y Ala539Thr de Butirilcolinesterasa (BCHE),
- \quad
- el polimorfismo A-392G del citocromo P450 3A4 (CYP3A4),
- \quad
- los polimorfismos A-163C, A-3860G, G3534A y C558A del citocromo P450 1A2 (CYP1A2),
- \quad
- los polimorfismos G14690A, C3699T, G19386A, T29753C y G6986A del citocromo P450 3A5 (CYP3A5),
- \quad
- el polimorfismo 44bp deleción del promotor del transportador de serotonina (SLC6A4),
- \quad
- el polimorfismo delAGA (alelo*B) de Glutation S-transferasa M3 (GSTM3),
- \quad
- el polimorfismo alelo nulo de Glutation S-transferasa Ml (GSTM1),
- \quad
- el polimorfismo alelo nulo de Glutation S-transferasa n1 (GSTT1),
- \quad
- los polimorfismos Cys112Arg y Arg158Cys de apolipoproteina E (APOE),
- \quad
- el polimorfismo G-308A de Tumor necrosis factor (TNF), y
- \quad
- el polimorfismo G-1082A de Interleukina 10 (IL10)
Las secuencias de todos los genes mencionados en
las Tablas 1-3 son conocidas y están recogidas,
entre otras, en las siguientes páginas webs: GeneBank (NCBI),
GeneCard (Weizmann Institute of Sciences) y Snpper.chip.org (Innate
Immunity PGA).
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un kit para la puesta en práctica del método de la invención, en
adelante kit de la invención, que comprende:
- -
- un DNA-chip de la invención que comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad de sondas que permiten la detección de variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes;
- -
- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en el método de la invención que comprende el empleo de un algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente,
- -
- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación del método de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El kit de la invención puede contener, además,
si se desea, unos controles positivos y negativos de la reacción de
hibridación.
Las características del DNA-chip
de la invención, método de la invención y algoritmo proporcionado
por esta invención ya han sido descritas previamente.
El kit de la invención puede ser utilizado para
la detección de variaciones génicas humanas asociadas a
enfermedades o antígenos de interés, y para la detección de
variaciones génicas humanas asociadas a reacciones adversas a
fármacos, para lo cual se seleccionarán las sondas adecuadas para
las variaciones génicas que se desean detectar.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas humanas asociadas con enfermedades incluyen las
variaciones genéticas asociadas a la enfermedad inflamatoria
intestinal (IBD), tales como las variaciones génicas humanas
seleccionadas del grupo de variaciones génicas mencionadas en la
Tabla 1 y combinaciones de las mismas.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas humanas asociadas con antígenos de interés
incluyen las variaciones génicas humanas asociadas a antígenos
eritrocitarios humanos, tales como las variaciones génicas humanas
seleccionadas del grupo de variaciones génicas mencionadas en la
Tabla 2 y combinaciones de las
mismas.
mismas.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
variaciones génicas humanas asociadas con reacciones adversas a
fármacos incluyen las variaciones génicas humanas seleccionadas del
grupo de variaciones génicas mencionadas en la Tabla 3 y
combinaciones de las mismas.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha indicado previamente, para la
validación del método de la invención, se han diseñado y validado
unos oligonucleótidos cebadores capaces de amplificar, mediante PCR
multiplex, las regiones DNA diana que contienen las variaciones
génicas humanas asociadas, por ejemplo, a IBD, o a reacciones
adversas a fármacos cuyas secuencias corresponden a:
- -
- SEQ ID NO: 1-124 (en el Ejemplo 3 se indican las parejas de oligonucleótidos cebadores que amplifican las regiones DNA diana que contienen las variaciones génicas humanas asociadas a IBD a amplificar)
- -
- SEQ ID NO: 125-254 (en el Ejemplo 5 se indican las parejas de oligonucleótidos cebadores que amplifican las regiones DNA diana que contienen las variaciones génicas humanas asociadas a reacciones adversas a fármacos a amplificar).
\vskip1.000000\baselineskip
Dichos oligonucleótidos cebadores presentan la
ventaja de que permiten la amplificación específica de dichas
regiones DNA diana en un número de reacciones PCR muy bajo,
concretamente:
- en el caso de la detección de variaciones
génicas asociadas a IBD se amplifican, en tan sólo 3 reacciones de
PCR multiplex, los 42 fragmentos necesarios para el genotipado de
las 77 variaciones génicas que se analizan en el
DNA-chip de la invención para la detección de
variaciones génicas asociadas a IBD indicadas en el Ejemplo 3;
\newpage
- en el caso del DNA-chip que
permite la detección de variaciones génicas asociadas a las
reacciones adversas a fármacos se amplifican, en tan sólo 4
reacciones de PCR multiplex, los 65 fragmentos necesarios para el
genotipado de las 89 variaciones génicas que se analizan en el
DNA-chip de la invención para la detección de
variaciones génicas asociadas a reacciones adversas a fármacos
indicadas en el Ejemplo 5.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se diseñó y fabricó un DNA-chip
para detectar variaciones génicas humanas asociadas a algunos
antígenos eritrocitarios que permite la detección simultánea,
sensible, específica y reproducible de variaciones génicas asociadas
a antígenos eritrocitarios humanos. Ejemplos ilustrativos de dichas
variaciones génicas humanas asociados a antígenos eritrocitarios
humanos que pueden ser determinados utilizando este
DNA-chip se mencionan en la Tabla 2.
En este caso concreto, el
DNA-chip diseñado y fabricado consta de un soporte
(portaobjetos de cristal) que contiene sobre su superficie una
pluralidad de sondas que permiten la detección de las variaciones
génicas mencionadas anteriormente. Estas sondas son capaces de
hibridar con las secuencias diana amplificadas de los genes que
codifican los antígenos eritrocitarios cuya variación génica se
desea estudiar. Las secuencias de DNA de cada una de las sondas
utilizadas son las siguientes [en general, se indica el nombre del
gen, la mutación (cambio de nucleótido, "ins": inserción,
"del": deleción), el genotipo y el exón).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las sondas capaces de detectar las distintas
variaciones génicas identificadas previamente se imprimen en el
soporte (portaobjetos de cristal) aminosilanizado empleando DMSO
como tampón de impresión. La impresión se lleva a cabo con un
spotter o impresor de oligonucleótidos (sondas) controlando
la temperatura y la humedad relativa.
La unión de las sondas al soporte (portaobjetos
de cristal) se lleva a cabo mediante entrecruzamiento con radiación
ultravioleta y horneado tal y como se describe en la documentación
aportada por el fabricante (Por ejemplo, Corning Lifesciences
http://www.cornina.com). La humedad relativa durante el
proceso de deposición se mantiene entre el 40-50% y
la temperatura en torno a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrae DNA del individuo a partir de una
muestra de sangre mediante un protocolo estándar de filtración (Por
ejemplo, kits comerciales de Macherey Nagel, Quiagen, etc).
Se amplifican todos los exones e intrones de
interés mediante PCR multiplex utilizando las parejas de
oligonucleótidos cebadores apropiadas. Prácticamente puede
utilizarse cualquier par de oligonucleótidos cebadores que permita
la amplificación específica de fragmentos génicos en los que pueda
existir la variación génica a detectar, ventajosamente, aquellos
pares de oligonucleótidos cebadores que permitan dicha
amplificación en el menor número posible de reacciones PCR; en
particular, se seleccionaron unos oligonucléotidos cebadores que
permitían amplificar, en tan sólo 3 reacciones de PCR multiplex,
los 36 fragmentos necesarios para el genotipado de las 94
variaciones génicas previamente mencionadas analizadas utilizando el
DNA-chip de la invención para la detección de
variaciones génicas asociadas a antígenos eritrocitarios.
Los oligonucleótidos cebadores útiles para
llevar a cabo la PCR multiplex para la detección de variaciones
génicas asociadas a antígenos eritrocitarios humanos pueden ser
diseñados por los expertos en la materia utilizando las secuencias
de los genes correspondientes tal y como se describen en GenBank
usando por ejemplo los softwares:
Primer 3
(http://frodo.wi.mit.edu/cqi-bin/primer3/primer3
www.cai) o
Web Primer
(http://sea.veastaenome.orq/cqi-bin/web-primer)
Las PCR multiplex se llevan a cabo
simultáneamente bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura
que permiten la amplificación específica de los fragmentos de los
genes en los que pueda existir la variación génica a detectar.
Finalizada la PCR multiplex se comprueba, en gel de agarosa, que ha
tenido lugar reacción de amplificación.
A continuación, la muestra a hibridar (producto
de la amplificación) se somete a fragmentación con una Dnasa y los
productos resultantes del proceso de fragmentación se someten a una
reacción de marcaje indirecto. Una transferasa terminal incorpora
un nucleótido unido a un miembro de un par de unión específica, por
ejemplo, biotina, al final de estos pequeños fragmentos.
Antes de aplicar la muestra sobre el
DNA-chip se procede a desnaturalizar la muestra
mediante calentamiento a 95ºC durante 5 minutos y, posteriormente,
se añade el tampón de hibridación "ChipMap Kit Hybridization
Buffer" (Ventana Medical System).
La hibridación se lleva a cabo de forma
automática en la estación de hibridación Ventana Discovery (Ventana
Medical Systems), desarrollada para tal fin.
Se realiza una prehibridación o bloqueado del
portaobjetos con BSA. A continuación, se aplica la muestra junto
con la solución de hibridación [ChipMap Kit Hybridization Buffer
(Ventana Medical System)] y se mantiene durante 1 hora a 45ºC
siguiendo el protocolo Ventana 9.0 Europe (Ventana Medical System).
Finalmente, el portaobjetos se somete a la acción de diferentes
soluciones de lavado [ChipMap hybridisation Kit Buffers (Ventana
Medical System)]. Una vez finalizado el proceso de hibridación se
procede al lavado final y secado del portaobjetos.
Finalizada la hibridación, el revelado con
estreptavidina-Cy3 marca los puntos (sondas) en los
que se ha producido la hibridación.
Se introduce el portaobjetos en el escáner de
fluorescencia confocal, por ejemplo Axon escaner 4100A, y se
procede a escanear la señal emitida por el marcaje estándar al ser
excitado por el láser.
El software del propio escáner permite la
cuantificación en la imagen obtenida de la señal de los puntos
donde se ha producido hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de la señal que se obtiene con las
sondas que detectan las diferentes variaciones génicas se establece
el genotipo del individuo. Para ello, brevemente, en primer lugar,
a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas se les
resta su propio ruido de fondo; a continuación, se agrupan las
réplicas correspondientes a cada uno de las 4 sondas que se usan
para caracterizar cada variación génica. El valor medio de
intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media
acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes.
Conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las
sondas se calculan dos ratios (ratio 1 y ratio 2):
Ratio 1 =
\frac{Intensidad \ media \ sonda \ 1}{Intensidad \ media \ sonda \
1 \ + \ Intensidad \ media \ sonda \
2}
\vskip1.000000\baselineskip
Ratio 2 =
\frac{Intensidad \ media \ sonda \ 3}{Intensidad \ media \ sonda \
3 \ + \ Intensidad \ media \ sonda \
4}
Estos ratios se sustituyen en tres funciones
lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos
posibles:
- AA
- Función 1
- AB
- Función 2
- BB
- Función 3
La función que presente un valor absoluto mayor
determina el genotipo que presenta el paciente.
En este caso, la obtención de dichas funciones
lineales se lleva a cabo mediante el análisis de 5 sujetos por cada
uno de los tres posibles genotipos de la variación génica (AA, AB,
BB). Con los resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 15
sujetos. Estos ratios sirven como variables de clasificación de los
tres grupos para generar las funciones lineales. Con estas tres
funciones lineales se evalúa la capacidad discriminatoria de las
dos parejas de sondas diseñadas. En caso de que la capacidad de
discriminación no sea del 100%, las sondas serían rediseñadas.
Nuevos sujetos caracterizados para cada uno de los tres genotipos
constituyen nuevos ratios 1 y 2 para perfeccionar las combinaciones
lineales de los mismos que constituyen las funciones lineales y, en
definitiva, para mejorar la capacidad discriminatoria del algoritmo
basado en estas tres funciones.
Siempre que los ratios 1 y 2 se encuentren
dentro del rango de los ratios usados para construir los grupos, la
intensidad de fluorescencia media de las 40 réplicas con respecto al
ruido de fondo sea mayor de 5 y el coeficiente de variación de
todas las réplicas del DNA-chip esté por debajo de
0,25 (utilizando un escáner de fluorescencia confocal) el resultado
de las funciones lineales se considera correcto.
Para dar por buena una hibridación completa es
necesario que la relación intensidad frente a ruido de fondo de
todas las sondas del DNA chip esté por encima de 15. Asimismo, la
media de todos los ratios debe superar 0,6 como control de
especificidad y sensibilidad. El ratio del control externo debe
estar por encima de 0,6 y el control negativo nunca debe ser
superior a 3 veces el ruido de fondo. Estos parámetros son
consistentes con la realización particular de un escáner de
fluorescencia confocal.
Resumiendo, cada mutación presenta en el
portaobjetos 4 sondas (repetidas 10 veces) para su detección. Dos
de dichas sondas detectan una variación génica y las otras dos la
otra variación génica. La base interrogada se localiza siempre en la
posición central.
En el caso de un sujeto homocigoto para la
variación génica A, este no presentará variación génica B; por
consiguiente, en la imagen que se obtiene del soporte de cristal las
sondas que detectan la variación génica B presentan una señal de
hibridación notablemente inferior a la presentada por la variación
génica A y viceversa; en este caso, los ratios 1 y 2 tenderán a 1 y
los sujetos serán asignados como homocigotos AA por el software de
análisis.
Por otro lado, un sujeto heterocigoto para una
variación génica determinada presenta ambos la variaciones génicas;
por tanto, las sondas que los detectan presentan una señal de
hibridación equivalente. Los ratios 1 y 2 tenderán a 0,5 y los
sujetos serán asignados como heterocigotos AB por el software de
análisis.
Ejemplo
2
Se llevó a cabo la extracción del DNA por
métodos convencionales de 15 donantes de sangre que respondían a
los grupos serológicos A y O. El análisis genético mediante
secuenciación de la región de interés corroboró que 5 de los
donantes presentaban genotipo 188G189C (determinación serológica A),
otros 5 donantes presentaban genotipo 188GA189CT (determinación
serológica 0) y los restantes 5 donantes presentaban genotipo
188A189T (determinación serológica 0).
Se diseñaron 4 sondas para la detección del
polimorfismo ABO G188A/C189T genotipo ABO O1v, tal y como se ha
descrito previamente en la descripción de la invención, cuyas
secuencias se recogen a continuación (Ejemplo 1):
Las sondas diseñadas se imprimieron en el
portaobjetos de cristal con un microarrayer tal y como se describe
en el Ejemplo 1.2.
Se amplificó, mediante PCR multiplex utilizando
cebadores específicos, la región del gen ABO que permitía el
análisis de la variación génica de interés (ABO G188A/C189T
genotipo ABO O1v). El producto de la amplificación fue fragmentado y
marcado tal y como se indica en el Ejemplo 1.3.1.
La hibridación se llevó a cabo en una estación
automática de hibridación, tal y como se ha descrito previamente en
el Ejemplo 1.3.2.
El portaobjetos se introdujo en el escáner y se
procedió a escanear la señal emitida por el marcaje estándar al ser
excitado por el láser (Ejemplo 1.3.3) y a cuantificar la imagen
obtenida de la señal de los puntos donde se ha producido
hibridación (Ejemplo 1.3.4).
El análisis de los resultados se llevó a cabo
utilizando el algoritmo previamente descrito en el Ejemplo 1.3.5.
El empleo de dicho algoritmo permitió caracterizar esta variación
génica para los 15 sujetos con una coincidencia del 100% con
respecto a los métodos serológicos y de secuenciación.
La Figura 1 muestra la representación de los
ratios 1 y 2 y permite caracterizar a los 15 pacientes.
Las funciones lineales para los tres grupos se
exponen en la Tabla 5, en donde el número de réplicas de las 4
sondas usadas fue 10; "X" es el ratio 1; "Y" es el ratio
2; "0" se corresponde con el genotipo 188A189T; "1" se
corresponde con el genotipo: 188GA189CT; y "2" se corresponde
con el genotipo 188G189C.
Un donante con genotipo 188G189C presentó unos
ratios 1 y 2 de 0,77 y 0,82, respectivamente. Al sustituir estos
ratios en las funciones lineales, se observa que la función 2
presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda demostrado
cómo el algoritmo proporcionado por esta invención clasifica
perfectamente a los donantes para 10 réplicas de cada una de las 4
sondas.
Las funciones lineales obtenidas para 8 réplicas
de cada una de las 4 sondas, se recogen en la Tabla 6.
El mismo donante con genotipo 188G189C presentó
igualmente unos ratios 1 y 2 de 0,77 y 0,82, respectivamente. AI
sustituir estos ratios en las funciones lineales, se observa que la
función 2 presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda
demostrado cómo el algoritmo proporcionado por esta invención
clasifica perfectamente a los pacientes para 8 réplicas de cada una
de las 4 sondas.
Las funciones lineales obtenidas para 6 réplicas
de cada una de las 4 sondas, se recogen en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El mismo donante con genotipo 188G189C presentó
igualmente unos ratios 1 y 2 de 0,77 y 0,82, respectivamente. Al
sustituir estos ratios en las funciones lineales, se observa que la
función 2 presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda
demostrado cómo el algoritmo proporcionado por esta invención
clasifica perfectamente a los pacientes para 6 réplicas de cada una
de las 4 sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se diseñó y fabricó un DNA-chip
para detectar variaciones génicas humanas asociadas a IBD que
permite la detección simultánea, sensible, específica y
reproducible de variaciones génicas asociadas a IBD. Dichas
variaciones génicas se relacionan con un mayor o menor riesgo de
padecer la IBD, una mejor o peor respuesta a los fármacos e incluso
un mejor o peor pronóstico de la enfermedad. Ejemplos ilustrativos
de variaciones génicas humanas asociadas a antígenos asociados a
IBD que pueden ser determinados utilizando este
DNA-chip se mencionan en la Tabla 1.
El DNA-chip diseñado y producido
consta de un soporte (portaobjetos de cristal) que presenta en su
superficie una pluralidad de sondas que permiten la detección de
las variaciones génicas mencionadas anteriormente. Estas sondas son
capaces de hibridar con las secuencias amplificadas de los genes
relacionados con IBD. Las secuencias de DNA de cada una de las
sondas utilizadas se mencionan a continuación [en general, se
indica el nombre del gen y la mutación (cambio de nucleótido,
"ins": inserción, "del": deleción o cambio de
aminoácido)]:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de las sondas al portaobjetos de vidrio
se lleva a cabo mediante entrecruzamiento con radiación
ultravioleta y horneado tal y como se ha descrito previamente
(Ejemplo 1.2) manteniendo la humedad relativa durante el proceso de
deposición entre el 40-50% y la temperatura en torno
a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrae DNA del individuo a partir de una
muestra de sangre mediante un protocolo de filtración.
Se amplifican todos los exones e intrones de
interés mediante PCR multiplex utilizando las parejas de
oligonucleótidos cebadores apropiadas. Prácticamente puede
utilizarse cualquier pareja de oligonucleótidos cebadores que
permita la amplificación específica de fragmentos génicos en los
que pueda existir la variación génica a detectar, ventajosamente,
aquellas parejas que permitan dicha amplificación en el menor
número posible de reacciones
PCR.
PCR.
\newpage
Los oligonucleótidos cebadores utilizados para
amplificar, mediante PCR multiplex, los fragmentos de los genes en
los que pueden existir las variaciones génicas correspondientes
asociados a IBD a detectar, se mencionan a continuación. Dichos
oligonucleótidos cebadores constituyen un aspecto adicional de la
presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Las PCR multiplex se llevan a cabo
simultáneamente bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura
que permiten la amplificación específica de los fragmentos de los
genes en los que pueda existir la variación génica a detectar.
Finalizada la PCR multiplex se comprueba, en gel de agarosa, que ha
tenido lugar reacción de amplificación.
A continuación, la muestra a hibridar (producto
de la amplificación) se somete a fragmentación con una Dnasa y los
productos resultantes del proceso de fragmentación se someten a una
reacción de marcaje indirecto. Una transferasa terminal un
nucleótido unido a un miembro de un par de unión específica, por
ejemplo, biotina, al final de estos pequeños fragmentos.
Antes de aplicar la muestra sobre el
DNA-chip se procede a desnaturalizar la muestra
mediante calentamiento a 95ºC durante 5 minutos y, posteriormente,
se añade el tampón de hibridación "ChipMap hybridisation Kit
Buffers" (Ventana Medical System).
A continuación se procede a realizar las etapas
de hibridación, escaneado del portaobjetos, cuantificación de la
imagen e interpretación de los resultados, siguiendo el
procedimiento descrito en los apartados 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 y 1.3.5
del Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se llevó a cabo la extracción del DNA por
métodos convencionales de 9 individuos (pacientes) para
caracterizar las variaciones génicas que presentaban estos
individuos en relación a la variación génica A2033T del gen CSFR1
asociado con el desarrollo de la enfermedad de Crohn. El análisis
genético mediante secuenciación de la región de interés determinó
que 3 de los pacientes presentaban genotipo AA, otros 3 genotipo AT
(heterocigotos) y los restantes 3, genotipo TT.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron 4 sondas para la detección de la
variación génica A2033T CSFR1, cuyas secuencias nucleotídicas eran
las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos diseñados se imprimieron en
el portaobjetos de cristal con un microarrayer tal y como se
describe en el Ejemplo 3.2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se amplificó, mediante PCR multiplex utilizando
cebadores específicos (SEQ ID NO 39 y SEQ ID NO 40), la región del
gen CSFR1 que permitía el análisis de la variación génica de
interés. El producto de la amplificación fue fragmentado y marcado
tal y como se indica en el Ejemplo 1.3.1.
\vskip1.000000\baselineskip
La hibridación se llevó a cabo en una estación
automática de hibridación, tal y como se ha descrito previamente en
el Ejemplo 1.3.2.
\vskip1.000000\baselineskip
El portaobjetos se introdujo en el escáner y se
procedió a escanear la señal emitida por el marcaje estándar al ser
excitado por el láser (Ejemplo 1.3.3) y a cuantificar la imagen
obtenida de la señal de los puntos donde se ha producido
hibridación (Ejemplo 1.3.4).
El análisis de los resultados se llevó a cabo
utilizando el algoritmo previamente descrito en el Ejemplo 1.3.5.
El empleo de dicho algoritmo permitió caracterizar esta variación
génica para los 9 pacientes con una coincidencia del 100% con
respecto a la metodología de secuenciación.
La Figura 2 muestra la representación de los
ratios 1 y 2 y permite caracterizar a los 9 pacientes.
Las funciones lineales para los tres grupos se
exponen en la Tabla 8, en donde el número de réplicas de las 4
sondas usadas fue 10; "X" es el ratio 1; "Y" es el ratio
2; "0" se corresponde con el genotipo TT; "1" se
corresponde con el genotipo AT; y "2" se corresponde con el
genotipo AA.
\vskip1.000000\baselineskip
Un paciente con genotipo AA presentó unos ratios
1 y 2 de 0,26 y 0,32, respectivamente. Al sustituir estos ratios en
las funciones lineales, se observa que la función 2 presenta un
valor absoluto mayor. De esta forma queda demostrado cómo el
algoritmo proporcionado por esta invención clasifica perfectamente a
los pacientes para 10 réplicas de cada una de las 4 sondas.
Las funciones lineales obtenidas para 8 réplicas
de cada una de las 4 sondas, se recogen en la Tabla 9.
El mismo paciente con genotipo AA presentó
igualmente unos ratios 1 y 2 de 0,26 y 0,32, respectivamente. Al
sustituir estos ratios en las funciones lineales, se observa que la
función 2 presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda
demostrado cómo el algoritmo proporcionado por esta invención
clasifica perfectamente a los pacientes para 8 réplicas de cada una
de las 4 sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
Las funciones lineales obtenidas para 6 réplicas
de cada una de las 4 sondas, se recogen en la Tabla 10.
El mismo paciente con genotipo AA presentó
igualmente unos ratios 1 y 2 de 0,26 y 0,32, respectivamente. Al
sustituir estos ratios en las funciones lineales, se observa que la
función 2 presenta un valor absoluto mayor. De esta forma queda
demostrado cómo el algoritmo proporcionado por esta invención
clasifica perfectamente a los pacientes para 6 réplicas de cada una
de las 4 sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se diseñó y fabricó un DNA-chip
para detectar reacciones farmacológicas adversas que permite la
detección simultánea, sensible, específica y reproducible de
variaciones génicas asociadas a reacciones adversas a fármacos.
Ejemplos ilustrativos de variaciones génicas humanas asociadas a
reacciones adversas a fármacos que pueden ser determinados
utilizando este DNA-chip se mencionan en la Tabla
3.
En este caso concreto, el
DNA-chip diseñado y fabricado consta de un soporte
que contiene sobre su superficie una pluralidad de sondas que
permiten la detección de las variaciones génicas mencionadas
anteriormente. Estas sondas son capaces de hibridar con las
secuencias diana amplificadas de genes asociados con reacciones
adversas a fármacos cuya variación génica se desea estudiar. Las
secuencias de DNA de cada una de las sondas utilizadas son las
siguientes [en general, se indica el nombre del gen y la variación
génica (cambio del aminoácido, cambio de nucleótido, "ins":
inserción, "del ": deleción)]:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se imprimen o depositan las sondas capaces de
detectar las variaciones génicas de interés en un portaobjetos de
vidrio aminosilanizado empleando DMSO como tampón de impresión. La
impresión se lleva a cabo con un spotter o impresor de
oligonucleótidos en el que se lleva a cabo un control de la
temperatura y la humedad.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión de las sondas al portaobjetos de vidrio
se lleva a cabo mediante entrecruzamiento con radiación
ultravioleta y horneado tal y como se ha descrito previamente
(Ejemplo 1.2) manteniendo la humedad relativa durante el proceso de
deposición entre el 40-50% y la temperatura en torno
a 20ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrae DNA del individuo a partir de una
muestra de sangre de 300 \mul aproximadamente mediante un
protocolo de filtración.
Se amplifican todos los exones e intrones de
interés mediante PCR multiplex utilizando las parejas de
oligonucleótidos cebadores apropiadas. Prácticamente puede
utilizarse cualquier pareja de oligonucleótidos cebadores que
permita la amplificación específica de fragmentos génicos en los
que pueda existir la variación génica a detectar, ventajosamente,
aquellas parejas que permitan dicha amplificación en el menor
número posible de reacciones
PCR.
PCR.
Los oligonucleótidos cebadores utilizados para
amplificar, mediante PCR multiplex, los fragmentos de los genes en
los que pueden existir las variaciones génicas correspondientes
asociadas a reacciones adversas a fármacos a detectar, se mencionan
a continuación.
Las PCR multiplex se llevan a cabo
simultáneamente bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura
que permiten la amplificación específica de los fragmentos de los
genes en los que pueda existir la variación génica a detectar.
Finalizada la PCR multiplex se comprueba, en gel de agarosa, que ha
tenido lugar reacción de amplificación.
A continuación, la muestra a hibridar (producto
de la amplificación) se somete a fragmentación con una DNAsa y los
productos resultantes del proceso de fragmentación se someten a una
reacción de marcaje indirecto. Una transferasa terminal incorpora
un nucleótido unido a un miembro de un par de unión específica, por
ejemplo, biotina, al final de estos pequeños fragmentos.
Antes de aplicar la muestra sobre el
DNA-chip se procede a desnaturalizar la muestra
mediante calentamiento a 95ºC durante 5 minutos y, posteriormente,
se añade el tampón de hibridación "ChipMap hybridisation Kit
Buffers" (Ventana Medical System).
A continuación se procede a realizar las etapas
de hibridación, escaneado del portaobjetos, cuantificación de la
imagen e interpretación de los resultados, siguiendo el
procedimiento descrito en los apartados 1.3.2, 1.3.3, 1.3.4 y 1.3.5
del Ejemplo 1.
<110> Progenika Biopharma, S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos y productos para el
genotipado in vitro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen "multidrug resistance protein MDR-1" en
el que puede existir el polimorfismo G2677T/C ala893Ser/Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcatagtaag cagtagggag taaca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen "multidrug resistance protein MDR-1" en
el que puede existir el polimorfismo G2677T/C ala893Ser/Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcaatagca ggagttgttg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 oligo 1 para amplificar el
fragmento del gen "multidrug resistance protein
MDR-1" en el que puede existir el polimorfismo
C3435T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctcccagg ctgtttattt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen "multidrug resistance protein MDR-1" en
el que puede existir el polimorfismo C3435T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttttcagc tgcttgatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CARD15 en el que puede existir el polimorfismo R702W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagatcacagc agccttcctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CARD15 en el que puede existir el polimorfismo R702W
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatggagtg gaagtgcttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CARD15 en el que puede existir el polimorfismo G908R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgcagagg gaggaggact
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen CARD15 en el que puede existir el polimorfismo G908R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacctcaag ctctggtgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CARD15 en el que puede existir el polimorfismo 1007insC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactggctaac tcctgcagtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CARD15 en el que puede existir el polimorfismo 1007insC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaaaactga ggttcggaga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen microsomal epoxide hydrolase (EPXH1) en el que puede
existir el polimorfismo T612C Y113H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcaactt ggggtcctga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen microsomal epoxide hydrolase (EPXH1) en el que puede existir
el polimorfismo T612C Y113H
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcgttttgc aaacatacct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen monocyte chemotactic protein 1 (MCP1) en el que puede
existir el polimorfismo (-2518)G/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagccaaat gcattctctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen monocyte chemotactic protein 1 (MCP1) en el que puede
existir el polimorfismo (-2518)G/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacagggaag gtgaagggta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 10 (IL10)en el que puede existir el
polimorfismo (-1082)G/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaactggctc cccttacctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 10 (IL10)en el que puede existir el
polimorfismo (-1082)G/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaggctg gataggaggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 10 (IL10)en el que puede existir el
polimorfismo G15R G43A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaggcctcc ctgagcttac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 10 (IL10)en el que puede existir el
polimorfismo G15R G43A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctcggagat ctcgaagcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 16 (IL16) en el que puede existir el
polimorfismo (-295)T/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaactgaagca atgccagtcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 16 (IL16) en el que puede existir el
polimorfismo (-295)T/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagagccagc acctcctaga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen fas ligand en el que puede existir el
polimorfismo(-843)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgagccca ggagtttgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen fas ligand en el que puede existir el
polimorfismo(-843)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcagaggct gcaaaccagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen nuclear factor kappa-B (NFKB1) en el que
puede existir el polimorfismo 94delATTG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaccgcat gactctatca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen nuclear factor kappa-B (NFKB1) en el que
puede existir el polimorfismo 94delATTG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctctggct tcctagcag
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen nuclear factor kappa-B inhibitor alpha
(NFKBIA) en el que puede existir el polimorfismo SNP en el 3'UTR
(G/A)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagccatca tttccactct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen nuclear factor kappa-B inhibitor alpha
(NFKBIA) en el que puede existir el polimorfismo SNP en el 3'UTR
(G/A)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgcaccct gtaatcctgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen signal transducer and activator of transcription
6(STAT6) en el que puede existir el polimorfismo G2964A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccaatcca ctccttcctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen del signal transducer and activator of transcription
6(STAT6) en el que puede existir el polimorfismo G2964A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatgccctaa cctgtgctct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 18 (IL18)en el que puede existir el
polimorfismo TCA/TCC en el codon 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatagaggccg atttccttgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 18 (IL18)en el que puede existir el
polimorfismo TCA/TCC en el codon 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctggaaca gaagattgtc att
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo E474E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccccaga aacaaactga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo E474E
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctgcaga agttcccatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo Q476Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctccccaga aacaaactga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo Q476Q
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacctgcaga agttcccatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo D510D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggaagctgg agcaggtgta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo D510D
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccattctgac tggcactcct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo P588P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcttctggaa cgtggtaggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mediterranean fever gene (MEFV)en el que puede
existir el polimorfismo P588P
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaagcaggg ggttccttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen discs, large homolog 5 (DLG5) en el que puede existir el
polimorfismo 113G/A (R30Q)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggcgcaatt actacctctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen discs, large homolog 5 (DLG5) en el que puede existir el
polimorfismo 113G/A (R30Q)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtgaatgcc agatgaacac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen colony stimulating factor receptor 1(CSFR1) en el
que puede existir el polimorfismo A2033T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctccttgctt gctttccttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen colony stimulating factor receptor 1(CSFR1) en el que
puede existir el polimorfismo A2033T
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtagggatg ggatggatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen organic cation transporter (OCTN1, SLC22A4) en el que
puede existir el polimorfismo 1672C/T (L503F)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagagtgcc cagagagtcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen organic cation transporter (OCTN1, SLC22A4) en el que
puede existir el polimorfismo 1672C/T (L503F)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctccctaa ggcattttgg t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen organic cation transporter (OCTN2, SLC22A5) en el que
puede existir el polimorfismo (-207G/C)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttacatagg gcgcacgac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen organic cation transporter (OCTN2, SLC22A5) en el que
puede existir el polimorfismo (-207G/C)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcccgctg ccttccta
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen toll-like receptor 4 (TLR4) en el que puede
existir el polimorfismo Asp299Gly (A/G)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctagaggg cctgtgcaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen toll-like receptor 4 (TLR4) en el que puede
existir el polimorfismo Asp299Gly (A/G)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaatgtggg aaactgtcca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen toll-like receptor 4 (TLR4) en el que puede
existir el polimorfismo Thr399Ile (C/T)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacaaaggt gggaatgctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen toll-like receptor 4 (TLR4) en el que puede
existir el polimorfismo Thr399Ile (C/T)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttcaaattg gaatgctgga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 1 beta (IL1\beta) en el que puede existir el
polimorfismo (-511)A/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggcagagag ggaaggagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 1 beta (IL1\beta) en el que puede existir el
polimorfismo (-511)A/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaacagcgag ggagaaactg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen superoxide dismutase 2 (SOD2) en el que puede existir el
polimorfismo Ala16Val C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgtgctt tctcgtcttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen superoxide dismutase 2 (SOD2) en el que puede existir el
polimorfismo Ala16Val C/T
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgacgttc aggttgttca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen peroxisome proliferator-activated receptor
gamma (PPARG) en el que puede existir el polimorfismo Pro12Ala
C/G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcaaacccc tattccatgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen peroxisome proliferator-activated receptor
gamma (PPARG) en el que puede existir el polimorfismo Pro12Ala
C/G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacataaatg cccccacgtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen intercellular adhesion molecule 1(ICAM1) en el que
puede existir el polimorfismo K469E (A/G)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgagggca cctacctctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen intercellular adhesion molecule 1(ICAM1) en el que
puede existir el polimorfismo K469E (A/G)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattatgact gcggctgcta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen intercellular adhesion molecule 1(ICAM1) en el que
puede existir el polimorfismo R241G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatgaaatg ccccagagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen intercellular adhesion molecule 1(ICAM1) en el que
puede existir el polimorfismo R241G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgtggggt tcaacctctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen IBD5 locus en el que puede existir el polimorfismo
IGR2060a_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatacagcac cttcgggtct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen IBD5 locus en el que puede existir el polimorfismo
IGR2060a_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcagactt tggaactcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen IBD5 locus en el que puede existir el polimorfismo
IGR2198a_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcataatcagg ggttgcatga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen IBD5 locus en el que puede existir el polimorfismo
IGR2198a_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagagacac tgggacatca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen IBD5 locus en el que puede existir el polimorfismo
IGR3096a_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaggccat ggtgtatagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen IBD5 locus en el que puede existir el polimorfismo
IGR3096a_1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgccacctc ccatctctaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen heat shock protein 70 (HSP70-2) en el que
puede existir el polimorfismo 1267A/G Gln351Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtttgagg gcatcgactt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen heat shock protein 70 (HSP70-2) en el que
puede existir el polimorfismo 1267A/G Gln351Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggttgatg ctcttgttca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen toll-like receptor (TLR9) en el que puede
existir el polimorfismo 1237C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtcaaagcc acagtccaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen toll-like receptor (TLR9) en el que puede
existir el polimorfismo 1237C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgttgag agggtgacat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen methylenetetrahydrofolate reductase (MTFHR) en el que puede
existir el polimorfismo C677T Val222Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctctcctg actgtcatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen methylenetetrahydrofolate reductase (MTFHR) en el que puede
existir el polimorfismo C677T Val222Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacaaagcg gaagaatgtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 4 (IL4) en el que puede existir el polimorfismo
(-590)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccaaacta ggcctcacct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 4 (IL4) en el que puede existir el polimorfismo
(-590)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaggtggca tcttggaaac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 4 (IL4) en el que puede existir el polimorfismo
(-34)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcattttccc tcggtttcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 4 (IL4) en el que puede existir el polimorfismo
(-34)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaacagagg gggaagcagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mannan-binding lectin (MBL) (A/G) en el que
puede existir el polimorfismo Gly54Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcagcgtc ttactcagaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mannan-binding lectin (MBL) (A/G) en el que
puede existir el polimorfismo Gly54Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagaacagccc aacacgtacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mannan-binding lectin (MBL) (A/G) en el que
puede existir el polimorfismo (a/g) Gly57Glu
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttccccttg cacgttcc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mannan-binding lectin (MBL) (A/G) en el que
puede existir el polimorfismo (A/G) Gly57Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgttggaag aaaagaattg tcc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen mannan-binding lectin (MBL) en el que puede
existir el polimorfismo (C/T) Arg52Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaacctcagc cagacaaggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen mannan-binding lectin (MBL) en el que puede
existir el polimorfismo (C/T) Arg52Cys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagccacgtg attgtctagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen angiotensinogen precursor (AGT) en el que puede existir el
polimorfismo(-6)A/T
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcttctggca tctgtccttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen angiotensinogen precursor (AGT) en el que puede existir el
polimorfismo(-6)A/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccggcttacc ttctgctgta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen plasminogen activator inhibitor (PAI1) en el que puede
existir el polimorfismo 4G/5G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctggtccc caaaagaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen plasminogen activator inhibitor (PAI1) en el que puede
existir el polimorfismo 4G/5G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagttgggg acacacaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen tumor necrosis factor alpha (tnf\alpha) en el que puede
existir el polimorfismo (-857)C/T
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccacagcaa tgggtaggag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen tumor necrosis factor alpha (tnf\alpha) en el que puede
existir el polimorfismo (-857)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtttcagt cttggcttcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen tumor necrosis factor alpha (tnf\alpha) en el que puede
existir el polimorfismo (-308) G/A y (-238) G/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctggtccc caaaagaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen tumor necrosis factor alpha (tnf\alpha) en el que puede
existir el polimorfismo (-308) G/A y (-238) G/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagttgggg acacacaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen TPMT en el que puede existir el polimorfismo G238C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaacttttg tggggatatg ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen TPMT en el que puede existir el polimorfismo G238C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctctattt agtcatttga aaaca
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen TPMT en el que puede existir el polimorfismo G460A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggtccac acattcctct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen TPMT en el que puede existir el polimorfismo G460A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaccatttg cgatcacctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen TPMT en el que puede existir el polimorfismo A719G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatccattac attttcaggc ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen TPMT en el que puede existir el polimorfismo A719G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgatgct tttgaagaac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen MICA en el que puede existir el polimorfismo Trp14Gly y
Thr24Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagccccaca gtcttcgtta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen MICA en el que puede existir el polimorfismo Trp14Gly y
Thr24Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttccgttcc ctgtcaagtc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen MICA en el que puede existir el polimorfismo Met129Val,
Lys173Glu y Gly175Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcttcctc tcccaaaacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen MICA en el que puede existir el polimorfismo Met129Val,
Lys173Glu y Gly175Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccatgggg ggcactgttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen SLC11A1=NRAMP1 en el que puede existir el polimorfismo en
la región del promotor (-377 a -222): alelo 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgaggggt cttggaactc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen SLC11A1=NRAMP1 en el que puede existir el polimorfismo en
la región del promotor (-377 a -222): alelo 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgttctgtg cctcccaagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CD14 en el que puede existir el polimorfismo
(-159)T/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacccaccag agaaggctta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen CD14 en el que puede existir el polimorfismo
(-159)T/C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcacctccc cacctctctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen CD16A=FCGR3A en el que puede existir el polimorfismo G4985T
Val158Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaaaagcca cactcaaagac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen CD16A=FCGR3A en el que puede existir el polimorfismo G4985T
Val158Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgagtgat ggtgatgttca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen NR1I2 en el que puede existir el polimorfismo
(-25385)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaccagggc tggattaaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen NR1I2 en el que puede existir el polimorfismo
(-25385)C/T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctctggca acagtaaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen TUCAN/CARD8/CARDINAL en el que puede existir el polimorfismo
(T/A) Cys10stop
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgccgagac gggtatacag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen TUCAN/CARD8/CARDINAL en el que puede existir el polimorfismo
(T/A) Cys10stop
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaaatgtct cctgggaatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen IKBL en el que puede existir el polimorfismo +738T/C
Cys224Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagtccttc tcagcctggt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen IKBL en el que puede existir el polimorfismo +738T/C
Cys224Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctcacgca gctcttcctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen TNFRSF1B=TNFR2 en el que puede existir el polimorfismo
G593A y T620C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctgggcca agttcctcta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen TNFRSF1B=TNFR2 en el que puede existir el polimorfismo G593A
y T620C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcaggtc acagagagt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen MEKK1 en el que puede existir el polimorfismo Asp643Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaaagtt tgccaacca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen MEKK1 en el que puede existir el polimorfismo Asp643Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 116
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccaaagtc tgggctcttt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 117
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen HLA-DQ4 en el que puede existir el
polimorfismo 159G/A/C Y 282C/T (DQB1*0401 Y DQB1*0402)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 117
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtttaagggc atgtgctac
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen HLA-DQ4 en el que puede existir el
polimorfismo 159G/A/C Y 282C/T (DQB1*0401 Y DQB1*0402)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 118
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctccaact ggtagttgtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen HLA-DRB en el que puede existir el
polimorfismo 109T/C, 119T/C/G/A, 122A/C/G/T, 129A/G, 161G/A/T,
175A/T/C/G, 184A/C/DELA, 286C/A/T, 305C/G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcttcgac agcgacgtgg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen HLA-DRB en el que puede existir el
polimorfismo 109T/C, 119T/C/G/A, 122A/C/G/T, 129A/G, 161G/A/T,
175A/T/C/G, 184A/C/DELA, 286C/A/T, 305C/G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcgccgctg cactgtgaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen IL1RN en el que puede existir el polimorfismo 2018 T/C EXÓN
2 Y 2073 C/T INTRÓN 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacaagttctg ggggacacag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 122
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen IL1RN en el que puede existir el polimorfismo 2018 T/C EXÓN
2 Y 2073 C/T INTRÓN 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgcaccta gggtttgtgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 123
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen IL1B en el que puede existir el polimorfismo 3954 C/T
TAQI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttcttagc caccccactc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen IL1B en el que puede existir el polimorfismo 3954 C/T
TAQI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgatcgtac aggtgcatcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 125
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor adrenérgico beta 1 (ADRB1) en el que puede existir
el polimorfismo Arg389Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccttcaacc ccatcatcta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor adrenérgico beta 1 (ADRB1) en el que puede existir
el polimorfismo Arg389Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggctcgag tcgctgtc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 127
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2) en el que puede existir
el polimorfismo Arg16Gly y Gln27Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcacctgc cagactgc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor adrenérgico beta 2 (ADRB2) en el que puede existir
el polimorfismo Arg16Gly y Gln27Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaggacga tgagagacat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor dopaminérgico D3 (DRD3) en el que puede existir el
polimorfismo Ser9Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcagtagga gagggcatag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor dopaminérgico D3 (DRD3) en el que puede existir el
polimorfismo Ser9Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagccccaa agagtctgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
gen receptor serotonérgico 2A (HTR2A) en el que puede existir el
polimorfismo His452Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcaagatgc caagacaaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
gen receptor serotonérgico 2A (HTR2A) en el que puede existir el
polimorfismo His452Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagtgtgcct tccacagttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor serotonérgico 2A (HTR2A) en el que puede existir el
polimorfismo T102C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 133
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggagagaca cgacggtgag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor serotonérgico 2A (HTR2A) en el que puede existir el
polimorfismo T102C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagttctgg cttagacatg ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen catecol-O-metiltransferasa
(COMT) en el que puede existir el polimorfismo Val108Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 135
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcctactg tggctactca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen catecol-O-metiltransferasa
(COMT) en el que puede existir el polimorfismo Val108Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctttttcc aggtctgaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen glutation S transferasa clase 1 (GSTP1) en el que puede
existir el polimorfismo Ile105Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtggacat ggtgaatgac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 138
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen glutation S transferasa clase 1 (GSTP1) en el que puede
existir el polimorfismo Ile105Val
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgcaggttg tgtcttgtcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen aducina 1 (ADD1) en el que puede existir el polimorfismo
Gly460Trp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 139
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttgctagtga cggtgattcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen aducina 1 (ADD1) en el que puede existir el polimorfismo
Gly460Trp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 140
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagactgcag caagggtttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 141
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen de la proteína de reparación de DNA XRCC1 en el que puede
existir el polimorfismo Arg399Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtctcccct gtctcattcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen de la proteína de reparación de DNA XRCC1 en el que puede
existir el polimorfismo Arg399Gln
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattgcccagc acaggataag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 143
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A1 (CYP1A1) en el que puede existir el
polimorfismo Ile462Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcacccctg atggtgctat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A1 (CYP1A1) en el que puede existir el
polimorfismo Ile462Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttggaagtg ctcacagcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 145
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor tipo 1 de angiotensina II (AGTR1) en el que puede
existir el polimorfismo A1166C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaacattc ctctgcagca c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor tipo 1 de angiotensina II (AGTR1) en el que puede
existir el polimorfismo A1166C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtggctttg ctttgtcttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 147
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor B2 de bradikinina (BDKRB2) en el que puede existir
el polimorfismo C-58T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagcaatgtc tggcttctcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 148
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor B2 de bradikinina (BDKRB2) en el que puede existir
el polimorfismo C-58T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagggagag aacatttgga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 149
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen angiotensinógeno (AGT) en el que puede existir el
polimorfismo Met235Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggctgtgac aggatggaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen angiotensinógeno (AGT) en el que puede existir el
polimorfismo Met235Thr
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggtcacc aggtatgtcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C9(CYP2C9) en el que puede existir el
polimorfismo C430T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgggatct ccctcctagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 152
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C9 (CYP2C9) en el que puede existir el
polimorfismo C430T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacccttgg tttttctcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C9 (CYP2C9) en el que pueden existir los
polimorfismos A1075C, T1076C y C1080G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacatgccc tacacagatg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C9 (CYP2C9) en el que pueden existir los
polimorfismos A1075C, T1076C y C1080G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgaaaacat ggagttgcag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 155
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el gen
citocromo P450 2C9 (CYP2C9) en el que puede existir el polimorfismo
812delA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccgggaactc acaacaaatt a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el gen
citocromo P450 2C9 (CYP2C9) en el que puede existir el polimorfismo
812delA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaaattca caagcagtca ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 31G>A, 100C>T y 138insT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggtatggg gctagaagca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 31G>A, 100C>T y 138insT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 158
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctggtcga agcagtatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 883G>C, 1023C>T y 1039C>T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 159
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatcctggct tgacaagagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 160
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 883G>C, 1023C>T y 1039C>T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 160
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcccacggaa atctgtctct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 1659G>A, 1661G>C, 1707T>del, 1758G>A y
1758G>T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 161
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggggctaa tgccttcat
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 1659G>A, 1661G>C, 1707T>del, 1758G>A y
1758G>T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 162
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcccagtt cccgcttt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que puede existir los polimorfismos
1846G>A y 1863ins9bp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 163
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgggtgatg ggcagaag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 164
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que puede existir los polimorfismos
1846G>A y 1863ins9bp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 164
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagggtcgtc gtactcgaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que puede existir el polimorfismo
1973insG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 165
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagccgtgagc aacgtgat
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que puede existir el polimorfismo
1973insG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 166
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgcagagac tcctcggtct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 para detectar los polimorfismos
2539delAACT, 2549A>del y 2613delAGA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 167
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaggtccta cgcttccaaa
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 168
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 para detectar los polimorfismos
2539delAACT, 2549A>del y 2613delAGA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 168
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgcactgg tccaaccttt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 169
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 2850C>T y 2935A>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 169
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaaccctga gagcagctt
\hfill19
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 170
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 2850C>T y 2935A>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 170
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgtcccag caaagttcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 171
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 3183G>A, 3198C>G y 3277T>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 171
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggcaaga aggagtgtca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 172
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 3183G>A, 3198C>G y 3277T>C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 172
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatgtcacg ggatgtcata
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 173
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 4042G>A y 4125insGTGCCCACT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 173
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtcttgc aggggtatca
\hfill20
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<210> 174
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2D6 en el que pueden existir los
polimorfismos 4042G>A y 4125insGTGCCCACT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 174
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaccaggaa agcaaagaca
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 175
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C8 (CYP2C8) en el que pueden existir los
polimorfismos C792G y A805T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 175
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C8 (CYP2C8) en el que pueden existir los
polimorfismos C792G y A805T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 176
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgtttagt gcaggcccat a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C8 (CYP2C8) en el que puede existir el
polimorfismo G416A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcacaacct tgcggaattt
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C8 (CYP2C8) en el que puede existir el
polimorfismo G416A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcaaatct ccctccacca
\hfill20
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<210> 179
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C8 (CYP2C8) en el que puede existir el
polimorfismo A1196G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctgctgag aaaggcatga
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 180
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C8 (CYP2C8) en el que puede existir el
polimorfismo A1196G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttccagggca caaccataat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 181
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que
pueden existir los polimorfismos 191G>A y 282C>T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 181
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggagtt gggcttagag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 182
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que
pueden existir los polimorfismos 191G>A y 282C>T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgccagt gctgtatttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 183
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo T341C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtgtctcc aggtcaatca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo T341C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctgatcct tcccagaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo C481T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgacggcagg aattacattg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo C481T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtttcttct ttggcaggag a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo A803G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgtttggt gggcttcatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo A803G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtttgggc acgagattt
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo G590A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
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\hskip-.1em\dddseqskipcctgccaaag aagaaacacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo G590A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgaagccc accaaacagt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo G857A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactgtttggt gggcttcatc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen n-acetiltransferasa 2 (NAT2) en el que puede
existir el polimorfismo G857A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggtgataca tacacaaggg ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo G636A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccctgtgat cccactttca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo G636A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtacttcag ggcttggtca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que pueden existit los
polimorfismos C680T Y G681A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaccagagc ttggcatatt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que pueden existit los
polimorfismos C680T Y G681A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaaagtcccg agggttgttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo A1G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtgggcct aggtgattgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo A1G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttccaatca ctgggagagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 199
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo IVS5+2T>A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 199
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaccctcgg gactttattg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 200
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo IVS5+2T>A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagcattac tccttgacct gtt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo T358C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 201
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccagtgtca gcttcctctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo T358C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcctcaatg ctcctcttcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo G431A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 203
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatcgtttt cagcaatgga a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 204
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo G431A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 204
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatgttcac ccacccttgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 205
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo C1297T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaccgaaca gttcttgcat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 206
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 2C19 (CYP2C19) en el que puede existir el
polimorfismo C1297T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcaaggtcc tttgggtcaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 207
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen receptor de glutamatérgico ionotrópico
N-metil D-aspartato (NMDA) 2B
(GRIN2B) en el que puede existir el polimorfismo C2664T
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 207
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaggatgtt ggagtgtgtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 208
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen receptor de glutamatérgico ionotrópico
N-metil D-aspartato (NMDA) 2B
(GRIN2B) en el que puede existir el polimorfismo C2664T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 208
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcaattattg gtgggagagt g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 209
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen glicoproteína P (ABCB1) en el que puede existir el
polimorfismo C3435T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 209
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctcccagg ctgtttattt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 210
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen glicoproteína P (ABCB1) en el que puede existir el
polimorfismo C3435T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 210
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttttcagc tgcttgatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen tiopurinmetiltransferasa (TPMT) en el que puede existir el
polimorfismo A719G
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 211
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttgatgct tttgaagaac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 212
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen tiopurinmetiltransferasa (TPMT) en el que puede existir el
polimorfismo A719G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 212
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatccattac attttcaggc ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 213
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen tiopurinmetiltransferasa (TPMT) en el que puede existir el
polimorfismo G238C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaacttttg tggggatatg ga
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen tiopurinmetiltransferasa (TPMT) en el que puede existir el
polimorfismo G238C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 214
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccctctat ttagtcattt gaaaaca
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa
(MTHFR) en el que puede existir el polimorfismo C677T
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 215
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccctgtggt ctcttcatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 216
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa
(MTHFR) en el que puede existir el polimorfismo C677T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 216
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaagcggaa gaatgtgtca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 217
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen butirilcolinesterasa (BCHE) en que el puede existir el
polimorfismo Asp70Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 217
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagccacag tctctgacca a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen butirilcolinesterasa (BCHE) en que el puede existir el
polimorfismo Asp70Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 218
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtgctggaa tccatacatt t
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 219
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen butirilcolinesterasa (BCHE) en el que puede existir el
polimorfismo Ala539Thr
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 219
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaaaatgg cttttgtatt cg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen butirilcolinesterasa (BCHE) en el que puede existir el
polimorfismo Ala539Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 220
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatttttcc agtccatcat gt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A4 (CYP3A4) en el que puede existir el
polimorfismo A-392G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 221
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggggagga aatggttaca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 222
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A4 (CYP3A4) en el que puede existir el
polimorfismo A-392G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 222
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagccatt ggcataaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo A-163C
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 223
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagagccag cgttcatgtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 224
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo A-163C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 224
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgatgcgtg ttctgtgctt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 225
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo A-3860G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 225
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagtgcagtg gtgcgatct
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 226
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo A-3860G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 226
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaggccagg agttcaagac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 227
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo G3534A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 227
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtggaggta ggagcaacac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 228
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo G3534A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctgaacc tgcacacatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 229
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo C558A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 229
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctcatcctc ctgctacctg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 230
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 1A2 (CYP1A2) en el que puede existir el
polimorfismo C558A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 230
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggcagtct ccacgaactc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 231
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo G14690A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 231
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcctacagca tggatgtga
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 232
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo G14690A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 232
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggaattgta ccttttaagt gga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 233
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo C3699T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 233
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcacaatccc tgtgacctga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 234
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo C3699T
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 234
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcatttt tactgatgga
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 235
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo G19386A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 235
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgaaaccacc agcagtgttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo G19386A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 236
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaattctcc tggggagtgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 237
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo T29753C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 237
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctaaca tgtaactctg tgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 238
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo T29753C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 238
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptttgaaggag aagttctgaa gga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 239
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo G6986A
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 239
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacccagctt aacgaatgct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 240
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen citocromo P450 3A5 (CYP3A5) en el que puede existir el
polimorfismo G6986A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 240
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggaagcc agactttgat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen transportador de serotonina (SLC6A4) en el que puede existir
el polimorfismo deleción de 44 pb en el promotor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 241
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacccctaatg tccctactgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 242
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen transportador de serotonina (SLC6A4) en el que puede existir
el polimorfismo deleción de 44 pb en el promotor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 242
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagatcctg ggagaggtg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen glutation S-transferasa M3 (GSTM3) en el que
puede existir el polimorfismo delAGA (alelo*B)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 243
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttctggggaa attctcatgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen glutation S-transferasa M3 (GSTM3) en el que
puede existir el polimorfismo delAGA (alelo*B)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 244
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcaggtttgg gaactcatcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen glutation S-transferasa M1 (GSTM1) en el que
puede existir el polimorfismo alelo nulo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 245
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggtttgca ggaaacaagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen glutation S-transferasa M1 (GSTM1) en el que
puede existir el polimorfismo alelo nulo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 246
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagcgggag atgaagtcct
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen glutation S-transferasa n1 (GSTT1) en el que
puede existir el polimorfismo alelo nulo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 247
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcagcataa gcaggacttc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 248
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen glutation S-transferasa n1 (GSTT1) en el que
puede existir el polimorfismo alelo nulo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 248
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgctcgag gacaagttcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen apolipoproteina E (APOE) en la que pueden existir los
polimorfismos Arg158Cys y Cys112Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 249
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcacggctgt ccaagga
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 250
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen apolipoproteina E (APOE) en la que pueden existir los
polimorfismos Arg158Cys y Cys112Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 250
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgggccccg gcctggt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 251
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen tumor necrosis factor (TNF) en el que puede exisitr el
polimorfismo G-308A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 251
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacctggtccc caaaagaaat
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen tumor necrosis factor (TNF) en el que puede exisitr el
polimorfismo G-308A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 252
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagttgggg acacacaagc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 253
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 1 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 10 (IL10) en el que puede existir el
polimorfismo G-1082A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 253
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacacacaca cacaaatcca ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 254
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220> ADN sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligo 2 para amplificar el fragmento
del gen interleucina 10 (IL10) en el que puede existir el
polimorfismo G-1082A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 254
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatggggtgg aagaagttga
\hfill20
Claims (13)
1. Un método in vitro, extracorpóreo,
para el genotipado simultáneo de múltiples variaciones génicas
humanas presentes en uno o más genes de un sujeto, que
comprende:
- -
- extraer el ácido nucleico de una muestra biológica procedente de un sujeto;
- -
- amplificar regiones de dicho ácido nucleico que contienen las variaciones génicas a identificar, y, opcionalmente, marcar dichos productos de amplificación durante la reacción de amplificación, para obtener unos productos de amplificación, opcionalmente marcados, que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- someter dichos productos de amplificación a una reacción de fragmentación para obtener unos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar, y, en caso de que dichos productos de amplificación no hubieran sido marcados previamente en la etapa de amplificación, marcar dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar;
- -
- poner en contacto dichos productos de fragmentación que contienen las variaciones génicas a identificar con sondas capaces de identificar mediante hibridación las variaciones génicas correspondientes, bajo condiciones que permiten la hibridación de dichos productos de fragmentación con dichas sondas, en donde dichas sondas están depositadas en un soporte y, por cada variación génica a caracterizar, se usan 4 sondas que se depositan en dicho soporte siguiendo un patrón determinado de forma que se hallen homogéneamente distribuidas pero no agrupadas por variación génica a caracterizar, de las cuales 2 sondas detectan una variación génica y las otras 2 sondas detectan otra variación génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas es de 10, 8 ó 6 réplicas;
- -
- introducir, tras la hibridación, dicho soporte en un escáner y cuantificar la intensidad de los puntos en donde se ha producido la hibridación; y
- -
- genotipar cada una de las variaciones génicas a partir de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de cada una de las 4 sondas, en la que se eliminan los valores extremos, mediante la aplicación de un algoritmo que permite detectar cada una de las variaciones génicas con una sensibilidad, especificidad y reproducibilidad tales que permiten la aplicación clínica del método, en base a que conduce a la obtención de tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles.
2. Método según la reivindicación 1, en donde
dicho ácido nucleico es DNA o RNA.
3. Método según la reivindicación 2, en donde
dicho ácido nucleico es RNA o un fragmento del mismo que se utiliza
como molde para obtener el correspondiente cDNA.
4. Método según la reivindicación 1, en donde
tras la etapa de hibridación se procede a una reacción de
amplificación mediante "primer extensión" o a una reacción de
ligación mediante un ensayo de ligación de oligonucleótidos
("OLA").
5. Método según la reivindicación 1, en el que
cada una de dichas 4 sondas para la detección de cada variación
génica presentan la base a interrogar en la posición central y
tiene una longitud comprendida entre 19 y 27 nucleótidos.
6. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho algoritmo es un algoritmo basado en la obtención de tres
Funciones Lineales que caracterizan a cada uno de los tres
genotipos posibles:
- AA
- Función 1
- AB
- Función 2
- BB
- Función 3
en
donde
- \quad
- AA representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica A;
- \quad
- AB representa el genotipo de un sujeto heterocigoto para las variación génica A y B; BB representa el genotipo de un sujeto homocigoto para la variación génica B;
- \quad
- Función 1 es la Función Lineal que caracteriza a los pacientes con el genotipo AA y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- \quad
- Función 2 es la Función Lineal para el genotipo AB y consiste en una combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- \quad
- Función 3 es la Función Lineal para el genotipo BB y consiste en una: combinación lineal de las variables ratio 1 y ratio 2;
- \quad
- en donde dichas combinaciones lineales están formadas por constantes y cofactores que acompañan a las variables ratio 1 y ratio 2;
- \quad
- Ratio 1 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 1 que detecta la variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 2 que detecta la variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Ratio 1 =
\frac{Intensidad \ media \ sonda \ 1}{Intensidad \ media \ sonda \
1 \ + \ Intensidad \ media \ sonda \
2}
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- Ratio 2 es la proporción de la media acotada de las intensidades de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta la variación génica A dividido por la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 3 que detecta variación génica A más la media acotada de las 10, 8 ó 6 réplicas de la sonda 4 que detecta variación génica B y puede calcularse mediante la ecuación:
Ratio 2
\frac{Intensidad \ media \ sonda \ 3}{Intensidad \ media \ sonda \
3 \ + \ Intensidad \ media \ sonda \
4}
\vskip1.000000\baselineskip
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el genotipado de dichas variaciones génicas comprende:
- -
- en primer lugar, restar a los valores absolutos de intensidad de todas las sondas su propio ruido de fondo;
- -
- a continuación, se agrupan las réplicas correspondientes a cada una de las 4 sondas que se han usado para caracterizar cada mutación;
- -
- el valor medio de intensidad para cada una de las 4 sondas se calcula usando la media acotada de las réplicas para eliminar los puntos aberrantes;
- -
- conocidos los valores medios de intensidad para cada una de las sondas se calculan los ratios 1 y 2, según las ecuaciones definidas en la reivindicación anterior y dichos ratios se sustituyen en tres funciones lineales que caracterizan a cada uno de los tres genotipos posibles AA, AB y BB definidos en dicha reivindicación anterior; y
- -
- la función que presenta un valor absoluto mayor determina el genotipo que presenta el sujeto en relación con la variación génica analizada.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según la reivindicación 6 ó 7, en el
que la obtención de dichas funciones lineales se lleva a cabo
mediante el análisis de 5 pacientes por cada uno de los tres
posibles genotipos de la variación génica AA, AB, BB; con los
resultados, se calculan los ratios 1 y 2 para los 15 pacientes, los
cuales sirven como variables de clasificación de los tres grupos en
un análisis discriminante; y, en caso de que la capacidad de
discriminación no sea del 100%, los oligonucleótidos son
rediseñados.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que los ratios 1 y 2 están dentro del
rango de los ratios usados para construir los grupos, la intensidad
de fluorescencia media de las 4n réplicas (donde "n" es 6, 8 ó
10) con respecto al ruido de fondo es mayor de 5, determinado
mediante el empleo de un escáner de fluorescencia confocal, y el
coeficiente de variación de las réplicas está por debajo de
0,25.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 8, en el que, cuando se utiliza un escáner de
fluorescencia confocal:
- a)
- la relación de la intensidad frente al ruido de fondo de todas las sondas depositadas en el soporte está por encima de 15;
- b)
- la media de todos los ratios es superior a 0,6;
- c)
- el coeficiente de variación de todas las réplicas es inferior a 0,25;
- d)
- el ratio del control externo es superior a 0,6; y
- e)
- el control negativo es igual o inferior a 3 veces el ruido de fondo.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, para el genotipado simultáneo,
sensible, específico y reproducible de múltiples variaciones
génicas humanas asociadas con la enfermedad inflamatoria intestinal
(IBD), o asociadas con antígenos eritrocitarios, o asociadas con
reacciones adversas a fármacos.
12. Un DNA-chip de genotipado
adecuado para la puesta en práctica de un método in vitro,
extracorpóreo, para el genotipado simultáneo de múltiples
variaciones génicas humanas presentes en uno o más genes de un
sujeto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que
comprende un soporte sobre el que están depositadas una pluralidad
de sondas útiles para detectar variaciones génicas humanas
presentes en uno o más genes, en donde, por cada variación génica a
detectar, hay 4 sondas, de las cuales 2 sondas detectan una primera
variación génica y las otras 2 detectan una segunda variación
génica, en donde el número de réplicas de cada una de dichas sondas
es de 10, 8 ó 6 réplicas, depositadas siguiendo una patrón
determinado y distribuidas homogéneamente entre las 2 áreas que
constituyen el DNA-chip pero no agrupadas por
variación génica a detectar, y, opcionalmente, unos
oligonucléotidos depositados sobre el soporte útiles como controles
positivos y negativos de las reacciones de hibridación.
13. Un kit adecuado para la puesta en práctica
de un método in vitro, extracorpóreo, para el genotipado
simultáneo de múltiples variaciones génicas humanas presentes en uno
o más genes de un sujeto según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 11, que comprende:
- -
- un DNA-chip según cualquiera de la reivindicación 12;
- -
- un protocolo de detección de dichas variaciones génicas, basado en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende el empleo de un algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación de dicho método; y, opcionalmente,
- -
- un software informático que facilita, automatiza y asegura la reproducibilidad de la aplicación de dicho algoritmo para la interpretación de los datos generados con la aplicación del método de la invención.
Priority Applications (9)
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|---|---|---|---|
| ES200502423A ES2326708B1 (es) | 2005-10-05 | 2005-10-05 | Metodos y productos para genotipado in vitro. |
| MX2007008506A MX2007008506A (es) | 2005-01-13 | 2006-01-12 | Metodos y productos para genotipificacion in vitro. |
| PCT/IB2006/000796 WO2006075254A2 (en) | 2005-01-13 | 2006-01-12 | Methods and products for in vitro genotyping |
| EP06727428.2A EP1836322B8 (en) | 2005-01-13 | 2006-01-12 | Methods and products for in vitro genotyping |
| AU2006205571A AU2006205571B2 (en) | 2005-01-13 | 2006-01-12 | Methods and products for in vitro genotyping |
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| US11/813,646 US7914990B2 (en) | 2005-01-13 | 2006-01-12 | Methods and products for in vitro genotyping |
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|---|---|
| ES2326708A1 ES2326708A1 (es) | 2009-10-16 |
| ES2326708B1 true ES2326708B1 (es) | 2010-09-30 |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2326708B1 (es) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2319939A3 (en) * | 1999-10-21 | 2012-09-26 | Case Western Reserve University | Gene expression profiling of inflammatory bowel disease |
-
2005
- 2005-10-05 ES ES200502423A patent/ES2326708B1/es active Active
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CHEE M. et al. "{}ACCESSING GENETIC INFORMATION WITH HIGH-DENSITY DNA ARRAYS"{}. SCIENCE. 25.10.1996. Vol. 274. Páginas 610-614. ISSN 0036-8075. * |
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| KOZAL M J. et al. "{}EXTENSIVE POLYMORPHISMS OBSERVED IN HIV-1 CLADE B PROTEASE GENE USING HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE ARRAYS"{}. NATURE MEDICINE. 01.07.1996. Vol. 2. N$^{o}$. 7. Páginas 753-759. ISSN 1078-8956. * |
| SAPOLSKY R. J.et al. "{}High-throughput polymorphism screening and genotyping with high-density oligonucleotide arrays"{}. GENETIC ANALYSIS: BIOMOLECULAR ENGINEERING. 01.02.1999. Vol. 14. N$^{o}$ 5-6. Páginas 187-192. ISSN 1050-3862. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2326708A1 (es) | 2009-10-16 |
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| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20091016 Kind code of ref document: A1 |
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Ref document number: 2326708B1 Country of ref document: ES |