ES2356880B1 - Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la prote�?na apo2l/trail. - Google Patents
Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la prote�?na apo2l/trail. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2356880B1 ES2356880B1 ES200930618A ES200930618A ES2356880B1 ES 2356880 B1 ES2356880 B1 ES 2356880B1 ES 200930618 A ES200930618 A ES 200930618A ES 200930618 A ES200930618 A ES 200930618A ES 2356880 B1 ES2356880 B1 ES 2356880B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- apo2l
- trail
- liposome
- document
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 101100369992 Homo sapiens TNFSF10 gene Proteins 0.000 title claims description 261
- 102100024598 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Human genes 0.000 title claims description 115
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 33
- 108700012411 TNFSF10 Proteins 0.000 claims abstract description 212
- 102000046283 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Human genes 0.000 claims abstract description 211
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 59
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 32
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 20
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 17
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 claims description 11
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 9
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 7
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 7
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 3
- ACGUYXCXAPNIKK-UHFFFAOYSA-N hexachlorophene Chemical compound OC1=C(Cl)C=C(Cl)C(Cl)=C1CC1=C(O)C(Cl)=CC(Cl)=C1Cl ACGUYXCXAPNIKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 7
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 claims 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 claims 1
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 claims 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 109
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 48
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 34
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 18
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 17
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 17
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 15
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 11
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 10
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 10
- -1 that is Chemical class 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 9
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 9
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 9
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 7
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 7
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 5
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 5
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 4
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000010565 Apoptosis Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010063104 Apoptosis Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150017888 Bcl2 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000610605 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 102100040113 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10A Human genes 0.000 description 2
- 230000006786 activation induced cell death Effects 0.000 description 2
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 231100000334 hepatotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003082 hepatotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 125000002730 succinyl group Chemical group C(CCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 206010003011 Appendicitis Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100025027 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM69 Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101000830565 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000911513 Homo sapiens Uncharacterized protein FAM215A Proteins 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010023567 Labyrinthitis Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010315 Mastoiditis Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 description 1
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 206010030216 Oesophagitis Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 208000005141 Otitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000031845 Pernicious anaemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000007048 Polymyalgia Rheumatica Diseases 0.000 description 1
- 206010036105 Polyneuropathy Diseases 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010090931 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000013535 Proto-Oncogene Proteins c-bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010038910 Retinitis Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108091005956 Type II transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026728 Uncharacterized protein FAM215A Human genes 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910052768 actinide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001255 actinides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940086745 ampicillin 100 mg/ml Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229940015342 chloramphenicol 50 mg/ml Drugs 0.000 description 1
- 201000001352 cholecystitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 150000004696 coordination complex Chemical class 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 208000019258 ear infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006881 esophagitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000044949 human TNFSF10 Human genes 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 201000004614 iritis Diseases 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 201000001231 mediastinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 206010034674 peritonitis Diseases 0.000 description 1
- 150000008103 phosphatidic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000008105 phosphatidylcholines Chemical class 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 229940067605 phosphatidylethanolamines Drugs 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 229940067626 phosphatidylinositols Drugs 0.000 description 1
- 150000008106 phosphatidylserines Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 208000019629 polyneuritis Diseases 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 201000006845 reticulosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000029922 reticulum cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 201000009890 sinusitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000008409 synovial inflammation Effects 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 210000003905 vulva Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
- A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Hematology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL.#La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o decorado, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL y a su uso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente, para el tratamiento de un cáncer o de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la artritis reumatoide.
Description
Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL.
La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología y la medicina. Específicamente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o decorado, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAILyasuuso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente, para el tratamiento de un cáncer o de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la artritis reumatoide.
Estado de la técnica anterior
APO2L/TRAIL es una proteína de la familia del TNF (Tumor Necrosis Factor) que actúa como ligando mortal induciendo la muerte celular al activar la vía extrínseca de la apoptosis (Pitti et al. 1996. J Biol Chem 271: 1268790; Wiley et al. 1995. Immunity 3: 673-82). APO2L/TRAIL es capaz de inducir la apoptosis de las células tumorales sin afectar a las células normales. Esta observación ha propiciado que la vía de señalización de esta molécula tenga un gran potencial terapéutico en el tratamiento del cáncer (Mitsiades et al. 2001. Blood 98: 795-804; Marini et al. 2006. Oncogene 25: 5145-54; Mitsiades et al. 2001. Expert Opin Investig Drugs 10: 1521-30; Duiker et al. 2006. Eur J Cancer 42: 2233-40; Daniel et al. 2007. Blood 110: 4037-46; Xu et al. 2003. World J Gastroenterol 9: 1241-5). El uso de diversas formas recombinantes de APO2L/TRAIL en ensayos preclínicos para inducir la apoptosis de células tumorales, bien en monoterapia, bien en combinación con otras terapias, ha sido descrito en las solicitudes de patente con número de publicación EP1957529, US6444640, CA2544923, WO9701633, WO02069995 o WO03028001. De hecho, su uso para el tratamiento de diversas neoplasias malignas se está evaluando actualmente en diversos ensayos clínicos (Johnstone et al. Nat Rev Cancer. 2008 Oct; 8:782-98).
APO2L/TRAIL también ha sido implicado en el proceso denominado muerte celular inducida por activación (AICD, del inglés, Activation Induced Cell Death) mediante el cual los linfocitos T activados que se generan durante una respuesta inmune son eliminados para recuperar la homeostasis (Anel et al. 2007. Front Biosci 12: 207484; Bosque et al. 2008. J Leukoc Biol 84:488-98; Bosque et al. 2005. J Leukoc Biol 77: 568-78; Bosque A et al. 2005 Eur J Immunol 35: 1812-21; Martinez-Lorenzo et al. 1998. Eur J Immunol 28: 2714-25). La implicación de APO2L/TRAIL en fenómenos de regulación del sistema inmune y en la patogénesis de las enfermedades autoinmunes ha sido corroborada en los estudios realizados en el ratón KO para APO2L/TRAIL (Lamhamedi-Cherradi et al. 2003. Nat Immunol 4: 255-60). La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad de base autoinmune en la que el sistema inmune ataca y destruye fundamentalmente las articulaciones. Se cree que una apoptosis defectiva podría contribuir a la perpetuación de los linfocitos T activados presentes en el líquido sinovial, responsables de la destrucción articular característica de la AR. Por ejemplo, aunque los linfocitos T activados presentes en el líquido sinovial de pacientes con AR son sensibles a la muerte celular inducida por APO2L/TRAIL, parece existir en el líquido sinovial de estos pacientes un defecto en la secreción de APO2L/TRAIL asociado a exosomas (Martinez-Lorenzo et al. 2007. Clin Immunol 122: 28-40). El uso de APO2L/TRAIL recombinante también puede ser una terapia efectiva para el tratamiento de la AR (Yao et al. 2006. Arthritis Res Ther 8: R16; solicitud de patente con número de publicación WO0122987).
Por otra parte, los liposomas son vesículas lipídicas utilizadas como sistemas de almacén o de transporte de fármacos para el tratamiento de diversas enfermedades como, por ejemplo, el cáncer o la AR. La unión de ligandos a la superficie de los liposomas que favorezcan la vectorización de los liposomas hacia células diana también es conocida (Samad et al. 2007. Curr Drug Deliv 4: 297-305; Schwendener. 2007. Adv Exp Med Biol 620: 117-28; Metselaar et al. 2004. Ann Rheum Dis 63: 348-53; Ceponis et al. 2001. Arthritis Rheum 44: 1908-16; Trif et al. 2007. J Liposome Res 17: 237-48).
Por tanto, el uso de APO2L/TRAIL recombinante es una aproximación terapéutica útil en el tratamiento del cáncer, así como de enfermedades inflamatorias o autoinmunes como, por ejemplo, la AR. No obstante, el desarrollo de compuestos que potencien su actividad terapéutica y/o disminuir la dosis terapéutica necesaria permitiría mejorar significativamente la eficacia del tratamiento y/o la calidad de vida de los pacientes.
Explicación de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o decorado, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAILyasuuso para la elaboración de un medicamento, preferiblemente, para el tratamiento de un cáncer o de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la artritis reumatoide.
Los autores de la presente invención han generado liposomas artificiales de características similares a las de los exosomas naturales secretados por las células en lo que se refiere a su composición lipídica y tamaño, a los cuales se les ha incorporado la proteína APO2L/TRAIL bioactiva en su superficie (LUV-APO2L/TRAIL).
En estudios de citotoxicidad realizados in vitro sobre distintas líneas celulares tumorales se ha podido comprobar que la capacidad de inducir muerte celular es mayor con LUV-APO2L/TRAIL que con APO2L/TRAIL soluble. Concretamente, la concentración inhibitoria media es unas 5 veces menor en el caso de los liposomas decorados con APO2L/TRAIL respecto a la proteína soluble como media de las líneas celulares tumorales analizadas.
Por otra parte, utilizando un modelo animal de artritis inducida por antígeno (AIA) se ha demostrado que la inyección intra-articular de LUV-APO2L/TRAIL es capaz de reducir la inflamación de las articulaciones afectadas de artritis de manera más eficaz que cuando se inyecta la proteína APO2L/TRAIL soluble.
APO2L/TRAIL es una proteína transmembrana de tipo II perteneciente a la superfamilia del TNF. La proteína APO2L/TRAIL de Homo sapiens tiene 281 aminoácidos y su número de acceso del Genebank es NP003801.1 (SEQ ID: 3). Consta de un dominio intracelular (aminoácidos 1-17), un dominio transmembrana (aminoácidos 18-38) y un dominio extracelular (aminoácidos 39-281; SEQ ID: 2). Este dominio extracelular puede ser liberado al medio, pudiendo así aparecer de forma soluble. Se han generado varias proteínas recombinantes de APO2/TRAIL soluble con diferentes tamaños, que contienen, por ejemplo, los aminoácidos 91-281, 95-281 ó 114-281 (SEQ ID: 1). Estas proteínas recombinantes se han empleado para estudiar la relación entre la estructura y la función de APO2L/TRAIL. Además, estas proteínas recombinantes de APO2/TRAIL solubles están siendo comercializadas por diferentes casas comerciales como, por ejemplo, Calbiochem® con número de catálogo 616376, Bender MedSystems® con número de catálogo BMS356, Prepotech® con número de catálogo 310-4, Biovisión, Inc. con número de catálogo 4354-50, Cell Sciences® con número de catálogo CRT500 o Chemicon® GF092.
Un primer aspecto de la presente invención, que de ahora en adelante denominaremos “composición de la invención”, se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o “decorado”, al menos, con la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2 o cualquiera de sus variantes o porciones de las mismas biológicamente activas.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término “variante” se refiere a una proteína sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente a la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no alteren sustancialmente su función. El término “variante” incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación o fosforilación.
Tal como aquí se utiliza, una proteína es “sustancialmente homologa” a la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2, cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID: 2, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID:2, de, al menos, un 60%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias homologas a la secuencia de la SEQ ID: 2 pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Los términos “biológicamente activa” o “funcionalmente equivalente”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier variante de la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2, a cualquier porción de la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2 o a cualquier porción de una variante de la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2 que, bien de manera soluble, bien formando parte de la composición de la invención, mantiene su función relacionada con la capacidad de inducir apoptosis. Algunos métodos de análisis de la apoptosis son, por ejemplo, pero sin limitarse, análisis morfológico de la condensación y/o fragmentación de la cromatina y los cuerpos apoptóticos, ensayos de detección de la fragmentación del DNA, análisis de proteasas inducidas por apoptosis (PARP
o caspasa 3), métodos basados en la tinción del DNA (DAPI o ioduro de propicio), análisis de alteraciones de membrana (Anexina V), análisis de la capacidad celular para reducir MTT, técnicas de mareaje in situ (TUNEL o ISEL) o detección de proteínas relacionadas con la apoptosis (Fas, Apo-1, CD59 o p53). Por ejemplo, la capacidad de inducir apoptosis se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en los Ejemplos que acompañan a esta descripción.
El término “porción” se refiere a un fragmento de la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID:2oaun fragmento de una variante de la misma. En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto o “decorado”, al menos, con una porción biológicamente activa de la proteína que presenta una identidad de, al menos, un 80% con la SEQ ID NO: 1, preferiblemente de, al menos, un 90%, más preferiblemente de, al menos, un 95% y de, aún más preferiblemente, un 100%. Las secuencias homologas a la secuencia de la SEQ ID: 1 pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias.
Por tanto, los términos “liposoma decorado o recubierto con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL”
o “liposoma decorado o recubierto con la proteína APO2L/TRAIL” o “liposoma decorado o recubierto con APO2L/ TRAIL”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, a un liposoma que presenta unido a su superficie la proteína de secuencia aminoacídica SEQ ID: 2, cualquiera de sus variantes o porciones de las mismas biológicamente activas. Preferiblemente, dichos términos se refieren a una porción biológicamente activa de la proteína que presenta una identidad de, al menos, un 80% con la SEQ ID NO: 1, más preferiblemente de, al menos, un 90%, aún más preferiblemente de, al menos, un 95% y de, todavía aún más preferiblemente, un 100%.
Los liposomas son vesículas huecas que encapsulan parte del disolvente en el que se han preparado y cuya membrana esta formada por una o varias bicapas lipídicas. Han sido utilizados como sistemas de almacén o de transporte de fármacos para el tratamiento de diversas enfermedades como, por ejemplo, el cáncer o la AR. Sin embargo, en la presente invención se describe el uso terapéutico de los liposomas con una molécula anclada en su exterior con el fin de potenciar la bioactividad (en este caso aumentar la capacidad citotóxica) de la proteína APO2L/TRAIL, que actúa como ligando mortal induciendo la apoptosis de las células diana). De este modo, el propio liposoma decorado con la proteína APO2L/TRAIL se convierte en el tratamiento per se y no en un simple reservorio o modo de transporte del fármaco.
Los liposomas se pueden clasificar en función de su estructura y de su tamaño (Vanee y Vanee, 1996). Los liposomas multilaminares grandes (MLV) están formados por más de una bicapa, dispuestas en forma concéntrica y separadas entre sí por amplios espacios acuosos. Los liposomas unilaminares, en cambio, están formados por una única bicapa; se pueden clasificar asimismo según su tamaño en: liposomas unilaminares pequeños (SUV), cuando presentan un diámetro medio entre 25 y 40 nm, y liposomas unilaminares grandes (LUV), cuando presentan un diámetro medio entre 40 y 500 nm. Preferiblemente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un LUV con un diámetro de entre 100 nm y 200 nm.
Los liposomas se forman predominantemente a partir de compuestos anfifílicos, es decir, compuestos que se caracterizan por tener tanto un grupo hidrofílico (soluble en agua) como uno hidrofóbico (insoluble en agua) en la misma molécula. Los componentes estructurales más importantes de los liposomas son los fosfolípidos. Las propiedades de las vesículas liposomales van a depender, entre otros factores, de la naturaleza de los fosfolípidos constituyentes, de determinadas características tales como la carga de su grupo polar y/o la longitud y el grado de saturación de las cadenas de sus ácidos grasos. Algunos ejemplos de fosfolípidos usados son: fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos o esfingomielinas. Preferiblemente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma formado por, al menos, un fosfolípido seleccionado de entre: fosfatidilcolina y/o esfingomielina.
Además de los fosfolípidos, otros lípidos pueden formar parte de la composición de los liposomas. Pueden formar parte de los liposomas esteróles como, por ejemplo, pero sin limitarse, el colesterol o los ácidos biliares; esfingolípidos como, por ejemplo, pero sin limitarse, gangliósidos o cerebrósidos; o lípidos quelantes. Preferiblemente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma que comprende, al menos, un fosfolípido seleccionado de entre: fosfatidilcolina y/o esfingomielina, y que comprende, además, un esterol. Preferiblemente, el esteral es el colesterol.
Los liposomas pueden ser preparados mediante numerosos procedimientos conocidos en el estado de la técnica, como, por ejemplo, pero sin limitarse sonicación, extrusión, utilización de ciclos de congelación-descongelación o utilización de surfactantes.
La presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto con la proteína APO2L/ TRAIL. La porción soluble de la proteína APO2L/TRAIL puede estar unida directamente a los lípidos que constituyen el liposoma o a través de otra molécula que se encuentre integrada en el liposoma. Esta unión puede ser covalente, o mediante la formación de un compuesto de coordinación con un metal quelado. El metal puede estar quelado de tal manera que la unión mediante coordinación tenga lugar entre un grupo quelante presente en el liposoma y un grupo quelante presente en la proteína. Dichos grupos quelantes pueden ser partes quelantes de metales, como un lípido quelante de metales o una parte usada como una “etiqueta de afinidad por metales”.
Los términos “parte quelante” o “grupo quelante de metales” incluyen cualquier parte capaz de formar un complejo de coordinación con un metal iónico. El término “lípido quelante de metales”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un lípido que comprende una parte o un grupo quelante de metales como, por ejemplo, pero sin limitarse, ácido nitrilo triacético (NTA). En principio, puede ser incorporado cualquier metal que tenga sitios de coordinación libres que puedan unirse con elementos donantes de electrones del grupo quelante de metales. El ión metálico puede ser un ión de un metal de transición, un ión de un lantánido o un ión de un actínido. El metal puede ser seleccionado del grupo que comprende, por ejemplo, pero sin limitarse, cobre, níquel, zinc, hierro, cobalto, cadmio, manganeso o magnesio. Preferiblemente, el metal es níquel.
La expresión una “etiqueta de afinidad por metales”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una parte capaz de unirse mediante quelación a un ión metálico, e incluye, pero sin limitarse, secuencias aminoacídicas cortas, unidas a la proteína APO2L/TRAIL. La “etiqueta” puede ser adyacente al extremo amino-terminal de la proteína APO2L/TRAIL. Por ejemplo, pero sin limitarse, una “etiqueta de afinidad por el metal” común consiste en varios residuos de histidina. El aumento del número de residuos capaces de unirse al metal generalmente aumenta la afinidad de la unión. La proteína APO2L/TRAIL con una “etiqueta de afinidad por el metal” puede ser obtenida mediante diferentes técnicas de generación de proteínas recombinantes conocidas en el estado de la técnica, y la proteína resultante puede ser aislada y purificada mediante diferentes métodos conocidos en el estado de la técnica. Como consecuencia del proceso de generación de la proteína recombinante, ésta puede presentar una inserción de uno o más aminoácidos extra entre la etiqueta de afinidad y la porción soluble de la proteína APO2L/TRAIL.
Preferiblemente, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende un liposoma recubierto, al menos, con la proteína APO2L/TRAIL que tiene unido en su extremo N-terminal, al menos, 6 histidinas, y preferiblemente, al menos 10 hisitidinas, donde el liposoma comprende además un lípido quelante. Preferiblemente, el lípido quelante es 1,2,-dioleoil-sn-glicerol-3-{succinil[ácido N-(5-amino-1-carboxilpentil)]iminodiacético iminodiacético} funcionalizado con níquel (DOGS-NTA-Ni).
Por tanto, el compuesto de la invención contiene, preferiblemente, fosfatidilcolina, esfingomielina, colesterol y DOGS-NTA-Ni, donde la proporción de DOGS con respecto al peso total de lípidos es de, al menos, el 1%, más preferiblemente de, al menos, el 2,5% y aún más preferiblemente, de al menos el 5%. Siendo, por tanto, algunas composiciones válidas, por ejemplo, pero sin limitarse, 59%/30%/10%/1%, 57,5%/30%/10%/2,5% o 55%/30%/10%/5% de fosfatidilcolina, esfingomielina, colesterol y DOGS-NTA-Ni, respectivamente.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un cáncer. Los términos “tumor” o “tumoral”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a células transformadas que presentan un crecimiento incontrolado. Dependiendo de su posible evolución puede tratarse de un tumor benigno, que permanece en su lugar de inicio y no produce metástasis; o tumor maligno o cáncer, invasivo o que produce metástasis. Por tanto, el término “cáncer” o “canceroso” tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una alteración de las células tumorales que tienen capacidad de invadir tejidos o de producir metástasis en lugares distantes del tumor primario. Ejemplos de cáncer pueden ser, pero sin limitarse, de mama, de ovario, de útero, de cérvix, de vagina, de vulva, de colon, de vejiga, de próstata, de piel, de pulmón, de hígado, de esófago, de estómago, de páncreas, de tracto urinario, de tiroides, de riñón, de cerebro, sarcoma, plasmocitoma, mieloma, linfoma o leucemia. Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un cáncer perteneciente al siguiente grupo: cáncer de pulmón, de colon, de riñón, plasmocitoma, mieloma, linfoma, o leucemia. Más preferiblemente, la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un cáncer perteneciente al siguiente grupo: cáncer de pulmón, plasmocitoma, mieloma, linfoma, o leucemia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de las enfermedades inflamatorias o autoinmunes. El término “enfermedades inflamatorias” tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a aquellas en las que tienen lugar lesiones causadas por una reacción inmunitaria o una reacción inflamatoria del organismo. Algunos ejemplos de enfermedades inflamatorias son, por ejemplo, pero sin limitarse conjuntivitis, iritis, uveítis, retinitis, otitis, mastoiditis, rinitis, laberintitis, sinusitis, faringitis, tonsilitis, bronquitis, neumonía, bronconeumonía, pleuritis, mediastinitis, endocarditis, tromboflebitis, poliarteritis, nefritis, cistitis, estomatitis, esofaguitis, gastritis, colitis, apendicitis, hepatitis, colecistitis, pancreatitis, peritonitis, tiroiditis, dermatitis, encefalitis, meningitis, neuromielitis óptica, polineuritis, polimiositis, miositis osificante, osteoartritis o artritis reumatoide. Algunas enfermedades inflamatorias, como la artritis reumatoide, son trastornos de naturaleza autoinmune. Dentro del concepto “enfermedades autoinmunes” se engloban diferentes procesos patológicos que cursan con una respuesta inmunitaria contra el propio organismo. Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero sin limitarse, enfermedad de Crohn, anemia perniciosa, diabetes tipo I, enfermedad de Addison, enfermedad celíaca, enfermedad de Graves, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, esclerodermia, síndrome de Goodpasture, granulomatosis de Wegener, polimialgia reumática o artritis reumatoide. Preferiblemente, la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la artritis reumatoide.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “substancia activa”, “substancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” o “ingrediente farmacéuticamente activo” significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones. Ejemplos de soluciones no acuosas son, por ejemplo, pero sin limitarse, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, o ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Ejemplos de soluciones acuosas, son por ejemplo, pero sin limitarse, agua, soluciones alcohólicas en agua, o medios salinos. Las soluciones acuosas pueden estar tamponadas o no, y pueden tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, o similares, o nutrientes, incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes, tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes, tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes, tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes, tales como menta o salicilato de metilo.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, intraperitoneal, intravenoso, intramuscular, subcutáneo, intratecal, intraventricular, intraarticular, intratumoral, oral, enteral, parenteral, intranasal, ocular o tópica. Una vía de administración preferida de las composiciones y/o formulaciones del compuesto de la invención para la prevención o el tratamiento de un cáncer es la vía intratumoral. Una vía de administración preferida de las composiciones y/o formulaciones del compuesto de la invención para la prevención o el tratamiento de la artritis reumatoide es la vía intraarticular.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto o de la composición farmacéutica de la invención que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dicho compuesto o dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir. Los “adyuvantes” y “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la técnica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Figura 1. Muestra la expresión y purificación de APO2L/TRAIL recombinante. A. SDS-PAGE al 12% y tinción de azul de Coomassie de los distintos pasos de expresión y purificación de APO2L/TRAIL-His10:1-E. Coli BL21-CodonPlus® (DE3)-RP transformadas sin IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido); 2-E. Coli BL21-CodonPlus® (DE3)-RP transformadas y tratadas 18 horas con 1 mM IPTG; 3-Precipitado del extracto bacteriano diluido y dializado; 4-Extracto bacteriano diluido y dializado; 5-Sobrenadante del extracto tras incubar con la resina; 6-Lavado de la resina; 7-Eluido de la resina; 8-Marcadores de peso molecular. B. Western-blot de la fracción de elución de la resina revelado con el anticuerpo monoclonal Purified Mouse Anti-Human TRAIL, el anticuerpo monoclonal His-Tag® Monoclonal Antibody que reconoce la cola de histidinas incluida en el vector de expresión pET19b, y con un antisuero policlonal de conejo que reconoce APO2L/TRAIL generado previamente en nuestro laboratorio. Como control se ha revelado también la proteína recombinante APO2L.0 sin cola de histidinas (Genentech, San Diego, CA).
Figura 2. Muestra el análisis de la citotoxicidad de APO2L/TRAIL recombinante. La línea celular Jurkat clon E6.1 y la línea celular RPMI 8226 se incuban en ausencia (Control) o en presencia de 1.000 ng/mL o 100 ng/mL de APO2L/TRAIL-His-10 respectivamente. Tras 24 horas en ambos líneas celulares tumorales se observa la presencia de numerosas células de morfología típicamente apoptótica.
Figura 3. Muestra la unión de APO2L/TRAIL-His10 a los LUVs con DOGS-NTA-Ni. Se han generado LUVs con una proporción de DOGS-NTA-Ni del 5, 2,5, 1 y 0% (p/p) que se han incubado con la proteína APO2L/TRAIL-His10. Posteriormente se recolectan los LUVs-APO2L/TRAIL mediante ultracentrifugación y se realiza SDS-PAGE al 12% tomando alícuotas tanto de los pellets recolectados como de los sobrenadantes. El gel se tiñe con azul de Coomassie. 1-APO2L/TRAIL-His10 sin incubar con LUVs; 2 y 3-Pellet y sobrenadante de LUVs-APO2L/TRAIL con DOGS-NTA-Ni 5%; 4 y 5-Pellet y sobrenadante de LUVs-APO2L/TRAIL con DOGS-NTA-Ni 2,5%; 6 y 7-Pellet y sobrenadante de LUVs-APO2L/TRAIL con DOGS-NTA-Ni 1%; 8 y 9-Pellet y sobrenadante de LUVs-APO2L/TRAIL con DOGS-NTANi 0%. Stock: APO2L/TRAIL-His10; P: Pellet; S: Sobrenadante.
Figura 4. Muestra el análisis de la citotoxicidad de los LUVs-APO2L/TRAIL. La línea celular Jurkat clon E61 se incuba en presencia de 100 ng/mL de APO2L/TRAIL-His10, de 100 ng/mL de LUVs 5% Ni-APO2L/TRAIL presentes en el pellet obtenido tras la ultracentrifugación, de 100 ng/mL del sobrenadante o de LUVs 5% control que no se han incubado con APO2L/TRAIL-His10. Tras 24 horas se observa la presencia de numerosas células de morfología típicamente apoptótica cuando las células se han incubado con APO2L/TRAILHis10 y con LUVs 5% Ni-APO2L/TRAIL presentes en el pellet. En el caso del sobrenadante o de los LUVs control, no se observa apoptosis de las células Jurkat.
Figura 5. Muestra el análisis de la citotoxicidad in vitro de los LUVs-APO2L/TRAIL en Jurkat clon E6.1. Se ha analizado la capacidad de inducir muerte celular en la línea celular tumoral Jurkat clon E6.1 tanto de APO2L/TRAIL soluble como de los LUVs-APO2L/TRAIL. El ensayo de citotoxicidad se ha realizado incubando las células con las dosis de 1.000, 500, 250, 100, 50, 25 y 10 ng/mL durante 24 horas. A. Análisis mediante citometría de flujo para valorar la presencia de células Anexina-V positivas. B. Análisis con tinción con azul de Tripán. C. Análisis con una variante del método de Mossman de reducción del MTT (dimetil-tiazolil-tetrazoilo). Los resultados obtenidos se muestran como la media ± la desviación estándar de al menos dos experimentos.
Figura 6. Muestra el análisis de la citotoxicidad in vitro de los LUVs-APO2L/TRAIL en RPMI 8226. Se ha analizado la capacidad de inducir muerte celular en la línea celular tumoral RPMI 8226 tanto de APO2L/TRAIL soluble como de los LUVs-APO2L/TRAIL. El ensayo de citotoxicidad se ha realizado incubando las células con las dosis de 1.000, 500, 250, 100, 50, 25 y 10 ng/mL durante 24 horas. A. Análisis mediante citometría de flujo para valorar la presencia de células Anexina-V positivas. B. Análisis con tinción con azul de Tripán. C. Análisis con una variante del método de Mossman de reducción del MTT. Los resultados obtenidos se muestran como la media ± la desviación estándar de al menos dos experimentos.
Figura 7. Muestra el análisis de inhibición de la citotoxicidad in vitro con el anticuerpo bloqueante anti-APO2L/ TRAIL 5C2. Se ha realizado un ensayo de citotoxicidad en ausencia o en presencia del anticuerpo bloqueante anti-APO2L/TRAIL 5C2. Se ha empleado una dosis de 5C2 de 100 ng/mL cuando se ha incubado en presencia de APO2L/TRAIL soluble o de 1.000 ng/mL cuando se ha incubado con LUVs-APO2L/TRAIL. A. Jurkat clon E6.1.
B. RPMI 8226.
Figura 8. Muestra el análisis de citotoxicidad in vitro de los LUVs-APO2L/TRAIL en U266, IM-9, MM1.S, A549, U937 y U937-Bcl2 (proveniente de la línea parental U937 en la que se ha sobre-expresado la proteína anti-apoptótica Bcl2). Se ha analizado mediante citometría de flujo (células Anexina-V positivas) la capacidad de inducir muerte celular tanto de APO2L/TRAIL soluble como de los LUVs-APO2L/TRAIL. El ensayo de citotoxicidad se ha realizado incubando las células con las dosis de 1.000, 500, 100, 50 y 10 ng/mL durante 24 horas. A. Línea celular U266. B. Línea celular IM-9. C. Línea celular MM1.S. D. Línea celular A549. E. Línea celular U937. F. Línea celular U937-Bcl2.
Figura 9. Muestra el esquema temporal del protocolo empleado para la inducción de la AIA.
Figura 10. Muestra la inducción de la artritis inducida por antígeno (AIA) en conejos blancos New Zealand. A. La inyección i.a. con 5 mg de ovoalbúmina (OVA) induce correctamente la AIA en todas las rodillas de los 13 conejos blancos New Zealand (Grupo AIA). Tras 24 horas, se produce un aumento significativo en el diámetro latero-lateral de las rodillas que se mantiene hasta el día del sacrificio. En los 6 conejos en los que la inyección i.a. se hace con PBS (Grupo Control), no se produce un aumento significativo del diámetro latero-lateral de las rodillas. *** p<0,001. B. La AIA se produce de manera similar en ambas rodillas y en los 3 grupos de tratamiento. Los resultados obtenidos de la medición del diámetro latero-lateral de las rodillas se muestran como la media ± la desviación estándar de los animales de cada grupo.
Figura 11. Muestra el peso de los conejos tras la inducción de la AIA. La AIA produce una pérdida de peso en el grupo de 13 conejos blancos New Zealand (Grupo AIA) a los que se les ha inducido la artritis. * p<0,05; ** p<0,01. En el grupo de 6 conejos blancos New Zealand a los que no se les induce la AIA (Grupo Control) no se observa descenso del peso en el momento del sacrificio. Los resultados obtenidos de la medición del peso se muestran como la media ± la desviación estándar de los animales de cada grupo.
Figura 12. Muestra el análisis de la expresión del factor reumatoide tras la inducción de la AIA. La AIA produce un aumento del factor reumatoide (FR) en el grupo AIA de conejos blancos New Zealand a los que se les ha inducido la artritis respecto al grupo Control. ** p<0,01. Los resultados obtenidos de la medición del FR se muestran como la media ± la desviación estándar de los animales de cada grupo.
Figura 13. Muestra el efecto de los tratamientos (APO2L/TRAIL 5 μg) en la AIA en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. El día del sacrifico se mide el diámetro latero-lateral de todas las rodillas de todos los conejos. A. Las barras indican la media ± la desviación estándar de las rodillas no tratadas (barras blancas)ydelas rodillas tratadas (barras negras) en el grupo 1 (APO2L/TRAIL), grupo 2 (LUVs-APO2L/TRAIL) y grupo 3 (LUVs). *p<0,05. B. Las barras indican la media ± la desviación estándar de las rodillas no tratadas (barras blancas) y de las rodillas tratadas (barras negras) en el grupo control 4-1 (APO2L/TRAIL), grupo 4-2 (LUVs-APO2L/TRAIL) y grupo 4-3 (LUVs).
Figura 14. Muestra el efecto de los tratamientos en la AIA en cada conejo blanco New Zealand. De cada conejo se calcula la diferencia entre el diámetro latero-lateral de su rodilla tratada y su rodilla no tratada y se expresa en milímetros (mm). Conejos del grupo 1 (rombos negros, APO2L/TRAIL), grupo 2 (cuadrados negros, LUVs-APO2L/TRAIL), grupo 3 (triángulos negros, LUVs) y grupo 4 (círculos blancos, control). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001.
Figura 15. Muestra la ausencia de efecto sistémico hepatotóxico de los tratamientos en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. A. Tras la inducción de la AIA se produce un aumento transitorio de los niveles de alaninoaminotransferasa (ALT) en el suero de los conejos del grupo AIA debido a la inducción de la artritis y no a la cola de histidinas de APO2L/TRAI-His10.**p<0,01. B. Este aumento transitorio de la ALT se observa en los 3 grupos de tratamiento. En el grupo Control no se producen variaciones en los niveles séricos de ALT desde el inicio del experimento hasta el día del sacrificio. Los resultados obtenidos de la medición de la ALT se muestran como la media ± la desviación estándar de los animales de cada grupo.
Figura 16. Muestra el efecto de los tratamientos (APO2L/TRAIL 10 μg) en el diámetro latero-lateral de las rodillas en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. A. Experimento realizado en 10 conejos blancos New Zealand (Grupo 1, N=4; Grupo 2, N=4; Grupo 3, N=2). B. Experimento realizado en 13 conejos blancos New Zealand (Grupo 1, N=5; Grupo 2, N=5; Grupo 3, N=3). Las barras indican la media ± la desviación estándar de las rodillas no tratadas (barras blancas) y de las rodillas tratadas (barras blancas) en el grupo 1 (APO2L/TRAIL), grupo 2 (LUVs-APO2L/TRAIL) y grupo 3 (LUVs). * p<0,05; ** p<0,01.
Figura 17. Muestra el examen macroscópico de las rodillas en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. En la figura se muestra un ejemplo representativo de un conejo de cada grupo. A. Rodilla izquierda grupo 1 (no tratada).
B. Rodilla derecha grupo 1 (tratada con APO2L/TRAIL). C. Rodilla izquierda grupo 2 (no tratada). D. Rodilla derecha grupo 2 (tratada con LUVs-APO2L/TRAIL). E. Rodilla izquierda grupo 3 (no tratada). F. Rodilla derecha grupo 3 (tratada con LUVs). G. Rodilla izquierda grupo 4 (control, no tratada). H. Rodilla derecha grupo 4 (control, tratada con LUVs-APO2L/TRAIL). La flecha negra indica la localización de la bolsa sinovial retro-patelar.
Figura 18. Muestra la valoración de los parámetros histopatológicos de las rodillas en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. Valoración de los 4 parámetros histológicos descritos por Sánchez-Pernaute O. y colaboradores (Sánchez-Pernaute O. et al. Arthritis Rheum 1997; 40:2147-56) para la evaluación de la inflamación en el modelo de AIA en conejos blancos New Zealand. A. Infiltrado inflamatorio. B. Hiperplasia sinovial (número de capas de células sinoviales). C. Formación de villus. D. Aumento de la vascularización. En cada porta se ha examinado al microscopio óptico (20×) la totalidad del tejido sinovial presente y el resultado se ha expresado como la media ± la desviación estándar de todos los campos examinados para cada uno de los 4 parámetros.
Figura 19. Muestra el examen microscópico de las rodillas en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. Tinción con hematoxilina-eosina (H/E) del tejido sinovial de las rodillas de los conejos. En la figura se muestra un ejemplo representativo de un conejo de cada grupo (20x). Izqda: Rodilla izquierda no tratada; Dcha: Rodilla derecha tratada (grupo 1: APO2L/TRAIL; grupo 2: LUVs-APO2L/TRAIL; grupo 3: LUVs). En la imagen se ha señalado la presencia de infiltrado inflamatorio (i), la capa de células sinoviales (s), presencia de villus (v) y la presencia de vasos sanguíneos (x).
Figura 20. Muestra el examen microscópico de las rodillas en los distintos grupos de conejos blancos New Zealand. Tinción con H/E del tejido sinovial de las rodillas de los conejos. En la figura se muestra un ejemplo representativo de un conejo de cada grupo (40x). Izqda: Rodilla izquierda no tratada; Dcha: Rodilla derecha tratada (grupo 1: APO2L/TRAIL; grupo 2: LUVs-APPO2L/TRAIL). En la imagen se ha señalado la presencia de infiltrado inflamatorio mononuclear (m), de infiltrado inflamatorio polimorfonuclear (p), la capa de células sinoviales (s) y la presencia de vasos sanguíneos (x).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1
Generación de liposomas decorados con APO2L/TRAIL recombinante bioactivos
Expresión de la proteína APO2L/TRAIL recombinante
Para la obtención de la proteína APO2L/TRAIL recombinante se ha empleado el vector de expresión en células procariotas pET19b (Novagen, Gibbstown, NJ) con el cDNA clonado de la porción soluble de la proteína APO2L/TRAIL humana (codones 114-281) que expresa una cola de 10 histidinas (Pitti RM. et. al. J Biol Chem 1996; 271 (22):1268790). El plásmido pET19b contiene un gen de resistencia a la ampicilina y su promotor responde a la inducción con IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido). Se ha empleado dicho plásmido en la cepa de E. Coli BL21-CodonPlus® (DE3)-RP (Stratagene, La Jolla, CA) que contiene un plásmido adicional con un gen de resistencia a Cloranfenicol.
En primer lugar se han obtenido bacterias competentes de dicha cepa de E. Coli usando un método basado en la apertura de poros en la membrana mediante CaCl2 a baja temperatura. Tras cultivar las bacterias y cuando éste alcanza la fase de crecimiento exponencial, el cultivo se enfría en hielo durante 30 minutos para detener el crecimiento resuspendiéndose las bacterias en un tampón que contiene 0,1 M CaCl2, 0,07 M MgCl2 0,04 M Acetato Sódico manteniéndolas en frío durante 15 minutos para que se formen los poros en la membrana bacteriana tras lo cual, las bacterias se centrifugan a 3.500 rpm durante 10 minutos a 4ºC, se elimina el sobrenadante resuspendiéndose en un tampón de conservación que contiene 0,1 M CaCl2 y 15% de Glicerol y se guardan a -80ºC hasta su utilización.
Las bacterias E. Coli BL21-CodonPlus® (DE3)-RP competentes se transforman con 50 ng de la construcción pET19b-APO2L/TRAIL siguiendo las instrucciones de la casa comercial Stratagene. Para ello, se ha empleado un método basado en el choque térmico incubando las bacterias competentes en hielo y posteriormente en baño húmedo a 42ºC. Las bacterias transformadas se siembran en placa de LB-Agar que contiene Ampicilina 100 μg/mL y se cultivan durante toda la noche a 37ºC. Al día siguiente se selecciona una de las colonias transformadas y se crece en 10 mL de medio LB que contiene Ampicilina 100 mg/mL y Cloranfenicol 50 mg/mL dejándose en cultivo a 37ºC en agitación a 200 rpm durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se realiza una dilución 1/100 del cultivo bacteriano en medio LB sin antibióticos dejándose crecer durante 4-6 horas hasta que las bacterias transformadas se encuentran en fase exponencial del crecimiento (lectura de absorbancia a 600 nm de 0,6-0,8) momento en el que se induce la expresión de APO2L/TRAIL recombinante añadiendo al cultivo bacteriano 1 mM IPTG e incubándolo a 37ºC en agitación durante 18 horas. Posteriormente se recolecta el cultivo bacteriano inducido mediante centrifugación a 3.500 rpm durante 30 minutos, se elimina el sobrenadante y el pellet se guarda a -20ºC hasta su utilización.
Plegamiento y Purificación de la proteína APO2L/TRAIL recombinante
Para la purificación de APO2L/TRAIL se ha aprovechado que dicha proteína se expresa como una proteína de fusión unida a una cola de 10 histidinas (APO2L/TRAILHis10) que tiene afinidad por los metales bivalentes como el Cobalto (Co2+ ). Por este motivo la purificación se ha realizado mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado empleando la resina BD TALON TM Metal Affinity Resin (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) que contiene Co2+ .
En primer lugar se lava el pellet bacteriano con un tampón que contiene 0,05 M Fosfato Sódico pH 7,4, 1 M NaCl, 6 M Urea y 0,5% de Tritón X-100, se centrifuga a 3.500 rpm durante 30 minutos. Se descarta el sobrenadante y el pellet se resuspende en un tampón de solubilización que contiene 0,05 M Tris-HCl pH 8,5,5Mde Cloruro de Guanidinio y 0,03 M DTT y se incuba a 4ºC en agitación durante 3 horas. El sobenadante que contiene APO2L/TRAIL-His10 se recolecta mediante centrifugación a 20.000 g durante 30 minutos a 4ºC y se diluye añadiéndolo gota a gota sobre el tampón de plegado 1 que contiene 0,05 M Tris-HCl pH 7,4, 0,4 M L-Arginina, 2 mM DTT, 0,5 M Urea y 0.5 M NaCl en agitación a 4ºC. El diluido obtenido se dializa frente al tampón de plegado 2 que contiene 0,05 M Tris-HCl pH 7,4, 1 mM DTT, 0,1 M Urea, 0,3 M NaCl durante toda la noche a 4ºC. Posteriormente, la solución se centrífuga a 20.000 rpm durante 30 minutos a 4ºC para obtener el sobrenadante donde se encuentra APO2L/TRAIL-His10 correctamente plegada y se incuba con una resina que contiene Co2+ siguiendo las instrucciones del fabricante para la purificación de proteínas recombinante en condiciones nativas. Por último, APOO2L/TRAIL-His10 se eluye de la resina mediante el tampón que contiene 0,05 M Fosfato Sódico pH 7,0, 0,3 M NaCl, 0,15 M Imidazol. La proteína recombinante recolectada se unifica y se elimina el Imidazol cambiando a otro tampón de dilución denominado KHE (0,1 M KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EDTA, pH 7,0) empleando la columna Disposable PD-10 Desalting Column (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) o bien se concentra empleando el filtro Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10,000 NMWL (Millipore, Billerica, MA) siguiendo en ambos casos las instrucciones del fabricante. La proteína obtenida se guarda a 4ºC hasta su utilización.
De todos los pasos de la purificación se guardan alícuotas que posteriormente son analizadas mediante electroforesis en gel al 12% de poliacrilamida-SDS (SDSPAGE) y tinción con azul de Coomassie (Figura 1.A.). En el cultivo de las bacterias E. Coli BL21-CodonPlus® (DE3)-RP transformadas y tratadas con 1 mM IPTG durante 18 horas se induce la expresión de APO2L/TRAIL recombinante aumentando la expresión de la banda de 22 kDa de peso molecular correspondiente a la proteína de fusión APO2L/TRAIL-His10 (Figura 1.A.: 1 y 2). Al realizar el plegamiento de la proteína mediante el proceso de dilución y diálisis, aparece un precipitado en el que se encuentra la gran mayoría de proteínas bacterianas además de APO2L/TRAIL-His10 en forma de cuerpos de inclusión que no se han solubilizado (Figura 1.A.: 3). En el sobrenadante obtenido se encuentra la proteína recombinante correctamente plegada (Figura
1.A: 4).Tras incubar el extracto diluido y dializado con la resina que contiene Co2+ la intensidad de la banda correspondiente a APO2L/TRAIL-His10 se ha reducido considerablemente lo que indica que APO2L/TRAIL-His10 ha quedado mayoritariamente unida a la resina (Figura 1.A: 5). Por último, tras eluir de la resina la proteína recombinante con 0,15 M de Imidazol, la banda correspondiente a APO2L/TRAIL-His10 aparece en la fracción de elución (Figura 1.A: 7).
Además se ha realizado Western-blot de la fracción de elución revelando con el anticuerpo monoclonal His·Tag® Monoclonal Antibody (Novagen, Gibbstown, NJ) que reconoce la cola de histidinas que incluye la mayoría de los vectores de expresión de Novagen como el pET19b, el anticuerpo monoclonal Purified Mouse Anti-Human TRAIL (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) y con un antisuero policlonal de conejo que reconoce APO2L/TRAIL generado previamente en nuestro laboratorio. El revelado del Western-blot del eluido de la resina empleando el anticuerpo monoclonal anti-His Tag, el anticuerpo monoclonal anti-TRAIL o un antisuero policlonal de conejo que reconoce APO2L/TRAIL, confirma que la banda de 22 kDa que se observa en la tinción con azul de Commassie, es la proteína recombinante APO2L/TRAIL-His10 (Figura 1.B.).
La proteína APO2L/TRAIL es un ligando mortal que induce apoptosis a través de la vía extrínseca. Para comprobar la bioactividad de la proteína purificada se realiza un ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular Jurkat clon E6.1 y la línea celular RPMI 8226. Tras 24 horas de cultivo en presencia de APO2L/TRAIL-His10 en ambos casos se observa la presencia de numerosas células con la típica morfología apoptótica (Figura 2).
Generación de liposomas decorados con APO2L/TRAIL recombinante
Los lípidos empleados para la generación de los liposomas son los siguientes: Fosfatidilcolina de huevo (PC), Esfingomielina porcina de cerebro (SM), Colesterol bovino (CHOL) y 1,2-dioleoil-sn-glicerol-3-{succinil[ácido N(5-amino-1-carboxilpentil)]iminodiacético iminodiacético} funcionalizado con níquel (DOGS-NTA-Ni) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL). La mezcla de lípidos se prepara en Cloroformo, se seca en tubos de cristal mediante flujo de Nitrógeno durante 30 minutos y luego mediante vacío durante 2 horas. Los lípidos se resuspenden en tampón KHE y la suspensión se somete a 10 ciclos de congelación/descongelación y luego se somete un proceso de extrusión 10 veces a través de dos membranas de Policarbonato con un poro de 200 nm (Whatman, Maidstone, UK) usando un Extruder (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) para obtener los liposomas de tipo LUVs (Large Unilamellar Vesicles). Los LUVs generados tienen una composición lipídica con una mezcla de PC, SM, CHOL y DOGSNTA-Ni en una proporción de 55:30:10:5 similar a la conocida de los exosomas naturales que contienen ligandos mortales secretados de manera fisiológica por las células. Además, se han generado LUVs con una proporción de DOGS-NTA-Ni del 0, 1, 2,5% (p/p) manteniendo la misma proporción de lípidos anteriormente descrita excepto la de PC.
Los LUVs se incuban con la proteína APO2L/TRAIL-His10 a una relación molar proteína:lípido de 1:2.000 durante 30 minutos a 37ºC. Posteriormente se recolectan los LUVs-APO2L/TRAIL mediante ultracentrifugación a 60.000 rpm durante 5 horas a 4ºC y el pellet obtenido se resuspende en tampón KHE estéril y se guardan a 4ºC hasta su utilización.
La unión de APO2L/TRAIL a los LUVs se analiza mediante electroforesis en gel al 12% de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) y tinción con azul de Coomassie tanto del pellet como del sobrenadante obtenido (Figura 3).
La concentración de proteína unida a los LUVs se valora mediante los métodos de cuantificación de BCA y Bradford y la concentración lipídica de los LUVs mediante el método de Fiske.
Se comprueba que la unión de APO2L/TRAIL-His-10 a los LUVs depende de la presencia del lípido DOGSNTA-Ni de modo que cuando la proteína se incuba con LUVs con un 5% de DOGS-NTA-Ni se une a los liposomas encontrándose en el pellet (Figura 3.: 2) mientras que cuando APO2L/TRAIL-His10 se incuba con LUVs sin DOGSNTA-Ni toda la proteína aparece en el sobrenadante (Figura 3.: 9). La incubación de la proteína recombinante con los LUVs con un 2,5 y un 1% de lípido quelante de Níquel no consigue unir toda la proteína apareciendo parte de ésta en el sobrenadante y parte unida a los LUVs en el pellet (Figura 3.:4y6;5y7 respectivamente).
En los estudios que se detallan a continuación se emplean LUVs-APO2L/TRAIL con una proporción de DOGSNTA-Ni del 5% (p/p).
Para comprobar la bioactividad de los LUVs-APO2L/TRAIL se realiza un ensayo de citotoxicidad sobre la línea celular tumoral humana Jurkat clon E6.1 (Figura 4.). Tras 24 horas de cultivo se observa que los LUVs 5% Ni-APO2L/TRAIL presentes en el pellet inducen la apoptosis de la mayoría de las células mientras que la incubación de las células con la misma cantidad de sobrenadante no induce la muerte celular de las mismas. Además, la citotoxicidad inducida por los LUVs-APO2L/TRAIL se debe a la presencia de la proteína recombinante ya que la incubación en presencia de LUVs 5% control (no incubados con APO2L/TRAIL-His10) no induce apoptosis.
Ejemplo 2
Uso de los LUVs-APO2L/TRAIL para el tratamiento de un tumor o un cáncer
Se ha descrito el uso de diversas formas recombinantes de TRAIL/APO2 en ensayos preclínicos in vitro e in vivo para inducir la apoptosis de células tumorales, bien en monoterapia, bien en combinación con otras terapias De hecho, su uso para el tratamiento de diversas neoplasias malignas se está evaluando actualmente en diversos ensayos clínicos (Johnstone et al. Nat Rev Cancer. 2008 Oct; 8:782-98). En la presente memoria se evalúa la capacidad de inducir muerte celular de los liposomas LUVs-APO2L/TRAIL sobre distintas líneas celulares tumorales de origen humano. Los estudios de citotoxicidad realizados in vitro han puesto de manifiesto que la capacidad de inducir muerte celular con LUV-APO2L/TRAIL es mayor que con APO2L/TRAIL soluble. Por tanto, el uso de liposomas decorados con APO2L/TRAIL es una terapia eficaz para el tratamiento del cáncer.
Material y métodos
Tras la obtención y optimización de los LUVs-APO2L/TRAIL se han realizado estudios de su bioactividad analizando su capacidad de inducir muerte celular in vitro en distintas líneas celulares tumorales en paralelo con APO2L/ TRAIL-His10 soluble.
Para ello, se han realizado ensayos de inducción de muerte celular sobre distintas líneas celulares tumorales: Jurkat clon E6.1 (proveniente de una leucemia linfoblástica humana aguda tipo T), RPMI 8226 (proveniente de un plasmocitoma humano de origen B), U266 (proveniente de un mieloma/plasmocitoma humano de origen B), IM9 (proveniente de un mieloma/plasmocitoma humano de origen B), MM1.S (proveniente de mieloma/plasmocitoma humano de origen B), A549 (proveniente de un adenocarcinoma de pulmón humano), U937 (proveniente de un linfoma histiocítico) y U937-Bcl2 (proveniente de la línea parental U937 en la que se ha sobre-expresado la proteína antiapoptótica Bcl2).
Se han realizado ensayos de dosis-respuesta incubando las líneas Jurkat clon E6.1 y RPMI 8226 con las siguientes dosis: 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1.000 ng/mL y el resto de las líneas con las dosis: 10, 50, 100, 500 y 1.000 ng/mL durante 24 horas tanto de APO2L/TRAIL-His10 soluble como de LUVs-APO2L/TRAIL valorando la muerte celular mediante tinción con azul Tripán, mediante una variante del método de Mossman de reducción del MTT (dimetiltiazolil-tetrazoilo) y mediante análisis por citometría de flujo de la translocación de Fosfatidilserina a la cara externa de la membrana celular mediante la unión de Anexina-V conjugada con Ficoeritrina (PE) en el caso de las líneas celulares Jurkat clon E6.1, U266, IM-9, MM1.S y A549 o con Fluoresceína (FITC) en el caso de la línea celular RPMI 8226.
Los ensayos de citotoxicidad se han realizado en ausencia o en presencia del anticuerpo bloqueante anti-APO2L/ TRAIL denominado 5C2 (amablemente cedido por el Dr. Ashkenazi, Genentech, San Diego, CA) para comprobar que la citoxicidad observada en las líneas celulares incubadas tanto con APO2L/TRAIL-His10 soluble como con LUVs-APO2L/TRAIL es específica y debida a este ligando mortal.
Los resultados de los estudios de citotoxicidad se muestran como la media ± desviación estándar de al menos 2 experimentos distintos.
Para todos los estudios de comparación entre variables cuantitativas ha sido aplicado el test de la t de Student.
En todos los casos, se ha considerado como significativamente estadístico un valor de p <0,05.
Los datos estadísticos han sido analizados usando el software SPSS for Windows Release 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
En primer lugar se ha analizado la citotoxicidad in vitro sobre distintas líneas celulares tumorales de origen humano realizando curvas de dosis-respuesta en paralelo con APO2L/TRAIL soluble y LUVs-APO2L/TRAIL y analizando los resultados mediante tinción con azul de Tripán, mediante una variante del método de Mossman o mediante análisis por citometría de flujo de las células Anexina-V positivas (células apoptóticas).
Los resultados en los ensayos de citotoxicidad con la línea Jurkat clon E6.1 muestran que los LUVs-APO2L/TRAIL tienen un efecto citotóxico mayor que el de APO2L/TRAIL soluble. Cuando se analiza en paralelo la capacidad de inducir la muerte celular por cualquiera de los métodos anteriormente citados se observa que la concentración inhibitoria media (IC50) es claramente inferior (entre 3 y 7 veces) en el caso de los liposomas decorados con APO2L/TRAIL cuando se comparan con APO2L/TRAIL soluble (Figura 5.).
En el caso de la línea celular RPMI 8226, los LUVs-APO2L/TRAIL también inducen la muerte celular de una manera más eficiente que APO2L/TRAIL soluble observándose una IC50 aproximadamente 2 veces menor en el caso de los LUVs-APO2L/TRAIL cuando se comparan con APO2L/TRAIL soluble (Figura 6.).
Para comprobar que el efecto citotóxico observado en estos experimentos se debe a APO2L/TRAIL, los ensayos de citotoxicidad se hacen en presencia del anticuerpo bloqueante anti-APO2L/TRAIL 5C2. En ambas líneas tumorales el efecto citotóxico de APO2L/TRAIL es revertido cuando la incubación se realiza en presencia de 5C2. En el caso de APO2L/TRAIL soluble es necesaria una dosis de 100 ng/mL de 5C2 para conseguir la inhibición de la muerte celular producida por APO2L/TRAIL a una dosis de 100 ng/mL mientras que en el caso de los LUVs-APO2L/TRAIL, para inhibir la muerte celular producida por la misma dosis de 100 ng/mL, es necesario emplear una dosis de 5C2 de 1.000 ng/mL lo que indica que la eficiencia en la señal apoptótica es mayor en el caso de los LUVS-APO2L/TRAIL (Figura 7.).
Por último, se ha ampliado el estudio de citotoxicidad a otras líneas celulares tumorales de origen humano: U266, IM-9, MM1.S, A549, U937 y U937-Bcl2 (Figura 8.). Los análisis indican que en todas ellas, la capacidad de inducir muerte celular es mayor en el caso de los LUVs-APO2L/TRAIL que en el caso de APO2L/TRAIL soluble cuando se analiza en paralelo. Incluso en la línea U937-Bcl2 los LUVs-APO2L/TRAIL son capaces de superar el efecto antiapoptótico de la proteína Bcl2 de una manera más efectiva que APO2L/TRAIL soluble.
Ejemplo 3
Uso de los LUVs-APO2L/TRAIL para el tratamiento de la AR
Por otra parte, APO2L/TRAIL también está implicado en la regulación del sistema inmune y en la patogénesis de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes, como la artritis reumatoide (AR). Se ha descrito el uso de APO2L/TRAIL recombinante para el tratamiento de la AR (Yao et al. 2006. Arthritis Res Ther 8: R16). En la presente memoria, utiliza un modelo animal de artritis inducida por antígeno (AIA) para demostrar que la inyección intra-articular de LUV-APO2L/TRAIL es capaz de reducir la inflamación de las articulaciones afectadas de artritis de manera más eficaz que cuando se inyecta la proteína APO2L/TRAIL soluble. Por tanto, el uso de liposomas decorados con APO2L/TRAIL es una terapia eficaz para el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes, como la AR.
Material y métodos
Inducción de la artritis inducida por antígeno (AIA) en conejos blancos New Zealand
Basándose en la literatura científica previa (Sanchez-Pernaute O. et al. Rheumatol 2003; 42:19-25; Lo YJ. et. al. Rheumatol Int 2007; 27(12):1099-111; Keravala A. et. al. Arthritis Res Ther 2006; 8(4):R91; Nakaya H. et. al. Arthritis Rheum 2005; 52:2559-2566; Yao Q. et. al. Artritis Res Ther 2006; 8(1):R16) se ha inducido una AIA en conejos blancos New Zealand para valorar in vivo la eficacia del tratamiento con LUVs-APO2L/TRAIL en un modelo animal de artritis. Para ello, se han sensibilizado conejos blancos New Zealand mediante dos inyecciones intra-dérmicas (i.d.) de 5 mg de ovoalbúmina (OVA, Sigma, St. Louis, MO) con adyuvante autorizado.
Posteriormente se ha inducido la AIA en ambas mediante la inyección intra-articular (i.a.) de 5 mg de OVA disuelta en PBS estéril. El protocolo empleado para la inducción de la AIA se representa esquemáticamente en la Figura 9.
Inducción de la artritis inducida por antígeno (AIA) en conejos blancos New Zealand
Basándonos en la literatura científica previa (Sanchez-Pernaute O. et al. Rheumatol 2003; 42:19-25; Lo YJ. et. al. Rheumatol Int 2007; 27(12):1099-111; Keravala A. et. al. Arthritis Res Ther 2006; 8(4):R91; Nakaya H. et. al. Arthritis Rheum 2005; 52:2559-2566; Yao Q. et. al. Artritis Res Ther 2006; 8(1):R16) se ha inducido una AIA en conejos blancos New Zealand para valorar in vivo la eficacia del tratamiento con LUVs-APO2L/TRAIL en un modelo animal de artritis. Para ello, se han sensibilizado conejos blancos New Zealand mediante dos inyecciones intra-dérmicas (i.d.) de 5 mg de ovoalbúmina (OVA, Sigma, St. Louis, MO) con adyuvante autorizado.
Posteriormente se ha inducido la AIA en ambas mediante la inyección intra-articular (i.a.) de 5 mg de OVA disuelta en PBS estéril. El protocolo empleado para la inducción de la AIA se representa esquemáticamente en la Figura 1.
Utilización de los LUVs-APO2L/TRAIL para el tratamiento de la AIA
El experimento se ha realizado en 19 conejos blancos New Zealand distribuidos en los siguientes grupos según el tratamiento recibido:
- 1.
- Grupo APO2L: 5 conejos a los que 24 horas después de inducirles la AIA en ambas rodillas, se ha tratado la rodilla derecha mediante inyección i.a. de 5 μg de APO2L/TRAIL-His10 soluble en 0,5 mL de PBS estéril mientras que en la rodilla izquierda se les ha inyectado 0,5 mL de PBS estéril.
- 2.
- Grupo LUVs-APO2L: 5 conejos a los que, tras inducirles la AIA en ambas rodillas, 24 horas después se ha tratado la rodilla derecha mediante inyección i.a. de LUVs decorados con 5 μg de APO2L/TRAIL en 0,5 mL de PBS estéril mientras que en la rodilla izquierda se les ha inyectado 0,5 mL de PBS estéril.
- 3.
- Grupo LUVs: 3 conejos en los que se ha inducido la AIA en ambas rodillas y 24 horas después se les ha tratado la rodilla derecha mediante inyección i.a. de LUVs en 0,5 mL de PBS estéril a la misma concentración que en el grupo 2 mientras que en la rodilla izquierda se les ha inyectado 0,5 mL de PBS estéril.
- 4.
- Grupo Control: 6 conejos a los que se les ha realizado las 2 inyecciones de sensibilización y en los que la inyección i.a. en ambas rodillas se ha realizado con 0,5 mL de PBS. En estos conejos, en la rodilla izquierda no se ha realizado ningún tratamiento mientras que en la rodilla derecha se han realizado los siguientes tratamientos según el subgrupo:
4.1. Control-APO2L: en 2 conejos se ha inyectado APO2L/TRAIL-His10 soluble en 0,5 mL de PBS estéril.
4.2. Control-LUVs-APO2L: en 2 conejos se ha inyectado liposomas decorados con APO2L/TRAIL en 0,5 mL de PBS estéril.
4.3. Control-LUVs: en 2 conejos se ha inyectado los LUVs en 0,5 mL de PBS estéril.
Este último grupo sirve por una parte como control sano (rodillas no tratadas) y por otra parte como control negativo para comprobar la falta de efecto de los tratamientos en ausencia de AIA (rodillas tratadas).
El seguimiento de los conejos se ha realizado durante 8 días desde la inyección i.a. de inducción de la AIA (7 días desde los tratamientos recibidos según el grupo al que pertenezcan) y ha consistido en la medición diaria del diámetro latero-lateral de las rodillas y en la medición del peso de cada animal. Tras estos 8 días, se ha procedido al sacrificio de los animales, al examen macroscópico de las rodillas abiertas y la exéresis quirúrgica de la bolsa sinovial retropatelar de ambas rodillas. Los tejidos se fijaron en formaldehído al 10% y posteriormente se parafinaron y cortaron en microtomo en portas seriados de 5 micras de grosor para su posterior estudio histológico mediante tinción con Hematoxilina/Eosina (H/E, Merck, Darmstadt, Alemania).
Además a todos los animales se les ha realizado extracciones de sangre los días 31 (día de la inducción de la AIA previamente a la inyección i.a.), 32 (día de los tratamientos previamente a la inyección i.a.) y 39 (día del sacrificio) para la determinación analítica de factor reumatoide (FR) y la transaminasa alaninoaminotransferasa (ALT).
Se han realizado 2 experimentos más con 10 y 13 conejos respectivamente siguiendo el mismo protocolo anteriormente descrito empleando una dosis de 10 μg de APO2L/TRAIL.
Evaluación histopatológica de la AIA
La evaluación histopatológica del grado de inflamación sinovial presente en los cortes teñidos con H/E se ha realizado basándonos en la escala de puntuación descrita previamente para este modelo animal de artritis (Sanchez-Pernaute O. et al. Arthritis Rheum 1997; 40:2147-56, Tabla 1.).
Se han analizado los siguientes criterios: presencia de infiltrado inflamatorio, aumento del número de capas de células sinoviales, formación de villus y aumento de la vascularización con una puntuación de 0 para el tejido sano a 13 para la inflamación más severa. La totalidad del tejido sinovial presente en cada porta ha sido examinado mediante microscopía óptica a un aumento de 20× sin conocimiento del grupo al que pertenecía dicho porta y el resultado se ha expresado como la media ± la desviación estándar de todos los campos examinados.
TABLA 1
Criterios para la evaluación histológica de la AIA
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos de la medición del diámetro latero-lateral de las rodillas se muestran como la media ± la desviación estándar de las mediciones tomadas por dos observadores de manera independiente de las medias de los animales de cada grupo. Los resultados obtenidos de la medición de la pérdida de peso, FR, ALT se muestran como la media ± la desviación estándar de los animales de cada grupo.
Los resultados del análisis histopatológico de los cortes teñidos con H/E se muestran como la media ± la desviación estándar de todos los campos examinados en cada porta.
Para todos los estudios de comparación entre variables cuantitativas ha sido aplicado el test de la t de Student.
En todos los casos, se ha considerado como significativamente estadístico un valor de p <0,05.
Los datos estadísticos han sido analizados usando el software SPSS for Windows Release 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Resultados
Inducción de la artritis inducida por antígeno (AIA) en conejos blancos New Zealand
Tal y como se indica en Material y Métodos, se induce la AIA en ambas rodillas mediante inyección i.a. de 5 mg de OVA en 13 conejos blancos New Zealand previamente sensibilizados (Grupo AIA). En 6 conejos sensibilizados la inyección i.a. se realiza con PBS (Grupo Control).
Veinticuatro horas después de la inducción, la artritis se genera correctamente en todas las rodillas de todos los conejos del grupo AIA produciéndose un aumento significativamente estadístico en el diámetro latero-lateral de todas las rodillas mientras que en el grupo Control la inyección i.a de PBS no produce un aumento significativo del diámetro latero-lateral de las rodillas (Figura 10.A.). En el grupo AIA, la artritis se mantiene hasta el día del sacrificio sin observarse diferencias significativas en la medición del diámetro latero-lateral de las rodillas respecto al día del inducción de la AIA.
La artritis se induce de manera similar en ambas rodillas sin observarse diferencias estadísticamente significativas en el diámetro latero-lateral ni entre las rodillas izquierdas y las derechas ni tampoco entre los 3 grupos en los que se va a realizar los distintos tratamientos de la AIA (Grupo 1: APO2L; Grupo 2: LUVs-APO2L; Grupo 3: LUVs, Figura 10.B.).
En lo referente al peso de los animales, en el grupo AIA se produce un descenso del peso el día del sacrificio estadísticamente significativo respecto al peso el día de la inducción de la AIA mientras que en el grupo Control, no se produce variación en el peso a lo largo del experimento y hasta el día del sacrificio (Figura 11.).
En cuanto al FR, un parámetro analítico característico de la AR, aumenta de manera significativa en el grupo AIA el día del sacrificio respecto a los valores observado en el grupo Control (Figura 12.).
Efecto del tratamiento de la AIA con LUVs-APO2L/TRAIL
Tras comprobar que la artritis se ha inducido correctamente, 24 horas después se realiza el tratamiento mediante inyección i.a. Los 13 conejos en los que se ha inducido la AIA se distribuyen aleatoriamente en 3 grupos: 5 conejos a los que se les inyecta vía i.a. 5 μg de APO2L/TRAIL-His10 en su rodilla derecha (Grupo 1), 5 conejos a los que se les inyecta vía i.a. 5 μg de LUVs-APO2L/TRAIL en su rodilla derecha (Grupo 2)ya3conejos a los que se les inyecta vía
i.a. la misma concentración de LUVs que al grupo 2 en este caso sin APO2L/TRAIL (Grupo 3). En la rodilla izquierda de todos los conejos de los 3 grupos se inyecta de vía i.a. PBS estéril. Estas rodillas sirven como control interno en cada animal de la evolución natural de la AIA sin tratamiento.
En las rodillas no tratadas del grupo 1 del grupo 2, la inflamación observada tras 24 horas de la inducción, se mantiene hasta el día del sacrificio. Sin embargo en las rodillas tratadas, tanto en el grupo 1 (tratamiento con 5 μg de APO2L/TRAIL recombinante soluble) como en el grupo 2 (tratamiento con LUVs decorados con 5 μgde APO2L/TRAIL), el día del sacrificio se observa un descenso de la inflamación respecto la observada a las 24 horas de la inducción. Cuando se compara el diámetro latero-lateral de las rodillas no tratadas y las tratadas en cada grupo, el descenso observado en las rodillas tratadas con LUVs-APO2L/TRAIL del grupo 2 llega a ser estadísticamente significativo mientras que en el grupo 1 el descenso observado en las rodillas tratadas con APO2L/TRAIL soluble no alcanza niveles significativos. En el grupo 3 la inyección i.a. de LUVs sin APO2L/TRAIL no tiene ningún efecto sobre la inflamación de modo que las rodillas tratadas presentan una inflamación similar a las rodillas no tratadas (Figura 13.A.).
En el grupo Control, ninguno de los 3 tratamientos que se inyectan en los 3 subgrupos, produce cambios significativos en el diámetro de las rodillas tratadas respecto a las rodillas no tratadas, esto es ninguno de los 3 tratamientos tiene efecto en ausencia de AIA (Figura 13.B.).
Cuando se comparan las medias de las diferencias entre los diámetros de las rodillas no tratadas y las tratadas en cada grupo se observa que esta diferencia es estadísticamente mayor en el grupo 2 que en el grupo 1. En el grupo 3, apenas hay diferencias entre el diámetro de las rodillas tratadas y no tratadas en el momento del sacrifico, esto es, no hubo descenso de la inflamación de las rodillas tratadas (Figura 14.).
Se ha descrito que APO2L/TRAIL-His10 puede tener un efecto hepatotóxico atribuible a la presencia de la cola de histidinas (Lawrence D. et. al. Nature Med 2001; 7(4):383-5). Para comprobar que la inyección i.a. tanto de APO2L/TRAIL-His10 como de LUVs-APO2L/TRAIL no presenta toxicidad sistémica, se realiza la determinación del enzima hepático ALT en el suero de los conejos. En el grupo AIA 24 horas después de la inducción de la artritis se produce un aumento en los niveles séricos de ALT de modo que el día del sacrificio los niveles séricos vuelven a valores similares a los previos a la inducción de la AIA (Figura 15.A.). Este aumento transitorio y posterior descenso hasta valores normales el día del sacrificio se observa también en los 3 grupos de tratamiento por separado (Figura 15.B.). En el grupo Control los niveles de ALT en suero no varían a lo largo del experimento. Estos datos indican que el aumento transitorio de la ALT en los conejos con AIA se debe a la inducción de la artritis y no tienen que ver con un efecto sistémico adverso de APO2L/TRAIL-His10.
En los 2 experimentos realizados utilizando una dosis de 10 μg de APO2L/TRAIL soluble o asociado a LUVs, los resultados en la medición del diámetro latero-lateral de las rodillas son similares a los del primer experimento en el que se ha empleado 5 μg de APO2L/TRAIL. (Figura 16.).
Tras el sacrificio de los animales se procede al examen macroscópico de las rodillas abiertas (Figura 17.).
En las rodillas izquierdas no tratadas de los 3 grupos de tratamiento se observa un aumento del tamaño y de la pigmentación de la bolsa sinovial retro-patelar debido a la inflamación producida por la artritis (Figura 17. A. C. E.). En las rodillas derechas tratadas del grupo 1 (Figura 17. B.) y sobre todo en el grupo 2 (Figura 17. D.) se observa una menor inflamación comparada con las rodillas no tratadas. En las rodillas tratadas del grupo 3 (Figura 17.F.) la inflamación de la bolsa retro-patelar es similar a las rodillas no tratadas. Por último, en el grupo 4 (Control) tanto las rodillas no tratadas como las tratadas presentan una anatomía macroscópica normal (Figura 17. G. H.).
El examen histopatológico del tejido sinovial en los cortes teñidos con H/E se ha realizado basándonos en la escala de evaluación descrita previamente por Sanchez-Pernaute O. y colaboradores para este modelo animal de artritis. Tal y como se ha descrito anteriormente en Material y Métodos, se ha examinado la totalidad del tejido sinovial presente en cada porta mediante microscopía óptica a un aumento de 20× y el resultado se ha expresado como la media ± la desviación estándar de todos los campos examinados para cada uno de los 4 parámetros analizados (Tabla 2.).
TABLA 2
Evaluación histopatológica de la AIA en los distintos grupos
Cuando se analiza el índice histológico por grupos, las rodillas no tratadas de los grupos 1, 2 y 3 presentan unos índices elevados (entre 7 y 8,5 aproximadamente según el grupo) sin observarse diferencias estadísticamente significativas entre grupos. En las rodillas tratadas, tanto en el grupo 1 como en el grupo 2, se observa un índice histológico menor que en el caso de las rodillas no tratadas de modo en el grupo 2 la diferencia entre el índice de las rodillas tratadas y no tratadas es estadísticamente significativo. En el grupo 3 el índice histológico de las rodillas tratadas es elevado y similar al de las rodillas no tratadas. El grupo Control presenta uno índices histológicos prácticamente de 0 (normalidad) no observándose diferencias entre las rodillas no tratadas y las tratadas con cualquiera de los 3 tratamientos (según el subgrupo).
Cuando se analizan por separado los 4 parámetros histológicos (infiltrado inflamatorio, hiperplasia sinovial, formación de villus y aumento de la vascularización, Figura 18.) se observa que en el grupo 2 el tratamiento con LUVs-APO2L/TRAIL es capaz de reducir todos ellos llegando a ser significativo el descenso observado en el infiltrado inflamatorio y en la hiperplasia sinovial. En el grupo 1, el tratamiento con APO2L/TRAIL soluble es capaz de reducir la hiperplasia sinovial, donde se llega a observar un descenso significativo, la formación de villus y la hipervascularización pero no tiene efecto sobre el infiltrado inflamatorio. En el grupo 3, el tratamiento con LUVs no tiene ningún efecto sobre ninguno de los 4 parámetros analizados. Por último, en el grupo 4 el índice tanto de las rodillas no tratadas como las tratadas es similar y prácticamente de 0 en los 4 parámetros sin observarse diferencias entre los distintos subgrupos según el tratamiento recibido.
En la Figura 19 se muestra la tinción con H/E de los cortes del tejido sinovial de las rodillas izquierdas (no tratadas) y las rodillas derechas (tratadas) de un conejo representativo de cada grupo a un aumento de 20x. En las rodillas izquierdas de los conejos del grupo 1 (índice histológico: 9,381) y del grupo 2 (índice histológico: 10,511) se observa un abundante infiltrado inflamatorio, una marcada hiperplasia sinovial con un aumento en el número de capas de células sinoviales (más de 5 capas de células sinoviales en ambas), un importante aumento en el número de vasos sanguíneos y la formación de villus. En la rodilla tratada con APO2L/TRAIL del conejo del grupo 1 (índice histológico: 7,700) se puede observar una disminución en el número de capas de células sinoviales así como en el número de vasos sanguíneos presentes en el tejido cuando se compara con la rodilla no tratada del mismo conejo, sin embargo, se observa un abundante infiltrado inflamatorio similar al de la rodilla no tratada. En el caso del conejo del grupo 2 en la rodilla tratada con LUVs-APO2L/TRAIL (índice histológico: 5,998) además de una importante disminución del número de vasos sanguíneos y de la hiperplasia sinovial que en su mayor parte presenta una única capa de células sinoviales, se observa un importante descenso del infiltrado inflamatorio cuando se compara con la rodilla no tratada del mismo conejo.
En el grupo 3 tanto la rodilla no tratada (índice histológico: 9,833) como la tratada con LUVs (índice histológico: 10,500) presentan un abundante infiltrado inflamatorio, una marcada hiperplasia de las células sinoviales, un importante incremento en la vascularización del tejido así como la formación de villus sin que se observe diferencias significativas entre ambas rodillas. Por último en el grupo 4 (Control) el tejido sinovial es normal tanto en las rodillas no tratadas como en las que han sido tratadas con cualquiera de los 3 tratamientos sin observarse diferencias en los 3 subgrupos (grupo 4-1: índices histológicos: 0,200 y 0,284; grupo 4-2: índices histológicos: 0,083 y 0,222; grupo 4-3: índices histológicos: 0,180 y 0,111).
En la Figura 20 se muestra la tinción con H/E del tejido sinovial de la rodilla izquierda y la rodilla derecha de los mismos conejos del grupo 1 y del grupo 2 que en la figura anterior con mayor detalle (aumento de 40x).
En las rodillas izquierdas de los conejos del grupo 1 y 2 se observa un abundante infiltrado inflamatorio a expensas tanto de infiltrado de tipo mononuclear como de tipo polimorfonuclear, una marcada hiperplasia sinovial con un aumento en el número de capas de células sinoviales (más de 5 capas de células sinoviales en ambas) y un importante aumento en el número de vasos sanguíneos. En la rodilla derecha tratada del conejo del grupo 1 (APO2L/TRAIL) se puede observar una disminución en el número de capas de células sinoviales así como en el número de vasos sanguíneos presentes en el tejido cuando se compara con la rodilla no tratada del mismo conejo, sin embargo, se observa que el infiltrado inflamatorio tanto mononuclear como polimorfonuclear persiste en un grado similar al de la rodilla no tratada. En la rodilla derecha tratada (LUVs-APO2L/TRAIL) del conejo del grupo 2, se observa una importante disminución del número de vasos sanguíneos y de la hiperplasia sinovial que en su mayor parte presenta una única capa de células sinoviales y también, un importante descenso del infiltrado inflamatorio mononuclear y polimorfonuclear cuando se compara con la rodilla no tratada.
Claims (24)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Liposoma recubierto, al menos, con una porción biológicamente activa del dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL cuya secuencia es SEQ ID NO: 2, donde dicha porción presenta una secuencia con una identidad de al menos un 80% con la SEQ ID NO: 1.
-
- 2.
- Liposoma según la reivindicación 1, donde la porción biológicamente activa presenta una identidad de al menos un 90% con la SEQ ID NO: 1.
-
- 3.
- Liposoma según la reivindicación 2, donde la porción biológicamente activa presenta una identidad de al menos un 95% con la SEQ ID NO: 1.
- 4. Liposoma según la reivindicación 3, donde la porción biológicamente activa es la SEQ ID NO: 1.
-
- 5.
- Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la porción biológicamente activa tiene unida en su extremo amino-terminal, al menos, 6 histidinas.
-
- 6.
- Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la porción biológicamente activa tiene unida en su extremo amino-terminal, al menos, 10 histidinas.
-
- 7.
- Liposoma recubierto, al menos, con el dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID: 2 o con cualquiera de sus variantes o porciones de las mismas biológicamente activas que comprende una porción biológicamente activa según se describe en cualquiera de las reivindicaciones1a6.
-
- 8.
- Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el liposoma es unilamelar grande (LUV) con un diámetro de entre 40 nm y 500 nm.
- 9. Liposoma según la reivindicación 8 donde el LUV tiene un diámetro de entre 100 nm y 200 nm.
-
- 10.
- Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el liposoma comprende al menos un fosfolípido seleccionado de entre: fosfatidilcolina y/o esfingomielina.
-
- 11.
- Liposoma según la reivindicación 10 donde el liposoma comprende además un esteral.
-
- 12.
- Liposoma según la reivindicación 11 donde el esteral es el colesterol.
-
- 13.
- Liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 donde el liposoma comprende además un lípido quelante.
-
- 14.
- Liposoma según la reivindicación 13 donde el lípido quelante es DOGS-NTA-Ni.
-
- 15.
- Uso del liposoma según cualquiera de las reivindicaciones1a14 para la elaboración de un medicamento.
-
- 16.
- Uso del liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un cáncer.
-
- 17.
- Uso del liposoma según la reivindicación 16 donde el cáncer se selecciona de entre: linfoma, leucemia, plasmocitoma, mieloma o cáncer de pulmón.
-
- 18.
- Uso del liposoma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias o autoinmunes.
-
- 19.
- Uso del liposoma según la reivindicación 18 donde la enfermedad inflamatoria o autoinmune es la artritis reumatoide.
- 20. Composición farmacéutica que comprende el liposoma según cualquiera de las reivindicaciones1a14.
-
- 21.
- Composición farmacéutica según la reivindicación 20 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
-
- 22.
- Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 que comprende además otro principio activo.
LISTA DE SECUENCIAS<110> Universidad de Zaragoza Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea (UPV/EHU) Centro Superior de investigaciones Científicas (CSIC)<120> Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína APO2/TRAIL<130> 1510.30<160> 3<170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 168<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 1<210> 2<211> 243<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2<210> 3<211> 281<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 3ES 2 356 880 BlOFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCASN.º solicitud: 200930618ESPAÑAFecha de presentación de la solicitud: 21.08.2009Fecha de prioridad:INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA51 Int. Cl. : Ver Hoja AdicionalDOCUMENTOS RELEVANTES- Categoría
- Documentos citados Reivindicaciones afectadas
- X
- NAM, G.H. et al. "Association of human tumor necrosisfactor-related apoptosis inducing ligand with 1-4,7-10,15-17,
- membraneupon acidification". EUR. J. BIOCHEM. 01.11.2002. Vol. 269, N°. 21, páginas 5280-5287, todo el documento.
- 20-22
- Y
- 1-22
- Y
- JIANG, X.L. et al. "Suppession of teratocarcinomagrowth by soluble TRAIL gene expression driven bythe progression-elevated gene-3 promoter". CANCERBIOLOGY & THERAPY. 01.08.2009. Vol. 8, N°. 15, páginas 1517-1524, todo el documento. 1-7,15,16,20-22
- Y
- WO 02098465 A1 (CELATOR TECHNOLOGIES, INC.) 12.12.2002, páginas 8-19; reivindicaciones. 1-22
- Y
- ANEL, A. et al. "Apo2L/TRAIL and immune regulation". FRONTIERS IN BIOSCIENCE. 01.01.2007. Vol. 12, páginas 2074-2084, todo el documento. 1-22
- Y
- MART�?NEZ-LORENZO, M.J. et al. "Rheumatoid synovialfluid T cells are sensitive to APO2L/TRAIL". CLINICALIMMUNOLOGY. 16.12.2006. Vol. 122, N°. 1, páginas 28-40, todo el documento. 1-22
- Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud
- El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:
- Fecha de realización del informe 31.03.2011
- Examinador M. Novoa Sanjurjo Página 1/5
INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICANº de solicitud: 200930618CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUDA61K9/133 (2006.01) A61K47/48 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) A61P37/00 (2006.01)Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)A61K, A61PBases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)INVENES, EPODOC, HCAPLUS, BIOSIS, EMBASE, MEDLINEInforme del Estado de la Técnica Página 2/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 200930618Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 31.03.2011Declaración- Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18, 19 1-4, 7-10, 15-17, 20-22 SI NO
- Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)
- Reivindicaciones Reivindicaciones 1-22 SI NO
Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).Base de la Opinión.-La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.Consideraciones:La invención consiste en un liposoma decorado con el dominio extracelular (114-281) de la proteína APO2L/TRAIL. El liposoma de la invención es unilamelar grande (LUV) y comprende en su estructura fosfatidilcolina, esfingomielina y colesterol. Los lípidos se unen a la proteína que tiene en su extremo N terminal 10xHis, formando un compuesto de coordinación con el lípido quelante DOGS-NTA-Ni.Informe del Estado de la Técnica Página 3/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 2009306181. Documentos considerados.-A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.- Documento
- Número Publicación o Identificación Fecha Publicación
- D01
- NAM, G.H. et al. "Association of human tumor necrosisfactorrelated apoptosis inducing ligand with membraneupon acidification". EUR. J. BIOCHEM. 01.11.2002. Vol. 269, N°. 21, páginas 5280-5287, todo el documento.
- D02
- JIANG, X.L. et al. "Suppession of teratocarcinomagrowth by soluble TRAIL gene expression driven bythe progression-elevated gene-3 promoter". CANCERBIOLOGY & THERAPY. 01.08.2009. Vol. 8, N°. 15, páginas 1517-1524, todo el documento.
- D03
- WO 02098465 A1 (CELATOR TECHNOLOGIES, INC.) 12.12.2002, páginas 8-19; reivindicaciones.
- D04
- ANEL, A. et al. "Apo2L/TRAIL and immune regulation". FRONTIERS IN BIOSCIENCE. 01.01.2007. Vol. 12, páginas 2074-2084, todo el documento.
- D05
- MART�?NEZ-LORENZO, M.J. et al. "Rheumatoid synovialfluid T cells are sensitive to APO2L/TRAIL". CLINICALIMMUNOLOGY. 16.12.2006. Vol. 122, N°. 1, páginas 28-40, todo el documento.
El documento D01, describe los cambios que se producen en la estructura de la proteína APO2L/TRAIL en medio ácido. Los ensayos se realizan con liposomas unilamelares de 100 nm de diámetro unidos al fragmento 114-281 de la proteína APO2L/TRAIL. El documento D02, describe un ensayo de terapia génica contra un teratocarcinoma de ratón en el que la transfección de un plásmido que codifica la secuencia 114-281 de la proteína APO2L/TRAIL, se realiza por inyección intratumoral de un complejo ADN:liposoma. El liposoma del ensayo es el liposoma catiónico (DOTAP):colesterol El documento D03, describe el potencial terapéutico de proteínas recombinantes y péptidos sintéticos que unidas a residuos de poli histidina, pueden unirse específicamente a liposomas que contienen un lípido quelante como DOGS-NTA-Ni. Esta estructura permite la internalización de los péptidos. El documento D04, es una revisión sobre la proteína Apo2L/TRAIL y su implicación en la regulación inmune. En el apartado - 2.2.2. se analiza la aplicación como agente antitumoral y en el apartado 7., la aplicación en el tratamiento de enfermedades autoinmunes con especial mención a la artritis reumatoide. El documento D05, describe actividad de APO2L/TRAIL frente a la acumulación de células T que se produce en el líquido sinovial de enfermos de artritis reumatoide, lo que la convierte en un candidato para tratar la enfermedad.
- 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciónNOVEDAD Reivindicaciones 1-4, 7-10, 15-17, 20-22 La reivindicación 1, está redactada de una forma tan general que cualquier liposoma que comprenda en su estructura la SEQ ID nº 2 que se corresponde con el dominio extracelular de la proteína Apo2L/TRAIL, o parte de ella como el fragmento 114-281 de las reivindicaciones 2-5 y descrito en el documento D01, ataca su novedad. En dicho documento también se menciona que TRAIL es conocida por su actividad apoptótica en varias líneas celulares de tejidos cancerosos. Las reivindicaciones 7-10, 15-17 y 20-22 en la medida en que dependen de las reivindicaciones 1-4, carecen de novedad y no cumplen los requisitos del Art. 6 de la LP. Reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18, 19 Las reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18 y 19 son nuevas. No se ha encontrado en el estado de la técnica un liposoma APO2L/TRAIL-10xHis-DOGS-NTA-Ni-Colesterol/Esfingomielina/Fosfatidilcolina. Tampoco se ha descrito el liposoma del documento D01 para tratar la artritis reumatoide. Las reivindicaciones 5, 6, 11-14, 18 y 19, cumplen los requisitos del Art. 6 de la LP. ACTIVIDAD INVENTIVA Reivindicaciones 1-22 El documento D03, describe un método para internalizar un péptido por medio de un liposoma que se construye con una disposición similar a la del liposoma de la invención, uniendo una cadena de 10 His al N terminal del péptido/proteína y el lípido DOGS-NTA-Ni a los lípidos que forman la vesícula unilamelar. La diferencia es que en el caso del documento D03 el péptido es AntpHD-Cw3 y en el liposoma de la solicitud la proteína es el fragmento 114-281 del dominio extracelular de la proteína APO2L/TRAIL. Este fragmento ha sido descrito previamente en los documentos D01 y D02 como un péptido con actividad antitumoral.Informe del Estado de la Técnica Página 4/5OPINIÓN ESCRITANº de solicitud: 200930618El documento D04, recoge información sobre la actividad de APO2L/TRAIL como agente antitumoral y D05 describe actividad del fragmento 114-281 de APO2L/TRAIL frente a la acumulación de células T que se produce en el líquido sinovial de enfermos de artritis reumatoide. De la información contenida en los documentos D01-D05, se deduce que el liposoma de la invención no supone un esfuerzo inventivo respecto al liposoma descrito en el documento D03 combinado con el péptido de actividad farmacológica descrito en los documentos D01, D02, D04 y D05. Resultaría obvio para el experto en la materia, la obtención del liposoma de la solicitud utilizando los materiales y reactivos descritos en dichos documentos; por tanto, las reivindicaciones 1-22 carecen de actividad inventiva y no cumplen los requisitos del Art. 8 de la LP.Informe del Estado de la Técnica Página 5/5
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930618A ES2356880B8 (es) | 2009-08-21 | 2009-08-21 | Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína apo2l/trail. |
| PCT/ES2010/000354 WO2011020933A2 (es) | 2009-08-21 | 2010-08-12 | Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína apo2l/trail |
| EP10809583A EP2468260A2 (en) | 2009-08-21 | 2010-08-12 | Liposomes covered with the extracellular domain of the apo2l/trail protein |
| US13/391,582 US20120189690A1 (en) | 2009-08-21 | 2010-08-12 | Liposomes covered with the Extracellular Domain of the APO2L/Trail Protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200930618A ES2356880B8 (es) | 2009-08-21 | 2009-08-21 | Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína apo2l/trail. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2356880A1 ES2356880A1 (es) | 2011-04-14 |
| ES2356880B1 true ES2356880B1 (es) | 2012-04-23 |
| ES2356880B8 ES2356880B8 (es) | 2012-10-30 |
Family
ID=43607379
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200930618A Expired - Fee Related ES2356880B8 (es) | 2009-08-21 | 2009-08-21 | Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la proteína apo2l/trail. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20120189690A1 (es) |
| EP (1) | EP2468260A2 (es) |
| ES (1) | ES2356880B8 (es) |
| WO (1) | WO2011020933A2 (es) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10391146B2 (en) | 2013-08-02 | 2019-08-27 | Cornell University | Method to functionalize cells in human blood, other fluids and tissues using nanoparticles |
| IT202000013042A1 (it) * | 2020-06-01 | 2021-12-01 | Univ Degli Studi G Dannunzio Chieti Pescara | Sistema liposomiale con killer tnf-apoptosis induced ligand (killertrail), pro-apoptotico-direzionante. |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5763223A (en) | 1995-06-29 | 1998-06-09 | Immunex Corporation | DNA encoding a cytokine that induces apoptosis |
| US6284236B1 (en) * | 1995-06-29 | 2001-09-04 | Immunex Corporation | Cytokine that induces apoptosis |
| US6030945A (en) * | 1996-01-09 | 2000-02-29 | Genentech, Inc. | Apo-2 ligand |
| CA2386002A1 (en) | 1999-09-30 | 2001-04-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Trail: an inhibitor of autoimmune inflammation and cell cycle progression |
| US6444640B1 (en) | 1999-09-30 | 2002-09-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Compositions of trail and DNA damaging drugs and uses thereof |
| WO2002069995A2 (en) | 2001-02-16 | 2002-09-12 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Use of trail and antiprogestins for treating cancer |
| WO2002098465A2 (en) * | 2001-06-07 | 2002-12-12 | Celator Technologies, Inc. | Cell penetrating therapeutic agents |
| KR20030026069A (ko) | 2001-09-24 | 2003-03-31 | 주식회사 엘지생명과학 | 티엔에프계 단백질과 플라보피리돌의 조합에 의한 암세포특이적인 세포사멸 유도용 조성물 |
| US20050113328A1 (en) | 2003-11-06 | 2005-05-26 | Devi Gayathri R. | Method and antisense compound for potentiating anti-cancer agents |
| GB0524316D0 (en) | 2005-11-29 | 2006-01-04 | Medical Res Council | Tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligands (TRAILs) |
-
2009
- 2009-08-21 ES ES200930618A patent/ES2356880B8/es not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-08-12 US US13/391,582 patent/US20120189690A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-12 EP EP10809583A patent/EP2468260A2/en not_active Withdrawn
- 2010-08-12 WO PCT/ES2010/000354 patent/WO2011020933A2/es active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2011020933A2 (es) | 2011-02-24 |
| WO2011020933A3 (es) | 2011-07-14 |
| ES2356880A1 (es) | 2011-04-14 |
| EP2468260A2 (en) | 2012-06-27 |
| WO2011020933A8 (es) | 2012-04-05 |
| ES2356880B8 (es) | 2012-10-30 |
| US20120189690A1 (en) | 2012-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2745208T3 (es) | Nanoestructuras para tratar cánceres | |
| ES2500340T3 (es) | Anexinas, derivados de las mismas, y variantes de la anexina-Cys, al igual que usos de diagnóstico y terapéuticos de las mismas | |
| ES2529453T3 (es) | Nuevas composiciones de liposomas | |
| ES2333400T3 (es) | Composiciones y procedimientos para tratar linfonas. | |
| ES2365639T3 (es) | Ectoína para el tratamiento de fugas vasculares. | |
| Geng et al. | Bioactive phospho-therapy with black phosphorus for in vivo tumor suppression | |
| CN103443123A (zh) | 脂蛋白复合物及其制备和用途 | |
| US9682094B2 (en) | Targeting matriptase expressing tumor cells with chemotherapeutic agents conjugated to matriptase antibodies | |
| ES2973098T3 (es) | Administración liposomal dirigida de análogos de CGMP | |
| BRPI0616598A2 (pt) | composições de lipossoma e o uso das mesmas | |
| ES2894026T3 (es) | Composición que comprende antagonistas del VEGF y un péptido catiónico y usos de la misma | |
| ES2303114T3 (es) | Metodo para cargar medicamentos en liposomas. | |
| IT202000013042A1 (it) | Sistema liposomiale con killer tnf-apoptosis induced ligand (killertrail), pro-apoptotico-direzionante. | |
| ES2897983T3 (es) | Liposomas cargados con IPA-3 y procedimientos de uso de los mismos | |
| ES2676543T3 (es) | Terapia profiláctica y nutracéutica | |
| ES2356880B1 (es) | Liposomas recubiertos con el dominio extracelular de la prote�?na apo2l/trail. | |
| De Miguel et al. | Double-edged lipid nanoparticles combining liposome-bound TRAIL and encapsulated doxorubicin showing an extraordinary synergistic pro-apoptotic potential | |
| Hu et al. | Treatment of lung cancer by peptide-modified liposomal irinotecan endowed with tumor penetration and NF-κB inhibitory activities | |
| Ren et al. | Resolving hepatic fibrosis via suppressing oxidative stress and an inflammatory response using a novel hyaluronic acid modified nanocomplex | |
| Cui et al. | 13F-1, a novel 5-fluorouracil prodrug containing an Asn–Gly–Arg (NO2) COOCH3 tripeptide, inhibits human colonic carcinoma growth by targeting Aminopeptidase N (APN/CD13) | |
| ES2214269T3 (es) | Composiciones liposomicas para una retencion del farmaco mejorada. | |
| KR20090115856A (ko) | 캄포테신 유도체를 함유하는 약학적 조성물 | |
| Parrasia et al. | Small-molecule modulators of mitochondrial channels as chemotherapeutic agents | |
| ES2885823T3 (es) | Liposomas para modulación de proteína de síndrome de Wiskott-Aldrich | |
| ES2380620T3 (es) | Tratamiento de tumores resistentes a múltiples fármacos mediante un conjugado de mitomicina C |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2356880 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20120423 |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20180924 |