ES2894026T3 - Composición que comprende antagonistas del VEGF y un péptido catiónico y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende el péptido RRRRRRRR (SEQ ID NO: 1) y ranibizumab, en donde la relación molar de péptido a ranibizumab es de al menos 40:1.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición que comprende antagonistas del VEGF y un péptido catiónico y usos de la misma

Campo de la invención

La invención se refiere a una composición que comprende ranibizumab y el péptido R8, y a dicha composición para su uso en el tratamiento o prevención de afecciones vasculoproliferativas, particularmente en el ojo.

Antecedentes de la invención

Los antifactores de crecimiento endotelial vascular (anti-VEGF) han revolucionado el tratamiento de la degeneración macular asociada con la edad (DMAE). Las inyecciones intraoculares de ranibizumab (Lucentis) son los tratamientos anti-VEGF más comunes aprobados por el Instituto Nacional para la Excelencia en la Salud y la Atención (NICE, del inglés "National Institute for Health and Care Excellence"), aunque los regímenes de inyección exitosos son muy costosos (el Servicio Nacional de Salud (NHS, del inglés "National Health Service") estima 85 millones de libras/año). Además de la creciente carga de los servicios de salud, las inyecciones están asociadas con complicaciones oculares importantes, que incluyen endoftalmitis, desprendimiento de retina, cataratas y uveítis, y no interesa a los pacientes. Existe una gran cantidad de datos clínicos que respaldan la eficacia y seguridad de Lucentis. Al igual que los otros tratamientos con anticuerpos monoclonales en esta categoría, actualmente se requiere la administración por parte de un médico especialista a través de una inyección intravítrea que es desagradable para el paciente y puede estar asociada con una infección, sangrado y desprendimiento de retina.

Rosenfeld P. et al., (2006) NEJM, 355, páginas 1419-1431 describe ranibizumab para la degeneración macular asociada con la edad neovascular.

Sumario de la invención

La presente invención describe una nueva formulación para mejorar de manera considerable la cantidad de anti-VEGF que llega a los tejidos intraoculares mediante la administración tópica. Utiliza un pequeño péptido catiónico (R8, oligoarginina, RRRRRRRR (SEQ ID NO: 1)). Hasta ahora, el R8 se ha caracterizado como un péptido que penetra en las células (CPP, del inglés "cell-penetrating peptide"). Los CPP se definen como péptidos que permiten el paso a través de las barreras de la membrana celular permitiendo la captación intracelular de fármacos (Ye et al. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(11), 1892). Determinados estudios confirman que el R8 promueve la captación corneal in vivo e in vitro, donde se demostró el paso de Lucentis a través de una barrera de la membrana celular inalterada.

Sin embargo, un hallazgo sorprendente fue que R8 promovió la administración de anti-VEGF a través de las células de la córnea. Esto se demostró utilizando un ensayo de transcitosis y midiendo el cambio en el coeficiente de permeabilidad del fármaco (Papp) de Avastin y Lucentis en presencia de R8/ST-R8. El Papp de ambos anti-VEGF aumentó de manera considerable en presencia de R8/ST-R8. Se encontró que esta mejora ocurre de una manera dependiente de la concentración, siendo eficaz con una relación molar entre 40:1 y 200:1 de R8 a antagonista, y siendo particularmente eficaz con una relación molar entre 50:1 a 80:1 de R8 a antagonista.

Investigaciones posteriores mostraron que el paso a través de las células de la córnea no fue tóxico con R8 en todas las concentraciones estudiadas, y solo fue tóxico con ST(estearil)-R8 cuando la relación molar era >40:1. No se registraron cambios en la resistencia transepitelial (TEER, del inglés "transepithelial resistance"), lo que indica la participación de un mecanismo transcelular, ya que la integridad de la barrera de la córnea permaneció inalterada. Este es nuevamente un hallazgo novedoso, ya que estudios previos han sugerido que los polipéptidos de poliarginina (36 kDa) inducían una interrupción reversible de uniones estrechas que se manifiesta como un cambio en la TEER (Nemoto et al. Biol Pharm Bull. Septiembre de 2007; 30(9):1768-72.). Además, estos ensayos mostraron claramente que la presencia de R8 no interfiere con la actividad de unión de VEGF. Finalmente, se realizó una evaluación funcional adicional de la actividad del anti-VEGF in vivo en conejos en los que solo se dosificó en un ojo con instilación tópica de Lucentis 10 mg/ml en comparación con Lucentis 10 mg/ml/R850 mg/ml. Las mediciones a las 2 horas después de la aplicación tópica mostraron que el R8 aumenta de manera significativa los niveles de Lucentis en el vítreo y la retina/coroides de los ojos recién enucleados (10 frente a 215 ng/g de tejido).

Los aspectos únicos de este enfoque es su simplicidad, ya que no requieren una formulación compleja o componentes costosos; la simple mezcla del péptido liofilizado con un antagonista de VEGF, tal como Lucentis, en la relación molar óptima permite la administración de una concentración terapéuticamente apropiada a los tejidos del segmento posterior.

La invención utiliza Lucentis (Ranibizumab) e incluye una nueva formulación que permite la administración en forma de colirio. Esto: •

• Evitará la experiencia desagradable del paciente y los posibles efectos adversos de la inyección intravítrea • Permitirá la autoadministración en casa

• Evitará los costes asociados con las visitas a la clínica para el tratamiento y manejo de los efectos adversos relacionados con las inyecciones

• Permitirá una ventaja potencial de dosificación (y un coste de terapia potencialmente más bajo).

• Se informa que la semivida de ranibizumab en el ojo es de 7,19 días. Por lo tanto, debe utilizarse una dosis elevada para mantener una concentración terapéutica en la parte posterior del ojo durante todo el mes antes de la siguiente inyección.

La adición de pequeños péptidos catiónicos (como R8) a otras proteínas farmacológicas (anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas terapéuticas) mejoraría de manera similar la capacidad de estos factores para ser transportados a través de barreras biológicas de una manera similar a la presentada para Lucentis.

Determinados estudios indican que ~70 % de la dosis absorbida aplicada por vía tópica llega a los tejidos intraoculares por absorción tópica en lugar de sistémica, una propiedad farmacodinámica muy deseable. No se registraron informes de irritación o lesión ocular en estudios in vivo en conejos y ambos agentes fueron bien tolerados con un modelo in vitro del epitelio corneal (células HCE-S).

La adición del péptido R8 y ranibizumab en la composición de la invención se redujo mediante la adición de trehalosa a la formulación. Se encontró que una concentración de trehalosa de 600 mg/ml era particularmente eficaz.

Finalmente, además de una elevada permeación corneal, la mejora del tiempo de contacto ocular con el fármaco es una estrategia reconocida para mejorar la administración de fármacos aplicados por vía tópica a los tejidos oculares posteriores. En la presente invención, la mejora del tiempo de contacto ocular con el fármaco se consiguió mediante la formulación de la mezcla de péptido R8 y ranibizumab antes mencionada con un agente potenciador de la viscosidad tal como un polímero o hidrogel. La incorporación de la combinación de ranibizumab y R8 en un hidrogel termoestable que comprende Lutrol F127 al 20 % (p/v), mejoró de manera considerable la administración de anti-VEGF a los tejidos oculares posteriores en comparación con la formulación del colirio descrito anteriormente. Los inventores proponen que este efecto no se limitará a los hidrogeles que contienen Lutrol-F127 y también se observaría para otros potenciadores de viscosidad biocompatibles, combinaciones de los mismos (por ejemplo, ácido hialurónico, hipermelosa, etc.) u otros materiales formadores de gel de hidrogel biocompatibles.

Los inventores también han descubierto que la adición de un polímero mucoadhesivo, tal como quitosano, a la formulación mejora la administración de la formulación a los tejidos oculares posteriores.

Por lo tanto, la invención proporciona:

Una composición que comprende el péptido RRRRRRRR (SEQ ID NO: 1) y ranibizumab, en donde la relación molar de péptido a ranibizumab es de al menos 40:1.

La invención también proporciona:

La composición de la invención como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF.

La invención también proporciona:

La composición de la invención como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección vasculoproliferativa del ojo.

La invención también proporciona:

Un kit que comprende la composición de la invención como se define en el presente documento.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Medición in vitro del paso transcelular del anti-VEGF El ensayo Transwell permite la evaluación de la transcitosis del anti-VEGF utilizando la TER como medida de la integridad de la barrera. TEER: La resistencia eléctrica transepitelial describe la resistencia eléctrica de la barrera epitelial corneal de las HCE-S. Si la barrera permanece inalterada, este valor no disminuirá durante el transcurso de un experimento.

[A] Ilustración del ensayo utilizado. [B] Los resultados demuestran que la presencia de R8 (conjugado con estearilo, ST-R8) mejoró la administración de Lucentis a través de este modelo de barrera corneal. (ANOVA bidireccional con pruebas a posteriori de Bonferroni ** p <0,01, ***p <0,001).

Figura 2 - La adición de R8 y Lucentis no tiene ningún efecto sobre la integridad de la barrera epitelial corneal (sin disminución de la TEER)

Figura 3 - Una relación de R8 a Lucentis de 40:1 o más mejora de manera significativa la transcitosis corneal in vitro

Un hallazgo sorprendente en los presentes estudios in vitro fue que hay evidencia de que R8 promueve la administración a través de las células de la córnea. Otro método para controlar el alcance de la administración a través de los modelos de barrera corneal es calcular el coeficiente de permeabilidad del fármaco (Papp) como se describe en Davis et al. 2014. R8 (=> relación 40:1) mejora la transcitosis de Lucentis (* p <0,05, **p <0,01). El efecto de la relación es sorprendente ya que trabajos anteriores (de Cogan et al., 2017) han sugerido que una relación molar 25:1 de R7 a Avastin es suficiente.

Figura 4 - R8 mejora la administración de antagonistas de VEGF a través de las barreras corneales in vitro de una manera dependiente de la concentración.

La presencia de R8 (ST-R8) ayudó al transporte de los anti-VEGF [A] Avastin y [B] Lucentis a través de la barrera de las HCE-S (prueba T bilateral, P = 0,0096). [C] Estearil-R8 mejoró la administración del anti-VEGF Lucentis a través de la barrera de las HCE-S de una manera dependiente de la concentración. ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni P = 0,0307.

Figura 5 - Ensayo de toxicidad de HCE-S con R8/Lucentis

Las combinaciones de R8 y Lucentis (relación máxima de 200/1) fueron bien toleradas por las células HCE-S in vitro en todas las concentraciones probadas. La tabla muestra las relaciones molares de R8 a Lucentis utilizadas en cada punto del ensayo.

Figura 6 - R8 no influye de manera negativa en la unión de VEGF165 Se utilizó un ELISA funcional para controlar la afinidad de Lucentis en presencia de concentraciones variables de R8.

La adición de R8 a Lucentis no afectó de manera negativa a la actividad de unión de VEGF.

Figura 7- Efecto de R8 en la unión de VEGF165 a Avastin

Se utilizó un ELISA funcional para controlar la afinidad de Avastin en presencia de concentraciones variables de R8. La adición de R8 a Avastin no afectó de manera negativa a la actividad de unión de VEGF.

Figura 8- Efecto de la relación R8:Lucentis sobre la estabilidad a 25 °C y con la adición de trehalosa Se utilizó la absorbencia (600 nm) para evaluar la agregación de la formulación R8:Lucentis (R/L) a lo largo del tiempo.

Las formulaciones más estables tenían una relación R/L de 50 a 100/1.

Sorprendentemente, la agregación se retrasó en las formulaciones R/L >100:1 mediante el aumento de la concentración de trehalosa (100 a 300 mg/ml ensayados).

Figura 9- Estudio de estabilidad acelerada (6 horas a 25 °C luego 7 días a 4 °C)

Aumentar la concentración de trehalosa (a 600 mg/ml) o reducir la de Lucentis (1 mg/ml mientras se mantiene la relación R/L) aumentó la estabilidad.

Figura 10- R8/Lucentis es estable durante 3 meses a 4 °C

[A] Las combinaciones de R8/Lucentis en proporciones de 40:1 y 80:1 son estables durante 3 meses a 4 °C.

[B] Estabilidad de la formulación de 12 semanas a 4 °C en Lucentis:R8 a 1:50 (solución, no hidrogel). Una combinación de fórmula de Lucentis y R8 en relación 1:50 permaneció estable después de 12 semanas cuando se almacenó a 4 °C.

Figura 11- Detección mediante ELISA de Lucentis para un trabajo in vivo

R8, aunque es un péptido muy cargado, no interfiere con el ELISA de detección de Lucentis utilizado para el ensayo Transwell.

Figura 12- Experimento en conejo: Lucentis libre (2 h)

Se detectaron niveles bajos (~20 ng) de Lucentis libre en la retina 2 h (Cmáx previamente establecida) después de la instilación tópica. Estos datos se utilizaron como controles para comparar con los datos de la formulación. La concentración detectada en plasma fue mínima (<0,1 ng/ml). La proporción de fármaco administrado por vía tópica y sistémica se puede estimar utilizando la siguiente ecuación;

D

Tópico absorbido (%) = 100 x

(D C)

donde D es la concentración de Lucentis detectada en el tejido ocular dosificado y C es la concentración en el co­ ojo. La proporción de Lucentis libre dosificado que llega a la retina por vía tópica fue ~30 % (n = 10).

Figura 13- La relación de R8:Lucentis de 20/1 no mejora la administración en la retina después de 2 h.

100 mg/ml de Lucentis con 50 mg/ml de R8, no hubo una mejora significativa en la administración de Lucentis a la retina en comparación con el control de Lucentis solo (n = 3) (16 ± 6 ng/g frente a 18 ± 8 ng/g). Esta relación de péptido R a anti-VEGF es similar a la informada en la referencia de Cogan (2017) (25:1).

Figura 14- La relación de R8:Lucentis de 200/1 mejora la administración en la retina después de 2 h.

10 mg/ml de Lucentis con 50 mg/ml de R8, mejora significativa en la administración de Lucentis a la retina en comparación con el control de solo Lucentis.

Figura 15- Sumario de experimentos con conejos

Evaluación in vivo de las concentraciones de Lucentis en la retina después de la aplicación tópica de formulaciones R/L a las 2 h. No hay diferencias significativas en el nivel de Lucentis retiniano cuando se compara el control de Lucentis libre con el grupo R/L de relación 20/1. Sin embargo, hay un aumento significativo (*13,5 veces) en el nivel de la retina cuando el grupo R/L de relación 200/1 se compara con el grupo R/L 20/1.

Figura 16- Preparación de hidrogeles de R8:Lucentis para mejorar la administración Para aumentar el tiempo de contacto con la córnea, se prepararon formulaciones de R8:Lucentis con hidrogeles para mejorar la viscosidad de la formulación.

Se eligió Lutrol F127 porque ya se utiliza en varias aplicaciones clínicas existentes debido a sus propiedades termosensibles.

El intervalo de concentraciones de Lutrol F127 estuvo entre el 15 % y el 25 % (p/v). Las soluciones se prepararon mediante la mezcla de las cantidades deseadas de Lutrol F127. Se encontró que entre el 20 % y el 25 % de Lutrol F127 se genera un gel termosensible con las propiedades deseadas.

Figura 17- Estudio de estabilidad acelerada (25 °C después a 4 °C)

[A] El hidrogel de Lutrol al 20 % mejora la estabilidad de las formulaciones de Lucentis. La presencia de Lutrol ayuda a prevenir la agregación de las formulaciones de R8:Lucentis (como se ve por el aumento de DO) incluso en una relación de 200:1.

[B] La formulación de 12 semanas de hidrogel U8:Lucentis mostró una buena estabilidad cuando se almacenó a 4 °C (Relación Lucentis:R8 de 1:50).

[C] La prueba de estabilidad acelerada de U8:Lucentis (relación 50:1) 12 h a 25 °C no mostró una pérdida significativa de la actividad de unión de VEGF (ELISA funcional) en comparación con U8:Lucentis almacenado a 4 °C o un control de solo Lucentis.

[D] Estabilidad de las formulaciones de U8:Lucentis que contienen quitosano a las 4 semanas. La estabilidad de la formulación de U8:Lucentis (80:1) con quitosano al 0,1 % p/v mostró una buena estabilidad durante 4 semanas según lo determinado por la relación CE50 (U8:Lucentis/Patrón) de menos de 2.

Figura 18- Se comprobó la liberación sostenida in vitro utilizando un ensayo de liberación de hidrogel de Lucentis

[A] (Gel de Lutrol al 20 %) tarda ~1 h en liberar Lucentis. Se obtuvieron resultados similares in vivo (Conejo) con hidrogeles de Lutrol cargados con FITC.

[B] Sumario de estabilidad de formulaciones líquidas de R8/Lucentis e hidrogel

Figura 19- La formulación de la relación de hidrogel de R8/Lucentis 200:1 (Lutrol al 20 %) mejora de manera considerable la administración a la retina

[A] Gel de Lucentis 2 h (relación 200:1), n = 3, Lucentis 10 mg/ml y R8 50 mg/ml. Se administraron concentraciones significativas de Lucentis a la retina frente al ojo sin dosificar. La concentración alcanzó 41823 ± 18709 ng/g de tejido retiniano, superando el objetivo de 200 ng/g.

[B] Gel de Lucentis 12 h (relación 200:1), n = 3, Lucentis 10 mg/ml y R8 50 mg/ml. Se administraron concentraciones significativas de Lucentis a la retina frente al ojo sin dosificar. La concentración alcanzó 5282 ± 2840 ng/g de tejido retiniano, superando el objetivo de 200 ng/g.

[C] Sumario de la formulación de hidrogel de R8:Lucentis 200:1 de liberación en la retina a lo largo del tiempo.

Figura 20- La formulación de la relación de hidrogel de R8/Lucentis 50:1 (Lutrol al 20 %) mejora de manera considerable la administración a la retina

[A] Gel de Lucentis 2 h (relación 50:1), n = 6, Lucentis 10 mg/ml y R8 12,5 mg/ml. Se administraron concentraciones significativas de Lucentis a la retina frente al ojo sin dosificar. La concentración alcanzó 1254 ± 460 ng/g de tejido retiniano, superando el objetivo de 200 ng/g.

[B] Gel de Lucentis 2 h (relación 50:1), n = 6, Lucentis 10 mg/ml y R8 12,5 mg/ml. Se administraron concentraciones significativas de Lucentis a la retina frente al ojo sin dosificar. La concentración alcanzó 13790 ± 6725 ng/g de tejido retiniano, superando el objetivo de 200 ng/g.

[C] Gel de Lucentis 2 h (relación 50:1), n = 6, Lucentis 10 mg/ml y R8 12,5 mg/ml. Se administraron concentraciones significativas de Lucentis a la retina frente al ojo sin dosificar. La concentración alcanzó 169 ± 140 ng/g de tejido retiniano, por debajo del objetivo de 200 ng/g.

[D] Sumario de la formulación de hidrogel de R8:Lucentis 50:1 de liberación en la retina a lo largo del tiempo.

Figura 21- Sumario del trabajo de hidrogel y tolerabilidad y toxicidad de la formulación de hidrogel

[A] Evaluación in vivo de las concentraciones de Lucentis en la retina después de la aplicación tópica de formulaciones R/L a las 2 h, 12 h, 24 h y 72 h. No hubo diferencias significativas en el nivel de Lucentis en la retina cuando se comparó el control de Lucentis libre con el grupo de relación R/L 20/1 a las 2 h. Sin embargo, hubo un aumento significativo (*13,5 veces) en el nivel en la retina cuando se comparó el grupo de relación R/L 200/1 con el grupo R/L 20/1 a las 2 h. Además, hubo un aumento de *195 veces el nivel de Lucentis en la retina a las 2 h, retenido a las 12 h, cuando se comparó la formulación de hidrogel 200/1 con el grupo de relación 200/1. También hubo un aumento significativo en el nivel en la retina cuando se comparó el grupo de relación R/L 50/1 con el grupo R/L 20/1. Además, se observaron mejoras adicionales en la administración y retención en la retina mediante el aumento de la relación R/L a 80:1 y la adición del quitosano mucoadhesivo. Se encontró que un aumento en la relación R/L a 80:1 y la adición de un mucoadhesivo (quitosano al 0,1 %) mejora de manera sustancial la administración frente a repeticiones anteriores.

[B] Evaluación de la toxicidad en la córnea de ojos de conejo. Mediante la búsqueda de evidencia de enrojecimiento, hinchazón, secreción, ulceración, hemorragia o cicatrización en el ojo tratado. No hubo evidencia de toxicidad en la córnea o evidencia de enrojecimiento o daño en la córnea asociado con la administración de U8:Lucentis (como se observa mediante tinción con fluoresceína).

Figura 22- Optimización de la formulación

Las formulaciones se probaron en ensayos de estabilidad acelerada a 25 °C, ensayos de estabilidad de 3 meses a 4 °C, en el ensayo Transwell de HCE-S in vitro y en estudios en conejos in vivo. Se encontró que un intervalo de relación de R8 a Lucentis de 50 a 80:1 era óptimo.

Figura 23-Cromatografía de exclusión por tamaño para investigar la unión de R8 a Lucentis Este método cromatográfico se utiliza para la separación de moléculas por tamaño o, en algunos casos, por peso molecular. Suele aplicarse a moléculas grandes o complejos macromoleculares. No hubo elución conjunta de Lucentis y FITC-R8, así que no hubo unión.

Figura 24- Microbalanza de cristal de cuarzo para investigar la unión de R8 a Lucentis Este método mide una variación de masa por unidad de área mediante la medición del cambio de frecuencia de un resonador de cristal de cuarzo. La resonancia se ve perturbada por la adición o eliminación de una pequeña masa debido al crecimiento/descomposición del óxido o la deposición de la película en la superficie del resonador acústico. Se utilizaron 10 pg/ml de Lucentis, aproximadamente 100 pl en inyecciones. No se detectó unión a R8.

Figura 25- Resonancia de plasmón superficial para investigar la unión de R8 a Lucentis Lucentis inmovilizado en la superficie del chip CM5 UR = 3700. Se detectó alguna unión de R8 a Lucentis.

Figura 26- Calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para investigar la unión de R8 a Lucentis HisCl 10 mM, trehalosa al 10 %, pH 5,5

[A] Relación molar de R8:Lucentis

[B] Calores de dilución de R8 (proporciones trazadas solo con fines ilustrativos)

[C] Resultados de ITC con una relación de 0 a 2,5 de R8:Lucentis y una relación de 2,5 a 180 de R8:Lucentis. No se detectó unión.

Figura 27- El transporte de dextranos utilizado para investigar si el R8 puede transportar dextranos a través de la membrana. R8 no supuso ninguna diferencia en el transporte de diferentes tamaños de dextrano a través de una membrana.

Figura 28 - Sumario de las investigaciones de la interacción entre R8 y Lucentis

Descripción detallada de la invención

Debe entenderse que las diferentes aplicaciones de los métodos divulgados pueden adaptarse a las necesidades específicas de la materia. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene únicamente el fin de describir realizaciones particulares de la invención y no se pretende que sea limitante.

Además, como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno/a" y "el/la" incluyen las referencias en plural, salvo que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "péptido catiónico pequeño" incluye "péptidos catiónicos pequeños" y similares. "R8:Lucentis", "R8/Lucentis" o "R8 a Lucentis" se utilizan indistintamente para significar la relación de R8 a Lucentis.

Las expresiones "U8 Lucentis", "gel U8 Lucentis" e "hidrogel U8 Lucentis" se utilizan indistintamente para referirse a una formulación de R8 y Lucentis que contiene un hidrogel y trehalosa.

La composición de la invención comprende ranibizumab (Lucentis) y el péptido catiónico pequeño R8, RRRRRRRR, (SEQ ID NO: 1).

Antagonista de VEGF

Los antagonistas de VEGF se pueden definir como cualquier agente que previene o inhibe la expresión o función de VEGF. Los antagonistas de VEGF pueden ser proteínas. Los antagonistas de VEGF pueden ser un receptor soluble de VEGF, tal como aflibercept (Eylea) o un anticuerpo anti-VEGF. Los antagonistas de VEGF pueden ser diacuerpos o anticuerpos biespecíficos. Los antagonistas de VEGF pueden ser fragmentos o derivados de anticuerpos anti-VEGF. Los ejemplos de fragmentos o derivados de anticuerpos incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento dAb y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. También se pretende que estén incluidos anticuerpos monocatenarios, tales como los anticuerpos scFv. Por tanto, los antagonistas de VEGF pueden ser anticuerpos scFv. El antagonista de VEGF de la invención es el anticuerpo anti-VEGF ranibizumab (Lucentis).

Péptido catiónico pequeño

Pequeños péptidos catiónicos de parte de la composición de la invención. Los péptidos catiónicos pequeños de la invención son péptidos penetrantes en células (CPP). Los péptidos catiónicos pequeños de la invención ayudan a la captación de sustancias en los tejidos. Los péptidos catiónicos pequeños de la invención ayudan a la captación intracelular de sustancias. Los péptidos catiónicos pequeños de la invención mejoran la transcitosis de sustancias. Los expertos en la materia pueden medir la captación intracelular y la transcitosis mediante métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, la transcitosis se puede medir mediante un ensayo de transcitosis de HCE-S in vitro (como se describe en Davis et al. (2014)).

Los péptidos catiónicos pequeños pueden consistir en 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos y tener una carga positiva general debido a la presencia de aminoácidos catiónicos. Los aminoácidos catiónicos tienen una carga positiva a pH fisiológico. Los ejemplos de dichos aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina, histidina y arginina.

Se entenderá que los péptidos catiónicos pequeños de la invención pretenden abarcar determinadas variantes de dichos péptidos. Aparte de la ingeniería para reducir la formación de dímeros indicada anteriormente, se pueden realizar otras modificaciones a la secuencia de aminoácidos nativa de un péptido. Por ejemplo a uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en la secuencia de un péptido. Cualquiera de dichas modificaciones será normalmente conservativa, en que si un aminoácido en la secuencia nativa se reemplaza con un aminoácido diferente, el aminoácido diferente normalmente tendrá propiedades similares al aminoácido nativo. La siguiente tabla muestra las propiedades de los aminoácidos. Los pesos moleculares se muestran junto al código de 3 letras para cada aminoácido. Los pesos moleculares indicados son los aminoácidos libres neutros; los pesos de los restos se pueden obtener mediante la resta de un equivalente de agua (18 g/mol). La invención también incluye péptidos que contienen extremos N y C modificados o bloqueados para reducir o inhibir la degradación mediante enzimas exopeptidasas.

El resto o restos que se modifican pueden estar comprendidos en cualquier parte de la secuencia.

Los péptidos catiónicos pequeños de la invención ayudan a la captación de antagonistas de VEGF en los tejidos. Estos péptidos ayudan a la captación de antagonistas de VEGF en la retina cuando la composición de la invención se administra por vía tópica al ojo. Estos péptidos ayudan a la transcitosis de los antagonistas de VEGF a alcanzar la retina cuando la composición de la invención se administra por vía tópica al ojo. En la invención, el péptido catiónico pequeño es un péptido R8 o un péptido R8 modificado (por ejemplo, estearil-R8 (ST-R8)). R8 se define como ocho restos de arginina consecutivos, RRRRRRRR (SEQ ID NO:1).

En la composición de la invención, la relación de péptido catiónico pequeño a antagonista de VEGF se establece como una relación molar. En la composición de la invención, la relación de R8 a Lucentis es de al menos 40:1, al menos 50:1, al menos 60:1, al menos 70:1, al menos 80:1, al menos 90:1, al menos 100:1, al menos 150:1 o al menos 200:1. Un intervalo de relación preferido de R8 a Lucentis es de 50:1 a 80:1.

Síntesis de péptidos

Los péptidos catiónicos pequeños de la invención se pueden sintetizar utilizando métodos bien conocidos en la materia. Los métodos preferidos incluyen técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida y lo más preferentemente un sintetizador de péptidos automatizado o semiautomatizado. Normalmente, utilizando dichas técnicas, un aminoácido protegido con a-N-carbamoílo y un aminoácido unido a la cadena peptídica en crecimiento en una resina se acoplan a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidinona o cloruro de metileno en presencia de agentes de acoplamiento tales como diciclohexilcarbodiimida y 1-hidroxibenzotriazol en presencia de una base tal como diisopropiletilamina. El grupo protector a-N-carbamoílo se elimina del péptido-resina resultante utilizando un reactivo tal como ácido trifluoroacético o piperidina, y la reacción de acoplamiento se repite con el siguiente aminoácido N protegido que se desea añadir a la cadena peptídica. Los grupos protectores de N adecuados son bien conocidos en la materia e incluyen t-butiloxicarbonilo (tBoc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).

El término "péptido" incluye no solo moléculas en las que los restos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas en las que se invierte el enlace peptídico. Dichos peptidomiméticos retroinversos se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, tales como los descritos en Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque implica preparar pseudopéptidos que contienen cambios que implican la cadena principal y no la orientación de las cadenas laterales. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

De manera similar, se puede prescindir del enlace peptídico por completo siempre que se utilice un resto conector adecuado que conserve la separación entre los átomos de carbono de los restos de aminoácidos; se prefiere en particular si el resto conector tiene sustancialmente la misma distribución de cargas y sustancialmente la misma planicidad que un enlace peptídico. También se apreciará que el péptido puede bloquearse convenientemente en su extremo N o C para ayudar a reducir la susceptibilidad a la digestión exoproteolítica. Por ejemplo, el grupo amino del extremo N de los péptidos puede protegerse haciéndolo reaccionar con un ácido carboxílico, y el grupo carboxilo del extremo C del péptido puede protegerse haciéndolo reaccionar con una amina. Otros ejemplos de modificaciones incluyen glucosilación y fosforilación. Otra posible modificación es que los hidrógenos de las aminas de la cadena lateral de R o K pueden reemplazarse por grupos metileno (-NH2 se reemplaza por -NH(Me) o - N(Me)2) (metilación). Otra posible modificación es que los hidrógenos de un grupo hidroxilo de un aminoácido tal como K pueden reemplazarse con un grupo acetilo (CH3CO) (acetilación).

Los análogos de péptidos de acuerdo con la invención también pueden incluir variantes de péptidos que aumentan o disminuyen la semivida del péptido in vivo. Los ejemplos de análogos capaces de aumentar la semivida de los péptidos usados de acuerdo con la invención incluyen análogos peptoides de los péptidos, derivados de D-aminoácidos de los péptidos e híbridos de péptido-peptoide. Una realización adicional de los polipéptidos variantes usados de acuerdo con la invención comprende formas de D-aminoácidos del polipéptido. La preparación de polipéptidos usando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos disminuye en gran medida cualquier degradación indeseada de dicho agente mediante procesos metabólicos normales, disminuyendo las cantidades de agente que es necesario administrar, junto con la frecuencia de su administración.

Formulaciones

En una realización preferida, la composición de la invención también puede comprender otros componentes. Dichos componentes pueden actuar para mejorar la estabilidad de la formulación, por ejemplo, mediante la prevención de la agregación, o puede actuar para mejorar su eficacia. Dichos componentes pueden actuar para mejorar la estabilidad de la formulación de modo que generalmente sea más estable durante el almacenamiento y transporte y tenga una vida útil más larga que la formulación equivalente sin el componente adicional.

En una realización preferida de la invención, la composición de la invención también comprende trehalosa. La trehalosa actúa para retrasar la agregación de la formulación de R8 y ranibizumab. La concentración de trehalosa en la composición puede ser de 100 mg/ml o más, 200 mg/ml o más, 300 mg/ml o más, 400 mg/ml o más, 500 mg/ml o más o preferentemente 600 mg/ml o más. En una realización preferida de la invención, la composición de la invención también comprende trehalosa a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml.

Otros agentes alternativos o adicionales que pueden actuar para mejorar la estabilidad de las composiciones incluyen azúcar trehalosa, tampones, agentes de tonicidad, hidratos de carbono simples, azúcares tales como sorbitol o sacarosa, polímeros de hidratos de carbono, aminoácidos, oligopéptidos, ácidos poliamino, alcoholes polihídricos y éteres de los mismos, detergentes, lípidos, tensioactivos, antioxidantes, sales, seroalbúmina humana, gelatinas, formaldehído, polisorbato 80 o combinaciones de los mismos.

En una realización preferida de la invención, la composición de la invención comprende un agente que aumenta la viscosidad de la composición. El experto en la materia puede medir la viscosidad mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo, utilizando un viscosímetro o reómetro. Un ejemplo de un agente que aumenta la viscosidad es un hidrogel. En una realización preferida de la invención, la composición de la invención comprende un hidrogel. El hidrogel mejora el tiempo de contacto de la composición con el tejido de interés, por ejemplo, la córnea, mediante el aumento de la viscosidad de la composición. Los ingredientes comunes en los hidrogeles incluyen alcohol polivinílico, poliacrilato de sodio, polímeros y copolímeros de acrilato con abundancia de grupos hidrófilos. Se están investigando materiales de hidrogel naturales para la ingeniería de tejidos; estos materiales incluyen agarosa, metilcelulosa, hialuronano y otros polímeros de origen natural.

Los agentes alternativos que se pueden añadir a la composición para aumentar la viscosidad de la composición incluyen Lutrol (Poloxamer), quitosano, gelificantes, polisacáridos, proteínas, polietilenglicol y carbómeros.

La concentración de hidrogel en la composición de la invención puede estar entre el 15 % y el 25 % p/v. Preferentemente, la concentración de hidrogel está entre el 20 % y el 25 % p/v. El hidrogel puede ser, por ejemplo, ácido hialurónico, hipermelosa u otro material biocompatible formador de gel de hidrogel. En una realización preferida, el hidrogel es Lutrol F127.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende tanto trehalosa como un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 50:1, trehalosa y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 100:1, trehalosa y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 200:1, trehalosa y un hidrogel.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa a una concentración de al menos 100 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 50:1, trehalosa a una concentración de al menos 100 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa a una concentración de al menos 100 mg/ml y un hidrogel.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa a una concentración de al menos 200 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 50:1, trehalosa a una concentración de al menos 200 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa a una concentración de al menos 200 mg/ml y un hidrogel.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa a una concentración de al menos 300 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 50:1, trehalosa a una concentración de al menos 300 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa a una concentración de al menos 300 mg/ml y un hidrogel.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa a una concentración de al menos 600 mg/ml y un hidrogel. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 200:1, trehalosa a una concentración de al menos 600 mg/ml y un hidrogel.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa y un hidrogel a una concentración de al menos el 15 % al 25 % p/v. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 40:1, trehalosa y un hidrogel a una concentración de al menos el 20 % al 25 % p/v.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 50:1, trehalosa y un hidrogel a una concentración de al menos el 20 % al 25 % p/v. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa y un hidrogel a una concentración de al menos el 20 % al 25 % p/v. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa a una concentración de al menos 100 mg/ml y un hidrogel a una concentración de al menos el 20 % al 25 % p/v.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 50:1 a 80:1, trehalosa a una concentración de al menos 200 mg/ml y un hidrogel a una concentración de al menos el 20 % al 25 % p/v. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de al menos 200:1, trehalosa a una concentración de al menos 600 mg/ml y un hidrogel a una concentración del 20 % al 25 % p/v.

Un ejemplo de una formulación final de la invención comprende Lucentis 8 mg/ml (0,173 mM) (Lucentis 10 mg/ml, histidina HCl 10 mM, trehalosa 100 mg/ml, polisorbato 80 al 0,01 %, pH 5,5), R8 10 mg/ml (relación molar de R8:Lucentis 50:1), trehalosa 200 mg/ml, Lutrol-F127 al 20 % p/v, polisorbato 80 al 0,01 %, pH 5,5.

En una realización preferida, la composición de la invención también comprende un polímero mucoadhesivo. Los polímeros mucoadhesivos ya están en uso clínico para mejorar aún más la administración de Lucentis a los tejidos oculares posteriores. Un ejemplo de un polímero mucoadhesivo adecuado para su uso en la invención es el quitosano. Aunque hasta la fecha no existe ningún medicamento aprobado por la UE que incluya quitosano, ha habido un ensayo clínico con quitosano, principalmente en colirios para los ojos secos: Tolerabilidad local de colirios de quitosano-N-acetilcisteína en voluntarios jóvenes sanos Identificador de ClinicalTrials.gov: NCT01278784.

Anteriormente, Croma Pharma tenía disponible un colirio que contenía quitosano con el nombre comercial Lacrimera para el tratamiento de los ojos secos (Schmidl, D. et al., 2017). También existe bibliografía que respalda el uso de quitosano con un buen perfil de seguridad y tolerabilidad, pero en un número limitado de pacientes (Fischak C., et al., 2017).

En una realización preferida, la composición de la invención comprende un péptido catiónico pequeño y un antagonista de VEGF en una relación de 50:1 a 80:1, un hidrogel y un polímero mucoadhesivo. En una realización preferida, la composición de la invención comprende un péptido catiónico pequeño y un antagonista de VEGF en una relación de 50:1 a 80:1, un hidrogel y quitosano. Preferentemente, el péptido catiónico pequeño es R8. Preferentemente, el antagonista de VEGF es Lucentis. Preferentemente, el péptido catiónico pequeño es R8 y el antagonista de VEGF es Lucentis. Preferentemente, el quitosano está presente a una concentración de entre el 0,05 % y el 0,25 % p/v. Preferentemente, la relación de R8 a Lucentis es 80:1. Preferentemente, la relación de R8 a Lucentis es 80:1 y el quitosano está presente a una concentración de entre el 0,05 % y el 0,25 % p/v. Preferentemente, la relación de R8 a Lucentis es 80:1 y el quitosano está presente a una concentración de 0,1 p/v. Preferentemente, la relación de R8 a Lucentis es 80:1, el hidrogel está presente a una concentración del 20 % al 25 % p/v y el quitosano está presente a una concentración del 0,1 % p/v. Preferentemente, el quitosano es quitosano 5k. Preferentemente, la composición también comprende trehalosa.

En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 80:1, un hidrogel y quitosano. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 80:1, trehalosa, un hidrogel y quitosano. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 80:1, trehalosa a una concentración del 10 % p/v, un hidrogel a una concentración del 20 % p/v y quitosano a una concentración del 0,1 % p/v. En una realización preferida, la composición de la invención comprende R8 y Lucentis en una relación de 80:1, trehalosa a una concentración del 10 % p/v, un hidrogel a una concentración del 20 % p/v y quitosano 5k a una concentración del 0,1 % p/v.

Un ejemplo de una formulación final de la invención comprende Lucentis 10 mg/ml, R820 mg/ml (relación molar de R8:Lucentis 80:1), Lutrol-F 127 al 20 % p/v, a,a-trehalosa deshidratada al 10 % p/v, quitosano 5k al 0,1 % p/v, histidina HCl 10 mM, polisorbato 80 al 0,01 % p/v, pH 5,5.

Indicaciones terapéuticas

Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir enfermedades o afecciones caracterizadas por disfunción del VEGF. Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir enfermedades o afecciones en las que el VEGF funciona de forma anormal. Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar enfermedades actualmente tratadas por un antagonista de VEGF. Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para prevenir o tratar enfermedades o afecciones caracterizadas por una disfunción del VEGF tales como afecciones vasculoproliferativas, cánceres, edema o vasos permeables, oclusiones de las venas retinales, vasculopatía diabética, enfermedades caracterizadas por angiogénesis retiniana, drepanocitosis y retinopatía del prematuro.

Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para tratar o prevenir enfermedades o afecciones caracterizadas por una disfunción del VEGF tales como afecciones vasculoproliferativas. "Vasculoproliferación", "vasculoproliferativa", "afecciones vasculoproliferativas" y términos similares, como se usan en el presente documento, abarcan todas y cada una de las patologías relacionadas con el desarrollo anormal o no deseado de los vasos sanguíneos o tejido vascular o células. Por ejemplo, tanto la angiogénesis patógena (la formación de nuevos vasos sanguíneos, por ejemplo, a través del crecimiento de nuevos capilares de los vasos sanguíneos existentes) como la malformación vascular (por ejemplo, telangiectasia, la formación de vasos sanguíneos dilatados, vasos tortuosos e incompetentes, microaneurismas) se pueden prevenir o reducir, al igual que la neovascularización y la proliferación de células endoteliales vasculares. Además, como se conoce en la materia, el crecimiento neoplásico requiere la formación de nuevos vasos sanguíneos para proporcionar un suministro de sangre al tumor en crecimiento.

Por lo tanto, los tumores en los que se produce una vasculoproliferación también son afecciones que pueden tratarse, prevenirse o mejorarse de acuerdo con la presente invención.

El tratamiento de afecciones vasculoproliferativas oculares es una realización preferida de la invención. Entre las afecciones que se pueden tratar se encuentran: degeneración macular asociada con la edad (DMAE), retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, retinopatía de prematuridad, telangiectasia macular o neovascularización coroidea, vasculopatía diabética, enfermedades caracterizadas por la angiogénesis retiniana y drepanocitosis. La degeneración macular asociada con la edad puede incluir DMAE "húmeda" o "seca".

El tratamiento de tumores, normalmente tumores sólidos, también se puede realizar, ya que la prevención de la angiogénesis en los tumores deriva en la pérdida de irrigación sanguínea. Las dianas del tratamiento tumoral incluyen tumores en el cerebro, mama, riñón, colorrectal, pulmón, próstata, cabeza y cuello, estómago, páncreas, piel, cuello de útero, hueso, ovario, testiculares y hepáticos.

Composiciones farmacéuticas, dosificaciones y pautas posológicas

Las composiciones de la invención se formularán normalmente en composiciones farmacéuticas, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se utiliza en el presente documento, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular o intravítrea (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, la composición puede estar recubierta con un material para proteger la composición de la acción de los ácidos y de otras condiciones naturales que puedan inactivar la composición.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado. Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables preferidos comprenden vehículos o diluyentes acuosos. Los ejemplos de vehículos acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, agua tamponada y solución salina. Los ejemplos de otros vehículos incluyen etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. En muchos casos, se preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, trehalosa, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición.

Normalmente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una elevada concentración de fármaco.

Cuando se utiliza un hidrogel como parte de la formulación, la composición de la invención se almacena preferentemente a 4 °C antes de su uso, debido a la gelificación a temperatura y presión ambiente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender principios activos adicionales, en particular, los antagonistas de VEGF como se indica en el presente documento.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un sujeto que ya padece un trastorno o afección como se describe anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la afección o uno o más de sus síntomas. Dicho tratamiento terapéutico puede dar como resultado una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad o un aumento de la frecuencia o duración de los períodos sin síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad terapéuticamente eficaz".

En aplicaciones profilácticas, las composiciones se administran a un sujeto en riesgo de padecer un trastorno o afección como se ha descrito anteriormente, en una cantidad suficiente para prevenir o reducir los efectos posteriores de la afección o uno o más de sus síntomas. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "cantidad profilácticamente eficaz". Las cantidades eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o lesión, así como del peso y el estado general del sujeto. Un ejemplo de una afección que puede tratarse de manera profiláctica en el contexto de la invención es la DMAE húmeda (degeneración macular asociada con la edad); un ojo puede desarrollar la afección antes que el otro, tratándose el primer ojo una vez que se conoce el problema y el segundo de forma profiláctica.

Un sujeto para la administración de las composiciones de la invención puede ser un ser humano o animal no humano. La expresión "animal no humano" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Se prefiere la administración a seres humanos.

Las composiciones de la presente invención se pueden administrar a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la materia. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para las composiciones de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraocular, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La expresión "administración parenteral", tal como se usa en el presente documento, significa modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, generalmente por inyección. Como alternativa, la composición de la invención se puede administrar mediante una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa.

En una realización preferida de la invención, la composición de la invención se administra por vía tópica. La composición se puede administrar por vía tópica en el ojo en forma de colirio.

Un médico especialista experto puede determinar una dosificación adecuada de la composición de la invención. Los niveles de dosificaciones reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse de tal forma que se obtiene una cantidad del principio activo que es eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de administración particulares, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto en particular que se esté empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, el estado de salud general y la anamnesis previa del paciente que se está tratando y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una dosis adecuada puede ser, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del paciente a tratar. Por ejemplo, una dosificación adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día o de aproximadamente 10 g/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por día. Para la administración intraocular, una dosis adecuada puede ser de aproximadamente 1 pg a 1 mg.

Las formulaciones tópicas pueden contener 10 mg/ml de Lucentis con 12,5 mg/ml de R8. Un volumen normal de colirio puede ser de 0,05 ml, por lo que una dosis normal puede ser; una gota al día: 50 pg de Lucentis con 62,5 pg de R8, dos gotas al día: 100 pg de Lucentis con 125 pg de R8, o cuatro gotas al día: 200 pg de Lucentis con 250 pg de R8. Las pautas posológicas pueden ser, por ejemplo, cada 12 horas o 24 horas. Las pautas posológicas pueden ser, por ejemplo, una vez al día o dos veces al día.

Pueden ajustarse las pautas posológicas para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse una única dosis, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente individuales adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que han de tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico necesario.

La administración puede ser en dosis únicas o múltiples. Pueden administrarse dosis múltiples a través de las mismas o diferentes vías y en el mismo o diferentes lugares. Como alternativa, las dosis pueden ser a través de una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida del antagonista en el paciente y la duración del tratamiento deseado.

La composición de la invención puede comprender más de un antagonista de VEGF como se describe en el presente documento. La composición de la invención se puede administrar en combinación con otras terapias para el tratamiento de las afecciones descritas en el presente documento.

También dentro del alcance de la presente invención están los kits que comprenden las composiciones de la invención. Los kits pueden contener instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un agente terapéutico o profiláctico adicional como se ha indicado anteriormente.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF, en donde la afección caracterizada por una disfunción del VEGF es cáncer, edema o vasos permeables.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF, en donde la afección caracterizada por una disfunción del VEGF es una afección vasculoproliferativa.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF, en donde la afección vasculoproliferativa comprende neovascularización, proliferación de células endoteliales vasculares, angiogénesis, telangiectasias o microaneurismas.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección vasculoproliferativa del ojo.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF, en donde la composición se formula para la administración tópica.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF, en donde la composición está formulada para administración tópica en el ojo.

La invención abarca la composición de la invención tal como se define en el presente documento, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF, en donde la composición se administra al ojo mediante un colirio.

La presente invención abarca un método para tratar un tumor que presenta vasculoproliferación como se describe en el presente documento, en donde el tumor se selecciona de un tumor cerebral, tumor de mama, tumor renal, tumor colorrectal, tumor pulmonar, tumor de próstata, tumores de cabeza y cuello, tumor estomacal, tumor pancreático, tumor de piel, tumor cervical, tumor óseo, tumor de ovario, tumor testicular y tumores hepáticos.

La invención abarca la composición descrita en el presente documento para su uso en el tratamiento de un tumor que presenta vasculoproliferación.

La presente invención abarca la composición descrita en el presente documento para su uso en el tratamiento de un tumor que presenta vasculoproliferación como se describe en el presente documento, en donde el tumor se selecciona de un tumor cerebral, tumor de mama, tumor renal, tumor colorrectal, tumor pulmonar, tumor de próstata, tumores de cabeza y cuello, tumor estomacal, tumor pancreático, tumor de piel, tumor cervical, tumor óseo, tumor de ovario, tumor testicular y tumores hepáticos.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

Ejemplos

Se ha establecido previamente que las nanopartículas liposomales funcionalizadas con anexina A5 (AnxA5) pueden liberar moléculas proteicas grandes, incluidos anticuerpos, a través de la córnea hacia la parte posterior del ojo en la aplicación tópica mediante la promoción de la transcitosis. Durante el aumento a escala de las nanopartículas AnxA5/Lucentis, se encontraron dos problemas:

i) la duración de la interacción electrostática de AnxA5 y la nanopartícula es de corta duración

ii) Lucentis interactúa con las nanopartículas a estas concentraciones provocando agregación

lo que redujo la vida útil eficaz. Aunque la conjugación covalente directa de AnxA5 con nanopartículas cargadas de Lucentis era técnicamente factible, era extremadamente difícil y prohibitivamente caro de fabricar.

La AnxA5 humana contiene un total de 19 restos de arginina. Todas las anexinas de vertebrados contienen una arginina (R) invariante en cada dominio. La AnxA5 tiene una estructura de dominio de cuatro repeticiones que a su vez forma estructuras intermoleculares de orden superior (dímeros/trímeros de AnxA5) al interactuar con las membranas celulares que contienen PS o PE. Aunque no es adyacente en la secuencia de aminoácidos primaria, al plegarse (estructura secundaria y terciaria), los restos R de AnxA5 se acercan e interactúan entre sí mediante la formación de interacciones intramoleculares e intermoleculares que son clave para la función de la proteína anexina V.

8 de los 19 restos de arginina tienen actividades activas de unión a la membrana. R43, R115, R199 y R274 son restos de arginina altamente conservados en la secuencia de AnxA5, y se ha demostrado que tienen efectos diferenciales sobre la capacidad de unión a PS, la estructura terciaria y la susceptibilidad proteolítica de la AnxA5. Las mutaciones R23E y R61E tienen una reducción significativa en la adsorción a las membranas de fosfolípidos en relación con la proteína de tipo silvestre. Se encontró que el R23 es un determinante principal para la unión de fosfolípidos interfaciales y participa en un puente salino intermolecular que es clave para la formación de trímeros en la superficie de la membrana. R163 juega un papel importante en la unión selectiva de AnxA5 a la proteína cinasa C y la mutación de este resto anula esta interacción.

La AnxA5 tiene ocho sitios de unión a calcio implicados en la unión a las células y vesículas a través de la interacción de lípidos.

Los péptidos ricos en arginina se pueden utilizar como péptidos penetrantes en las células mediante la promoción de la captación intracelular o la endocitosis. Recientemente se ha sugerido que esto ocurre debido a una interacción con PS y PE que promueven la curvatura negativa de la membrana en membranas que contienen PS/PE. Se propone un mecanismo de acción similar para la endocitosis mediada por AnxA5.

Basado en lo anterior, se buscó determinar si la secuencia RRRRRRRR (R8) (SEQ ID NO: 1) procedente de la anexina podría utilizarse como un reemplazo para la AnxA5 inicialmente en liposomas acoplados a R8, para mejorar la transcitosis del anti-VEGF encapsulado a través de las barreras epiteliales corneales.

Utilizando un ensayo in vitro de transcitosis con HCE-S descrito previamente (ilustración del modelo in vitro de barrera del epitelio corneal humano (HCE-S) utilizado en este estudio que se muestra en la figura 1), se encontró que la presencia de ST-R8 mejoró significativamente la transcitosis de liposomas cargados con anti-VEGF (Lucentis). Se investigó el R8 solo sin liposomas como control. Sorprendentemente, esta formulación también mostró una mejora considerable en la transcitosis.

Materiales y métodos

Ensayos in vitro con HCE-S

Se cultivaron células HCE-S como una monocapa en DMEM al 90 % complementado con FBS al 10 % inactivado por calor y penicilina-estreptomicina (100 U/ml). Las células se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 % y el medio de crecimiento se reemplazó cada tres días. Las poblaciones de HCE-S se cultivaron hasta el 80 % de confluencia antes del paso al 20 % utilizando tripsina-EDTA al 0,25 %. Antes de cada experimento, se estimaron las poblaciones de células utilizando un hemocitómetro y un ensayo de exclusión con azul tripán.

Ensayo de viabilidad

Se prepararon monocapas de HCE-S para ensayos de captación mediante la siembra en placas de 96 pocillos con 1 x 104 células/pocillo y el mantenimiento durante 5 días sustituyendo el medio cada dos días. Después de este tiempo, el medio se reemplazó por el que contenía PLV cargadas con calceína 100 pM en presencia o ausencia de AnxA5 200 nM. Las células se incubaron con PLV a 37 °C durante 3 h protegidas de la luz. A continuación, las monocapas epiteliales se lavaron tres veces en PBS helado (con calcio y magnesio) para eliminar las PLV libres, seguido de un único lavado en tampón citrato isosmótico enfriado con hielo (pH 3) para eliminar las PLV unidas a la superficie antes de aplicar un lavado con PBS que contiene Triton X-100 al 1 % para solubilizar las membranas. Tras completar cada etapa de lavado, se midió la fluorescencia de la calceína utilizando una excitación de 485 nm y una emisión de 515 nm con un lector de microplacas SAFIRE (TECAN). Se prepararon monocapas de HCE-S para ensayos de viabilidad mediante la siembra en placas de 96 pocillos con 1 x 104 células/pocillo y el mantenimiento durante 24 h a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %. Después de este tiempo, el medio se reemplazó por el que contenía concentraciones específicas de anti-VEGF (Lucentis o Avastin) en presencia o ausencia de concentraciones variables de R8 o ST-R8 (relación molar de 0 a 200). Las células se incubaron con soluciones anti-VEGF/R8 durante 24 h antes de evaluar la viabilidad de las células HCE-S en respuesta al ensayo de viabilidad celular AlamarBlue (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadieron 10 pl de solución de AlamarBlue a cada placa de pocillos y se incubaron durante 2,5 h, después de lo cual se registró la intensidad de la fluorescencia de AlamarBlue (excitación 570 nm/emisión 585 nm) a partir del cual se determinó el porcentaje de viabilidad celular utilizando la ecuación 1;

Viabilidad (%) = 100

donde T es la intensidad de fluorescencia del pocillo de prueba, H es la intensidad de fluorescencia de una población de células no tratadas (sanas) y N indica una población de células tratadas con un ataque altamente citotóxico (Triton-X100 al 0,1 %).

Establecimiento del modelo de barrera Transwell

Se prepararon modelos de barrera en HCE-S para ensayos de transcitosis utilizando una adaptación de un método descrito previamente.[1] Se sembraron células HCE-S (5 x 104 células/pocillo) en insertos Transwell (policarbonato, tamaño de poro de 3 pm, 1,13 cm2) y se mantuvieron durante 7 días refrescando el medio en las cámaras apical y basal cada dos días. Después de este tiempo, las células se cultivaron durante 10 días más en una interfaz de aire apical para estimular el desarrollo de una barrera multicapa. Antes de cada experimento, el medio de cultivo se reemplazó con DMEM sin rojo fenol y se midió la integridad de la barrera mediante la resistencia transepitelial (TER). Los valores de la TER se obtuvieron en el intervalo de 300 a 600 O cm 2 y solo barreras epiteliales con TER >300 O cm2, el umbral aceptado para barreras epiteliales estrechas, se utilizaron para experimentos de transcitosis.

Experimentos de transcitosis de anti-VEGF

Se realizaron estudios de permeación para determinar la tasa de transcitosis de anti-VEGF en presencia/ausencia de concentraciones variables de R8. Los experimentos se iniciaron mediante la adición de 1,5 ml de DMEM sin suero ni rojo fenol a la cámara basal y 0,5 ml a la cámara apical que contenía Avastin o Lucentis 0,1 mg/ml en presencia de relaciones molares variables de R8. Después de 3 h, se extrajeron 100 pl de medio de la cámara basal y se determinó la concentración de anti-VEGF en la cámara basal utilizando técnicas ELISA de tipo sándwich establecidas y disponibles comercialmente (KPL Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Human n.° de cat. 54-62-10 con Jackson Immuno Research [309-005-082] anticuerpo de captura de conejo anti-IgG humana AffiniPure).[1] Se encontró que la presencia de R8 no impacta de manera significativa en la detección del anti-VEGF utilizando esta técnica de ELISA. El coeficiente de permeabilidad (Papp) de cada anti-VEGF se determinó como se describió anteriormente[1] utilizando la ecuación 1;

donde C^r es la concentración final del anti-VEGF recuperado del ensayo ELISA, C^d es la concentración inicial de los anti-VEGF añadidos al ensayo, tmin es el tiempo de transcitosis (180 min), V^r es el volumen de la cámara receptora (1,5 ml) y A representa el área del filtro (1,12 cm2).

Estabilidad de las formulaciones que contienen R8

Se añadió Lucentis (0,1 mg/ml) a cada pocilio de una placa de 96 pocilios en presencia de concentraciones variables de R8 en el mismo tampón (histidina HCl 10 mM, trehalosa al 10 % (p/v) y polisorbato 80 al 0,1 % (v/v)) y se añadió trehalosa adicional (hasta una concentración final de 600 mg/ml). Las muestras se incubaron a 25 °C y se controló la agregación mediante el registro de la absorbencia a 600 nm a lo largo del tiempo utilizando un lector de placas TECAN Safire.

La actividad del anti-VEGF se registró utilizando un ELISA de unión a VEGF. Brevemente, se cubrió una placa ELISA Nunc Maxisorp (cat 442404) de alta afinidad y unión a proteínas con 0,05 ml de VEGF ¹⁶⁵ humano Peprotech [n.° de cat. 100-20] 0,25 pg/ml disuelto en tampón PBS durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron (tres veces, cinco minutos cada una) con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,005 % antes de bloquearlas durante 1,5 h con Protein free (TBS), Thermo Scientific (n.° de cat. 37570). La placa se lavó antes de que se añadieran las muestras y los patrones de concentraciones conocidas del anti-VEGF y la placa se incubó durante 2 h más. Después de este tiempo, la placa se lavó antes de aplicar 0,05 ml/pocillo de 0,1 mg/ml de anticuerpo de detección (peroxidasa de cabra anti-IgG humana purificada por afinidad marcada (KPL, 04-10-06)) durante 1 h más. Finalmente, la placa se lavó antes del revelado con sustrato BM Blue POD, soluble (Sigma, 000000011484281001) durante 10 minutos antes de detener la reacción con ácido clorhídrico 1 M y registrar la absorbencia a 450 nm frente a una longitud de onda de referencia de 690 nm. Los resultados se presentan como la razón de CI50 de cada formulación sobre la CI50 de formulaciones de anti-VEGF disponibles comercialmente.

Estudios in vivo con conejos

Todos los experimentos en animales se llevaron a cabo en cumplimiento con la declaración ARVO para el uso de los animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los conejos de Nueva Zelanda recibieron instilaciones tópicas unilaterales de 0,03 ml de anti-VEGF en presencia de R8 (concentraciones molares variables) como formulaciones líquidas o de hidrogel sin anestesia. En el tiempo especificado después de la aplicación, los animales fueron sacrificados antes de la enucleación, lavado (PBS) y congelación rápida y disección de tejidos oculares. Las muestras se pesaron y criohomogeneizaron antes de determinar la concentración de anti-VEGF por gramo de tejido ocular utilizando protocolos de ELISA en sándwich establecidos.

Se evaluó in vivo la toxicidad corneal en los ojos de los conejos, donde hubo evidencia de enrojecimiento, hinchazón, secreción, ulceración, hemorragia o cicatrización en el ojo tratado. La toxicidad epitelial se investigó mediante tinción con fluoresceína, utilizando protocolos convencionales.

Referencia

[1] B. Davis, E. Normando, L. Guo, P. O'Shea, S. Moss, S. Somavarapu, M. Cordeiro, Small 2014, 10, 1575.

Ejemplo 1- Relaciones molares de R8/anti-VEGF y transcitosis

Las formulaciones iniciales se referían a la sustitución de AnxA5 por R8 en formulaciones de liposomas y micelas, pero se encontró que las interacciones electrostáticas entre el R8 y los fármacos proteicos también tenían un efecto beneficioso para la administración del fármaco. Un esquema del ensayo in vitro con HCE-S utilizado para medir el transporte a través de las barreras corneales in vitro se muestra en la figura 1A. La figura 1B indica que la presencia de R8 (Estearil-R8) mejora el transporte de Lucentis a través de las barreras corneales in vitro. Se aplicó Lucentis (+/-estearil-R8) a la cámara apical y se determinó la concentración que cruzaba la barrera desde la cámara basolateral en diferentes puntos temporales utilizando un ELISA de tipo sándwich de Lucentis. La barrera de las HCE-S inalterada se confirmó mediante la medición de la resistencia transepitelial (>600 Qcm2) antes de cada ensayo.

R8 mejoró la transcitosis a través de la córnea a través de un mecanismo transcelular sin afectar la viabilidad celular o la interrupción de la integridad de la barrera corneal (Figura 2). La adición de R8 y Lucentis a Transwell de HCE-S durante 3 h no indujo ningún cambio significativo en la resistencia transepitelial que sugiera un mecanismo de administración transcelular. Esto es contrario a lo que se ha informado con polipéptidos de poliarginina (36 kDa) para los que se ha sugerido que el mecanismo es la ruptura reversible de uniones estrechas (TJ, del inglés "tight junctions") (Nemoto et al. Biol Pharm Bull. Septiembre de 2007;30(9): 1768-72.)

R8 mejoró la administración a través de las barreras corneales in vitro de una manera dependiente de la concentración. Un hallazgo sorprendente en los presentes estudios in vitro fue que hay evidencia de que R8 promueve la administración a través de las células de la córnea. Otro método para controlar el alcance de la administración a través de los modelos de barrera corneal es calcular el coeficiente de permeabilidad del fármaco (Papp) como se describe en Davis et al. 2014. En la figura 3 se muestra que R8 mejoró la liberación del anti-VEGF Lucentis a través de la barrera de las HCE-S de una manera dependiente de la concentración. Las relaciones molares de R8:Lucentis de 40:1 o más mejoran de manera significativa la transcitosis corneal in vitro. En la figura 4 se muestra que R8 mejora la administración de ambos antagonistas de VEGF, Avastin y Lucentis, a través de la barrera de las HCE-S. Además, el estearil-R8 mejoró la administración del anti-VEGF Lucentis a través de la barrera de las HCE-S de una manera dependiente de la concentración.

Ejemplo 2- Ensayos de toxicidad y estabilidad

Utilizando el ensayo de viabilidad celular AlamarBIue, se encontró que R8 no era tóxico para cultivos de células corneales humanas (HCE-S) in vitro después de 24 h de exposición. (Figura 5). Se encontró que el R8 se tolera bien en ausencia o presencia de Lucentis después de 24 h de exposición. R8 no provocó una reducción significativa en la viabilidad celular a las concentraciones más altas evaluadas (relación molar 200/1).

La presencia de R8 no afectó de manera negativa a la actividad de unión a VEGF de Lucentis. (Figura 6). La presencia de R8 no afectó al ELISA de tipo sándwich de Lucentis utilizado en estudios con conejos. Utilizando un ELISA hVEGF-165 para evaluar la actividad de Lucentis, la adición de R8 en una relación molar 200/1 de R8/Lucentis no causó ningún impedimento significativo en la unión de Lucentis a hVEGF. De hecho, los datos sugirieron que la presencia de estos péptidos puede aumentar levemente la afinidad de Lucentis por hVEGF. Se obtuvieron resultados similares con Avastin (Figura 7).

La estabilidad de las formulaciones de R8:Lucentis se investigaron mediante la medición de la agregación a lo largo del tiempo utilizando una absorbencia de 600 nm a 25 °C (Figura 8). Las relaciones de 50 a 100:1 de R/L fueron las más estables. Sin embargo, la agregación se retrasó mediante el aumento de la concentración de trehalosa en la formulación. Los resultados sugieren que una relación de 50:1 sería adecuada para la formulación de la invención. Se obtuvieron resultados similares mediante la reducción de la concentración de Lucentis mientras se mantenía la relación de R/L, o mediante el aumento aún más de la concentración de trehalosa, hasta 600 mg/ml (Figura 9). Se encontró que las combinaciones de R8/Lucentis en proporciones de 40:1 y 80:1 eran estables durante 3 meses a 4 °C (Figura 10A). También se encontró que una combinación de R8/Lucentis en una relación de 50:1 era estable durante 3 meses (12 semanas) a 4 °C (Figura 10B).

Además, la presencia de R8 no interfirió con el ELISA de detección del anti-VEGF (Figura 11).

Ejemplo 3- Estudios in vivo

En la figura 12 se muestre un experimento de control in vivo para determinar la proporción de Lucentis libre que llega a la retina. La proporción de Lucentis libre dosificado que llega a la retina por vía tópica fue ~30 %. Además, R8:Lucentis en una relación de 20/1 no mejoró la administración de Lucentis a la retina después de 2 h. Una combinación de 100 mg/ml de Lucentis con 50 mg/ml de R8 no proporcionó una mejora significativa en la administración de Lucentis a la retina en comparación con el control de Lucentis solo (n = 3) (16 ± 6 ng/g frente a 18 ± 8 ng/g). (Figura 13). Esto sugiere que la relación R8: Lucentis es importante. Esta relación de péptido R a anti-VEGF es similar a la informada en la referencia de Logan (2017), que sugiere problemas con los datos presentados en esa referencia. Los datos anteriores están respaldados por datos de Transwell in vitro que sugirieron que se requiere una relación de 40:1 como mínimo.

Sin embargo, una relación de R8 a Lucentis de 200/1 mejoró la administración a la retina después de 2 h (Figura 14), véase el nivel de Lucentis en la retina en el gráfico inferior, en comparación con el gráfico equivalente en la figura 12. La figura 15 resume los resultados de la evaluación in vivo de las concentraciones de Lucentis en la retina después de la aplicación tópica de formulaciones de R/L a las 2 h.

Ejemplo 4- Formulación de R8:Lucentis con hidrogel

Para aumentar el tiempo de contacto con la córnea, se prepararon formulaciones de R8:Lucentis con hidrogeles para mejorar la viscosidad de la formulación y se investigaron sus propiedades. En la figura 16 se muestra que mediante el aumento de la concentración de un hidrogel en la formulación, se formó un gel termosensible con las propiedades deseadas. En el experimento mostrado en la figura 16, se utilizó Lutrol F127 como hidrogel. Las soluciones se prepararon mediante la mezcla de las cantidades deseadas de Lutrol F127 con tampón HEPES 20 mM, pH 7,4. El intervalo óptimo de concentración probado fue entre el 20 % y el 25 % de Lutrol. La formulación de R8:Lucentis se mantuvo estable a 4 °C durante siete días en presencia de concentraciones crecientes de trehalosa (Figura 17A). Además, reducir la concentración de Lucentis manteniendo la relación de R8:Lucentis igual, ayudó a la estabilidad en relaciones más elevadas. Además, el hidrogel de Lutrol al 20 % mejoró la estabilidad de las formulaciones de Lucentis. La presencia de Lutrol ayudó a prevenir la agregación de las formulaciones de R8:Lucentis incluso en una relación de 200:1. En la figura 17B se muestra que una formulación de R8:Lucentis (50:1) e hidrogel (Lutrol al 20 %) fue estable durante 12 semanas a 4 °C. En la figura 17C se muestra que una formulación de R8:Lucentis (50:1) e hidrogel (Lutrol al 20 %) permaneció estable durante 12 horas a 4 °C y a 25 °C. En la figura 17D se muestra que una formulación de R8:Lucentis (50:1), hidrogel y el polímero mucoadhesivo quitosano 5K (01 % p/v) mostró una buena estabilidad durante 4 semanas según lo determinado por la relación CE50 (U8:Lucentis/Patrón) de menos de 2.

En la figura 18A se muestra que una formulación de gel de Lutrol al 20 %, HisCl de 10 mM, trehalosa al 10 %, polisorbato 20 al 0,01 %, pH 5,5 tardó aproximadamente 1 h en liberar Lucentis en un ensayo de liberación. En la figura 18B se resumen los resultados de estabilidad para las formulaciones líquidas y con hidrogel de R8/Lucentis. Las relaciones de R8/Lucentis de hasta/incluyendo 100:1 en la formulación líquida fueron estables a una concentración de 100 o 600 mg/ml de trehalosa. En una formulación con hidrogel de Lutrol al 20 %, las relaciones de R8/Lucentis de hasta/incluyendo 200:1 fueron estables en concentraciones de 100 a 600 mg/ml de trehalosa.

La incorporación de Lucentis/R8 en un hidrogel aumentó considerablemente la concentración del anti-VEGF administrado a los tejidos oculares posteriores del conejo, debido a un mayor tiempo de contacto con la córnea (Figura 19). En la figura 19 se muestra que el gel con relación de R8/Lucentis 200:1 administró concentraciones significativas de Lucentis a la retina a las 2 h (A) y a las 12 h (B) después de la administración del hidrogel. En ambos momentos, la concentración de Lucentis excedió la concentración diana en la retina de al menos 200 ng/g de tejido retiniano. Los datos se resumen en la figura 19C. En la figura 20 se muestra que el gel con la relación 50:1 de R8/Lucentis administró concentraciones significativas de Lucentis a la retina a las 2 h (A), a las 12 h (B) y a las 24 h (C) después de la administración del hidrogel. A las 2 h y a las 12 h, la concentración de Lucentis excedió la concentración diana en la retina de al menos 200 ng/g de tejido retiniano. A las 24 h de la administración del hidrogel, la concentración de Lucentis había caído por debajo del nivel retiniano diana de 200 ng/g de tejido retiniano. Los datos se resumen en la figura 20D.

En la figura 21A se resume la evaluación in vivo de las concentraciones de Lucentis en la retina después de la aplicación tópica de formulaciones de R/L a las 2 h, 12 h, 24 h y 72 h, con la adición de un hidrogel y quitosano como se indica. Una formulación de hidrogel de relación 80:1 de R8/Lucentis con quitosano al 0,1 % p/v pareció dar el mejor perfil de Lucentis en la retina.

En la figura 21B se muestra que la formulación preferida de U8:Lucentis (relación 80:1 de R8 a Lucentis, hidrogel, trehalosa y quitosano) no se asocia con enrojecimiento o daño corneal in vivo en los ojos de los conejos, como se ve por la tinción con fluoresceína.

En la figura 22 se resume los experimentos realizados y los intervalos de relaciones de R8/Lucentis probados, para llegar a la conclusión de que un intervalo de relación de 50 a 80:1 de R8 a Lucentis es el intervalo óptimo de relación.

Ejemplo 5- Investigación del mecanismo de interacción de R8/Lucentis

La interacción entre R8 y Lucentis se investigó más a fondo. Una hipótesis considerada fue que, dado que R8 está muy cargado, puede asociarse de manera electrostática con la superficie de la proteína dando a la partícula una carga neta positiva, mejorando así la administración del fármaco a través de las membranas oculares. Otra hipótesis considerada fue el efecto de vecindad. R8 podría desestabilizar las membranas celulares a través de la interacción con los grupos fosfato de lípidos. La rotura mediada por R8 de la película lagrimal ocular y la membrana plasmática del epitelio corneal podría, por tanto, potenciar la difusión pasiva de fármacos en los tejidos oculares.

El primer experimento realizado fue la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), figura 23. No hubo elución conjunta de Lucentis y FITC-R8, así que no hubo unión. El segundo experimento realizado fue la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), figura 24. Este método mide una variación de masa por unidad de área mediante la medición del cambio de frecuencia de un resonador de cristal de cuarzo. La resonancia se ve perturbada por la adición o eliminación de una pequeña masa debido al crecimiento/descomposición del óxido o la deposición de la película en la superficie del resonador acústico.

Ecuación de Sauerbrey

Af = -Cf-Am

Donde Af — el cambio de frecuencia observado en Hz.

Am — el cambio en masa por unidad de área, en g/cm2, y

Cf — el factor de sensibilidad para el cristal utilizado (es decir, 56,6 Hz-jg^-cm 2 para un cristal de cuarzo de corte AT de 5 MHz a temperatura ambiente)

Sistema de QCM Attana; aprox. 4,4 Hz/(ng-cm2) que se reduce aún más a 0,7 Hz/ng (1,5 mm2)

75-0,7 = 52,5 ng (11,3 pmol de Lucentis unido)

Cálculos hipotéticos: 1 mm de profundidad = 1,5 mm3 (1,5 j l)

R8 20 jM en 1,5 mm3 = 30 pmol de R8 (R8:Lucentis = 2,6)

R8 200 jM en 1,5 mm3 = 300pmol de r 8 (R8:Lucentis = 26)

Caudal de 1 jl/s, relación 20 jM (0,26 a 2,6):1, Relación de R8:Lucentis 200 jM (2,6 a 26), control: diferencia 4Hx = 5,7 ng de VEGF 165 (6,25 jg añadidos).

Se inmovilizó Lucentis en una superficie de un chip y se probó, no se detectó unión a R8.

El tercer experimento realizado fue resonancia de plasmón superficial (SPR), figura 25. Lucentis se inmovilizó sobre una superficie de un chip CM5 UR = 3700. Se probaron concentraciones crecientes de R8 en tampón de HisCl 10 mM pH 5,5, trehalosa al 10 % o HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,05 % v/v. Se detectó alguna unión de R8 a Lucentis.

El cuarto experimento realizado fue calorimetría de titulación isotérmica (ITC) (Figura 26). Esta es una técnica utilizada para determinar los parámetros termodinámicos de las interacciones en una solución. Se utiliza con mayor frecuencia para estudiar la unión de moléculas pequeñas (tales como compuestos medicinales) a macromoléculas más grandes (proteínas, ADN, etc.) La ITC es una técnica cuantitativa que puede determinar la afinidad de unión, los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos o más moléculas en una solución. A partir de estas medidas iniciales, los cambios de energía de Gibbs y los cambios de entropía se pueden determinar utilizando la relación; dG = - RTInKa = dH - TdS. No se detectó unión entre R8 y Lucentis en relaciones de hasta 180 de R8:Lucentis.

El quinto experimento realizado fue si R8 afectaba el transporte de dextranos a través de una membrana, figura 27. Los dextranos son polisacáridos complejos ramificados hechos de muchas moléculas de glucosa. Pueden estar compuestos por cadenas de diferentes longitudes. En un ensayo de transcitosis de dextrano, utilizado para comprobar si el R8 transportaba dextranos de varios tamaños a través de la membrana, el R8 no supuso ninguna diferencia en el transporte de los diferentes tamaños de dextrano.

Los resultados del experimento se muestran en la figura 28. Debido a la falta de evidencia de unión a Lucentis, parece que el R8 puede estar actuando a través del efecto de vecindad. Si es así, entonces la acción del R8 ayudaría en el transporte de una variedad de macromoléculas y fármacos a través de las membranas.

Ejemplo 6 - Especificación de producto ilustrativa y método de fabricación

Preparación del producto HICF:

Día 1

1. Preparación del tampón A: Lutrol F127 al 20 %, quitosano 5k al 0,1 % p/v, péptido R820 mg/ml:

a. A 40 ml de agua destilada enfriada previamente (4 °C) se añade lo siguiente con mezcla (rodillo a 4 °C durante 1 a 3 h);

b. Se completa hasta 50 ml con agua destilada fría adicional

c. Se mezclan 50 ml de tampón A con 50 ml de Lucentis (como se proporciona) rodillo a 4 °C durante 1 h d. Se filtra la solución resultante a 0,2 pm y se almacena a 4 °C hasta que sea necesario (lo ideal es utilizarla inmediatamente)

e. Se preparan alícuotas de 2 ml de este material en frascos de vidrio de 6 ml 2

2. Secado por congelación (las condiciones requerirán optimización; busca lograr una concentración de producto x2 veces superior)

a. Congelación: -60 °C, 2 h

b. Secado primario: -34 °C, 100 mTorr, 18 h

c. Secado secundario: 20 °C, 100 mTorr, 2 h

d. Almacenaje de las tortas a 4 °C hasta que se necesiten, protegidas de la luz

Día 2

3. Rehidratación (realizada en cámara frigorífica a 4 °C)

a. A una torta liofilizada (preparada en 1 y 2 arriba) se añade 1 ml (la mitad del volumen de secado previo a la congelación para dar un efecto de concentración doble) de agua destilada estéril previamente enfriada. Se rehidrata con rotación (rodillo de tubo 2 h a 4 °C y 30 rpm o hasta que la torta esté completamente disuelta). b. Filtrar la solución resultante a 0,2 pm y distribuir las alícuotas en frascos.

c. Composición final aproximada (puede haber efectos de dilución adicionales debido a la elevada concentración de soluto)

Lucentis 10 mg/ml

R8 20 mg/ml

Lutrol F127 al 20 %

histidina HCl 10 mM

dihidrato de a,a-trehalosa al 10 % p/v

polisorbato 20 al 0,01 % (p/v)

quitosano 5k al 0,1 % p/v

pH 5,5

NOTAS

1. Tipo de filtro sugerido: Unidades de filtrado Millipore® Stericup™ membrana PVDF (Durapore), muy baja unión a proteínas, tamaño de poro 0,22 pm, capacidad del embudo 150 ml N.° de cat.: SCGVU01RE, disponible en http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Stericup-GV-Sterile-Vacuum-Filtration-System.MM NF-SCGVU01RE

2. La alternativa es liofilizar a granel y rehidratar a granel antes de filtrar y dividir en alícuotas la solución resultante Ejemplo 7 - Apéndice de PNT para ELISA de actividad de Lucentis

Día 1.

Recubrimiento de las placas

1. Se descongela una alícuota de hVEGF165 por placa y se añaden 5,40 ml de tampón de recubrimiento al tubo Eppendorf (0.25 pg/ml)

2. Se recubre cada pocillo de una placa de 96 pocillos con 50 pl/pocillo de solución de hVEGF165

3. Se golpea ligeramente la placa para asegurar una buena cobertura antes de cubrir y se incuba a 4 °C durante la noche

Día 2.

Bloqueo (2 h, preparación de diluciones de Lucentis en el hueco)

1. Se lava la placa tres veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado. Cada lavado debe dejarse en la placa durante 5 minutos

2. Se bloquean los sitios de unión no específicos con 300 pl/pocillo de tampón de bloqueo. Se incuba la placa sellada durante 1,5 h con agitación.

Diluciones de Lucentis (2 h, según el protocolo de dilución de scFv)

1. Se lava la placa tres veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado. Cada lavado debe dejarse en la placa durante 5 minutos

2. Para la curva patrón, se preparan las siguientes diluciones en tampón de dilución o matriz;

a. Se diluyen 0,05 ml de solución madre de Lucentis (10 mg/ml) en 4,95 ml de tampón de dilución. [Solución A, 100 pg/ml]

b. Se diluyen 0,05 ml de [Solución A] en 4,95 ml de tampón de dilución [Solución B, 1000 ng/ml]

c. Se diluyen 0,05 ml de [Solución A ] en 4,95 ml de tampón de dilución con 1 pg/ml de R8 (5 pl d

lución madre 1 mg/ml) [Solución B-R, 1000 ng/ml]

d. Se diluyen 0,15 ml de [Solución B] en 1,35 ml de tampón de dilución [Solución 1, 100 ng/ml] (hacer x4)

e. Se diluyen 0,15 ml de [Solución B-R] en 1,35 ml de tampón de dilución [Solución 1-R, 100 ng/ml] (hacer x4) f. A partir de las Soluciones 1 y 1-R, se prepara el siguiente intervalo de dilución (x4 cada uno);

g. Se añaden 50 pl de cada uno a la placa y se incuba durante 2 h con agitación suave.

Recubrimiento de anticuerpos (1,5 h)

3. Se lava la placa tres veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado. Cada lavado debe dejarse en la placa durante 5 minutos

4. Se añaden 100 pl de anti-IgG humana con HRP a cada pocillo, se deja reaccionar durante 1 h a temperatura ambiente

Desarrollo de la placa (1 h)

5. Se lava la placa tres veces con 300 pl/pocillo de tampón de lavado. Cada lavado debe dejarse en la placa durante 5 minutos

6. Se apagan las luces

7. Se añaden 50 pl/pocillo de sustrato POD

8. Se incuba durante 15 minutos

9. Se detiene la reacción mediante la adición de 50 pl/pocillo de HCl 1 M

10. Se mide la absorbencia a 450 nm frente a una longitud de onda de referencia de 690 nm. Nota de actividad de Lucentis: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR__Scientific_Discussion/human/000715/WC5000 43550. pdf

"Ranibizumab inhibió de manera dependiente de la dosis la proliferación inducida por el VEGF en células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), que son células que expresan los receptores de VEGF, con valores de CI50 por debajo de 1 nM. Esto es de 10 a 20 veces superior a la Cmáx clínica. Los niveles de Ci10 aproximados fueron algo más altos que los valores clínicos de Cmáx (1,7 ng/ml previstos en el estado estacionario, nivel individual máximo 2,4 ng/ml) y, en consecuencia, no se espera una actividad inhibidora sistémica significativa del VEGF en seres humanos. Se observó una inhibición total de la proliferación a concentraciones de ranibizumab >1,3 nM. Ranibizumab inhibió la regulación del factor tisular inducida por el rhVEGF165 de una manera dependiente de la dosis, con una CI50 de 0,31 nM".

Referencias

F. de Cogan, L. J. Hill, A. Lynch, P. J. Morgan-Warren, J. Lechner, M. R. Berwick, A. F. A. Peacock, M. Chen, R. A. H. Scott, H. Xu, A. Logan, Investig. Opthalmology Vis. Sci. 2017, 58, 2578.

B. Davis, E. Normando, L. Guo, P. O'Shea, S. Moss, S. Somavarapu, M. Cordeiro, Small 2014, 10, 1575.

F. Oling, W. Bergsma-Schutter, A. Brisson, J. Struct. Biol. 2001, 133, 55.

B. Campos, S. Wang, G. S. Retzinger, M. A. Kaetzel, B. A. Seaton, N. J. Karin, J. D. Johnson, J. R. Dedman, Arch. Med. Res. n.d., 30, 360.

Y. Mo, B. Campos, T. R. Mealy, L. Commodore, J. F. Head, J. R. Dedman, B. A. Seaton, J. Biol. Chem. 2003, 278, 2437.

V. Kheifets, R. Bright, K. Inagaki, D. Schechtman, D. Mochly-Rosen, J. Biol. Chem. 2006, 281, 23218.

M. Jin, C. Smith, H.-Y. Hsieh, D. F. Gibson, J. F. Tait, 2004, DOI 10.1074/jbc.M405846200.

M. Vazdar, E. Wernersson, M. Khabiri, L. Cwiklik, P. Jurkiewicz, M. Hof, E. Mann, S. Kolusheva, R. Jelinek, P. Jungwirth, J. Phys. Chem. B 2013, 117, 11530.

K. Melikov, A. Hara, K. Yamoah, E. Zaitseva, E. Zaitsev, L. V Chernomordik, Biochem. J 2015, 471,221.

Z. Wu, Q. Cui, A. Yethiraj, J. Phys. Chem. B 2013, 117, 12145.

H. Kenis, H. van Genderen, N. M. Deckers, P. a G. Lux, L. Hofstra, J. Narula, C. P. M. Reutelingsperger, Exp. Cell Res. 2006, 312, 719.

H. Kenis, H. van Genderen, A. Bennaghmouch, H. a Rinia, P. Frederik, J. Narula, L. Hofstra, C. P. M.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende el péptido RRRRRRRR (SEQ ID NO: 1) y ranibizumab, en donde la relación molar de péptido a ranibizumab es de al menos 40:1.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la relación molar de péptido a ranibizumab es de al menos 50:1, opcionalmente de 50:1 a 80:1.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde la composición también comprende trehalosa.

4. La composición de la reivindicación 3, en donde la trehalosa está presente a una concentración de 100 mg/ml o más, 200 mg/ml o más, 300 mg/ml o más, 400 mg/ml o más, 500 mg/ml o más o 600 mg/ml o más.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición también comprende un hidrogel.

6. La composición de la reivindicación 5, en donde la concentración de hidrogel está entre el 15 % y el 25 % p/v, opcionalmente entre el 20 % y el 25 % p/v.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición también comprende quitosano.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde la concentración de quitosano está entre el 0,05 % y el 0,25 % p/v, opcionalmente en donde la concentración de quitosano es del 0,1 % p/v.

9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección caracterizada por una disfunción del VEGF.

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la afección caracterizada por una disfunción del VEGF es cáncer, edema o vasos permeables.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la afección caracterizada por una disfunción del VEGF es una afección vasculoproliferativa, opcionalmente en donde la afección vasculoproliferativa comprende neovascularización, proliferación de células endoteliales vasculares, angiogénesis, telangiectasias o microaneurismas.

12. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en la prevención o el tratamiento de una afección vasculoproliferativa del ojo, opcionalmente, en donde la afección vasculoproliferativa del ojo se selecciona de degeneración macular asociada con la edad (DMAE), retinopatía diabética, oclusión de la vena retiniana, retinopatía de prematuridad, telangiectasia macular o neovascularización coroidea, vasculopatía diabética, enfermedades caracterizadas por la angiogénesis retiniana y drepanocitosis.

13. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde la composición se formula para la administración tópica.

14. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la composición está formulada para la administración tópica en el ojo, opcionalmente para la administración en el ojo mediante colirio.

15. Un kit que comprende la composición definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.