ES2355650T3 - Adn polimerasa termoestable del ampullavirus de arqueas abv y sus aplicaciones. - Google Patents
Adn polimerasa termoestable del ampullavirus de arqueas abv y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
ADN polimerasa aislada seleccionada de entre el grupo de polipéptidos constituido por: a) el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1; b) un fragmento de a) que presenta una actividad ADN polimerasa; c) un polipéptido que comprende por lo menos los fragmentos de SEC ID nº: 1 que permiten la actividad ADN polimerasa de dicha ADN polimerasa de a); d) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 en la que los siguientes sitios de exonucleasa tal como se identifican en la figura 4: Exo I: ---I---DLET---, Exo II: -Y-HNL-FD---FIL, y/o Exo III: KE---YL--D---L, se han mutado o delecionado con el fin de que el polipéptido de ADN polimerasa resultante presente una actividad exonucleasa no detectable o deficiente en comparación con el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1; e) un polipéptido que presenta una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad tras la alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 1, presentando dicho polipéptido una actividad ADN polimerasa.
Description
La presente invención se refiere a la proteína ADN polimerasa termoestable del ampullavirus de arqueas ABV (virus con forma de botella de Acidianus) y al ácido nucleico que codifica para dicha ADN polimerasa. La invención se refiere asimismo a un procedimiento de síntesis, amplificación o secuenciación de ácido nucleico que implementa dicha proteína ADN polimerasa y a un kit o aparato que comprende dicha 5 proteína ADN polimerasa.
Los virus de ADN bicatenario (bc) de Crenarchaeota hipertermófilas presentan estructuras de genoma y morfotipos notablemente diversos y, basándose en estas propiedades, varios se han asignado ya a seis nuevas familias virales: Fuselloviridae con forma de huso, Lipothrixviridae filamentoso, Rudiviridae con forma de varilla, Guttaviridae con forma de gotita, Globuloviridae esférico y Bicaudaviridae con dos colas 10 (revisado en Prangishvili et al., 2001; Prangishvili y Garrett, 2004, 2005). Se descubrió recientemente un nuevo virus que presentaba una morfología con forma de botella única y se asignó provisionalmente a una nueva familia, la Ampullaviridae (Häring et al., 2005a).
Una variedad de técnicas de amplificación de ácido nucleico, desarrolladas como herramientas para la manipulación y el análisis de ácido nucleico, se han aplicado satisfactoriamente para el diagnóstico clínico 15 de enfermedades genéticas e infecciosas. Las técnicas de amplificación pueden agruparse en las que requieren ciclos de temperatura (PCR y reacción en cadena de la ligasa) y sistemas isotérmicos (sistemas de amplificación (3SR y NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena y sistemas de replicación Q). Dos aspectos son advertencias frecuentes en estos procedimientos: la fidelidad de la síntesis y la longitud del producto amplificado. 20
El desarrollo de un sistema de amplificación que se basa en el mecanismo de replicación del ADN del fago phi29 (Φ29) ha sido objeto de publicaciones y documentos de patente (Dean et al., Genome Res. Junio de 2001;11 (6):1095-9; Mendez et al., EMBO J. 1997 1;16(9):2519-27; Hutchison et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(48):17332-6; Mamone, Innovations Forum: GenomiPhi DNA amplification, Life Sciences News 14, 2003 Amersham Biosciences; Blanco et al., 1994; documento EP 0 862 656 o patente US nº 5.001.050). 25
La ADN polimerasa de phi29 es una polimerasa altamente procesiva que se caracteriza por una fuerte actividad de desplazamiento de cadena que permite una amplificación de ADN isotérmica altamente eficaz (Blanco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5325-5329, 1984 y J. Biol.Chem., 264, 8935-8940, 1989). La ADN polimerasa de phi29 también posee actividad exonucleasa 3’=>5’ (corrección de lectura) que actúa preferentemente sobre ADN monocatenario (Garmendia J. Biol.Chem., 267, 2594-2599, 1992). 30
Entre sus características, se pueden mencionar su actividad de desplazamiento de cadena y procesividad máximas entre las ADN polimerasas conocidas - pueden sintetizarse tramos de ADN de más de 70 kb de longitud (Blanco et al., 1989), su síntesis de ADN altamente precisa (Esteban et al., J. Biol. Chem., 268, 4, 2719-2726, 1993), sus altos rendimientos de ADN amplificado incluso a partir de cantidades minúsculas de molde y los productos de amplificación pueden utilizarse directamente en aplicaciones 35 posteriores (PCR, digestión por restricción, genotipado de SNP, etc.). Se desarrollaron numerosas aplicaciones específicas implementando esta ADN polimerasa particular tales como amplificación por círculo rodante (ACR) (Lizardi et al., Nat. Genet., 19, 225-232, 1998; Dean et al., Genome Res., 11, 1095-1099, 2001; Baner et al., Nucleic Acids Res., 26, 5073-5078, 1998). Amplificación por desplazamiento múltiple (ADM) (Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 5261-5266, 2002), amplificación no sesgada de preparación de 40 molde de ADN o genoma completo para secuenciación. Este sistema sería adecuado para una amplificación fiel de moléculas de ADN mayores de 70 kb (Blanco et al., 1989), en gran medida por encima del límite de tamaño obtenido con los sistemas de amplificación disponibles hasta la fecha. Este procedimiento de amplificación cebada por PT isotérmica (“PT” significa proteína terminal) se aprovecharía de las propiedades particulares de la ADN polimerasa de phi29: (1) capacidad para utilizar una proteína como cebador, (ii) alta 45 procesividad intrínseca (>70 kb), y (iii) desplazamiento de cadena acoplado a la síntesis de ADN. La actividad específica de esta ADN polimerasa de phi29 se facilita para una temperatura de 30ºC y se precisa que esta ADN polimerasa de phi29 se inactive a 65ºC.
Actualmente, resulta necesaria una nueva ADN polimerasa que pertenezca a la familia de ADN polimerasas cebadas por proteína tales como ADN polimerasa de phi29 que puede funcionar a temperaturas 50 significativamente superiores a 30ºC y que no se inactiva completamente a 60ºC.
Puede mencionarse la patente US nº 5.198.543 (Blanco et al., 1993) que da a conocer una ADN polimerasa de Phi 29 que puede utilizarse en un procedimiento para determinar la secuencia de bases de nucleótidos de una molécula de ADN.
Puede mencionarse asimismo el documento Pecenkova et al. (J. Mol. Evol., 48:197-208, 1999) que estudia y analiza las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de proteínas y regiones de ADN seleccionadas del género de fagos de tipo Phi 29 con el fin de evaluar la filogenia del grupo de fagos, particularmente de regiones que codifican para ADN polimerasas y proteínas terminales.
Este es el objetivo de la presente invención. 5
Tras secuenciar y anotar la secuencia genómica completa del virus ABV (virus con forma de botella de Acidianus) que infecta a la arquea hipertermófila del género Acidianus, se ha demostrado una secuencia nucleica que codifica para una ADN polimerasa dependiente de ADN. De manera sorprendente, el análisis de la secuencia de proteína indicó que pertenece a la familia de ADN polimerasas cebadas por proteína. El gen para la ADN polimerasa se expresaba de manera heteróloga en E. coli y se ha confirmado la actividad de 10 polimerización de ADN de la proteína recombinante. Esta nueva enzima, similar a ADN polimerasas virales conocidas, es altamente procesiva y autosuficiente, sin requerir proteínas auxiliares. Debido a estas características, la enzima puede presentar ventajas significativas como herramienta para la amplificación de ADN mediante PCR. Al ser una enzima viral termoestable cebada por proteína, puede ser mucho más eficaz en la amplificación exponencial de ADN lineal mono o bicatenario (es decir, mediante el procedimiento 15 GenomiPhi desarrollado por Amersham) que la ADN polimerasa del bacteriófago Phi29, una enzima cebada por proteína mesófila, actualmente utilizada en este procedimiento. El kit de amplificación GenomiPhi de Amersham permite realizar pruebas de ADN ilimitadas a partir de un pequeño número de células o una cantidad limitada de muestra valiosa y es un procedimiento de amplificación de ADN genómico fácil que amplifica de manera representativa el genoma completo. 20
De este modo, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una ADN polimerasa aislada seleccionada de entre el grupo de polipéptidos constituido por:
a) el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1;
b) un fragmento de a) que presenta una actividad ADN polimerasa;
c) un polipéptido que comprende por lo menos los fragmentos de SEC ID nº: 1 que permiten la actividad 25 ADN polimerasa de dicha ADN polimerasa de a);
d) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 en la que los sitios de exonucleasa Exo I, Exo II y/o Exo III tal como se identifican en la figura 4 se han mutado o delecionado para proporcionar un polipéptido de ADN polimerasa que presenta una actividad exonucleasa no detectable o deficiente en comparación con el polipéptido que presenta la secuencia 30 de aminoácidos de SEC ID nº: 1;
e) un polipéptido que presenta una secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad tras la alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 1, o tal como se define en de b) a d), presentando dicho polipéptido una actividad ADN polimerasa. Se da a conocer que dicho polipéptido presenta una actividad ADN polimerasa a una temperatura de 50ºC o superior a 50ºC. 35
En una forma de realización preferida, la ADN polimerasa según la invención se aísla del ampullavirus de arqueas ABV. Se da a conocer que dicha ADN polimerasa se aísla del gen de ABV que codifica para la DBA polimerasa.
En una forma de realización más preferida, la ADN polimerasa de la presente invención comprende por lo menos los fragmentos Pol I, Pol IIa, Pol IIb, Pol III y Pol IV de SEC ID nº: 1 tal como se identifican en la 40 figura 4.
Haciendo referencia a la figura 4, el polipéptido de la presente invención que presenta su actividad ADN polimerasa conservada pero una actividad exonucleasa deficiente o significativamente menor que el polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº: 1 puede seleccionarse teniendo en cuenta la homología de la secuencia de aminoácidos con otras polimerasas y las mutaciones que es conocido que reducen la 45 actividad exonucleasa de la ADN polimerasa (Derbyshire et al., Science. 8 de abril de 1988; 240(4849):199-201). Generalmente, los aminoácidos en estas partes mostradas como Exo I, Exo II y/o Exo III en la figura 4 pueden o bien delecionarse o bien sustituirse por aminoácidos diferentes. También pueden llevarse a cabo deleciones grandes o múltiples sustituciones de aminoácidos en estas posiciones Exo I, Exo II y/o Exo III. Tras la mutagénesis del polipéptido que presenta la secuencia SEC ID nº: 1, se mide el nivel de actividad 50 exonucleasa y se determina la cantidad de actividad ADN polimerasa para garantizar que es suficiente para su utilización en la presente invención.
La expresión “actividad exonucleasa 5’” se refiere a la presencia de una actividad en una proteína que puede eliminar nucleótidos del extremo 5’ de un oligonucleótido. La actividad exonucleasa 5’ puede medirse utilizando cualquiera de los ensayos proporcionados en el presente documento.
Las ADN polimerasas de esta invención incluyen polipéptidos que se han modificado genéticamente para reducir la actividad exonucleasa de esa polimerasa, así como las que son sustancialmente idénticas 5 (identidad a por lo menos 80%) a la ADN polimerasa de ABV que se produce de manera natural o una polimerasa modificada de la misma, o a las enzimas equivalentes mencionadas anteriormente. Cada una de estas enzimas puede modificarse para que presente propiedades similares a las de la ADN polimerasa de ABV. Es posible aislar la enzima a partir de células infectadas por virus ABV directamente, aunque la enzima se aísla preferentemente a partir de células que la sobreproducen (expresión recombinante). 10
La expresión “actividad exonucleasa” se refiere a la presencia de una actividad en una proteína que puede eliminar nucleótidos del extremo 3’ o del extremo 5’ de un oligonucleótido. Tal actividad exonucleasa puede medirse utilizando cualquiera de los ensayos de actividad exonucleasa bien conocidos por el experto en la materia.
La expresión “actividad ADN polimerasa” se refiere a la capacidad de un polipéptido enzimático para 15 sintetizar nuevas cadenas de ADN mediante la incorporación de desoxinucleósidos trifosfato. El ejemplo 4 proporciona a continuación un ejemplo de ensayo para la medición de la actividad ADN polimerasa. Tal actividad ADN polimerasa puede medirse utilizando cualquiera de los ensayos de actividad ADN polimerasa bien conocidos por el experto en la materia. Una proteína que puede dirigir la síntesis de nuevas cadenas de ADN (síntesis de ADN) mediante la incorporación de desoxinucleósidos trifosfato de una manera dependiente 20 de molde se dice que “puede presentar actividad ADN polimerasa”.
En la presente descripción, los términos polipéptidos, secuencias polipeptídicas, péptidos y proteínas son intercambiables.
Los términos “idéntico” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o presentan un 25 porcentaje especificado de residuos de aminoácido que son iguales (es decir, aproximadamente 80% de identidad, preferentemente 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o mayor identidad a lo largo de una región especificada cuando se comparan y alinean para lograr una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación o región designada) tal como se mide utilizando algoritmos de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con parámetros por defecto, o mediante alineación manual e inspección 30 visual (véase, por ejemplo, el sitio web de NCBI). La definición también incluye secuencias que presentan deleciones y/o adiciones, así como las que presentan sustituciones. Tal como se describe a continuación, los algoritmos preferidos pueden representar huecos y similares. Preferentemente, existe identidad a lo largo de una región que presenta por lo menos aproximadamente 25 aminoácidos de longitud, o más preferentemente a lo largo de una región que presenta por lo menos 25-75 aminoácidos de longitud. 35
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de prueba y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Preferentemente, pueden utilizarse parámetros por defecto del programa, o pueden designarse 40 parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias calcula entonces las identidades de secuencia en tanto por ciento para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Son bien conocidos en la técnica los procedimientos de alineación de secuencias para comparación. Un ejemplo preferido de algoritmo que es adecuado para determinar la similitud de secuencia y la identidad de 45 secuencia en tanto por ciento son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) y Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990).
Por ejemplo, es posible utilizar el programa BLAST, “BLAST 2 sequences” (Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/b12.html, siendo los parámetros utilizados los facilitados 50 por defecto (en particular para los parámetros “penalización por hueco abierto”: 5, y “penalización por extensión de hueco”: 2; siendo la matriz seleccionada, por ejemplo, la matriz “BLOSUM 62” propuesta por el programa), calculándose directamente por el programa el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que van a compararse.
Por secuencia de aminoácidos que presenta por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, o mayor identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia, resultan preferidas las que presentan, con respecto a la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, en particular una deleción, adición o sustitución de por lo menos un aminoácido, un truncamiento o una elongación. En el caso de una sustitución de uno o más aminoácido(s) consecutivo(s) o no consecutivo(s), se prefieren las sustituciones en 5 las que los aminoácidos sustituidos se sustituyen por aminoácidos “equivalentes”. La expresión “aminoácidos equivalentes” pretende hacer referencia en la presente memoria a cualquier aminoácido que pueda sustituirse por uno de los aminoácidos de la estructura base sin, sin embargo, modificar esencialmente la actividad ADN polimerasa del polipéptido de referencia y tal como se definirá a continuación, especialmente en el ejemplo 4, último párrafo. 10
Estos aminoácidos equivalentes pueden determinarse o bien basándose en su homología estructural con los aminoácidos que sustituyen, o bien en los resultados de ensayos comparativos de actividad ADN polimerasa entre los diferentes polipéptidos que pueden llevarse a cabo. A título de ejemplo, se mencionan las posibilidades de sustitución que pueden llevarse a cabo sin dar como resultado una modificación profunda de la actividad ADN polimerasa del polipéptido modificado correspondiente. Por tanto, es posible sustituir leucina 15 por valina o isoleucina, ácido aspártico por ácido glutámico, glutamina por asparagina, arginina por lisina, etc. siendo las sustituciones inversas naturalmente concebibles en las mismas condiciones.
De ese modo, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de ADN polimerasa según la invención.
Se da a conocer el ácido nucleico que presenta la secuencia SEC ID nº: 2 o que presenta una 20 secuencia que presenta por lo menos el 80% de identidad tras la alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 2, presentando el polipéptido codificado por dicho ácido nucleico una actividad ADN polimerasa, preferentemente a una temperatura de 50ºC o superior a 50ºC.
En la presente descripción, los términos ácido nucleico, polinucleótido, oligonucleótido, o secuencia de nucleótidos o de ácido nucleico son intercambiables. 25
En otro aspecto, la invención comprende un vector que comprende el ácido nucleico de la invención.
En una forma de realización preferida, el vector según la invención está caracterizado porque dicho ácido nucleico está funcionalmente unido a un promotor.
La presente descripción se refiere a vectores de clonación y/o expresión que contienen una secuencia de nucleótidos según la invención. 30
Se da a conocer que los vectores según la invención contienen elementos que permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias de nucleótidos en una célula huésped determinada. Por tanto, el vector debe contener un promotor, señales de iniciación y terminación de la traducción, así como regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Debe poder mantenerse de manera estable en la célula huésped y puede presentar opcionalmente señales particulares que especifican la secreción de la proteína traducida. 35 Estos diferentes elementos los selecciona y optimiza el experto en la materia en función de la célula huésped utilizada. A este efecto, las secuencias de nucleótidos según la invención pueden insertarse en vectores de replicación autónoma en el huésped elegido, o son vectores integrativos del huésped elegido.
Tales vectores se preparan mediante procedimientos actualmente utilizados por el experto en la materia, y los clones resultantes pueden introducirse en un huésped apropiado mediante procedimientos 40 convencionales, tales como lipofección, electroporación, choque térmico o procedimientos químicos.
Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o viral. Son útiles para transformar células huésped con el fin de clonar o expresar las secuencias de nucleótidos según la invención.
En una forma de realización preferida, el vector de la presente invención es el vector plasmídico contenido en la bacteria que se ha depositado según el Tratado de Budapest en la C.N.C.M. (Collection 45 Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 28 de abril de 2006 con el número I-3601.
Este vector plasmídico clonado es el vector pET30a en el que se ha insertado la secuencia nucleica de la ADN polimerasa de la invención entre los sitios NdeI y XbaI del plásmido pET30a.
La expresión “vector de expresión” se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene la 50 secuencia de ácido nucleico codificante deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para
la expresión de la secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas incluyen habitualmente un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosomas, a menudo junto con otras secuencias. Es conocido que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación. 5
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector según la invención, particularmente la bacteria recombinante que se ha depositado según el Tratado de Budapest en la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 28 de abril de 2006 con el número I-3601.
El polipéptido de ADN polimerasa de la presente invención puede expresarse en células huésped o 10 bien procariotas o bien eucariotas. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido de ADN polimerasa de la presente invención puede introducirse en células huésped bacterianas mediante varios medios incluyendo transformación de células bacterianas que se hace que sean competentes para la transformación mediante tratamiento con cloruro de calcio o mediante electroporación. Si el polipéptido de ADN polimerasa de la presente invención va a expresarse en células huésped eucariotas, el ácido nucleico que codifica para el 15 polipéptido de ADN polimerasa de la presente invención puede introducirse en células huésped eucariotas mediante varios medios incluyendo coprecipitación con fosfato de calcio, fusión de esferoplastos, electroporación y similares. Cuando la célula huésped eucariota es una célula de levadura, la transformación puede efectuarse mediante el tratamiento de las células huésped con acetato de litio o mediante electroporación o cualquier otro procedimiento conocido en la materia. Se contempla que cualquier célula 20 huésped será útil en la producción de péptidos o proteínas o fragmentos de las mismas de la invención.
Las células transformadas según la invención pueden utilizarse en procedimientos para la preparación de polipéptidos recombinantes según la invención. Los procedimientos para la preparación de un polipéptido según la invención en forma recombinante, caracterizados porque emplean un vector y/o una célula transformada por un vector según la invención, están comprendidos por sí mismos en la presente 25 invención.
Preferentemente, se cultiva una célula transformada por un vector según la invención en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido y se recupera dicho péptido recombinante.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una ADN polimerasa, comprendiendo dicho procedimiento: 30
(a) cultivar la célula huésped según la invención en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ácido nucleico; y
(b) aislar dicha ADN polimerasa de dicha célula huésped.
Dicha célula huésped puede ser una célula procariota o una eucariota.
Tal como se ha mencionado, la célula huésped puede seleccionarse de entre sistemas procariotas o 35 eucariotas. En particular, es posible utilizar secuencias de nucleótidos que facilitan la secreción en un sistema eucariota o procariota de este tipo. Por tanto, un vector según la invención que porta una secuencia de este tipo puede utilizarse ventajosamente para la producción de proteínas recombinantes, destinadas a secretarse. En efecto, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés se facilitará por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular en vez de en el interior de las células huésped. 40
En otro aspecto, la presente invención comprende un procedimiento de síntesis de una molécula de ADN bicatenario que comprende:
(a) hibridar un cebador con una primera molécula de ADN; y
(b) incubar dicha molécula de ADN de la etapa (a) en presencia de uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato o análogos de los mismos y el polipéptido según la invención, en condiciones suficientes 45 para sintetizar una segunda molécula de ADN complementaria a toda o parte de dicha primera molécula de ADN.
En otro aspecto, la presente invención comprende un procedimiento de síntesis de una molécula de ADN monocatenario que comprende:
(a) la síntesis de una molécula de ADN bicatenario mediante un procedimiento según la invención; y 50
(b) desnaturalizar la molécula de ADN bicatenario obtenida en la etapa (a); y
(c) recuperar la molécula de ADN monocatenario obtenida en la etapa (b).
En otro aspecto, la presente invención comprende un procedimiento para la producción de moléculas de ADN de más de 10 kilobases de longitud que comprende el procedimiento según la invención, en el que la primera molécula de ADN: 5
que sirve como molde en la etapa (a) es de más de 10 kilobases.
En el procedimiento según la invención, dichos desoxirribonucleósidos trifosfato se seleccionan del grupo que consiste en dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
En otro aspecto, la presente invención comprende un procedimiento para amplificar una molécula de ADN bicatenario, que comprende: 10
(a) proporcionar un primer y segundo cebador, en el que dicho primer cebador es complementario a una secuencia en o cerca de los extremos 3’ terminales de la primera cadena de dicha molécula de ADN y dicho segundo cebador es complementario a una secuencia en o cerca de los extremo 3’ terminales de la segunda cadena de dicha molécula de ADN;
(b) hibridar dicho primer cebador con dicha primera cadena y dicho segundo cebador con dicha segunda 15 cadena en presencia del polipéptido según la invención, en condiciones tales que se sintetizan un ácido nucleico complementario a dicha primera cadena y un ácido nucleico complementario a dicha segunda cadena;
(c) desnaturalizar
- dicha primera cadena y sus cadenas complementarias; y 20
- dicha segunda cadena y sus cadenas complementarias; y
(d) repetir las etapas (a) a (c) una o más veces.
También se da a conocer que la etapa de amplificación se realiza mediante PCR, o un procedimiento similar a PCR, o una reacción de RT-PCR implementando el polipéptido que presenta una actividad ADN polimerasa (polipéptido de ADN polimerasa). 25
“PCR” describe un procedimiento de amplificación génica que implica hibridación basada en la secuencia de cebadores con genes específicos dentro de una muestra de ADN y la posterior amplificación que implica múltiples rondas de apareamiento (hibridación), alargamiento y desnaturalización utilizando una ADN polimerasa termoestable.
“RT-PCR” es una abreviatura de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. 30 Someter ARNm a la enzima transcriptasa inversa da como resultado la producción de ADNc que es complementario a las secuencias de bases del ARNm. Pueden producirse entonces grandes cantidades de ADNc seleccionado por medio de la reacción en cadena de la polimerasa que se basa en la acción de la ADN polimerasa termoestable.
“De tipo PCR” se entenderá que hace referencia a todos los procedimientos que utilizan 35 reproducciones directas o indirectas de secuencias de ácido nucleico, o alternativamente en los que los sistemas de marcaje se han amplificado, estas técnicas, por supuesto, se conocen, implican en general la amplificación de ADN mediante una polimerasa; cuando la muestra original es un ARN, es aconsejable llevar a cabo una transcripción inversa de antemano. Hay actualmente un gran número de procedimientos que permiten esta amplificación, por ejemplo los denominados NASBA “amplificación basada en la secuencia de 40 ácido nucleico”, TAS “sistema de amplificación basado en transcripción”, LCR “reacción en cadena de la ligasa”, “amplificación Endo Run” (ERA), “reacción de sonda cíclica” (CPR) y SDA “amplificación por desplazamiento de cadena”, procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.
Cuando se utiliza ARNm, el procedimiento puede llevarse a cabo convirtiendo el ARN aislado en ADNc según procedimientos convencionales utilizando transcriptasa inversa (RT-PCR). 45
La presente descripción se refiere a un procedimiento de preparación de ADNc a partir de ARNm, que comprende:
(a) poner en contacto ARNm con un cebador de oligo(dT) u otro cebador complementario para formar un híbrido, y
(b) poner en contacto dicho híbrido formado en la etapa (a) con el polipéptido de ADN polimerasa según la invención y dATP, dCTP, dGTP y dTTP, mediante lo cual se obtiene un híbrido de ADNc-ARN.
La presente descripción se refiere además a un procedimiento de preparación de ADNbc (ADN 5 bicatenario) a partir de ARNm, que comprende:
(a) poner en contacto ARNm con un cebador de oligo (dT) u otro cebador complementario para formar un híbrido; y
(b) poner en contacto dicho híbrido formado en la etapa (a) con el polipéptido según la invención, dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y un oligonucleótido o cebador que es complementario a la primera cadena de 10 cDNA;
mediante lo cual se obtiene ADNbc.
En otro aspecto, la presente invención comprende un procedimiento para determinar la secuencia de bases de nucleótidos de una molécula de ADN, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto dicha molécula de ADN con una molécula de cebador que puede hibridar con 15 dicha molécula de ADN;
(b) incubar dicho híbrido formado en la etapa (a) en un recipiente que contiene cuatro desoxinucleósidos trifosfato diferentes, un polipéptido de ADN polimerasa según la invención y uno o más agentes de terminación de la síntesis de ADN que terminan la síntesis de ADN en una base de nucleótido específica, en el que cada dicho agente termina la síntesis de ADN en una base de nucleótido 20 diferente; y
(c) separar los productos de ADN de la reacción de incubación según el tamaño, mediante lo cual puede determinarse por lo menos una parte de la secuencia de bases de nucleótidos de dicho ADN.
En una forma de realización preferida, dicho agente de terminación es un didesoxinucleósido trifosfato. 25
Un agente de terminación de la síntesis de ADN que termina la síntesis de ADN en una base de nucleótido específica se refiere a compuestos, incluyendo pero sin limitarse a, didesoxinucleósidos que presentan una estructura de 2’,3’-didesoxi (por ejemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP y ddTTP). Cualquier compuesto que pueda terminar específicamente una reacción de secuenciación de ADN en una base específica puede emplearse como agente de terminación de la síntesis de ADN. 30
En otro aspecto, la presente invención comprende un procedimiento para la amplificación de una molécula de ADN que comprende las etapas que consisten en:
(a) incubar dicha molécula de ADN en presencia de un polipéptido que presenta ADN polimerasa según la invención, la proteína terminal del ampullavirus de arqueas ABV y una mezcla de diferentes desoxinucleósidos trifosfato. 35
En una forma de realización preferida, el procedimiento para la amplificación de una molécula de ADN según la invención se caracteriza porque en un extremo de dicha molécula de ADN está covalentemente unido un fragmento que contiene el origen de replicación de dicho ABV.
De hecho, es probable que ABV realice la replicación de una manera similar a la de phi29, las secuencias de la repetición terminal invertida (ITR) y la región circundante deben estar implicadas en la 40 iniciación de la replicación. Las secuencias SEC ID nº: 5 (extremo izquierdo) y SEC ID nº: 6 (extremo derecho) son las secuencias de ambos extremos terminales genómicos que incluyen la ITR.
Se describe particularmente que la secuencia del fragmento que contiene el origen de replicación de dicho ABV comprende las secuencias SEC ID nº: 5 (extremo izquierdo) y SEC ID nº: 6 (extremo derecho).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para secuenciar una molécula de ADN, que 45 comprende:
(a) unos primeros medios de recipiente que comprenden el polipéptido según la invención;
(b) unos segundos medios de recipiente que comprenden uno o más didesoxirribonucleósidos trifosfato; y
(c) unos terceros medios de recipiente que comprenden uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato.
La presente invención comprende asimismo un kit para amplificar una molécula de ADN, que comprende: 5
(a) unos primeros medios de recipiente que comprenden el polipéptido según la invención; y
(b) unos segundos medios de recipiente que comprenden uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato.
En una forma de realización más preferida, el kit para amplificar una molécula de ADN según la invención comprende además la proteína terminal aislada de ampullavirus de arqueas ABV correspondiente al polipéptido que presenta la SEC ID nº: 3 codificada por el ORF163 (SEC ID nº: 4) del genoma de ABV. 10
La presente invención también comprende la utilización de un polipéptido según la invención para implementar un procedimiento de amplificación por círculo rodante, amplificación por desplazamiento múltiple o amplificación cebada por proteína.
Estos procedimientos particulares son bien conocidos por el experto en la materia y se describen por ejemplo en los documentos: 15
Lizardi et al., 1998; Baner et al., 1998; Dean et al., Genome Res., 11, 1095-1099, 2001;
Larsson et al., Nature methods, 1, 227-232, 2004; para el procedimiento de amplificación por círculo rodante isotérmica;
Dean et al., 2002, para el procedimiento de amplificación por desplazamiento múltiple; y
Blanco et al., 1994, para el procedimiento de amplificación cebada por proteína. 20
Se da a conocer que el procedimiento según la invención, el kit según la invención o la utilización según la invención se caracteriza porque el polipéptido de ADN polimerasa según la invención es un polipéptido que presenta actividad ADN polimerasa y actividad exonucleasa deficiente (por lo menos inferior al 1%, preferentemente inferior a 0,1% de la actividad normalmente asociada con la ADN polimerasa de ABV de tipo natural). 25
La actividad exonucleasa asociada con los polipéptidos de ADN polimerasa de la invención no pueden interferir significativamente con la utilización de la polimerasa en una reacción de amplificación, síntesis o secuenciación de ADN. Sin embargo, se prefiere que el nivel de actividad exonucleasa se reduzca hasta un nivel que es inferior al 10% o el 1%, preferentemente inferior al 0,1% de la actividad normalmente asociada con ADN polimerasas aisladas a partir de células infectadas con el ABV que se produce de manera 30 natural o que presenta la secuencia SEC ID nº: 1.
Se da asimismo a conocer un aparato para la amplificación o secuenciación de ADN que presenta un reactor que comprende un polipéptido de ADN polimerasa de la presente invención.
La presente invención también proporciona procedimientos para producir un polipéptido anti-ADN polimerasa de la invención que comprende exponer un animal que presenta células inmunocompetentes a un 35 inmunógeno que comprende un polipéptido de la invención o por lo menos una parte antigénica (determinante) de un polipéptido de la invención en condiciones tales que las células inmunocompetentes producen anticuerpos dirigidos específicamente contra el polipéptido de la invención, o una parte epitópica del mismo. En una forma de realización, el procedimiento comprende además la etapa de recoger los anticuerpos. En una forma de realización alternativa, el procedimiento comprende la etapa de fusionar las 40 células inmunocompetentes con una línea celular inmortal en condiciones tales que se produce un hibridoma.
Tales anticuerpos pueden utilizarse particularmente para purificar el polipéptido de la presente invención en una muestra en la que están presentes otros componentes.
Los siguientes ejemplos y las figuras se proporcionan a título ilustrativo de las formas de realización de la invención y no limitativo de la presente invención de ningún modo. 45
Figura 1. Micrografías electrónicas de partículas de ABV tras la tinción negativa con acetato de uranilo al 3%. Barras, 100 nm.
Figura 2. Estimación del tamaño del genoma procesando ADN viral digerido con enzimas de restricción (panel derecho) y ADN intacto (panel izquierdo) en un gel de agarosa. Carril 1, ADN viral 5 intacto; carril 2 y 3, ADN digerido con Age I y Afl II respectivamente; M1, marcador de tamaño Lambda DNA-mono cut mix de New England Biolabs (catálogo N3019S); M2, marcador de tamaño Ladder DNA de Amersham.
Figura 3. Mapa del genoma de ABV que muestra la ubicación y el tamaño de los genes supuestos presentes en las dos cadenas de ADN. La mayoría de los genes se expresan en una cadena tal 10 como se indica mediante flechas que apuntan hacia la derecha y unos cuantos en la cadena complementaria tal como se muestra mediante flechas que apuntan hacia la izquierda. Las flechas oscuras indican ORF con funciones asignadas mientras que los genes hipotéticos se muestran mediante flechas grises. Se indican tres ORF internos mediante flechas vacías y sus tamaños están entre paréntesis. Se dibujó el mapa utilizando MacPlasmap 2.05 y Adobe Illustrator. 15
Figura 4. Alineación de secuencia entre ORF653 (SEC ID nº: 1) y la ADN polimerasa de Phi29 (publicada en SEC ID nº: 7 (número de registro de GenBank 1XI1B) que corresponde a la familia de ADN polimerasa de tipo B) que muestra dos inserciones (TPR I y II) que son específicas para todas las secuencias de ADN polimerasas cebadas con proteína. Se indican los motivos conservados implicados en la actividad exonucleasa (Exo I, II, III) y en la polimerización (Pol I, IIa, IIb, III y IV). Los 20 números indican las longitudes de aminoácidos entre la secuencias.
Figura 5A. Purificación de polimerasa recombinante codificada por ORF653 de E. coli. Carril 1, marcador de tamaño de proteína; 2, mezcla bruta total de las células inducidas; 3, sobrenadante tras la sonicación y centrifugación; 4, flujo a través tras la unión de la proteína marcada con His con 25 resina de agarosa Ni-NTA; 5, lavado de la columna de resina; 6, proteína purificada. El tamaño (kD) de los polipéptidos en el marcador se muestra en el lado izquierdo. Dos flechas indican la posición de la polimerasa intacta (parte superior) y fragmentada (parte inferior).
Figura 5B. Ensayo de polimerización. La concentración de polimerasa en la reacción se mostró en la parte superior mientras que la posición del cebador de 18 nt y las moléculas alargadas (42 nt) se 30 indica en el lado izquierdo.
Figura 6A. Estructura secundaria del elemento de ARN supuesto implicado en el empaquetamiento de ABV.
Figura 6B. Estructura secundaria del ARN de procabeza de phi29. Las siete hélices conservadas en 35 los ARNp del bacteriófago están marcadas mediante A a F desde los extremos 5’ terminales hasta los extremos 3’ terminales mientras que se realizaron las designaciones originales según las longitudes de los tallos (Bailey et al., 1990).
Figura 7. Representación del contenido genómico en el extremo izquierdo de ABV, phi29 y adenovirus (tipo 5). La longitud de la ITR es de 580, 6 y 103 pb respectivamente. Los recuadros 40 oscuros indican la región implicada en el empaquetamiento, mostrándose la dirección de la transcripción para ABV y Ø29 mediante flechas pequeñas. Se presentan genes que codifican para polimerasa (pol) y proteína terminal (PT) mediante flechas grises claras y oscuras, respectivamente. El número de ORF presentes entre pol y el elemento de empaquetamiento se indica entre paréntesis.
Se obtuvieron (γ-32P)ATP, dNTP y enzimas de Pharmacia. El oligonucleótido po1F1 (5’-CCTCCCTATTTGATAGGC-3’ SEC ID nº: 8) estaba marcado en 5’ con (γ-32P)ATP y polinucleótido cinasa de T4 y se purificó electroforéticamente en geles de poliacrilamida al 20%-urea 8 M. Se mezcló po1F1 marcado
con polF1c+24 (5’-AGGTAAGCATGCATCAGTTAATACGCCTATCAAATAGGGAGG-3’ SEC ID nº: 9) y se usó la mezcla como cebador-molécula de ADN molde en el ensayo de purificación (véase a continuación).
Se prepararon cultivos de enriquecimiento aerobios a partir de muestras tomadas de un depósito de agua en el cráter del volcán Solfatara en Pozzuoli, Italia, a 87-93ºC y pH 1,5-2, tal como se describió 5 anteriormente (Häring et al., 2005a). Se hicieron crecer a 75ºC, pH 3. Se purificaron viriones mediante centrifugación en un gradiente de densidad de flotación de CsCl y se rompieron con SDS al 1% (p/v) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de extraer y precipitar el ADN tal como se describió anteriormente (Häring et al., 2005a).
Dado que se encontraba disponible un total de sólo aproximadamente 200 ng de ADN viral purificado para el proyecto, inicialmente se amplificó aproximadamente 1 ng de ADN in vitro para producir unos cuantos μg utilizando el kit de amplificación GenomiPhi (Amersham Biotech, Amersham). Se construyó entonces una biblioteca al azar a partir de fragmentos de ADN sonicado en el intervalo de tamaño de 1,5 a 4 kpb, clonados en el sitio SmaI de pUC18. La biblioteca produjo una cobertura del genoma altamente 15 sesgada.
Se confirmaron el ensamblaje y la secuencia obtenidos a partir de la biblioteca amplificada preparando una biblioteca al azar mixta utilizando aproximadamente 50 ng de ADN de ABV original y 1 μg de ADN extraído de betalipothrixvirus de Acidianus (Vestergaard et al., en prep.). Se preparó la biblioteca tal como se describió anteriormente excepto porque se clonaron fragmentos de ADN sonicado más grandes en el 20 intervalo de 2 a 6,5 kpb. Se realizaron reacciones de PCR para verificar las regiones que no estaban cubiertas por la segunda biblioteca y se secuenciaron también adicionalmente unos cuantos clones mediante paseo con cebador (Peng et al., 2001).
Se realizó una búsqueda BlastP en la base de datos del NCBI. Se utilizaron SMART y MotifScan para 25 detectar dominios, perfiles o patrones conservados. Se detectaron espirales enrolladas, estructuras secundarias y hélices transmembrana mediante programas en ExPASy Proteomics Tools (http://www.expasy.org/tools/).
Se amplificó por PCR ORF653 a partir del ADN viral original utilizando dos cebadores que contenían 30 sitios de restricción NdeI y XhoI, respectivamente (5’-TATTTTTACATATGCTACAAATCCT-3’ SEC ID nº: 10 y 5’-TATAACTCGAGTGAGAGAATACTATTTAAGTC-3’ SEC ID nº: 11). En primer lugar, se clonó el producto de PCR en el vector pGEM-T (Promega) y se digirió el plásmido purificado que contenía el inserto de ORF653 con NdeI y XhoI. Se separó el fragmento de ADN que contenía ORF653 con extremos NdeI y XhoI cohesivos del fragmento de pGEM-T mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión (Promega) y se 35 purificó utilizando un kit de extracción de gel (Quiagen). Se clonó posteriormente el fragmento purificado en el vector pET30-a (Novagen) digerido con NdeI y XhoI y se trató mediante fosfatasa intestinal de ternero. El constructo contiene una secuencia que codifica para 6 residuos de histidina tras el extremo C-terminal del producto de ORF653. Se secuenció el constructo para verificar la secuencia del ORF653 insertado antes de la transformación en la célula huésped de expresión Rosetta (Novagen). 40
Se inoculó una única colonia de transformante de Rosetta en 5 ml de medio LB que contenía cloranfenicol y kanamicina 25 μg/ml y se incubó a 37ºC hasta que la DO alcanza 0,5. Se transfirieron entonces los 5 ml de cultivo a 250 ml de medio LB que contenía los mismos antibióticos. Se recogieron células tras el crecimiento durante la noche a 30ºC en presencia de IPTG 0,1 mM y etanol al 1%. Se purificó la proteína marcada con his utilizando resinas de unión a his Ni-NTA según el protocolo proporcionado por la compañía 45 (Novagen) y se comprobó mediante SDS-PAGE.
La molécula híbrida polF1/polF1c+24 (descrita anteriormente) contiene un extremo saliente en 5’ de 24 nucleótidos de longitud, y por tanto puede utilizarse como cebador-molde para la polimerización de ADN. La mezcla de reacción contenía, en 10 μl, Tris-HCl 25 mM (pH 7,6), ditiotreitol 1 mM, MgCl 10 mM, 250 μM de 50 cada uno de los cuatro dNTP, 0,1 μM del cebador-molécula de ADN de molde y una concentración creciente de polimerasa recombinante. Tras la incubación durante 20 minutos a 50ºC, se detuvo la reacción mediante la
adición de 5 μl de tampón de carga (formamida al 80%, EDTA 10 mM, azul de bromofenol 50 μg/ml) y calentando durante 3 minutos a 80ºC. Se analizaron las muestras mediante PAGE al 20%-urea 8 M y autorradiografía. Se detectó la polimerización como un aumento en el tamaño de la cadena de cebador marcada en 5’ (polF1).
Se aisló ácido nucleico de viriones de ABV y se mostró que eran insensibles a ARNasa A pero podían digerirse mediante endonucleasas de restricción de tipo II, lo que es consecuente con que son de ADNbc. Dada la baja cantidad de ADN genómico que estaba disponible (<200 ng de ADN purificado), se adoptó una estrategia de secuenciación del genoma en dos etapas.
En primer lugar, se amplificó aproximadamente 1 ng de ADN in vitro para producir aproximadamente 10 2 μg de ADN utilizando el kit de amplificación GenomiPhi (Amersham Biotech). Se construyó entonces una biblioteca al azar (véase Materiales y procedimientos) que produjo una cobertura del genoma altamente sesgada, similar a la observada anteriormente para ADN genómico del rudivirus de arqueas SIRV1 que se amplificó mediante el mismo procedimiento (Peng et al., 2004). Se produjo también un alto nivel de clones quiméricos. Se secuenció el genoma con, en promedio, una cobertura de 20 veces, y se identificaron las 15 secuencias de los clones quiméricos mediante su frecuencia inferior en los cóntigos y se eliminaron de la biblioteca.
Con el fin de confirmar el ensamblaje de secuencias obtenidas a partir de la biblioteca de ADN amplificado, se mezclaron aproximadamente 50 ng del ADN de ABV original con 1 μg de ADN extraído de lipothrixvirus de Acidianus (Vestergaard et al., 2005) y se preparó una biblioteca al azar mixta con insertos 20 clonados más grandes (de 2 a 6,5 kpb). La secuenciación y el ensamblaje de estos clones de ABV en los de la primera biblioteca mostraron que las secuencias de las dos bibliotecas coincidían exactamente. Además, se verificaron secuencias de regiones no cubiertas por la segunda biblioteca tras la amplificación por PCR de estas regiones, o paseo con cebador, ambos realizados en ADN viral y/o clones con inserto grande. Además, se extendieron secuencias de unos cuantos clones en el extremo izquierdo terminal mediante paseo con 25 cebador que produjo un cóntigo final de aproximadamente 22 kb.
Para confirmar el ensamblaje del genoma, se digirieron aproximadamente 40 ng del ADN viral con las enzimas de restricción AgeI y AflII. Se fraccionaron los productos mediante electroforesis en gel de agarosa junto con el ADN viral intacto y se tiñeron las bandas con SYBR Gold (Invitrogen). Los tamaños de los fragmentos concordaban con la secuencia del cóntigo ensamblado y la banda del ADN viral intacto indica un 30 tamaño de genoma de aproximadamente 23,8 kb (figura 2).
La discrepancia entre la estimación de tamaño de los digestos de restricción y el tamaño de cóntigo único refleja probablemente que las regiones terminales de genomas virales lineales no están representadas en bibliotecas de clones (Häring et al., 2004; Häring et al., 2005b). Por tanto, se intentó secuenciar adicionalmente a partir de los extremos del cóntigo mediante paseo con cebador en ADN amplificado. Esto 35 produjo aproximadamente 2 kb de secuencia adicional más allá de la cual las lecturas de secuencias terminan invariablemente. La secuencia total obtenida presentaba 23.794 pb, lo que concuerda con la estimación del digesto de fragmentos de restricción. El contenido en G+C era del 35%.
El genoma presenta repeticiones terminales invertidas (ITR) de 580 pb, más pequeñas que las de los genomas de los rudivirus (Peng et al., 2001) pero similares a las de los betalipothrixvirus de arqueas 40 (Vestergaard et al., en prep.).
Con el fin de someter a prueba si los genomas pueden circularizarse, se realizaron experimentos de PCR con unos cuantos pares de cebadores diferentes, que se apareaban cerca de cada extremo del genoma pero ninguno de estos produjo un producto amplificado (datos no representados). Por tanto, se deduce que el genoma de ABV es lineal. 45
Se anotó el genoma y se asignaron codones de terminación (88% de AUG, 6% de GUG y 6% de UUG), motivos de promotor de tipo TATA y/o motivos de Shine-Dalgarno tal como se describió anteriormente (Bettstetter et al., 2003, tabla 1S complementaria). Se presenta en la figura 3 un mapa para el genoma viral completo que contiene 59 ORF supuestos que oscilan en tamaño desde 37 hasta 653 aminoácidos. Tres 50 ORF, 653, 103 y 257, contienen codones de iniciación internos que van precedidos por motivos de Shine-Dalgarno. Por tanto, se asignaron también los ORF internos como genes supuestos (figura 3 y tabla 1). Todos los ORF excepto uno están ubicados en una cadena entre la posición de 8,5 kb y el extremo derecho. Del
resto, todos excepto 3 (ORF247, ORF53a y ORF156) están ubicados en la otra cadena entre el extremo izquierdo y la posición de 8,5 kb (figura 3). Aproximadamente el 49% de los ORF mostrados en la figura 3 van precedidos por secuencias promotoras supuestas, y el 68% van precedidos por motivos de Shine-Dalgarno supuestos. Además, aproximadamente el 11% de los ORF presentan terminadores supuestos ricos en T en el sentido de 3’. Aproximadamente el 85% de los ORF se disponen en operones supuestos y se predice que 5 aproximadamente el 25% de los genes generan transcritos que o bien no llevan secuencia líder o bien portan secuencias líder muy cortas. La distancia entre los ORF es generalmente muy corta y el 24% de los ORF se superponen con el ORF en el sentido de 5’, lo que indica que el genoma es compacto. Muy sorprendentemente, los 29 ORF ubicados entre las posiciones de 10 kb a 21 kb parecen formar un único operón grande (figura 3 y tabla 1S) 10
Sólo a tres ORF pudieron asignarse funciones inequívocas basándose en búsquedas de homólogos en bases de datos de secuencias públicas (véase Materiales y procedimientos). ORF653 mostró una similitud de secuencia significativa con la familia de ADN polimerasas B con las mejores coincidencias con polimerasas cebadas por proteína. Además, se identificó ORF156 como una timidilato cinasa y ORF315 como una glicosil transferasa supuesta. 15
Todas las anotaciones de genes se resumen en la tabla 1. Mientras que la mayoría de los genomas virales de crenarqueas secuenciados codifican para por lo menos una proteína con dominio cinta-hélice-hélice (RHH) que es el producto génico más común en virus de crenarqueas, no se detectó ningún dominio RHH en el genoma de ABV. Sin embargo, ORF56 muestra una similitud limitada con el dominio hélice-giro-hélice de tipo tetR que está presente en algunos reguladores de la transcripción procariotas implicados en la resistencia 20 frente a fármacos o estrés. Otros tres ORF contienen un patrón de cremallera de leucina que puede estar implicado en la regulación de la transcripción (figura 3 y tabla 1). ORF188 contiene un dominio de unión a calcio de mano EF significativo y muestra una similitud limitada con la subunidad reguladora de la subunidad R de la proteína cinasa A de tipo II. Por tanto, puede codificar para una proteína cinasa dependiente de Ca++. Se detectó un perfil de dominio apaG supuesto en la secuencia de ORF133 que puede estar implicado en 25 interacciones proteína-proteína. La predicción de la estructura secundaria de la proteína de ORF133 reveló aproximadamente un 90% cadena extendida y espiral aleatoria. Esto se correlaciona con el alto contenido en láminas beta en las estructuras terciarias de diferentes proteínas apaG. Tres ORF adyacentes (112, 166 y 346) contienen unas cuantas hélices transmembrana y parecen ser proteínas unidas a membrana o de membrana supuestas. De especial interés es ORF346 que porta un sitio de unión a lípidos de lipoproteínas de 30 membrana procariotas y un dominio de tipo EGF. Este último se produce generalmente en el dominio extracelular de proteínas unidas a membrana o en proteínas secretadas (tabla 1). Estas propiedades concuerdan con que ORF346 constituya una proteína de la envuelta viral que interacciona con proteínas de membrana del huésped, o una proteína transmembrana que facilita la liberación de partículas virales de las células huésped. Las proteínas transmembrana supuestas codificadas por los dos ORF en el sentido de 5’ 35 (112 y 166) también podrían estar implicadas en el mismo proceso. Las secuencias C-terminales tanto de ORF346 como de ORF470 en el sentido de 3’ muestran baja complejidad tal como se observa en unos cuantos ORF grandes en otros genomas virales de crenarqueas (por ejemplo Häring et al., 2005; Neumann y Zillig, 1990). La/las función/funciones de las proteínas se desconoce(n).
Mientras que a tres ORF se les asignó una función inequívoca y unos cuantos portan motivos o 40 patrones conservados supuestos (tabla 1), el único gen compartido entre ABV y otros virus de crenarqueas es ORF315, la glicosil transferasa. Anteriormente, la genómica comparativa reveló ningún gen o muy pocos genes compartidos entre diferentes genomas virales de crenarqueas (Häring et al., 2004; Peng et al., 2001; Bettstetter et al., 2003). El resultado de este trabajo refuerza que los virus de crenarqueas forman un grupo extremadamente diverso. 45
- ORF
- Función predicha Entrada de Pfam o número de documento de prosite valor de e*
- 53a
- Cremallera de leucina Pdoc00029
- 56
- Dominio HTH (tipo TetR) Pdoc00830 1,4
- 92a
- Cremallera de leucina Pdoc00029
- 133
- Perfil de dominio ApaG, interacción proteína-proteína Pdoc51087 0,94
- 150
- Cremallera de leucina Pdoc00029
- 188
- Dominio de unión a Ca++ de mano EF Pdoc00018
- Subunidad reguladora de la subunidad R de la proteína cinasa A de tipo II Pfam02197 0,0024
- 346
- Sitio de unión a lípidos de lipoproteínas Pdoc00013
- Dominio de tipo EGF Pdoc00021
- 156
- Timidilato cinasa Pfam02223 6,1e-5
- ORF
- Función predicha Entrada de Pfam o número de documento de prosite valor de e*
- 315
- Glicosil transferasa Pfam00534 3e-10
- 470
- Espiral enrollada, interacción proteína-proteína
- 653
- ADN polimerasa Pfam03175
- *No se facilita el valor de e para resultados positivos del patrón de Prosite
Con la excepción de los rudivirus, se tienen pocos conocimientos sobre los mecanismos de 5 replicación de los genomas virales de arqueas. Sin embargo, ABV es excepcional porque su genoma codifica para una ADN polimerasa cebada por proteína supuesta. Estas enzimas se codifican invariablemente en genomas de ADNbc lineales que portan ITR con proteínas terminales covalentemente unidas y se han caracterizado tanto en un bacteriófago, Ø29, como en un adenovirus de Eukarya (revisado por Salas, 1991). El modelo de iniciación de la replicación para estos virus implica una proteína terminal libre que forma un 10 heterodímero con la ADN polimerasa y que interacciona con el origen de replicación por medio de la proteína terminal unida al ADN y secuencias de nucleótidos específicas en cualquier extremo del genoma. Un grupo hidroxilo de la serina, treonina o tirosina en la proteína terminal sirve como sitio receptor para el primer nucleótido. Además, muchos plásmidos de ADNbc lineales y genomas mitocondriales presentan ITR y ADN polimerasas cebadas por proteína y portan proteínas terminales que es probable que se repliquen de una 15 forma similar (Salas, 1991). La subfamilia de ADN polimerasas cebadas por proteína pertenece a la familia B de ADN polimersas dependientes de ADN y posee dos inserciones, TPR-1 y TPR-2 (Blasco et al., 2000; Dufour et al., 2000; Rodriguez et al., 2005).
Una alineación de secuencias de ORF653 y la ADN polimerasa de Ø29 (figura 4) ilustra que ORF653 contiene tres dominios exonucleasa (Exo I, II y III) en la región N-terminal y cinco dominios sintéticos 20 conservados (pol I, IIa, IIb, III y IV) en la parte C-terminal característica de ADN polimerasas de la familia B (Blanco et al., 1991; Rohe et al., 1992). Además, las inserciones TPR-1 y TPR-2 también están presentes en ORF653 (figura 4). Mientras TPR-1 es similar en tamaño (50 aa) a las de todas las ADN polimerasas cebadas por proteína, incluyendo las codificadas por adenovirus humanos (Dufour et al., 2000), mientras que TPR-2, ubicada entre los motivos pol IIa y IIb, está truncada en relación con el intervalo de tamaño conocido de 25 insertos que se extienden desde 28 aa (Ø29) hasta 118 aa (adenovirus tipo 2) (Bois et al., 1999). Para la ADN polimerasa de Ø29, se encontró que TPR-1 participaba en la interacción con la proteína de cebado terminal (Dufour et al., 2000) mientras que se mostró que se requería TPR-2 para la al alta procesividad y actividad de desplazamiento de cadena de la polimerasa (Rodriguez et al., 2005). Aunque la función de la TPR-1 más conservada es probable que sea general para todas las ADN polimerasas cebadas con proteína, sigue 30 desconociéndose si esto se aplica a la TPR-2 más variable.
Con el fin de confirmar que ORF653 es una ADN polimerasa, se amplificó el gen a partir del genoma viral mediante PCR y se clonó en un vector de expresión de E. coli. Se purificó una cantidad razonable de
proteína recombinante soluble junto con un fragmento C-terminal de la proteína (figura 5A). Para someter a prueba la actividad de polimerización, se incubó la proteína con un ADN de molde-cebador marcado a 50ºC. La figura 5B muestra claramente que el cebador (18 nt) se alargó hasta el tamaño del molde (42 nt), lo que indica actividad de polimerización. Cuando se utilizaron NTP en lugar de dNTP, no se detectó polimerización (datos no representados). Esto confirma que el producto de ORF653 es de hecho una ADN polimerasa. 5
La presencia de una ITR y un gen que codifica para una ADN polimerasa cebada por proteína supuesta en el genoma lineal de ABV sugiere fuertemente que cada extremo 5’ terminal está covalentemente unido a una proteína terminal. Esto es difícil de someter a prueba experimentalmente, debido a los rendimientos muy bajos de partículas de virus que se producen. Por tanto, se analizaron las secuencias de 10 proteínas terminales de bacteriófagos relevantes, plásmidos lineales y adenovirus humanos con el fin de llegar a comprender bien las características conservadas de estas proteínas. Mientras que la polimerasa está relativamente conservada, la proteína terminal muestra muy baja conservación. Por ejemplo, la proteína terminal del bacteriófago PRD1 de E. coli no muestra similitud de secuencia significativa con otras proteínas terminales conocidas (Savilahti et al., 1987) y sólo se encontró un 13/48% de identidad/similitud entre la 15 proteína terminal de Ø29 y un plásmido mitocondrial lineal del hongo de la podredumbre blanca Pleurotus ostreatus (Kim et al., 2000). Sin embargo, la ubicación génica de la proteína terminal está altamente conservada. Por tanto, en los bacteriófagos Ø29, PRD1, GA-1 y CP-1 (números de registro P03681, P09009, X96987 y Z47794) y en adenovirus humanos el gen está ubicado siempre inmediatamente en el sentido de 5’ del gen de la ADN polimerasa mientras que el tamaño de la proteína oscila entre 230 aa y 266 aa para los 20 bacteriófagos y 671 aa para el adenovirus tipo 2 (AC_000007). La replicación del ADN está menos estudiada para los plásmidos lineales, dos de los cuales se encontró que codificaban para una proteína terminal N-terminal fusionada y una ADN polimerasa C-terminal (Kim et al., 2000; Takeda et al., 1996). La alineación de secuencias de las ADN polimerasas también reveló extensiones de secuencias grandes en la parte N-terminal en los otros plásmidos lineales (Bois et al., 1999), lo que indica que los genes de la polimerasa y la proteína 25 terminal pueden estar fusionados generalmente. Además, el mapeo de transcritos reveló que los genes de proteínas terminales y ADN polimerasas siempre se transcriben conjuntamente en un único ARNm en todos los virus estudiados, incluyendo CP-1 (Martin et al., 1996) y fagos de la familia de Ø29 (revisado por Meijer et al., 2001). Por tanto, la polimerasa y la proteína terminal están vinculadas estrechamente tanto en la organización génica como en la función. Para ABV, el gen en el sentido de 5’ de la polimerasa codifica para 30 163 aa, lo que es dos tercios del tamaño de las proteínas terminales de bacteriófagos. Sin embargo, alineaciones de secuencias utilizando ClustalW (EMBL-EBI) revelaron una puntuación superior entre ORF163 y PT de PRD1 que entre PT de PRD1 y Ø29 (datos no representados), lo que indica que ORF163 puede codificar para una proteína terminal.
Anteriormente, se mostró que la estructura de virión de ABV es muy compleja en comparación con otros virus de crenarqueas conocidos. El virión con forma de botella contiene un “tapón” en el extremo estrecho y un disco, o anillo, que lleva 20 filamentos cortos en el extremo ancho (Häring et al., 2005). El cuerpo principal parece estar formado por dos capas que recubren un núcleo complejo y el filamento de nucleoproteína está empaquetado, de manera compacta, dentro del cuerpo principal. Por tanto, es probable 40 que el mecanismo de empaquetamiento del ADN sea complejo.
Se ha estudiado el empaquetamiento del ADN genómico para diversos bacteriófagos y virus de Eukarya que portan genomas lineales. Los mecanismos comparten algunas características comunes, incluyendo la participación de un par de proteínas que no son de la cápsida y la fuente de energía, ATP, para translocar la molécula de ADN larga al interior de una procápsida preformada (revisado por Guo, 2005). Un 45 componente esencial de la maquinaria de empaquetamiento de Ø29 es un ARN de 174 nt, ARNp, que participa activamente en la translocación del ADN uniéndose a la procápsida y al ATP y cooperando con la proteína de empaquetamiento (Guo, 2005). El ARNp se codifica adyacente a la ITR en un extremo del genoma de Ø29 y presenta un alto nivel de estructura secundaria y pueden formarse motivos estructurales secundarios conservados para todos los bacteriófagos relacionados con Ø29 conocidos (revisado por Meijer 50 et al., 2001). Además, se encontró también que una región correspondiente, adyacente a una ITR, era importante para el empaquetamiento de ADN adenoviral (Grable y Hearing, 1990). El examen de las regiones correspondientes en el genoma de ABV reveló una región de 600 pb, que carecía de marcos de lectura abiertos, próxima a la ITR izquierda, que era relativamente rica en G+C en el centro. La estructura secundaria predicha para la secuencia rica en G+C de 200 pb muestra una alta similitud con la de ARNp de bacteriófagos 55 Ø29 y CP-1 (figura 6). Las siete hélices marcadas A a F están altamente conservadas en todos los ARNp de bacteriófagos. Se producen diferencias sólo en la región a la izquierda de la hélice F en la que se producen
horquillas-bucles adicionales en el ARN de ABV supuesto mientras que está presente un bucle pequeño en los ARNp de los bacteriófagos (figura 6). La transcripción del ARN de ABV podría iniciarse en la secuencia de tipo promotor, ATTTAAT, ubicada 20 pb en el sentido de 5’ del elemento. La posición genómica conservada, la estructura secundaria similar, el alto contenido en G+C y la presencia de un promotor supuesto indican fuertemente que esta región no codificante codifica para una molécula de ARN que está probablemente 5 implicada en el empaquetamiento del ADN viral.
Otro componente importante implicado en el empaquetamiento del ADN de Ø29 es el conector que se ha propuesto que gira con el fin de translocar el ADN al interior de la procabeza (Meijer et al., 2001). Aunque la morfología general de ABV es diferente de la de Ø29, el “tapón” se parece al conector de Ø29 que también presenta una forma de cuello de botella y cuyo extremo ancho también está enterrado en el interior 10 de la procabeza (Meijer et al., 2001). Además, el extremo ancho del tapón está conectado con el filamento de nucleoproteína (Häring et al., 2005). Por tanto, el conector también puede estar implicado en el empaquetamiento de ABV.
Actualmente, se sabe poco sobre el empaquetamiento de viriones de arqueas con ADN lineal. Tiende a especularse que es más sencillo para los virus filamentosos y rudivirus de crenarqueas que presentan 15 generalmente el ADN genómico superenrollado dispuesto en estructuras largas y “lineales” (forma de varilla o filamentosa) que contienen de 1 a 3 proteínas. Por tanto, parece que no empaquetan el ADN genómico en una estructura preformada. Para virus tales como ABV y PSV, que presentan una estructura más compacta y genomas lineales especialmente largos, se deduciría que necesitan un mecanismo de empaquetamiento o encapsidación exhaustivo. 20
El contenido genómico en el extremo izquierdo de ABV, bacteriófago Ø29 y adenovirus eucariota se representa en la figura 7, que presenta alta similitud entre los tres virus. El ABV es el primer virus de arqueas que se notifica que contiene una ADN polimerasa cebada por proteína. La presencia de la polimerasa en tres virus morfológicamente distintos de tres dominios de vida indica fuertemente que el mecanismo de replicación del ADN cebado por proteína es antiguo, existiendo probablemente desde antes de la divergencia de los tres 25 dominios de vida.
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<130> D24232
<160> 11 20
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 653 25
<212> PRT
<213> Ampullavirus ABV
<220>
<223> ADN polimerasa termoestable 30
<400> 1
<210> 2
<211> 1962
<212> ADN 5
<213> Ampullavirus ABV
<220>
<223> ADNc que codifica para la ADN polimerasa termoestable
<400> 2
5
<210> 3
<211> 163
<212> PRT
<213> Ampullavirus ABV 10
<220>
<223> Proteína terminal del ampullavirus ABV codificada por el ORF163 del genoma de ABV
<400> 3 15
<210> 4 5
<211> 492
<212> ADN
<213> Ampullavirus ABV
<220> 10
<223> ADNc que codifica para la proteína terminal del ampullavirus ABV
<400> 4
15
<210> 5
<211> 600
<212> ADN
<213> Ampullavirus ABV
5
<220>
<223> Secuencia del extremo izquierdo del extremo terminal genómico del ampullavirus ABV que incluye la repetición terminal invertida
<400> 5 10
<210> 6
<211> 600
<212> ADN 15
<213> Ampullavirus ABV
<220>
<223> Secuencia del extremo derecho del extremo terminal genómico de ampullavirus ABV que incluye la repetición terminal invertida 20
<400> 6
<210> 7
<211> 575
<212> PRT 5
<213> Fago phi29 de Bacillus
<220>
<223> Familia de ADN polimerasa tipo B (de número de registro de GenBank 1XI1B)
10
<400> 7
<210> 8
<211> 18
<212> ADN 5
<213> secuencia artificial
<220>
<223> Cebador utilizado como cebador-molécula de ADN de molde en la polimerización de la molécula híbrida polF1/polF1c+24 10
<400> 8
cctccctatt tgataggc 18
15
<210> 9
<211> 42
<212> ADN
<213> secuencia artificial
5
<220>
<223> Cebador utilizado como cebador-molécula de ADN de molde en la polimerización de la molécula híbrida polF1/polF1c+24
<400> 9 10
aggtaagcat gcatcagtta atacgcctat caaataggga gg 42
<210> 10
<211> 25 15
<212> ADN
<213> secuencia artificial
<220>
<223> Cebador utilizado como cebador-molécula de ADN de molde para la amplificación de la ADN 20 polimerasa del ampullavirus ABV
<400> 10
tatttttaca tatgctacaa atcct 25 25
<210> 11
<211> 32
<212> ADN
<213> secuencia artificial 30
<220>
<223> Cebador utilizado como cebador-molécula de ADN de molde para la amplificación de la ADN polimerasa del ampullavirus ABV
35
<400> 11
tataactcga gtgagagaat actatttaag tc 32
Claims (27)
- REIVINDICACIONES
- 1. ADN polimerasa aislada seleccionada de entre el grupo de polipéptidos constituido por:
a) el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1;b) un fragmento de a) que presenta una actividad ADN polimerasa;c) un polipéptido que comprende por lo menos los fragmentos de SEC ID nº: 1 que permiten la actividad 5 ADN polimerasa de dicha ADN polimerasa de a);d) un polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1 en la que los siguientes sitios de exonucleasa tal como se identifican en la figura 4:Exo I: ---I---DLET---,Exo II: -Y-HNL-FD---FIL, y/o 10Exo III: KE---YL--D---L,se han mutado o delecionado con el fin de que el polipéptido de ADN polimerasa resultante presente una actividad exonucleasa no detectable o deficiente en comparación con el polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 1;- e) un polipéptido que presenta una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad tras la 15 alineación óptima con la secuencia SEC ID nº: 1, presentando dicho polipéptido una actividad ADN polimerasa.
-
- 2. ADN polimerasa según la reivindicación 1, que es aislada del ampullavirus de arqueas ABV.
-
- 3. ADN polimerasa según la reivindicación 1 ó 2, que comprende por lo menos los fragmentos siguientes de SEC ID nº: 1 tal como se identifican en la figura 4: 20
Pol I: YDVNSLYP-AM;Pol IIa: --K---NS-YG;Pol IIb: T---GR;Pol III: Y-DTDS; yPol IV: K-Y. 25 -
- 4. Ácido nucleico que codifica para un polipéptido de ADN polimerasa según una de las reivindicaciones 1 a 3.
-
- 5. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 4.
-
- 6. Vector según la reivindicación 5, en el que dicho ácido nucleico está funcionalmente unido a un promotor. 30
-
- 7. Vector según la reivindicación 5, que ha sido depositado en la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 28 de abril de 2006 con el número I-3601.
-
- 8. Célula huésped que comprende el vector según las reivindicaciones 5 a 7.
-
- 9. Célula huésped según la reivindicación 8, que se ha depositado en la C.N.C.M. (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, París, Francia) el 28 de abril de 2006 con el 35 número I-3601.
-
- 10. Procedimiento de producción de una ADN polimerasa, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) cultivar la célula huésped según la reivindicación 8 ó 9 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ácido nucleico; y- (b) aislar dicha ADN polimerasa de dicha célula huésped. 40
-
- 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicha célula huésped es una célula procariota o una eucariota.
-
- 12. Procedimiento de síntesis de una molécula de ADN bicatenario que comprende:
(a) hibridar un cebador con una primera molécula de ADN; y- (b) incubar dicha molécula de ADN de la etapa (a) en presencia de uno o más desoxirribonucleósidos 5 trifosfato o análogos de los mismos y el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones suficientes para sintetizar una segunda molécula de ADN complementaria a la totalidad o parte de dicha primera molécula de ADN.
-
- 13. Procedimiento de síntesis de una molécula de ADN monocatenario que comprende:
(a) la síntesis de una molécula de ADN bicatenario mediante un procedimiento según la reivindicación 10 12; y(b) desnaturalizar la molécula de ADN bicatenario obtenida en la etapa (a); y- (c) recuperar la molécula de ADN monocatenario obtenida en la etapa (b).
-
- 14. Procedimiento para la producción de moléculas de ADN de más de 10 kilobases de longitud que comprende los procedimientos según la reivindicación 12 ó 13, en el que la primera molécula de ADN: que 15 sirve como molde en la etapa (a) es de más de 10 kilobases.
-
- 15. Procedimiento según las reivindicaciones 12 a 14, en el que dichos desoxirribonucleósidos trifosfato se seleccionan de entre el grupo constituido por dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
-
- 16. Procedimiento para amplificar una molécula de ADN bicatenario, que comprende:
(a) proporcionar unos primer y segundo cebadores, en el que dicho primer cebador es complementario a 20 una secuencia en o próxima a los extremos 3’ terminales de la primera cadena de dicha molécula de ADN y dicho segundo cebador es complementario a una secuencia en o próxima a los extremos 3’ terminales de la segunda cadena de dicha molécula de ADN;(b) hibridar dicho primer cebador con dicha primera cadena y dicho segundo cebador con dicha segunda cadena en presencia del polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3, en condiciones tales que se 25 sintetizan un ácido nucleico complementario a dicha primera cadena y un ácido nucleico complementario a dicha segunda cadena;(c) desnaturalizar- dicha primera cadena y sus cadenas complementarias; y- dicha segunda cadena y sus cadenas complementarias; y 30- (d) repetir las etapas (a) a (c) una o más veces.
-
- 17. Procedimiento para determinar la secuencia de bases de nucleótidos de una molécula de ADN, que comprende las etapas que consisten en:
(a) poner en contacto dicha molécula de ADN con una molécula de cebador que puede hibridar con dicha molécula de ADN; 35(b) incubar dicho híbrido formado en la etapa (a) en un recipiente que contiene cuatro desoxinucleósidos trifosfato diferentes, un polipéptido de ADN polimerasa según las reivindicaciones 1 a 3 y uno o más agentes de terminación de la síntesis de ADN que terminan la síntesis de ADN en una base de nucleótido específica, en el que dicho agente termina la síntesis de ADN en una base de nucleótido diferente; y 40- (c) separar los productos de ADN de la reacción de incubación según el tamaño, pudiéndose determinar por lo menos una parte de la secuencia de bases de nucleótidos de dicho ADN.
-
- 18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho agente de terminación es un didesoxinucleósido trifosfato.
-
- 19. Procedimiento para la amplificación de una molécula de ADN que comprende las etapas que consisten en:
- (a) incubar dicha molécula de ADN en presencia de un polipéptido que presenta ADN polimerasa según las reivindicaciones 1 a 3, la proteína terminal del ampullavirus de arqueas ABV y una mezcla de diferentes desoxinucleósidos trifosfato. 5
-
- 20. Procedimiento para la amplificación de una molécula de ADN según la reivindicación 19, en el que en un extremo de dicha molécula de ADN está covalentemente unido un fragmento que contiene el origen de replicación de dicho ABV.
-
- 21. Procedimiento según las reivindicaciones 10 a 20, en el que el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 es un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 1d) que presenta una 10 actividad exonucleasa deficiente y una actividad ADN polimerasa.
-
- 22. Kit para secuenciar una molécula de ADN, que comprende:
a) unos primeros medios de recipiente que comprenden el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3;(b) unos segundos medios de recipiente que comprenden uno o más didesoxirribonucleósidos trifosfato; y 15(c) unos terceros medios de recipiente que comprenden uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato. -
- 23. Kit para amplificar una molécula de ADN, que comprende:
(a) unos primeros medios de recipiente que comprenden el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3; y- (b) unos segundos medios de recipiente que comprenden uno o más desoxirribonucleósidos trifosfato. 20
-
- 24. Kit según la reivindicación 23, que comprende además una proteína terminal recombinante o aislada de ampullavirus de arqueas ABV que presenta la secuencia SEC ID nº: 3.
-
- 25. Kit según las reivindicaciones 22 a 24, en el que el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 es un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 1d) que presenta una actividad exonucleasa deficiente y una actividad ADN polimerasa. 25
-
- 26. Utilización de un polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 para amplificación por círculo rodante, amplificación por desplazamiento múltiple o amplificación cebada por proteínas.
-
- 27. Utilización según la reivindicación 26, en el que el polipéptido según las reivindicaciones 1 a 3 es un polipéptido como se ha definido en la reivindicación 1d) que presenta una actividad exonucleasa deficiente y una actividad ADN polimerasa. 30
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06290764T Active ES2355650T3 (es) | 2006-05-12 | 2006-05-12 | Adn polimerasa termoestable del ampullavirus de arqueas abv y sus aplicaciones. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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