ES2355555T3 - Amplificación de ácidos nucleicos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para una amplificación de ácidos nucleicos ciclados térmicamente, que incluye una reacción de polimerasa de una plantilla de ácido nucleico, un cebador, una polimerasa de ácido nucleico y al menos un polifosfato de nucleósido, comprendiendo la mejora realizar dicha reacción de polimerasa en presencia de al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, y además en el que la amplificación se realiza en presencia de una concentración adecuada de un estabilizador seleccionado entre el grupo sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico, tungstato sódico, que estabiliza el polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal frente a hidrólisis no enzimática.
Description
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos Nº 60/445.274, presentada el 5 de febrero de 2003. Campo de la Invención
La presente invención se refiere, en general, a amplificación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de nucleótidos marcados en el fosfato terminal en la amplificación de ácidos nucleicos. Antecedentes de la Invención
Se conocen procedimientos para detectar ácidos nucleicos específicos o analitos en una muestra con gran especificidad y sensibilidad. Dichos procedimientos requieren generalmente amplificar primero la secuencia de ácidos nucleicos basándose en la presencia de una secuencia diana específica o analito. Después de la amplificación, se detectan y cuantifican las secuencias amplificadas. Los sistemas de detección convencionales para ácidos nucleicos incluyen detección de
Los nucleótidos marcados en el fosfato terminal proporcionan los beneficios anteriores. Por ejemplo, la incorporación de nucleótidos gamma- o delta- marcados en ADN o ARN por polimerasas de ácido nucleico da como resultado la producción de ADN o ARN no modificado y al mismo tiempo el pirofosfato marcado generado puede usarse para detectar, caracterizar y/o cuantificar la diana. Si estos pudieran usarse en reacciones de amplificación no sólo proporcionarían herramientas útiles para la detección y cuantificación de secuencia diana, sino que el producto amplificado, que es una copia exacta de la secuencia diana sin modificaciones, podría usarse en otros estudios.
La amplificación de ADN mediante varios procedimientos de amplificación se realiza a altas temperaturas. Por ejemplo, en PCR, ciclos repetidos de desnaturalización a 95ºC, hibridación alrededor de 60ºC y extensión alrededor de 70ºC provocan una degradación significativa de los dNTP. Esto puede afectar significativamente al rendimiento del producto en ciclos posteriores. Otros procedimientos de amplificación tales como RCA y NASBA, aunque son isotermos, también se realizan a temperaturas superiores. En el caso de NASBA, que se realiza a 41ºC, la estabilidad de los nucleótidos puede no ser muy crítica, sin embargo en RCA, que puede realizarse a una temperatura superior dependiendo de la polimerasa usada y de la complejidad de la secuencia a amplificar, la estabilidad de los nucleótidos puede ser una cuestión en estas condiciones. Si se produjera la degradación de los nucleótidos marcados en el fosfato terminal, la cantidad de fondo generado abrumaría cualquiera señal directamente relacionada con el proceso de amplificación. Por lo tanto, es deseable tener nucleótidos que puedan sobrevivir a esta ciclación repetida de temperatura o al calentamiento prolongado a una temperatura muy elevada constante y, por lo tanto, continúan proporcionando altos rendimientos de producto y un bajo fondo incluso en los últimos ciclos de amplificación y posiblemente acorten el número de ciclos/tiempo requerido para conseguir la amplificación deseable. Además, los nucleótidos marcados en el gamma-fosfato son sustratos extremadamente pobres para la polimerasa en las condiciones usadas normalmente para la síntesis de y amplificación de ácidos nucleicos. La síntesis de grandes tramos de ácidos nucleicos (longitudes de varios centenares a varios millares de bases) requeriría horas si no días por ciclo. Harding y col. (documento WO 0244425 A2) describen el uso de aminonaftalenosulfonato-gamma-amido-dATP para la síntesis de ADN a alta temperatura. Sin embargo, de acuerdo con los inventores, en este caso la síntesis sólo se desarrolla después de que el aminonaftalenosulfonato retire por hidrolización el nucleótido y es dATP el que se usa por la polimerasa para formar ADN. Por supuesto, esto es útil para la detección o cuantificación de secuencia diana ya que el tinte generado es independiente de la síntesis de ADN.
Se han desarrollado varios ensayos en tiempo real para la cuantificación de ADN. La mayoría de éstos pueden clasificarse en dos categorías. La primera categoría que es relativamente fácil de usar implica el uso de tintes de intercalación, que tienen una fluorescencia mejorada después de la intercalación. Varios colorantes de ácido nucleico tales como bromuro de etidio, tintes SYBR Green®, PicoGreen®, YOYO®, TOTO® o análogos se han desarrollado como intercaladores para ensayos en tiempo real. Éstos, sin embargo, generan una señal de fondo significativa debido parcialmente a la intercalación entre dímeros cebadores y parcialmente debido a que son fluorescentes, aunque débilmente, incluso cuando no están intercalados.
La otra categoría de ensayo en tiempo real se basa en el uso de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia entre un tinte y un inactivador. Varios de estos ensayos se han desarrollado usando sondas FRET y/o cebadores, tales como Taqman, MGB Eclipse™, cebadores Scorpion, balizas moleculares, cebadores sunrise, por nombrar algunos. Estas sondas/cebadores se inactivan por transferencia de energía hasta que se produce la amplificación y el inactivador se separa físicamente del tinte o se escinde. La sensibilidad de estos ensayos depende en gran medida del diseño de la sonda y requiere mucha optimización. Además, incluso con la sonda mejor optimizada, no se consigue una inactivación completa. Así que estos ensayos sólo pueden proporcionar una mejora de unas pocas veces en la señal después de la amplificación y en los ciclos iniciales la señal de fondo es mucho mayor que la señal verdadera.
Sería beneficioso, por lo tanto, desarrollar procedimientos de amplificación que usen polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal en los que la amplificación pueda realizarse en un tiempo razonable (similar a dNTP no modificados) y la cantidad de marcador generado sea proporcional al producto formado. También es deseable tener un ensayo en tiempo real, en el que la cantidad de marcador generada pueda detectarse independientemente sin interferencia de la señal del nucleótido marcado en el fosfato terminal. Sería deseable tener un ensayo en tiempo real en el que el marcador sea completamente oscuro hasta que se desarrolle una amplificación.
La presente invención proporciona procedimientos de uso de nucleótidos marcados en el fosfato terminal (también denominados polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal) en la amplificación de ácidos nucleicos. También se proporcionan procedimientos para la detección y cuantificación de una secuencia diana por amplificación selectiva. También se proporcionan procedimientos para la detección y cuantificación en tiempo real de una secuencia diana durante la amplificación. Todas las reacciones de amplificación que incluyen un nucleótido marcado en el fosfato terminal, también incluyen un estabilizador seleccionado entre sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico y tungstato sódico.
La presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que incluye las etapas de: a) realizar una amplificación de ácido nucleico que incluye la reacción de un nucleótido marcado en el fosfato terminal, dando como resultado de reacción la producción de polifosfato marcado; b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de la especie detectable. Una definición de fosfatasa en la presente invención incluye cualquier enzima que escinda monoésteres de fosfato, tioéster de fosfato, fosforamidato, polifosfatos y nucleótidos para liberar fosfato inorgánico. En el contexto de la presente invención, esta enzima no escinde un fosfato de nucleósido marcado terminalmente (es decir, el nucleótido marcado en el fosfato terminal es sustancialmente no reactivo a fosfatasa). La definición de fosfatasa proporcionada en el presente documento incluye específicamente, pero sin limitación, fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) y fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2). La definición de un nucleótido en la presente invención incluye un fosfato de nucleósido natural o modificado.
La presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que incluye las etapas de: a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso, en la que la reacción incluye la reacción de un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de la especie detectable.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ADN que incluye las etapas de: a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de la especie detectable.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ADN que incluye las etapas de: a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de un nucleótido marcado en el fosfato terminal y una sal de manganeso, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de la especie detectable.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ADN que incluye las etapas de: a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de a nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; b) detectar la presencia del polifosfato marcado.
También se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal que tiene cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; y (b) detectar el polifosfato marcado.
También se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso y al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; y (b) detectar el polifosfato marcado.
También se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso y al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal tiene cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; y (b) detectar el polifosfato marcado.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal que tiene cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y (c) detectar la presencia de la especie detectable.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para cuantificar un ácido nucleico que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, en la que la reacción incluye a nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado;
- (b)
- permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en una cantidad sustancialmente proporcional a la cantidad de ácido nucleico; (c) medir la especie detectable; y (d) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad de ácido nucleico.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso y al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal que tiene cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que la reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado;
- (b)
- permitir que el fosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y (c) detectar la presencia de la especie detectable.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para cuantificar un ácido nucleico que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso, en la que la reacción incluye a nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en una cantidad sustancialmente proporcional a la cantidad de ácido nucleico; (c) medir la especie detectable; y
- (d)
- comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad de ácido nucleico.
La invención también se refiere a un procedimiento para cuantificar una secuencia de ADN que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de ADN polimerasa en presencia de una sal de manganeso y un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en cantidades sustancialmente proporcionales a la cantidad de la secuencia de ADN; (c) medir la especie detectable; y (d) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad de ADN.
La invención también se refiere a un procedimiento para cuantificar una secuencia de ADN que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de una sal de manganeso y un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado en cantidades sustancialmente proporcionales a la cantidad de la secuencia de ADN; (b) medir el polifosfato marcado; y (c) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad de ADN.
Otro aspecto de la descripción se refiere a un procedimiento para determinar la identidad de un solo nucleótido en una secuencia de ácido nucleico, que incluye las etapas de:
- (a)
- realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal, un cebador específico de alelo, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable;
- (c)
- detectar la presencia de la especie detectable; y (d) identificar el nucleósido incorporado. Otro aspecto de la descripción se refiere a un procedimiento para determinar la
identidad de un solo nucleótido en una secuencia de ácido nucleico, que incluye las etapas de:
(a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal, un cebador específico de alelo, y una sal de manganeso, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; (c) detectar la presencia de la especie detectable; y (d) identificar el nucleósido incorporado. También se proporciona un procedimiento para determinar la identidad de un solo
nucleótido en una secuencia de ácido nucleico que incluye las siguientes etapas: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal que tiene cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; (c) detectar la presencia de dicha especie detectable; y (d) identificar el nucleósido incorporado.
También se proporciona un procedimiento para determinar la identidad de un solo nucleótido en una secuencia de ácido nucleico que incluye las siguientes etapas: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso y al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal que tiene cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; (c) detectar la presencia de dicha especie detectable; y (d) identificar el nucleósido incorporado.
La presente invención proporciona un procedimiento para amplificar una secuencia de ácido nucleico en presencia de un estabilizador de polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal tal como poliol (glicerol, treitol, etc.), un poliéter incluyendo poliéteres cíclicos, polietilenglicol, sales orgánicas o inorgánicas, tales como sulfato de amonio, sulfato sódico, molibdato sódico, tungstato sódico, sulfonato orgánico, etc., junto con un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal en presencia de una sal de metal, tales como sales de manganeso, magnesio, cinc, calcio o cobalto, para disminuir la generación de señal de fondo en un ensayo enzimático.
La presente descripción también incluye un kit de detección de ácidos nucleicos en el que el kit incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural
o modificado; P-L es un marcador fosforilado y puede contener un engarce entre P y L; y
(b) al menos una polimerasa de ácido nucleico.
La presente descripción también incluye un kit de cuantificación de ácidos nucleicos en el que el kit incluye:
- (a)
- al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal de acuerdo con la siguiente Fórmula:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado y puede contener un engarce entre P y L; y
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico.
La presente descripción también incluye un kit de detección o cuantificación de ácidos nucleicos en el que el kit incluye:
(a) al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal de acuerdo con la siguiente Fórmula:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado que preferentemente se vuelve detectable independientemente cuando se elimina el fosfato;
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico;
- (c)
- una fosfatasa;
- (d)
- un estabilizador; y
- (e)
- un tampón de reacción que contiene una sal de manganeso.
La presente descripción también incluye un kit de detección o cuantificación de ácidos nucleicos en el que el kit incluye:
- (a)
- al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal de acuerdo con la siguiente Fórmula:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado que preferentemente se vuelve detectable independientemente cuando se elimina el fosfato;
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico; y
- (c)
- fosfatasa.
Breve Descripción de las Figuras
La Figura 1 es un gel que muestra amplificación por PCR de una secuencia diana usando un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal con diferente polimerasa. La Figura 2 muestra la amplificación por PCR de ADN de pUCp53 usando polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal con diferentes marcadores o bases. La Figura 3 muestra la amplificación por PCR de ADN de pUC18 usando polifosfatos de
nucleósidos marcados en el fosfato terminal con diferentes marcadores o bases. La Figura 4 muestra la estabilización de dT4P-DDAO con sulfato de amonio. La Figura 5 muestra la estabilización de dT4P-DDAO con una diversidad de sales
orgánicas e inorgánicas. La Figura 6 muestra la amplificación por PCR con polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal en presencia de estabilizadores. La Figura 7 muestra los resultados de PCR cuantitativa con polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal en un instrumento ABI 7900. La Figura 8 muestra el producto de PCR producido durante la PCR cuantitativa usando polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal. La Figura 9 muestra la amplificación lineal de ADN cromosómico usando polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal y ADN polimerasa de Phi29. La Figura 10 muestra que la cantidad de producto producido en la fase inicial de amplificación es directamente proporcional a la cantidad de ADN de entrada.
Descripción Detallada de la Realización Preferida
El término "nucleósido", como se define en el presente documento, es un compuesto que incluye una purina deazapurina, pirimidina o base modificada unida a un azúcar o a un derivado de azúcar.
El término "nucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a un éster fosfato de un nucleósido, en el que el sitio de esterificación corresponde típicamente al grupo hidroxilo unido a la posición C-5 del azúcar pentosa.
El término "oligonucleótido" incluye oligómeros lineales de nucleótidos o derivados de los mismos, incluyendo desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos y similares. A lo largo de la memoria descriptiva, cuando se representa un oligonucleótido mediante una secuencia de letras, los nucleótidos están en el orden 5' → 3' de izquierda a derecha, donde A representa desoxiadenosina, C representa desoxicitidina, G representa desoxiguanosina y T representa timidina, a menos que se indique otra cosa.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido lineal que hibrida de una forma específica con una única secuencia de ácido nucleico y permite la amplificación de esa única secuencia.
La expresión "secuencia diana de ácidos nucleicos" y similares se refiere a un ácido nucleico cuya identidad de secuencia u ordenación o localización de nucleósidos está determinada por uno o más de los procedimientos de la presente invención.
La presente invención se refiere a procedimientos de detección de un polinucleótido en una muestra en los que se usa un ensayo para monitorizar la síntesis de ARN o ADN a través de la actividad de la polimerasa de ácido nucleico. Las polimerasas de ARN y ADN sintetizan oligonucleótidos por transferencia de un nucleósido monofosfato de un nucleósido trifosfato (NTP) o desoxinucleósido trifosfato (dNTP) al hidroxilo 3' de una cadena de oligonucleótidos creciente. La fuerza que conduce esta reacción es la escisión de un enlace anhídrido y la formación concomitante de un pirofosfato inorgánico. La presente invención utiliza el descubrimiento de que la modificación estructural del fosfato terminal del nucleótido no suprime su capacidad de funcionar en la reacción de polimerasa. La reacción de síntesis de oligonucleótidos implica cambios directos sólo en los grupos - y -fosforilo del nucleótido, permitiendo que los nucleótidos con modificaciones en la posición terminal fosfato sean valiosos como sustratos para reacciones de polimerasa de ácidos nucleicos.
En ciertas realizaciones, la polimerasa es una ADN polimerasa, tal como una ADN polimerasa I, II o III o ADN polimerasa , , o desoxinucleotidil transferasa terminal o telomerasa. En otras realizaciones, las polimerasas adecuadas incluyen, pero sin limitación, una polimerasa de ARN dependiente de ADN, una primasa o una ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa).
Los procedimientos proporcionados por la presente invención utilizan un polifosfato de nucleósido, tal como un polifosfato de nucleósido, polifosfato de desoxinucleósido, con un
marcador electroquímico, marca de masa, o un tinte colorimétrico, marcador quimioluminiscente o fluorescente unido al fosfato terminal. Cuando una polimerasa de ácido nucleico usa este análogo como un sustrato, estará presente un marcador en el subproducto de polifosfato inorgánico de transferencia de fosforilo. Este marcador puede leerse 5 directamente o, en los casos preferibles, el marcador se activa mediante enzimas y puede leerse después de eliminar los fosfatos. En el último caso, la escisión del producto polifosfato de transferencia de fosforilo mediante fosfatasa conduce a un cambio detectable en el marcador unido al mismo. Debe apreciarse que aunque las polimerasas de ARN y ADN son capaces de reconocer nucleótidos con grupos fosforilo terminales modificados, los inventores 10 han determinado que este material de partida no es una plantilla para fosfatasas. El siguiente esquema muestra algunas moléculas pertinentes en los procedimientos de la presente invención; concretamente, el nucleótido marcado en el fosfato terminal, el subproducto de
15 En el esquema anterior, n es 1 o más, R1 es OH y R2 es H o OH; B es una base de nucleósido o base heterocíclica modificada; X es O, S, CH2 o NH; Y es O, S o BH3; y L es un marcador activable por fosfatasa que puede ser una molécula cromogénica, fluorogénica o quimioluminiscente, marca de masa o marca electroquímica. Una marca de masa es un resto de bajo peso molecular adecuado para espectrometría de masas que es fácilmente distinguible
20 de otros componentes gracias a una diferencia en la masa. Una marca electroquímica es una especie fácilmente oxidable o reducible. Se ha descubierto que cuando n es 2 o más, los nucleótidos son sustratos significativamente mejores para polimerasas que cuando n es 1. Por lo tanto, en realizaciones preferidas, n es 2, 3 ó 4; X e Y son O; B es una base de nucleósido y L es un marcador que puede ser una molécula cromogénica, fluorogénica o
25 quimioluminiscente. En una realización del procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos proporcionada en el presente documento, las etapas incluyen (a) realizar una
reacción de amplificación de ácido nucleico en la que la reacción incluye al menos un nucleótido que es sustancialmente no reactivo a fosfatasa además de un nucleótido marcado en el fosfato terminal en el que la reacción de la polimerasa da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa adecuada para hidrolizar el éster fosfato y producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de una especie detectable por medios adecuados. En esta realización, la plantilla usada para la reacción de polimerasa de ácidos nucleicos puede ser una plantilla heteropolimérica u homopolimérica. Por nucleótido marcado en el fosfato terminal se entiende, a lo largo de la memoria descriptiva, que el polifosfato marcado que se libera de forma concomitante después de la incorporación del monofosfato de nucleósido en la cadena de nucleótidos creciente, puede leerse directamente o, si existe un marcador activable por enzimas, puede hacerse reaccionar con una fosfatasa para producir una especie detectable. Otros nucleótidos incluidos en la reacción que son sustancialmente no reactivos a fosfatasa también pueden, por ejemplo, bloquearse en el fosfato terminal por un resto que no conduce a la producción de una especie detectable por el procedimiento usado para la detección de la especie detectable producida a partir del nucleótido marcado. El ácido nucleico para la detección en esta realización particular puede incluir ARN, un oligonucleótido natural o sintético, ADN mitocondrial o cromosómico.
En una realización del procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos proporcionado en el presente documento, las etapas incluyen (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de Mn en la que la reacción incluye al menos un nucleótido que es sustancialmente no reactivo a fosfatasa además de un nucleótido marcado en el fosfato terminal en el que la reacción de polimerasa da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa adecuada para hidrolizar el éster fosfato y producir una especie detectable; y c) detectar la presencia de una especie detectable por medios adecuados.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ADN que incluye las etapas de (a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que dicha reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; (b) permitir que el fosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y (c) detectar la presencia de dicha especie detectable. La secuencia de ADN para la detección puede incluir ADN aislado de células, ADN tratado químicamente tal como ADN metilado tratado con bisulfito o ADN sintetizado química o enzimáticamente de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen PCR y los descritos en DNA Structure Part A: Synthesis and Physical analysis of DNA, Lilley, D.M.J. y Dahlberg, J.E. (Eds.), Methods Enzymol., 211, Academic Press, Inc., Nueva York (1992).
La secuencia de ADN puede incluir adicionalmente ADN cromosómico y oligonucleótidos naturales o sintéticos. El ADN puede ser mono- o bicatenario.
La invención también proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ADN que incluye las etapas de (a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de una sal de Mn y un nucleótido marcado en el fosfato terminal, donde dicha reacción da como resultado la producción de un polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie detectable; y (c) detectar la presencia de dicha especie detectable.
Los procedimientos de la invención pueden incluir adicionalmente la etapa de incluir uno
o más reactivos de detección adicionales en la reacción de polimerasa. El reactivo de detección adicional puede ser capaz de una respuesta que es detectablemente diferente de la especie detectable. Por ejemplo, el reactivo de detección adicional puede ser un anticuerpo.
Los nucleótidos adecuados para su adición como sustratos en la reacción de polimerasa incluyen polifosfatos de nucleósidos, incluyendo, pero sin limitación, polifosfatos de desoxirribonucleósido, polifosfatos de ribonucleósido y análogos de los mismos. Son particularmente deseables nucleótidos que contienen 3, 4 ó 5 grupos fosfato en la cadena polifosfato, en la que el fosfato terminal está marcado.
Debe apreciarse que está dentro de la contemplación de la presente invención que el subproducto de polifosfato marcado de transferencia de fosforilo puede detectarse sin el uso de tratamiento con fosfatasa. Por ejemplo, se sabe que las bases de nucleósidos naturales o modificadas, particularmente guanina, pueden provocar la inactivación de marcadores fluorescentes. Por lo tanto, en un nucleótido marcado en el fosfato terminal, el marcador puede estar parcialmente inactivado por la base. Después de la incorporación del monofosfato de nucleósido, el marcador del subproducto de polifosfato puede detectarse debido a su fluorescencia potenciada. Como alternativa, es posible separar físicamente el producto de polifosfato marcado por procedimientos de separación cromatográficos o de otro tipo antes de la identificación por fluorescencia, color, quimioluminiscencia o detección electroquímica. Además, podría usarse espectrometría de masas para detectar los productos por diferencia de masas.
Los procedimientos de la presente invención pueden incluir realizar la reacción de polimerasa en presencia de al menos uno de ADN o ARN polimerasa. Las polimerasas de ácido nucleico adecuadas también pueden incluir primasas, telomerasas, desoxinucleotidil transferasas terminales y transcriptasas inversas. Puede requerirse una plantilla de ácido nucleico para que tenga lugar la reacción de polimerasa y puede añadirse a la solución de reacción de polimerasa. Se anticipa que todas las etapas (a), (b) y (c) en los procedimientos de detección de la presente invención podrían realizarse de forma concurrente usando una sola mezcla de reacción homogénea, así como realizarse secuencialmente.
Los ejemplos de procedimientos de amplificación útiles en la presente invención incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento de hebras (SDA) y amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). Para, por ejemplo, cuando la molécula diana es una polímero de ácido nucleico tal como ADN, puede detectarse por incorporación por PCR de una base de nucleótido marcada en el gamma-fosfato tal como adenina, timina, citosina, guanina u otras bases heterocíclicas de nitrógeno en la molécula de ADN. El procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se describe por Saiki y col en Science Vol. 239, página 487, 1988, Mullis y col en la Patente de Estados Unidos 4.683.195 y por Sambrook, J. y col. (Eds.), Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1980), Ausubel, F. M. y col. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Inc., NY (1999) y Wu, R. (Ed.), Recombinant DNA Methodology II, Methods en Zumulogy, Academic Press, Inc., NY, (1995). Usando PCR, el ácido nucleico diana para la detección tal como ADN se amplifica poniéndolo directamente en un recipiente de reacción que contiene los reactivos de PCR y cebadores apropiados. Típicamente, se selecciona un cebador que es complementario en secuencia a al menos una porción del ácido nucleico diana.
Debe apreciarse que las reacciones de amplificación de ácido nucleico adecuadas para realizar la etapa (a) de los procedimientos de la presente invención pueden incluir adicionalmente varios procedimientos de amplificación por RCA de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, son útiles los desvelados en la Patente de Estados Unidos 5.854.033 para Lizardi, Paul M. Las reacciones de polimerasa pueden incluir adicionalmente la amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA) en la que el sistema implica la amplificación de ARN, no de ADN, y la amplificación es isotérmica, teniendo lugar a una temperatura (41ºC). La amplificación del ARN diana por NASBA implica las actividades coordinadas de tres enzimas: transcriptasa inversa, RNAsa H y ARN polimerasa T7 junto con cebadores oligonucleotídicos dirigidos hacia la muestra de ARN diana. Estas enzimas catalizan la amplificación exponencial de un ARN monocatenario diana en cuatro etapas: extensión, degradación, síntesis de ADN y amplificación de ARN cíclica.
Los procedimientos de RT-PCR, RCA, y NASBA generalmente requieren que la cantidad original de ácido nucleico diana se mida de forma indirecta por cuantificación de los productos de amplificación. Los productos de amplificación típicamente se separan primero de los materiales de partida por electroforesis en un gel de agarosa para confirmar una amplificación satisfactoria y después se cuantifican usando cualquiera de los sistemas de detección convencionales para un ácido nucleico, tales como detección de marcadores fluorescentes, sistemas de detección ligados a enzimas, detección de marcadores mediada por anticuerpos y detección de marcadores radiactivos. Por el contrario, el presente procedimiento elimina la necesidad de separar los productos de la reacción de polimerasa de los materiales de partida antes de que puedan detectarse estos productos. Por ejemplo, en la presente invención, una molécula informadora (fluorescente, quimioluminiscente o un cromóforo) u otra molécula útil se adhiere al nucleótido de tal forma que es indetectable en ciertas condiciones cuando se enmascara por la unión de fosfato. Sin embargo, después de la incorporación del nucleótido a la cadena de oligonucleótidos creciente y del tratamiento con fosfatasa de la reacción, el marcador es detectable en esas condiciones. Por ejemplo, si el grupo hidroxilo en el lateral de la estructura de triple anillo de 1,3-dicloro-9,9-dimetil-acridina-2-ona (DDAO) está unido a la posición del fosfato terminal del nucleótido, la DDAO no es fluorescente a 659 nm. Cuando se incorpora el monofosfato de nucleósido en el ADN, el otro producto, polifosfato de DDAO (que tampoco es fluorescente a 659 nm) es un sustrato para la fosfatasa. Cuando se desfosforila para formar DDAO, el resto de tinte se volverá fluorescente a 659 nm y, por lo tanto, detectable. El análisis específico del producto de polifosfato puede realizarse en la solución de reacción de polimerasa, eliminando la necesidad de separar los productos de reacción de los materiales de partida. Este esquema permite la detección y, opcionalmente, cuantificación de ácidos nucleicos formados durante las reacciones de polimerasa usando instrumentación rutinaria tal como espectrofotómetros.
En los procedimientos descritos anteriormente, la etapa de reacción de amplificación puede incluir adicionalmente realizar la reacción de polimerasa en presencia de una fosfatasa, que convierte el subproducto de polifosfato marcado en el marcador detectable. Como tal, se establece un ensayo conveniente para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos que permite monitorizar de forma continua la formación de especies detectables. Esto representa un formato de ensayo homogéneo en tanto que puede realizarse en un solo tubo.
Un formato de los procedimientos de ensayo descritos anteriormente puede incluir, pero sin limitación, realizar la reacción de amplificación en presencia de un solo tipo de nucleótido marcado en el fosfato terminal capaz de producir una especie detectable. Por ejemplo, podría usarse un ATP marcado con tinte mientras que los tres nucleótidos restantes tienen un resto que no es un tinte; dicho resto hace a estos nucleótidos no reactivos a fosfatasa. En este ejemplo, dichos restos no son detectables en las condiciones usadas para detectar dicho tinte.
En otro formato de ensayo, la reacción de amplificación puede realizarse en presencia de más de un tipo de nucleótido marcado en el fosfato terminal, siendo cada tipo capaz de producir una especie detectable inequívocamente. Por ejemplo, el ensayo puede incluir un primer nucleótido (por ejemplo, adenosín polifosfato) que se asocia con un primer marcador que, cuando se libera enzimáticamente del subproducto de polifosfato inorgánico de transferencia de fosforilo, emite luz a una primera longitud de onda y un segundo nucleótido (por ejemplo, polifosfato guanosina) asociado con un segundo marcador que emite luz a una segunda longitud de onda. De forma deseable, la primera y segunda emisiones de longitud de onda tienen sustancialmente poco o ningún solapamiento. Está dentro de la contemplación de la presente invención que múltiples ensayos simultáneos basados en la información de secuencias de nucleótidos puedan, después de ello, derivarse basándose en el marcador particular liberado del polifosfato.
En un aspecto de los procedimientos para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos descritos anteriormente, el nucleótido marcado en el fosfato terminal puede representarse por la siguiente estructura:
en la que P = fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado que preferentemente se vuelve detectable independientemente cuando se elimina el fosfato.
En otro aspecto, L también puede contener un grupo haloalquilo adecuado para formar fosfonato de alquilo. En este aspecto, el fosfato marcado o polifosfato marcado es la especie detectable.
En ciertas realizaciones, el resto azúcar en la Fórmula I puede seleccionarse entre los siguientes: ribosilo, 2'-desoxirribosilo, 2'-alcoxirribosilo, 2'-aminorribosilo, 2'-fluororribosilo y otros azúcares modificados con la condición de que dicha modificación no evite el alargamiento adicional de la cadena de ácido nucleico. Por ejemplo, la posición 3' del azúcar debería tener un grupo hidroxilo de manera que el monofosfato de nucleósido entrante pueda unirse a esta posición.
Además, en la Fórmula I, la base puede incluir uracilo, timina, citosina, 5-metilcitosina,
guanina, 7-deazaguanina, hipoxantina, 7-deazahipoxantina, adenina, 7-deazaadenina, 2,6diaminopurina o análogos de las mismas. El marcador unido a la posición del fosfato terminal en el nucleótido marcado en el fosfato terminal puede seleccionarse entre el grupo que consiste en compuestos
5 quimioluminiscentes de 1,2-dioxetano, tintes fluorogénicos, tintes cromogénicos, marcas de masa y marcas electroquímicas. Esto debería permitir que la especie detectable pueda detectarse por la presencia de uno cualquiera de color, emisión de fluorescencia, quimioluminiscencia, cambio de masa, detección electroquímica o una combinación de las mismas.
10 Además, los tintes de transferencia de energía fabricados por conjugación de un tinte donador y un tinte aceptor también son útiles en la presente invención. Los ejemplos de marcadores que pueden unirse al grupo fosfato terminal directamente
o a través de engarces se dan en las Tablas 1-2 a continuación. Algunos ejemplos de polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal se muestran en la Tabla 3.
15
- Tabla 1: Ejemplos de restos marcadores detectables que se vuelven detectables independientemente después de la eliminación de restos fosfato
- 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetil-7-hidroxiacridin-2-ona)
- 9H-(9,9-dimetil-7-hidroxiacridin-2-ona)
- 9H-(1,3-dibromo-9,9-dimetil-7-hidroxiacridin-2-ona)
- Resorrufina
- Umbeliferona (7-hidroxicoumarina)
- 4-Metilumbeliferona
- 4-Trifluorometilumbeliferona
- 3-Cianoumbeliferona
- 3-Fenilumbeliferona
- 3,4-Dimetilumbeliferona
- 3-Acetilumbeliferona
- 6-Metoxiumbeliferona
- SNAFL™
- Fluorescein-alquil éter
- Naftofluoresceína
- Naftofluorescein alquil éter
- SNARF™
- Rhodol green™
(cont)
- Tabla 1: Ejemplos de restos marcadores detectables que se vuelven detectables independientemente después de la eliminación de restos fosfato
- meso-Hidroximonocarbocianina
- meso-Hidroxitricarbocianina
- meso-Hidroxidicarbocianina
- bis-(ácido 1,3-dibutilbarbitúrico)pentametina
- Oxonol
- Sal 1-etil-2-(naftil-1-vinileno)-3,3-dimetil-4-(3H)-6-indolinio
- 2-Hidroxi-5'-cloro-fenil-cloro-quinazolona
- Trifluoroacetil-R110
- Acetil-R110
- 8-Hidroxi-2H-dibenz(b,f)azepin-2-ona
- 8-hidroxi-11,11-dimetil-11H-dibenz(b,e)(1,4)oxazepin-2-ona
- Hidroxipireno
- 2-hidroxi-11,11-dimetil-11H-dibenz(b,e)(1,4)oxazepin-8-ona
- Tabla 2: Ejemplos de restos detectables que son detectables incluso cuando están unidos a un polifosfato de nucleósidos
- Rhodamine green ácido carboxílico
- Carboxi-fluoresceína
- Pireno
- Dansilo
- Bodipy
- Ácido dimetilamino-coumarin carboxílico
- Eosin-5-isotiocianato
- Ácido metoxicoumarin carboxílico
- Texas Red
- Oregon Green™ 488 ácido carboxílico
- ROX
- TAMRA
- Antracen-isotiocianato
- Cy3
- Cy3.5
- Cy5
- Cy5.5
- Cy7
- Cy7.5
- Ácido anilinonaftalen-sulfónico
- Tabla 3: Ejemplos de Polifosfatos de Nucleósidos Marcados
- Adenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o A3P-DDAO
- Guanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o G3P-DDAO
- Citidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o C3P-DDAO
- Timidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o T3P-DDAO
- Uridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o U3P-DDAO
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o dA3P-DDAO
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacidin-2-ona)))trifosfato o dG3P-DDAO
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o dC3P-DDAO
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o dT3P-DDAO
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))trifosfato o dU3P-DDAO
- Adenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o A4P-DDAO
- Guanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o G4P-DDAO
- Citidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o C4P-DDAO
- Timidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o T4P-DDAO
- Uridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o U4P-DDAO
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o dA4P-DDAO
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o dG4P-DDAO
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o dC4P-DDAO
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o dT4P-DDAO
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))tetrafosfato o dU4P-DDAO
- Adenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o A5P-DDAO
- Guanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o G5P-DDAO
- Citidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o C5P-DDAO
- Timidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o T5P-DDAO
- Uridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o U5P-DDAO
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o dA5PDDAO
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o dG5PDDAO
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o dC5P-DDAO
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o dTSP-DDAO
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))pentafosfato o dU5P-DDAO
- Adenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o A6P-DDAO
(cont) (cont) (cont) (cont) (cont)
- Guanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o G6P-DDAO
- Citidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o C6P-DDAO
- Timidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o T6P-DDAO
- Uridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o U6P-DDAO
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o dA6P-DDAO
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o dG6P-DDAO
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o dC6P-DDAO
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o dT6P-DDAO
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona)))hexafosfato o dU6P-DDAO
- Adenosin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o A3P-Umb
- Guanosin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o G3P-Umb
- Citidin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o C3P-Umb
- Timidin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o T3P-Umb
- Uridin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o U3P-Umb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o dA3P-Umb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o dG3P-Umb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o dC3P-Umb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o dT3P-Umb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-umbeliferona)trifosfato o dU3P-Umb
- Adenosin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o A4P-Umb
- Guanosin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o G4P-Umb
- Citidin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o C4P-Umb
- Timidin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o T4P-Umb
- Uridin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o U4P-Umb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o dA4P-Umb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o dG4P-Umb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o dC4P-Umb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o dT4P-Umb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-umbeliferona)tetrafosfato o dU4P-Umb
- Adenosin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o A5P-Umb
- Guanosin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o G5P-Umb
- Citidin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o C5P-Umb
- Timidin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o T5P-Umb
- Uridin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o U5P-Umb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o dA5P-Umb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o dG5P-Umb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o dC5P-Umb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o dT5P-Umb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-umbeliferona)pentafosfato o dU5P-Umb
- Adenosin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o A6P-Umb
- Guanosin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o G6P-Umb
- Citidin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o C6P-Umb
- Timidin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o T6P-Umb
- Uridin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o U6P-Umb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o dA6P-Umb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o dG6P-Umb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o dC6P-Umb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o dT6P-Umb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-umbeliferona)hexafosfato o dU6P-Umb
- Adenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o A3P-MeUmb
- Guanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))))trifosfato o G3P-MeUmb
- Citidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o C3P-MeUmb
- Timidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o T3P-MeUmb
- Uridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o U3P-MeUmb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o dA3P-MeUmb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o dG3P-MeUmb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o dC3P-MeUmb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o dT3P-MeUmb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))trifosfato o dU3P-MeUmb
- Adenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o A4P-MeUmb
- Guanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))))tetrafosfato o G4P-MeUmb
- Citidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o C4P-MeUmb
- Timidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o T4P-MeUmb
- Uridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o U4P-MeUmb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o dA4P-MeUmb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o dG4P-MeUmb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o dC4P-MeUmb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o dT4P-MeUmb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))tetrafosfato o dU4P-MeUmb
- Adenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o A5P-MeUmb
- Guanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o G5P-MeUmb
- Citidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o C5P-MeUmb
- Timidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o T5P-MeUmb
- Uridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o U5P-MeUmb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o dA5P-MeUmb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o dG5P-MeUmb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o dC5P-MeUmb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o dT5P-MeUmb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))pentafosfato o dU5P-MeUmb
- Adenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o A6P-MeUmb
- Guanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o G6P-MeUmb
- Citidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o C6P-MeUmb
- Timidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o T6P-MeUmb
- Uridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o U6P-MeUmb
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o dA6P-MeUmb
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o dG6P-MeUmb
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o dC6P-MeUmb
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o dT6P-MeUmb
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-(4-metilumbeliferona))hexafosfato o dU6P-MeUmb
- Adenosin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o A3P-RR
- Guanosin-5'-(-7-resorufin)))trifosfato o G3P-RR
- Citidin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o C3P-RR
- Timidin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o T3P-RR
- Uridin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o U3P-RR
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o dA3P-RR
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o dG3P-RR
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o dC3P-RR
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o dT3P-RR
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-resorufin)trifosfato o dU3P-RR
- Adenosin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o A4P-RR
- Guanosin-5'-(-7-resorufin)))tetrafosfato o G4P-RR
- Citidin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o C4P-RR
- Timidin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o T4P-RR
- Uridin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o U4P-RR
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o dA4P-RR
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o dG4P-RR
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o dC4P-RR
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o dT4P-RR
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-resorufin)tetrafosfato o dU4P-RR
- Adenosin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o A5P-RR
- Guanosin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o G5P-RR
- Citidin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o C5P-RR
- Timidin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o T5P-RR
- Uridin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o U5P-RR
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o dA5P-RR
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o dG5P-RR
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o dC5P-RR
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o dT5P-RR
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-resorufin)pentafosfato o dU5P-RR
- Adenosin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o A6P-RR
- Guanosin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o G6P-RR
- Citidin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o C6P-RR
- Timidin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o T6P-RR
- Uridin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o U6P-RR
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o dA6P-RR
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o dG6P-RR
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o dC6P-RR
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o dT6P-RR
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-7-resorufin)hexafosfato o dU6P-RR
- Adenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o A3P-FIEt
- Guanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein)trifosfato o G3P-FIEt
- Citidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o C3P-FIEt
- Timidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o T3P-FIEt
- Uridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o U3P-FIEt
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o dA3P-FIEt
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o dG3P-FIEt
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o dC3P-FIEt
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o dT3P-FIEt
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))trifosfato o dU3P-FIEt
- Adenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o A4P-FIEt
- Guanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o G4P-FIEt
- Citidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o C4P-FIEt
- Timidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o T4P-FIEt
- Uridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o U4P-FIEt
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o dA4P-FIEt
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o dG4P-FIEt
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o dC4P-FIEt
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-3'-(6'-etoxitluorescein))tetrafosfato o dT4P-FIEt
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))tetrafosfato o dU4P-FIEt
- Adenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o A5P-FIEt
- Guanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o G5P-FIEt
- Citidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o C5P-FIEt
- Timidin-5'-('-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o T5P-FIEt
- Uridin-5'-('-3-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o U5P-FIEt
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o dA5F-FIEt
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o dG5P-FIEt
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o dCSP-FIEt
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o dTSP-FIEt
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))pentafosfato o dUSP-FIEt
- Adenosin-5'-(-3'-(6'-etlioxifluorescein))hexafosfato o A6P-FIEt
- Guanosin-5'-(-3'-(6'-etoxitluorescein))hexafosfato o G6P-FIEt
- Citidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o C6P-FIEt
- Timidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o T6P-FIEt
- Uridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o U6P-FIEt
- 2'-Desoxiadenosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o dA6P-FIEt
- 2'-Desoxiguanosin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o dG6P-FIEt
- 2'-Desoxicitidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o dC6P-FIEt
- 2'-Desoxitimidin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o dT6P-FIEt
- 2'-Desoxiuridin-5'-(-3'-(6'-etoxifluorescein))hexafosfato o dU6P-FIEt
En las que el marcador fosforilado en la Fórmula I es un resto fluorogénico, se selecciona deseablemente entre uno de los siguientes (todos mostrados como el fosfomonoéster): 2-(5'-cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona, comercializada con el nombre comercial ELF 97 (Molecular Probes, Inc.), difosfato de fluoresceína (sal tetraamonio), 3'(6')-O-alquil-6'(3')-fosfato de fluoresceína, 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2on-7-il)fosfato (sal diamonio), fosfato de 4-metilumbeliferilo (ácido libre), fosfato de resorrufina, fosfato de 4-trifluorometilumbeliferilo, fosfato de umbeliferilo, fosfato de 3-cianoubeliferilo, fosfato de 9,9-dimetilacridin-2-on-7-ilo, fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo y derivados de
En las que el resto marcador en la Fórmula I anterior es un resto cromogénico, puede seleccionarse entre los siguientes: fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, fosfato de 3-indoxilo, fosfato de p-nitrofenilo y derivados de los mismos. Las estructuras de estos tintes cromogénicos se muestran en los siguientes fosfomonoésteres:
El resto de la posición del fosfato terminal puede ser adicionalmente un compuesto quimioluminiscente en el que se desea que sea un compuesto de 1,2-dioxetano activado por fosfatasa. El compuesto de 1,2-dioxetano puede incluir, pero sin limitación, fosfato de 2-cloro-5
5 (4-metoxiespiro[1,2-dioxetano-3,2'-(5-cloro)triciclo[3,3,1-13,7]-decan]-1-il)-1-fenilo disódico, comercializado con el nombre comercial CDP-Star (Tropix, Inc., Bedford, MA), dioxetano cloroadamant-2'-ilidenometoxifenoxi fosforilado, comercializado con el nombre comercial CSPD (Tropix) y 3-(2'-espiroadamantan)-4-metoxi-4-(3"-fosforiloxi)fenil-1,2-dioxetano, comercializado con el nombre comercial AMPPD (Tropix). Las estructuras de estos compuestos de dioxetano
10 disponibles en el mercado se desvelan en las Patentes de Estados Unidos 5.582.980,
5.112.960 y 4.978.614, respectivamente.
Los procedimientos descritos anteriormente pueden incluir adicionalmente la etapa de cuantificar la secuencia de ácidos nucleicos. En un aspecto relacionado, la especie detectable puede producirse en cantidades sustancialmente proporcionales a la cantidad de una
15 secuencia de ácidos nucleicos amplificada. La etapa de cuantificar la secuencia de ácidos nucleicos se desea realizar por comparación de espectros producidos por la especie detectable con espectros conocidos. La presente invención también proporciona un procedimiento para amplificar una secuencia de ácidos nucleicos en presencia de un estabilizador de polifosfato de nucleósidos
20 marcados en el fosfato terminal tal como poliol (glicerol, treitol, etc.), un poliéter incluyendo poliéteres cíclicos, polietilenglicol, sales orgánicas o inorgánicas, tales como sulfato de amonio, sulfato sódico, molibdato sódico, tungstato sódico, sulfonato orgánico, etc., junto con un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal en presencia de una sal de metal, tal como sal de manganeso, magnesio, cinc, calcio o cobalto, para disminuir la generación de señal de fondo en un ensayo enzimático. Se han usado en la técnica anterior aditivos tales como queladores débiles durante reacciones de polimerización de ácidos nucleicos en presencia de manganeso. Su propósito, sin embargo, era reducir el índice incorporación errónea de nucleótidos provocada por el manganeso. Como se muestra en la figura 6, incluso en ausencia de aditivos, no existe incorporación errónea de los nucleótidos marcados en el fosfato terminal por polimerasas. Por lo tanto, el propósito de añadir aditivos en la presente invención es solamente reducir la hidrólisis no enzimática de nucleótidos marcados en el fosfato terminal provocada por sales de metal, para reducir el fondo.
En una realización, la descripción proporciona un procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, incluyendo la reacción de amplificación la reacción de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en una cantidad sustancialmente proporcional a la cantidad del ácido nucleico a cuantificar; (c) medir la especie detectable; y (d) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad del ácido nucleico. En esta realización del procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico, el ácido nucleico a cuantificar puede ser ARN. El ácido nucleico puede ser adicionalmente un oligonucleótido natural o sintético, ADN cromosómico o ADN.
En otra realización, la descripción proporciona un procedimiento de cuantificación de un ácido nucleico que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico en presencia de una sal de manganeso, incluyendo la reacción de amplificación la reacción de al menos un nucleótido marcado en el fosfato terminal, en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en una cantidad sustancialmente proporcional a la cantidad del ácido nucleico a cuantificar; (c) medir la especie detectable; y (d) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad del ácido nucleico.
La descripción también proporciona un procedimiento para cuantificar una secuencia de ADN que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de un nucleótido marcado en el fosfato terminal en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en una cantidad sustancialmente proporcional a la cantidad de secuencia de ADN a cuantificar; (c) medir la especie detectable; y (d) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad de ADN. En esta realización, la secuencia de ADN para la cuantificación puede incluir oligonucleótidos naturales o sintéticos, o ADN aislado de células incluyendo ADN cromosómico.
La descripción también proporciona un procedimiento para cuantificar una secuencia de ADN que incluye las etapas de: (a) realizar una reacción de amplificación de ADN en presencia de una sal de manganeso y un nucleótido marcado en el fosfato terminal en la que la reacción da como resultado la producción de polifosfato marcado; (b) permitir que el polifosfato marcado reaccione con una fosfatasa para producir una especie de subproducto detectable en cantidades sustancialmente proporcionales a la cantidad de la secuencia de ADN a cuantificar;
(c) medir la especie detectable; y (d) comparar las mediciones usando patrones conocidos para determinar la cantidad de ADN.
En cada uno de estos procedimientos de cuantificación de una secuencia de ácidos nucleicos descrita anteriormente, la etapa de reacción de polimerasa puede incluir adicionalmente realizar la reacción de polimerasa en presencia de una fosfatasa. Como se ha descrito anteriormente en la memoria descriptiva, esto permitiría la monitorización en tiempo real de la actividad de polimerasa de ácido nucleico y, por lo tanto, la detección en tiempo real de una secuencia de ácidos nucleicos diana para su cuantificación.
El nucleótido marcado en el fosfato terminal útil para los procedimientos de cuantificación de la secuencia de ácidos nucleicos proporcionada en el presente documento puede repesentarse por la Fórmula I que se ha mostrado anteriormente. El marcador que puede activarse por enzimas se vuelve detectable a través de la actividad enzimática de la fosfatasa que cambia el engarce éster fosfato entre el marcador y el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado de tal forma que produce una especie detectable. La especie detectable puede detectarse por la presencia de uno cualquiera de una combinación de color, emisión de fluorescencia, quimioluminiscencia, diferencia de masa o potencial electroquímico. Como ya se ha descrito anteriormente, el marcador activable por enzimas puede ser un compuesto quimioluminiscente de 1,2-dioxetano, tinte fluorescente, tinte cromogénico, una marca de masa o una marca electroquímica o una combinación de los mismos. Los marcadores adecuados son los mismos que se han descrito anteriormente.
Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de detección de ácidos nucleicos que incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo 5 haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural
o modificado; P-L es un marcador fosforilado y puede contener un engarce entre P y L; y
(b) al menos una polimerasa de ácido nucleico.
10 Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de detección de ácidos nucleicos que incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
15 en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural
20 o modificado; P-L es un marcador fosforilado y puede contener un engarce entre P y L;
(b) al menos una polimerasa de ácido nucleico; y
(c) un tampón de reacción que contiene una sal de manganeso. Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de detección de ácidos nucleicos que incluye:
25 (a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de
oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural
o modificado; P-L es un marcador fosforilado y puede contener un engarce entre P y L;
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico;
- (c)
- un tampón de reacción que contiene una sal de manganeso; y
- (d)
- un estabilizador
Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de detección de ácidos nucleicos que incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado y puede contener un engarce entre P y L; y
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico.
- (c)
- una fosfatasa
Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de detección de ácidos nucleicos que incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I a continuación:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado que preferentemente se vuelve independientemente detectable cuando se elimina el fosfato;
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico termoestable;
- (c)
- una fosfatasa; y
- (d)
- tampón de reacción que contiene una sal de manganeso.
Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de detección de ácidos nucleicos que incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado que preferentemente se vuelve detectable independientemente cuando se elimina el fosfato;
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico termoestable;
- (c)
- una fosfatasa;
- (d)
- tampón de reacción que contiene una sal de manganeso; y
- (e)
- un estabilizador.
Otro aspecto de la descripción se refiere a un kit de cuantificación de ácidos nucleicos que incluye:
(a) al menos uno o más nucleótidos marcados en el fosfato terminal de acuerdo con la Fórmula I:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo, n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado que preferentemente se vuelve detectable independientemente cuando se elimina el fosfato;
- (b)
- al menos una polimerasa de ácido nucleico termoestable; y
- (c)
- fosfatasa.
El resto azúcar en el nucleótido marcado en el fosfato terminal incluido en el kit puede incluir, pero sin limitación, ribosilo, 2'-desoxirribosilo, 2'-alcoxirribosilo, 2'-aminorribosilo, 2'fluororribosilo y otros azúcares modificados.
La base puede ser, pero sin limitación uracilo, timina, citosina, 5-metilcitosina, guanina, 7-deazaguanina, hipoxantina, 7-deazahipoxantina, adenina, 7-deazaadenina y 2,6diaminopurina y análogos de las mismas.
Además, como se ha descrito anteriormente, el marcador activable por enzimas puede ser un compuesto quimioluminiscente de 1,2-dioxetano, tinte fluorescente, tinte cromogénico, una marca de masa, una marca electroquímica o una combinación de los mismos. Los compuestos adecuados para la conjugación en la posición del fosfato terminal del nucleótido son los mismos que se han descrito anteriormente. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones preferidas de la ilustración pero no pretenden ser ilustrativas de todas las realizaciones. Ejemplo 1 Preparación de -9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxitimidin-5'-tetrafosfato (dT4PDDAO) y compuestos relacionados.
Se evaporaron a sequedad 10 moles de sal TEA de TTP. Al residuo se le añadieron 40 moles de tributilamina y 5 ml de piridina seca. La solución se evaporó de nuevo a sequedad. Después de 2 coevaporaciones con 3 ml de dimetilformamida seca (DMF), el residuo se disolvió de nuevo en 200 gel de DMF seca, se lavó abundantemente con argón y se tapó. Usando una jeringa, se añadieron 50 moles (8 mg) de carbonildiimidazol (CDI) disueltos en 100 ml de DMF seca. El matraz se agitó durante 4 h a temperatura ambiente.
Mientras la reacción anterior estaba progresando, se disolvieron 35 mg (83 moles) de fosfato de DDAO y 166 moles de tributilamina en DMF seca. El fosfato de DDAO se evaporó a sequedad seguido de 3 coevaporaciones con DMF seca. El residuo se disolvió en 300 l de DMF seca.
Después del tiempo de reacción de 4 h, a la reacción de TTP-CDI se le añadieron 3,2 l de metanol anhidro. La reacción se agitó durante 30 minutos. A esta mezcla, se le añadió solución de fosfato de DDAO y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La reacción se comprobó por HPLC de fase inversa (columna Xterra de 4,6 x 100, TEAA 0,1 M/acetonitrilo). El volumen de reacción se redujo a 200 l por evaporación y la reacción se dejó progresar durante 80 h.
Después de 80 h, la reacción se interrumpió mediante la adición de 15 ml de TEAB 0,1
M. La mezcla diluida se aplicó a una columna Xterra RP de 19 x 100 y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo en TEAB 0,1 M. Las fracciones que contenían DDAO T4P puro se evaporaron a sequedad y se coevaporaron dos veces con etanol. El residuo se reconstituyó con agua MilliQ. Rendimiento: 1,10 mol, 11%; pureza de HPLC > 98% a 455 nm; EM: M-1 = 850,07 (calc. 849,95)
Se prepararon -9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxiguanosin-5'tetrafosfato (dG4P-DDAO), -9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxicitidin-5'tetrafosfato (dC4P-DDAO) y -9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxiadenosin-5'tetrafosfato (dA4P-DDAO) de una manera similar a la que se ha descrito anteriormente con la excepción de que se usaron 3,5 equivalentes de fosfato de DDAO en lugar de 8,3 equivalentes. Después de la purificación sobre C18, las muestras se purificaron en intercambio iónico usando una columna Mono Q 10/10.
-9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxiguanosin-5'-tetrafosfato (dG4PDDAO): Rendimiento: 0,57 mol, 5,7%; pureza de HPLC 99% a 455 nm; EM: M-1 = 875,03 (calc. 874,96).
-9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxicitidin-5'-tetrafosfato (dC4P-DDAO): Rendimiento: 0,24 mol, 2,4%; pureza de HPLC 99% a 455 nm; EM: M-1 = 835,03 (calc. 834,95).
-9H(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-on-7-il)-desoxiadenosina-5'-tetrafosfato (dA4PDDAO): Rendimiento: 0,38 mol, 3,8%; pureza de HPLC 99% a 455 nm; EM: M-1 = 859,07
Amplificación por PCR de una secuencia diana usando polifosfato de nucleótidos marcados en el fosfato terminal
5 Mezclas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (20 l) contenían Tris-HCL 20 mM (pH 8,75), KCL 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, MgSO4 2 mM, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y 0,1% (v/v) de Triton X-100. Las concentraciones de nucleótidos finales fueron de 20 M cada una, y se usaron 2,5 unidades de la ADN polimerasa para cada reacción. La plantilla inicial de ADN (1-5 ng) fue pUC18 o pUCp53 (Amersham Biosciences). Las secuencias de los
10 cebadores, junto con la secuencia del segmento amplificado de pUCp53 se muestran en la Tabla 4. La cantidad inicial de cebador fue de 2 pmol cada vez, y se usaron 2,5 unidades de la ADN polimerasa indicada. Las reacciones se realizaron durante 15 ciclos térmicos de 90ºC, 30 seg.; 55ºC, 60 seg.; y 72ºC, 300 seg. La mayoría de las reacciones de PCR también incluyeron MnCl2 a una concentración final de 0,08-0,2 mM. Los productos de reacción se cargaron en
5 geles de agarosa al 1,6%. Los geles se tiñeron con SYBR Gold (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se exploraron a 532 nm usando un escáner de fluorescencia Typhoon (Amersham Biosciences). Los marcadores de tamaño de gel fueron una escalera de 100 pb (Amersham Biosciences).
Las ADN polimerasas usadas para estos experimentos incluyeron ADN polimerasa Taq,
10 ADN polimerasa Thermo Sequenase (Amersham Biosciences), exo-ADN polimerasa Tba (de Thermococcus barosii, patente de Estados Unidos 5602011 con sustituciones de aminoácidos D141A y E143A patente de Estados Unidos 5882904), ADN polimerasa Pfu (Stratagene), ADN polimerasa KOD XL (Novagen) y ADN polimerasa Deep Vent (New England BioLabs).
- Tabla 4: Secuencias de ADN
- Producto de PCR de pUCp53 (SEC. ID Nº: 1)
- imagen1
- imagen1
15 La Figura 1 muestra los resultados de PCR usando diversas ADN polimerasas y nucleótidos normales (carriles 10-12) o una mezcla de dATP, dGTP, dCTP y -DDAO dT tetra Fosfato (DDAO-dT4P). Para este experimento, se usaron ADN polimerasa Taq (carriles 1-3, 12), ADN polimerasa Thermo Sequenase (Amersham Biosciences) (carriles 7-9, 11) o exo-ADN
20 polimerasa Tba (carriles 4-6, 10). La concentración de MnCl2 fue 0 mM para las reacciones resueltas en los carriles 1, 4, 7 y 10-12; 0,2 mM en los carriles 2, 5 y 8; 0,4 mM en los carriles 3, 6 y 9. Para todas las muestras, el ADN molde fue pUCp53 y los cebadores fueron P53SNP22C-51F y P53SNP22G131R. Como se muestra en la figura, se fabricaron cantidades significativas de producto de PCR mediante las tres polimerasas usando nucleótidos normales,
25 pero sólo por la exopolimerasa Tba cuando DDAO-dT4P reemplazó a dTTP, y ese rendimiento de PCR se aumenta al menos 5 veces en presencia de MnCl2 0,2-0,4 mM. En experimentos similares (no mostrados), se descubrió que el rendimiento del producto se aumenta con tan sólo MnCl2 0,04 mM, y como máximo MnCl2 1,0 mM. Es interesante apreciar que no se requiere MnCl2 cuando se usan dNTP normales, y de hecho MnCl2 reduce el rendimiento de estas amplificaciones por PCR (datos no mostrados). Además, el producto de PCR se fabrica con ADN polimerasa Pfu y con ADN polimerasa KOD XL en las mismas condiciones. También es interesante apreciar que el fracaso de lagunas polimerasas para fabricar productos de amplificación sugiere que la amplificación satisfactoria mediante exo-ADN polimerasa Tba y otras polimerasas no se consiguió por degradación simple del nucleótido modificado en el fosfato.
Detección de productos de PCR por fluorescencia
Se añadió fosfatasa alcalina de camarón (Amersham Biosciences), 0,1 unidades, a los productos de las reacciones presentadas en los carriles 2 y 5 de la Figura 1 y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Después la fluorescencia se determinó usando un lector de placa de fluorescencia FarCYte (Amersham Biosciences) usando excitación a 650 nm y emisión a 670 nm. El producción de reacción de Taq polimerasa (que produce producto de PCR en poca cantidad o no detectable) proporcionó una lectura de 5500 unidades de fluorescencia. El producto de reacción de la exo-ADN polimerasa Tba proporcionó una lectura de 31.000 unidades de fluorescencia. Esto indica que las lecturas de fluorescencia simples que detectan la fluorescencia de DDAO libre pueden usarse para detectar la amplificación por PCR satisfactoria. Ejemplo 4 PCR con nucleótidos, moldes y cebadores adicionales.
La Figura 2 muestra los productos de amplificación del mismo molde que la Figura 1 con los mismos cebadores. La Figura 3 muestra los productos de amplificación de ADN pUC 18 usando los cebadores -21 Directo y -28 Inverso (Tabla 1). Para ambas figuras, la reacción de amplificación cargada en el carril 1 se realizó con dNTP normales y sin MnCl2. Para los carriles marcados 2, el dTTP se reemplazó con dT4P-DDAO y las reacciones contenían MnCl2 0,2 mM. Para los carriles marcados 3, el dGTP se reemplazó con dG4P-DDAO y para los carriles marcados 4, el dGTP se reemplazó con dG4P-MeCoumarina de nuevo con MnCl2 0,2 mM. Todas las amplificaciones produjeron de forma satisfactoria producto del tamaño esperado, lo que sugiere que la amplificación es independiente del resto de colorante o base en los nucleótidos modificados. Ejemplo 5 Los efectos de aditivos en hidrólisis no enzimática de polifosfatos de nucleósidos marcados con fosfato terminal
Muestras de setenta l que contenían Hepes 50 mM, pH 8,0, MgCl2 5 mM, MnCl2 0,5 mM, Tween-20 0,01%, ddT4P-EtF1 1 m, cebador/molde 100 nM, SAP 0,0036 unidades/l con o sin glicerol al 5% se sometieron a ciclos como sigue: 95ºC, 30 s y 50ºC, 3 min, repetido 10 veces. Se comprobó la cantidad de colorante libre formado en un fluorímetro. En ausencia de glicerol la concentración del colorante libre formado fue de 151 nM en comparación con sólo 19 nM en presencia de glicerol (cercano al valor observado en ausencia de manganeso, 8 nM). Claramente a temperaturas altas el glicerol reduce la cantidad de degradación causada por manganeso. Ejemplo 6 El Efecto del Sulfato de Amonio como un aditivo de hidrólisis no enzimática de polifosfatos de nucleósidos marcados con fosfato terminal en presencia de MnCl2
Veinte l de Tris.HCl 25 mM, pH 9,0, que contenían MnCl2 0,5 mM, 1 m de dT4P-DDAO y sal 10 mM (véase figura 4) se calentaron a 95ºC durante 60 minutos. Se mezclaron 4 l de cada mezcla de reacción con 16 l de solución EAP en Hepes (0,005 unidades de BAP/l) y se incubaron a 37ºC durante 60 minutos. Se analizaron las muestras en un lector de placa Tecan ultra. Se usaron como controles una muestra sin calentar y una muestra sin calentar sin MnCl2. Los conteos de fluorescencia sin procesar se convirtieron a porcentaje de degradación usando conteos de fluorescencia de una muestra hidrolizada de fosfodiesterasa de Veneno de Serpiente como muestra 100% degradada. La figura 4 muestra claramente que la adición de sulfato de amonio claramente estabiliza el dT4P-DDAO. También se observa algo de efecto de estabilización en presencia de iones sulfato (MgSO4) e iones amonio (NH4Cl). Ejemplo 7 Efecto de otras sales como aditivos en hidrólisis no enzimática de polifosfatos de nucleósido marcados en el fosfato terminal en presencia de MnCl2.
Veinte l de Hepes 25 mM, pH 8,1, que contenían MnCl2 0,5 mM, 1 m de dT4P-DDAO y sal inorgánica u orgánica 10 ó 25 mM (véase figura 5) se calentaron a 95ºC durante 60 minutos. Se trataron 4 l de cada muestra con BAP como se ha descrito anteriormente y se analizaron en un lector de placa Tecan ultra. Una muestra no calentada con MnCl2 (carril de agua) y una muestra calentada sin Hepes y MnCl2 se usaron como controles. Los conteos de fluorescencia se convirtieron a % de degradación como se ha descrito anteriormente. Los datos de la figura 5 claramente muestran que el sulfato de amonio, fosfonoacetato, molibdato sódico, tungstato sódico y vanadato sódico estabilizan el nucleótido. La estabilización debido a sulfonato de propano por otro lado fue mínima. Ejemplo 8 Amplificación por PCR usando polifosfatos de nucleósido marcados en el fosfato terminal en presencia de aditivos estabilizantes de nucleótidos
Las mezclas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (20 l) contenían Hepes 25 mM (pH 8,1), KCl 10 Mm, MgSO4 2 mM, MnCl2 0,25 mM, albúmina de suero bovino 1 mg/ml, Tween-20 0,01% (v/v) y sal 10-25 mM como se muestra en la figura 6. Cada muestra también contenía 20 m de cada una de dA4P-Me, dT4P-Me, dC4P-Me, 200 m de dG4P-FIEt, BAP 0,006 unidades/l, 2 unidades de T. ba polimerasa, 0,1 m de cebador directo -40 M13, 0,1 m de cebador inverso -28 M13 y 0,2 ng de ADN M13. Además del nucleótido marcado en el fosfato terminal, se usaron dNTP bloqueados con metilo terminal en lugar de dNTP normales para evitar la degradación por BAP (fosfatasa). Esto último se requiere para la generación de una señal de tinte-polifosfato después de que el nucleótido se incorpore en el ADN por la polimerasa. Las reacciones se llevaron a cabo durante 35 ciclos térmicos de 90ºC, 30 s; 55ºC, 30 s; y 65ºC, 300 s. Los productos de reacción se cargaron en geles de agarosa al 1,6%. Los geles se tiñeron con SYBR Gold (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se exploraron a 532 nm usando un escáner de fluorescencia Typhoon (Amersham Biosciences). Los marcadores de tamaño del gel fueron una escalera de 100 pb (Amersham Biosciences).
Como se muestra en la figura 6, el producto de PCR se separó en presencia de sulfato de amonio, molibdato sódico y tungstato sódico así como en ausencia de cualquier estabilizador. No se formó producto en presencia de meta vanadato sódico o fosfonoacetato. Considerando que el sulfato de amonio, molibdato sódico y el tungstato no sólo estabilizan los polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal sino que también permiten amplificación de ADN, estas sales son bastante útiles para su uso en procedimientos de amplificación cuantitativos. Ejemplo 9 PCR cuantitativa que emplea polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal.
Las mezclas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (20 l) contenían Tris.HCl 25 mM (pH 9,0), KCL 10 mM, MgSO4 2 mM, MnCl2 0,25 mM, albúmina de suero bovino 1 mg/ml y Tween-20 0,01% (v/v). Cada muestra también contenía 20 m de cada uno de dA4P-Me, dT4PMe, dC4P-Me, 200 m de dG4P-FIEt, BAP 0,005 unidades/l, 2 unidades de polimerasa pfu (con mutación A486Y), 0,1 m de cebador directo -40 M13, 0,1 m de cebador inverso -28 M13 y 1,2x106-1,2x109 copias de ADN M13. Además del nucleótido marcado en fosfato terminal, los nucleótidos restantes se bloquearon con un grupo metilo en el fosfato terminal para evitar la degradación por BAP. Las reacciones se llevaron a cabo durante 50 ciclos térmicos de 90ºC, 30 s; 55C, 30 s; y 65ºC, 300 s en un instrumento ABI 7900. El conteo de ciclo en el que el conteo de fluorescencia alcanza un cierto umbral (que corresponde a una cantidad fija del producto de amplificación) para cada reacción se representó frente a la cantidad de copias de ADN M13 de entrada para proporcionar una línea recta (Figura 7) que indica que el procedimiento puede usarse para la cuantificación de números de copias de ADN diana en una muestra dada.
Los productos de reacción también se cargaron en geles de agarosa al 1,6%. Los geles se tiñeron con SYBR Gold (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes y se exploraron a 532 nm usando un escáner de fluorescencia Typhoon (Amersham Biosciences) para mostrar la formación de producto de PCR (Figura 8). Los marcadores de tamaño del gel fueron una escalera de 100 pb (Amersham Biosciences). Ejemplo 10 Amplificación de ADN mediante Amplificación por Círculo Rodante (RCA) que emplea polifosfatos de nucleósidos bloqueados/marcados en el fosfato terminal
Se tomaron diversas cantidades de ADN cromosómico de esperma del salmón desnaturalizado en tampón Tris: borato 25 mM, pH 8,0 que contenía sulfato de amonio 5 mM, NacL 75 mM, MgCl2 5 mM, MnSO4 1 mM, Tween-20 al 0,01%, 400 ng de ADN polimerasa Phi29, 40 m de hexámeros aleatorios resistentes a nucleasa, 0,03 unidades de BAP y 50 m de cada uno de dA4P-Me, dG4P-Me, dC4P-Me y dT4P-DDAO. Las reacciones se incubaron a 30ºC en un lector de placa de fluorescencia Tecan y se analizaron cada cinco minutos a longitudes de onda de excitación y emisión utilizadas para DDAO. Los conteos de fluorescencia sin procesar se representan en función del tiempo.
La Figura 9 claramente muestra que en ausencia de ADN de entrada, no se produce señal. A medida que la cantidad de ADN aumenta, la cantidad de fluorescencia y por tanto la cantidad de producto producido aumenta. Además, cuando la pendiente de la fase lineal de amplificación para cada reacción (entre 20 y 40 minutos) se representa como en función de la entrada de ADN (Figura 10), se observa una correlación lineal, entre la cantidad de ADN de entrada y la velocidad de formación de producto, lo que indica que este procedimiento puede usarse para cuantificar ADN.
Claims (20)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un procedimiento para una amplificación de ácidos nucleicos ciclados térmicamente, que incluye una reacción de polimerasa de una plantilla de ácido nucleico, un cebador, una polimerasa de ácido nucleico y al menos un polifosfato de nucleósido, comprendiendo la mejora realizar dicha reacción de polimerasa en presencia de al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, y además en el que la amplificación se realiza en presencia de una concentración adecuada de un estabilizador seleccionado entre el grupo sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico, tungstato sódico, que estabiliza el polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal frente a hidrólisis no enzimática.
-
- 2.
- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el estabilizador se selecciona entre molibdato sódico, tungstato sódico y sulfato de amonio.
-
- 3.
- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2 en el que el estabilizador es molibdato sódico o tungstato sódico.
-
- 4.
- Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que la amplificación se consigue por reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
-
- 5.
- Un procedimiento de la reivindicación 1, en el que la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa arqueobacteriana.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la amplificación se realiza en presencia de dos o más polifosfatos de nucleósidos marcados en el fosfato terminal con distintos marcadores.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal comprende cuatro o más grupos fosfato en la cadena polifosfato.
-
- 8.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho polifosfato de nucleósidos
imagen1 en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo; n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo haloalquilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster, alquilfosfonato o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado. -
- 9.
- El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal es un engarce entre P y L.
-
- 10.
- El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho marcador fosforilado es un marcador activable por enzimas y se selecciona entre el grupo que consiste en compuestos quimioluminiscentes, tintes fluorogénicos, tintes cromogénicos, marcas de masa, marcas electroquímicas y combinaciones de los mismos.
-
- 11.
- El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho compuesto quimioluminiscente es un compuesto de 1,2-dioxoetano activado por fosfatasa alcalina.
-
- 12.
- Un procedimiento para detectar la presencia de una secuencia de ácidos nucleicos en una muestra que comprende las etapas de:
- (a)
- realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos ciclados térmicamente para generar un polifosfato marcado, incluyendo dicha reacción al menos un polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal, y una polimerasa de ácido nucleico en presencia de una concentración adecuada de un estabilizador que estabiliza el polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal frente a hidrólisis no enzimática; y en el que el estabilizador se selecciona entre sulfato de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, molibdato sódico y tungstato sódico;
- (b)
- detectar dicho polifosfato marcado, en el que dicha etapa de detección incluye (a) tratar dicho polifosfato marcado con una fosfatasa para producir una especie detectable; y (b) detectar dicha especie detectable.
-
- 13.
- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 en el que el estabilizador se selecciona entre molibdato sódico, tungstato sódico y sulfato de amonio.
-
- 14.
- Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 en el que el estabilizador es molibdato sódico o tungstato sódico.
-
- 15.
- El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha etapa de tratamiento y dicha etapa de realización se realizan simultáneamente.
-
- 16.
- El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicha etapa de detección se realiza en tiempo real según se produce dicha especie detectable.
-
- 17.
- El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la amplificación se realiza por PCR.
-
- 18.
- El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha etapa de realización se realiza por PCR, y dicha reacción también incluye cebadores específicos de alelo.
-
- 19.
- El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal está representado por la fórmula:
en la que P es fosfato (PO3) y derivados del mismo; n es 2 o más; Y es un átomo de oxígeno o azufre; B es una base heterocíclica que contiene nitrógeno; S es un resto azúcar; L es un marcador activable por enzimas que contiene un grupo hidroxilo, un grupo sulfhidrilo o un grupo amino adecuado para formar un éster fosfato, un tioéster o un enlace fosforamidato en el fosfato terminal de un nucleótido natural o modificado; P-L es un marcador fosforilado. -
- 20.
- El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dicho polifosfato de nucleósidos marcados en el fosfato terminal contiene un engarce entre P y L.
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