ES2354611T3 - Inhibidores de caspasa 3, 8, 9 ó 10 en combinación con inhibidores de mek para el tratamiento de la gripe. - Google Patents
Inhibidores de caspasa 3, 8, 9 ó 10 en combinación con inhibidores de mek para el tratamiento de la gripe. Download PDFInfo
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Abstract
Preparación de combinación para su uso para el tratamiento de una enfermedad viral, provocada por virus Influenza, que contiene al menos una sustancia activa, seleccionada del grupo que consiste en inhibidores de caspasa 3, concretamente Z-DEVD-FMK, Ac-DEVD-CHO, Ac-DMQD- CHO, Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK, Z-D(OMe)QMD(OMe)-FMK, e inhibidores de caspasas celulares, que pueden activar la caspasa 3, concretamente los inhibidores de caspasa 8 Z- LE(OMe)TD(OMe)-FMK, Ac-ESMD-CHO, Ac-IETD-CHO, Z-IETD-FMK, los inhibidores de caspasa 9 Z-LE(OMe)HD(OMe)-FMK, Z-LEHD-FMK, Ac-LEHD-CHO, y los inhibidores de caspasa 10 Ac-AEVD-CHO, Z-AEVD-FMK, que inhibe una caspasa celular de manera que se inhibe una multiplicación viral, caracterizada porque adicionalmente está contenida al menos una sustancia de acción antiviral, seleccionada del grupo que consiste en los inhibidores de MEK 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4-oxo- 4H-(1)benzopirano, U0126, PD18453, PD98059.
Description
Inhibidores de caspasa 3, 8, 9 ó 10 en combinación con inhibidores de mek para el tratamiento de la gripe.
Campo de la invención.
La presente invención se refiere a una preparación de combinación según el preámbulo de la 5 reivindicación 1.
Antecedentes y estado de la técnica.
Las infecciones por virus de ARN o de ADN representan una amenaza significativa para la salud de seres humanos y animales. Por ejemplo, las infecciones por virus Influenza forman parte todavía de las grandes epidemias de la humanidad y año a año causan una multitud de víctimas mortales. Desde el 10 punto de vista de la macroeconomía, son un inmenso factor de coste, por ejemplo por la incapacidad laboral por enfermedad. Asimismo, tienen gran importancia económica, por ejemplo, infecciones por el virus de la enfermedad de Borna, (VEB), que afecta sobre todo a los caballos y a las ovejas, sin embargo se aisló también en seres humanos y en este caso se relacionó con enfermedades neurológicas.
El problema de la lucha contra, especialmente, virus de ARN, es la capacidad de transformación 15 de los virus provocada por una alta tasa de errores de las polimerasas virales, que hace muy difícil tanto la producción de vacunas adecuadas como el desarrollo de sustancias antivirales.
Además, se ha mostrado que la aplicación de sustancias antivirales que están dirigidas directamente contra funciones del virus, si bien al comienzo del tratamiento muestran una buena acción antiviral, en cambio, debido a la mutación, conduce muy rápidamente a la selección de variantes 20 resistentes. Un ejemplo de ello es el agente antigripal amantadina y sus derivados, el que o los que está dirigido o están dirigidos contra una proteína transmembrana del virus. En el plazo de un tiempo corto tras la aplicación se forman variantes resistentes del virus.
Un ejemplo adicional son los nuevos agentes terapéuticos para infecciones por Influenza, que inhiben la proteína de superficie del virus Influenza, neuraminidasa. A éstos pertenece por ejemplo 25 Relanza. Se encontraron ya variantes resistentes a Relanza en pacientes (Gubareva et al., J Infect Dis 178, 1257-1262, 1998). Por tanto, no pudieron cumplirse las esperanzas que se depositaron en este agente terapéutico.
Debido a su genoma la mayoría de las veces muy pequeño y a la capacidad de codificación limitada relacionada con ello para funciones necesarias para la replicación, todos los virus dependen en 30 gran medida de las funciones de sus células huésped. Mediante la influencia sobre tales funciones celulares que son necesarias para la replicación viral, es posible influir negativamente en la replicación del virus en la célula infectada. A este respecto, no existe la posibilidad para el virus, mediante adaptación, especialmente mediante mutaciones, de remplazar la función celular ausente, para huir de ese modo de la presión de selección. Esto pudo demostrarse ya en el ejemplo del virus Influenza A con inhibidores 35 relativamente inespecíficos contra metiltransferasas y cinasas celulares (Scholtissek y Müller, Arch Virol 119, 111-118, 1991).
Se sabe que las células disponen de una multitud de rutas de transmisión de señales, con ayuda de las cuales se transmiten al núcleo celular señales que actúan sobre la célula. De esta manera la célula puede reaccionar a estímulos externos y responder con proliferación celular, activación celular, 40 diferenciación o destrucción celular controlada.
Es común a estas rutas de transmisión de señales que contienen al menos una cinasa, que, mediante fosforilación activa al menos una proteína de transmisión de señales siguiente.
Considerando los procesos celulares que se inducen tras infecciones por virus, se encuentra que una multitud de virus de ADN y de ARN activan rutas de transmisión de señales definidas en la célula 45 huésped infectada, así como por ejemplo, la denominada ruta de transmisión de señales Raf/MEK/ERK-cinasa o la ruta de transmisión de señales MEKK/SEK/JNK. Datos más recientes muestran que la inhibición de la ruta de transmisión de señales Ras-Raf-MEK-ERK mediante sustancias activas, que inhiben de manera relativamente selectiva una o varias de las cinasas que participan en esta ruta de transmisión de señales, por ejemplo las MEK y/o las SEK, puede inhibir drásticamente la multiplicación 50 intracelular de virus de ARN de cadena negativa que se replican dentro del núcleo, por ejemplo del virus Influenza A y del virus de la enfermedad de Borna (VEB) (documento PCT/DE 01/01292; documento PCT /DE 02/02810).
Se sabe que los virus pueden inducir la apoptosis de la célula infectada. Esto pudo comprobarse por ejemplo para virus Influenza in vitro e in vivo (Fesq et al 1994; Hinshaw et al 1994; Mori et al 1995; 55
Takizawa et al 1993). Aún no se ha aclarado de manera inequívoca qué proteína viral actúa de manera proapoptótica a este respecto, posiblemente, la apoptosis de la célula huésped se induce mediante la formación de interferón (Balachandran et al 2000) o mediante proteínas virales proapoptóticas tales como por ejemplo PB1-F2 (Chen et al 2001).
No está clara qué influencia tiene la apoptosis inducida por el virus sobre la multiplicación viral. 5 En parte se cree que la liberación de proteínas virales puede llevar los linfocitos a la apoptosis y, a causa de ello, puede producirse una resistencia inmunitaria reducida contra las células infectadas por el virus y un favorecimiento de la multiplicación viral (van Campen et al 1989; Tumpey et al 2000). Otros suponen que la apoptosis de la célula huésped aumenta la reacción inmunitaria contra el virus a través de la fagocitosis reforzada con ello (Watanabe et al 2002). Por otro lado se sabe que una sobreexpresión de 10 Bcl-2 que actúa de manera antiapoptótica inhibe la multiplicación viral (Hinshaw et al 1994; Olsen et al 1996). En contraposición a esto existen hallazgos de que la inhibición de la apoptosis inducida por virus mediante un inhibidor de caspasa, no tenía ninguna influencia sobre la síntesis de proteínas virales (Takizawa et al 1999).
La apoptosis de una célula puede inducirse, aparte de mediante virus, también mediante otros 15 mecanismos proapoptóticos y proteínas distintos. Es común a estos mecanismos y proteínas diferentes que activan una serie de cascadas celulares proteolíticas de cisteinil-proteasas, denominadas caspasas. Las caspasas activadas inicialmente, tales como por ejemplo caspasa 8 y caspasa 9, activan a este respecto las cascadas efectoras tales como por ejemplo las caspasas 3 y 6. Éstas dividen a su vez una serie de sustratos celulares y provocan con ello la apoptosis de la célula afectada (resúmenes en Cohen 20 1997; Thornberry y Lazebnik 1998). El documento F. Takenari et al., Microbiology and Immunology, 43(3), 245-252 (1999) describe que la apoptosis inducida por virus se facilita mediante la actividad de caspasa 3.
Problema técnico de la invención.
La invención se basa en el problema técnico de exponer preparaciones de combinación que muestran una acción antiviral mejorada. 25
Rasgos fundamentales de la invención así como formas de realización.
Para solucionar el problema técnico, la invención enseña el objeto de la reivindicación 1, así como el objeto de la reivindicación 2. Se encontró que i) los virus Influenza necesitan las caspasas celulares para su multiplicación, en especial la caspasa 3 y que en células sin caspasa 3 los complejos de virus-genoma-ribonucleoproteína no pueden difundirse a través de los poros de la membrana nuclear 30 hacia el citoplasma, sino que permanecen en el núcleo, ii) la inhibición de al menos una caspasa celular, en particular la inhibición de la caspasa 3 lleva a una clara inhibición de la multiplicación de los virus de ARN de cadena negativa, en especial de los virus Influenza y iii) la combinación de un inhibidor para una caspasa, en particular de caspasa 3, con otra sustancia de acción antiviral, concretamente con un inhibidor para una cinasa celular, presenta un efecto sinérgico sobre la inhibición de la multiplicación viral. 35
La acción de los inhibidores de caspasa sobre la multiplicación de virus, en especial de virus de ARN de cadena negativa, por ejemplo de los virus Influenza se aclara porque esta inhibición de la multiplicación viral mediante inhibición de la caspasa no está relacionada con una inhibición de la síntesis de proteínas virales tempranas y tardías (por ejemplo NP o NS1 (tempranas) ni de proteínas de la matriz (M1, tardía)) y tampoco se observó cuando el inhibidor de caspasa no se añadió hasta 4 h tras la 40 infección.
La administración de la preparación de combinación puede tener lugar como mezcla de las sustancias activas. Sin embargo, por administración, las sustancias activas pueden administrarse también separadas entre sí en el mismo sitio, por ejemplo por vía intravenosa, o también en sitios separados entre sí, simultáneamente o también en momentos diferentes en el plazo de un intervalo de tiempo en el que la 45 sustancia administrada en primer lugar muestra todavía efecto, por ejemplo en un intervalo de tiempo de tres días.
Preferiblemente, las sustancias activas según la presente invención se preparan para dar un fármaco para la administración local o sistémica en un organismo con ayuda de los métodos y excipientes y/o aditivos habituales para el experto. 50
En general, el experto conoce excipientes y aditivos adecuados que sirven por ejemplo para la estabilización o conservación del fármaco o del medio diagnóstico (véase por ejemplo Sucker H et al. (1991) Pharmazeutische Technologie, 2ª edición, Georg Thieme Verlag, Stuttgart). Ejemplos de tales excipientes y/o aditivos son soluciones salinas fisiológicas, solución de Ringer-dextrosa, dextrosa, solución de Ringer-lactato, agua desmineralizada, estabilizadores, antioxidantes, agentes complejantes, 55 compuestos antimicrobianos, inhibidores de proteinasas y/o gases inertes.
La administración local puede tener lugar por ejemplo sobre la piel, sobre la mucosa, en una cavidad corporal, en un órgano, en una articulación o en el tejido conjuntivo o tejido de sostén, mediante administración nasal o mediante inhalación. La administración sistémica tiene lugar preferiblemente en la circulación sanguínea, en la cavidad peritoneal o en la cavidad abdominal.
La preparación farmacéutica que contiene las sustancias activas según la invención depende del 5 tipo de sustancias activas y del tipo de su administración y puede representar por ejemplo una disolución, una suspensión, una pomada, un polvo, una forma de pulverización u otra preparación para inhalación. Preferiblemente se insertan secuencias de nucleótidos en un vector viral o en un plásmido con métodos conocidos por el experto y se mezclan con excipientes para la transfección celular. A estos excipientes pertenecen por ejemplo polímeros catiónicos o lípidos catiónicos. Se derivatizan oligonucleótidos 10 antisentido con los métodos habituales para el experto, para protegerlos frente a la degradación enzimática mediante ADNasas o ARNasas.
Las sustancias activas según la invención pueden encontrarse en forma de una sal, éster, amida o como un precursor, usándose preferiblemente sólo modificaciones de la sustancia activa que no desencadenen demasiada toxicidad, irritaciones o reacciones alérgicas en el paciente. 15
Las sustancias activas se mezclan en condiciones estériles con un vehículo fisiológicamente aceptable y posibles conservantes, tampones o propelentes, según sea necesario. Los vehículos de este tipo para preparaciones farmacéuticas son habituales para el experto.
Las sustancias activas según la invención se administran preferiblemente en una única dosis, de manera especialmente preferible en varias dosis, no sobrepasando las dosis individuales la dosis máxima 20 tolerable (DMT) de la sustancia activa correspondiente para el ser humano. Preferiblemente se selecciona una dosis que ascienda a la mitad de la DMT.
Según la presente invención, la administración puede tener lugar de manera o bien local o bien sistémica, sólo en un día o diariamente a lo largo de varios días o cada dos o tres días a lo largo de varias semanas, hasta que se manifieste un efecto terapéutico. 25
A continuación se explica en detalle la invención mediante ejemplos que representan únicamente formas de realización.
Ejemplo 1 (comparación): Multiplicación viral en células de tipo natural y en células deficientes en caspasa 3
Para analizar si las caspasas, especialmente la caspasa 3, desempeña un papel importante en la 30 multiplicación del virus Influenza, se inhibió la actividad y la expresión de la(s) proteasa(s) de cuatro formas distintas: a) mediante la adición de un inhibidor permeable a la célula (Z-DEVD-FMK), que además de otras caspasas inhibe preferiblemente la actividad de caspasa 3, b) mediante la expresión de una proteína inhibidora de caspasas, XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis (inhibidor de la apoptosis ligado al cromosoma X)) (Devereaux et al Nature, 388, 300-304, 1997), que, entre otras, inhibe la caspasa 3, c) 35 mediante la transfección estable de un vector, que forma un ARNip contra el ARNm de la caspasa 3, d) mediante el estudio de una línea celular (MCF-7), que es deficiente en caspasa 3 (Jänicke et al. J Biol Chem, 273, 9357-9360) y que se complementó mediante transfección transitoria con procaspasa 3.
Para a) se procedió tal como sigue. Se infectaron células MDCK con la cepa de virus Influenza A Bratislava/79 (Fowl Plague virus, FPV) con una multiplicidad de infección de 1 (M.O.I.=1) en ausencia y 40 presencia de cantidades crecientes del inhibidor de caspasa Z-DEVD-FMK (2, 4, 20, 40 M, Alexis Biochemicals), que inhibe preferiblemente la caspasa 3. La concentración de DMSO (2%) correspondiente a la mayor cantidad de inhibidor sirvió como control de disolvente. Como control adicional se aplicó el análogo de inhibidor inactivo Z-FA-FMK en una concentración de 40 M. Tras 24 h se examinaron con métodos habituales (titulación de placas) los sobrenadantes celulares con respecto a la cantidad de virus 45 recién formados. En paralelo a ello se analizó, en la inmunotransferencia de tipo Western de lisados celulares, la acción del inhibidor de caspasa mediante la medida de la escisión del sustrato de caspasa celular PARP (Poly-ADP-Ribose Polymerase (poli-ADP-ribosa polimerasa)), que, entre otras, se escindió mediante la caspasa 3 (Tewari et al Cell 81, 801-809, 1995). Asimismo se examinó la acción del inhibidor sobre la expresión de proteínas virales tempranas y tardías (NS1, NP, M1) en la inmunotransferencia de 50 tipo Western. En una variación del experimento se añadió el inhibidor DEVD-FMK en una concentración de 40 M y ya tras 2 h tras la infección se eliminó mediante lavado y se sustituyó por medio nuevo, o no se añadió hasta 4 h tras la infección. En una variación adicional del experimento se utilizó el inhibidor de caspasa de amplio espectro Z-VAD-FMK de manera comparativa en concentraciones análogas tanto en células A549, MDCK como en células Vero. 55
Para b) se procedió tal como sigue. Se transfectaron células MDCK con un plásmido vector o con plásmidos que expresan XIAP o procaspasa 3. La transfección se realizó con el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según métodos convencionales (Ludwig et al. J Biol Chem 276,
10990-10998, 2001). Las eficacias de transfección se encontraban en aproximadamente el 60%. 24 h tras la transfección tuvo lugar la infección con la cepa de virus Influenza A Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 1 (M.O.I.=1). Otras 24 h tras la infección se examinaron en las células MDCK los títulos de los virus recién formados en el sobrenadante de cultivo celular en ensayos en placa convencionales. Se verificó la expresión eficaz de las proteínas expresadas de manera transitoria en la 5 inmunotransferencia de tipo Western.
Para c) se procedió tal como sigue. Se transfectó la línea de células epiteliales de pulmón A549 según métodos convencionales (Lipofectamine 2000 (Life Technologies); Ludwig et al. J Biol Chem 276, 10990-10998, 2001) con el vector pSUPER, lo que conduce a la formación de fragmentos de ARNbc interferente pequeño en la célula (ARNip) (Brummelkamp et al. Science, 296, 550-553, 2002). Como 10 inserto servían las siguientes secuencias objetivo de la caspasa 3 (número de registro de Genbank NM004346): TGACATCTCGGTCTGGTAC (nt 417-435), CTGGACTGTGGCATTGAGA (734-755) y TACCAGTGGAGGCCGACTT (795-813) (clon n.º 113, n.º 252 y n.º 311). En un clon adicional (n.º 313) se identificó una inserción. Por consiguiente, este clon sirvió como control negativo. Los constructos se transfectaron junto con el vector pCAGI-puro para hacer las células seleccionables con el antibiótico 15 puromicina. 24 h tras la transfección se lavaron las células y a continuación se incubaron con medio que contenía puromicina 1 g/ml. 24 h más tarde se lavaron las células intensamente con PBS y se añadió medio nuevo que contenía antibióticos. Este procedimiento se repitió entonces durante 7 días en presencia de puromicina 0,6 g/ml. Tras 7 días se examinaron las distintas células para determinar la expresión de la caspasa 3. Asimismo tras 7 días tuvo lugar las infección de las distintas líneas celulares 20 con la cepa de virus Influenza A Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 1 (M.O.I.=1). Otras 24 h tras la infección se examinaron en las células MDCK los títulos de los virus recién formados en el sobrenadante de cultivo celular en ensayos en placa convencionales.
Para d) se procedió tal como sigue. Se transfectó la línea celular MCF-7 de carcinoma de mama deficiente en caspasa 3 con un plásmido vector o un plásmido que expresa la procaspasa 3. La 25 transfección se realizó con el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según métodos convencionales (Ludwig et al. J Biol Chem 276, 10990-10998, 2001). Las eficacias de transfección se encontraban aproximadamente al 50%. 24 h tras la transfección tuvo lugar la infección con la cepa de virus Influenza A Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 1 (M.O.I.=1). Otras 24 h tras la infección se examinaron en las células MDCK los títulos de los virus recién formados en 30 el sobrenadante de cultivo celular en ensayos en placa convencionales. Se verificó la expresión eficaz de procaspasa 3 en la inmunotransferencia de tipo Western.
Se obtuvieron los siguientes resultados.
Para a): el inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD-FMK llevó, de manera dependiente de la dosis, a la reducción del título de virus Influenza tras 24 h hasta aproximadamente el 60% de inhibición a una 35 concentración de 40 M. Esta inhibición se correlacionaba exactamente con la inhibición de caspasa alcanzada, medida en la escisión del sustrato de caspasa PARP. Esto muestra que el nivel de la actividad de las caspasas celulares, especialmente de la caspasa 3 está directamente correlacionado con la eficacia de la multiplicación viral y que los inhibidores de caspasa pueden utilizarse para la inhibición de la multiplicación de virus Influenza. Se alcanzó la misma eficacia de inhibición de la multiplicación viral con 40 un inhibidor de pan-caspasa, Z-VAD-FMK tanto en células A549 como en células MDCK y Vero, mientras que un análogo de inhibidor inactivo Z-FA-FMK no mostró ningún efecto. Adicionalmente se observó que a pesar de los efectos de inhibición sobre la multiplicación viral, Z-DEVD-FMK no presentó una influencia significativa sobre la expresión de proteínas virales. Esto es una prueba de que la actividad caspasa es necesaria tarde en la replicación viral. Esto se respalda mediante el hallazgo de que el inhibidor todavía 45 inhibía eficazmente la multiplicación viral cuando no se añadía hasta 4 h tras la infección, es decir, en momentos tardíos del ciclo de replicación. La presencia de Z-DEVD-FMK en las dos primeras horas tras la infección no tuvo ningún efecto significativo en la eliminación posterior.
Para b): La expresión de la proteína inhibidora de caspasa XIAP llevó a una reducción del título de virus Influenza tras 24 h de aproximadamente el 50%. Esta reducción estaba correlacionada en gran 50 medida con la inhibición de la actividad caspasa alcanzada, medida en la escisión reducida de la proteína PARP, que asimismo se encontraba al 40-50% de la eficacia de la actividad inicial. Al contrario, mediante la expresión de la procaspasa-3 pudo observarse una multiplicación viral aumentada en las células transfectadas. Esto prueba una vez más que el nivel de la actividad de caspasa 3 en las células está directamente correlacionado con la eficacia de la replicación de virus Influenza. 55
Para c): Experimentos de inmunotransferencia de tipo Western mostraron que la expresión estable de distintos segmentos de ARNip en células A549 llevó a una reducción más o menos intensa del nivel de proteína de caspasa 3 en las distintas líneas celulares, mientras que la expresión de un segmento de ARNip control no mostró ningún efecto. Según el grado de reducción de la cantidad de proteína se deducen efectos escalonados sobre la replicación de virus Influenza en las distintas líneas, llevando el 60 segmento (n.º 113) de ARNip que inhibe más intensamente a una reducción de aproximadamente 10
veces del título de virus. El segmento (n.º 313) de ARNip control no tuvo, de manera correspondiente, ningún efecto sobre la multiplicación viral. En este caso cabe mencionar que la intensa inhibición de la expresión de caspasa 3 llevó a una expresión aumentada y una actividad de la caspasa 7 en la línea celular n.º 113. Sin embargo este efecto que ha de entenderse como reacción de compensación no pudo anular los defectos en la multiplicación viral. 5
Para d): la infección de células MCF-7 de tipo natural o transfectadas con vector llevó sólo a títulos muy reducidos de la progenie del virus, lo que indica que la eficacia de replicación de los virus Influenza A en estas células deficientes en caspasa 3 es muy reducida. Sin embargo, si se introducía procaspasa 3 mediante transfección transitoria en estas células, se observaba un aumento de 30 veces de los títulos de la progenie del virus, una prueba adicional de la importancia de las caspasas, 10 especialmente de la caspasa 3 para una multiplicación eficaz del virus Influenza.
En resumen, a partir de estos resultados se puede concluir que el grado de expresión y actividad de las caspasas, especialmente de la caspasa 3, está directamente correlacionado con la eficacia de la replicación de virus Influenza. De manera correspondiente las caspasas, especialmente la caspasa 3, forman puntos de mira para una profilaxis o un tratamiento contra el virus Influenza. 15
Ejemplo 2 (comparación): Mecanismo de la inhibición de la multiplicación viral mediante un inhibidor de caspasa.
Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de lisados celulares de células infectadas con virus Influenza tratadas con inhibidor de caspasa prueban que a pesar de la inhibición eficaz de la multiplicación viral, no se produjo ningún efecto sobre la síntesis de proteínas virales y, por consiguiente, 20 una etapa posterior del ciclo de replicación, cuando la síntesis de proteínas virales ha concluido en gran parte, parece verse afectada por la actividad caspasa (véanse también los resultados para a)). Esto se respalda mediante hallazgos que muestran que los inhibidores de caspasa provocan todavía una inhibición eficaz de la multiplicación viral, cuando no se añaden hasta 4 h tras la infección, es decir, tarde en el ciclo de infección, mientras que la presencia de las sustancias en las dos primeras horas de 25 infección no tuvo ningún efecto en la eliminación posterior. Una etapa esencial tardía en el ciclo de infección por virus Influenza es la exportación de ARN viral recién formado en forma de complejos de ribonucleoproteína (RNP) a partir del núcleo celular de la célula infectada. Hace poco se demostró que la actividad caspasa en las células lleva a un aumento de los poros del núcleo, lo que les permite a proteínas o complejos de proteína grandes una difusión libre entre el núcleo celular y el citoplasma 30 (Falerio y Lazebnik J Cell Biol, 151, 951-959, 2000). Para analizar si la actividad caspasa interviene de manera reguladora en la exportación de proteínas virales o RNP desde el núcleo celular, y si esto sucede mediante difusión libre de las proteínas, se realizaron los siguientes planteamientos experimentales: a) Se infectaron células A549 de tipo natural y células A549, que portan un ARNip de caspasa 3 y se examinaron en análisis de inmunofluorescencia para determinar la ubicación de las RNP, b) se trataron 35 células MDCK de tipo natural con el inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD-FMK y se infectaron y asimismo se examinaron en análisis de inmunofluorescencia para determinar la ubicación de las RNP, c) se transfectaron células MDCK con un plásmido para la nucleoproteína (NP) del virus Influenza A y se examinó la ubicación de la NP en análisis de inmunofluorescencia tras la inducción de la apoptosis con estaurosporina en presencia y ausencia de un inhibidor de caspasa, d) se transfectaron células MDCK 40 para la reconstitución de complejos de RNP con plásmidos que codificaban para la NP y las polimerasas PB2, PB1 y PA de Influenza, así como con un plásmido que expresa una matriz de ARN específica de virus Influenza. Se examinó el efecto sobre la ubicación de los complejos de RNP en presencia y ausencia de inhibidores de caspasa en análisis de inmunofluorescencia.
Para a) se procedió tal como sigue. Se infectaron células A549 o líneas celulares A549, que 45 portaban el segmento de ARNip n.º 113, con la cepa de virus Influenza A Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 3 (M.O.I.=3). 5 h tras la infección se alimentaron las células según métodos habituales (Pleschka et al Nat Cell Biol 3, 301-305, 2001) de análisis de inmunofluorescencia con un antisuero de cabra anti-NP (Robert Webster, Memphis, EE.UU.) y un anticuerpo secundario IgG anti-cabra Texax-Red (Dianova). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI. La visualización tuvo lugar con un 50 microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 40x.
Para b) se procedió tal como sigue. Se infectaron células MDCK con la cepa de virus Influenza A Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 5 (M.O.I.=5) en presencia de DMSO (2%), del inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD-FMK (40 M, Alexis Biochemicals), del análogo de inhibidor inactivo Z-FA-FMK (40 M, Alexis Biochemicals) o del inhibidor de MEK U0126 (50 M, Taros Coustom 55 Biochemicals). 5 horas tras la infección se alimentaron las células según métodos habituales (Pleschka et al Nat Cell Biol 3, 301-305, 2001) de análisis de inmunofluorescencia con un antisuero de cabra anti-NP (Robert Webster, Memphis, EE.UU.) y un anticuerpo secundario IgG anti-cabra Texas-Red (Dianova). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI, la coloración del citoesqueleto tuvo lugar con faloidina-FITC. La visualización tuvo lugar con un microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 40x. 60
Para c) se procedió tal como sigue. Se transfectaron células MDCK con plásmidos, que codifican para las proteínas PB2, PB1, PA y NP del virus Influenza A, así como con un plásmido que forma un ARN antisentido para la proteína fluorescente verde flanqueada por elementos promotores específicos de virus Influenza como matriz para el complejo de polimerasa. Se sabe que la expresión de estos plásmidos lleva a una reconstitución de los complejos de RNP, lo que se indica mediante la expresión del gen indicador, 5 en este caso GFP, (Pleschka et al J Virol, 70, 4188-4192, 1996). La transfección se realizó con el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según métodos convencionales (Ludwig et al. J Biol Chem 276, 10990-10998, 2001). 16 horas tras la transfección se trataron las células durante 5 h con DMSO, estaurosporina (1 M) y DMSO, estaurosporina (1 M) y Z-DEVD-FMK (40 M), o estaurosporina (1 M) y leptomicina B (2 ng/ml). Después se añadieron a las células según métodos habituales (Pleschka et 10 al Nat Cell Biol 3, 301-305, 2001) de análisis de inmunofluorescencia un antisuero de cabra anti-NP (Robert Webster, Memphis, EE.UU.) y un anticuerpo secundario IgG anti-cabra Texas-Red (Dianova). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI, la visualización tuvo lugar con un microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 40x.
Para d) se procedió tal como sigue. Se transfectaron células MDCK con un plásmido que codifica 15 para la NP del virus Influenza A. La transfección se realizó con el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según métodos convencionales (Ludwig et al. J Biol Chem 276, 10990-10998, 2001). 16 horas tras la transfección se trataron las células durante 5 h con DMSO, estaurosporina (1 M) y DMSO, estaurosporina (1 M) y Z-DEVD-FMK (40 M), o estaurosporina (1 M) y U0126 (40 M). Después se añadió a las células según métodos habituales (Pleschka et al Nat Cell Biol 3, 301-305, 2001) de 20 análisis de inmunofluorescencia un antisuero de cabra anti-NP (Robert Webster, Memphis, EE.UU.) y un anticuerpo secundario IgG anti-cabra Texas-Red (Dianova). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI, la visualización tuvo lugar con un microscopio invertido de fluorescencia con un aumento de 40x.
Se obtuvieron los siguientes resultados.
Para a): La comparación de la ubicación de los complejos de RNP (según la detección con un 25 antisuero frente a la nucleoproteína (NP) viral, el componente principal de las RNP), mostró que en células A549 infectadas que presentan, de manera dependiente de ARNip, una expresión intensamente reducida de caspasa 3, las RNP se retienen en el núcleo celular 5 h tras la infección, mientras que en células A549 de tipo natural, al mismo tiempo, las RNP se acumulan ya de manera eficaz en el citoplasma. Esto muestra que el grado de expresión de caspasa 3 está correlacionado con la eficacia de 30 migración de las RNP desde el núcleo celular y señala que este efecto se facilita por la caspasa 3.
Para b): La comparación de la ubicación de los complejos de RNP en células MDCK infectadas, que se incubaron con disolvente o distintos inhibidores, mostró que la migración de las RNP desde el núcleo celular 5 h tras la infección puede inhibirse de manera eficaz tanto mediante el inhibidor de caspasa Z-DEVD como mediante el inhibidor de MEK U0126, pero no mediante el análogo de inhibidor de 35 caspasa inactivo Z-FA-FMK. Esto es una prueba adicional de que las caspasas, especialmente la caspasa 3, facilitan la exportación eficaz de RNP desde el núcleo celular.
Para c): Tras la expresión transitoria en células no estimuladas, la NP de virus Influenza mostró una ubicación nuclear. Sin embargo, si se inducía en estas células la actividad caspasa mediante adición del inductor de la apoptosis estaurosporina, se encontraba la nucleoproteína distribuida por toda la célula. 40 Este “sangrado” desde el núcleo celular pudo impedirse mediante la adición del inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD, pero no mediante un inhibidor de la exportación nuclear activa, leptomicina B. Esto indica que la actividad caspasa facilita la difusión libre de proteínas grandes probablemente mediante un aumento proteolítico de los poros del núcleo y, por consiguiente, promueve la migración de la NP hacia el citoplasma. 45
Para d): Tras la expresión transitoria de las proteínas virales PB2, PB1, PA y NP en células MDCK que, adicionalmente, partiendo de un plásmido expresan una matriz de ARN con regiones promotoras específicas de virus Influenza, que flanquean un gen indicador de GFP, se encontraron células coloreadas de verde en la cubeta de cultivo, lo que indica que en estas células se formaron complejos de RNP intactos. Tanto GFP como los complejos de RNP se encontraban en el núcleo en 50 células sin estimular. Sin embargo, si se inducía actividad caspasa en estas células mediante la adición del inductor de la apoptosis estaurosporina, se encontraba que tanto la GFP como los complejos de RNP se distribuían a su vez por toda la célula. De manera correspondiente, este “sangrado” desde el núcleo celular pudo impedirse mediante la adición del inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD, pero no mediante un inhibidor de la exportación nuclear activa, U0126. Esto indica que la actividad caspasa facilita la difusión 55 libre de complejos de proteína muy grandes probablemente mediante un aumento proteolítico de los poros del núcleo y, por consiguiente, promueve la migración de las RNP hacia el citoplasma. A este respecto es interesante también que las células afectadas, tal como se prueba mediante la capacidad de inhibición con Z-DEVD-FMK, si bien presentan actividad caspasa, sin embargo por lo demás no portan ningún signo morfológico de células apoptóticas, tal como por ejemplo evaginaciones de la membrana o 60 núcleos condensados. Esto muestra que ya los acontecimientos iniciales de la inducción de la apoptosis,
tales como la activación de caspasa temprana son suficientes para facilitar la mejor exportación nuclear de los complejos de proteína. No es necesaria la ejecución completa del programa apoptótico o sería incluso contraproducente.
Ejemplo 3 (según la invención): Acción sinérgica de un inhibidor de caspasa y un inhibidor de cinasa en la inhibición de la multiplicación viral 5
Se sabe que la exportación de RNP de virus Influenza se facilita al menos en parte mediante la exportación nuclear activa (O’Neill et al EMBO J, 17, 288-296, 1998) y de manera correspondiente puede inhibirse con sustancias inhibidoras de la maquinaria de exportación nuclear activa tales como leptomicina B. Asimismo se sabe que la exportación de RNP en fases tardías de la replicación mediante la inhibición de la cascada de Raf/MEK/ERK cinasa, puede inhibirse, entre otros, mediante el inhibidor de MEK U0126, 10 tratándose en este caso de la interferencia con un mecanismo de exportación activa. En el contexto de la invención se encontró sorprendentemente que la exportación nuclear de RNP de virus Influenza puede inhibirse alternativamente también mediante inhibidores de caspasa, tratándose en este caso en gran parte del bloqueo de un proceso pasivo. Debería aclararse ahora si a) la ruta de señalización de activación de caspasa y la cascada de Raf/MEK/ERK se influyen mutuamente y b) si mediante la 15 inhibición de la exportación activa mediante U0126 y la inhibición simultánea de la difusión pasiva reforzada, mediante inhibidores de caspasa, es decir, el bloqueo hasta cierto punto de dos mecanismos de exportación alternativos, puede obtenerse un efecto de inhibición sinérgico sobre la replicación del virus Influenza.
Para a) se procedió tal como sigue. Se infectaron células A549 con la cepa de virus Influenza A 20 Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 1 (M.O.I.=1) en presencia de DMSO (2%), del inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD-FMK (40 M, Alexis Biochemicals), o del inhibidor de MEK U0126 (40 M, Taros Coustom Biochemicals). 24 horas tras la infección se lisaron las células y se alimentaron los lisados tanto a una inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo anti-PARP para la determinación de la actividad caspasa como a un ensayo de cinasa de inmunocomplejos de ERK según métodos 25 habituales (Pleschka et al Nat Cell Biol 3, 301-305, 2001) para la determinación de la actividad de la ruta de señalización de Raf/MEK/ERK en las células infectadas y tratadas.
Para b) se procedió tal como sigue. Se infectaron células A549 y células MCF-7 deficientes en caspasa 3 con la cepa de virus Influenza A Fowl Plague Virus (FPV) con una multiplicidad de infección de 1 (M.O.I. =1) en presencia de DMSO (2%), del inhibidor de caspasa 3 Z-DEVD-FMK (40 M, Alexis 30 Biochemicals), o del inhibidor de MEK U0126 (40 M, Taros Coustom Biochemicals). 9 h y 24 h tras la infección se examinaron en las células MDCK los títulos de los virus recién formados en el sobrenadante de cultivo celular en ensayos en placa convencionales.
Se obtuvieron los siguientes resultados.
Para a): La inhibición de caspasa 3 en células infectadas llevó a una escisión reducida del 35 sustrato de caspasa PARP, pero no a una activación reducida de la ruta de señalización de Raf/MEK/ERK, medida en grado de actividad de ERK inducida por virus en el ensayo de cinasa de inmunocomplejos, que en gran parte era idéntico en células tratadas con DMSO y Z-DEVD-FMK. Igualmente, la inhibición de MEK mediante U0126 en concentraciones que inhibían de manera eficaz la activación de ERK inducida por virus, no llevó a una escisión modificada de PARP. Esto señala que la 40 cascada dependiente de la caspasa 3 y la ruta de señalización de Raf/MEK/ERK facilitan independientemente entre sí distintos procesos que promueven alternativamente la exportación de RNP y con ello configuran de manera más eficaz la multiplicación viral.
Para b): Si en células A549 se inhibían simultáneamente caspasas, preferiblemente la caspasa 3, mediante Z-DEVD-FMK así como la cascada de Raf/MEK/ERK, se podía observar un efecto de 45 inhibición sinérgico sobre la replicación viral tanto tras 9 h como tras 24 h. Con ello pudo reforzarse así la acción de inhibición por debajo de la óptima inferior a una potencia decimal mediante los agentes aplicados de manera aislada hasta el escalón de >1 log mediante adición de combinación. Tal como se esperaba, en células MCF-7 deficientes en caspasa 3, Z-DEVD-FMK no tuvo ningún efecto sobre la multiplicación viral, en cambio se redujeron los títulos ya reducidos de la progenie de virus en estas 50 células de nuevo mediante la aplicación de U0126. Estos hallazgos muestran que en efecto la cascada de caspasa y la ruta de señalización de Raf/MEK/ERK regulan dos procesos alternativos para respaldar de manera eficaz la multiplicación viral y que según estos hallazgos, la aplicación combinatoria de inhibidores de caspasa y de inhibidores de MEK es adecuada de manera ideal para inhibir de manera eficaz la multiplicación de virus Influenza. 55
Claims (2)
- REIVINDICACIONES
- 1. Preparación de combinación para su uso para el tratamiento de una enfermedad viral, provocada por virus Influenza, que contiene al menos una sustancia activa, seleccionada del grupo que consiste en inhibidores de caspasa 3, concretamente Z-DEVD-FMK, Ac-DEVD-CHO, Ac-DMQD-CHO, Z-D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK, Z-D(OMe)QMD(OMe)-FMK, e inhibidores de caspasas 5 celulares, que pueden activar la caspasa 3, concretamente los inhibidores de caspasa 8 Z-LE(OMe)TD(OMe)-FMK, Ac-ESMD-CHO, Ac-IETD-CHO, Z-IETD-FMK, los inhibidores de caspasa 9 Z-LE(OMe)HD(OMe)-FMK, Z-LEHD-FMK, Ac-LEHD-CHO, y los inhibidores de caspasa 10 Ac-AEVD-CHO, Z-AEVD-FMK, que inhibe una caspasa celular de manera que se inhibe una multiplicación viral, 10
caracterizada porque adicionalmente está contenida al menos una sustancia de acción antiviral, seleccionada del grupo que consiste en los inhibidores de MEK 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4-oxo-4H-(1)benzopirano, U0126, PD18453, PD98059. -
- 2. Uso de al menos un inhibidor de caspasa, seleccionado del grupo que consiste en inhibidores de caspasa 3, concretamente Z-DEVD-FMK, Ac-DEVD-CHO, Ac-DMQD-CHO, Z-15 D(OMe)E(OMe)VD(OMe)-FMK, Z-D(OMe)QMD(OMe)-FMK, e inhibidores de caspasas celulares, que pueden activar la caspasa 3, concretamente los inhibidores de caspasa 8 Z-LE(OMe)TD(OMe)-FMK, Ac-ESMD-CHO, Ac-IETD-CHO, Z-IETD-FMK, los inhibidores de caspasa 9 Z-LE(OMe)HD(OMe)-FMK, Z-LEHD-FMK, Ac-LEHD-CHO, y los inhibidores de caspasa 10 Ac-AEVD-CHO, Z-AEVD-FMK y un inhibidor de una o varias cinasas celulares, 20 seleccionado del grupo que consiste en los inhibidores de MEK 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4-oxo-4H-(1)benzopirano, U0126, PD18453, PD98059 para la producción de una preparación de combinación según la reivindicación 1 para el tratamiento de una infección por Influenza.
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