ES2351808B2 - Procedimiento de selección de gérmenes proteosintéticos y procedimiento de fermentación industrial que usa dichos gérmenes para enriquecimiento en proteína microbiana de un substrato. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de fermentación industrial para el
enriquecimiento en proteína microbiana de gramíneas recolectadas en
verde.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de fermentación industrial para el enriquecimiento en
proteína microbiana de gramíneas recolectadas en verde, que
comprende ensilar y fermentar en anaerobiosis dichas gramíneas
mediante la incorporación de una fuente de nitrógeno no proteico y
el inóculo de gérmenes proteo-sintéticos obtenido a
través de una selección de gérmenes que comprende:
- sembrar sobre un substrato de gramíneas ricas
en energía, al que se añade una cantidad de NNP, un inóculo que
contiene microorganismos celulolíticos procedentes de flora ruminal,
fermentarlo en una estufa en anaeroblosis durante 45 días,
deshidratar y micronizar el producto resultante de la anterior
fermentación con lo que se obtiene una primera generación de
gérmenes proteo-sintéticos, repetir las tres etapas
primeras de la misma manera pero sembrando el substrato con los
gérmenes de la generación anterior, obteniendo así un inóculo
mejorado.
Description
Procedimiento de fermentación industrial para el
enriquecimiento en proteína microbiana de gramíneas recolectadas en
verde.
El objeto de la presente invención es una
técnica de fermentación industrial para el enriquecimiento en
proteína microbiana, de substratos fermentables de diversas
gramíneas ricas en energía, recolectadas en verde, antes de su
completa maduración, mediante su ensilado y fermentación en
anaerobiosis obteniendo así productos para la alimentación animal
(rumiantes y monogástricos herbívoros).
En relación con esta tecnología la solicitud de
patente P200500025 se refiere a un procedimiento de fermentación de
sustratos fibrosos y lignofibrosos para alimentación de rumiantes y
monogástricos, mediante microorganismos celulolíticos. Se trata del
acondicionamiento de un sustrato de pajas u otros lignofibrosos con
la adición de una fuente de nitrógeno, sembrado con una flora
digestiva específica, la flora celulolítica, y la aplicación de
condiciones anaerobias. En la presente invención a diferencia de
esta patente, el substrato es completamente diferente, y el inóculo
que produce la fermentación así mismo distinto, porque aunque
procede del anterior, los fermentos han sido seleccionados por su
alta capacidad de síntesis proteica.
Un segundo documento incorporado como referencia
es la patente española número de solicitud P200500017, relativa a un
procedimiento de fermentación utilizando microorganismos
celulolíticos procedentes de flora ruminal.
El objeto de la presente invención es una
técnica de fermentación industrial para el enriquecimiento en
proteína microbiana, de substratos fermentables de diversas
gramíneas ricas en energía, recolectadas en verde, antes de su
completa maduración, que es el momento más adecuado para su ensilado
y conservación, y cuando su digestibilidad, contenido en
carbohidratos fermentables es más alta porque el grado de
lignificación de sus tallos es todavía incipiente. Este substrato se
fermenta siguiendo las pautas que se indican (incorporación de una
fuente de nitrógeno no proteico y un inóculo de gérmenes altamente
proteo-sintéticos). Mediante el ensilado y
fermentación en anaerobiosis de dicho substrato fermentable se
obtienen productos para la alimentación animal (rumiantes y
monogástricos herbívoros) totalmente diferentes a los originales,
enriquecidos con la proteína de origen microbiano de alta calidad
por su contenido en aminoácidos, de mayor digestibilidad y mayor
capacidad para ser consumidos por los animales a los que se
destina.
El objeto de la presente invención no se
refiere, por tanto, a un ensilaje en particular, forraje de maíz o
de otras gramíneas, de las que se obtienen, en determinadas
condiciones, productos destinados a la alimentación animal
(rumiantes y monogástricos herbívoros). Se refiere a una técnica de
fermentación especifica, que aplicada a cualquier forraje de
gramíneas, que cumpla las condiciones que se detallan más adelante,
vale como substrato de fermentación para enriquecer estos alimentos
en proteína microbiana, mejorando sus características
nutritivas.
La presente invención se refiere en primer lugar
a un procedimiento de selección de gérmenes proteosintéticos
caracterizado porque comprende:
- sembrar sobre un substrato de gramíneas ricas
en energía, al que se añade una cantidad de NNP, un inóculo que
contiene microorganismos celuloliticos procedentes de flora
ruminal,
- y fermentarlo en una estufa de anaerobiosis
durante 45 días,
- deshidratar y micronizar el producto
resultante de la anterior fermentación con lo que se obtiene una
primera generación de gérmenes
proteo-sintéticos,
- repetir el sembrado sobre un substrato
idéntico al anterior, pero esta vez sembrando con los gérmenes
procedentes de la primera generación, y mantener otros 45 días en
estufa de anaerobios, para obtener una segunda generación de
gérmenes,
- repetir las tres etapas primeras de la misma
manera pero sembrando con los gérmenes de la segunda generación,
obteniendo así un inóculo así obtenido de tercera generación,
- sembrar el inóculo así obtenido de tercera
generación sobre un substrato idéntico a los anteriores, pero esta
vez cultivarlo en un silo con capacidad industrial, obteniendo
cantidad suficiente de inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos de cuarta generación, que después
del mismo tiempo de fermentación, es deshidratado, micronizado y
envasado en sacos de plástico y sellado.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento de fermentación industrial para el enriquecimiento en
proteína microbiana, de substratos fermentables de gramíneas ricas
en energía caracterizado porque comprende:
- seleccionar un inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos de cuarta generación según el
procedimiento descrito,
- recolectar dichas gramíneas en verde, antes de
su completa maduración,
- ensilar y fermentar en anaerobiosis dichas
gramíneas mediante la incorporación de:
- -
- una fuente de nitrógeno no proteico y
- -
- el inóculo de gérmenes proteo-sintéticos de cuarta generación.
Según una realización preferida el procedimiento
de fermentación industrial comprende:
- sembrar un inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos de cuarta generación obtenido por
el procedimiento de selección descrito, sobre un substrato
fermentable de gramíneas ricas en energía al que se le añade una
cantidad de una fuente de nitrógeno no proteico,
- llevar inmediatamente este substrato ya
preparado a un silo donde se prensará y aislará perfectamente del
oxígeno aéreo,
- dejarlo en fermentación entre 30 y 45 días en
verano, 60 ó más en primavera-otoño.
Según una realización particular las gramíneas
utilizadas son gramíneas con un contenido en humedad entre el 80 y
el 50%, preferentemente entre el 75 y 55% de humedad, y entre el 20
y el 50% de materia seca, preferentemente entre el 25 y 45% de
materia seca, dicha materia seca contiene más del 70% en peso en
carbohidratos con un grado de lignificación de sus tallos inferior
al 6% de lignina ácido detergente, LAD.
El nitrógeno no proteico, NNP, puede provenir de
cualquier fuente de nitrógeno, como por ejemplo, puede tener un
origen orgánico, como son los aminoácidos libres, péptidos,
peptonas, aminas, amidas, proteínas solubles o degradables o
inorgánico como nitratos, nitritos, amoniaco, biuret, urea, sulfatos
mono o di-amónico.
Las gramíneas pueden ser cualquiera, por
ejemplo, maíz, sorgo, pasto del Sudán, trigo, cebada, centeno, maíz,
avena, arroz, caña de azúcar y mezclas de las mismas.
La presente invención se refiere en tercer lugar
a un producto para alimentación animal que comprende una mezcla
fermentada de forraje de gramíneas caracterizado porque ha sido
obtenido a través de un procedimiento de fermentación industrial de
fermentables de gramíneas ricas en energía que comprende:
- seleccionar un inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos a partir de microorganismos
celuloliticos procedentes de flora ruminal según el procedimiento
de selección descrito anteriormente,
- recolectar dichas gramíneas en verde, antes de
su completa maduración,
- ensilar y fermentar en anaerobiosis dichas
gramíneas mediante la incorporación de:
- -
- una fuente de nitrógeno no proteico y
- -
- el inóculo de gérmenes proteo-sintéticos de cuarta generación.
El inóculo polimicrobiano proteosintético, tiene
su origen en la patente propiedad de ALIMENTACIÓN SIGLO XXII, S. L.,
(presentada el 5 enero del 2005, con el nº 200500017) con el titulo:
"Procedimiento de selección de microorganismos celuloliticos a
partir de flora ruminal y reproducción por fermentación industrial
de la flora seleccionada". En este producto están representadas
la mayoría de las especies microbianas responsables de la digestión
ruminal (que suelen clasificarse según su actividad principal en
celulolíticas, hemiceluloliticas, sacaroliticas, amilolíticas,
proteolíticas, productoras de amonio, de vitaminas etc.). Cada grupo
está formado por numerosas especies cuya actividad más
representativa es la digestión de los radicales químicos
correspondientes al grupo al que pertenecen si bien la mayoría son
polifacéticas, esto es, que son capaces de producir enzimas con
actividad sobre diferentes componentes de los substratos. Todas las
especies microbianas, para reproducirse necesitan radicales
carbohidratados en los que fijar amoniaco, y algunas especies
también determinados aminoácidos y péptidos para con ellos crear
sus propias proteínas, utilizando como energía de síntesis el ATP
generado de la hidrólisis de los hidrocarbonados.
En un determinado substrato de fermentación,
solamente pueden desarrollarse aquellas bacterias, o grupos de
bacterias, que disponen de los equipos enzimáticos adecuados para
degradar carbohidratos o proteínas que estén presentes este medio,
para producir radicales carbohidratados sencillos (monosacáridos,
como glucosa o pentosas) a la vez que energía química de síntesis,
adenosin-tri-fosfato (ATP) y
esqueletos de proteína, aminoácidos y amoniaco, con los que en el
interior de su protoplasma a partir de éstos radicales sintetizar
proteína y así poder reproducirse. Es por tanto la composición del
substrato (medio de cultivo) y las condiciones eugenésicas de medio
(humedad, pH, tensión de oxígeno, temperatura, tiempo de
fermentación etc.) los factores que SELECCIONAN las especies
microbianas que se desarrollarán en ése medio de cultivo, y crecerán
con mayor rapidez e intensidad las que están mejor dotadas para
utilizar los nutrientes disponibles. El agotamiento de alguno de los
nutrientes del medio, modificaciones intensas del pH,
deshidratación, la disminución intensa de la temperatura óptima, o
la acumulación de residuos de fermentación, pueden disminuir e
incluso paralizar la fermentación, e inducir a la formación de
esporas como medio de supervivencia a los gérmenes dotados de esta
capacidad.
Por tanto, este tipo especial de fermentación,
consiste en la degradación en anaerobiosis de los carbohidratos
fermentables (azúcares, almidones, pectinas, hemicelulosas y
celulosas) de un determinado substrato hasta convertirlos primero en
hexosas y pentosas, que tras su fosforilación produce dos moléculas
de piruvato, del que proceden dos moléculas de
acetil-coenzima A. Estas penetran en el interior de
las bacterias, donde - mediante el llamado "Ciclo de Krebs" -
sufre sucesivas deshidrogenaciones con producción de CO_{2},
ácidos grasos volátiles (acético, propiónico y butírico) y
adenosin-tri fosfato (ATP), cargado de una enorme
cantidad de energía de síntesis. Cada mol de glucosa produce 38
moles de ATP.
Por otra parte el nitrógeno no proteico, y parte
de las proteínas contenidas en el substrato, son desaminadas para
generar amoniaco y esqueletos carbohidratados, capaces penetrar así
mismo en el interior de su protoplasma a través de su cutícula
externa, y usando como energía de síntesis la contenida en el ATP,
generan su propia proteína lo que les permite multiplicarse por
bipartición. Este proceso de fermentación "in vitro"
produce una predigestión de los nutrientes contenidos en el
substrato, semejante a la digestión ruminal, con lo que se origina
un nuevo alimento enriquecido en proteína microbiana de muy alta
calidad para la alimentación animal.
Cuando el concentrado de gérmenes patentado por
ALIMENTACIÓN SIGLO XXII, S. L., se siembra en condiciones adecuadas
(de humedad, temperatura, ph, ausencia de oxígeno, etc.,) sobre un
substrato determinado especialmente rico en energía fermentable al
que se le añade en cantidad suficiente una fuente de nitrógeno no
proteico (urea, amoniaco, sulfato amónico, o cualquier otra fuente
de nitrógeno no proteico autorizado), para que su agotamiento precoz
no paralice la fermentación, y se mantiene en una estufa de
anaerobiosis a temperatura (de 38ºC \pm 1), y humedad relativa
(del 80 al 85%) controladas durante un mínimo de 45 días, se
desarrollan en la masa de fermentación principalmente aquellos
gérmenes que son capaces de reproducirse más rápida e intensamente,
consumiendo energía y amoniaco y generando ácidos grasos volátiles y
con lo que reproducen una enorme cantidad de cuerpos microbianos,
precisamente los más aptos y los mejor dotados para generar biomasa,
con lo que se SELECCIONA una primera generación de gérmenes
especializados en TRANSFORMAR EL NITRÓGENO NO PROTEICO EN PROTEÍNA
MICROBIANA a partir de la energía producida en la fermentación,
ATP.
En un ejemplo concreto para esta primera
fermentación de selección de gérmenes proteosintéticos, hemos usado
el siguiente substrato: FORRAJE DE MAÍZ, con la siguiente analítica:
(Mat. Seca, 41'79%: Cenizas 4'94%; EE 4'20%; Prot. Bruta% 7'62;
Fibra Br. 20'97%; LAD 3'22%; Almidones 28'23%; Carbohidratos
Fermentables 80%; y N - NH_{3} 0'23). UREA con el 46% de N. Y como
INOCULO, el ya patentado por ALIMENTACIÓN SIGLO XXII, en las
siguientes proporciones:
- FORRAJE DE MAIZ
- 97'3%
- UREA
- 2'5%
- INOCULO DESCRITO EN P200500017 de ALIM. SIGLO XXII ......
- 0'2%
La composición de éste substrato, contando todo
el amoniaco contenido en la urea, como proteína bruta (N x 6'25),
teóricamente producirla un contenido en proteína bruta del 24'78%,
lo que garantiza que durante todo el tiempo de fermentación la falta
de amoniaco no actuará como factor limitante de la reproducción de
los gérmenes.
Tras 45 días de fermentación en estufa de
anaerobiosis a temperatura y humedad controlada, (como ya se indicó
anteriormente) el producto final de ésta fermentación se deshidrata,
microniza, y se somete a análisis químico para compararlo con el
análisis del substrato original, con lo que se comprueba la
cantidad, calidad de la proteína neoformada y se hace recuento de
gérmenes contenidos en la materia seca siguiendo la técnica de
recuento de número más probable de gérmenes por gramo de
producto.
Este inóculo polimicrobiano, (procedente de la
primera fermentación) se utiliza como inóculo para realizar una
nueva generación (la segunda) utilizando el substrato de
fermentación con la misma composición que el anterior, y se procede
de la misma manera: 45 días de fermentación en estufa de
anaerobiosis, deshidratación, análisis químico, recuento de gérmenes
y se compara con los resultados de la generación anterior para
comprobar la mejora de la capacidad fermentativa de los gérmenes
sembrados.
Una tercera generación a partir de la segunda
mejora todavía la capacidad fermentativa de los gérmenes, aunque ya
en menor grado que la anterior pero todavía obtiene una mejor
eficacia en la síntesis de proteína (en cantidad y calidad), con
incremento el nº de gérmenes contenidos en un gramo de materia seca.
Estas tres primeras generaciones se realizan en el laboratorio, en
la estufa de anaerobios.
La 4ª generación se realiza ya fuera del
laboratorio, a nivel industrial, para obtener gran cantidad de
inóculo que es el que se utiliza para sembrar grandes masas de
forrajes de gramíneas, para la obtención del producto para la
alimentación animal. Los análisis de materia seca de los inóculos de
esta 4ª generación, han producido ya una muy ligera mejora de la
tercera, por lo que se considera que los gérmenes que contiene han
sido óptimamente SELECCIONADOS por su cualidad proteosintética, a
partir del alto contenido en energía del substrato.
Las gramíneas idóneas para éste
tratamiento, pueden pertenecer a cualquier género, a modo de
ejemplo no limitante, pueden ser maíz, sorgo, pasto del Sudán,
trigo, cebada, centeno, maíz, avena, arroz, caña de azúcar y mezclas
de las mismas, siempre que contengan suficiente humedad que permita
el desarrollo de los gérmenes sembrados (entre el 75 y 55% de
humedad, o lo que es lo mismo, entre el 25 y 45% de materia seca),
que su materia seca tenga alto nivel de carbohidratos fermentables
(más del 70% de la materia seca), que proporcionen energía
fermentable suficiente, y que el grado de lignificación de sus
tallos sea bajo (inferior al 6% de lignina ácido detergente (LAD)).
Los carbohidratos fermentables (CF) se calculan mediante la
siguiente fórmula: CF= 100 - (Proteína bruta% + Grasa% + Cenizas% +
LAD%).
Las gramíneas a las que se les puede aplicar
este procedimiento de fermentación, son en la práctica todas las que
recolectadas cuando sus granos alcanzan consistencia pastosa, y
todavía sus cañas permanecen con un grado de lignificación bajo,
momento en que el contenido en energía fermentable de estas plantas
completas es más elevado, para que los gérmenes puedan generar el
máximo de biomasa el substrato de fermentación debe contener mucha
energía fermentable.
Todas estas gramíneas son muy diferentes entre
sí, en su digestibilidad, fermentabilidad y valor nutritivo, que se
determina por su composición química analítica (materia seca,
cenizas, proteína, fibra bruta, azúcares, almidones, fibras neutro
detergente, ácido detergente, lignina etc.), e incluso varían
muchísimo, dentro de cada especie según el estado vegetativo que se
encuentran en el momento de la siega. No obstante todas tienen como
característica común, cuando se siegan en verde con un grado
adecuado de maduración de sus semillas, el alto contenido en energía
fermentable de su materia seca, a utilizar por los gérmenes
proteo-sintéticos capaces de desarrollarse en estos
medios de cultivo, y cuya biomasa compuesta por los cuerpos
microbianos son los que enriquecen el medio en proteína. Cuanto
mayor sea el contenido energético, en presencia de NNP, se producirá
un número mayor de cuerpos microbianos y se sintetizará más proteína
microbiana.
El contenido en proteína y carbohidratos
fermentables de cada uno de estos forrajes recién segados, depende,
además de la especie de gramínea, de su humedad, ya que los
nutrientes están ligados a su materia seca, (cuyo porcentaje
disminuye en el forraje húmedo a medida que aumenta la humedad).
Cuando los forrajes son muy jóvenes, antes de que se complete el
crecimiento de sus cañas, y con sus espigas inmaduras todavía
incipientes, son muy húmedos, (con solo el 14 o hasta el máximo del
20% de materia seca), por lo que por kilo de forraje recién
recolectado, en estas condiciones, contiene pocos carbohidratos
fermentables en relación a su peso húmedo. Su capacidad de
transformar la energía en proteína es en estas condiciones, por
tanto, baja. A medida que se produce la maduración de las semillas,
la planta completa va creciendo gradualmente en materia seca,
(llegando a sobrepasar con mucho el 80%, cuando culminan su completa
madurez), y sus tallos van incrementando su contenido en lignina y
cediendo casi todos sus nutrientes a las semillas por lo que su
residuo final, cuando se cosechan los granos, son las pajas. Es por
tanto el contenido en materia seca y el estado de maduración de los
granos ya pasados del estado lechoso a francamente pastoso, e
iniciado el estado cristalino, el momento en que la totalidad de la
planta contiene mayor cantidad de energía fermentable y cuando
todavía el grado de lignificación de los tallos y hojas es bajo y su
humedad (55 al 70%) es la más adecuada para permitir el desarrollo
microbiano.
Como origen de nitrógeno no proteico
(NNP), puede valer cualquiera de las fuentes citadas anteriormente,
siempre que se conozca el% de nitrógeno transformable en amoniaco
que contiene, ya que cada fuente dispone de diferente % de este
elemento. Las de origen orgánico aminoácidos, peptonas, proteínas
solubles o degradables, etc., no pasan del 16% de N, y resulta cara
su utilización, aunque son de una calidad excelente, porque cuando
los enzimas de los fermentos las desaminan, dejan como residuo
esqueletos carbohidratados que funcionan como factores de
crecimiento microbiano. Algunos subproductos de origen orgánico
contienen en cantidad este tipo de NNP. De origen inorgánico el
amoniaco líquido, con el 80% de N, es la fuente más barata pero su
manejo y distribución en ensilados es difícil porque se evapora con
facilidad y es irrespirable, aunque pudiera utilizarse adoptando
determinadas precauciones. La más universalmente usada como aditivo
es la urea, con un 46% de nitrógeno, que es precisamente la que
nosotros hemos utilizado. Los sulfatos mono o
di-amónico, se recomiendan cuando el contenido en
azufre de determinadas gramíneas es escaso, porque este elemento es
necesario para la síntesis de determinados aminoácidos que forman
parte de las proteínas neo-formadas. Cualquier
fuente de NNP puede servir como fuente de amoniaco en este tipo de
fermentaciones.
El inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos es fundamental, porque sin su
presencia e intenso desarrollo en la masa de fermentación, solo se
producirla un ensilado normal, a partir de la flora láctica ya
contenida en el substrato, que con muy alta producción de ácido
láctico y una bajada acelerada del pH hasta entre 3 y 4, que en muy
corto tiempo, una a dos semanas, paraliza la fermentación, pero sin
posibilidad de generación de nueva proteína neoformada. La siembra
del inóculo proteo-sintético en el substrato,
orienta la fermentación hacia la producción de ácidos grasos
volátiles, y energía de síntesis (ATP), a partir de los
carbohidratos fermentables y la desaminación del nitrógeno no
proteico para producir amoniaco, lo que les permite desarrollar su
alta capacidad de proteosíntesis.
El nitrógeno no proteico, NNP, es de
incorporación obligada al substrato, porque es la fuente de
nitrógeno necesaria para la síntesis de proteína por parte de los
microorganismos. Las gramíneas son muy pobres en proteína para
atender las altas necesidades de este nutriente de animales en
crecimiento, cebo o producción de leche por lo que su
enriquecimiento en nitrógeno no proteico transformado por
fermentación en proteína es importante desde los puntos de vista
zootécnico y económico.
Durante el proceso de fermentación el nitrógeno
contenido en estas fuentes de NNP origina amoniaco, igual que el que
procede de la desaminación de parte de las proteínas solubles y
degradables que forman parte de los forrajes. Este amoniaco junto a
algunos aminoácidos libres, y radicales carbohidratados procedentes
de la hidrólisis de los glúcidos y de los esqueletos de aminoácidos
desaminados del NNP, constituyen los metabolitos con los que las
bacterias replican en el interior de su protoplasma su propia
proteína para su crecimiento y multiplicación.
En un determinado substrato de fermentación,
solamente pueden desarrollarse aquellas bacterias, o grupos de
bacterias, que disponen de los equipos enzimáticos adecuados para
degradar carbohidratos o proteínas que estén presentes en este
medio, para producir radicales carbohidratados sencillos
(monosacáridos, como glucosa o pentosas) a la vez que energía
química de síntesis,
adenosin-tri-fosfato (ATP) y
esqueletos de proteína, aminoácidos y amoniaco, con los que en el
interior de su protoplasma a partir de éstos radicales sintetizar
proteína y así poder reproducirse. Es por tanto la composición del
substrato (medio de cultivo) y las condiciones eugenésicas de medio
(humedad, pH, tensión de oxigeno, temperatura, tiempo de
fermentación etc.) los factores que seleccionan las especies
microbianas que se desarrollarán en ese medio de cultivo, y crecerán
con mayor rapidez e intensidad las que están mejor dotadas para
utilizar los nutrientes disponibles. El agotamiento de alguno de los
nutrientes del medio, modificaciones intensas del pH,
deshidratación, la disminución intensa de la temperatura óptima, o
la acumulación de residuos de fermentación, pueden disminuir e
incluso paralizar la fermentación, e inducir a la formación de
esporas como medio de supervivencia a los gérmenes dotados de esta
capacidad.
Por tanto, este tipo especial de fermentación,
consiste en la degradación en anaerobiosis de los carbohidratos
fermentables (azúcares, almidones, pectinas, hemicelulosas y
celulosas) de un determinado substrato hasta convertirlos primero
en hexosas y pentosas, que tras su fosforización produce dos
moléculas de piruvato, del que proceden dos moléculas de
acetil-coenzima A. Éstas penetran en el interior de
las bacterias, donde mediante el "Ciclo de Krebs" sufren
sucesivas deshidrogenaciones con producción de CO_{2}, ácidos
grasos volátiles (acético, propiónico y butírico) y
adenosin-tri fosfato (ATP), cargado de una enorme
cantidad de energía de síntesis. Cada mol de glucosa produce 38
moles de ATP.
Por otra parte el nitrógeno no proteico, y parte
de las proteínas contenidas en el substrato, son desaminadas para
generar amoniaco y esqueletos carbohidratados, capaces penetrar así
mismo en el interior de su protoplasma a través de su cutícula
externa. Usando como energía de síntesis la contenida en el ATP,
generan su propia proteína lo que les permite multiplicarse por
bipartición. Este proceso de fermentación "in vitro"
produce una predigestión de los nutrientes contenidos en el
substrato, semejante a la digestión ruminal, con lo que se origina
un nuevo alimento enriquecido en proteína de muy alta calidad para
la alimentación animal.
El tiempo de fermentación activa se prolonga de
30 a 45 días en verano, porque las altas temperaturas favorecen la
fermentación mientras que en invierno este tiempo es más largo
porque la baja temperatura ralentiza la actividad microbiana y
alarga la fermentación hasta los 60 días. La temperatura ambiente
óptima para el desarrollo de esta flora está comprendida entre 30 y
40ºC, que se corresponden con la época de primavera tardía, verano,
y otoños cálidos, que son las fechas en que suelen cosecharse los
forrajes de gramíneas para su ensilado. Valores por encima o debajo
de estas temperaturas ralentizan la fermentación, prolongándose
hasta 60 días el tiempo de fermentación, cuando la temperatura es
de entre 15 y 30ºC. Por debajo de estas temperaturas, la
fermentación es escasísima y se paraliza del todo por debajo de los
4ºC, porque los gérmenes son incapaces de reproducirse, aunque
permanecen vivos, en estado de latencia hasta que se restablece de
nuevo su temperatura eugenésica.
En cuanto a la humedad óptima del substrato ya
se ha dicho que está comprendida entre el 55 y el 70%. Un contenido
de más del 45% de MS, ralentiza la fermentación, por falta de
humedad; pero cuando baja del 30%, se concentran en el suelo y
paredes de los silos líquidos rezumados de la masa en fermentación,
y cuando la MS está por debajo del 20%, ya llegan a formar
colecciones líquidas importantes.
El pH final de esta fermentación se sitúa entre
4 y 6, porque los ácidos grasos volátiles producidos (acético,
propionico y butirico) son menos fuertes que el láctico cuya
producción en este tipo de fermentación es escasa.
Los productos que se pueden elaborar son muy
numerosos en función de la clase de gramínea que forme parte del
substrato, de su composición química analítica, de la capacidad
fermentativa de sus carbohidratos, contenido en proteína etc., y de
la cantidad potencial de producción de amoniaco procedente del
nitrógeno no proteico durante la fermentación. La capacidad de
fijación de proteína microbiana depende de la energía contenida en
el substrato y de la cantidad de amoniaco aportado en forma de NNP
para su fermentación. Si la cantidad de amoniaco supera la potencial
fermentabilidad del substrato quedará en su seno un sobrante de
amoniaco no utilizado, que como es muy alcalino, mantendrá alto el
pH, incluso por encima de 7, lo que pudiera producir rechazo del
alimento por los animales. Es por tanto muy importante la
dosificación del NNP, en función del contenido en materia seca que
contienen los carbohidratos fermentables de los forrajes, para
permitir que el pH final del producto sea ácido y esté comprendido
como máximo entre 5 y 6. De esta forma el ganadero puede formular la
composición del substrato y predecir de forma bastante aproximada la
composición del producto que le interesa obtener, una vez finalizada
la fermentación, de acuerdo con las necesidades nutritivas de sus
animales.
En los trabajos de investigación que se han
realizado para seleccionar el concentrado
proteo-sintético y para la producción industrial del
alimento para realizar las pruebas de alimentación, se ha utilizado
forraje de maíz, que cumplía todas las condiciones de materia seca,
madurez de granos etc., que ya se han reseñado. Se podría haber
realizado sobre otra clase de gramíneas de composición química y
analítica semejante y se hubieran obtenido resultados muy
semejantes, tanto en la selección del concentrado
proteo-sintético, como en el producto final de
fermentación. Así, los gérmenes seleccionados por este
procedimiento, actúan con la misma eficacia sobre distintos forrajes
de gramíneas.
Las necesidades nutricionales de los animales
son muy diversas dependiendo de la especie, raza, orientación y
situación productiva, nivel de producción según su grado de
selección genética etc. Por otra parte, la capacidad de los
animales para consumir alimentos en general es limitada, por lo que
un alimento en teoría debería aportar todos los nutrientes
necesarios contenidos en su materia seca para que, en la cantidad
que voluntariamente pueda ingerir el animal, completara sus
necesidades de mantenimiento y producción. En la práctica, las
explotaciones ganaderas intensivas, tienen que complementar los
forrajes con concentrados, formulados de forma que el conjunto
complete, dentro de su ingestión voluntaria de materia seca, todas
las necesidades nutritivas de sus altas producciones. Cuanto más
rico es el forraje en energía y proteína, la necesidad de incluir
concentrados es menor, lo que conduce a una importante mejora de las
condiciones fisiológicas de la digestión, eliminando riesgos de
acidosis ruminal, y a la vez una fuerte disminución de los costes de
alimentación. Sin embargo, en animales cuyas necesidades nutritivas
sean moderadas, próximas a las de mantenimiento, y hasta con
producciones limitadas, como las de amamantamiento, estos productos
de fermentación, pueden consumirse "ad libitum" o
incluso racionadas con suplemento de pajas que reducirán el consumo
de estos forrajes fermentados.
Naturalmente todos los rumiantes que han
superado la fase de lactación están especialmente dotados para su
consumo, porque someten los alimentos a una fermentación previa
(fermentación ruminal) antes de que fluyan al estómago glandular
(cuajar), donde se realiza la verdadera digestión. Estos animales,
cuando ingieren alimentos con bajo contenido en proteína y alto en
celulosa, hacen uso del NNP para sintetizar en el rumen proteína
microbiana que después es digerida en el cuajar y además aprovechan
parte de la energía contenida en celulosa para transformarla en
ácidos grasos volátiles que les aportan energía a su metabolismo.
Pero además hay una serie de monogástricos herbívoros, cuyo aparato
digestivo está diseñado para consumir alimentos fibrosos como los
équidos, asnos, cerdas adultas etc., grandes consumidores de hierba,
que si bien no pueden hacer uso de la celulosa de los alimentos
bastos, (por no disponer de rumen) si que utilizan los
carbohidratos no celulósicos, los ácidos grasos volátiles, los
productos intermedios de la fermentación, y además la proteína
microbiana creada en el proceso de la fermentación "in
vitro", contenida en estos nuevos alimentos. Otras especies
posibles consumidoras, pueden ser los lepóridos, (conejos, liebres
etc.,) e incluso ciertas aves como los avestruces, grandes
consumidores de forrajes.
Mediante la técnica de fermentación industrial
para el enriquecimiento en proteína microbiana, de substratos
fermentables de diversas gramíneas se produce una importante mejora
de sus características nutricionales.
La siega y picado del forraje de gramíneas para
su ensilado, se realiza con cosechadoras de forraje "ad
hoc", que cargan un vehículo para llevarlos hasta la granja,
donde se ensilan. La mayoría de las explotaciones cuentan con un
carro mezclador para alimentar a la ganadería en régimen
"unifeed", que resulta ideal para realizar las mezclas de los
ingredientes que componen el substrato de fermentación: Forraje de
maíz, urea como fuente más usada de NNP y los fermentos que provocan
la fermentación.
1º.- La materia seca (MS) que contiene el
forraje, porque la dosis de urea como fuente de NNP, está en función
del % de MS, pero que al dosificarla sobre forraje húmedo, cuya
humedad es variable (entre el 55 y 70%) hay que calcular
correctamente la cantidad a incorporar.
2º.- Hay que saber que por cada 1% de urea (46%
de Nitrógeno) agregada a la MS del forraje, proporciona un
incremento de 2'87% en la proteína microbiana (PM) naciente
contenida en esta MS. Así, por ejemplo, si consideramos un forraje
que contiene un 30% de MS y una proteína bruta en su MS del 8%, y
pretendemos conseguir un producto fermentado con el 15% de proteína,
tenemos que crear un 7% de PM; Si dividimos 7 (que queremos crear)
entre 2'87 (que aporta un 1% de urea) = 2'44% de la MS. Esto es 2'44
kilos de urea por cada 100 kilos de MS del forraje. Como
consideramos que este forraje tiene un 30% de MS y tenemos que
dosificar sobre el forraje húmedo, a cada 100 kilos de forraje le
corresponden el 30% de 2'44 = 730 gr, de urea por cada 100 kilos de
forraje que vayan a ensilarse.
3º.- Los fermentos a dosificar deben
incorporarse a razón de entre 1 y 2 kilos por tonelada, esto es 100
a 200 gr, por 100 kilos.
4º.- Hay que procurar que la distribución de la
urea y el inóculo en una masa tan grande de forraje sea lo más
perfecta posible, por lo que se debe recurrir a elementos mecánicos
que realicen con la mayor perfección la mezcla de los componentes
del substrato, empleando el tiempo necesario para la misma.
5º.- Inmediatamente después de preparado el
substrato debe llevarse al silo, donde se compactará perfectamente
para la eliminación del aire, y se sellará en completa
anaerobiosis.
En el cuadro siguiente se analiza la importancia
de diferentes dosis de urea sobre la una gramínea con contenidos en
humedad del 55, 60, 65 y 70% y con un contenido del 6'5% de proteína
bruta en su materia seca, con incorporación de 0'5, 0'75, 1'00, 1'25
y 1'5% de urea; el análisis de su materia seca debe contener un
mínimo de carbohidratos fermentables del 70%. En este caso las dosis
recomendadas sobre MS de urea, para conseguir una buena
fermentación, y máximo aprovechamiento de los carbohidratos
fermentables (CF), en primavera-verano, con
temperaturas de entre 20 y 30ºC, deben estar comprendidas entre un
máximo de 2'5 a 3%, que después de su fermentación, consigue añadir
a la proteína de la MS del substrato entre un 7 a un 8'5% de
proteína microbiana, con un aprovechamiento del
N-NH_{3} prácticamente total.
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Resultado práctico de la técnica de
fermentación, para la producción de piensos para el ganado:
Para constatar éstos hechos, se confeccionaron
tres microsilos con la siguiente composición:
1º.- Del forraje de maíz recién recolectado para
ensilar, sin ningún aditivo, para que una vez ensilado sirviera como
testigo con el que comparar con los dos siguientes
2º.- De un substrato de fermentación, compuesto
de: Forraje de maíz el 99'1%; Urea 46% de N el 0'9%, sin
incorporación de fermentos.
3º.- De sustrato de fermentación idéntico al 2º,
pero con incorporación además del 0'2% de fermentos
proteo-sintéticos.
Con ellos se confeccionaron tres microsilos,
fuertemente comprimidos y sellados, para conseguir un ambiente en
anaerobiosis, que se mantuvieron en una estufa convencional durante
45 días a la temperatura de 39ºC., (que es la temperatura normal en
el interior del rumen) desde el 15 de mayo hasta el 3 de julio,
fecha en que se abrió y se iniciaron los análisis de
laboratorio.
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Comentarios:
3.- La proteína bruta representa el nitrógeno
total (incluido el contenido en nitrógeno NH_{3}) X 6'25 y
representa la PB contenida en la MS.
4.- El nitrógeno NH_{3} se analiza
independientemente de la proteína bruta y representa el% de NH_{3}
contenido en la MS.
5.- La proteína bruta del NH_{3}, representa
el nitrógeno NH_{3} (punto 4) X 6'25 que es la cantidad de
proteína Br., NH_{3} contenida en la MS.
6.- Representa la PB de 3, menos la linea 5 que
es la PB de origen amoniacal.
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En la columna 1ª (silo de maíz): La proteína
bruta de la MS (7'61%) incluye el 1'437% de PB., de origen
amoniacal, que corresponde al 0'23% de N-NH_{3} X
6'25.
La columna 2ª, (maíz más urea, pero sin
fermentos) con el 14'06% de proteína, de la que 7'918 es proteína de
origen NH_{3} aportada por la urea (1'266 X 6'25).
En la columna 3, maíz fermentado, con el 14'81%
de PB, indica que la P.Br., del silo de maíz ha crecido desde 7'61
en 7'2 puntos hasta (14'81) y solamente quedan de residuos de
proteína de origen amoniacal el 1'187%, que viene a ser la mitad de
la que inicialmente contiene el silo de maíz.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez ensilado perfectamente el substrato, se
inicia rápidamente la fermentación por gérmenes sembrados. Su
capacidad para reproducirse es elevadísima en las condiciones
eugenésicas del medio; esto es: abundancia de carbohidratos
fermentables, ausencia de oxígeno, grado de humedad, temperatura
adecuada, pH del medio y contenido en NNP de la mezcla.
La fermentación se produce entre un amplio
margen de contenido en humedad: entre un 25 a 55% de MS, si bien se
consideran óptimos entre 35 y 45%; la temperatura ambiente influye
en la fermentatividad del substrato, siendo óptima entre 25 y 40ºC.
La fermentación se paraliza con temperaturas por debajo de 4ºC.
La proporción de urea en la mezcla en relación
con el contenido en MS del forraje, depende del contenido de
carbohidratos fermentables, que va creciendo a medida que va
madurando la planta del forraje. Ya se ha calculado arriba la forma
de calcular el% de urea sobre MS y sobre MH: El 1'5% sobre MS
aumenta la proteína bruta en un 4'3% y el 2'5% en un 7'18%.
El tiempo de fermentación se prolonga durante
los meses de invierno y con el aumento del% de urea, El pH inicial
esta próximo a 7; Si la cantidad de urea es elevada puede elevarse
durante la primera semana de fermentación hasta pH próximo a 8 para
descender después hacia final de la fermentación hasta situarse por
debajo de 5.
Una vez iniciada la fermentación se produce la
inmediata degradación extracelular de carbohidratos fermentables,
mediante la acción de enzimas bacterianos hasta hexosas y pentosas,
con una enorme producción de energía (ATP). Estos azúcares y el ATP
penetran en el interior de las células microbiana donde se
convierten a través del pivurato en acetil-coenzima
A, del que se producen ácidos orgánicos volátiles (acetato,
propionato y butirato) y también CO_{2} y CH_{4}.
De manera sincronizada con el anterior proceso,
las bacterias que producen ureasa, hidrolizan en el medio las
moléculas de urea en CO_{2} y 2NH_{3} (amoniaco) así como las
proteolíticas desaminan los aminoácidos libres y otras formas de
NNP, con más producción de NH_{3} y radicales
carbohidratados.
En el interior de las bacterias se produce la
síntesis de proteína mediante la replicación de su propia proteína
microbiana, usando las más eficaces, como fuente de nitrógeno
exclusivamente amoniaco, mientras que otras, con menos capacidad de
síntesis, necesitan además aminoácidos libres o péptidos.
De esta forma, las bacterias se reproducen de
forma activísima, una generación cada 20 minutos, hasta agotar el
substrato de carbohidratos fermentables o de amoniaco, o cuando el
ph del medio es tan bajo, menor de 4, que paraliza el proceso.
Muchas de las bacterias que intervienen en esta predigestión
"in vitro", no superviven a éste nivel de pH, y terminan
Usándose y vertiendo en el medio el contenido de su protoplasma muy
rico en proteína; otras que tienen capacidad para esporular, lo
hacen, y solo quedan de ellas los núcleos refringentes, y toda su
proteína protoplasmática es vertida así mismo en el medio.
Los productos finales de la fermentación, ácidos
grasos volátiles, radicales carbohidratados no utilizados, proteína
microbiana soluble etc., permanecen en el sustrato, y cuando son
ingeridas por los rumiantes, los AGV, se absorben directamente a
través de la mucosa ruminal y la proteína neoformada se comporta
como de sobrepaso, o "by pass" y se digiere en su mayoría en
intestino delgado, proporcionando aminoácidos de alta calidad al
metabolismo animal. El CNCPS, estima la composición la composición
media de las bacterias que componen la biomasa que llegan al
estómago glandular (cuajar), para ser digeridas que es: 12% de
grasa, 21% de carbohidratos, 4'5% de cenizas, 37'5 de proteína
verdadera digestible en el intestino delgado, 15'5 de proteína
verdadera ligada a la pared bacteriana no digestible y 9'5 de ácidos
nucleicos que se absorben, y excretan en la orina, una vez
transformados en purinas.
Claims (6)
1. Procedimiento de fermentación industrial para
el enriquecimiento en proteína microbiana de gramíneas recolectadas
en verde caracterizado porque comprende:
a) seleccionar un inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos de cuarta generación mediante las
siguientes etapas:
- a_{1})
- sembrar sobre un substrato de gramíneas ricas en energía, al que se añade una cantidad de NNP, un inóculo que contiene microorganismos celulolíticos procedentes de flora ruminal,
- a_{2})
- fermentarlo en una estufa en anaerobiosis durante 45 días,
- a_{3})
- deshidratar y micronizar el producto resultante de la anterior fermentación con lo que se obtiene una primeara generación de gérmenes proteo-sintéticos,
- a_{4})
- repetir el sembrado sobre un substrato idéntico al anterior, pero esta vez sembrando con los gérmenes procedentes de la primera generación, y mantener otros 45 días en estufa de anaerobios, para obtener una segunda generación de gérmenes,
- a_{5})
- repetir las tres etapas primeras de la misma manera pero sembrando con los gérmenes de la segunda generación, obteniendo así un inóculo de tercera generación, y
- a_{6})
- sembrar el inóculo de tercera generación sobre un substrato idéntico a los anteriores, pero esta vez cultivarlo en un silo con capacidad industrial, obteniendo cantidad suficiente de inóculo de gérmenes proteo-sintéticos de cuarta generación, que después del mismo tiempo de fermentación, es deshidratado, micronizado y envasado en sacos de plástico y sellado,
b) recolectar dichas gramíneas en verde, antes
de su completa maduración,
c) ensilar y fermentar en anaerobiosis dichas
gramíneas mediante la incorporación de:
- -
- una fuente de nitrógeno no proteico y
- -
- el inóculo de gérmenes proteo-sintéticos de cuarta generación seleccionado en el paso a).
2. Procedimiento de fermentación industrial
según la reivindicación l, caracterizado porque
comprende:
a) sembrar un inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos de cuarta generación sobre un
substrato fermentable de gramíneas ricas en energía seleccionado en
el paso a) de la reivindicación 1 al que se le añade una cantidad de
una fuente de nitrógeno no proteico,
b) llevar inmediatamente este substrato ya
preparado a un silo donde se prensará y aislará perfectamente del
oxígeno aéreo,
c) dejarlo en fermentación entre 30 y 45 días en
verano, 60 ó más en primavera-otoño.
3. Procedimiento de fermentación industrial
según la reivindicación 1, caracterizado porque las gramíneas
utilizadas son gramíneas con un contenido en humedad entre el 80 y
el 50%, preferentemente entre el 75 y 55% de humedad, y entre el 20
y el 50% de materia seca, preferentemente entre el 25 y 45% de
materia seca, dicha materia seca contiene más del 70% en peso en
carbohidratos con un grado de lignificación de sus tallos inferior
al 6% de lignina ácido detergente, LAD.
4. Procedimiento de fermentación industrial
según la reivindicación 1, caracterizado porque las gramíneas
están seleccionadas entre maíz, sorgo, pasto del Sudán, trigo,
cebada, centeno, maíz, avena, arroz, caña de azúcar y mezclas de las
mismas.
5. Procedimiento de fermentación industrial
según la reivindicación 1, caracterizado porque el nitrógeno
no proteico, NNP, está seleccionado entre aminoácidos libres,
péptidos, peptonas, aminas, amidas, proteínas solubles o
degradables, nitratos, nitritos, urea, amoniaco, sulfatos mono o
di-amónico y biuret.
6. Producto para alimentación animal según la
reivindicación 1 que comprende una mezcla fermentada de forraje de
gramíneas caracterizado porque ha sido obtenido a través de
un procedimiento de fermentación industrial de fermentables de
gramíneas ricas en energía que comprende:
a) seleccionar un inóculo de gérmenes
proteo-sintéticos obtenidos mediante el paso a) de
la reivindicación 1 a partir de microorganismos celulolíticos
procedentes de flora ruminal según el procedimiento de la
reivindicación
b) recolectar dichas gramíneas en verde, antes
de su completa maduración,
c) ensilar y fermentar en anaerobiosis dichas
gramíneas mediante la incorporación de:
- -
- una fuente de nitrógeno no proteico y
- -
- el inóculo de gérmenes proteo-sintéticos de cuarta generación seleccionado en el paso a) de la reivindicación 1.
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| ES200900784A ES2351808B2 (es) | 2009-03-23 | 2009-03-23 | Procedimiento de selección de gérmenes proteosintéticos y procedimiento de fermentación industrial que usa dichos gérmenes para enriquecimiento en proteína microbiana de un substrato. |
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|---|---|---|---|
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| ES2351808A1 ES2351808A1 (es) | 2011-02-10 |
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| ES2257208B1 (es) * | 2005-01-07 | 2008-04-01 | Alimentacion Siglo Xxii, S.L. | Fermentacion de sustratos fibrosos y lignofibrosos para alimentacion de rumiantes y monogastricos, mediante microorganismos celuloliticos. |
| US20070098822A1 (en) * | 2005-10-31 | 2007-05-03 | Mankovitz Roy J | Food compositions and methods |
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