ES2351303T3 - Utilización de pramipexol para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica. - Google Patents

Abstract

Utilización de una cantidad eficaz de pramipexol para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), consistiendo el pramipexol en más de un 99% en R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.

Description

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de pramipexol (2-amino4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol) para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Más en particular, la invención se refiere a la utilición del estereoisómero R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol

10 esencialmente puro y de las sales farmacológicamente aceptables del mismo como agentes neuroprotectores para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

En la composición utilizada, por tanto, se incluye pramipexol, estando más de un 99% de los componentes de pramipexol en la conformación R(+).

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Antecedentes de la invención

Las enfermedades neurodegenerativas (END) tales como la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) surgen por la pérdida acelerada de determinadas poblaciones neuronales en el cerebro. Las

20 enfermedades de Parkinson (EP) y de Alzheimer (EA) aparecen normalmente de forma esporádica, sin ningún patrón de herencia mendeliana obvio, pero pueden presentar sesgos maternos. Aunque existen formas de END hereditarias poco comunes o poco frecuentes en adultos, la relevancia de la patogénesis en estas variantes genéticas autosómicas en relación con las formas esporádicas

25 que se producen con mucha más frecuencia es un tema de intenso debate.

La acumulación de pruebas confirma convincentemente que un componente etiológico principal de las END esporádicas en el adulto está relacionado con una disfunción mitocondrial y consiguiente aumento del estrés oxidativo celular. Los cerebros con EP y EA y los tejidos no pertenecientes al

30 SNC muestran una disminución de la actividad de la cadena transportadora de electrones (CTE) mitocondrial. Cuando se amplifican selectivamente en modelos celulares híbridos citoplásmicos (“cíbridos”), los genes mitocondriales de sujetos con EP (Swerdlow y col., Exp Neurol 153:135-42,1998) y EA (Swerdlow y col.,

Exp Neurol 153:135-42 1997) recapitulan los déficits de la CTE, producen un aumento del estrés oxidativo y otras diversas disfunciones mitocondriales y celulares importantes. El peso combinado de las pruebas de los estudios de tejidos y de modelos cíbridos de EP y EA esporádicas sugiere que el alivio del estrés oxidativo mediante agentes capaces de capturar radicales libres oxígeno y proteger las células de la muerte celular generada por las mitocondrias puede ser considerado como una característica principal de los compuestos desarrollados como agentes neuroprotectores para estas enfermedades (Beal, Exp Neurol 153: 135-42, 2000).

El estrés oxidativo también se ha relacionado con el trastorno neurodegenerativo mortal denominado "esclerosis lateral amiotrófica" (ELA). La ELA, también conocida como enfermedad de Lou Gehring, es un trastorno neurodegenerativo progresivo mortal que afecta a las neuronas motoras de la corteza, del tronco encefálico y de la médula espinal. Se trata de una enfermedad degenerativa de las neuronas motoras superiores e inferiores que produce una debilidad progresiva de los músculos voluntarios y finalmente la muerte. La enfermedad aparece normalmente en la cuarta o quinta década de vida y los individuos afectados fallecen en un plazo de 2 a 5 años desde el comienzo de la enfermedad. La ELA se produce tanto de forma esporádica como de forma familiar.

Aproximadamente un 10% de todos los pacientes de ELA son casos familiares, de los cuales un 20% tiene mutaciones en el gen de la superóxidodismutasa 1 (SOD 1) (antiguamente conocido como Cu,Zn-SOD), lo que sugiere que el funcionamiento anómalo de la enzima Cu,Zn-SOD puede desempeñar un papel fundamental en la patogénesis y progresión de la esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF). Se cree que un aumento de la generación de radicales libres oxígeno, en especial de radicales hidroxilo, por la SOD1 mutante es el factor inicial que produce la secuencia de eventos que conduce a la muerte de las neuronas motoras en la ELAF. Esta hipótesis está corroborada por informes recientes, según los cuales la transacción de células precursoras neuronales con SOD1 mutante conduce a un aumento de la producción de radicales hidroxilo y a un incremento de la tasa de muerte celular por apoptosis. Además, los solicitantes creen que el estrés oxidativo también es responsable de la muerte de las neuronas motoras en formas esporádica de ELA.

Muchas publicaciones analizan las causas posibles de la EP (enfermedad de Parkinson), la EA (enfermedad de Alzheimer) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), pero sólo algunas de ellas proponen un tratamiento específico para la ELA.

El documento WO 96/18395 da a conocer el uso de pramipexol como agente neuroprotector. Las enfermedades específicas mencionadas incluyen la EP (enfermedad de Parkinson) y la EA (enfermedad de Alzheimer). El documento WO 96/18395 no da a conocer el uso de pramipexol para el tratamiento de pacientes de esclerosis lateral amiotrófica (ELA). El documento WO 96/18395 tampoco da a conocer ninguna composición farmacéutica que incluya pramipexol y en la que al menos más de un 99% del pramipexol sea R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol.

Deigner y col. (véase Deigner y col., "Apoptosis modulators in the therapy of neurodegenerative diseases", Expert opinion on investigational drugs, Ashley Publications Ltd., Londres, GB, vol. 9, nº 4, abril de 2000, pp. 747-764) presentan un análisis general de la relación de la apoptosis con enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Huntington, y de los conceptos terapéuticos utilizados o propuestos para tratar enfermedades neurodegenerativas. Deigner y col. (2000) mencionan trastornos neurodegenerativos como la EM (esclerosis múltiple), la EA, la EH (enfermedad de Huntington) o la EP (véase la página 747, resumen), pero ninguna composición farmacéutica que incluya pramipexol ni el tratamiento para pacientes de ELA.

Worker ("Novel therapeutic strategies", IDRUGS, Current Drugs Ltd, GB, vol. 2, nº 9, 1999, pp. 848-852) da a conocer la modulación de mecanismos mitocondriales como objetivo potencial para la terapia en el tratamiento de la neurodegeneración. Worker (1999) también da a conocer la participación del glutamato específicamente en la pérdida de potencial de membrana mitocondrial a través de la acumulación de calcio intracelular. Según Worker (1999), la prevención de la acumulación de calcio intracelular puede prevenir la forma necrótica del daño por glutamato y se ha convertido en una estrategia terapéutica para la neurodegeneración. Sin embargo, Worker (1999) no menciona ninguna composición farmacéutica aceptable para el tratamiento de la neurodegeneración. Además, Worker (1999) tampoco menciona la ELA ni el tratamiento de la neurodegeneración por ELA en general como enfermedad neurodegenerativa.

Abramova y col. (véase Journal of Neuroscience Research, 15 de febrero de 2002, EE. UU., vol. 67, nº 4, pp. 494-500) dan a conocer la inhibición de la activación de la caspasa y la muerte celular inducida por iones metilpiridinio o péptidos beta amiloides en células de neuroblastoma humanas mediante R(+)- o S(-)-pramipexol en el tratamiento de la EA o la EP. Abramova y col. no hacen ninguna propuesta para el tratamiento de la ELA.

Cassarino y col. (véase Brain Research Reviews, vol. 29, nº 1, 1999, pp. 1-25) mencionan el estrés oxidativo como un importante factor de implicación en las principales enfermedades neurodegenerativas: EA, EP y ELA. Aunque Cassarino y col. (1999) dan a conocer la implicación mitocondrial en estas enfermedades y analizan las características patológicas, la cadena de transporte de electrones mitocondrial, el ensayo de estrés oxidativo por influencia enzimática, enzimas antioxidantes y sistemas de modelo cíbrido, Cassarino y col. (1999) no mencionan ninguna composición farmacéutica adecuada para el tratamiento de la neurodegeneración, en particular ninguna composición farmacéutica que incluya pramipexol para el tratamiento de la neurodegeneración por ELA.

Investigaciones recientes han revelado que un evento que probablemente influye en la muerte neuronal prematura asociada con la ELA es la presencia de genes mitocondriales mutados (ADN mitocondrial, ADNmt). Estas mutaciones ADNmt conducen a anomalías en el funcionamiento de las vías de producción de energía en las mitocondrias, que resultan en una generación excesiva de derivados de oxígeno perjudiciales conocidos como “especies de oxígeno reactivas” (EOR), incluyendo entidades denominadas “radicales libres oxígeno”. Cuando la producción de EOR supera la capacidad de los mecanismos celulares para eliminar/inactivar EOR, se establece la condición conocida como “estrés oxidativo”.

El estrés oxidativo puede dañar muchos componentes celulares. Algunos trabajos realizados por el inventor han demostrado que un componente celular crítico dañado por el estrés oxidativo en modelos celulares de EA y EP es un complejo proteínico mitocondrial concreto conocido como “complejo de poro de transición mitocondrial” (CPTM). La actividad normal del CPTM es esencial para el mantenimiento de un potencial bioeléctrico () a través de las membranas mitocondriales, que se utiliza a su vez para la síntesis mitocondrial de sustancias químicas de almacenamiento de energía, tales como ATP. La pérdida de  conduce a una despolarización de las mitocondrias e inicia una cascada de reacciones bioquímicas que finalmente producen la muerte celular por un mecanismo conocido como “muerte celular programada” o “apoptosis”. Los mecanismos de apoptosis no sólo se han observado en la EA y la EP, sino también en otras END como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la

5 enfermedad de Huntington.

Por consiguiente, una estrategia para tratar estas enfermedades neurodegenerativas diversas implica la administración de un agente neuroprotector. Los agentes neuroprotectores eficaces para estas enfermedades debilitantes y mortales no sólo deberían ser eficaces en cultivos

10 celulares y modelos animales de estas enfermedades, sino que también han de ser tolerados crónicamente en dosis suficientemente altas hasta niveles terapéuticos en tejidos nerviosos. Lo ideal sería que dichos agentes también estuvieran dirigidos a los componentes celulares implicados en el control de las vías de muerte celular e interrumpieran la fisiopatología de la enfermedad.

15 De acuerdo con una realización, la presente invención utiliza pramipexol para tratar una enfermedad neurodegenerativa como la ELA. Esta utilización comprende el paso de administrar pramipexol al individuo en una cantidad eficaz para reducir el estrés oxidativo en dicho individuo.

El pramipexol (PPX, 2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol) 20 existe en forma de dos estereoisómeros:

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El enantiómero S(-) es un potente agonista de los receptores de dopamina de la familia D2 y se emplea ampliamente en la gestión sintomática de la EP. En las patentes US 4,843,086, 4,886,812 y 5,112,842 se describe la

25 síntesis, formulación y administración de pramipexol. Varios grupos han demostrado que el S(-)-PPX es neuroprotector en modelos celulares y animales donde existe un aumento del estrés oxidativo, incluyendo la toxicidad de la MPTP en cuanto a las neuronas de dopamina (véanse las patentes US 560,420 y 6,156,777). El S(-)-PPX reduce el estrés oxidativo producido por la neurotoxina parkinsoniana y el inhibidor I del complejo CTE-metilpiridinio (MPP+), tanto in vitro como in vivo y puede bloquear la apertura del poro de transición mitocondrial (PTM) inducida por MPP+ y otros estímulos (Cassarino y col., 1998). La estructura catiónica lipófila del PPX sugiere la posibilidad de que la concentración en las mitocondrias por el M, en combinación con su bajo potencial de reducción (320 mV), sea la explicación de estas propiedades neuroprotectoras deseables.

La administración de S(-)-PPX está limitada en los humanos debido a sus potentes propiedades como agonista de la dopamina, lo que restringe los niveles de fármaco que se pueden alcanzar en el cerebro. Dado que el enantiómero R(+) del PPX tiene muy poca actividad como agonista de la dopamina (Schneider y Mierau, J Med Chem 30: 494-498, 1987) pero puede conservar las propiedades moleculares/antioxidantes deseables del S(-)-PPX, se sugiere aquí que este compuesto tiene utilidad como inhibidor eficaz de la activación de las cascadas de muerte celular y la pérdida de viabilidad que se producen en las enfermedades neurodegenerativas.

Sumario de la invención

La presente invención da a conocer métodos para prevenir y/o retrasar o aliviar los síntomas relacionados con una gran variedad de enfermedades neurodegenerativas. Más en particular, la invención se refiere a la utilización de composiciones que comprenden pramipexol para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).

Breve descripción de las figuras

Figura 1A: representa el desarrollo con el tiempo de la liberación de citocromo C inducida por MPP+; Figura 1B: representa el desarrollo con el tiempo de la activación de la caspasa 3 inducida por MPP+. Células SH-SY5Y se incubaron con MPP+ 5 mM durante diversos tiempos y se recolectaron. En la Figura 1A, las células se homogeneizaron en sacarosa isotónica y se centrifugaron y 100 µg de proteína sobrenadante se sometieron a electroforesis utilizando SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nylon y se sometieron a inmunotinción para el citocromo C con detección por quimioluminiscencia aumentada. La banda situada más a la izquierda (designada “0hr” en el eje “X”) corresponde al citocromo mitocondrial C en el tiempo “0” y las demás bandas representan la proteína citoplásmica sometida a electroforesis y a inmunotinción para el citocromo C. En el eje “Y” se muestran las posiciones de los marcadores MW. Otros lotes de células se ensayaron en cuanto a la caspasa 3 utilizando un sistema comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biomol). Los ensayos de caspasa mostrados en la Figura 1B son los resultados de 3-4 experimentos independientes, *p<0,05, en comparación con la actividad a las 0,25 h.

Figura 2: representa los datos que muestran la inhibición de la activación de la caspasa 3 inducida por MPP+ mediante PPX, ácido bongkrécico y ácido aristolóquico. Células SH-SY5Y se incubaron con MPP+ 5 mM durante 24 horas en ausencia o en presencia de S(-)-PPX 1 mM, R(+)-PPX 1 mM, ácido bongkrécico (ABK) 250 µM o ácido aristolóquico (AAR) 25 µM o combinaciones de ellos. Después se ensayaron las células en relación con la actividad de la caspasa 3. En la Figura 2 se muestra la media ±EEM de 4-5 experimentos independientes. Las barras A-F representan la activación de la caspasa 3 mediante células incubadas con los siguientes compuestos: A, control (sin compuesto añadido); B, MPP+; C, MPP+/ABK; D, MPP+/S(-)-PPX; E, MPP+/R(+)-PPX; F, MPP+/AAR. En la barra B, p<0,05 en comparación con el control; y en las barras C-F, p<0,05 en comparación con células tratadas con MPP+ (barra B).

Figura 3: representa los datos que muestran la inhibición de la activación de la caspasa 9 inducida por MPP+ mediante PPX, ácido bongkrécico y ácido aristolóquico. Células SH-SY5Y se incubaron con MPP+ 5 mM durante 4 u 8 horas en ausencia o en presencia de S(-)-PPX 1 mM, R(+)-PPX 1 mM, ácido bongkrécico (ABK) 250 µM o ácido aristolóquico (AAR) 25 µM. Después se ensayaron las células en relación con la actividad de la caspasa 9. En la Figura 3 se muestra la media ±EEM de 3-4 experimentos independientes. Las barras AI representan la activación de la caspasa 9 mediante células incubadas con los siguientes compuestos: A, control (sin compuesto añadido); B, 15 minutos MPP+; C, 4 horas MPP+; D, 4 horas MPP+/PPX; E, 8 horas MPP+; F, 8 horas MPP+ABK; G 8 horas MPP+/S(-)-PPX; H, 8 horas MPP+/R(+)-PPX; I, 8 horas MPP+/AAR. En las barras C y E, p<0,01 en comparación con el control; y en las barras F, G, H e I, p<0,05 en comparación con el control.

Figuras 4A y 4B: Inhibición de la muerte celular inducida por MPP+ mediante enantiómeros de PPX. Células SH-SY5Y se incubaron con MPP+ 5 mM durante 24 horas en ausencia o en presencia de concentraciones crecientes de S(-)-PPX (Figura 4A) o R(+)-PPX (Figura 4B). Las barras A-F representan células tratadas con 0 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3 uM y 30 uM de PPX, respectivamente. Las células se incubaron después con calceína-AM, se lavaron y se leyeron en un lector de placas de fluorescencia. La cantidad de experimentos independientes está indicada en cada barra y los valores P para el terst-t para comparar con el caso sin PPX (sólo MPP+) se muestran por encima de cada barra. En presencia de MPP+, el R(+)-PPX 3 nM causó una mayor retención de calceína que el S(-)-PPX (p = 0,035), y el S(-)-PPX 3 µM causó una mayor retención de calceína que el R(+)-PPX (p = 0,027).

Figura 5: representación gráfica del desarrollo temporal de los cambios en los niveles de 2,3-DHBA en suero en sujetos con ELA y de control (CTL) después de la administración de 1,3 gramos de aspirina. La Figura 5A muestra la media±EEM de los cambios en la concentración de 2,3-DHBA en suero; la Figura 5B muestra la relación entre la concentración de 2,3-DHBA y la concentración de salicilato en suero; y la Figura 5C muestra la concentración de salicilato en suero con el tiempo.

Figura 6: representación gráfica del efecto del pramipexol en la concentración de 2,3-DHBA en suero. La Figura 6A indica las concentraciones de DHBA en casos individuales tanto antes como después del tratamiento con pramipexol. Los casos 2, 3, 7 y 12 no eran ambulatorios. Los casos 3 y 7 dependían del respirador. La Figura 6B muestra la media±EEM de los niveles de concentración de 2,3-DHBA/salicilato en suero antes y después del tratamiento con pramipexol.

Figura 7: A unos ratones se les administró R(+)-PPX a través del agua que bebían y después se trataron con una neurotoxina (N-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina, MPTP), que aumenta el estrés oxidativo en el cerebro y el cerebro anterior. Se determinaron los niveles de 2,3-DHBA.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

En la descripción y las reivindicaciones de la invención se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas más abajo.

Tal como se utiliza aquí, el término “purificado” y términos similares se refieren al aislamiento de una molécula o compuesto en una forma esencialmente libre de los contaminantes normalmente asociados a la molécula

o compuesto en un entorno nativo o natural.

Tal como se utiliza aquí, el término “tratamiento” incluye la profilaxis del trastorno o condición específica o la mitigación de los síntomas asociados a un trastorno o condición específica y/o la prevención o eliminación de dichos síntomas.

Tal como se utiliza aquí, una “cantidad eficaz” significa una cantidad suficiente para producir un efecto determinado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de pramipexol incluye una cantidad que inhibirá la generación o reducirá los niveles de las especies de oxígeno reactivo presentes en un individuo.

Tal como se utiliza aquí, el término “halógeno” significa Cl, Br, F e I. Los halógenos especialmente preferentes incluyen Cl, Br y F. El término “haloalquilo” se refiere a un grupo alquilo(C1-C4) que porta al menos un sustituyente halógeno, por ejemplo clorometilo, fluoroetilo o trifluorometilo.

Tal como se utiliza aquí, el concepto “alquilo(C1-Cn)”, siendo n igual a un número entero, representa un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a la cantidad especificada de átomos de carbono. Los grupos alquilo(C1-C6) típicos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo y hexilo.

Tal como se utiliza aquí, el concepto “alquenilo(C2-Cn)”, siendo n igual a un número entero, representa un grupo olefínicamente insaturado lineal o ramificado que tiene de 2 a la cantidad especificada de átomos de carbono y al menos un enlace doble. Ejemplos de estos grupos incluyen 1-propenilo, 2propenilo, 1,3-butadienilo, 1-butenilo, hexenilo y pentenilo.

El concepto “alquinilo(C2-Cn)”, siendo n igual a un número entero, se refiere a un grupo insaturado lineal o ramificado que tiene de 2 a la cantidad especificada de átomos de carbono y al menos un enlace triple. Ejemplos de estos grupos incluyen 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo y 1-pentinilo.

El término “cicloalquilo(C3-Cn)”, siendo n = 8, representa ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

Tal como se utiliza aquí, el término “arilo” se refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos, incluyendo fenilo, bencilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo e indenilo. El término alquil(C5C8)arilo se refiere a cualquier grupo arilo unido a la fracción primaria a través del grupo alquilo.

El concepto “grupo heterocíclico” se refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que contiene de uno a tres heteroátomos seleccionados de entre el grupo consistente en oxígeno, azufre y nitrógeno.

Tal como se utiliza aquí, el término “heteroarilo” se refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos que contienen de uno a tres heteroátomos, e incluye furilo, tienilo y piridilo.

El término “bicíclico” representa un anillo de carbono bicíclico puenteado

o fusionado de 7 a 12 miembros estable, saturado o insaturado. El anillo bicíclico puede estar unido en cualquier átomo de carbono que proporcione una estructura estable. El término incluye naftilo, diciclohexilo y diciclohexenilo.

Tal como se utiliza aquí, el término "agente neuroprotector" se refiere a un agente que previene o retrasa la progresión de la degeneración neuronal y/o previene la muerte celular neuronal.

Descripción detallada de la invención

La

presente invención se refiere a la utilización de pramipexol, un

tetrahidrobenzotiazol,

para tratar la ELA. Más en particular, los

tetrahidrobenzotiazoles tienen la estructura general:

imagen1

5 en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan, independientemente entre sí, de entre el grupo consistente en H, alqilo(C1-C3) y alquenilo(C1-C3). En un caso, el grupo NR3R4 está en la posición 6. En otro caso, R1, R2 y R4 son H, R3 es alquilo(C1C3) y el grupo NR3R4 está en la posición 6. En un caso, el compuesto tiene la estructura general de fórmula I, siendo R1 y R2 iguales a H en cada caso y

10 siendo R3 y R4 iguales a H o alquilo(C1-C3).

La presente invención se refiere a la Utilización de pramipexol para el tratamiento de la ELA. Dicha utilización incluye una cantidad eficaz de pramipexol, consistiendo el componente de pramipexol esencialmente en R(+)2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o en otras sales

15 farmacológicamente aceptables, básicamente libres de su enantiómero S(-). Por consiguiente, la composición utilizada incluye pramipexol, estando más de un 99% de los compuestos de pramipexol en la conformación R(+).

En una realización está prevista una composición que comprende un principio activo consistente esencialmente en diclorhidrato de R(+)-2-amino

20 4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol, u otras sales del mismo farmacológicamente aceptables, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición se puede administrar vía oral de forma crónica para prevenir la pérdida de células neuronales en caso de ELA (y más particularmente para reducir el estrés oxidativo en pacientes de ELA).

25 El efecto neuroprotector de las composiciones utilizadas de acuerdo con la presente invención se deriva, al menos en parte, de la capacidad del compuesto activo para prevenir la muerte celular neuronal mediante al menos uno de tres mecanismos. En primer lugar, los presentes tetrahidrobenzotiazoles son capaces de reducir la formación de EOR (tanto in vivo en cerebro de rata

30 como in vitro en células con producción reducida de energía mitocondrial) inducida con neurotoxinas que pueden imitar la EP. De este modo, los tetrahidrobenzotiazoles funcionan como “capturadores de radicales libres”. En segundo lugar, los tetrahidrobenzotiazoles pueden restaurar parcialmente el  reducido que está en correlación con mitocondrias en la EA y la EP. En tercer lugar, los tetrahidrobenzotiazoles pueden bloquear las vías de muerte celular apoptósica que se producen mediante modelos farmacológicos de deterioro mitocondrial por EA y EP.

De acuerdo con una realización, el pramipexol se utiliza para reducir el estrés oxidativo en pacientes de ELA. Para los fines de la presente invención, una reducción del estrés oxidativo incluye cualquier reducción del nivel de las especies de oxígeno reactivas presentes en el paciente, incluyendo por ejemplo niveles reducidos de EOR en suero detectados mediante la conversión de salicilato en 2,3-DHBA. Dicha utilización incluye una cantidad eficaz de más de un 99% de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol. La cantidad de pramipexol a administrar para el tratamiento de la ELA variará en función de la vía de administración y de otros factores, incluyendo la edad, el peso, el estado de salud general, la gravedad de los síntomas, la frecuencia del tratamiento y si el tratamiento va acompañado de otros tratamientos adicionales. La cantidad de dosis del compuesto activo a administrar se determina fácilmente mediante procedimientos rutinarios conocidos por el experto en la materia.

Alternativamente, la presente invención se refiere a la utilización de pramipexol para aumentar el potencial bioeléctrico () a través de las membranas mitocondriales de células con producción reducida de energía mitocondrial. Dicha utilización puede comprender el paso consistente en poner en contacto células que tienen una producción reducida de energía mitocondrial con una composición que comprende un principio activo de pramipexol o sales farmacológicamente aceptables del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además, la invención es segura para la administración a seres humanos. El S(-)-pramipexol, que es un potente agonista de la dopamina aprobado para el tratamiento de síntomas de la EP, es el enantiómero del R(+)-pramipexol. Sin embargo, el R(+)-pramipexol carece de actividad de dopamina farmacológica. Por consiguiente, el R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol y las sales farmacológicamente aceptables del mismo pueden ser administrados en dosis mucho mayores que el S(-)-pramipexol y pueden alcanzar niveles en el cerebro capaces de proporcionar neuroprotección. La ELA se puede tratar mediante la administración de R(+)-o S(-)-pramipexol, sin embargo la administración de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol es preferible, ya que las dosis pueden ser mucho más altas. Como se indica en el Ejemplo 1, los isómeros S(-) y R(+) tienen aproximadamente la misma potencia de reducción del estrés oxidativo. Sin embargo, el uso del isómero R(+) permite administrar dosis más altas y, en consecuencia, lograr una mayor reducción de los radicales libres de oxígeno tóxicos. Por consiguiente, en una realización se prevé la reducción de la muerte celular neuronal en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA), administrándose a los pacientes una composición farmacéutica que comprende un compuesto de estructura general:

imagen1

10 La síntesis del pramipexol se describe en la Patente Europea 186.087 y su equivalente, la patente U.S. 4,886,812.

En una realización, el pramipexol, y de forma especialmente preferentemente el R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol, se combina con agentes aglutinantes para producir tabletas para la administración

15 oral o con sustancias conocidas en la técnica para producir un parche transdérmico (“parche para la piel”) para la administración continua. Alternativamente, el pramipexol se puede formular con los agentes estabilizadores necesarios para producir una solución que pueda ser administrada vía parenteral (es decir, vía intravenosa, intramuscular,

20 subcutánea). Las preparaciones para la administración oral y/o transdérmica aquí descritas se pueden utilizar para reducir la muerte celular neuronal en pacientes con ELA (esclerosis lateral amiotrófica).

Dado que el R(+)-pramipexol es un estereoisómero relativamente inactivo del agonista de la dopamina S(-)-pramipexol (Mirapex, Pharmacia y Upjohn), su 25 utilización para tratar la ELA resuelve un importante problema asociado al empleo de S(-)-pramipexol como agonista de la dopamina. La administración de Mirapex está limitada por los efectos secundarios dopaminérgicos en la tensión arterial. El R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol tiene una potencia del 1% o menos para producir los efectos secundarios que resultan del 30 uso de S(-)-pramipexol. Por consiguiente, las presentes composiciones se

pueden administrar de forma más segura a pacientes de EA, que generalmente son intolerantes incluso a pequeñas dosis de medicación con agonistas de la dopamina. Además, las presentes composiciones se pueden administrar vía intravenosa en dosis mucho mayores que el S(-)-pramipexol. Por consiguiente, se puede utilizar de forma segura en situaciones tales como apoplejías, en las que una disminución de la tensión arterial puede resultar perjudicial.

Las utilizaciones de la presente invención para el tratamiento de la ELA reducen al mismo tiempo el riesgo de efectos secundarios dopaminérgicos. Dichas utilizaciones pueden incluir el paso de administrar una composición que comprende un principio activo de pramipexol y un vehículo farmacéuticamente aceptable, consistiendo el principio activo de pramipexol esencialmente en el estereoisómero R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol y sales del mismo farmacológicamente aceptables. La composición se ha de administrar en una dosis de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg al día de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o sales del mismo farmacológicamente aceptables.

La dosis a utilizar depende evidentemente del trastorno específico a tratar y también de otros factores adicionales, incluyendo la edad, el peso, el estado de salud general, la gravedad de los síntomas, la frecuencia del tratamiento y de si el tratamiento va acompañado de productos farmacéuticos adicionales. Las cantidades de los compuestos activos individuales se determinan fácilmente mediante procedimientos rutinarios conocidos por el especialista en la materia. Por ejemplo, el pramipexol utilizado de acuerdo con la presente invención se puede administrar vía oral a humanos con ELA en dosis totales diarias entre 10 mg y 500 mg.

En una realización preferente, el R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6propilaminobenzotiazol (o una sal farmacológicamente aceptable del mismo) se administra a un paciente que padece una enfermedad neurodegenerativa, tal como ELA, para tratar la enfermedad. Tal como se utiliza aquí, el término “tratamiento” incluye la mitigación de los síntomas asociados a un trastorno o a una condición específica y/o la prevención o eliminación de dichos síntomas. Más particularmente, al paciente se le puede administrar una composición que comprende un principio activo de pramipexol o sales farmacológicamente aceptables del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable para prevenir

o reducir sustancialmente la muerte celular neuronal. En las patentes US 4,843,086, 4,886,812 y 5,112,842 se describe la síntesis, formulación y administración del pramipexol.

La generación de radicales hidroxilo en los tejidos de un individuo conduce a un aumento de la conversión del salicilato en ácido 2,3dihidroxibenzoico (DHBA) (Floyd y col (1984), J. Biochem. Biophys., Methods 10:221-235; Hall y col. (1993), J. Neurochem. 60:588-594). Por consiguiente, la acumulación de 2,3-DHBA en el suero de un individuo puede ser utilizada como un indicador del nivel del estrés oxidativo sufrido por dicho individuo. Se ha investigado el efecto del R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o del S-(-)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol en los niveles del ácido 2,3-dihidroxibenzoico (DHBA) en suero. Como muestran las Figuras 5 y 6, los niveles individuales de 2,3-DHBA en suero disminuyeron en todos los pacientes de ELA después del tratamiento con S(-)-2-amino-4,5,6,7tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol. Estos datos demuestran que el tratamiento con pramipexol reduce el estrés oxidativo in vivo en pacientes de ELA.

Además, como se muestra en la Figura 7, se han realizado estudios adicionales con ratones que demuestran la eficacia del pramipexol para reducir el estrés oxidativo in vivo. En este estudio se administró a los ratones R(+)-PPX en el agua que bebían durante 8 semanas en 3 dosis diarias diferentes y después se les administró una neurotoxina (N-metil-4-fenil-1,2,3,6tetrahidropiridina, MPTP), que aumenta el estrés oxidativo en el cerebro. Después se analizó el tejido cerebral para comprobar la producción de radicales libres oxígeno. Los datos muestran que las dosis de 30 mg/kg/día y 100 mg/kg/día condujeron a una reducción considerable de los niveles de radicales libres en el cerebro.

También se han realizado estudios toxicológicos y no se ha detectado ningún indicio de efectos negativos. En particular se llevó a cabo un estudio toxicológico de 8 semanas con los ratones a los que se les administró R(+)-PPX a través del agua. Todos sus órganos principales fueron examinados en cuanto a posibles patologías y no se encontró ninguna lesión. Aunque esto no aborda la cuestión de la eficacia del R(+)-PPX como neuroprotector, sí demuestra la seguridad potencial (y por consiguiente la viabilidad) de la administración de dosis muy altas del fármaco a humanos de forma crónica.

La presente invención también se refiere a la utilización de composiciones farmacéuticas que comprenden el pramipexol descrito en la presente invención.

Más particularmente, los compuestos de pramipexol se pueden formular como composiciones farmacéuticas utilizando vehículos farmacéuticamente aceptables estándar, materiales de carga, agentes solubilizadores y estabilizadores conocidos por los expertos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas que comprenden pramipexol se pueden administrar a un individuo que las necesite a través de numerosas vías, incluyendo las vías tópica, oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual

o rectal.

La invención también describe un paquete o kit que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas descritas en la invención. Por ejemplo, se describe un kit para tratar un paciente de ELA. Este kit comprende el pramipexol descrito en la presente invención, y más particularmente el estereoisómero R(+)2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol. Estos productos farmacéuticos se pueden envasar en una gran variedad de recipientes, por ejemplo viales, tubos, placas de pocillos de microtitulación, botellas y similares. Preferiblemente, el kit también incluirá instrucciones de uso.

Ejemplo 1: R(+)- y S(-)-PPX son eficaces inhibidores de la activación de las cascadas de muerte celular

Materiales y métodos

Cultivo celular

Se obtuvieron células de neuroblastoma humano SH-SY5Y de la American Tissue Culture Collection (www.atcc.org) y se mantuvieron en cultivo en estado de replicación. Para la realización de los ensayos de caspasa y estudios de liberación del citocromo C, las células se cultivaron en matraces T75 con DMEM/suero bovino fetal al 10% con alto contenido en glucosa, antibiótico/antimicótico (100 IU/ml de penicilina, 100 µg/ml de sulfato de estreptomicina, 0,25 µg/ml de anfotericina B) y 50 µg/ml de uridina y 100 µg/ml de piruvato bajo atmósfera de CO2 al 5%, a 37ºC, hasta aproximadamente una confluencia total (2 x 107 células/matraz). Después se incubaron con yoduro de metilpiridinio 5 mM (MPP+; Sigma; www.sigma-aldrich.com) o péptidos 25-35 ó 35-25 beta-amiloides 100 µM (Bachem; www.bachem.com) durante diversos tiempos y a continuación se recolectaron. Para los estudios de muerte celular, las células se dispusieron en placas de fondo negro de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 horas en un medio DMEM antes de exponerlas a una toxina.

Ensayos de caspasa

Después de exponerlas a MPP+ o al péptido beta amiloide, las células se recogieron en PBS y se centrifugaron a 450 x g durante 6 minutos a 4ºC. Las pellas celulares se resuspendieron en un tampón de lisis celular hipotónico [HEPES 25 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 5 mM, DTT 1M y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma Chemical)] en una concentración de 2 x 107 células/100 µl de tampón de lisis. Los productos de lisis se sometieron a cuatro ciclos de congelación y descongelación. Después, los productos de lisis celular se centrifugaron a 16.000 x g durante 30 minutos a 4ºC. Se recogieron las fracciones sobrenadantes y se midió el contenido de proteínas mediante el ensayo Lowry (BioRad). Para medir la actividad de la caspasa se utilizaron 100 µg de proteína en placas de 96 pocillos, que se ensayaron por cuadruplicado. Dicha actividad se midió utilizando el tampón de ensayo y el protocolo proporcionados por los fabricantes (Biomol, caspasa 3; Promega, caspasas 3 y 9). La actividad de caspasa se basa en la división de substratos de péptido sintéticos, que conduce a la liberación de cromógenos coloreados (p-nitroanilina (p-NA), Biomol) o fluorescentes (aminometilcumarina (AMC), Promega). Únicamente las caspasas activadas son capaces de dividir estos substratos y la generación de cromógenos se inhibe por completo cuando en el ensayo se incluye el inhibidor de caspasa proporcionado con cada kit de ensayo. Bajo las condiciones de ensayo indicadas, se observaron tasas lineales de generación de cromógenos durante 2 horas. La absorbancia de cromógeno (p-NA) se midió en un lector de placas OptiMax o la fluorescencia de cromógeno (AMC) se midió en un lector de placas SpectraMax Gemini, en el tiempo cero y después de 30 minutos de incubación a 37ºC, para estimar las actividades de caspasa relativas. La señal de cromógeno en el tiempo cero se restó de las lecturas realizadas a los 30 minutos.

Muerte celular

La muerte celular se estimó midiendo la pérdida de retención de calceína con el ensayo “Live-Dead” (Molecular Probes; www.molecularprobes.com) en células cultivadas en placas de 96 pocillos e incubadas con calceína-AM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las señales de calceína se ensayaron en un lector de placas fluorescente ajustable SpectraMax Gemini (Molecular Devices). La fluorescencia de calceína de células preincubadas con metanol se restó de todas las lecturas como fondo. Cada ensayo se realizó con 8 pocillos/condición y se halló la media. Se llevaron a cabo 3-8 experimentos independientes para evaluar una amplia gama de concentraciones de S(-)-y R(+)-PPX en este paradigma.

Western Blot de citocromo C

El citocromo C se detectó mediante Western Blot después de electroforesis en poliacrilamida de 100 µg de proteína sobrenadante celular y transferencia a membrana de nylon. El anticuerpo primario era un anticitocromo C monoclonal de ratón obtenido de Pharmingen y utilizado en una dilución

1:10.000. La detección se llevó a cabo con quimioluminiscencia aumentada (Pierce) y se representó en una estación de representación BioRad FluorS.

Fármacos

Se obtuvieron R(+)- y S(-)-PPX (donados por Pharmacia Corporation) en forma de sus sales diclorhidrato y se disolvieron directamente en un medio de cultivo. El ácido bongkrécico, un antagonista del sitio de unión de ATP en el translocador del nucleótido de adenina, se suministró en forma de una solución en NH4OH 1M. El ácido aristolóquico (sal sódica), un inhibidor de la fosfolipasa A2, se obtuvo de Sigma Chemical Co. En los experimentos de caspasa, los fármacos se añadieron 1 hora antes que el MPP+ o el péptido beta amiloide. En los experimentos de calceína/muerte celular, los fármacos se añadieron 4 horas antes que el MPP.

Resultados

Activación de caspasas por MPP+ y Ba 25-35

La Figura 1B muestra el desarrollo con el tiempo de la actividad de caspasa 3 durante la incubación de células SH SY5Y con MPP+ 5 mM. Antes de 4 horas se podía detectar un aumento de actividad y ésta había aumentado aproximadamente al doble antes de 24 horas. La Figura 1A muestra el resultado del Western blot de la proteína de citocromo C liberada en el citoplasma. De modo similar a la curva de actividad bioquímica, el citocromo C citoplásmico se puede detectar en pequeñas cantidades antes de 4 horas y aumenta considerablemente antes de 12 horas.

La Figura 2 muestra que tanto el enantiómero R(+)-PPX como el enantiómero S(-)-PPX suprimían la activación de la caspasa 3 durante la exposición a MPP+. Los aumentos de la actividad de caspasa 3 inducidos por MPP+ también se bloquearon mediante ácido bongkrécico, un antagonista específico del sitio de unión de ATP en el sitio de membrana interior del translocador del nucleótido de adenina. El ácido aristolóquico, un inhibidor de la fosfolipasa A2 que ya había demostrado previamente que bloqueaba la apoptosis de células SH-SY5Y inducida por MPP+ (Fall y Bennett, 1998), también evitó aumentos en la actividad de la caspasa 3. La activación de caspasas por MPP+ y péptido BA 25-35 se bloqueó mediante enantiómeros de PPX y agentes activos en el poro de transición mitocondrial. El S(-)-PPX redujo aproximadamente un 70% los aumentos de la actividad de la caspasa 3 después de la incubación con péptido 25-35 y no tuvo ningún efecto supresor por sí mismo. La exposición a MPP+ también aumentó la actividad de la caspasa 9, con un desarrollo temporal similar al de la activación de la caspasa 3 (véase la Figura 3). Los aumentos de la actividad de la caspasa 9 también se bloquearon mediante S(-)- y R(+)-PPX, ácido bongkrécico y ácido aristolóquico. La Figura 4 muestra los efectos en la retención de calceína celular de la incubación de células SH-SY5Y con diversas concentraciones de R(+) o S(-) antes de la exposición a MPP+ 5 mM durante 24 horas. La calceína es un tinte fluorescente que se retiene dentro de la célula como una función de su capacidad para mantener un potencial de membrana plasmática. El MPP+ solo redujo la absorción de calceína en aproximadamente un 60%. Los dos enantiómeros de PPX restauraron esencialmente la absorción de calceína a niveles de 30 nM y este efecto protector se conservó con PPX 30 µM.

Discusión

Este estudio estaba enfocado al uso de las neurotoxinas MPP+ y péptido 25-35 beta amiloide añadidos a células de neuroblastoma SH-SY5Y replicantes como modelos de cultivo celular para estudiar compuestos potencialmente neuroprotectores útiles para la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, respectivamente. Las células SH-SY5Y son células divisoras neoplásicas de origen neuroectodérmico, no neuronas primarias. Son mitóticas a consecuencia de una mutación Ras que conduce a una activación crónica de las señales MAPK/ERK. Las células SH-SY5Y son relativamente insensibles al MPP+ en incubaciones a corto plazo en comparación con las neuronas primarias. Los solicitantes han comprobado que el MPP+ 2,5 y 5 mM, pero no 1 mM, produce una morfología apoptósica y fragmentos picnóticos de ADN en un plazo de 18-24 horas. Sin embargo, incubaciones más largas con concentraciones menores de MPP+ pueden aproximar más el modelo de MPTP in vivo de EP en animales y se ha informado de que una exposición más larga a niveles más bajos de MPP+ sigue siendo capaz de activar la cascada de muerte celular mitocondrial.

Las células SH-SY5Y también son sensibles a los péptidos beta amiloides. Li y col. (1996) comprobaron que SH-SY5Y con deficiencia de suero mostraban un extenso marcado de extremo mellado de ADN después de 3 días de exposición a 2S-3S beta-amiloide 100 µM y presentaban un aumento del desenrollamiento de ADN dependiente de la concentración. Según parece no se ha descrito la activación de caspasas inducida por péptido beta-amiloide en SHSY5Y, pero varios informes han demostrado activaciones de caspasa por exposición a péptidos beta-amiloides en diversas líneas neuronales primarias. Éstas incluyen la activación de las caspasas 2, 3 y 6 por el análogo de 25-35 en células granulares cerebelosas y de la caspasa 3 en neuronas corticales primarias de rata. Por consiguiente, no es sorprendente que se haya observado actividad de caspasa 3 (DEVDasa) en SH(-)SY5Y expuestas a 25-35 betaamiloide 100 µM pero que no se haya observado ninguna activación de caspasa después de una exposición a la secuencia 35-25 inversa.

Estos experimentos estaban enfocados a determinar si los enantiómeros de PPX pueden prevenir la activación de las caspasas y promover la retención de calceína como un marcador de supervivencia celular bajo exposición a una toxina aguda, modelos de cultivo celular de la EA y la EP. La activación tanto de la caspasa 9 “iniciadora” como de la caspasa 3 “verdugo” se bloqueó mediante los dos enantiómeros de PPX en el modelo de MPP+ para la EP, y la activación de caspasa 3 se bloqueó mediante S(-)-PPX en el modelo BA 25-3S para la EA. Los dos enantiómeros de PPX a niveles nanomolares promovieron la supervivencia celular en el modelo de MPP+ para la EP. Por consiguiente, las presentes conclusiones se suman a la creciente cantidad de trabajos que describen los efectos neuroprotectores del PPX y sugieren una utilidad clínica potencial de esta familia de compuestos en enfermedades neurodegenerativas.

Aunque este estudio no examinó el lugar de acción más inmediato del PPX, varios resultados indican una participación del complejo de poro de transición mitocondrial (CPTM) en estos modelos celulares. En primer lugar, el ácido bongkrécico, un antagonista translocador del nucleótido de adenina selectivo e inhibidor de la apertura de PTM, bloqueó la activación de las caspasas 9 y 3 inducida por MPP+. Esto corroboraría que el MPP+ provoca la apertura de PTM directamente o a través de mecanismos que implican un estrés oxidativo. El MPP+ puede provocar, en mitocondrias hepáticas aisladas, una apertura de PTM clásica que es bloqueada de forma incompleta por enzimas capturadoras de radicales libres y de forma más completa por S(-)-PPX. El péptido 25-35 BA neurotóxico también puede estimular la apertura de PTM en mitocondrias aisladas. Tanto el MPP+ como el péptido 2S-35 BA aumentan el estrés oxidativo en estudios de microdiálisis cerebral in vivo y en cultivos celulares neuronales in vitro, y se ha demostrado que el S(-)-PPX reduce tanto in vitro como in vivo el estrés oxidativo inducido por MPP+.

Ejemplo 2: Uso de pramipexol para tratar la ELA

Tanto en el caso de la esclerosis lateral amiotrófica familiar (ELAF) como en el caso de la ELA esporádica (ELAE), que es más frecuente, se han identificado anomalías oxidativas. El 2,3-DHBA es un producto derivado del salicilato hidroxilado que ha demostrado ser un marcador in vivo fiable de la elevada actividad de radicales libres y se ensaya de forma fiable mediante HPLC. Después de administrar una carga de salicilato vía oral a sujetos con ELAE se observaron niveles elevados de ácido 2,3-dihidroxibenzoico (2,3DHBA) y DHBA/salicilato. Tal como se describe aquí, 12 pacientes de ELAE fueron estudiados para determinar los niveles de 2,3-DHBA tanto antes como después del tratamiento con pramipexol.

Métodos

Preparación de los participantes

Este estudio se llevó a cabo en dos fases. En la primera fase se estudiaron once sujetos con ELAE confirmada que satisfacían los criterios de Airlie House y 7 controles. Estos participantes fueron sometidos a una carga de aspirina con análisis subsiguiente de 2,3-DHBA. Después de recibir 1,3 g de aspirina po, se les extrajo sangre 2, 3 y 4 horas más tarde. El suero se separó, se congeló y se guardó a -80ºC. A continuación se codificaron partes alícuotas del cuero y se prepararon para ensayos ciegos de 2,3-DHBA y salicilato.

En la segunda fase se seleccionaron aleatoriamente 17 sujetos con ELAE confirmada de una población clínica. Los sujetos recibieron 1,3 g de aspirina po y 3 horas después se les extrajo sangre. Después de la adquisición de estas muestras de referencia, los participantes con ELAE comenzaron la terapia con pramipexol. El aumento de las dosis se llevó a cabo de forma similar a la empleada con pacientes de EP, intentando alcanzar 1,5 mg t.i.d.- q.i.d. como dosis final después de una titulación de 7 semanas. Después, cada participante recibió su dosis de pramipexol máxima durante tres semanas y se realizó de nuevo el estudio de carga de aspirina. Doce de los diecisiete sujetos con ELAE iniciales pudieron completar la fase de aumento de dosis de pramipexol. De ellos, todos menos dos alcanzaron una dosis de pramipexol de 6 mg al día y todos los pacientes recibieron al menos una dosis de 3 mg al día. Después se ofreció a todos los participantes la oportunidad de continuar el tratamiento con pramipexol.

Preparación de las muestras

Preparación de suero: 0,9 ml de suero a 4ºC se mezclaron con 0,2 ml de ácido perclórico 1M y la mezcla se centrifugó a 15.000 r.p.m. durante 10 minutos en una microcentrifugfadora refrigerada.

Ensayo de 2,3-DHBA: 20 µl de sobrenadante se inyectaron por duplicado en una columna Adsorbosphere de “Catecolamina” C 18 (Alltech) con perfusión a 0,6 ml/min con un tampón consistente en 125 ml/l acetonitrilo, 1,5 gm/l de heptanosulfonato de sodio, 3 ml/l de trietilamina, 100 mg/l de Na2-EDTA y a pH final ajustado a 2,8 con ácido fosfórico. Para la detección se utilizó un detector electroquímico de flujo CouloChem II (ESA, con los siguientes ajustes: célula centinela = +600 mV; E1 = -100 mV; E2 = +400 mV). El 2,3-DHBA se eluyó a los 10-10,5 minutos bajo estas condiciones.

Ensayo de salicilato: 50 µl de sobrenadante se inyectaron por duplicado en una columna de HPLC C8 Kromosil (Alltech) con perfusión a 0,8-1,0 ml/min con 70% metanol/30% agua/0,5% ácido trifluoroacético. El salicilato se eluyó a los 6-7 minutos bajo estas condiciones y se detectó mediante absorción ultravioleta a 315 nM.

Resultados

La Figura 5A muestra el desarrollo con el tiempo del aumento de los niveles de 2,3-DHBA en suero en los 11 sujetos con ELAE (59,2  12,3 años) y los 7 sujetos de control de edades coincidentes (56,7  10,7 años) estudiados en la primera fase. Los pacientes de ELAE presentaban un intervalo de tiempo desde el comienzo de los síntomas de 10 a 156 meses, representando tanto las etapas agudas como las etapas crónicas de esta enfermedad. Los niveles máximos de 2,3-DHBA se detectaron en sujetos con ELAE 3 horas después de la dosificación de aspirina y este tiempo se eligió para la segunda fase del estudio. Además, un ANOVA de 2 vías reveló una diferencia en la producción de 2,3-DHBA al comparar los grupos con ELAE y los grupos de control a lo largo del tiempo. Esta diferencia era significativa al nivel p = 0,033 en las dos poblaciones; las pruebas posteriores (prueba de Tukey) no revelaron ninguna diferencia significativa entre tiempos individuales.

Como comparación adicional, las relaciones de 2,3-DHBA/salicilato se compararon a lo largo del tiempo en las dos poblaciones. En el grupo con ELA, este marcador normalizado de la producción de 2,3-DHBA aumentó aproximadamente 1,5 veces 3 horas después de la administración de aspirina. El ANOVA de 2 vías mostró una diferencia significativa al nivel p = 0,06 (Figura 5B). Los niveles de salicilato en suero de las poblaciones con ELA y de CTL no diferían de forma significativa a lo largo del tiempo (Figura 5C). De los 17 pacientes que iniciaron la segunda fase del estudio, 5 se retiraron debido a complicaciones de la enfermedad o a incapacidad para tolerar la medicación. Los participantes restantes eran 8 hombres y 6 mujeres. La edad media era de 63,2 años. Todos estos sujetos con ELA toleraron la terapia con pramipexol. Estos participantes no mostraron ningún indicio de demencia clínica ni presentaron ninguna inestabilidad cardiovascular significativa.

Los pacientes que participaron en este estudio representaban diversas etapas clínicas de la progresión de la enfermedad. Cuatro participantes no eran ambulatorios y dos de éstos dependían del respirador. Los otros ocho eran pacientes ambulatorios al comienzo del estudio. El tiempo medio desde la incorporación al estudio hasta la extracción final de sangre fue de 76,6 días dentro de un intervalo de 49-105 días.

Los niveles de 2,3-DHBA en suero se compararon antes y después del tratamiento con pramipexol. Todos los niveles individuales de 2,3-DHBA en suero se redujeron, sin excepción (Figura 6A). La Figura 6B muestra la media± EEM de la concentración de 2,3-DHBA en suero en los sujetos con ELA antes y después de alcanzar la dosificación estable de pramipexol. La reducción media fue de aproximadamente un 45% y resultó significativa al nivel p = 0,015. Los niveles de salicilato en suero (µM) permanecieron invariables tanto antes (18,8±7,2 D.E.) como durante el tratamiento con pramipexol (20,2±5,5 D.E.). La Figura 6C muestra que los niveles de 2,3-DHBA en suero normalizados a niveles de salicilato para cada sujeto se redujeron de promedio en un 59% mediante el tratamiento con pramipexol; la prueba-t mostró que esta diferencia era significativa al nivel p = 0,010.

Discusión

De acuerdo con este estudio, después de administrar una carga de

5 aspirina vía oral a pacientes de ELA se observaba que el estrés oxidativo in vivo aumentaba a aproximadamente el doble con respecto a un incremento de la producción de 2,3-DBHA. El aumento del 2,3-DBHA se observó en varias etapas de la progresión clínica de la enfermedad, lo que sugiere que este metabolito puede servir como marcador fiable del aumento del estrés oxidativo a lo largo de

10 todo este proceso patológico, pero en particular en las primeras etapas, cuando el diagnóstico frecuentemente es incierto. Debido al pequeño tamaño de la población no se hizo ningún intento de correlacionar el nivel de producción de 2,3-DBHA con la etapa de la enfermedad.

Este estudio también mostró que la terapia con pramipexol, en las dosis

15 generalmente toleradas en el caso de la enfermedad de Parkinson, redujo el estrés oxidativo in vivo en todos los sujetos con ELA. El suero de 12 pacientes antes y varias semanas después de alcanzar las dosis máximas toleradas de pramipexol mostró una reducción de aproximadamente un 45% del 2,3-DHBA basal y aproximadamente un 59% del 2,3-DHBA basal normalizado a nivel de

20 salicilato. Es probable que el pramipexol provocara esta reducción en la producción de EOR a causa de sus propiedades antioxidantes/de captura de radicales libres. Se ha comprobado que el pramipexol puede reducir la producción de EOR tanto in vitro en células de neuroblastoma SY5Y como in vivo en el cuerpo estriado de rata sumamente expuesto a la inhibición del

25 complejo I con metilpiridinio (Cassarino y col., J. Neurochem 1998; 71: 295-301). El pramipexol también reduce la producción de ERO cerebrales in vivo después de la infusión de la neurotoxina 6-hidroxidopamina (Ferger y col., Brain Res 2000; 883: 216-23), inhibe la liberación de citocromo C y reduce la oxidación de lípidos en el cerebro in vivo después del tratamiento con la proneurotoxina

30 MPTP.

Dado que se observan efectos neuroprotectores aproximadamente equivalentes en los enantiómeros R(+) y S(-) y que los efectos agonistas de dopamina residen principalmente en el enantiómero S(-), es probable que los efectos de captura de ERO no tengan ninguna relación con las propiedades

35 agonistas de dopamina. Si esto es cierto, el enantiómero R(+) de pramipexol debería ser tolerado en dosis mucho mayores que el enantiómero S(-) utilizado en el presente estudio, con el potencial de una mayor actividad antioxidante in vivo.

Los factores del estrés oxidativo están bien establecidos en la ELA esporádica, sin embargo la etiología del aumento del estrés oxidativo sigue estando poco clara. Los marcadores de daños por estrés oxidatvo en el SNC en caso de ELA incluyen un aumento de la tinción inmunohistoquímica en la médula espinal lumbar para el producto de peroxidación de lípidos y un aumento de los niveles de nitrotirosina y manganeso superóxido dismutasa nitrosilada en el líquido espinal. Estos resultados concuerdan con un aumento del daño a tejido de ELA por ERO que incluyen derivados de óxido nítrico.

Modelos animales y celulares de ELA también permiten comprender mejor el estrés oxidativo y la vulnerabilidad de las neuronas motoras. Las neuronas motoras de la médula espinal en caso de ELA tienen una actividad reducida de la citocromo C-oxidasa (según estudio histoquímico) y esta disminución de la función de la cadena transportadora de electrones puede servir para aumentar la producción de radicales libres de oxígeno. La microdiálisis de la médula espinal de ratones que tenían un gen de ELAF SOD1 humano mutante mostró un aumento de la producción de EOR y de los niveles de dialdehído malónico, lo que corrobora este concepto. Además existen informes que indican que una mutación de ELAF CuZn-SOD aumenta la vulnerabilidad de las neuronas motoras espinales a la muerte por excitotoxicidad, y implicando el mecanismo un aumento del estrés oxidativo. Por último, un aumento del estrés oxidativo en caso de ELA puede ser la causa del aumento de los marcadores de muerte celular apoptósica observados en la médula espinal en caso de ELA y de la implicación de las caspasas en la muerte de neuronas motoras en un modelo de ratón con ELA.

La patología mitocondrial se produce de forma temprana en el curso de la enfermedad de neuronas motoras experimental. Estas estructuras no sólo son sensibles a los daños por oxidación, sino que su disfunción conduce a una producción acelerada de radicales libres y a un posible deterioro del ADN mitocondrial. La visualización de la función mitocondrial en biopsias musculares en caso de ELA mostró una actividad reducida del complejo I y un análisis ultraestructural de dendritas celulares del asta anterior en caso de ELA mostró mitocondrias oscuras agregadas. La pérdida selectiva del transportador de aminoácido excitador 2 (EAAT2) glial alrededor de células del asta anterior en degeneración en caso de ELA puede reflejar un daño proteínico adicional que podría contribuir a un aumento de la excitotoxicidad.

Por consiguiente, el daño por oxidación en caso de ELA puede representar un proceso neurodegenerativo primario, un epifenómeno secundario de patología mitocondrial de las neuronas motoras o una combinación de ambos. Los estudios con cíbridos con amplificación de genes mitocondriales de ELAE han mostrado que un aumento del estrés oxidativo en caso de ELAE se puede entender en términos de una etiología genética mitocondrial primaria. No se sabe cómo el ADN mitocondrial se vuelve defectuoso en caso de ELAE; son posibles tanto mecanismos heredados por vía materna como mecanismos adquiridos esporádicamente.

El uso de mediciones de carga de salicilato y 2,3-DHBA como estimación de los niveles relativos de estrés oxidativo in vivo ha sido aplicado a la diabetes de comienzo en la madurez, la disfunción hepática en alcohólicos y artritis. Mútiples especies oxidantes pueden contribuir a la producción de 2,3-DHBA, incluyendo el radical hidroxilo y el anión de peroxinitrito. Por consiguiente no se puede asignar una fuente particular de EOR a los niveles de 2,3-DHBA observados, ni se pueden definir la o las fuentes tisulares de hidroxilación de salicilato elevada.

En resumen, en una serie de sujetos con ELAE se verificó un aumento de los niveles de 2,3-DHBA basal en suero, un marcador del estrés oxidativo, y dichos niveles se redujeron después del tratamiento con pramipexol. Como muestra la Figura 6, los niveles de 2,3-DHBA en suero individuales disminuyeron en pacientes de ELA después del tratamiento con S(-)-2-amino4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol. En particular, a los pacientes se les administró vía oral una dosis diaria de 3-6 mg de S(-)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro6-propilaminobenzotiazol durante siete semanas. Al final de las siete semanas se tomaron muestras de suero, se midió la concentración de 2,3-DHBA y se comparó con los niveles de 2,3-DHBA en las muestras de suero tomadas antes del tratamiento. Estos datos demuestran que el tratamiento con pramipexol reduce el estrés oxidativo in vivo en pacientes con ELA.

Ejemplo 3: Eficacia del pramipexol para reducir el estrés oxidativo inducido por MPTP in vivo

Métodos

Ratones C57BL/6 macho recibieron diariamente diclorhidrato de R(+)pramipexol en el agua durante 8 semanas en dosis calculadas para suministrar 0, 10, 30 ó 100 mg/kg/día. El día del estudio, a los ratones se les inyectaron vía subcutánea 30 mg/kg de la neurotoxina N-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina

5 (MPTP) para aumentar el estrés oxidativo en el cerebro. Una hora mas tarde se les inyectaron vía intraperitoneal 100 mg/kg de salicilato de sodio. Una hora después de la inyección de salicilato, los ratones fueron sacrificados y se analizaron sus cerebros anteriores para determinar el contenido de ácido 2,3dihidroxibenzoico (2,3-DHBA).

10 Como muestra la Figura 7, los resultados demuestran que un tratamiento con 30 y 100 mg/kg/día de R(+)-pramipexol reduce significativamente el estrés oxidativo en el cerebro anterior producido por MPTP. También se han llevado a cabo estudios de toxicología y no se ha detectado ningún indicio de efectos perjudiciales. En particular se realizó un estudio de toxicología durante 8

15 semanas en los ratones que habían recibido R(+)-PPX en el agua que bebían. Todos sus órganos principales fueron examinados en cuanto a posibles patologías y no se encontró ninguna lesión.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Utilización de una cantidad eficaz de pramipexol para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de pacientes de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), consistiendo el pramipexol en más de un 99% en R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.

2. 2.

   Pramipexol en una cantidad eficaz para su utilización en el tratamiento de pacientes de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), consistiendo el pramipexol en más de un 99% en R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6propilaminobenzotiazol o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.

3. 3.

   Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, consistiendo el pramipexol en R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6propilaminobenzotiazol.

4. 4.

   Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, debiendo ser administrado el pramipexol en una cantidad eficaz para mitigar y/o prevenir o eliminar los síntomas asociados con la ELA mediante la reducción del estrés oxidativo en el individuo.

5. 5.

   Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, debiendo ser administrado el pramipexol y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para prevenir o reducir considerablemente la muerte celular neuronal mediante la reducción de la formación de especies de oxígeno reactivo (EOR) y/o la restauración parcial del potencial bioléctrico en correlación con las membranas mitocondriales y/o el bloqueo de las vías de muerte celular apoptósica.

6. 6.

   Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, debiendo ser administrada la composición farmacéutica o el pramipexol en una dosis de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 500 mg al día de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.

7. 7.

   Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, debiendo administrarse el pramipexol en una cantidad de entre aproximadamente 3 mg/kg y aproximadamente 6 mg/kg al día.

8. 8.

   Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación

   5 2, debiendo administrarse el pramipexol por vía oral a humanos con ELA en dosis diarias entre 10 mg y 500 mg.
9. 9. Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, debiendo administrarse el pramipexol por una vía seleccionada de entre las vías tópica, oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial,

   10 intramedular, intratecal, intraventricular, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual y rectal.
10. 10. Utilización según la reivindicación 1 o pramipexol según la reivindicación 2, debiendo administrarse la composición de pramipexol en una dosis de entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 500 mg al día de más

    15 de un 99% de R(+)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-6-propilaminobenzotiazol o una sal farmacológicamente aceptable del mismo.