CN108348781B - 用于治疗与线粒体活性氧簇(ros)产生相关的疾病的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物用于预防和治疗疾病的用途，所述疾病的开始和/或发展涉及线粒体来源的活性氧簇(ROS)的产生和作用。

Description

用于治疗与线粒体活性氧簇(ROS)产生相关的疾病的化合物
技术领域
本发明涉及化合物用于预防和治疗疾病的用途，所述疾病的开始和/或发展涉及线粒体来源的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生和作用。
发明背景
线粒体是现在广泛公认的“衰老的自由基理论”的核心，并因此参与几乎所有衰老相关疾病的发病机理，包括心血管疾病、神经变性疾病(帕金森病、阿尔茨海默氏病等)、癌症和糖尿病以及缺血起源的组织功能障碍。该理论指出，由活性氧簇(ROS)引起的损害的累积影响许多细胞功能，特别是线粒体功能，其对于能量供应和最佳细胞功能是必不可少的。线粒体因此成为ROS的主要靶标，因为最佳细胞功能对于为细胞提供能量以修复自身是至关重要的。
有趣的是，线粒体是活性氧簇(ROS)的主要来源，因此特别易被氧化损伤所靶向。因此，ROS的线粒体自身产生导致氧化损伤，其导致线粒体功能障碍和细胞死亡。
针对ROS的生理和病理作用，已经测试了多种抗氧化剂。抗氧化剂研究已经提供了许多天然和设计的分子，这些分子针对不同来源的(即生理性的(细胞信号传导)或病理性的)ROS以不同的选择性调节ROS。然而，尽管ROS与许多疾病相关，并且抗氧化剂已经在许多临床前实验中显示出是有希望的，但几乎所有基于抗氧化剂的疗法的临床试验都显示出有限的功效(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-59)。
此外，最近的一些研究还表明，细胞中ROS的过度减少是有害的，并且似乎ROS产生的适当平衡对于细胞功能是必需的(Goodman et al.,2004Dec 1.J.Natl.Cancer Inst.96(23):1743-50；Bjelakovic G et al.,2007Feb 28.JAMA.297(8):842-57)。因此，对选择性抑制线粒体的ROS产生越来越感兴趣，其不会影响通过胞质ROS产生的细胞信号传导。
由于线粒体氧化损伤导致大量的人类疾病，因此已经开发了被设计成在体内被线粒体积累的抗氧化剂。这些靶向线粒体的抗氧化剂中研究最广泛的是MitoQ，其含有与亲脂性三苯基鏻阳离子共价连接的抗氧化剂醌部分。MitoQ现在已用于大鼠和小鼠的一系列体内研究以及两项II期人体试验中。现在高ROS产生的条件被更好地表征。似乎ROS可以在线粒体的呼吸链的多个位点产生(Quinlan CL et al.,2013May 23.Redox Biol.1:304-12)。最大超氧化物/H2O2产生在电子转运体(主要是醌)高度还原和高线粒体膜电位值的条件下发生。矛盾的是，当线粒体氧化磷酸化低(低肌肉收缩)时或在低氧条件(缺氧)下，这些条件得到满足。
申请人在此证明，AOL(茴三硫(Anethole trithione))不是作为典型的非特异性抗氧化剂分子起作用，而是更有趣地作为主要在线粒体呼吸链的复合物I的位点IQ处产生氧自由基(ROS)的直接选择性抑制剂，所述位点IQ是ROS产生的主要线粒体位点和线粒体功能障碍的主要负责位点。此外，申请人在此证明AOL不影响线粒体氧化磷酸化，表明不存在任何不良副作用，并且可能以长期方式治疗和/或预防与游离氧自由基相关的疾病。因此，AOL是第一个已知被许可用于人体使用(FDA上市许可)防止线粒体在位点IQ产生ROS的药物。
概述
本发明涉及用于治疗游离氧自由基相关疾病的活性氧簇(ROS)产生抑制剂。
在一个实施方案中，所述抑制剂是茴三硫(AOL)。
在一个实施方案中，所述抑制剂抑制ROS的线粒体产生。
在一个优选的实施方案中，所述抑制剂抑制在线粒体的复合物I的位点IQ处的ROS的线粒体产生。
在一个实施方案中，所述游离氧自由基相关疾病选自包括以下的组：年龄相关性黄斑变性、帕金森病、阿尔茨海默氏病、缺血和再灌注损伤、肺动脉高压、硬皮病、动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌梗塞、关节炎、肺毒性、心肺疾病、炎性疾病、癌症、转移、蒽环类药物的心脏毒性、不论来源的心力衰竭、缺血、心脏病发作、卒中、血栓形成和栓塞、哮喘、过敏性/炎症性状况、支气管哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、亨廷顿病、认知障碍、早老、早衰综合征(progeroid syndrome)、癫痫性痴呆、早老性痴呆、创伤后痴呆、老年性痴呆、血管性痴呆、HIV-1相关性痴呆、卒中后痴呆、唐氏综合征、运动神经元病、淀粉样变性(amyloidosis)、与11型糖尿病相关的淀粉样蛋白(amyloid)、Creutzfelt-Jakob病、坏死性细胞死亡、Gerstmann-Straussler综合征、库鲁病和动物瘙痒症、与长期血液透析相关的淀粉样蛋白、老年性心脏淀粉样蛋白和家族性淀粉样变性多发性神经病、脑病、神经内脏病症(neurospanchnic disorder)、记忆丧失、铝中毒、活受试者的细胞中铁水平降低、哺乳动物的游离过渡金属离子水平降低、患者体内或某些身体隔室具有毒性量的金属、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、白内障、糖尿病、癌症、肝脏疾病、皮肤老化、移植、氨基糖苷类药物的耳毒性继发效应、肿瘤和抗肿瘤或免疫抑制剂和化学品的毒性、先天性免疫应答和Friedreich共济失调。
在一个实施方案中，所述抑制剂用于预防转移。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
-“治疗(Treating)”或“治疗(treatment)”或“减轻(alleviation)”是指治疗性治疗和预防性或防御性措施；其中目的是预防或减缓靶向的病理状况或疾病。那些需要治疗的对象包括那些已经患有该疾病的对象，以及那些容易患上该疾病的对象或者那些待预防该疾病的对象。如果在接受根据本发明的治疗之后，受试者或哺乳动物显示可观察到的和/或可测量的以下一项或多项的减少或不存在，则成功地“治疗”了受试者或哺乳动物的疾病或病变或状况：减少ROS产生；和/或在一定程度上缓解与该特定疾病或状况相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率，以及改善生活质量问题。用于评估成功治疗和改善该疾病的上述参数可容易地通过医生熟悉的常规程序进行测量。
-“治疗有效量”是指在不对靶标产生显著的负面或不良副作用的情况下以以下为目标的药剂的水平或量：(1)延迟或防止与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况的发作；(2)减缓或停止与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况的一种或多种症状的进展、加重或恶化；(3)引起与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况的症状的改善；(4)降低与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况的严重程度或发病率；或(5)治愈与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况。可以在与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况发作之前施用治疗有效量，用于预防或防御作用。可选地或另外地，可以在与游离氧自由基相关的疾病、病症或状况开始之后施用治疗有效量，用于治疗作用。
-“药学上可接受的赋形剂”是指当施用于动物、优选人时不产生不利反应、过敏反应或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人体施用，制剂应符合监管部门(例如FDA局或EMA)要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
-“受试者”是指动物，包括人。在本发明的意义上，受试者可以是正在接受或已经接受过医学治疗或者监测疾病的发展的患者，即正在接受医疗关注的人。在一个实施方案中，受试者是雄性。在另一个实施方案中，受试者是雌性。
-“约”：在数字之前意指所述数字的值加上或减去10％。
详细描述
本发明的一个目的是用于治疗有需要的受试者的游离氧自由基相关疾病的方法，其包括施用有效量的线粒体活性氧簇(ROS)产生抑制剂。
本发明的另一目的是用于治疗游离氧自由基相关疾病的活性氧簇(ROS)产生抑制剂，其中所述抑制剂抑制线粒体产生ROS。
在一个实施方案中，本发明的抑制剂不影响生理性(胞质)ROS产生。在一个实施方案中，在本发明的抑制剂的存在下，对生理性(胞质)ROS产生的调节不超过5％(增加或减少)。
如本文所用，术语“不影响”是指通过本领域技术人员已知的用于测定ROS产生水平的技术测量，本发明的抑制剂没有作用。
在另一个实施方案中，本发明的抑制剂不是胞质ROS产生的抑制剂。
胞质ROS产生由总细胞ROS产生与线粒体ROS产生之间的差值决定。
在另一个实施方案中，本发明的抑制剂在ROS产生的上游起作用。
检测胞质ROS产生的试验在现有技术中以及对本领域技术人员而言是公知的。
这类试验的实例包括：
-总细胞ROS产生的测量：5-(和-6)-氯甲基-2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸乙酰基酯(CM-H2DCFDA)和/或H2DCFDA是细胞中胞质活性氧簇(ROS)的指示剂。CM-H2DCFDA被动地扩散到细胞中，其中其乙酸酯基团被细胞内酯酶切割，其硫醇反应性氯甲基与细胞内谷胱甘肽和其他硫醇反应。随后的氧化产生荧光加合物，其被捕获在细胞内，从而促进长期研究(Zhang,X.et al.,2008.J.Cardiovasc.Pharmacol.51(5):443-449；Sarvazyan,N.,1996.Am.J.Physiol.271(5Pt 2):H2079-2085)。
-细胞中线粒体ROS产生的测量：测量完整细胞中的细胞内ROS并将来源归属于线粒体要困难得多。近年来，对线粒体功能至关重要的质子动力已被开发用于利用亲脂性三苯基鏻阳离子TPP(+)作为“递送”缀合物来将多种化合物靶向于高度负电的线粒体基质。其中，MitoSOX Red(也被称为线粒体-氢乙锭(mito-hydroethidine)或线粒体-二氢乙锭(mito-dihydroethidium))普遍用于线粒体ROS估计。MitoSOX的TPP(+)部分使得ROS敏感性氢乙啶在线粒体基质中流形(manifold)积累，并且超氧化物对氢乙啶的氧化产生特定的荧光氧化产物2-羟基乙锭(Zhao,H.et al.,2005.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102(16):5727-5732；Polster,B.M.et al.,2014.Methods Enzymol.547:225-250)。
在一个实施方案中，本发明的抑制剂是线粒体活性氧簇产生的选择性抑制剂。
如本文所用的术语“选择性抑制剂”还指能够抑制在复合物I的位点IQ处的ROS产生同时对其余位点的ROS产生以及对线粒体膜电位(ΔΨm)和氧化磷酸化最有最小作用的化合物。例如，在分离的线粒体上，在鱼藤酮(rotenone)(即位点IQ处的ROS产生被抑制时)和抗霉素A(antimycin A)(即ROS主要由复合物III产生时)的存在下，化合物抑制ROS产生的EC50比不存在鱼藤酮时高约5、6、7、8、9、10、15、20倍。
在一个实施方案中，如本文所用的术语“选择性抑制剂”是指能够抑制在复合物I的位点IQ处的线粒体ROS产生且EC50为约10μM的化合物。在另一个实施方案中，所述化合物在NAD(P)H氧化酶ROS产生的体外测定中不显著抑制胞质ROS产生。
在另一个实施方案中，本发明的抑制剂或选择性抑制剂是在线粒体呼吸链的复合物I的位点IQ处的ROS产生的选择性抑制剂。
如本文所用的术语“选择性抑制剂”还指能够抑制在复合物I的位点IQ处的ROS产生同时对其余位点的ROS产生以及对线粒体膜电位(ΔΨm)和氧化磷酸化具有最小作用的化合物。例如，在分离的线粒体上，存在鱼藤酮时(即位点IQ处的ROS产生被抑制时)，化合物抑制ROS产生的EC50比存在抗霉素A时(即ROS主要由复合物III产生时)高约5、6、7、8、9、10、15、20倍。
已将鱼藤酮和神经毒素MPP+抑制复合物I的活性与啮齿动物和人的帕金森症关联起来，这表明功能障碍的复合物I、ROS产生和神经变性之间存在联系。因此能够抑制复合物I的ROS产生的化合物可用于治疗。
专门检测在从各种组织分离的线粒体上在线粒体呼吸链的复合物I的位点IQ处产生的ROS的试验是本领域技术人员熟知的。
还描述了用于鉴定在分离的线粒体中限定位点处的ROS产生抑制剂而不改变能量产生的高通量测定。该测定鉴定了ROS产生的位点特异性调节剂，同时也揭示了特异性较差的效应物，如广谱抗氧化剂和线粒体生物能量的多种抑制剂。因此，可以鉴定区分在电子传递链内的特定位点上不期望的电子漏到氧上(ROS产生)而不改变跨线粒体内膜的正常能量耦合电子和质子通量的抑制剂。测定修改了标准的使用染料Amplex UltraRed(Invitrogen)的线粒体ROS产生的基于荧光的测定和使用电位测定染料TMRM(Invitrogen)的ΔΨm的基于荧光的测定以适应于高通量微孔板形式。提供了用于稳健检测新鲜分离的骨骼肌线粒体中的功能调节的五种ROS和一种ΔΨm测定的核心组。通过改变添加到常用测定混合物中的底物和抑制剂，可以分别靶向ROS产生的五个主要位点(位点IQ、IF、IIIQO、SDH和mGPDH)。可以平行运行用于监测ΔΨm的反相筛选(counterscreen)以排除可能是正常线粒体能量产生的一般抑制剂或解联剂的化合物。
在另一个实施方案中，针对所有测定一式两份地在2.5μM下测试抑制剂。终点荧光相对于每个板上包括的DMSO和已知的线粒体抑制剂对照孔标准化。在每个ROS测定中的阳性命中(hit)可以通过在该测定中应用优选15％或更优选18％或甚至更优选20％或更大降低的阈值进行初始过滤。每种ROS测定可以用作针对其他测定的反相筛选，同时还排除了在基于TMRM的反相筛选中改变ΔΨm的化合物。因此，随后可以评估过滤的命中以排除将其他ROS测定改变超过例如20％或18％或15％或将ΔΨm改变超过优选10％或更优选5％或甚至更优选4％的那些化合物。
在另一个实施方案中，作为在ROS产生的单个位点处的ROS产生选择性抑制剂的抑制剂将ROS产生位点IQ、IF、IIIQO、SDH和mGPDH中的一个位点处的ROS产生降低大于18％，同时对ROS产生的其余位点处的ROS产生的影响低于10％。
呼吸链的复合物I可以从两个不同的位点生成ROS：泛醌结合位点和黄素单核苷酸位点。
复合物I的泛醌结合位点(IQ)：
为了专门分析IQ的ROS产生，可以使用5mM琥珀酸盐作为底物向呼吸链供应电子。IQROS产生对跨线粒体内膜的质子动力(PMF)(PMF＝ΔΨm+ΔpH)的变化异常敏感。因此，可以利用在评价IQ ROS测定中命中的选择性时用于ΔΨm测定的保守阈值。
位点IQ的电子漏在强PMF存在下从还原泛醌库(reduced Q-pool)经由CI反向传递到基质NAD+期间被表征得最好。通过实验，有利于IQ ROS产生的条件被认为与生理学相去甚远，导致许多人忽视其相关性，尽管其具有高速率的能力。然而，即使当提供较低浓度的谷氨酸盐(以通过CI正向供给电子)和琥珀酸盐(以反向供给电子)时，呼吸线粒体仍然产生显著水平的鱼藤酮敏感性ROS(即IQ ROS)。此外，比较分析显示位点IQ(但不是位点IF)的最大ROS产生与跨越不同脊椎动物物种的最大寿命之间呈相反关系(Lambert,A.et al.,2007.Aging Cell.6(5):607-18；Lambert,A.et al.,2010.Aging Cell.9(1):78-91)。因此，IQ ROS的选择性调节剂将提供独特的机会来探索线粒体ROS产生在正常过程和病理过程中的推定作用。
复合物I的黄素结合位点(IF)：
为了专门分析IF的ROS产生，向呼吸链供应电子的底物溶液可以包含5mM谷氨酸盐、5mM苹果酸盐和4μM鱼藤酮。位点IF以与线粒体基质中还原状态的NADH库成比例的速率产生ROS(Treberg,J.et al.,2011.J.Biol.Chem.286(36):31361-72)。用杀虫剂鱼藤酮阻断位点IQ可以通过防止黄素氧化来增加位点IF的ROS产生。相比于位点IQ和IIIQO，复合物I的黄素结合位点(位点IF)的最大ROS产生相对较低，并且这可能导致该测定中更高的变异性，并且随后在原始筛选中命中呼叫的假阳性率更高。
在另一个实施方案中，本发明的抑制剂没有显著地影响直接在线粒体上的氧化磷酸化，优选对氧化磷酸化的调节小于10％、9％、8％、7％、6％、5％。
与游离氧自由基相关的疾病涉及氧化应激失衡和线粒体功能障碍。特别是，与线粒体功能障碍相关的疾病是由线粒体ROS产生引起的。
与游离氧自由基相关的疾病包括但不限于：衰老疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、早衰综合征、帕金森综合征、神经疾病、缺血和再灌注损伤、感染性疾病、肌肉疾病、肺、肾和肝脏疾病。
衰老疾病包括但不限于：年龄相关性黄斑变性(AMD)、皮肤老化、对皮肤的UV损伤、变薄、下垂、起皱纹、出现老年斑、血管破裂和干燥区域、脂溢性角化病、日光性角化病、Kindler综合征、Bowen病、皮肤癌、关节炎、强直性脊柱炎、炎性多关节病(inflammatorypolyarthropathies)、膝关节炎、流行性多关节炎、银屑病性关节炎、白内障、耳聋、癌症、转移、转移过程预防(metastasis processes prevention)、肝脏疾病、移植、肿瘤和抗肿瘤或免疫抑制剂和化学品的毒性、骨质疏松症、皮肤异色病、肢端早老症、遗传性硬化性皮肤异色病、先天性角化不良症、着色性干皮病、Bloom综合征、Fanconi贫血症、Cockayne综合征和污染诱发的疾病。
自身免疫疾病包括但不限于：多发性硬化、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、I型糖尿病、克罗恩氏病；重症肌无力、Grave病、硬皮病、Sjogren综合征、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、银屑病。自身免疫疾病可以是与血液病症有关的自身免疫疾病，如自身免疫性溶血性贫血症、恶性贫血症和自身免疫性血小板减少症。自身免疫疾病还可以是颞动脉炎(temporal areritis)、抗磷脂综合征、血管炎，如Wegener肉芽肿和Behcet病。其他自身免疫疾病包括多肌炎、皮肌炎、脊椎关节病，例如强直性脊柱炎、抗磷脂综合征和多发性肌炎(polymyocysitis)。
心血管疾病包括但不限于：高血压、抗癌药物的心脏毒性、蒽环类药物的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性、不论来源的心力衰竭、缺血、心脏病发作、卒中、动脉粥样硬化、心脏纤颤、高血压、血栓形成和栓塞、过敏性/炎症性状况，如支气管哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、II型糖尿病、糖尿病和耳聋(DAD)或Ballinger-Wallace综合征、炎性疾病、风湿热、肺动脉高压、先天性免疫应答、心肺疾病，如：慢性阻塞性肺病、肺栓塞、心包炎、主动脉缩窄、法洛四联症、主动脉狭窄、二尖瓣狭窄、主动脉返流、二尖瓣反流、肺尘症、支气管扩张、心肌病、内皮硝酸甘油耐受。
早衰综合征包括但不限于：早老、Bloom综合征、Cockayne综合征、De Barsy综合征、先天性角化不良症、限制性皮肤病、Rothmund–Thomson综合征、毛发硫营养不良(trichothiodystrophy)、Werner综合征、Wiedemann-Rautenstrauch综合征、着色性干皮病。
帕金森综合征包括但不限于：帕金森病(PD)、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、皮质基底节变性或路易体痴呆、毒素诱导的帕金森病和PD的早发型变体，如常染色体隐性PARK6-相关帕金森症或常染色体隐性PINK1-相关帕金森症。
神经疾病包括但不限于：痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森病和衰老、亨廷顿病、Friedreich共济失调、Wilson病、Leigh综合征、Kearns–Sayre综合征、Leber遗传性视神经病、认知障碍、心境障碍、运动障碍、迟发性运动障碍、脑损伤、细胞凋亡、痴呆、癫痫、癫痫性痴呆、早老性痴呆、创伤后痴呆、老年性痴呆、血管性痴呆、HIV-1相关性痴呆、卒中后痴呆、精神分裂症、唐氏综合征、运动神经元病、淀粉样变性、与II型糖尿病相关的淀粉样蛋白、Creutzfelt-Jakob病、坏死性细胞死亡、Gerstmann-Straussler综合征、库鲁病和动物瘙痒症、与长期血液透析相关的淀粉样蛋白、老年性心脏淀粉样蛋白和家族性淀粉样变性多发性神经病、脑病、神经内脏病、记忆丧失、铝中毒、活受试者的细胞中铁水平降低、哺乳动物的游离过渡金属离子水平降低、患者体内或某些身体隔室具有毒性量的金属、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、运动盲(akinetopsia)、酒精相关痴呆、原发性年龄相关性tau蛋白病、命名性失语、病感失认、失用症、言语失用症、听觉性言语认识不能、额颞叶痴呆、额颞叶变性、少词型进行性失语(logopenic progressive aphasia)、神经原纤维缠结、声音失认症(phonagnosia)、Pick病、原发性进行性失语、进行性非流利性失语、语义性痴呆、类固醇痴呆综合征、视觉空间认知不全(visuospatial dysgnosia)、氨基糖苷类的耳毒性继发效应、可卡因中毒。
缺血和再灌注损伤包括但不限于：卒中、脑缺血、脑干卒中综合征、颈动脉内膜切除、小脑卒中综合征、脑全色盲、脑出血、脑梗塞、脑静脉窦血栓形成、实质内出血、颅内出血、腔隙性卒中、侧髓综合征、脑桥外侧部综合征(lateral pontine syndrome)、部分前循环梗塞、后循环梗塞、静息性卒中(silent stroke)、卒中相关(stroke Association)、卒中带(stroke belt)、卒中康复、短暂性缺血发作、Watershed卒中、Weber综合征、肥胖、移植器官保存、缺血、再灌注损伤。
感染性疾病包括但不限于：丙型肝炎、败血症、感染性肌病、败血性休克。
肌肉疾病包括但不限于：肌病、线粒体肌病、面肩肱型肌营养不良、1型面肩肱型肌营养不良、2型面肩肱型肌营养不良、兰尼碱受体1(Ryanodine Receptor 1，RYR1)相关肌病、硒蛋白1(SEPN1)相关肌病Kearns–Sayre综合征、心肌病、运动障碍、制动诱导的肌肉萎缩(immobilization-induced muscle atrophy)、骨骼肌烧伤、Dupuytren挛缩。
肺、肾和肝脏疾病包括但不限于：囊性纤维化、哮喘、污染诱发的疾病、心肺疾病、肺动脉高压、慢性阻塞性肺病、肺栓塞、肺尘症、支气管扩张、支气管哮喘、呼吸机诱导膈膜功能障碍、肺癌、酒精性脂肪肝病、脂肪肝病、糖尿病、离体肾保存、丙型肝炎中的肝脏炎症、I型糖尿病中的肾损伤、肝硬化。
在本发明中特别待治疗的疾病是衰老疾病、AMD、皮肤老化、心血管疾病例如蒽环类药物的心脏毒性、早老和早衰综合征、帕金森病、阿尔茨海默氏病、Friedreich共济失调、缺血再灌注、心肺疾病、哮喘、癌症、转移、污染诱发的疾病。
在一个实施方案中，本发明中特别待预防的疾病是转移。事实上，ROS产生参与肿瘤生长和转移的机制(一种命名为“转移性线粒体开关”的机制)：通过自然选择与ROS产生和异常TCA循环活性相关的线粒体表型促进了肿瘤细胞迁移、侵袭、克隆生成、转移性摄取和自发性转移(Porporato et al.,2014.Cell Reports.8:754-766)。ROS高产也促进血管生成，并且互惠地，ROS产生的抑制剂是抗血管生成产品。
在一个实施方案中，本发明的抑制剂或选择性抑制剂具有下式之一：
Figure BDA0001653039740000111
1,2二硫戊环类抑制剂
Figure BDA0001653039740000112
1,2二硫杂环戊烯类抑制剂
Figure BDA0001653039740000113
1,3二硫杂环戊烯类抑制剂
Figure BDA0001653039740000114
1,3二硫戊环类抑制剂
及其氧化物、衍生物和代谢物，其中
Z是S、O、NR、R2或CR2；
R是-H、-OH、C1-C5烷基、C1-C5烷氧基或C1-C5烷氧基羰基；
R2与它所键合的原子一起包含螺环；
R1、R2、R3和R4独立地为-H、-烷基、-芳基、-烷基芳基、杂环、卤素、-烷氧基羰基(C1-C5)或-羧基；
其中每个烷基是C1-C10直链或支链、饱和或不饱和部分，其任选地被1个、2个或更多个独立地选自以下的基团取代：醚(--O--)、卤素、烷基(C1-C5)、--OH、烷氧基(C1-C5)、烷氧基羰基(C1-C5)、羧基、酰氨基、烷基酰氨基(C1-C5)、氨基、单或二烷基氨基(C1-C5)、烷基氨基甲酰基(C1-C5)、巯基、烷硫基(C1-C5)或苯型芳基；并且
其中R1、R2、R3和R4的-芳基和-烷基芳基取代基包含苯型基团(C6-C14)，其中苯型基团任选地被1个、2个或更多个独立地选自以下的基团取代：--SO3H、卤素、烷基(C1-C5)、--OH、烷氧基(C1-C5)、烷氧基羰基(C1-C5)、羧基、酰氨基、烷基酰氨基(C1-C5)、氨基、单或二烷基氨基(C1-C5)、烷基氨基甲酰基(C1-C5)、巯基、烷硫基(C1-C5)；并且
其中杂环被定义为任何饱和或不饱和的4元、5元或6元任选取代的杂环，其含有1-3个选自N、O和S的环原子，其余的环原子是碳；并且其中所述芳基或所述杂环上的所述取代基选自卤素、烷基(C1-C5)、羟基、烷氧基(C1-C5)、烷氧基羰基(C1-C5)、羧基、酰氨基、烷基酰氨基(C1-C5)、氨基、单或二烷基氨基(C1-C5)、烷基氨基甲酰基(C1-C5)、巯基、烷硫基(C1-C5)、苯型、芳基、氰基、硝基、卤代烷基(C1-C5)、烷基磺酰基(C1-C5)或磺酸酯，或者
R1和R2之一以及R3和R4之一与它们所连接的碳原子一起包含稠合双环或三环化合物，其为饱和或不饱和的杂环或碳环，并且其中环全部是任选取代的5-、6-、7-或8-元环，且取代基任选地选自烷基、烷氧基、--SO3H、--OH和卤素，或者
R1和R2一起或R3和R4一起独立地为肟(═NOH)。
1,2二硫戊环类抑制剂的实例包括但不限于：硫辛酰胺(1,2二硫戊环)；1,2-二硫戊环-4-羧酸；4-辛基-l,3-二硫戊环-2-硫酮；4-癸基-l,3-二硫戊环-2-硫酮；4-十二烷基-l,3-二硫戊环-2-硫酮；4-十四烷基-l,3-二硫戊环-2-硫酮和l,3-二硫戊环-2-硫酮。
1,2二硫杂环戊烯类抑制剂的实例包括但不限于：4-甲基-5-(2-吡嗪基)-3-二硫杂环戊烯硫酮(奥替普拉(oltipraz))；5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(茴三硫或AOL)、茴香脑二硫杂环戊烯硫酮(ADT)、ADO、1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮；5-(4-苯基-1,3-丁二烯基)-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮、5-4(4-氯苯基)-1,3-丁二烯基-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮、5-{4-(4-甲氧基苯基)-1,3-丁二烯基}-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮、5-{4-(对甲苯甲酰基)-1,3-丁二烯基}-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮、5-{4-(邻氯苯基)-1,3-丁二烯基}-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮和5-{4-(间甲基苯基)-1,3-丁二烯基}-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮。
1,3二硫杂环戊烯类抑制剂的实例包括但不限于1,3-二硫杂环戊烯-2-亚基丙二酸二异丙酯(马洛替酯(malotilate))；1,3-二硫杂环戊烯并(4.5-d)-1,3-二噻英-2-硫酮(1,3-dithiolo(4.5-d)-1,3-dithiino-2-thione)；1,3-二硫杂环戊烯并(4.5-d)-1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮；5-氯-1,3-二硫杂环戊烯并(4.5-d)-1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮；和5-氰基-13-二硫杂环戊烯并(4.5-d)-1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮。
1,3二硫戊环类抑制剂的实例包括但不限于：5-(1-羰基-L-氨基酸)-2,2-二甲基-[1,3]二硫戊环-4-羧酸；六氢-1-3-苯并二硫杂环戊烯-2-硫酮；4-辛基-1,3-二硫戊环-2-硫酮；4-癸基-1,3-二硫戊环-2-硫酮；4-十二烷基-1,3-二硫戊环-2-硫酮。
本发明的抑制剂或选择性抑制剂优选选自：5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(茴三硫或AOL)、茴香脑二硫杂环戊烯硫酮(ADT)、ADO、1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮、1,2-二硫戊环、1,3-二硫杂环戊烯-2-硫酮、4-甲基-5-(2-吡嗪基)-3-二硫杂环戊烯硫酮(奥替普拉)和1,3-二硫杂环戊烯-2-亚基丙二酸二异丙酯(马洛替酯)，或其衍生物或类似物。
本发明的抑制剂或选择性抑制剂的实例包括但不限于：
Figure BDA0001653039740000131
Figure BDA0001653039740000141
在一个实施方案中，本发明的抑制剂是：
Figure BDA0001653039740000151
5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(AOL)。
在一个实施方案中，本发明的抑制剂不是螯合剂，优选不是Fe和/或Cu的螯合剂。
在一个实施方案中，本发明的抑制剂不是奥替普拉。
在一个实施方案中，抑制剂或选择性抑制剂选自以下专利申请US2004/053989中描述的那些。
在另一个实施方案中，抑制剂或选择性抑制剂选自以下专利中描述的那些：US3,040,057；EP0576619；US3,576,821；US3,959,313；US3,109,772。
在一个实施方案中，抑制剂不是N-环己基-4-(4-硝基苯氧基)苯磺酰胺。
本发明还涉及用于治疗有需要的受试者的与游离氧自由基关的疾病的组合物，其包含如上文所述的抑制剂，或由如上文所述的抑制剂组成，或基本上由如上文所述的抑制剂组成。
本发明还涉及用于治疗游离氧自由基相关疾病的组合物，其中所述组合物包含线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂，或由线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂组成，或基本上由线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂组成。
本发明还涉及用于治疗有需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病的药物组合物，其包含如上文所述的抑制剂以及至少一种药学上可接受的赋形剂，或由如上文所述的抑制剂以及至少一种药学上可接受的赋形剂组成，或基本上由如上文所述的抑制剂以及至少一种药学上可接受的赋形剂组成。
本发明还涉及用于治疗游离氧自由基相关疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂和至少一种药学上可接受的赋形剂组成，或基本上由线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂和至少一种药学上可接受的赋形剂组成。
本发明还涉及用于治疗有需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病的药物，其包含如上文所述的抑制剂或由如上文所述的抑制剂组成，或基本上由如上文所述的抑制剂组成。
本发明还涉及用于治疗游离氧自由基相关疾病的药物，其中所述药物包含线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂，或由线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂组成，或基本上由线粒体ROS产生抑制剂或选择性抑制剂组成。
合适的赋形剂包括水、盐水、林格溶液、右旋糖溶液和乙醇溶液、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、磷酸盐、乙酸盐、明胶、胶原蛋白、
Figure BDA0001653039740000161
植物油等等。还可以额外地包括合适的防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂和缓冲剂，例如BHA、BHT、柠檬酸、抗坏血酸、四环素等。
可以用于本发明的组合物中的药学上可接受的赋形剂的其他实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
另外，一些赋形剂可以包括表面活性剂(例如羟丙基纤维素)；合适的载体例如含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物的溶剂和分散介质，和植物油例如花生油和芝麻油；等渗剂，例如糖或氯化钠；包衣剂，例如卵磷脂；延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶；防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等；缓冲剂，例如硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、乙酸钠、磷酸二氢钠等；张度剂，例如葡聚糖40、葡聚糖70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠；抗氧化剂和稳定剂，例如亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等；非离子润湿剂或澄清剂，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊；粘度改性剂，例如葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿脂、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等等。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物为全身或局部施用的。
在一个实施方案中，本发明的组合物，药物组合物或药物为口服、通过注射、局部、经鼻、经颊、直肠、阴道、气管内、通过内窥镜、透粘膜和经皮施用施用的。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物被注射，优选被全身注射。适应于全身注射的制剂的实例包括但不限于：液体溶液或悬浮液、适于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。全身注射的实例包括但不限于静脉内、皮下、肌肉内、真皮内和腹膜内注射以及灌注。在另一个实施方案中，当注射时，本发明的组合物、药物组合物或药物是无菌的。获得无菌药物组合物的方法包括但不限于GMP合成(GMP代表“良好生产规范”)。
在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物是口服施用的。适应于口服施用的制剂的实例包括但不限于：固体形式、液体形式和凝胶。适应于口服施用的固体形式的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊、软明胶胶囊、硬明胶胶囊、囊片、压制片剂、扁囊剂、糯米纸(wafer)、糖衣丸剂、糖衣片剂或分散或崩解片剂、粉剂、适于在口服施用之前溶解或悬浮于液体中的固体形式和泡腾片剂。适应于口服施用的液体形式的实例包括但不限于溶液、悬浮液、可饮用溶液、酏剂、密封小瓶剂、药物软饮(potion)、灌服剂、糖浆和液剂。
在另一个实施方案中，局部施用本发明的组合物、药物组合物或药物。适应于局部施用的制剂的实例包括但不限于棒、唇膏、蜡、乳膏、洗剂、软膏、香膏、凝胶、光泽唇膏(gloss)、防晒制品、化妆品、面膜、免洗或清洁剂、脱毛制剂和/或类似制剂。
局部施用的特征为将本发明的组合物、药物组合物或药物直接递送、施用或施加于感兴趣的部位以实现局部效应(通常在其一个或多个暴露表面或外表面上，如暴露的或视觉可观察的表皮的最外层)，例如使用手、手指或各种涂抹器(卷起、滚动或其他棒状容器、管状容器、棉球、粉扑、棉签(Q-tip)、泵、刷子、垫子、布和/或类似物)。例如，可以通过铺展、放置、摩擦、扫、倾倒、延展和/或按摩到皮肤中或皮肤上或通过任何其他方便的或合适的方法进行施加。优选地，在没有任何显著吸收组合物的组分到受试者的血流中(以避免全身作用)的情况下实现局部施用。
本发明的组合物、药物组合物或药物可以与例如作为防腐剂的1％或2％(wt/wt)苯甲醇、乳化蜡、甘油、棕榈酸异丙酯、乳酸、纯化水和山梨醇溶液混合以形成白色、细腻、均匀、不透明的乳膏或洗剂。另外，组合物可以含有聚乙二醇400。它们可以与例如作为防腐剂的2％(wt/wt)苯甲醇、白矿脂、乳化蜡和tenox II(丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、柠檬酸、丙二醇)混合形成软膏。编织垫或绷带材料卷，例如纱布可以用溶液、洗剂、乳膏、软膏或其他形式的组合物浸渍，这样的形式也可以用于局部施加。
本发明的一个目的是包含本发明的抑制剂的化妆品组合物。
本发明的另一个目的是包含本发明的抑制剂的药用化妆品组合物。
在另一个实施方案中，本发明的组合物还可以使用透皮系统局部施加，如具有用组合物浸渍并层压至不可渗透的背衬的树脂交联剂的基于丙烯酸的聚合物粘合剂中的一种。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以作为透皮贴剂施用，更具体地作为缓释透皮贴剂施用。透皮贴剂可以包括任何常规形式，例如粘合剂基质、聚合物基质、储库贴剂、基质或单片型层压结构，并且通常包括一个或多个背衬层、粘合剂、渗透促进剂、任选速率控制膜和在施加之前移除以暴露粘合剂的释放衬垫。聚合物基质贴剂还包含聚合物基质形成材料。合适的透皮贴剂更详细地描述于例如美国专利号5,262,165；5,948,43；6,010,715和6,071,531，其中每一个专利的公开内容整体并入本文。
适应于透皮施用的制剂的实例包括但不限于软膏、糊剂、乳膏、膜剂、香膏、贴剂，例如透皮贴剂、凝胶、脂质体形式等。
在一个实施方案中，透皮组合物是软膏、糊剂、乳膏；膜剂、香膏、贴剂，例如透皮贴剂、凝胶、脂质体形式等。
在本发明的一个实施方案中，软膏是油性软膏；乳化软膏，例如水包油或油包水软膏；或水溶性软膏，优选为油性软膏。
在本发明的一个实施方案中，油性软膏使用基质，例如植物油和动物油；植物和动物脂肪；蜡；凡士林，例如白凡士林或凡士林油；和石蜡，例如液体石蜡或石蜡油。
在本发明的一个实施方案中，透皮组合物还包含一种或多种赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员公知的。合适的赋形剂的实例包括但不限于载体、乳化剂、硬化剂、流变改性剂或增稠剂、表面活性剂、润肤剂、防腐剂、湿润剂、缓冲剂、溶剂、保湿剂和稳定剂。
在另一个实施方案中，特定的施用途径可以是眼内施用。在另一个实施方案中，施用途径可以是局部眼部施用，例如施用滴眼剂或通过在包含本发明的抑制剂的眼用溶液中洗涤眼睛。
眼用溶液是指预期用于施用于眼球上和/或结膜，或者用于插入结膜囊中或用于施用于眼睛后段中的无菌液体、半固体或固体制剂。如本文所用，术语“眼睛后段”是指眼睛的后三分之二，包括前玻璃体膜(anterior hyaloids membrane)和其后的结构(玻璃体液、视网膜、脉络膜、视神经)。特别地，眼用组合物可以例如通过玻璃体内注射施用到玻璃体。眼用组合物的实例包括但不限于滴眼剂、眼用洗剂、滴眼剂粉末和眼用洗剂粉末，以及注射到结膜囊内或注射到玻璃体内的组合物。
载体的实例包括但不限于水；缓冲盐水；矿油(凡士林，又称白软石蜡)；矿脂；油，例如矿物油、植物油、动物油、石蜡油、蓖麻油或凡士林油；有机和无机蜡，例如微晶、石蜡、蜂蜡和地蜡；天然聚合物，例如黄原胶、明胶、纤维素、胶原、淀粉或阿拉伯树胶；合成聚合物；醇；多元醇；等等。在本发明的一个实施方案中，载体是基础乳膏，其包含乳化剂、油相成分和水相成分。
公知的软膏或洗剂基质赋形剂的实例包括但不限于凡士林、PlastibaseTM(其是用聚乙烯(平均分子量为约21000Da)和液体石蜡制备的基质)或ESMA-PTM(由微晶蜡制成)。
乳化剂的实例包括但不限于鲸蜡醇；鲸蜡硬脂醇；硬脂醇；羧基聚亚甲基；聚卡波非(polycarbophil)；聚乙二醇及其衍生物；聚氧乙烯及其衍生物，例如聚山梨酯20或聚山梨酯80，单独地或与脂肪醇例如鲸蜡醇、硬脂醇和鲸蜡硬脂醇组合；和脱水山梨醇酯，例如脱水山梨醇脂肪酸酯。
油相成分的实例包括但不限于凡士林，例如白凡士林、黄凡士林或凡士林油；石蜡，例如液体石蜡或石蜡油；二甲聚硅氧烷及其混合物。
水相成分的实例包括但不限于水、甘油和丙二醇。
硬化剂的实例包括但不限于硬脂醇、鲸蜡硬脂醇和鲸蜡醇。
流变改性剂或增稠剂的实例包括但不限于卡波姆，例如
Figure BDA0001653039740000201
和聚氧乙烯牛脂胺，例如
Figure BDA0001653039740000202
表面活性剂的实例包括但不限于阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、十二烷基硫酸镁、蜡或其组合。
润肤剂的实例包括但不限于白矿脂或黄矿脂(白凡士林或黄凡士林)、液体矿脂(液体凡士林)、石蜡或优色林(aquaphor)。
防腐剂的实例包括但不限于抗微生物防腐剂，例如尼泊金(羟基苯甲酸甲酯)、尼泊索(nipasol)(羟基苯甲酸酯)、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯钾、对羟基苯甲酸丙酯钠；对羟基苯甲酸酯；山梨酸；山梨酸钾；苯甲酸；对羟基苯甲酸酯；氯丁醇；苯酚；硫柳汞；苯甲酸钠和苯甲醇。
湿润剂的实例包括但不限于丙二醇和藻酸丙二醇酯。
缓冲剂的实例包括但不限于氢氧化钠、柠檬酸和氢氧化钾。
溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、苯甲醇和丙二醇。
保湿剂的实例包括但不限于甘油、矿物油、聚氧乙烯硬化蓖麻油和凡士林、丙二醇；石蜡；蜡，例如蜂蜡；聚乙二醇或其混合物，例如macrogol(macrogol是不同分子量的聚乙二醇的混合物)；硬脂醇；苯甲醇；对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸酯)；胶凝烃；柠檬酸；角鲨烯；羊毛脂；甘油；聚氧乙烯硬化蓖麻油；脱水山梨醇脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯；动物和植物脂肪；油；淀粉；黄蓍胶；纤维素衍生物；硅酮；膨润土；硅酸；滑石；氧化锌及其混合物。
稳定剂的实例包括但不限于碳水化合物，例如蔗糖、乳糖和海藻糖；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；氨基酸，例如组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物或药物可以与促进药剂递送至中枢神经系统的递送系统联合使用。例如，各种血脑屏障(BBB)渗透增强剂可以用于瞬时和可逆地增加血脑屏障对治疗剂的渗透性。这种BBB渗透增强剂包括但不限于白三烯、缓激肽激动剂、组胺、紧密连接干扰剂(例如连蛋白、紧密连接毒素(zot))、高渗溶液(例如甘露醇)、细胞骨架收缩剂和短链烷基甘油(例如1-O-戊基甘油)。口服、舌下、肠胃外、植入、经鼻和吸入途径可以将活性剂递送至中枢神经系统。在一些实施方案中，本发明的化合物可以施用于中枢神经系统，而对周围神经系统作用最小。
血脑屏障(BBB)是中枢神经系统(CNS)中的血管与CNS本身大部分区域之间的物理屏障和细胞转运机制系统。BBB通过限制血液中潜在有害的化学物质进入和允许必需营养物进入来维持体内稳态。然而，BBB可能成为将药理学药剂递送至CNS以治疗病症或维持或增强正常和理想的脑功能(如认知、学习和记忆)的强大障碍。
在一个实施方案中，抑制剂、组合物、药物组合物或药物以缓释形式施用。在另一个实施方案中，组合物、药物组合物或药物包含控制调节剂释放的递送系统。
在一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物或药物以本领域技术人员确定的且就个人而言适应于每个受试者的剂量施用。
应该理解，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物和药物的总日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效量将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和该疾病的严重程度；所采用的具体组合物；受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间、施用途径、治疗持续时间；与所用多肽或核酸序列组合或同时使用的药物；以及医学领域公知的类似因素。例如，以低于获得期望治疗效果所需水平的水平开始治疗化合物的给药，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果，这在本领域技术人员的能力范围内；但是，相反，开始使用负荷剂量(一种更快地达到稳态血浆浓度的方式)，然后使用计算的维持剂量以精确补偿消除过程的作用，可能同样有用。
在一个实施方案中，治疗有效量的本发明的抑制剂、组合物、药物组合物或药物一天至少一次、一天两次、一天至少三次施用。
在另一个实施方案中，治疗有效量的本发明的抑制剂、组合物、药物组合物或药物每两天、每三天、每四天、每五天、每六天施用。
在另一个实施方案中、治疗有效量的本发明的抑制剂、组合物、药物组合物或药物每周两次、每周、每两周、每月一次施用。
在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物的每日量为约2mg/天至约2000mg/天、约2mg/天至约1500mg/天、约2mg/天至约1000mg/天、约2mg/天至约500mg/天、约2mg/天至约200mg/天、约5mg/天至约2000mg/天、约5mg/天至约1500mg/天、约5mg/天至约1000mg/天、约5mg/天至约500mg/天、约5mg/天至约200mg/天、约10mg/天至约2000mg/天、约10mg/天至约1500mg/天、约10mg/天至约1000mg/天、约10mg/天至约500mg/天、约10mg/天至约200mg/天。
在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物的每日量为约1mg/kg/天至约20mg/kg/天、约1mg/kg/天至约15mg/kg/天、约1mg/kg/天至约12mg/kg/天、约1mg/kg/天至约10mg/kg/天、约1mg/kg/天至约9mg/kg/天、约1mg/kg/天至约8mg/kg/天、约1mg/kg/天至约7mg/kg/天。
在另一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物以约5mg至约2000mg、约5mg至约1500mg、约5mg至约1000mg、约5mg至约500mg、约5mg至约200mg的量施用。
在一个实施方案中，本发明的方法用于长期治疗。在另一个实施方案中，本发明的方法用于急性治疗。
在本发明的一个实施方案中，受试者被诊断为患有游离氧自由基相关疾病。在本发明的另一个实施方案中，受试者存在出现游离氧自由基相关疾病的风险。
在一个实施方案中，所述受试者是成年人、青少年、儿童、幼儿或新生儿。
本发明的另一个目的是包含本发明的抑制剂的保存介质。
在一个实施方案中，保存介质用于保存器官。在一个实施方案中，所述器官包括但不限于：心脏、肝脏、肾、肺、胰腺、肠。在一个实施方案中，所述器官用于移植。
在一个实施方案中，保存介质包含浓度为5μM至120μM，即浓度为约5μM、10μM、20μM、50μM、80μM、100μM或120μM的本发明的抑制剂。
本发明的另一个目的是通过作用于在复合物I的位点IQ处的线粒体来抑制有需要的受试者的游离氧自由基产生的方法，包括向该受试者施用有效量的活性氧簇抑制剂。
本发明的另一个目的是通过作用于在复合物I的位点IQ处的线粒体来治疗有需要的受试者的衰老疾病的方法，包括向该受试者施用有效量的活性氧簇抑制剂。
本发明的另一个目的是用于抑制有需要的受试者的游离氧自由基产生而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向该受试者施用有效量的活性氧簇抑制剂。
本发明的另一个目的是通过作用于在复合物I的位点IQ处的线粒体来增加有需要的受试者的胰岛素分泌的方法，包括施用有效量的如上文所述的活性氧簇产生抑制剂。
本发明的另一个目的是通过作用于在复合物I的位点IQ处的线粒体来保护有需要的受试者的神经元的方法，包括施用有效量的如上文所述的活性氧簇产生抑制剂。
本发明的另一个目的是用于治疗至少一种与游离氧自由基相关的疾病的线粒体活性氧簇产生抑制剂。
本发明的另一个目的是线粒体活性氧簇产生抑制剂用于治疗至少一种与游离氧自由基相关的疾病的用途。
本发明的另一个目的是线粒体活性氧簇产生抑制剂在制备用于治疗至少一种与游离氧自由基相关的疾病的药物中的用途。
附图简述
图1显示了AOL对线粒体呼吸没有作用。图A：在AOL(在本实施例中为20μM)的存在下孵育后，从大鼠心脏分离的线粒体氧化作为底物的谷氨酸盐+苹果酸盐(GM)。磷酸化由二磷酸腺苷(ADP)触发，并且由苍术苷(atractyloside)(ATR)(腺嘌呤易位体的一种特异性抑制剂)终止。图B至D：在多种呼吸底物存在下，在浓度渐增的AOL(5至80μM)的存在下进行线粒体氧化磷酸化的经典研究。加入AOL后，不同能量状态下的线粒体呼吸没有统计学差异。加入ADP后的氧化速率反映了分离的线粒体的三磷酸腺苷(ATP)合成活性。
图2显示了为了获得最大线粒体ROS产生，在ATR(态4)存在下，在复合物I和III二者的底物存在下由分离的线粒体产生氧自由基的主要位点。如前所述，线粒体ROS产生高度依赖于线粒体活性和条件。虽然已经在多种条件下测试了AOL，但为了清楚起见，我们选择在这里只提供最具证明性的结果。向整个链提供电子的所有底物(即谷氨酸盐+苹果酸盐+琥珀酸盐)的存在最接近细胞中的原位条件。在这些底物条件下，我们评价了AOL的存在对ATR(抑制磷酸化：最大产生)下完整链的ROS产生以及对复合物I(被鱼藤酮抑制)和复合物II(被抗霉素A抑制)的ROS产生的影响。颜色参照图3。
图3显示在ATR(态4)存在下，在复合物I和II的底物存在下，AOL(5-80μM)对分离的线粒体的ROS/H2O2产生的影响，鱼藤酮、抗霉素A和粘噻唑(myxothiazol)的影响。在不存在复合物的特异性抑制剂的情况下，ROS产生最大，主要来自位点IQ的反向电子传递(参见图4)。在添加通过抑制IQ特异性反转电子传递的鱼藤酮后，产生减少并几乎全部发生在位点IIIQO。随后添加阻断电子传递到氧的抗霉素A增加了位点IIIQO处的ROS产生，并且最后粘噻唑阻断位点IIIQO处的ROS产生(细节参见图2)。
图4是显示AOL对线粒体ROS产生的作用位点和AOL没有作用或有很少作用的位点的方案。
图5是显示10和20μM AOL对从雄性C57Bl/6J小鼠分离的胰岛中的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的作用的直方图。显示三个实验的组合。每个实验使用来自两只小鼠的胰岛；每个孔有五个胰岛；每种条件四至六个孔。将胰岛素分泌数据相对于11mM Glc-Veh组(其被认为是100％)标准化。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001，相比于3mM Glc-Veh；#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001，相比于11mM Glc-Veh；单因素ANOVA和Bonferroni事后检验。
图6是显示治疗3周后测定的脂肪量的直方图。脂肪量以克(g)表示。数据表示为平均值±SEM。
图7是显示治疗3周后测定的瘦体重的直方图。瘦体重以克(g)表示。数据表示为平均值±SEM。
图8是显示在胰岛素耐量测试(ITT)期间用AOL(5mg/kg和10mg/kg)长期治疗对葡萄糖反应的影响的图。该图表示ITT期间血糖水平的变化。数据表示为平均值±SEM。
图9是显示AOL对血糖水平的影响的直方图。治疗五周后，对禁食2小时的小鼠测量血糖。数据表示为平均值±SEM。
图10是显示在MPTP处理的小鼠中AOL(5mg/kg，一天两次，持续11天)对SN中TH阳性细胞计数的神经保护作用的直方图。数据表示为平均值±SEM(n＝10-11)，并使用单因素重复测量ANOVA分析，随后进行Dunnett多重比较检验进行分析。**P<0.01；***P<0.001c.f.MPTP+溶媒。
图11是显示缺血后再灌注阶段期间AOL对心脏收缩性恢复的影响的图。对于对照(黑色)和AOL治疗的(灰色)，数据表示为6次独立实验的平均值±SEM。
图12是显示AOL对缺血心脏切片的梗塞尺寸的影响的图。在再灌注期结束时，心脏用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。活组织显示为红色，而受损组织显示为白色。
图13是一组两幅图，显示了AOL治疗对肺动脉压和心脏重塑的影响。图A：在常氧大鼠(N，白色柱)、长期缺氧大鼠(CH，浅灰色柱)和野百合碱(monocrotaline)处理的大鼠(MCT，深灰色柱)中AOL(阴影柱)对测量的平均肺动脉压(mPAP)的影响。图B：以富尔顿指数(Fulton index)(即，右心室重量(RV)与左心室加上隔膜重量(LV+S)的比率)表示的右心室肥大。n是大鼠的数量。*、**和***分别表示与N相比，P<0.05、0.01和0.0001的显著性差异。###表示与CH相比，P<0.05的显著性差异。
Figure BDA0001653039740000251
和
Figure BDA0001653039740000252
分别表示与N+AOL相比，P<0.05和0.01的显著性差异。
Figure BDA0001653039740000253
表示与MCT相比，P<0.05的显著性差异。
图14是显示AOL对肺动脉(PA)重塑的影响的一组图。通过测量常氧大鼠(N，白色柱)、长期缺氧大鼠(CH，浅灰色柱)和野百合碱处理的大鼠(MCT，深灰色柱)的PA中膜厚度的百分比来评估AOL(阴影柱)对PA重塑的影响。为评估PA重塑而观察的腺泡内动脉被分成具有不同横截面直径的三组(图A：低于50μm；图B：50-100μm；图C：100-150μm)。n是脉管的数量。*、**和***分别表示与N相比，P<0.05、0.01和0.0001的显著性差异。##和###表示与CH相比，P<0.01和0.0001的显著性差异。分别与N+AOL相比，P<0.05和0.01的显著性差异。
Figure BDA0001653039740000254
表示与MCT相比，P<0.05的显著性差异。
图15是显示在渐进性光诱导视网膜变性中，AOL对视网膜的外核层(ONL)厚度的影响的一组图。图A：溶媒和AOL对“未转移”动物的影响。动物在循环低强度照明条件下饲养并接受溶媒或AOL注射，每天三次，持续7天。治疗结束后15天，进行视网膜的组织学分析。对于未治疗的动物(浅灰色，方形点)、溶媒治疗的动物(深灰色，三角形点)和AOL治疗的动物(黑色，圆点)，数据表示为从视神经并且在视盘的上下极中每0.39mm的ONL厚度的平均值±SEM，以μm计。图B：溶媒和AOL对“转移”动物的影响。将动物在循环低强度照明条件下饲养并转移至循环高强度照明，持续7天，在此期间它们每天三次接受溶媒或AOL注射。在治疗结束时，将动物转移回循环低强度照明条件，15天后进行视网膜组织学分析。对于未治疗的动物(浅灰色，方形点)、溶媒治疗的动物(深灰色，三角形点)和AOL治疗的动物(黑色，圆点)，数据表示为从视神经并且在视盘的上下极中每0.39mm的ONL厚度的平均值±SEM，以μm计。
图16是显示对四组小鼠(WT-KOL：用溶媒治疗的野生型小鼠；WT-AOL：用AOL治疗的野生型小鼠；KO-KOL：用溶媒治疗的SOD2-KO小鼠；KO-AOL：用AOL治疗的SOD2-KO小鼠)进行的寿命SOD2-KO实验的一组图。数据表示为平均值。图A：小鼠体重(以克计)随时间(以天计)的变化。图B：基线校正的小鼠体重，为体重随时间(以天计)增加的百分比。图C：KO-KOL和KO-AOL组随时间(以天计)的存活比例(以百分比计)。
图17是显示在五组小鼠(WT-KOL：用溶媒治疗的野生型小鼠；WT-AOL：用AOL治疗的野生型小鼠；KO-KOL：用溶媒治疗的SOD2-KO小鼠；KO-AOL：用AOL治疗的SOD2-KO小鼠；WT：野生型未治疗小鼠)的心脏中琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的图。用图像处理软件Image AnalystMKII(Akos)测量从心脏切片取样的SDH反应的光密度。该密度以平均灰度水平的形式表示，其中平均灰度水平＝灰度总和/测量的像素数。数据表示为测量的光密度的平均值。
图18是显示来自用AOL治疗或不用AOL治疗的WT和SOD2-KO小鼠的肝脏切片的油红O染色的一组图。直方图代表脂质液滴的平均尺寸(图A)，液滴密度(液滴数/肝脏面积)(图B)和总脂质面积(平均尺寸×液滴数)(图C)。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
实施例1：AOL不影响线粒体氧化磷酸化
材料和方法
动物程序和伦理学声明
描述的所有实验均在符合实验动物的护理和使用的国家和欧洲研究委员会指南(National and European Research Council Guide)的情况下进行。P.Diolez拥有通过法国Ministère de l’agriculture et de la Forêt的Service Vétérinaire de la Santéet de la Protection Animale进行动物试验的有效许可证(1999年3月17日，许可证号3308010)。
材料
所有化学品都是试剂级，购自Sigma Chemical(St.Louis,MO)，除了蔗糖和NADH氧化酶(获自Merck(Darmstadt，德国))。三硫-茴香脑化合物(AOL)是私人公司GMPO(巴黎，法国)的馈赠。在DMSO中制备15mM储备溶液，并在0℃暗处保存仅几天。
线粒体的分离
雄性Wistar大鼠(250-325g；获自Janvier Labs，Le Genest-Saint-Isle，法国)通过击晕和颈脱位法处死，迅速取出心脏并在含有100mM蔗糖、180mM KCl、50mM Tris、5mMMgCl2、10mM EDTA和0.1％(w/v)脱脂BSA(pH 7.2)的冷分离介质中洗涤。
心脏线粒体的分离在冷室中进行。在匀浆之前，用剪刀剪碎心脏(约1.5g)，并在搅拌下在5mL补充有蛋白酶(2mg XXIV型细菌蛋白酶/mL分离缓冲液)的相同介质中处理5min。将组织悬浮液倒入50-ml玻璃波特匀浆器中，用20mL分离缓冲液稀释，然后使用机动Teflon研棒匀浆3min。通过筛布(Sefar Nitex)过滤匀浆以去除碎片，并以8,000g离心10分钟。将得到的沉淀用5mL分离缓冲液冲洗，重悬于25mL相同的缓冲液中，然后进行低速离心(400g)8分钟。将得到的上清液以7,000g离心两次，持续15分钟以得到洗过的线粒体沉淀，将其轻轻地重悬于150μL分离缓冲液中。使用BSA作为标准品通过Bradford法(Sigma，试剂盒#B6916)确定蛋白质浓度。将线粒体以40-50mg/mL的最终浓度保持在冰上小于5小时。
线粒体呼吸
使用高分辨率血氧计(Oxygraph-2K，Oroboros Instruments，奥地利)在25℃下在恒定搅拌下通过极谱法记录在不存在AOL或存在剂量渐增(0至80μM最终浓度)的AOL的情况下孵育的心脏线粒体(0.1mg/mL)的氧消耗率。呼吸介质包含140mM蔗糖、100mM KCl、1mMEGTA、20mM MgCl2、10mM KH2PO4和基本不含脂肪酸的1g/L(w/v)BSA(pH 7.2)。
线粒体ROS/H2O2的产生
通过在外源性辣根过氧化物酶(HRP，EC 1.11.1.7，Sigma)的存在下氧化无色非荧光指示剂Amplex红来评估心脏线粒体的ROS/H2O2产生速率。H2O2与Amplex红以1：1化学计量比反应，得到荧光化合物试卤灵(resorufin)(激发：560nm；发射：585nm)，其一旦形成就是稳定的。用配有温度控制和搅拌的分光荧光计(SAFAS Xenius，摩纳哥)连续测量荧光。分离的线粒体(0.1mg/mL)在补充有15μM Amplex红和10μg/mL HRP的与先前相同的实验缓冲液中孵育。谷氨酸盐(5mM)/苹果酸盐(2.5mM)与琥珀酸盐(5mM)一起分别用作复合物I和复合物II的底物。在15μM苍术苷存在下在非磷酸化条件下进行实验，即在线粒体膜为最大的态IV条件下进行实验。之后，顺序加入鱼藤酮(1.5μM)、抗霉素A(2μM)和粘噻唑(0.2μM)以抑制电子传递链内的氧化还原中心(见图2)，即位点IQ、IF(用鱼藤酮)、IIIQi(用抗霉素A)和IIIQO(用粘噻唑)。在所有相关化合物(包括AOL)的存在下，用已知量的H2O2(各步骤为300nM)最终校准测定。在不存在心脏线粒体和存在NAD(P)H氧化酶(EC1.6.3.3，5mU/mL，Sigma)和NADH(100μM)溶液的情况下进行AOL对amplex红测定本身和NAD(P)H氧化酶ROS/H2O2产生没有作用的对照试验。
结果
我们首先证实(图1)AOL化合物不影响直接在从大鼠心脏分离的线粒体上的氧化磷酸化。这已经通过使用目前经典的测氧描记(oxygraph)方法进行。线粒体首先与多种AOL浓度(5至80μM)一起孵育，然后加入呼吸底物(底物状态，黑色曲线)，接着加入饱和ADP浓度以获得最大氧化磷酸化速率(灰色曲线)，最后加入苍术苷(ATR)，其抑制ADP/ATP易位体并在非磷酸化条件下产生线粒体漏速率(图1A)。图1B-D显示了用不同的呼吸底物组合得到的结果：向复合物I供给电子的谷氨酸盐+苹果酸盐，用于复合物II的琥珀酸盐(+鱼藤酮)和向两种复合物供给电子的谷氨酸盐+苹果酸盐+琥珀酸盐。已选择最后这种底物组合，因为它最接近于体内条件，其中Krebs循环起作用并且琥珀酸盐和NADH都被呼吸链氧化。结果表明，对于测试的大范围浓度，在AOL存在下没有观察到统计学上的差异(图1)，表明在这些条件下AOL对线粒体氧化磷酸化(即对呼吸链活性和ATP合成这二者)以及对线粒体内膜完整性(加入ATR后的漏速率)没有影响。最后的这一结果表明AOL不影响氧化磷酸化产量。总之，所有这些结果都证实，AOL没有任何有害的作用，如这种药物长期用于人类健康所证实的。
实施例2：AOL抑制线粒体的超氧化物/H2O2产生
如前所述，线粒体ROS产生高度依赖于线粒体活性和条件。尽管我们在很多条件下测试了AOL对线粒体ROS产生的影响，但为了清楚起见，我们选择在这里只提供AOL的非常特定的作用的最具证明性的结果。如已经讨论的，向整个呼吸链提供电子的底物组合(即谷氨酸盐+苹果酸盐+琥珀酸盐)的存在最能代表代谢活跃的细胞中的原位条件。此外，在高线粒体磷酸化条件下但在电子转运体的高度还原(即低磷酸化或无磷酸化)的条件下，不会发生最大线粒体ROS/H2O2产生。在存在ATR(ATR抑制ATP/ADP易位体)的情况下，这些条件得以实现(图1)，并且我们可以有效验证在ADP饱和条件下添加ATR触发ROS的产生，其在最大磷酸化条件下处于检测限(结果未显示)。在这些条件下，ROS在呼吸链的不同位点产生(Orr etal.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059；Quinlan et al.,2013.Redox Biol.1:304-312)(图2)。产生的主要位点位于复合物I和III，其中电子势能发生很大变化(Balabanet al.,2005.Cell.120:483-495；Goncalves et al.,2015Jan 2.J.Biol.Chem.290(1):209-27)，这也允许在这些位点泵送质子。
我们设计了一系列抑制剂滴定法，以解释在最大ROS产生条件下AOL对整个呼吸链的ROS产生的作用(图2E)。在没有复合物的特异性抑制剂的情况下，ROS产生最大，主要来自位点IQ处的反向电子传递(图2A)。至关重要的是，注意到由复合物I通过位点IQ(醌位点)或位点If(黄素位点)产生的ROS被递送至线粒体内膜的内基质侧。加入鱼藤酮(与IQ特异性结合的复合物I的一种典型抑制剂)后，ROS产生强烈下降，几乎全部发生在位点IIIQO，并且由于存在没有被鱼藤酮抑制的复合物I底物和NADH产生，剩余产生发生在位点If(图2B)。随后添加抗霉素A(电子传递至细胞色素c的一种抑制剂)引起还原相对于氧化醌比率的增加，该比率仍被复合物II活性降低，因此伴随着位点IIIQO处的ROS产生增加(图1C)。最后，添加粘噻唑(复合物III位点IIIQO的一种抑制剂)可以消除复合物III ROS产生，而剩余的非常低的产生可能归因于复合物I的黄素位点，对该位点我们没有已知的抑制剂(Goncalves etal.,2015Jan 2.J.Biol.Chem.290(1):209-27)。
图3说明了浓度渐增的AOL(5至80μM)对在图2中限定的不同条件下测量的ROS/H2O2产生的影响。从该图中显示的结果可以清楚地看出，AOL仅影响在不存在抑制剂时测量的ROS产生约80％，而对于这一范围的AOL浓度对在其他条件下测量的ROS/H2O2没有观察到统计学差异。从图2可以看出，这种特定的条件(仅存在ATR)是在我们的测定中唯一的由复合物I(位点IQ)产生ROS的条件。当将鱼藤酮加入到测定中时，即使在高浓度下，ROS/H2O2产生对AOL不敏感，无论涉及的位点如何。对线粒体ROS产生的几个位点明显没有作用不仅令人惊讶，而且还引起了关于AOL对线粒体的特有作用机制的有趣问题。事实上，这些结果排除了以前论文中描述的AOL的作用模式的基本假设，并且为其治疗用途的专利奠定了基础。这些结果有效地表明，AOL不是自由基清除剂；否则其作用将独立于ROS的来源。然而，由于AOL明显强烈地减少了复合物I在位点IQ(并且仅在该位点)处的ROS产生，我们有证据表明AOL特异性地抑制了ROS在该位点的形成。
虽然该机制仍有待研究，但在此提供的证据表明，AOL化合物特异性地干扰线粒体复合物I，并选择性抑制从复合物I的泛醌结合位点(位点IQ)的超氧化物产生，而对其他位点的超氧化物产生或对氧化磷酸化没有作用。据我们所知，目前有过记载的具有相当性质的化合物只有一种，即N-环己基-4-(4-硝基苯氧基)苯磺酰胺(Orr et al.,2013.FreeRadic.Biol.Med.65:1047-1059)。像AOL一样，这种化合物不改变复合物I作为呼吸链和氧化磷酸化的组分的活性。
使用用于测量线粒体的ROS/H2O2的过氧化物酶-Amplex红系统体外进一步测试AOL的特异性，其实际上通过将amplex红氧化成荧光试卤灵来测量H2O2的出现(参见图4)。在不存在线粒体的情况下，并且通过向测量系统添加H2O2生成系统作为代替，可以测试AOL对这种系统的影响。这已通过使用商业NAD(P)H氧化酶并测量Amplex红还原为试卤灵(图4)来进行，所述商业NAD(P)H氧化酶在添加的NAD(P)H存在下产生H2O2。我们在这些条件下没有观察到对荧光的任何抑制，这排除了AOL对NAD(P)H氧化酶或对过氧化物酶活性的任何影响(结果未显示)。这些结果证实，AOL不干扰测量系统或不与H2O2直接相互作用。有趣的是，这些结果还表明，AOL不抑制NADP(H)氧化酶产生ROS/H2O2，该NADP(H)氧化酶是细胞中的一个(如果不止一个)主要的非线粒体ROS/H2O2生产者。图4中的方案概括了关于AOL对由线粒体和NAD(P)H氧化酶产生ROS/H2O2的作用模式的不同信息，并且强调了这里显示的非常高的特异性。这些结果与以前关于AOL作为自由基清除剂的推定作用的断言形成鲜明对比。
当在从大鼠心脏分离的线粒体上测试时，AOL有效地降低了线粒体ROS/H2O2产生(在分离的线粒体中，由线粒体超氧化物歧化酶还原ROS来产生H2O2)。然而，这里提供的结果清楚地表明，AOL不是作为简单的抗氧化剂或自由基清除剂起作用。虽然抗氧化剂是一般的ROS/H2O2清除剂，但AOL提供了针对通过复合物I的位点IQ形成ROS的完全选择性，这表明AOL不是简单地与超氧化物自由基相互作用，而且特异性地防止其在复合物I中形成。在这方面，因此，AOL表现为一类全新的氧化应激保护剂的成员，其只有一个成员在最近被描述过(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)。而抗氧化剂通常不直接干扰电子传递并清除产生下游的ROS和/或H2O2，因此不能完全抑制ROS的作用(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)，AOL可能通过阻止ROS形成并因此更有效地保护线粒体免受其自身ROS的影响而以不同方式起作用。
这里提供的数据进一步证明AOL是线粒体呼吸链的复合物I的位点IQ处的ROS形成的特异性抑制剂。然而，需要进一步的实验来确定AOL对其他线粒体位点完全没有作用，但这并不排除上述结论。我们在这里还显示一些证据表明，AOL可能仅与线粒体相互作用而不影响胞质溶胶中氧自由基的形成，因此不会影响细胞内信号作用。
鱼藤酮或神经毒素MPP+对复合物I活性的抑制与啮齿类动物和人类的帕金森症有关，表明在功能失调的复合物I、ROS产生和神经变性之间存在联系(Langston et al.,1983.Science.219:979-980；Betarbet et al.,2000.Nat.Neurosci.3:1301-1306)。相比之下，比较分析显示了位点IQ而非位点IF的最大超氧化物/H2O2产生与跨越不同脊椎动物物种的最大寿命之间呈相反关系(Lambert et al.,2007.Aging Cell.6:607-618；Lambertet al.2010.Aging Cell.9:78-91)。因此，位点IQ或位点IF的超氧化物/H2O2产生的选择调节剂将提供独特的机会来探究线粒体ROS产生在正常过程和病理过程中的推定作用(Orret al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)。也有一些推测(甚至是有争议的)：位点IIIQ不受AOL影响，在缺氧期间在细胞信号传导中起重要作用。
总之，似乎AOL性质可能代表了寻找细胞中ROS/H2O2产生的特异性调节剂的突破性进展。这是目前研究中的一个重要问题，AOL对于新发现的分子具有巨大的优势，因为它已被许可用于人体使用。
-AOL在ROS产生的上游起作用，因此确保了比经典抗氧化剂更高的保护作用；
-AOL特异性地作用于线粒体ROS产生；
-AOL确保线粒体保护，其对许多疾病尤其是心脏疾病是至关重要的；
-AOL不干扰细胞信号作用；
-AOL特异性地作用于复合物I的位点IQ，其是主要的线粒体位点，并且可能与包括帕金森病和心脏纤颤在内的重要疾病有关。
→AOL可能代表特异性地防止线粒体内部的ROS产生的一类新的“保护剂”的第一个成员，因此可以用于各种氧化应激期间的线粒体保护，并因此可以预防疾病，对关键细胞ROS信号传导的副作用非常小。
实施例3：AOL在心血管疾病：糖尿病中的作用
化合物AOL对小鼠胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的影响
该研究的目的是研究化合物AOL调节从小鼠分离的胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的能力。
材料与方法
实验严格按照欧盟的建议(2010/63/EU)进行，并获得法国农业和渔业部(许可编号3309004)和波尔多大学的地方伦理委员会的批准。已尽最大努力减少所使用动物的痛苦和数量。
进行三个独立的实验，并且对于它们中的每一个，将两只小鼠处死并根据下文进一步描述的程序分离胰岛。
使用胶原酶消化法分离胰岛。简言之，用含有0.33mg/mL胶原酶(Sigma-Aldrich)、5.6mM葡萄糖和1％牛血清白蛋白(pH 7.35)的Hanks溶液使胰腺膨胀(inflate)，将其取出并在37℃保持6-9分钟。在组织消化和连续三次洗涤去除外分泌物后，在双筒放大镜下手动收集胰岛。通过在含有11mM葡萄糖(Invitrogen，CA，USA)并补充有2mM谷氨酰胺、200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素和用炭-葡聚糖吸附的8％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI-1640培养基中培养20-24小时而使胰岛从消化恢复。
对于每个静态GSIS实验，首先将两只小鼠的胰岛在37℃在用95％O2:5％CO2的混合物平衡的3mL Krebs-碳酸氢盐缓冲溶液(以mM计：14NaCl、0.45KCl、0.25CaCl2、0.1MgCl2、2HEPES和3葡萄糖)pH 7.4中孵育2小时。然后，将具有5个尺寸匹配的胰岛的各组转移到24孔板的孔中，该孔具有0.5mL含有以下刺激物之一的新鲜缓冲液：3mM葡萄糖(Glc)和11mM葡萄糖加溶媒(0.4％DMSO在Krebs-碳酸氢盐缓冲液中)或11mM葡萄糖加上待测试的稀释药物(10μM或20μM在溶媒中的AOL)，并进一步孵育1小时。每个实验条件使用六个不同的孔。在孵育结束时，将牛白蛋白加入到每个孔中至最终浓度为1％，将平板置于4℃ 15分钟以停止胰岛素分泌。接下来，收集培养基并储存于-20℃以便随后通过ELISA(试剂盒，来自Mercodia，Uppsala，瑞典)根据制造商的说明测量胰岛素含量。每个孔中的胰岛素分泌量按每个胰岛和每小时孵育的ng胰岛素计算，然后表示为在11mM葡萄糖溶媒组中胰岛素分泌的百分比，11mM葡萄糖溶媒组被认为是100％。
表1显示了实验组的描述。
Figure BDA0001653039740000331
表1.
结果
将三个实验中每一个获得的个体胰岛素分泌值组合并取平均值。这些表示为相对于11mM葡萄糖溶媒组标准化的胰岛素分泌的相对百分比(图5)。
数据的组合分析显示AOL在10和20μM下都增强GSIS，显示出相似的效力，与11mM葡萄糖溶媒组相比，GSIS增加约65-75％(单因素ANOVA；Bonferroni事后检验)。统计分析见表2。
Figure BDA0001653039740000341
表2.
结论
该研究表明，在测试剂量(10和20μM)下，AOL增强GSIS并显著刺激小鼠分离的胰岛中体外胰岛素分泌。
因此，这些发现表明，AOL可能特别可用于胰岛素分泌不足的病理状况。
AOL长期治疗对饮食诱导肥胖的小鼠的食物摄入量、体重和葡萄糖代谢的影响
材料和方法
该研究的目的是确定在用高脂肪饮食(HFD)喂养的饮食诱导肥胖(DIO)的小鼠中，化合物AOL以5mg/kg和10mg/kg的剂量每日通过腹膜内(ip)施用长达五周是否改变食物摄入量、体重、肥胖和葡萄糖代谢。
在药理学研究开始之前，用HFD(60％的卡路里来自脂肪，大部分是猪油)任意喂养小鼠12周。动物通过腹膜内(ip)施用接受AOL或其溶媒，并在研究期间维持HFD喂养。每天测量食物摄入量和体重并记录连续三周。
在开始药理学研究之前为了将小鼠适当分配在不同的实验组中，我们使用EchoMRI 900(EchoMedical Systems，Houston，Texas，USA)评估了它们的体内身体组成(还参见Cardinal P.et al.,2014Oct.Mol.Metab.3(7):705-16；Cardinal P.et al.,2015Feb.Endocrinology.156(2):411-8)。使用天平(TP1502型，Denver Instruments)获得每日食物摄入量和体重测量结果。
30只7周龄的雄性C57/Bl6J小鼠在2016年2月25日抵达实验室，并在适应实验饲养房屋1周后进行了第一次体内身体组成分析(Echo MRI 900，EchoMRI Systems)。在该第一次MRI分析后，对动物任意喂食高脂肪饮食(HFD)，持续12周。此后，它们进行第二次MRI分析，并将它们分配到3个等体重和身体组成的实验组中。
一旦开始药理学治疗(第1天)，对在其饲养笼中饲养的动物在黑暗阶段之前每天测量食物摄入量(FI)和体重(BW)。每天检查食物溢出量。通过从初始预称重量减去喂料斗中剩下的食物来计算消耗的食物。对FI和BW测量连续三周。之后，对动物进行第三次MRI分析以观察治疗对身体组成(脂肪量和瘦体重的变化)的潜在影响，随后进行葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。小鼠每天腹膜内施用AOL或其溶媒，总共五周，直到它们被杀死。
使用核回声磁共振成像全身组成分析仪(Echo MRI 900；EchoMedical Systems)来重复评估清醒小鼠中的身体脂肪和瘦体重。
GTT和ITT通常分别用于在葡萄糖负荷和胰岛素负荷期间评估葡萄糖代谢的动态调节。它们提供有关葡萄糖不耐受以及可能对激素胰岛素作用的抵抗的存在的信息。
对于GTT，动物腹膜内注射1.5g/kg D-葡萄糖(Sigma-Aldrich)，对于ITT，动物腹膜内注射0.5U/kg胰岛素(Humulin，Lilly，法国)。对于GTT和ITT，使动物禁食过夜。第二天早上进行测试。在不同的时间点(腹膜内施用葡萄糖或胰岛素后0、15、30、60、90和120分钟)从尾静脉采集血液样品，并且使用葡萄糖棒(OneTouch Vita，Lifescan France，Issy lesMoulineaux，法国)测量葡萄糖浓度。
在处死时，采集血液样品，使用葡萄糖棒快速评估血糖，然后将血液样品在3000rpm下离心15分钟。将获得的血浆储存在-80℃下，用于随后测量胰岛素，胰岛素测量通过根据制造商的说明实施ELISA(试剂盒，来自Mercodia，Uppsala，瑞典)来进行。
使用公式(葡萄糖mmol/L×胰岛素mU/L)/22.5计算HOMA-IR指数，其提供关于胰岛素抵抗存在的信息。
使用GraphPad Prism软件(San Diego，CA，USA)进行统计分析。进行重复测量双因素ANOVA来分析治疗因素、时间因素及其相互作用对食物摄入量、体重、GTT和ITT的影响。进行单因素ANOVA以比较治疗因素对处死时的累积食物摄入量、身体组成、GTT和ITT的AUC以及循环葡萄糖、胰岛素和HOMA-IR的影响。当ANOVA结果显著(p<0.05)时，进行Tukey事后检验以允许在各组之间进行充分的多重比较。数据表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism软件生成图。
结果
治疗对体重或从第1天起计算的体重变化的百分比(％)没有显著影响，在第一天在首次施用AOL之前测量体重。
三周后长期施用AOL趋于减少脂肪量(p＝0.13，图6)，但对瘦体重没有任何影响(图7)。平均值±SEM值在图6和图7中示出，统计分析分别在表3和表4中示出。
Figure BDA0001653039740000361
表3.图6所示数据的统计分析。
Figure BDA0001653039740000362
Figure BDA0001653039740000371
表4.图7所示数据的统计分析。
在ITT期间，10mg/kg剂量的AOL显著减弱了胰岛素对循环葡萄糖水平的作用(图8)，表明存在胰岛素抵抗。因此，当分析AUC(AUC veh：12812.50±750.35，AUC AOL 5mg/kg：15006.56±1139.69，AUC AOL 10mg/kg：18168.33±1562.90，单因素ANOVA F(2,23)＝5.186，p＝0.0138)时也发现了治疗作用，其中AOL 10mg/kg组的AUC显著高于溶媒组(Tukey事后，p＝0.0107)。在图8中示出平均值±SEM值，统计分析在表5中示出。
Tukey事后 溶媒 AOL5mg/kg AOL10mg/kg
溶媒 0.532016 0.023546
OP 5mg/kg 0.532016 0.232976
OP 10mg/kg 0.023546 0.232976
表5.对图8中的数据的治疗因素的事后分析。Tukey事后分析表中的数字表示p值。粗体值对应于显著(p<0.05)结果。
五周治疗后，在处死时，在禁食2小时的小鼠中测量血糖水平。
AOL趋于降低血糖水平(图9)，统计分析见表6。
Figure BDA0001653039740000372
表6.图9所示数据的统计分析。
结论
在饮食诱导肥胖的动物中，长期每日施用AOL趋于降低DIO小鼠的体重和食物摄入量(数据未显示)。因此，这与降低脂肪量和基础血糖水平的趋势相关。
总体而言，这些数据表明，AOL可能在饮食型肥胖模型中有一些有益的作用。
实施例4：AOL在神经疾病：帕金森病中的作用
在这项研究中，通过对亚慢性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)小鼠帕金森病模型的黑质(SN)中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的数目进行计数来评估AOL的潜在神经保护作用。用AOL(5mg/kg；ip)或溶媒治疗小鼠连续11天。在治疗第4-8天施用MPTP(20mg/kg；ip)或盐水。在第12天在最后一次施用治疗后处死所有小鼠。
在C57/bl6小鼠中的亚慢性MPTP施用诱导黑质纹状体多巴胺能神经元的变性，这导致SN中TH阳性神经元的数量减少，在这种情况下，减少39％。
材料和方法
对于溶媒条件，将试验物品溶解在0.5％DMSO/0.95％Tween 20的盐水溶液中，同时以5mg/kg的剂量腹膜内(i.p.)施用AOL。施用量为10mL/kg。
将重量为22-28g的C57bl/6雄性小鼠(Janvier)饲养在12小时光照/黑暗循环下的温控房间中，并自由获得食物和水。为了试验性地实现每组n＝10的最终数目，考虑到在实验过程中可能的损失，使用每组n＝12。为了产生黑质中的多巴胺能神经元的神经变性，将小鼠用MPTP盐酸盐(20mg/kg i.p.，一天一次，连续五天)处理。
最后一次施用后，通过颈脱位法对小鼠进行人道安乐死。
将尾侧半脑(含有黑质)置于多聚甲醛(4％在0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4中)中5天，然后转移至20％蔗糖(20％于0.1M PBS中)用于冷冻保护。然后将组织冷冻在冷异戊烷中(-50℃±2℃)。
将纹状体(striata)解剖出来，称重并分别在干冰(-70℃±10℃)中快速冷冻。组织样品储存在-70℃(±10℃)，用于任选的多巴胺及其代谢物的HPLC分析。如果没有采用这个选项，纹状体将被破坏。
将整个中脑的冠状连续切片在低温恒温器上以50μm间隔切割。收集在含有冷冻保护剂溶液的孔板中自由漂浮的切片，然后将其储存在-20℃直到TH免疫组织化学处理的那天。
如下对每四个切片进行TH免疫组织化学。从-20℃冷冻机中取出组织切片，使其调整至室温，然后在PBS溶液中漂洗。通过在含有0.3％H2O2的PBS中孵育10分钟来抑制内源性过氧化物酶。之后，将切片在PBS中洗涤，在PBS 4％正常马血清(NHS)和0.3％Triton X-100中孵育30分钟，以阻断非特异性抗原位点。然后将切片在稀释度为1/10,000的抗体稀释物+酪氨酸羟化酶(TH)的一抗(抗TH亲和分离抗体，Sigma T8700)中在室温下孵育过夜。然后将切片在PBS中彻底冲洗，并在ImmPRESS Ig过氧化物酶聚合物检测试剂(Vector MP7401)中孵育30分钟。之后，将切片用PBS彻底清洗。然后用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)/Tris/H2O2试剂盒(Vector SK4100)显示免疫染色。一分钟后，用PBS洗涤几次停止显示。安装切片，并用0.1％甲酚紫复染。
使用无偏性体视学分析来估计TH免疫阳性(TH+)神经元的数量(Mercator，Explora Nova，La Rochelle，法国)。SN的边界通过检查不同的TH+神经元组的尺寸和形状来确定。使用如下公式计算体积：V＝ΣS td；其中ΣS是表面积的总和，t是平均切片厚度，d是测量的两个连续切片之间的片数量。每4个切片使用一个；使用系统抽样方案分配光学解剖器。将解剖器(50μm长，40μm宽)按150μm(x)和120μm(y)彼此分隔开。使用以下公式评估TH+神经元的数量：N＝V(SN)(ΣQ-/ΣV(dis))；其中N是细胞数量的估计值，V是SN的体积，ΣQ-是在解剖器中计数的细胞数量，ΣV(dis)是所有解剖器的总体积。然后计算每组的神经元平均估计数和SEM。
所有统计分析均使用Graphpad prism第7版进行。所有数据均表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。AOL的作用用单因素ANOVA进行分析，然后进行Dunnett多重比较事后分析。P值小于0.05被认为是显著的。
结果
治疗对SN中TH+细胞的数量有显著影响(F2,29＝10.94，p<0.001，图10)。与溶媒处理的动物相比，在MPTP处理的动物中，SN中TH+细胞的数量减少了39％(p<0.001)。施用AOL后，与溶媒相比，在MPTP处理的小鼠中，SN中TH+细胞的数量增加了44％(p<0.01)。
结论
与溶媒相比，AOL以5mg/kg的剂量治疗连续11天具有显著的神经保护作用，防止SN中TH+细胞的MPTP诱导的减少，导致施用AOL使得SN中存活的细胞多44％。
这些数据表明，AOL治疗可以保护黑质中的多巴胺能神经元免于MPTP中毒。
实施例5：AOL在心血管疾病：缺血-再灌注损伤中的作用
本研究旨在评价AOL保护灌注的大鼠心脏免受全心缺血和再灌注后发生的损伤的能力。
在用10μM AOL预处理或不用AOL预处理(对照溶媒)的分离的灌注大鼠心脏上研究30分钟全心缺血然后120分钟再灌注对收缩性和组织活力的影响(图11)。
材料与方法
所有程序符合1986年英国动物(科学程序)法和国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(NIH出版号85-23，1996年修订)。将雄性Wistar大鼠(250-300g)用3％异氟烷麻醉，肝素化并通过致死性腹膜内注射戊巴比妥(130mg/kg)安乐死。快速收割心脏(约0.95g鲜重)并置于在37℃下用95％O2/5％CO2充气的含有以下组分(以mmol/L计)的冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液(pH 7.4)中：NaCl 118、NaHCO3 25、KCl 4.8、KH2PO4 1.2、MgSO41.2、葡萄糖11和CaCl2 1.8。进行Langendorff心脏灌注(Garlid,K.D.et al.,2006.Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.291(1):H152-60)，并且通过连续测量心率收缩压乘积(RPP)评估收缩性，这是由于气囊放置在左心室并连接到压力传感器。心脏以恒流模式(12mL/min)灌注。稳定化10分钟后用溶媒(对照)或10μM AOL溶液治疗10分钟，通过停止灌注流30分钟同时在37℃将心脏浸泡在灌注缓冲液中来诱导全心常温缺血。在再灌注期结束时，对心脏染色以评估梗塞尺寸，或使用液氮冷却舌冷夹。在后一种情况下，在液氮下研磨心脏，并将其储存在-80℃以进行进一步分析。
在再灌注期结束时，心脏用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色：将心脏用12％(w/v)TTC溶液以13mL/min灌注7分钟以获得心脏中1％的最终浓度。然后将心脏从套管上分离并在37℃下再孵育4分钟，然后垂直于纵轴切成6片。然后在4℃下在4％(w/v)福尔马林溶液中处理切片过夜并称重，然后对每个切片的两侧拍照。通过测面法(AlphaEase v5.5)在每张照片上确定每侧的坏死和危险区域的表面，并且由于全心脏经受缺血，梗死尺寸表示为心脏总横截面积的百分比。
来自6个独立制品的数据表示为平均值±SEM。每组中的n值为小于20，分布被认为是非正常的，因此进行非参数Mann-Whitney检验(SPSS statistics17.0)以比较两组。如果p值低于0.05，则结果被认为是统计学显著的。
结果
图11显示了在缺血后再灌注的关键阶段期间RPP(在此被认为是心脏收缩性的替代物)的变化。显然，AOL改善收缩性，并且在与对照相比进行相同的变化后，用AOL治疗的心脏在再灌注2小时后显示出比对照心脏高约三倍的收缩性改善。此时，心脏准备进行TTC染色以评估组织活力。通过TTC染色证实了AOL心脏的更高的收缩活性，并且治疗和未治疗心脏切片的照片(数据未显示)清楚地显示AOL诱导对心脏组织的重要保护。已对这种保护进行了更彻底的分析，结果如图12所示。梗塞尺寸-受损组织-表示为每个独立实验的总表面百分比以及AOL处理的和未处理的心脏的平均值。结果清楚地显示，AOL高度显著地保护心脏组织免受缺血/再灌注损伤。实际上，大约50％的梗塞组织通过用AOL预处理而救援(图12)。
结论
这些结果在离体(活器官)条件下延伸了AOL作为线粒体ROS产生抑制剂的作用，最可能是在复合物I的水平上。
它们还证明了AOL不仅在心脏中而且在遭受缺血的任何组织中针对缺血/再灌注损伤的组织保护的治疗利益。
实施例6：AOL在心血管疾病：蒽环类药物的心脏毒性中的作用
本研究旨在评价AOL在蒽环类药物心脏毒性模型中的作用。通过对10周龄大鼠施用蒽环类药物衍生的抗癌药物和AOL持续14至17天来评估这一点。
材料与方法
这些研究是在10周龄的Sprague-Dawley大鼠上进行的，并且在采集心脏进行分析之前，将不同的治疗腹膜内施用14至17天。为了尊重动物实验中的“三R原则”，尽可能限制测试组的数量，具体是将实验仅集中在一种蒽环类分子即多柔比星(Doxorubicine)上，并通过仅比较AOL与一种替代保护分子即右雷佐生(Dexrazoxane)的作用。
在实验结束时，将治疗的大鼠的心脏移除，并且在Langendhorf系统中灌注这些心脏之后将详尽地研究心脏功能，以确定受多柔比星影响的心脏功能以及AOL治疗是否有效。
该研究包括5个不同的组，每组8只大鼠：
1-对照组。大鼠仅接受由5％DMSO+95％NaCl 0.9％组成的溶媒，每天两次(早晨和晚上)，持续17天；
2-Doxo组。大鼠接受3mg/kg(ip)剂量的多柔比星，每两天一次(早晨)，从第3天开始，持续14天。对于每隔一次的注射，大鼠仅接受溶媒；
3-Dexra组。(根据法国地区健康局“ARS”于2011年推荐的剂量比率)大鼠每两天用30mg/kg ip剂量的右雷佐生(对照保护剂)同时用3mg/kg ip剂量的多柔比星治疗，从第3天开始，持续14天。对于每隔一次的注射，大鼠仅接受溶媒；
4-AOL组。大鼠用AOL和多柔比星治疗：
o 4mg/kg ip AOL，早晨和晚上，持续72小时，然后首次注射多柔比星；
o在多柔比星注射日(基于Doxo组)：4mg/kg ip AOL与多柔比星注射一起，90分钟后，以4mg/kg ip的剂量第二次注射AOL；
o在非多柔比星注射日：4mg/kg ip AOL，早晨和晚上。
5-AOL/Carv/Enal组。大鼠以与上文AOL组的大鼠类似的方式治疗。用心功能不全的经典治疗(卡维地洛(Carvediol)，一种β受体阻滞剂，剂量为1mg/kg，和依那普利(Enalapril)，一种血管扩张剂，剂量为0.5mg/kg)补充AOL注射。
实施例7：AOL在心血管疾病：肺高压中的作用
本研究旨在研究线粒体在肺血管生理学中的作用，并为肺高压提供新的替代治疗。该疾病的特征在于肺动脉压增加和肺动脉(PA)重塑，导致肺血管阻力增加、右心室肥大、右心衰竭并最终导致死亡。
肺高压可分为5组，其中第1组对应肺动脉高压。至于第3组，它包括由于肺部疾病(如慢性阻塞性肺病)和/或肺泡低氧血症引起的肺高压。
为了解决AOL的作用的问题，使用两种不同的大鼠模型：缺氧模型和野百合碱诱导模型，其分别与第3组和第1组肺高压共有病理生理学特征。
材料与方法
将雄性Wistar大鼠(300-400g)分成3组，并在4周后使用：
o第一组(对照或常氧大鼠-N大鼠)饲养在环境室内空气中；
o第二组(长期缺氧大鼠-CH大鼠)在低压室(50kPa)中暴露于长期缺氧3周，以及
o第三组(MCT大鼠)用野百合碱以60mg/kg的剂量单次腹膜内注射给药。将MCT(Sigma，St Quentin Fallavier，法国)溶解于等体积的HCl(1M)和NaOH(1M)中。
在每组中，一些动物用AOL(Sulfarlem，EG Labo Eurogenerics，压碎的片与食物混合，任意喂食)治疗，而一些其他动物未治疗。每天称重食用的食物以评估施用的AOL剂量。因此，在第二组和第三组的3周实验期间施用10mg/kg/天。
对于每种情况，使用7至10只大鼠。所有的动物护理和实验程序都符合欧洲实验动物科学协会联合会(Federation of European Laboratory Animals ScienceAssociation)的建议，并得到地方伦理委员会(Comitéd’éthique régional d’Aquitaine-编号50110016-A)的批准。
通过测量平均肺动脉压(mPAP)和右心室肥大来评估肺高压。为了测量PAP，用戊巴比妥钠(Centravet)通过腹膜内注射(60mg/kg)麻醉N、CH和MCT大鼠，并且在闭胸大鼠中通过插入在右颈静脉中然后通过右心房和右心室进入肺动脉并连接到Baxter Uniflow表压传感器的导管测量mPAP。通过右心室(RV)与左心室加隔膜(LV+S)重量的比值(富尔顿指数)评估右心室肥大。
通过测量石蜡包埋肺切片的PA中膜厚度的百分比来评估肺动脉(PA)重塑。首先根据常规组织学程序用苏木精和伊红(VWR)对肺切片进行染色。在每个切片上，观察三组具有不同横截面直径的10个腺泡内动脉以评价中层厚度(medial wall thickness)(即横截面直径低于50μm、50-100μm和100-150μm)。
结果
结果表示为n次独立观察的平均值±SEM。所有数据均使用非参数检验对非配对样本进行分析(Mann-Whitney检验)。图13显示了AOL对肺动脉压(图13A)和心脏重塑(图13B)的影响。n表示用于mPAP和富尔顿指数测量的大鼠数量。所有条形图和统计分析均使用Graphpad PRISM软件(v6，Graphpad Software)进行。P<0.05被认为是显著的。如所见，AOL对对照组(N大鼠)没有显著影响。然而，用AOL治疗的MCT大鼠的平均肺动脉压降低，并且用AOL治疗的CH大鼠中的平均肺动脉压甚至更显著地降低。然而，AOL治疗对富尔顿指数没有影响。
图14显示了AOL对肺动脉重塑的影响，n表示分析了中膜厚度测量值％的血管数量。所有条形图和统计均使用Graphpad PRISM软件(v6，Graphpad Software)进行。P<0.05被认为是显著的。AOL在CH大鼠中显示出显著的影响，其中肺动脉直径减小了≈30％。
结论
口服剂量为10mg/kg/天的AOL治疗对预防和/或治疗体内肺高压，尤其是第3组肺高压有显著影响。结果确实显示了临床症状的显著改善。
这些数据表明线粒体在肺血管生理学中起主要作用，并将AOL的用途延伸到治疗肺高压。
实施例8：AOL在衰老疾病和早衰综合征：黄斑变性中的作用
本研究旨在评价AOL保护视网膜免受进行性变性的能力。
材料与方法
将在低强度循环照明下饲养的大鼠转移到高强度循环照明中一周，并分成3组(未治疗的动物、溶媒治疗的动物和AOL治疗的动物)。在转移的这7天中，治疗的动物以6mg/kg/天的剂量接受溶媒或AOL注射，每天三次(开灯前30分钟；下午01.00点；下午9.00点)。一周后，将动物转移到暗处(D0)。
对照组(“未转移”)未转移至高强度循环照明，但接受与上所述相同的治疗：注射溶媒或AOL，每天三次，持续7天，接着转移到暗处(D0)。
在转移到暗处后的第二天(D1)，进行第一次视网膜电图描记术。其测量视网膜响应光刺激而产生的电生理信号。它通常用两种波表征，即a波和b波。a波表示来源于外光感受器层的视锥和视杆的初始角膜负偏转。它反映了由于外节膜中钠离子通道的关闭导致的光感受器的超极化。b波表示来源于内视网膜(主要是Muller和ON双极细胞)的角膜正偏转。视网膜电图的分析在于测量这些波的振幅和/或潜伏期(latency)，其作为光刺激强度的函数。对于给定的光刺激强度，a波振幅取决于光感受器的数量；而对于给定的光刺激强度和给定数量的光感受器，b波的幅度表示信号传输效率。
在D1的视网膜电图描记术后，将动物转移回到低强度循环照明条件下，在D15进行第二次视网膜电图描记术。
然后处死动物进行组织学分析。测量视网膜各层的厚度，尤其是外核层(ONL)和内核层(INL)的厚度(以μm计，从视神经起并且在视盘的上下极中每0.39mm)。
结果
组织学分析在图15中报告。这表明，在对照组(“未转移”)中，用AOL治疗对ONL的厚度没有影响(图15A)。这表明AOL对视网膜的光感受器没有毒性作用。
相反，在未治疗的动物中，在循环高强度照明条件下的转移(“转移”)诱导ONL显著减少(在一些区域减少一半)。然而，AOL倾向于保护ONL免受光诱导损害。在AOL治疗/循环高强度照明暴露的动物中，组织学分析确实显示ONL厚度的显著增加(图15B)。
结论
AOL治疗对视网膜的光诱导损害具有显著的保护作用。具体而言，在延长的循环高强度照明暴露之后，与未治疗的动物相比，视网膜的厚度显示为维持。
实施例9：AOL在与线粒体功能障碍相关的疾病中的作用
本研究旨在在氧化磷酸化功能障碍模型中测试AOL在体内的效应。
材料与方法
在CD1-背景上使用缺乏线粒体Mn-超氧化物歧化酶(Sod2-KO)的小鼠。这种遗传改变导致不良表型和动物在平均8日龄时死亡。线粒体超氧化物歧化酶是一种自由基清除酶，其将超氧化物(高反应活性)转化为过氧化氢(较低反应活性)，其然后可以穿过线粒体膜并通过基质和胞质抗氧化剂体系进行解毒。这项研究的目的是为了测试AOL是否可以通过其对IQ超氧化物产生的活性救援Sod2-KO表型。
出生后，对仔鼠进行基因分型(3日龄)，同胎生仔数减少至每笼6只仔鼠。然后对动物进行治疗(AOL于
Figure BDA0001653039740000461
中–5mg/kg)或不治疗(仅
Figure BDA0001653039740000462
下文记录为KOL)。剂量的选择主要取决于化合物的溶解度极限(在
Figure BDA0001653039740000463
中为2.8mM)和仔鼠的最大可注射体积(每克体重6至7μL)。对同一亲代的两个不同子代进行两项研究：寿命；以及心脏中的琥珀酸脱氢酶活性(SDH)和肝脏中的油红O染色。对动物称重，并且每日(腹膜内)注射。
琥珀酸脱氢酶活性是线粒体基质中超氧化物的标记。因此，缺少SOD2与心脏中SDH活性的降低有关。该实验的目的是测试AOL是否可以恢复KO小鼠的SDH活性。
油红O染色是已经显示在Sod2-KO肝脏中积累的脂质的标记。然而，超氧化物/过氧化氢产生与肝脏脂质聚集之间的直接联系尚未确立。该研究的目的是测试AOL预防Sod2-KO小鼠肝脏脂质聚集的效力。
结果
寿命
组成4个组：
1-WT-KOL(n＝7)，仅用溶媒治疗的野生型小鼠组，
2-WT-AOL(n＝17)，用AOL治疗的野生型小鼠组，
3-KO-KOL(n＝2)，仅用溶媒治疗的Sod2-KO小鼠组，
4-KO-AOL(n＝4)，用AOL治疗的Sod2-KO小鼠组。
动物从3日龄起开始每天注射一次，直至它们死亡。
图16A和图16B显示了体重(A)和初始体重的百分比的变化。这些结果表明，KO小鼠的体重和体重增加低于WT小鼠。然而，从第8天到第12天，用AOL治疗倾向于缓解这种效果，表明该化合物具有潜在的有益作用。
图16C显示了Sod2-KO小鼠的存活比例，无论它们是否用AOL治疗。正如鉴于上述结果所预期的，在KO小鼠中，通过AOL治疗中值寿命和最大寿命均略微改善，与未治疗小鼠相比，经AOL治疗的小鼠寿命延长达2天，支持了AOL的有益效果。
心脏中的SDH活性&油红O染色
组成5个组：
1-WT未注射(n＝6)，未治疗的野生型小鼠组；
2-WT-KOL(n＝6)，仅用溶媒治疗的野生型小鼠组；
3-WT-AOL(n＝6)，用AOL治疗的野生型小鼠组；
4-KO-KOL(n＝4)，仅用溶媒治疗的Sod2-KO小鼠组；
5-KO-AOL(n＝6)，用AOL治疗的Sod2-KO小鼠组。
在该研究中，从第3天到第5天每天(5mg/kg)治疗动物。在第6天收割心脏和肝脏。
正如预期的，与WT动物相比，KO中的SDH活性倾向于降低(不显著)。然而，AOL显示KO小鼠的SDH活性仅有非常轻微的增加，但不能使SDH活性恢复至WT小鼠的水平(图17)。
图18显示脂质液滴平均尺寸(图A)、密度(图B)和面积(图C)。与WT动物相比，未治疗的KO小鼠表现出高脂质含量表型。然而，在AOL治疗的KO小鼠中，与未治疗的动物相比，脂质液滴密度降低。更重要的是，这些结果还显示AOL治疗能够恢复KO小鼠的总脂质面积，与Sod2-KO小鼠体内线粒体超氧化物产生的靶上(on-target)抑制一致。
结论
体内研究显示令人鼓舞的结果。尽管AOL治疗不能完全抵消小鼠的SOD2耗竭的影响，但结果显示，与未治疗的KO动物相比，寿命仍可延长几天，同时缓解体重增加的减少。这表明AOL的潜在作用。
已知AOL的生物利用度非常短。因此，较高剂量的治疗在这些实验中可能会提高AOL的作用。然而，组成型KO仍保持高度不良的表型，只能用一种非常特异性的治疗救援，并且可能需要与其他药物的协同作用。
在体内，结果还显示AOL可以恢复脂质含量和/或防止脂质在Sod2-KO小鼠肝脏中的聚集。
实施例10：AOL在自身免疫疾病：硬皮病中的作用
本研究旨在测试AOL对来自硬皮病患者的成纤维细胞的作用。硬皮病是一种慢性全身性自身免疫疾病，其特征在于胶原合成增加、小血管损伤、激活T淋巴细胞和产生改变的结缔组织。
材料与方法
将来自健康供体和硬皮病患者的成纤维细胞在烧瓶中在完全DMEM培养基(10％FCS，1％抗生素)中培养。6小时贴壁后，细胞除去血清过夜。
临时制备AOL。称重AOL并以5mg/mL溶于DMSO中。将该储备溶液在DMSO中进一步稀释至最终浓度为10和5mM。将AOL在完全DMEM培养基中进一步稀释，以达到40、20和10μM的最终浓度。
培养的细胞与40、20和10μM的AOL接触。对照细胞与补充有DMSO(0.2％)和N-乙酰半胱氨酸(3mM)的完全DMEM培养基接触。细胞在常氧条件(37℃，20％O2)和低氧(37℃，1％O2)下孵育6或24小时。
对于MMP-1、MIP和MCP分泌分析，收获培养物上清液，等分并在-20℃保存用于给药。通过ELISA(Abcam)根据制造商的说明对MMP-1进行定量。通过CBA(流式微珠阵列(Cytometric Bead Array)，Biolegend)对MCP-1和MIP-1α的浓度进行定量。
对于MMP1、胶原和CC12表达分析，细胞用胰蛋白酶分离并用PBS洗涤。然后将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，根据制造商的说明(Nucleospin RNA Plus，Macherey Nagel)进行RNA提取。将1μg RNA逆转录(GoScript，Promega)，然后稀释10倍，然后在BioRadCFX384PCR仪器中进行SYBR Green qPCR(SYBR qPCR Premix Ex Taq，Takara)。使用MMP-1、Col1A2和CCl2的引物来测量感兴趣的基因；使用Ppia、RPLP0和EEF1A1的引物来测量对照基因。

Claims (5)

1.茴三硫在生产用于预防或减轻游离氧自由基相关心血管疾病的药物中的用途，其中所述游离氧自由基相关心血管疾病选自由以下疾病组成的组：蒽环类药物的心脏毒性和肺动脉高压。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述游离氧自由基相关心血管疾病是蒽环类药物的心脏毒性。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述游离氧自由基相关心血管疾病是肺动脉高压。
4.茴三硫在生产用于预防或减轻有需要的受试者的由心脏的缺血和再灌注引起的心脏组织损伤的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述心脏组织损伤的特征在于心脏的收缩活性降低和心肌梗塞。
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