ES2349015T3 - APLICACIONES ANGIOGENICAS E INMUNOLOGICAS DE COMPUESTOS ESPECIFICOS ANTI-CD160 PBTENIBLES A PARTIR DEL AcM CL1-R2. - Google Patents
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Abstract
Compuesto anti-CD160 seleccionado del grupo que consiste en AcM anti-CD160 CL1-R2 obtenible a partir del hibridoma depositado como CNCM I-3204, un fragmento conservativo de dicho AcM CL1-R2 y un derivado conservativo de dicho AcM CL1-R2 que comprende al menos un fragmento de CL1-R2, en el que dicho compuesto anti-CD160 puede competir con el AcM anti-CD160 CL1-R2 por la unión a CD160, y es suficientemente específico de CD160 para unirse a CD160 sin unirse a al menos CD8alfaß.
Description
Aplicaciones angiogénicas e inmunológicas de
compuestos específicos anti-CD160 obtenibles a
partir del AcM CL1-R2.
La presente invención se refiere a un AcM
específico anti-CD160 (CL1-R2
accesible con el número de depósito de hibridoma CNCM
I-3204), a compuestos específicos
anti-CD160 que se derivan del mismo y a las
aplicaciones médicas y biológicas de tales AcM y compuestos
anti-CD160.
La presente invención se refiere más
particularmente a medios para controlar y regular
específicamente:
- -
- la angiogénesis de células endoteliales (CE), y
- -
- la contribución de células NK y T a la regulación del sistema inmunitario.
Los diferentes aspectos de la invención
comparten la característica común de implementar o requerir un
anticuerpo monoclonal anti-CD160 (AcM) de la
presente invención, concretamente el AcM denominado por los
inventores CL1-R2 (depósito según el Tratado de
Budapest de hibridomas CNCM I-3204), o un
equivalente conservativo del
mismo.
mismo.
La presente invención demuestra de hecho que el
receptor CD160 (denominado también anteriormente BY55), que se sabe
que se expresa por los subconjuntos de NK y T citotóxicos
(CD56^{dim} CD16^{brillante} CD3- NK; T CD8+;
TCR\gamma\delta), participa tanto en la regulación del sistema
inmunitario como de la angiogénesis. La estructura de CD160 se ha
descrito extensamente en documentos de la técnica anterior, véase
por ejemplo el documento WO 98/21240 a nombre del
DANA-FARBER CANCER INSTITUTE.
La angiogénesis, la formación de nuevos
capilares a partir de los vasos sanguíneos preexistentes, es un
componente crucial del desarrollo vascular embrionario y la
diferenciación, la curación de heridas y la regeneración de
órganos. Sin embargo, contribuye también a la evolución de
patologías que dependen de la neovascularización, incluyendo
crecimiento tumoral, diabetes, enfermedades oculares isquémicas y
artritis reumatoide (Risau, 1997; Ferrara, 1997). Aunque los
mediadores más importantes de la angiogénesis, la familia del factor
de crecimiento de células endoteliales vasculares (VEGF) y la
familia del factor de crecimiento de fibroblastos están bien
definidos, la angiogénesis sigue siendo un proceso complejo que
implica múltiples productos génicos expresados por diferentes tipos
celulares que contribuyen todos a una secuencia integrada de
acontecimientos.
El documento WO 03/018048 a nombre de ABTECH
et al. se refiere al uso de dos moléculas de HLA de clase I
solubles, concretamente sHLA-G1 y
sHLA-B7, para inhibir la angiogenesis o para
detectar sitios angiogénicos. En apoyo a este efecto
anti-angiogénico está la demostración de que
sHLA-G1 inhibe la proliferación y migración de
células endoteliales (CE). Se demuestra también que sHLAG1 y
sHLA-B7 pueden inhibir la evolución de un tumor
inducido injertando células de adenocarcinoma de próstata humanas en
ratones desnudos.
El documento WO 03/018048 menciona también que
un anticuerpo anti-CD160 denominado
CL1-R2 inhibe la acción ejercida por
sHLA-G sobre la migración de CE. Se deduce a partir
del mismo que BY55 podría ser un receptor endotelial para
sHLA-G (véase el documento WO 03/018048 según se
publicó, página 23 líneas 3-8).
Sin embargo, el experto se daría cuenta de que
el documento WO03/018048 no facilita ninguna fuente públicamente
disponible para el anticuerpo CL1-R2 mencionado.
Por otro lado, HLA solubles, tales como
sHLA-G1 y sHLA-B7, son ligandos
naturales para numerosos receptores.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad en la
técnica anterior de medios que sean suficientemente específicos con
respecto a las rutas de señalización de la angiogénesis para
permitir el esclarecimiento de los mecanismos que implican. También
se necesita especificidad para proporcionar compuestos médicamente
útiles que puedan ejercer un control específico sobre la
angiogénesis sin alterar necesariamente otras rutas de
señalización.
Las células NK constituyen un subconjunto de
linfocitos que desempeñan un papel en la inmunidad innata dirigida
contra células tumorales o infectadas por virus. Sus funciones
efectoras son la destrucción de células diana y la producción de
citocinas. Las células NK usan una combinación de receptores
inhibitorios y activadores expresados en su superficie celular para
mediar la destrucción celular y la liberación de citocinas tras su
interacción con ligandos específicos. Tras el acoplamiento
específico con estos ligandos presentes sobre células diana,
liberan gránulos citolíticos que contienen perforina y granzima que
contribuyen a la apoptosis de células diana. Tras el contacto con
células diana sensibles, producen también varias citocinas,
incluyendo IFN-\gamma,
TNF-\alpha y GM-CSF de manera
temprana en la respuesta inmunitaria innata que modulan la inmunidad
adaptativa regulando la función de células T. La liberación de
IFN-\gamma por células NK tanto en tejidos
inflamados como en órganos linfoides secundarios influye en la
respuesta inmunitaria adaptativa iniciada por células dendríticas.
El IFN-\gamma secretado por células NK uterinas
puede controlar también la vascularización y el desarrollo de la
placenta durante el embarazo.
Sin embargo, se ha demostrado que sólo algunos
receptores activadores de células NK humanas inducen la producción
de citocinas tras el acoplamiento específico. KIR2DL4 (CD158d)
induce la producción de IFN-\gamma en células NK
activadas y en reposo. CD16 es un receptor de Fc\gammaRIII de baja
afinidad responsable de la citotoxicidad celular dependiente de Ac
(ADCC). La señalización a través de CD16 activa la producción de
citocinas, incluyendo IFN-\gamma,
GM-CSF y varias quimiocinas. La incubación de
células NK activadas con AcM anti-NKp30 o
anti-NKp46 condujo a la producción de
IFN-\gamma por células NK. El receptor activador
NKG2D humano que reconoce las moléculas MICA y MICB inducidas por
estrés así como la familia ULBP de moléculas y desempeña un papel
importante en la citotoxicidad mediada por células NK no puede
aparentemente producir citocinas una vez activado por AcM
específicos.
Las células T, incluyendo células T CD8+ y CD4+,
producen también citocinas. Las células Th1 producen
IL-2 e IFN\gamma, mientras que las células Th2
producen IL-4. Las funciones efectoras de las
células T CD8+ coinciden parcialmente con las de las células T
CD4+. Las células T sin tratar pueden diferenciarse en al menos dos
subconjuntos con patrones de citocinas distintos: las células T
citotóxicas 1 secretan un patrón de citocinas similar a Th1,
mientras que las células T citotóxicas 2 secretan citocinas Th2.
Actualmente, es habitual considerar que
TFN-\gamma representa una citocina de tipo 1
típica, mientras que la citocina representativa de la respuesta de
tipo 2 es la IL-4.
Las citocinas intervienen en la diferenciación y
estimulación de clones de células B que producen anticuerpos y la
acción citopática de células T citotóxicas. Asimismo, la secreción
de citocinas influye en la capacidad de destrucción de células de
las células NK, y la capacidad de los macrófagos para fagocitar
diferentes componentes de la placa bacteriana.
La presente invención proporciona medios para
controlar específicamente la regulación por incremento o disminución
de la producción de citocinas. Los medios actúan específicamente
sobre las rutas de señalización de CD160.
Entre los diferentes receptores de células NK
activadores descritos hasta la fecha, CD160 es el único receptor no
expresado de manera clonal en la mayoría de las células NK
circulantes. Las células CD160+ corresponden al subconjunto de NK
CD56^{dim} CD16+ no proliferativo, sumamente citolítico. El
acoplamiento de CD160 con moléculas de HLA-C media
la función citotóxica.
CD160 se expresa por NK CD3- CD56^{dim}
CD16^{brillante} circulantes, que constituyen la mayoría de las
células NK-SP. El subconjunto de células NK
CD56^{dim} es más citotóxico de manera natural y produce menos
citocinas abundantes que el subconjunto CD56^{brillante} tras la
activación por monocitos. El subconjunto de células NK CD56^{dim}
también expresa un patrón específico de receptores de quimiocinas y
moléculas de adhesión. Tal fenotipo es característico de células
efectoras diferenciadas de manera terminal. Las células NK CD160+
tienen una alta actividad citotóxica potencial, no proliferan con
IL-2, y median la lisis celular tras la interacción
con HLA-C. En contraposición a otros receptores de
células NK humanas descritos hasta la fecha, el receptor CD160
parece ser único por los siguientes motivos. Está codificado por un
gen ubicado en el cromosoma 1 humano, es una molécula anclada a
glicosilfosfatidilinositol (GPI) y su expresión en la superficie
celular está modulada por disminución mediante la activación de
células NK mediada por citocinas incluyendo IL-2 e
IL-15. Tal como se describió para los receptores
inhibidores similares a Ig de células citolíticas, CD160 se expresa
también por células T \gamma\delta, y un subconjunto de células
T CD8+ \alpha\beta.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal anti-CD160 (AcM CL1-R2
obtenible a partir del hibridoma TM60 accesible con el número de
depósito de CNCM I-3204) y a los equivalentes
anti-CD160 conservativos del mismo. Más
particularmente, se refiere a las aplicaciones de estos compuestos
anti-CD160 en los campos de la angiogénesis de CE y
la producción de citocinas NK y T.
La presente invención demuestra de hecho que
CD160 se expresa por células endoteliales (CE), y que los compuestos
anti-CD160 de la invención pueden actuar como
ligandos activadores de CD160. La estimulación de la ruta de
señalización de CD160 mediante los compuestos
anti-CD160 de la invención induce un efecto
anti-angiogénico.
La presente invención demuestra también que
CD160 se expresa no sólo por los subconjuntos NK y T citotóxicos,
sino también por células T CD4+ cultivadas con IL-15
(que expresan actividad citotóxica), y que la estimulación de CD160
mediante compuestos anti-CD160 agregados de la
invención conduce a la producción de citocinas. El perfil de
citocinas que se obtiene así es único en comparación con los
obtenidos mediante la estimulación de otros receptores expresados
por NK. También es único en el sentido de que imita muy
estrechamente el perfil de citocinas inducido por la estimulación
de CD160 con ligandos naturales (HLA unido a membrana). Estas
citocinas comprenden en particular IFN-\gamma,
TNF-\alpha e IL-6. Es la primera
vez que se proporcionan compuestos que no son ligandos naturales,
pero que pueden inducir la producción de IL-6 a
partir de células NK. La producción de citocinas inducida por
moléculas de HLA de la membrana celular puede inhibirse usando o
bien los compuestos anti-CD160 de la invención en
forma soluble, o bien compuestos anti-CD160 de la
invención que comprenden al menos un sitio de unión a CD158b además
de su(s) sitio(s) de unión a CD160.
La presente invención abarca por tanto el
hibridoma TM60 como tal, el anticuerpo monoclonal (AcM)
CL1-R2, los compuestos anti-CD160
de la invención, cualquier composición o kit que los comprende y
cualquier fármaco que contiene al menos uno de los mismos.
La presente invención se refiere también a
medios que permiten la identificación de ligandos de CD160,
moléculas de CD160 asociadas a la membrana y segundos mensajeros
citosólicos de CD160.
La presente invención facilita una fuente
públicamente disponible de un anticuerpo monoclonal (AcM) específico
anti-CD160, que los inventores denominan
CL1-R2. Se ha depositado un hibridoma que produce
CL1-R2 en la Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
C.N.C.M., Instituto Pasteur) según las condiciones del Tratado de
Budapest del 28 de abril de 2004 (C.N.C.M. Institut Pasteur 25, rue
du Docteur Roux F-75724 Paris Cedex 15 Francia). El
hibridoma depositado tiene el número de depósito de CNCM
I-3204. La presente invención se refiere por tanto
al hibridoma TM60 accesible con el número de depósito de CNCM
I-3204, así como al AcM anti-CD160
obtenible a partir del mismo (CL1-R2).
La presente invención proporciona también
compuestos anti-CD160 obtenibles a partir de dicho
AcM CL1-R2, por ejemplo como derivados o fragmentos
de CL1-R2.
Los inventores proporcionan además
demostraciones referentes a:
- -
- células endoteliales (CE) y angiogenesis, y a
- -
- células NK y T y producción de citocinas.
Estas demostraciones comparten la característica
común de implementar dicho AcM CL1-R2 o compuestos
anti-CD 160 conservativos obtenidos a partir del
mismo.
La presente invención proporciona la
demostración de que CD160, un receptor que hasta ahora se sabía que
se expresaba por un subconjunto citotóxico de células NK y por
células T CD8+ y TCR\gamma\delta, se expresa también por
células endoteliales (CE) como un receptor de membrana, y que CD160
media la señalización anti-angiogénica de HLA. La
presente invención demuestra también que el AcM
anti-CD160 que se mencionó en el documento WO
03/018048 que inhibía la acción de HLA-G sobre CE
de hecho no la inhibe, sino que la imita.
La presente invención demuestra además que la
unión de, y preferentemente la reticulación de CD160 mediante
compuestos anti-CD160 apropiados inhibe la formación
y el crecimiento de vasos que se induce mediante factores
proangiogénicos tales como VEGF o FGF2 sobre CE. La presente
invención proporciona así la primera demostración directa de que la
formación de nuevos capilares puede regularse y controlarse
realmente, y también proporciona medios industrialmente eficaces
para lo mismo. La presente invención proporciona por tanto
aplicaciones médicas y farmacéuticas reales.
Tales aplicaciones incluyen en particular la
prevención, el alivio de síntomas o el tratamiento de aquellas
patologías o estados que se deben a, o están favorecidos por una
actividad de neovascularización. En estas circunstancias, la
neovascularización está actuando como un componente
pro-patológico. Se considera entonces que la
actividad de neovascularización representa una actividad no deseada,
o que está a un nivel excesivo. Tales patologías o estados
alimentados por la neovascularización comprenden en particular
crecimiento tumoral (por ejemplo el crecimiento de tumores),
diabetes, enfermedades oculares isquémicas y artritis reumatoide.
También incluyen preeclampsia o eclampsia, que se caracterizan por
un suministro de sangre insuficiente en el punto de contacto
feto-placenta (invasión trofoblástica endovascular
inapropiada o insuficiente de las arterias espirales maternas).
Según un aspecto ventajoso de la invención, los
medios apropiados incluyen aquellos compuestos
anti-CD 160 que tienen una afinidad por la unión a
CD160 que es suficientemente alta para competir con
CL1-R2 por la unión a CD160.
Tal como se mencionó anteriormente,
CL1-R2 es el AcM anti-CD160 que se
produce mediante el hibridoma accesible con el número de depósito
de CNCM I-3204. Cuando se refiere a CD160 expresado
por CE, CL1-R2 puede usarse en forma soluble, así
como en forma agregada. Ambas formas inducen la transducción de
señales tras la unión a CD160 (es decir, transducción de una señal
de inhibición de la angiogénesis). La forma agregada sencillamente
tiene una afinidad superior por la unión a CD160 que la forma
soluble.
Los AcM anti-CD160 tienen la
ventaja técnica especial de tener una especificidad que los ligandos
HLA no tienen. Si se administrasen a un organismo vivo, tal como
por ejemplo un ser humano, los ligandos HLA se unirían a CD160 así
como a muchos otros receptores, e inducirían de ese modo reacciones
en cadena completamente descontroladas en dicho organismo. Desde un
punto de vista terapéutico, los ligandos HLA no tienen por tanto
aplicabilidad industrial comprobada.
AcM anti-CD 160 tales como
CL1-R2 son específicos de CD160, es decir, tienen
una afinidad por CD160 que es suficiente para que se unan
esencialmente sólo a CD160, al menos en condiciones similares a
in vivo. Por tanto, al contrario que los ligandos HLA, los
AcM anti-CD160 tienen aplicabilidad industrial como
agentes terapéuticos. La presente invención proporciona por tanto
por primera vez agentes que pueden actuar sobre CD160 como ligandos
activadores, y que pueden usarse también como agentes que van a
administrarse en un organismo vivo que necesita un tratamiento
activador de CD160. En resumen, la presente invención proporciona
los primeros agentes activadores de CD160 terapéuticamente
compatibles.
Tales ligandos candidatos
anti-CD160 apropiados incluyen por supuesto el
propio CL1-R2, así como derivados y fragmentos
conservativos del mismo.
Un aspecto de la presente invención reside
también en el hecho de que proporciona ahora la demostración de que
CD160 no se expresa por células tumorales (células de carcinoma de
pulmón de Lewis), sino que aquellas CE que rodean o se infiltran en
los tumores expresan realmente CD160.
Los AcM anti-CD160 así como
derivados y fragmentos conservativos de la invención pueden usarse
como agentes terapéuticos contra células malignas tales como
leucemia linfocítica crónica (LLC) de células B que expresaban
moléculas de CD160 en su membrana celular.
Los compuestos anti-CD160 de la
invención son por tanto medios muy útiles para prevenir, tratar o
aliviar los síntomas de un desarrollo tumoral.
La presente invención proporciona también medios
para identificar compuestos farmacéuticamente útiles mediante
examen para determinar su unión a CD160, y/o mediante examen para
detectar efectores citosólicos o unidos a membrana específicos de
CD160. Tales efectores representan una diana útil para la terapia
anti-angiogénica.
CD160 pertenece a la familia del supergén de las
inmunoglobulinas. Puede encontrarse información descriptiva sobre
CD160 en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/prow/guide/1660590458g.htm. La
secuencia de ADNc de CD160 humano se describe como SEQ ID NO:1
(1361 pb) en el documento WO 98/21240 (DANA-FARBER
CANCER INSTITUTE). La secuencia de ARNm de CD160 humano está
disponible de Genbank con el número de registro AF060981, la
secuencia de ARNm de CD160 de ratón tiene el número de registro de
Genbank AF060982. La secuencia de proteína de CD160 humano se
describe como SEQ ID NO:2 en dicho documento WO 98/21240, y también
está disponible de Genbank con el número de registro AAC72302 (181
aa).
Pueden aislarse ácidos nucleicos de CD160 a
partir de células que expresan CD160 tras cualquier procedimiento
de rutina que está disponible para el experto [véanse por ejemplo
los procedimientos dados a conocer en Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (2ª Ed., Sambrook, Fritsch y Maniatis, Cold Spring
Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Aufubel,
Brent, Kingston, Más, Feidman, Smith y Stuhl, Greene Publ. Assoc.,
Wiley-Interscience, NY, N.Y. 1992]. Pueden
encontrarse en particular células que expresan CD160 que se producen
de manera natural dentro de células NK y T citolíticas (tales como
células NK CD56^{dim} CD16+ y células TCR\gamma\delta y
TCR\alpha\beta^{+} CD8^{brillante} CD95^{+} CD56^{+}
CD28^{-} CD27^{-}), así como según la presente invención dentro
de células epiteliales y células T CD4+ citotóxicas.
Están disponibles proteínas y polipéptidos de
CD160 aislados tras cualquier procedimiento de rutina que está
disponible para el experto, tal como mediante aislamiento a partir
de células que expresan CD160, o mediante producción recombinante
(véanse los manuales de referencia mencionados anteriormente
-Molecular Cloning, A Laboratory Manual; Current Protocols in
Molecular Biology).
La proteína CD160 ésta también disponible por
supuesto en formas no aisladas, puesto que el acceso a una proteína
CD160 puede lograrse a través de la provisión de una célula que
expresa CD160. Por tanto, las células que expresan CD160 como un
receptor de membrana proporcionan también acceso a una forma no
aislada de CD160.
Para experimentos de unión y/o análisis de la
actividad biológica, las células que expresan CD160 como un
receptor de membrana son una fuente preferida de material de CD160.
Los ejemplos de tales células incluyen en particular células NK y
células T con actividad citolítica o células CE o células T CD4+
citotóxicas recogidas de seres humanos, así como líneas celulares
tales como NK92 (ATCC CRL-2407), HUVEC o células
endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) (Cambrex Bio
Science, Walkersville, Maryland).
También pueden proporcionarse polipéptidos o
proteínas CD160 en una forma agrupada. Los polipéptidos o las
proteínas CD160 pueden unirse por ejemplo a un soporte sólido,
preferentemente un soporte sólido biológicamente inactivo, por
ejemplo perlas recubiertas con CD160.
La presente invención se refiere por tanto a
compuestos anti-CD160, y a las aplicaciones médicas
y/o biológicas de los mismos. Los compuestos
anti-CD160 de la invención se unen a CD160
sustancialmente en el mismo epítopo que CL1-R2, y
preferentemente pueden competir con el AcM
anti-CD160 CL1-R2 (obtenible a
partir del hibridoma depositado como CNCM I-3204)
por la unión a CD160. Preferentemente, los compuestos
anti-CD160 de la invención son suficientemente
específicos de CD160 para unirse a CD160 sin unirse a al menos un
receptor HLA distinto de CD160, tal como por ejemplo
CD8\alpha\beta. La presente invención se refiere además a una
composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto
anti-CD160 de la invención, en la que dicha
composición está prevista para su uso en una terapia
anti-angiogénica, y en particular a un fármaco
anti-angiogénico. La presente invención se refiere
también a una composición farmacéutica que comprende al menos un
compuesto anti-CD160 de la invención, en la que
dicha composición está prevista para la detección de sitios
anti-angiogénicos, y/o para el diagnóstico y/o
pronóstico de una enfermedad o un estado que implica
angiogénesis.
Los compuestos anti-CD160 de la
invención incluyen el propio AcM anti-CD160
CL1-R2.
Se ha comprobado que CL1-R2 es
muy eficaz en la inducción de un efecto
anti-angiogénico tras su unión a CD160, mientras
que se ha comprobado que el AcM anti-CD160 de la
técnica anterior es ineficaz. Por tanto, se cree que la selección
como diana del epítopo de CD160 correcto en CD160 es crucial para
obtener el efecto deseado, concretamente la selección como diana de
un epítopo esencialmente similar al epítopo sobre el que se une
CL1-R2. Por tanto, los compuestos
anti-CD 160 de la invención se unen preferentemente
a CD160 en un epítopo que es esencialmente similar al epítopo sobre
el que se une CL1-R2. Preferentemente, los
compuestos anti-CD160 de la invención se unen a
CD160 humano.
La unión no específica puede inducir efectos
secundarios no deseados en el organismo que recibe un compuesto
anti-CD160. Más particularmente, si fuese a
administrarse un sHLA tal como sHLA-G a un paciente
que necesita un efecto anti-angiogénico (por
ejemplo, un paciente que tiene un tumor), dicho sHLA se uniría a
CD160 e induciría el efecto anti-angiogénico
deseado sobre CE, pero también se uniría a muchos otros receptores
expresados por una diversidad de diferentes células dentro de dicho
paciente. Un sHLA tal como sHLA-G se uniría en
particular a CD8\alpha\beta expresado por células T, e
induciría la apoptosis de estas células T. Un efecto
anti-T de este tipo es sumamente indeseable para el
paciente que padece una enfermedad tal como cáncer. La presente
invención proporciona por primera vez un compuesto
anti-CD160 que es suficientemente específico de
CD160 para inducir una anti-angiogénesis sobre CE,
sin inducir efectos secundarios no deseados o descontrolados, tales
como por ejemplo apoptosis de células T. Por tanto, los compuestos
anti-CD160 de la invención preferiblemente no se
unen a CD8\alpha\beta humano.
A partir de este AcM, el experto habitual en la
técnica puede producir fácilmente derivados y fragmentos
conservativos siguiendo procedimientos rutinarios. Tales derivados
y fragmentos conservativos han conservado la especificidad y
afinidad de unión deseadas, es decir, se califican como
"conservativos" porque todavía se unen a sustancialmente el
mismo epítopo que CL1-R2 y/o pueden competir con
CL1-R2 por la unión a CD160, y han conservado una
especificidad de CD160 suficiente, tal como por ejemplo una
especificidad de CD160 suficiente para no unirse a al menos un
receptor HLA distinto de CD160, tal como CD8\alpha\beta.
Según una característica ventajosa de la
invención, el compuesto anti-CD160 de la invención
no se une al receptor CD85j expresado por T y NK (también
denominado ILT-2). Preferentemente, no se unen a
CD85j humano.
Preferentemente, el compuesto
anti-CD160 de la invención no reacciona de manera
cruzada con ningún receptor de CE distinto de CD 160.
Lo más preferentemente, los compuestos
anti-CD160 de la invención son completamente
específicos de CD160, en el sentido de que no reaccionan de manera
cruzada con ningún receptor de molécula HLA clásico y no clásico
con especificidad o bien de alelo o bien amplia. Estos receptores
incluyen CD8\alpha\beta, CD94 asociado con cada uno de los
productos génicos de la familia NKG2 (ubicados en el cromosoma 12),
y todos los productos de los genes ubicados en el cromosoma 19
incluyendo las familias KIR y ILT/LIR.
La unión o ausencia de unión de un compuesto
anti-CD160 de la invención a un receptor quiere
decir unión o ausencia de unión tal como se observaría en
condiciones fisiológicas, o en condiciones in vitro
que imitan las condiciones in vivo. Cualquier medio
y/o procedimiento que el experto encuentre apropiado para realizar
dicho ensayo de unión es adecuado para determinar si un compuesto se
une a CD160, no se une a ningún otro receptor de CE, no se une a
CD8\alpha\beta y no se une a CD85j. Condiciones ilustrativas
comprenden proporcionar una célula que expresa la diana deseada, tal
como una CE (que expresa CD160 y otros receptores de CE), o una T
CD8+ (que expresa CD160 y CD8\alpha\beta), o tal como se
mostrará a continuación células T CD4+ (que expresan CD160 tal como
se demuestra mediante la presente invención), y poner en contacto
dicha célula que expresa CD160 con el compuesto en condiciones de
concentración de compuesto, duración del contacto, pH y temperatura
que permitirían la unión de la diana expresada por la célula con su
ligando natural. Técnicas ilustrativas para evaluar si un compuesto
se une a CD160 pero no a al menos otro receptor HLA, tal como
CD8\alpha\beta, comprenden en particular:
- -
- análisis de citometría de flujo con células transfectadas que expresan cada uno de los productos génicos que pueden unirse a moléculas de HLA (CD160, CD8\alpha\beta, etc.), y/o
- -
- chips detectores (tales como los chips detectores BR-1000-14, BIACORE AB, Uppsala, Suecia), que pueden recubrirse con ligandos de HLA recombinantes solubles tales como CD160, CD8\alpha\beta, etc. usando un aparato Biacore (BIACORE AB, Uppsala, Suecia).
Fuentes de células que expresan CD160 comprenden
CE recogidas de un individuo sano, o CE de una línea celular tal
como NK92 (número de ATCC CRL-2407), HUVEC, HMVEC
(Cambrex Bio Science, Walkersville, Maryland, EE.UU.). Fuentes de
células que expresan CD8\alpha\beta comprenden células T CD8+,
tales como células T CD8+ recogidas de un individuo sano, o células
T CD8+ de una línea celular tal como MOLT-4 (número
de ATCC CRL-1582). Fuentes de células que expresan
CD85j comprenden células T CD85j+, tales como células T CD85j+ o
monocitos recogidos de un individuo sano, o células T CD85j+ de una
línea celular tal como NAMALWA (número de ATCC
CRL-1432). Fuentes preferidas son las que expresan
la forma humana del receptor diana.
La secuencia humana de CD160 está disponible del
banco de datos del NCBI con los números de registro
NM_007053 (ácido nucleico) y CAG46686 (proteína). La secuencia humana de CD8\alpha está disponible del banco de datos del NCBI con los números de registro M27161 (ácido nucleico) y AAA59674 (proteína). La secuencia humana de CD8\beta está disponible del banco de datos del NCBI con los números de registro M36712 (ácido nucleico) y AAA35664 (proteína). La secuencia humana de CD85j está disponible del banco de datos del NCBI con los números de registro BC015731 y NM006669 (ácido nucleico) y AAH15731 y NP006660.1 (proteína).
NM_007053 (ácido nucleico) y CAG46686 (proteína). La secuencia humana de CD8\alpha está disponible del banco de datos del NCBI con los números de registro M27161 (ácido nucleico) y AAA59674 (proteína). La secuencia humana de CD8\beta está disponible del banco de datos del NCBI con los números de registro M36712 (ácido nucleico) y AAA35664 (proteína). La secuencia humana de CD85j está disponible del banco de datos del NCBI con los números de registro BC015731 y NM006669 (ácido nucleico) y AAH15731 y NP006660.1 (proteína).
Los compuestos anti-CD160 de la
invención son agentes anti-angiogénicos, y de ese
modo son útiles para prevenir o tratar un tumor tal como un
carcinoma, o una leucemia (por ejemplo leucemia linfocítica crónica
de células B). También son útiles para prevenir o tratar la
preeclampsia o la ecplampsia, y/o para prevenir o tratar la
diabetes, una enfermedad ocular isquémica o artritis reumatoide.
Un compuesto anti-CD160
ilustrativo de la invención comprende dicho AcM
CL1-R2. A partir de este AcM, el experto puede
producir derivados y fragmentos conservativos siguiendo
procedimientos rutinarios. Tales derivados y fragmentos
conservativos son equivalentes funcionales de dicho AcM
CL1-R2.
Un "fragmento de anticuerpo" es una parte
de un anticuerpo tal como una cadena pesada, una cadena ligera, una
VH, una VL, Fab, un Fab', un F(ab)2, un F(ab')2
y similares, así como unidades de reconocimiento mínimas que
consisten cada una en los residuos de aminoácido que imitan la
región hipervariable (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDR3L).
Tales fragmentos pueden obtenerse mediante procedimientos
rutinarios, tales como digestión proteolítica (por ejemplo,
digestión con pepsina para generar F(ab')2; digestión con
papaína para generar Fab). Fragmentos preferidos de la invención
son aquellos que son conservativos, es decir, aquellos fragmentos
de CL1-R2 que han conservado dicha especificidad y
afinidad de unión a CD160 deseadas (es decir, han conservado la
característica de unión a CD160 sustancialmente en el mismo epítopo
que CL1-R2 y/o pueden competir con
CL1-R2 por la unión a CD160, y la característica de
unión a CD160 sin unirse a al menos un receptor HLA distinto de
CD160, tal como por ejemplo CD8\alpha\beta). Un fragmento
conservativo preferido de AcM CL1-R2 comprende
fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 o Fv de
dicho AcM CL1-R2. Tales fragmentos conservativos
pueden usarse como tales, para aplicaciones médicas y/o biológicas.
No obstante, fragmentos no conservativos tales como una CDR de
CL1-R2 en forma aislada también son un objeto de la
presente invención, ya que pueden combinarse entre sí para formar
un derivado conservativo de CL1-R2.
Los compuestos anti-CD160 de la
invención también comprenden los derivados conservativos de dicho
AcM CL1-R2, es decir, cualquier compuesto
anti-CD160:
- -
- que es un derivado de CL1-R2 en el sentido de que comprende al menos un fragmento de CL1-R2 (preferentemente al menos una CDR de CL1-R2, preferiblemente al menos una CDR3 de CL1-R2), y
- -
- que también es conservativo en el sentido de que el derivado resultante ha conservado una afinidad de unión a CD160, y también ha conservado dicha especificidad de unión a CD160 (es decir, ha conservado la característica de unión a CD 160 sustancialmente en el mismo epítopo que CL1-R2 y/o puede competir con CL1-R2 por la unión a CD160, y la característica de unión a CD160 sin unirse a al menos un receptor HLA distinto de CD160, tal como por ejemplo CD8\alpha\beta).
A partir de CL1-R2, el experto
puede obtener de hecho derivados conservativos mediante síntesis y/o
ingeniería genética. El experto puede obtener derivados
conservativos ilustrativos de conformidad con estos procedimientos
rutinarios. El derivado conservativo de la invención puede ser
monovalente (un sitio de unión a CD160), o multivalente (al menos
dos sitios de unión a CD160). Los derivados conservativos
multivalentes preferidos incluyen derivados conservativos
tetravalentes. Por ejemplo, incluyen derivados que son anticuerpos
quiméricos que pueden obtenerse injertando al menos un fragmento Fv
de CL1-R2 en un fragmento Fc derivado de otro
anticuerpo. El fragmento Fc se elige preferentemente para que sea
tan poco inmunorreactivo como sea posible para el organismo al que
va a administrarse dicho fármaco. Por ejemplo, cuando el fármaco
está destinado a administrarse a un ser humano, dicho fragmento Fc
es preferentemente un fragmento Fc humano. Los derivados
conservativos de la invención también incluyen anticuerpos
humanizados, que pueden obtenerse injertando al menos una CDR de
CL1-R2 en una región de entramado de anticuerpo
humano (hFR). El objetivo también es en este caso proporcionar al
organismo al que va a administrarse dicho fármaco un compuesto que
induce tan pocos efectos secundarios inmunogénicos no deseados como
sea posible. Los derivados conservativos de la invención también
incluyen derivados que pueden obtenerse injertando al menos una
región VH de CL1-R2 en al menos una región VL,
opcionalmente a través de un ligador (L), tal como un ligador
peptídico. El experto conoce tales moléculas como scFv. Pueden ser
monoméricas o multiméricas. Ligadores apropiados son aquellos que
permiten que los dominios VH y VL se plieguen en una cadena
polipeptídica única que tiene una estructura tridimensional muy
similar a la estructura original del anticuerpo completo, y por
tanto mantienen la especificidad de unión. El experto conoce tales
ligadores apropiados. Se describe un método ilustrativo para
producir tales ligadores en el documento WO 88/01649 a nombre de
GENEX Corp. (documentos US 4.946.778 y US 5.260.203). Dicho
derivado conservativo de AcM CL1-R2 puede ser
monovalente o
multivalente.
multivalente.
Un derivado conservativo ilustrativo de AcM
CL1-R2 comprende al menos un compuesto de scFv que
comprende al menos una región CL1-R2 VH de
CL1-R2 unida a al menos una región
CL1-R2 VL de CL1-R2 a través de un
conector peptídico (L). El scFv puede tener una orientación
VL-L-VH (véase por ejemplo el
documento WO 88/01649 a nombre de GENEX Corp., documentos US
4.946.778 y US 5.260.203), o una orientación
VH-L-VL (véase por ejemplo el
documento WO 88/09344 a nombre de CREATIVE BIOMOLECULES Inc.,
documentos US 5.132.405; US 5.091.513; US 5.258.498; US 5.476.786;
US 5.482.858; US 6.207.804 B1). El scFv puede ser monovalente o
multivalente (agregación de varios scFv).
El derivado conservativo ilustrativo comprende
en particular un multímero de scFv derivado de dicho AcM
CL1-R2, unido a un fragmento Fc.
Otro derivado conservativo ilustrativo de AcM
CL1-R2 es un compuesto que comprende al menos un
fragmento Fv de CL1-R2 unido a un Fc humano.
Puede obtenerse otro derivado conservativo
ilustrativo de AcM CL1-R2 añadiendo uno o más Fab
derivados de dicho AcM CL1-R2 en el extremo
C-terminal de cada cadena H del AcM
CL1-R2 de longitud completa.
Puede obtenerse otro derivado conservativo
ilustrativo de AcM CL1-R2 uniendo covalentemente AcM
CL1-R2 de longitud completa entre sí para formar
una forma de Ac agregado.
Puede obtenerse otro derivado conservativo
ilustrativo de AcM CL1-R2 uniendo dos o más Fab de
cabeza a cola.
Puede obtenerse un scFv multivalente según la
presente invención uniendo al menos dos scFv en un multímero. La
unión puede lograrse de manera covalente o de manera no covalente.
scFv multivalentes ilustrativos son scFv tetraméricos. Los scFv
multivalentes tienen más de un sitio de unión. Por tanto, pueden
producirse scFv multiméricos que tienen varios sitios de unión a
CD160, para proporcionar un compuesto anti-CD160 con
avidez potenciada por CD160. Tales scFv multiméricos son
particularmente ventajosos según la presente invención. Los scFv
multiméricos pueden ser monoespecíficos, es decir, todos sus sitios
de unión seleccionan como diana CD160. Alternativamente, los scFv
multiméricos pueden comprender uno o más sitio(s) de unión a
CD160, así como uno o más otro(s) sitio(s) de unión
para la unión a una diana diferente de CD160. Tal(es)
otro(s) sitio(s) de unión puede(n) seleccionar
como diana un compuesto que es diferente de CD160, pero que todavía
se expresa por CE, de modo que dirige la acción del compuesto hacia
CE más eficazmente.
Ejemplos de tal(es) otra(s)
diana(s) comprenden receptores de VEGF y todos los receptores
que inducen el crecimiento de CE tras su unión con su ligando
fisiológico.
scFv multiméricos bi o multiespecíficos son
medios terapéuticos particularmente ventajosos. El experto conoce
métodos para producir scFv multiméricos, véase por ejemplo el
documento WO 94/13806 a nombre de The DOW CHEMICAL Company
(documentos US 5.877.291 y US 5.892.020), documento WO 93/11161 a
nombre de ENZON Inc. (documentos US 6.515.110 B1; US 6.121.424; US
6.027.725; US 5.869.620).
Pueden obtenerse otros derivados multivalentes
conservativos mediante:
- -
- la unión de un multímero de scFv a un fragmento Fc, o mediante
- -
- la adición de uno o más Fab en el extremo C-terminal de cada cadena H de la IgG CL1-R2 de longitud completa, o mediante
- -
- la unión covalente de CL1-R2 de longitud completa para formar un Ac multivalente, o mediante
- -
- la unión de dos o más Fab de cabeza a cola (véase por ejemplo Miller et al. 2003 "Design, Construction, and in vitro analysis of multivalent antibodies" The Journal of Immunology, 170:4854-4861).
La presente invención proporciona una
composición farmacéutica que comprende como principio activo un
compuesto anti-CD160 de la invención, para su uso
en diagnóstico y/o pronóstico y/o terapia. Dicha composición puede
estar en cualquier forma farmacéutica adecuada para su
administración a un paciente, incluyendo, pero sin limitarse a,
disoluciones, suspensiones, polvos liofilizados, cápsulas y
comprimidos. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden
comprender además cualquier adyuvante, excipiente, vehículo o
diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica
de la invención puede formularse para inyección, por ejemplo
inyección local, administración transmucosa, inhalación,
administración oral y más generalmente cualquier formulación que el
experto encuentre apropiada para lograr el pronóstico y/o el
diagnóstico y/o la terapia deseados. El compuesto
anti-CD160 de la invención está contenido en dicha
composición farmacéutica en una cantidad eficaz para lograr el fin
pretendido, y en dosificaciones adecuadas para la vía de
administración elegida. Más específicamente, una dosis
terapéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto
eficaz para prevenir, aliviar o mejorar síntomas de la enfermedad o
el estado del sujeto que está tratándose, o para detener dicha
enfermedad o estado.
Dependiendo de la aplicación pretendida, los
compuestos anti-CD160 de la invención, ya estén como
fragmentos de CL1-R2 o como derivados de
CL1-R2, pueden comprender además constituyentes
adicionales. Por ejemplo, cuando el compuesto
anti-CD160 de la invención está destinado al
pronóstico o diagnóstico, puede comprender además un marcador
detectable, tal como un fluorocromo, o una entidad con actividad
enzimática, o con radioactividad, y más generalmente cualquier
entidad que permita la detección de dicho compuesto. Cuando el
compuesto está destinado a su administración terapéutica a un
organismo que lo necesita, puede comprender además una inmunotoxina
y/o un radioelemento. Los compuestos anti-CD160 de
la invención pueden usarse por supuesto alternativamente para la
detección de sitios anti-angiogénicos. Por tanto, la
presente invención también se refiere a un kit o una composición
farmacéutica que comprende al menos un compuesto
anti-CD160 de la invención, que está destinado a la
detección de sitios anti-angiogénicos.
La presente invención también se refiere al uso
de un compuesto anti-CD 160 de la invención para la
identificación de un compuesto anti-angiogénico. De
hecho, la presente invención proporciona la demostración de que CD
160 se expresa por células endoteliales (CE), y que los compuestos
anti-CD160 de la invención se unen a CD160
expresado por CE y después de ello inducen un efecto
anti-angiogénico sobre dicha CE. Los compuestos
anti-CD160 de la invención tienen la capacidad
ventajosa para actuar como un ligando extracelular activador de
CD160.
Por tanto, pueden encontrarse compuestos
equivalentes mediante aislamiento y/o identificación de compuestos
que muestran especificidad y afinidad equivalente por la unión a
CD160, es decir, que tienen la capacidad para competir con un
compuesto anti-CD 160 de la invención (tal como el
propio CL1-R2) por la unión a CD160, y que son
suficientemente específicos de CD160 para unirse a CD160 sin unirse
a al menos un receptor HLA distinto de CD160, tal como
CD8\alpha\beta. Puede lograrse una identificación y/o
aislamiento de este tipo mediante por ejemplo un método de
selección, tal como por ejemplo selección de alto rendimiento. Por
tanto, la presente invención también se refiere a un kit o una
composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto
anti-CD 160 de la invención, estando destinado
dicho kit o composición farmacéutica a la identificación y/o
aislamiento de un compuesto anti-
angiogénico.
angiogénico.
Por tanto, la presente invención también se
refiere al uso y más particularmente al uso in vitro del AcM
CL1-R2 anti-CD160 (obtenible a
partir del hibridoma depositado como CNCM I-3204), o
de un fragmento conservativo del mismo, o de un derivado
conservativo del mismo, para la identificación y/o el aislamiento de
un compuesto anti-angiogénico, en el que dicho
fragmento o derivado puede competir con CL1-R2 por
la unión a CD160, y es suficientemente específico de CD160 para
unirse a CD160 sin unirse a al menos un receptor HLA distinto de
CD160, tal como CD8\alpha\beta, y en el que dicho derivado
comprende al menos un fragmento de CL1-R2.
Más particularmente, la presente invención
abarca un método para identificar un compuesto
anti-angiogénico, caracterizado porque
comprende
- -
- proporcionar un compuesto candidato,
- -
- determinar si dicho compuesto candidato:
- \circ
- tiene la capacidad de competir con CL1-R2 por la unión a CD160, y
- \circ
- no se une a al menos un receptor HLA distinto de CD160, tal como CD8\alpha\beta,
- -
- identificar dicho compuesto candidato como un compuesto específico anti-angiogénico si realmente tiene dicha especificidad y afinidad de unión a CD160.
Puede proporcionarse cualquier compuesto
candidato que el experto encuentre apropiado para la implementación
del método de la invención. Pueden encontrarse compuestos candidatos
ilustrativos por ejemplo en colecciones químicas o biológicas,
tales como por ejemplo péptidos virales o péptidos que se derivan de
patógenos (por ejemplo péptidos de Cytomegalovirus).
La diana CD160 que va a usarse para la
implementación de los métodos de la invención puede proporcionarse
en cualquier forma que el experto encuentre apropiada. Puede
proporcionarse por ejemplo en forma de una célula que expresa CD160
como receptor de membrana funcional. Células ilustrativas comprenden
en particular CE. Pueden obtenerse CE a partir de líneas celulares
tales como HUVEC, HMVEC, NK92 (véase el ejemplo 2 más adelante).
También pueden obtenerse CE mediante recogida y aislamiento a partir
de un individuo sano. La diana CD160 también puede proporcionarse
en forma de proteínas CD160 recombinantes solubles
(Flag-CD160 o GST-
CD160).
CD160).
La presente invención también se refiere al uso,
y más particularmente al uso in vitro de un compuesto
anti-CD 160 de la invención como ligando activador
de CD160 para identificar un transductor o efector molecular de
CD160, es decir, el uso de un compuesto anti-CD160
de la invención como ligando de CD160 para identificar una molécula
que participa en la transducción de señales
anti-angiogénicas mediada por un CD160 expresado
por CE. Tales efectores y transductores son dianas celulares
preferidas para fármacos anti-angiogénicos, tales
como fármacos antitumorales. La presente invención también se
refiere por tanto a un kit o una composición farmacéutica que
comprende al menos un compuesto anti-CD160 de la
invención, estando destinado dicho kit o composición farmacéutica a
la identificación y/o aislamiento de una molécula de membrana
asociada a balsas lipídicas
("lipid-RAFT") que participa en la
transducción de señales anti-angiogénicas de CD160,
y/o de un mensajero secundario que participa en la transducción de
señales anti-angiogénicas de CD160. La presente
invención también se refiere a un método para identificar una
molécula de membrana asociada a balsas lipídicas que participa en
la ruta de señalización anti-angiogénica de CD160
cuando se expresa por una célula endotelial, caracterizado porque
comprende:
- -
- activar un CD160 expresado en una CE con CL1-R2 o con un derivado o fragmento conservativo del mismo, por ejemplo proporcionando una CE que expresa CD160 y poniéndola en contacto con CL1-R2 o con un derivado o fragmento conservativo del mismo de modo que se agregue a CD 160,
- -
- lisar dicha célula de modo que se recupere la fracción del dominio de balsa lipídica de dicha célula, por ejemplo lisando dicha célula de modo que se disocien los complejos de membrana (por ejemplo usando un detergente fuerte tal como NP40), y recuperando una fracción de dicho lisado que comprende al menos un dominio de balsa lipídica,
- -
- identificar dentro de dicha fracción de balsa un compuesto que parezca ser específico de CD160:
- \circ
- mediante comparación con los compuestos control que se obtienen en condiciones similares pero usando un Ac control que corresponde con el isotipo no reactivo en lugar de dicho CL1-R2 o derivado o fragmento conservativo, y
- \circ
- mediante comparación con los compuestos control que se obtienen en condiciones similares pero usando un compuesto que no se une a CD160 pero se une a otro receptor expresado por CE,
- -
- opcionalmente, recuperar dicho al menos un compuesto específico de CD160 así identificado,
- -
- opcionalmente, secuenciar o microsecuenciar este/estos compuesto(s).
mediante lo cual dicho al menos un compuesto
específico de CD160 así identificado es una molécula de membrana
asociada a balsas lipídicas que participa en la ruta de señalización
anti-angiogénica de CD160.
Para lograr la comparación requerida con dichos
controles, puede usarse cualquier medio y/o método que el experto
pueda encontrar apropiado para comparar los patrones de proteínas.
Por ejemplo, dicha fracción de balsa puede colocarse por ejemplo
para lograr su migración en un gel bidimensional (pH/PM), y
revelarse los puntos de proteínas con nitrato de plata. Dicho Ac
control que corresponde con el isotipo no reactivo es un Ac no
relevante que tiene el mismo isotipo que CL1-R2,
pero que no se une a CD160, y tampoco se une a ningún compuesto que
pueda encontrarse dentro o sobre dicha CE. Dicho Ac control que
corresponde con el isotipo no reactivo puede ser por ejemplo una Ig
de ratón no relevante. Dicho compuesto no se une a CD160 pero se une
a otro receptor expresado por CE que puede ser por ejemplo un Ac
dirigido a un receptor de CE distinto de CD160, tal como un
receptor anti-VEGF cuando se usa CE.
Puede usarse cualquier CE que exprese CD160.
Células ilustrativas comprenden en particular CE obtenibles a
partir de líneas celulares tales como HUVEC, HMVEC, NK92 (véase el
ejemplo 2 más adelante), o mediante recogida y aislamiento a partir
de un individuo sano.
La presente invención también se refiere a un
método para identificar un mensajero secundario que participa en la
transducción de señales anti-angiogénicas de CD 160
cuando se expresa por una célula endotelial, caracterizado porque
comprende:
- -
- activar un CD160 expresado sobre una CE con CL1-R2, por ejemplo proporcionando una CE que expresa CD160 y poniéndola en contacto con CL1-R2 de modo que se agregue a CD160,
- -
- lisar dicha célula en condiciones suaves de modo que se conservan esencialmente los supuestos complejos formados sobre CD 160 (por ejemplo usando un detergente suave tal como BRIJ58® o BRIJ98®, SIGMA),
- -
- opcionalmente aclarar previamente el lisado,
- -
- recuperar CL1-R2 así como cualquier compuesto que pueda asociarse al mismo, por ejemplo mediante inmunoprecipitación con un Ac de cabra anti-ratón,
- -
- llevar a cabo un ensayo de cinasa in vitro,
- -
- identificar al menos un compuesto que ha incorporado al menos un compuesto de fósforo como resultado de dicho ensayo de cinasa in vitro,
mediante lo cual dicho al menos un compuesto
identificado es un mensajero secundario que participa en la
transducción de señales de CD160
(anti-angiogénicas),
- -
- opcionalmente recuperar dicho al menos un compuesto identificado,
- -
- cuando dicho al menos un compuesto identificado comprende una proteína o un constituyente polipeptídico:
- \circ
- opcionalmente llevar a cabo una digestión con tripsina de dicho al menos un compuesto recuperado,
- \circ
- opcionalmente secuenciar o microsecuenciar dicho al menos un compuesto recuperado y comparar la secuencia peptídica así obtenida con las disponibles en bancos de datos de proteínas, o tras un procedimiento de espectrometría de masas tal como el descrito por Bruyns E, Marie-Cardine A, Kirchgessner H, Sagolla K, Shevchenko A, Mann M, Autschbach F, Bensussan A, Meuer S, Schraven B. "T cell receptor (TCR) interacting molecule (TRIM), a novel disulfide-linked dimer associated with the TCR-CD3-zeta complex, recruits intracellular signalling proteins to the plasma membrane" J Exp Med. 1998 Aug 3; 188(3):561-75.,
- de modo que se obtiene la secuencia de dicha proteína o constituyente polipeptídico.
El experto conoce bien ensayos de cinasa
in vitro. Se usa habitualmente un compuesto de fósforo
detectable (tal como fósforo radiactivo proporcionado mediante por
ejemplo P^{32}-ATP, un compuesto de fósforo
luminiscente o fluorescente) para tal ensayo de cinasa in
vitro. Se describe un procedimiento experimental ilustrativo
en Bruyns E, Marie-Cardine A, Kirchgessner H,
Sagolla K, Shevchenko A, Mann M, Autschbach F, Bensussan A, Meuer
S, Schraven B. "T cell receptor (TCR) interacting molecule (TRIM),
a novel disulfide-linked dimer associated with the
TCR-CD3-zeta complex, recruits
intracellular signalling proteins to the plasma membrane" J Exp
Med. 1998 Aug 3; 188(3):561-75.
Para identificar dicho al menos un compuesto que
ha incorporado al menos un compuesto de fósforo, puede usarse
cualquier medio y/o procedimiento que el experto encuentre
apropiado. Puede realizarse por ejemplo mediante migración de dicha
fracción de complejo CL1-R2 sobre un gel de
poliacrilamida, opcionalmente inmunotransferencia de tipo Western
con anti-fosfoTyr y/o fosfoSer y/o fosfoThr, y
detectando la fosforilación incorporada (con un contador de
centelleo de radiactividad cuando se ha usado P^{32}), recuperando
la banda correspondiente (por ejemplo mediante elución). El experto
también puede encontrar un procedimiento experimental ilustrativo
en Nikolova et al. 2002 ("BY55/CD160 acts as a
co-receptor en TCR signal transduction of a human
circulating cytotoxic effector T lymphocyte subset lacking CD28
expression" International Immunology vol. 14, n.º 5, pág.
445-451).
Los inventores han identificado mensajeros
secundarios ilustrativos que participan en la transducción de
señales de CD160 (anti-angiogénicas). Comprenden en
particular pi-3-cinasa y lck
(p56).
Los inhibidores de moléculas asociadas a
membrana y/o mensajeros secundarios citosólicos pueden tener
aplicabilidad terapéutica. Pueden asociarse ventajosamente con un
compuesto que aumente la especificidad de su administración.
La presente invención proporciona la
demostración de que la producción de citocinas por células NK y T
usa la ruta de señalización de CD160 en células NK y T, y que puede
controlarse mediante compuestos anti-CD160
agregados para la regulación por incremento, o mediante compuestos
anti-CD160 solubles o agentes de reticulación de
CD160-CD158b para la regulación por disminución. La
presente invención proporciona compuestos específicos
anti-CD160 que pueden ejercer específicamente estos
controles sobre CD160.
La presente invención también demuestra que la
reticulación de CD160 con CD158b induce una inhibición de la
activación de CD160, dando como resultado de ese modo una inhibición
de la producción de citocinas.
El perfil de citocinas que se induce mediante la
estimulación de CD160 es único en comparación con el obtenido
mediante la estimulación de otros receptores expresados por NK tales
como CD16 o NKG2D. El perfil de citocinas activado por CD160 es
único también en el sentido de que imita muy estrechamente el
obtenido mediante la estimulación con el ligando de CD160 natural
(sHLA).
La estimulación de CD160 induce la producción y
secreción de IFN\gamma, TNF\alpha e IL-6.
Excepto por el ligando natural sHLA, es la primera vez que se
proporciona un ligando que induce la producción de
IL-6 a partir de células NK.
Los ligandos de CD160 proporcionados por la
presente invención son compuestos específicos
anti-CD160. Comprenden en particular el anticuerpo
monoclonal anti-CD160 denominado por los inventores
CL1-R2. Se ha depositado un hibridoma que produce
CL1-R2 en la Colección Nacional de Cultivos de
Microorganismos (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes) según el Tratado de Budapest con el número de
registro de depósito de CNCM 1-3204 (C.N.C.M.
Institut Pasteur 25, rue du Docteur Roux F-75724
Paris Cedex 15 Francia).
La presente invención también describe que CD160
se expresa por células T CD4+. Tales detecciones de CD160 podrían y
pueden hacerse porque la presente invención proporciona un compuesto
específico anti-CD160 públicamente disponible. Se
han identificado en particular células CD160+ CD4+ dentro de una
muestra de piel de un paciente humano que padece dermatitis
atópica.
Los compuestos anti-CD160 de la
invención que son útiles para regular la producción de citocinas de
células NK y T son idénticos a los que se han descrito
anteriormente para CE y angiogénesis: comprenden el AcM
CL1-R2 de la invención así como los derivados y
fragmentos conservativos del mismo. La descripción estructural, la
afinidad y las propiedades específicas que se han descrito para los
compuestos anti-CD160 de la invención en el
contexto de la angiogénesis de CE se aplican por tanto cambiando lo
que se deba cambiar a los compuestos anti-CD160 de
la invención en el contexto de la regulación de la producción de
citocinas de células NK y T. Además, de manera similar a lo que se
ha descrito en detalle en el contexto de la regulación de la
angiogénesis de CE, la unión no específica o unión a dianas no
deseadas, es decir, receptores HLA distintos de CD160, tales como
CD8\alpha\beta y/o CD85j y/o CD4 no es ventajosa, puesto que
tales compuestos inducirían una reacción en cadena descontrolada en
el organismo al que se administrasen. Inducirían en particular
apoptosis de células T si comprenden un ligando anti-
CD8.
CD8.
Sin embargo, hay una diferencia funcional entre
los compuestos anti-CD160 de la invención cuando se
usan como ligandos de CD 160 expresado como un receptor inmunitario
sobre células NK y/o T, y los compuestos anti-CD160
de la invención cuando se usan como ligandos de CD160 expresado como
un receptor de células endoteliales. Cuando se refiere a la
producción de citocinas y células NK y T, de hecho debe
diferenciarse funcionalmente entre compuestos
anti-CD160 solubles y agregados. Los compuestos
anti-CD160 solubles de la invención inducen una
inhibición de la ruta de señalización de CD160 (es decir, inhibición
de la producción de citocinas), mientras que las formas agregadas
de los compuestos anti-CD160 de la invención inducen
una estimulación de CD160 (es decir, inducción de o estimulación de
la producción de citocinas).
La presente invención también se refiere por
tanto a compuestos anti-CD160 que comprenden el AcM
CL1-R2 anti-CD160 (obtenible a
partir del hibridoma depositado como CNCM I-3204), y
cualquier compuesto que pueda competir con CL1-R2
por la unión a CD160, y que sea suficientemente específico de CD160
para unirse a CD160 sin unirse a al menos un receptor HLA distinto
de CD160, tal como y preferentemente CD8\alpha\beta.
Preferentemente, los compuestos anti-CD 160 de la
invención no se unen además a CD85j y/o CD4. Lo más preferentemente,
los compuestos anti-CD160 de la invención no se
unen a ningún receptor HLA distinto de CD 160. La presente invención
también se refiere a una composición farmacéutica, tal como un
fármaco, que comprende un compuesto anti-CD160 de
la invención.
Un fármaco de este tipo es útil para inducir o
inhibir, y/o regular por incremento o disminución la producción de
citocinas de un individuo. Dichas citocinas comprenden en particular
IFN\gamma y/o TNF\alpha y/o IL-6. Un fármaco de
este tipo es útil para el tratamiento (curación y/o prevención y/o
paliativo) de cualquier enfermedad o estado que implique una
producción de citocinas insuficiente o excesiva.
Un fármaco de este tipo puede ser por tanto útil
para inducir o inhibir, y/o regular por incremento o disminución el
potencial de inmunidad adaptativa de dicho individuo. Permite por
tanto la regulación de una respuesta Th1. Dicho fármaco también
puede estar destinado al tratamiento o la prevención de una
infección. Dicho fármaco también puede estar previsto como un
producto adicional, tal como un adyuvante, en un procedimiento de
vacuna para inducir y/o amplificar respuestas de linfocitos T
citotóxicos (CTL) específicas. Dicho fármaco también puede estar
destinado a inducir o inhibir, y/o regular por incremento o
disminución la hematopoyesis en un individuo, para el tratamiento
(curación o paliativo o preventivo) de individuos irradiados y/o
para el tratamiento o la prevención de aplasia de médula ósea. Un
fármaco de este tipo sería muy útil entonces para pacientes que se
han sometido a irradiación en un tratamiento previo al trasplante o
como tratamiento antitumoral: los compuestos
anti-CD160 de la invención pueden de hecho ayudarles
a restaurar su población de células sanguíneas.
Dicho fármaco también puede estar destinado a
inducir o inhibir, y/o regular por incremento o disminución una
reacción inflamatoria en dicho individuo, y/o al tratamiento o la
prevención de una alergia en dicho individuo, tal como dermatitis
atópica. Dicho fármaco también puede estar destinado a inducir
vasodilatación.
Cuando está destinado a inhibir y/o regular por
disminución la producción de citocinas de un individuo, un
compuesto anti-CD160 de la invención puede
comprender al menos un sitio de unión a CD158b además de
su(s) sitio(s) de unión a CD160. La reticulación de
CD160 y CD158b induce de hecho una inhibición de la ruta de
señalización de CD160. Alternativamente, el compuesto
anti-CD160 de la invención puede proporcionarse en
forma soluble. Cuando se proporcionan en forma soluble, los
compuestos anti-CD160 de la invención inhiben de
hecho la ruta de señalización de CD160. Por forma "soluble"
quiere decirse en el presente documento una forma "soluble"
tal como está previsto por el experto en el campo de las
interacciones receptor del sistema
inmunitario-ligando. Más particularmente, el hecho
de que un ligando esté en forma soluble implica que dicho ligando
tiene uno o dos, pero no más de dos, sitio(s) de unión para
la diana activadora, es decir, en el presente documento para CD160.
A la inversa, el hecho de que un ligando esté en forma agregada
implica que dichos ligandos tienen al menos tres sitios de unión
para la diana activadora, es decir, en el presente documento para
CD160.
\newpage
Los compuestos anti-CD160 de la
invención en forma soluble comprenden el AcM
anti-CD160 obtenible a partir del hibridoma CNCM
I-3204 (IgG). También comprenden los fragmentos
conservativos de CL1-R2, es decir los fragmentos de
CL1-R2 que han conservado una afinidad por la unión
a CD160, y más particularmente la capacidad para competir con
CL1-R2 por la unión a CD160, y que han conservado
una especificidad de CD160 suficiente para unirse a CD160, sin
unirse a al menos CD8\alpha\beta. Tales fragmentos conservativos
comprenden en particular los fragmentos Fab, Fab',
F(ab)2, F(ab')2 y Fv de dicho AcM
CL1-R2. Los compuestos anti-CD160 de
la invención en forma soluble también comprenden derivados
conservativos mono o divalentes de CL1-R2, es decir,
un
compuesto:
compuesto:
- -
- que comprende al menos un fragmento de dicho AcM CL1-R2, y
- -
- que ha conservado la capacidad para competir con CL1-R2 por la unión a CD160, y también ha conservado una especificidad de CD160 suficiente para unirse a CD160 sin unirse a al menos CD8\alpha\beta,
- -
- en el que dicho derivado tiene uno o dos sitio(s) de unión a CD160.
Derivados conservativos mono o divalentes
ilustrativos de CL1-R2 comprenden:
- -
- cualquier forma de Ac humanizado de CL1-R2, o
- -
- cualquier forma de Ac quimérico de CL1-R2, o
- -
- cualquier scFv mono o divalente derivado de CL1-R2, opcionalmente unido a un fragmento Fc, o
- -
- un fragmento Fv de CL1-R2 unido a un fragmento Fc, o
- -
- un Ac CL1-R2 de longitud completa que comprende un Fab de CL1-R2 adicional en cada una de sus cadenas H.
Cuando está destinado inducir y/o regular por
incremento la producción de citocinas de un individuo, los
compuestos anti-CD160 de la invención pueden
proporcionarse en forma agregada, es decir como un compuesto que
comprende al menos tres sitios de unión a CD160 y ningún sitio de
unión a CD158b. Tales formas agregadas de los compuestos
anti-CD160 de la invención pueden obtenerse mediante
agregación de las formas solubles de los compuestos
anti-CD160 de la invención. Pueden obtenerse formas
agregadas mediante manipulación genética o de manera química con
ligadores.
La presente invención también se refiere al uso
del AcM CL1-R2 anti-CD160 (obtenible
a partir del hibridoma TM60 depositado como CNCM
1-3204), o de un fragmento conservativo del mismo, o
de un derivado conservativo del mismo, para la identificación y/o
el aislamiento de un compuesto que tiene la capacidad para inducir o
inhibir, y/o para regular por incremento o disminución la
producción de citocinas de una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o
una célula T CD4+, en el que dicho fragmento o derivado puede
competir con CL1-R2 por la unión a CD160, y es
suficientemente específico de CD160 para unirse a CD160 sin unirse a
al menos CD8\alpha\beta, y en el que dicho derivado comprende
al menos un fragmento de CL1-R2.
Más particularmente, la presente invención
abarca un método para identificar un compuesto que tiene la
capacidad para inducir o inhibir, y/o regular por incremento o
disminución la producción de citocinas de una célula NK y/o una
célula T CD8+ y/o una célula T CD4+, caracterizado porque
comprende:
- -
- proporcionar un compuesto candidato,
- -
- determinar si dicho compuesto candidato:
- \circ
- tiene la capacidad para competir con CL1-R2 por la unión a CD160, y
- \circ
- no se une a al menos CD8\alpha\beta,
- -
- identificar dicho compuesto candidato como un compuesto que tiene la capacidad para inducir o inhibir, y/o para regular por incremento o disminución la producción de citocinas de una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+ si realmente tiene dicha especificidad y afinidad de unión a CD160.
La presente invención abarca también el uso del
AcM CL1-R2 anti-CD160 (obtenible a
partir del hibridoma depositado como CNCM 1-3204),
o de un fragmento conservativo del mismo, o de un derivado
conservativo del mismo, como ligando de CD160 para identificar una
molécula que participa en la producción de citocinas mediada por
CD160 de una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+,
en el que dicho fragmento o derivado puede competir con
CL1-R2 por la unión a CD160, y es suficientemente
específico de CD160 para unirse a CD160 sin unirse a al menos
CD8\alpha\beta, y en el que dicho derivado comprende al menos un
fragmento de CL1-
R2.
R2.
Más particularmente, la presente invención se
refiere a un método para identificar una molécula que participa en
la producción de citocinas mediada por CD160 de una célula NK y/o
una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+, y que se expresa por dicha
célula como una molécula de membrana asociada a balsas lipídicas,
caracterizado porque comprende:
- -
- activar un CD160 expresado por una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+, con CL1-R2 o con un fragmento o derivado conservativo del mismo, por ejemplo proporcionando una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+ que expresa CD160, y poniéndola en contacto con CL1-R2 o con un fragmento o derivado conservativo del mismo de modo que se agregue a CD160,
- -
- lisar dicha célula de modo que se recupere la fracción del dominio de balsa lipídica de dicha célula, por ejemplo lisando dicha célula de modo que se disocien los complejos de membrana (por ejemplo usando un detergente fuerte tal como NP40), y recuperando una fracción de dicho lisado que comprende al menos un dominio de balsa lipídica),
- -
- identificar dentro de dicha fracción de balsa al menos un compuesto que parezca ser específico de CD160:
- \circ
- mediante comparación con los compuestos control que se obtienen en condiciones similares pero usando un Ac control que corresponde con el isotipo no reactivo en lugar de dicho CL1-R2 o derivado o fragmento conservativo, y
- \circ
- mediante comparación con los compuestos control que se obtienen en condiciones similares pero usando un compuesto que no se une a CD160 pero se une a otro receptor expresado por dicha célula (tal como anticuerpo anti-CD16 o uno anti-CD2 cuando se usa una célula NK, un anticuerpo anti-CD8 cuando se usa una célula T CD8+, un anticuerpo anti-CD4 cuando se usa una célula T CD4+),
- -
- opcionalmente, recuperar dicho al menos un compuesto específico de CD160 así identificado,
- -
- opcionalmente, secuenciar o microsecuenciar este/estos compuesto(s).
mediante lo cual dicho al menos un compuesto
específico de CD160 así identificado es una molécula que participa
en la producción de citocinas mediada por CD 160 de dicha célula, y
que se expresa por dicha célula como una molécula de membrana
asociada a balsas lipídicas.
Los compuestos anti-CD160 de la
invención también permiten la identificación de aquellas moléculas
que se expresan en el compartimento citosólico de una célula NK y
que participan en la transducción de señales de CD160, mediando de
ese modo una regulación por incremento o disminución de la
producción de citocinas de dicha célula NK. La presente invención
también se refiere por tanto a un método para identificar un
mensajero secundario que participa en la producción de citocinas
mediada por CD160 de una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o una
célula T CD4+, caracterizado porque comprende:
- -
- activar un CD160 expresado sobre una célula NK y/o una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+ con CL1-R2, por ejemplo proporcionando una célula NK (es decir, una NK citotóxica) y/o una célula T CD8+ y/o una célula T CD4+ que expresa CD160 y poniéndola en contacto con CL1-R2 de modo que se agregue a CD160,
- -
- lisar dicha célula en condiciones suaves de modo que se conservan esencialmente los supuestos complejos formados sobre CD 160 (por ejemplo usando un detergente suave tal como BRIJ58® o BRIJ98®, SIGMA),
- -
- opcionalmente aclarar previamente el lisado,
- -
- recuperar CL1-R2 así como cualquier compuesto que pueda asociarse al mismo, por ejemplo mediante inmunoprecipitación con un Ac de cabra anti-ratón,
- -
- llevar a cabo un ensayo de cinasa in vitro,
- -
- identificar al menos un compuesto que ha incorporado al menos un compuesto de fósforo como resultado de dicho ensayo de cinasa in vitro,
mediante lo cual dicho al menos un compuesto
identificado es un mensajero secundario que participa en la
producción de citocinas mediada por CD160 de dicha célula,
- -
- opcionalmente recuperar dicho al menos un compuesto identificado,
- -
- cuando dicho al menos un compuesto identificado comprende una proteína o un constituyente polipeptídico:
- \circ
- opcionalmente llevar a cabo una digestión con tripsina de dicho al menos un compuesto recuperado,
\newpage
- \circ
- opcionalmente secuenciar o microsecuenciar dicho al menos un compuesto recuperado y comparar la secuencia peptídica así obtenida con las disponibles en bancos de datos de proteínas, o tras un procedimiento de espectrometría de masas tal como el descrito por Bruyns E, Marie-Cardine A, Kirchgessner H, Sagolla K, Shevchenko A, Mann M, Autschbach F, Bensussan A, Meuer S, Schraven B. "T cell receptor (TCR) interacting molecule (TRIM), a novel disulfide-linked dimer associated with the TCR-CD3-zeta complex, recruits intracellular signalling proteins to the plasma membrane" J Exp Med. 1998 Aug 3; 188(3):561-75.,
de modo que se obtiene la secuencia de dicha
proteína o constituyente polipeptídico.
Tal como se mencionó anteriormente, el experto
conoce bien ensayos de cinasa in vitro. Se usa
habitualmente un compuesto de fósforo detectable (tal como fósforo
radiactivo proporcionado mediante por ejemplo
P^{32}-ATP, un compuesto de fósforo luminiscente
o fluorescente) para tal ensayo de cinasa in vitro. Se
describe un procedimiento experimental ilustrativo en Bruyns E,
Marie-Cardine A, Kirchgessner H, Sagolla K,
Shevchenko A, Mann M, Autschbach F, Bensussan A, Meuer S, Schraven
B. "T cell receptor (TCR) interacting molecule (TRIM), a novel
disulfide-linked dimer associated with the
TCR-CD3-zeta complex, recruits
intracellular signalling proteins to the plasma membrane" J Exp
Med. 1998 Aug 3; 188(3):561-75.
También puede encontrarse un procedimiento
experimental ilustrativo en Nikolova et al. 2002
("BY55/CD160 acts as a coreceptor en TCR signal transduction of a
human circulating cytotoxic effector T lymphocyte subset lacking
CD28 expression" International Immunology vol. 14. n.º 5, pág.
445-451).
Los inventores han identificado mensajeros
secundarios ilustrativos que participan en la transducción de
señales de CD160 (anti-angiogénicas). Comprenden en
particular pi-3-cinasa y lck
(p56).
La presente invención también se refiere a:
- -
- el uso de una célula T CD4+ como fuente de, o como suministrador de, receptor CD 160,
- -
- el uso de CD160 como co-receptor CD4, y
- -
- el uso de CD 160 como receptor para inducir o estimular la producción de citocinas por una célula NK, y/o por una célula T CD8+, y/o una célula T CD4+,
- -
- el uso de una célula NK como productor de IL-6.
La presente invención también abarca el uso de
un compuesto anti-CD160 de la invención para inducir
la diferenciación de CTL.
Figuras 1A, 1B, 1C. HLA-C activa
la producción de citocinas por células NK92 y NK-SP.
(Figura 1A) Se cocultivaron células NK92 tratadas con
IL-2 durante 4 h con
K562_{clase-I+} en ausencia o presencia de
concentraciones bloqueantes de AcM W6/32
anti-HLA-C (panel inferior). Se
fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron para
determinar la expresión de TNF-\alpha
intracelular, tal como se describe en Materiales y Métodos. Se
usaron células K562_{clase-I+} o NK92 solas como
controles (panel superior).
(Figura 1B) Se analizaron
K562_{clase-I+}, K562 y K562-Cw5
mediante citometría de flujo para determinar la expresión en
superficie de HLA-C usando AcM W6/32, seguido por
conjugado con PE (perfiles en blanco). Los perfiles oscuros son
tinción con control de isotipo de Ig.
(Figura 1C) Medición simultánea de producción de
IL-4, IL-6, IL-10,
TNF-\alpha e IFN-\gamma por
NK-SP tras 16 h de cultivo solas o en cocultivo con
K562_{clase-I+}, K562 o K562-Cw5.
Se recogieron los sobrenadantes para su análisis mediante CBA. Se
adquirieron muestras usando un citómetro de flujo de doble láser y
se visualizaron los datos como gráficos de puntos en dos colores. A
cada conjunto de perlas específico de citocinas se le asigna una
intensidad de fluorescencia única que se resuelve en el canal de
FL-3. La presencia de cada citocina unida mediante
el anticuerpo específico anti-IL-4,
-IL-6, -IL-10,
-TNF-\alpha e -IFN-\gamma que
recubre las perlas de captura y se detecta mediante AcM
anti-IL-4, -IL-6,
-IL-10, -TNF-\alpha e
-IFN-\gamma conjugado con PE se indica mediante
la intensidad de señal de FL-2. Los datos son de un
experimento representativo de cinco.
Figura 2. La reticulación con AcM de CD160
activa la producción de citocinas TNF-\alpha,
IFN-\gamma e IL-6 por células
NK-SP. Tras la reticulación de receptores de células
NK, NKG2D, CD16 y CD160 mediante AcM específicos durante una
incubación de 16 h, se analizaron los sobrenadantes de la muestra
mediante CBA para determinar la producción de citocinas, tal como
se describe en Materiales y Métodos. Se calcularon las
concentraciones de citocinas en las muestras con respecto a las
curvas de calibración apropiadas con diluciones patrón para cada
citocina. Los resultados se expresan como media \pm EE de nueve
experimentos independientes realizados con diferentes donantes.
^{*}P\leq0,05, ^{**}P\leq0,03, ^{***}P\leq0,01,
^{****}P\leq0,003, ^{*****}P\leq0,008 (prueba de la T de
Student).
Figuras 3A y 3B. Inhibición de la producción de
citocinas TNF-\alpha, IFN-\gamma
e IL-6 mediada por CD160 por el receptor
inhibitorio CD158b.
(Figura 3A) Las NK-SP recién
purificadas se analizaron inmediatamente mediante citometría de
flujo para determinar la expresión en superficie de CD160, CD56,
CD3, CD16, CD158b y NKG2D usando AcM BY55 anti-CD160
conjugado con PE-Cy5 y/o AcM
anti-CD56, -CD3, -CD16, - CD158b conjugado con PE
y/o AcM anti-NKG2D, seguido por Ac de cabra
F(ab')_{2} anti-IgG1 de ratón conjugado con
PE. Panel superior, única tinción (perfiles oscuros); los perfiles
en blanco son tinción con control de isotipo
PE-Cy5-IgM o PE-IgG.
Panel inferior, doble tinción: se indica el porcentaje de células
positivas tanto para CD160 como para otro marcador. Los resultados
son representativos de cinco experimentos diferentes.
(Figura 3B) Se reticularon receptores CD160,
NKG2D y CD158b de células NK solos o se reticularon conjuntamente
en células NK-SP con AcM específicos usando las
concentraciones apropiadas, tal como se describe en Materiales y
Métodos. Tras activación de receptores durante 16 h, se analizaron
los sobrenadantes de la muestra mediante CBA, tal como se describe
en Materiales y Métodos. Se toman datos de un experimento
representativo de cinco realizados con diferentes donantes.
Figuras 4A, 4B, 4C, 4D. Efecto de
sHLA-G1 sobre la formación de tubos de tipo capilar,
migración y proliferación de CE inducida por VEGF o FGF2.
(Figura 4A) Inhibición de proliferación de HUVEC
mediada por VEGF mediante sHLA-G1. Se sembraron
células a baja densidad en presencia de VEGF y se incubaron con
diversas concentraciones de sHLA-G1 (sG1) o control
sHLA-G1-\beta2m monocatenario
(sG1mono). Tras 7 días de cultivo se tripsinizaron las células y se
contaron.
(Figura 4B) Inhibición de migración de HUVEC
inducida por VEGF mediante sG1 o sG1mono. Se rasparon monocapas de
HUVEC con crecimiento detenido y o bien no se estimularon (-) o bien
se estimularon con VEGF, en ausencia (-) o en presencia de sG1 o
sG1mono. 18 h después se tiñeron las monocapas celulares con
May-Grunwald Giemsa y se contó la migración de
células tal como se indica en Materiales y Métodos.
(Figuras 4C y 4D) Inhibición de angiogénesis
in vitro de HUVEC inducida por FGF-2 mediante
sHLA-G1. Se sembraron HUVEC en Matrigel diluido en
gel de colágeno en presencia o ausencia de FGF-2 y/o
sG1. 24 h después, se tomaron fotografías de cada pocillo (figura
4C), y se cuantificó la angiogénesis tal como se describe en
Materiales y Métodos (figura 4D). Microfotografías de pocillos
representativos muestran la disminución de la formación de tubos de
HUVEC inducida por FGF-2 tras la incubación con
sHLAG1, en comparación con FGF-2 solo o
FGF-2 y control. El control para
sHLA-G1 es el sobrenadante de cultivo de células no
transfectadas, que se hizo pasar a través de una columna de
inmunoafinidad, se eluyó y se combinó (10). Los resultados en A,
B y D son medias ^{+}/- DE de pocillos por triplicado y son
representativos de cinco experimentos independientes.
Figuras 5A, 5B. sHLA-G1 no se
une a receptores de VEGF.
(Figura 5A) Se incubaron HUVEC con
^{125}I-sHLA-G1 en ausencia (-) o
presencia de VEGF, FGF-2 fríos o concentraciones
variables de sHLA-G1 (sG1). sHLA-G1
sin marcar impidió la unión de
^{125}I-sHLA-G1, pero VEGF y
FGF-2 no lo hicieron.
(Figura 5B) Se incubaron HUVEC con VEGF yodado
en presencia de sG1, FGF-2 o VEGF fríos. Al
contrario que VEGF frío, sG1 frío no suprimió la unión de VEGF
yodado. Los resultados son medias ^{+}/- DE de pocillos por
triplicado y son representativos de 5 experimentos
independientes.
Figuras 6A, 6B, 6C. sHLA-G1 se
une al receptor CD160 expresado por CE.
(Figura 6A) Se analizaron HUVEC mediante
citometría de flujo tras la incubación con AcM específico para CD8,
ILT2 o CL1-R2 (CD160) (perfiles en blanco) o Ac para
control de isotipo Ig (perfiles en negro) seguido por conjugados
marcados con FITC, en presencia o no de VEGF o sG1. Los resultados
son representativos de seis experimentos independientes.
(Figura 6B) Se midió la expresión de ARNm de
CD160 en linfocitos NK92, HUVEC y SP-CD4^{+}
mediante RT-PCR, usando cebadores para CD160 (parte
superior) o \beta-actina (parte inferior).
(Figura 6C) Alineación de secuencia de
aminoácidos prevista de CD160 expresado en NK92 (NK) y HUVEC. (-)
indica identidad.
Figuras 7A, 7B. Los tetrámeros de
HLA-G se unen a Jurkat-CD160 y
HUVEC.
(Figura 7A, parte superior). Mediante
citometría de flujo, AcM CL1-R2 tiñó
Jurkat-CD160 pero no Jurkat no transfectadas
(perfiles en blanco). Los perfiles en negro son tinciones con
control de isotipo de Ig.
(Figura 7A, parte superior). El tetrámero
de HLA-G1 reticulado con AcM W6/32, seguido por
incubación con estreptavidina-PE, se une a
Jurkat-CD160 pero no a Jurkat no transfectadas,
mientras que el tetrámero de HLA-G1 no reticulado,
seguido por incubación con estreptavidina-PE, se une
a HUVEC (perfiles en blanco). Los perfiles en negro son tinción de
control con estreptavidina-PE.
(Figura 7B) Se incubaron HUVEC o no con
sHLA-G1 (100 ng/ml) a 4ºC. Tras 2 h, se incubaron
las células con AcM CL1-R2 seguido por conjugado
con PE y se analizaron mediante citometría de flujo (perfiles en
blanco). El perfil en negro es tinción con control de isotipo de
Ig. Los resultados son representativos de 3 experimentos
independientes.
Figura 8. La reticulación con AcM de CD160
activa la inhibición de la angiogénesis in vitro. Se
sembraron HUVEC en Matrigel diluido en gel de colágeno en presencia
o ausencia de FGF-2 y sHLA6G1 y/o AcM frente a CD160
o control de isotipo de Ig. 24 h después, se tomó una fotografía de
cada pocillo y se cuantificó la angiogénesis tal como se describe
en Materiales y Métodos. Los resultados son medias \pm DE de
pocillos por triplicado y son representativos de 5 experimentos
independientes.
Figuras 9A, 9B. Efecto de hipoxia sobre la
expresión de CD160 en CE. Se incubaron HUVEC en condiciones de
normoxia o hipoxia (O_{2} al 5%) durante 24 h y se analizaron para
determinar la expresión en superficie de CD160 usando AcM
CL1-R2 (Figura 9A), o VCMAM, usando AcM
anti-CD106 (Figura 9B), seguido por conjugado
marcado con PE. Los perfiles en negro son tinciones con control de
isotipo de Ig. Los resultados son representativos de 3 experimentos
independientes.
Figuras 10A, 10B, 10C, 10D. Inmunohistoquímica
de AcM CL1-R2 en secciones de tumor, que muestra que
CD160 no se expresa por células tumorales, pero se expresa a un
nivel alto por CE de vasos linfáticos en la periferia del tumor y
CE de microvasos dentro del tumor.
(Figuras 10A y 10B) Tinción con CD160 de
microvasos linfáticos en la periferia del tumor.
(Figuras 10C y 10D) Tinción con CD 160 de
microvasos dentro del tumor.
Figura 11. Inducción de transcritos de CD160 en
linfocitos CD4^{+} con IL-15.
Figura 12a, 12b, 12c, 12d.
sHLA-G1 inhibe la formación de tubos de tipo
capilar, migración y proliferación de células endoteliales mediada
por VEGF o FGF2. (a) Respuesta proliferativa de HUVEC frente a VEGF.
Efectos de sHLA-G1 recombinante (sG1) o
sHLA-G1-2m monocatenario de control
(sG1mono). (b) Inhibición de migración de HUVEC inducida por VEGF
mediante sHLA-G1. Se rasparon monocapas de HUVEC con
crecimiento detenido y o bien no se estimularon (sin tratar) o bien
se estimularon con VEGF, en ausencia (-) o en presencia de sG1 o
sG1mono. 16 h después, se tiñeron las monocapas celulares con
May-Grunwald Giemsa y se contó la migración de
células tal como se indica en Métodos. (c, d)
sHLA-G1 inhibe la angiogénesis inducida por
FGF-2. Se sembraron HUVEC en Matrigel en presencia
o ausencia de FGF-2 y/o sG1. Se tomaron fotografías
de cada pocillo tras 24 h (c), y se cuantificó la angiogénesis tal
como se describe en Materiales y Métodos (d). El control es
sobrenadante de cultivo de células no transfectadas, que se hizo
pasar a través de una columna de inmunoafinidad, se eluyó y se
combinó^{34}. ^{***}P < 0,001, prueba de ANOVA. Los
resultados en (a, b, y d) son medias ^{+}/- EEM de pocillos por
triplicado y son representativos de cinco experimentos
independientes.
Figura 13a, 13b, 13c, 13d, 13e.
sHLA-G1 induce la apoptosis de células endoteliales.
(a) Curva de cinética de inducción de la apoptosis. Se incubaron
células SGHEC-7 con medios condicionados a partir de
células PC3 transfectadas con sHLA-G1 (G1s) o
vector vacío (neo). Se llevó a cabo la microscopía en intervalos de
tiempo para evaluar la aparición de la morfología apoptótica. Se
muestra la media \pm EEM de datos combinados de siete
experimentos. Aunque se obtuvieron datos cada 15 min., sólo se
muestran puntos de datos cada 2 h por motivos de claridad. (b)
Imágenes de células endoteliales tras el tratamiento con medios
condicionados con sG1 o neo (figura 2 complementaria, secuencia de
vídeo en línea). (c) Curva de cinética de inducción de la apoptosis
mediante sHLA-G1 recombinante en presencia o
ausencia del inhibidor de caspasas zVAD-fmk evaluada
mediante microscopía en intervalos de tiempo. Se muestra la media
\pm EEM de datos combinados de cuatro experimentos. (d) Se
calculó el área bajo la curva a partir de las curvas de cinética
mostradas en (c). **P < 0,003 prueba de la U de
Mann-Whitney. (e) Análisis de inmunotransferencia de
tipo Western de la expresión de PARP escindida en p85. Se incubaron
células SGHEC-7 en ausencia (control) o presencia de
sHLA-G1.
Figura 14a, 14b. sHLA-G1 no
interfiere con los receptores de VEGF. (a) Se incubaron HUVEC con
^{125}I-sHLA-G1 en ausencia (-) o
presencia de VEGF, FGF-2 fríos o concentraciones
variables de sHLA-G1 (sG1). sHLAG1 sin marcar
impidió la unión de
^{125}I-sHLA-G1, pero VEGF y
FGF-2 no lo hicieron. (b) Se incubaron HUVEC con
^{125}I-VEGF en presencia de sG1,
FGF-2 o VEGF fríos. Al contrario que VEGF frío, sG1
frío no suprimió la unión de VEGF yodado. Los resultados son medias
^{+}/- EEM de pocillos por triplicado y son representativos de
tres experimentos independientes.
Figura 15a, 15b, 15c. HUVEC expresan el receptor
CD160. (a) Se analizaron HUVEC y HMVEC mediante citometría de flujo
tras la incubación con AcM específico de CD8, CD85d, CD85j o
CL1-R2 (CD160) (perfiles en blanco) o controles de
isotipo de Ig (perfiles en negro) seguido por conjugados marcados
con FITC. Los resultados son representativos de seis experimentos
independientes. (b) Expresión de ARNm de CD160 por HUVEC. (c)
Alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de CD160
expresado en HUVEC y NK92. (-) indica identidad.
Figura 16a, 16b, 16c, 16d. Tinción
inmunohistoquímica de secciones de tumor de carcinoma de pulmón de
Lewis con AcM anti-CD160 que demuestran vasos
positivos para CD160 en marrón. La tinción de la red de vasos se
localizó en la periferia del tumor (a). Los vasos sanguíneos en la
periferia (b) y el centro del tumor (c,d) también se tiñeron con
AcM frente a CD160, mientras que las células tumorales permanecieron
sin teñir. Aumento, x 400.
Figura 17a, 17b, 17c, 17d.
sHLA-G1 se une al receptor CD160 expresado por
células endoteliales. (a, parte superior), AcM
anti-CD160 tiñe Jurkat-CD160 pero no
Jurkat no transfectadas (perfiles en negro, control de isotipo).
(a, parte inferior), el tetrámero de HLA-G1 se une a
transfectante de control Jurkat-CD160 y HUVEC pero
no a células Jurkat no transfectadas (perfiles en negro, tinción de
control con estreptavidina-PE). (b)
sHLA-G1 recombinante bloquea la unión de AcM frente
a CD160 a HUVEC (perfil en negro, control de isotipo). Los
resultados son representativos de tres experimentos independientes.
(c) AcM anti-CD160 CL1-R2 soluble
activa la inhibición de la angiogénesis in vitro. Se
sembraron HUVEC en Matrigel en presencia o ausencia de
FGF-2 y sHLA-G1 y/o AcM frente a
CD160 (^{+++}, 10 \mug/ml; ^{+}, 1 \mug/ml) o control de
isotipo IgG1 (10 \mug/ml). Se tomaron fotografías de cada pocillo
tras 24 h y se cuantificó la angiogénesis. Los resultados son la
media ^{+}/- DE de pocillos por triplicado y son representativos
de cinco experimentos independientes. ***P, < 0,001, *P <
0,005 mediante prueba ANOVA, en comparación con células tratadas
con FGF-2. (d) AcM anti-CD160
CL1-R2 soluble induce la apoptosis endotelial. Se
incubaron células SGHEC-7 con
CL1-R2 (^{+}, 1 \mug/ml, ^{++}, 5 \mug/ml,
^{+++}, 10 \mug/ml) o control de isotipo IgG1 (10 \mug/ml) y
se llevó a cabo microscopía en intervalos de tiempo para evaluar la
aparición de la morfología apoptótica. Se muestran niveles de
apoptosis tras 50 h con la media \pm DE de datos combinados de 3
experimentos. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 mediante
prueba ANOVA, en comparación con control.
Figura 18a: Expresión de CD160 en HUVEC y HMVEC
en comparación con células de control negativo (células de músculo
liso y fibroblasto humano en cultivo primario). Análisis mediante
citometría de flujo usando AcM BY55 anti-CD160
(IgM) en comparación con control de isotipo IgM. Se incubaron las
células con cualquiera de estos anticuerpos, se lavaron y se
incubaron con un conjugado
anti-IgM-FITC.
Figura 18b: AcM CL1-R2 induce la
apoptosis de HUVEC pero no de fibroblastos (evaluación mediante
citometría de flujo con doble tinción con anexina-V
y PI)
Figura 18c: El mismo método que en la figura
18b. Media de 2 experimentos diferentes (5 pocillos diferentes para
cada experimento).
Ejemplo
1
Células. Las células efectoras fueron la
línea CD160^{+} NK92 humana (ATCC número CRL-2407)
cultivadas con IL-2 durante varios días, y células
NK de sangre periférica (SP) humana reciente derivadas de donantes
normales, purificadas mediante el kit de aislamiento de células NK
inmunomagnético (Miltenyi Biotec). Se mostró que la pureza de
NK-SP era >90% de CD3^{-} CD56^{+} mediante
citometría de flujo y >90% de las NK-SP
purificadas eran CD160^{+}.
Se usaron dos variantes de células de
eritroleucemia K562 humanas como células diana: una variante
(K562_{clase\ I+}) expresaba HLA-C cuando se
cultivaba con IFN-\gamma, (publicación con la
referencia 14; ATCC CCL-243) mientras que la otra
(K562 cultivada con IFN-\gamma, ATCC
CCL-243) no lo hacía. Se obtuvieron transfectantes
K562-HLA-Cw5
(K562-Cw5) mediante transfección de ADNc de
HLA-Cw5 en células parenterales negativas para la
clase I de CMH K562.
Anticuerpos y análisis de citometría de
flujo. Los AcM usados incluyeron:
- -
- CL1-R2 (IgG1 anti-CD160; hibridoma TM60 disponible de C.N.C.M. Instituto Pasteur 25, rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15 FRANCIA con el número de depósito de C.N.C.M. = 1-3 204),
- -
- BY55 (IgM anti-CD160; Beckman-Coulter),
- -
- W6/32 anti-HLA (IgG2a; ATCC número HB-95), denominado en el presente documento anti-HLA-C,
- -
- 3G8 anti-CD16 conjugado con PE (IgG1; Beckman-Coulter),
- -
- GL183 anti-CD158b (IgG1; Beckman-Coulter),
- -
- anti-CD3 (UCHT1 de Beckman-Coulter)
- -
- anti-CD56 (Beckman-Coulter), y
- -
- clon 149810 anti-NKG2D (IgG1, R & D Systems).
Para el análisis de citometría de flujo de una
única tinción, se incubaron células con AcM BY55
anti-CD160 conjugado con PE-Cy5 o
con los demás AcM conjugados con PE. Para la tinción con NKG2D, se
incubaron células con AcM anti-NKG2D seguido por Ac
F(ab')_{2} de cabra anti-IgG1 de ratón
conjugado con PE (Cliniscience). Para la doble tinción, se
incubaron células con BY55 conjugado con PE-Cy5,
seguido por AcM anti-CD56, -CD3, -CD16, -CD158b
conjugados con PE, o por AcM anti-NKG2D seguido por
Ac F(ab')_{2} cabra anti-IgG1 de ratón
conjugado con PE. Se usaron
PE-Cy5-IgM o PE-IgG
(Beckman-Coulter) como controles de isotipo. Se
analizaron muestras en un citómetro de flujo EPICS XL4C
(Beckman-Coulter).
Reticulación mediada por AcM específico de
receptor. Se realizó la reticulación de receptores CD160, NKG2D,
CD16 o CD158b sobre células NK-SP a la
concentración final de 1-10 \mug/ml durante 16 h
de incubación a 37ºC en CO_{2} al 5%. También se usó el control
de isotipo IgG1 en las mismas condiciones. Se añadieron 100 U/ml de
IL-2 durante el tiempo de incubación. Se recogieron
los sobrenadantes y se almacenaron a -80ºC hasta su análisis
adicional.
Cocultivos de células NK y células que
expresan ligandos de CD160. Se incubaron células NK92 o
NK-SP solas o se coincubaron con K562_{clase\
I+}, K562 o K562-Cw5 a una razón de 10:1 durante 4
h (NK92) o 16 h (NK-SP) a 37ºC en presencia o no de
concentraciones bloqueantes (25-50 \mug/ml) de AcM
W6/32 o CL1-R2 o controles de isotipo de Ig. Se
añadieron 100 U/ml de IL-2 durante los tiempos de
incubación.
Detección de TNF-\alpha
intracelular. Se lavaron células NK92 tratadas como
anteriormente, se fijaron en paraformaldehído al 2%, se
permeabilizaron con saponina al 0,1% durante 10 min, se tiñeron
mediante AcM anti-TNF-\gamma
conjugado con PE o IgG1 de ratón-PE
(Coulter-Immunotech) y se analizaron mediante un
citómetro de flujo EPICS XL4C (Coulter).
Medición de citocinas mediante red de perlas
citométricas. Se usó el kit de red de perlas citométricas (CBA)
Th1/Th2 (BD Biosciences) para la medición simultánea de
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-10, TNF-\alpha e
IFN-\gamma según las instrucciones del fabricante
(Cook, E.B., J.L. Stahl, L. Lowe, R. Chen, E. Morgan, J. Wilson, R.
Varro, A. Chan, F.M. Graziano, y N.P. Barney. 2001. Simultaneous
measurement of six cytokines in a single sample of human tears
using microparticle-based flow cytometry: allergics
vs. non-allergics. J. Immunol. Meth.
254:109-118). En resumen, la CBA usa una serie de
perlas de tamaño uniforme con intensidad de fluorescencia
diferenciada (FL3). Cada series de perlas está recubierta con un AcM
frente a una única citocina (IL-2,
IL-4, IL-6, IL-10,
TNF-\alpha o IFN-\gamma y la
mezcla de perlas detecta seis citocinas en una muestra. Se usó un
patrón de citocinas que contenía una mezcla de cantidades
predeterminadas de las seis citocinas para preparar curvas patrón.
Se mezclaron alícuotas de 10 \mul de cada perla de captura
específica para IL-2, IL-4,
IL-6, IL-10,
TNF-\alpha e IFN-\gamma para
cada tubo de ensayo que iba a analizarse. Entonces se añadieron 50
\mul de tales perlas de captura mezcladas, 50 \mul de reactivo
de detección Th1/Th2 humano-PE y 50 \mul de
muestra de prueba apropiada (sobrenadantes congelados de diferentes
células NK-SP tratadas, descongelados y
centrifugados antes del análisis) a cada tubo de ensayo. Se
incubaron los tubos durante 3 h a temperatura ambiente, se lavaron
y se reconstituyeron en 300 \mul de tampón de lavado. Finalmente,
se analizaron perlas citométricas unidas a citocina
IL-2, IL-4, IL-6,
IL-10, TNF-\alpha e
IFN-\gamma\beta en un citómetro de flujo
FACScalibur (Becton Dickinson) usando CELLQuest (Becton Dickinson).
Se compararon la fluorescencia media con curvas patrón y se
calcularon las concentraciones de citocinas (pg/ml) usando el
software de CBA proporcionado (BD Biosciences). Se excluyeron las
mediciones de IL-2 del análisis porque el medio de
cultivo en el que se incubaron las células NK durante los
diferentes ensayos siempre contenía IL-2.
Estadística. Se realizaron análisis
estadísticos usando o bien la prueba de la t de Student bilateral o
bien la prueba de la t de Student para datos emparejados
definiéndose p \leq0,05 como significativo.
Se investigó si podía obtenerse la producción de
TNF-\alpha en la línea celular NK92 que expresaban
una alta cantidad de CD160. Se evaluó la expresión intracelular de
esta citocina mediante citometría de flujo en NK92 cocultivadas con
células diana K562 (K562_{clase\ I+}) que expresaban
HLA-C. Se encontró que tal cocultivo estimulaba la
producción de TNF-\alpha, en comparación con la
secreción moderada de esta citocina por NK92 cultivadas solas
(figura 1A). La ausencia de producción de
TNF-\alpha por K562_{clase\ I+} solas indicó
que la liberación de TNF-\alpha se producía
únicamente por NK92. Además, la adición en el medio de cultivo de
enmascaramiento de HLA-C mediado por AcM W6/32 en
células diana dio como resultado una disminución de la producción
de TNF-\alpha por NK92 (figura 1A). Estos
resultados indican que HLA-C podía activar NK92
para secretar TNF-\alpha.
A continuación, se evaluó si
NK-SP citotóxicas también podían producir
TNF-\alpha tras activación específica mediada por
HLA-C. Se cocultivaron NK-SP durante
16 h o bien con K562_{clase\ I+}, transfectante
K562-Cw5, que expresan ambos moléculas de
HLA-C en su superficie celular, o bien con K562 que
es totalmente negativo para la clase I de CMH (figura 1B). Usando
el kit CBA y citometría de flujo, se midieron
TNF-\alpha y otras cuatro citocinas Th1/Th2 en el
fluido sobrenadante libre de células (figura 1C para un experimento
representativo y tabla I para 5 experimentos independientes).
Cuando se cocultivaron NK-SP de
diferentes donantes con K562_{clase\ I+} o
K562-Cw5, se detectó una gran cantidad de
IFN-\gamma, TNF-\alpha e
IL-6 y ni IL-4 ni
IL-10. En comparación, NK-SP
cocultivadas con K562 negativas para la clase I produjeron
cantidades muy bajas de IFN-\gamma y sólo
cantidades marginales de TNF-\alpha e
IL-6, que no eran significativamente diferentes de
las observadas cuando se cultivaron células NK-SP
solas (figura 1C y tabla I). Nunca se produjo una liberación
espontánea de citocinas cuando se cultivaron K562 o K562_{clase\
I+} solas. Sin embargo, debe mencionarse que, en algunos donantes,
NK-SP sí que produjeron citocinas cuando se
cocultivaron con K562. Esto sugería que también podrían estar
implicados receptores activadores independientes de la clase I de
CMH. En conjunto, estos datos indican que el reconocimiento del
ligando fisiológico HLA-C por el subconjunto de
células NK-SP citotóxicas podría activar la
secreción de citocinas específicas.
Se investigó si el receptor CD160 activaba una
secreción de citocinas específicas por NK-SP tras su
acoplamiento con HLA-C. Se cocultivaron
NK-SP con K562_{clase\ I+} en presencia de
concentraciones bloqueantes de AcM frente a o bien CD160 o bien
HLA-C, o de controles de isotipo de Ig (tabla
II).
El enmascaramiento del ligando
HLA-C o el receptor CD160 por su AcM específico
disminuyó significativamente la producción de
IFN-\gamma, TNF-\alpha e
IL-6. Estos resultados muestran que esta producción
de citocinas por NK-SP puede atribuirse
principalmente a la interacción
CD160-HLA-C. Sin embargo, por algún
motivo desconocido, el uso de AcM W6/32
anti-HLA-C no inhibió
significativamente la secreción de IL-6.
Entonces se compararon las citocinas producidas
activando CD160 con el receptor activador CD16 cuya expresión
también está limitada al subconjunto de células NK citotóxicas. Se
excluyeron los receptores citotóxicos naturales (NCR) activadores y
el correceptor 2B4/CD244 ya que están distribuidos por igual en
linfocitos NK-SP tanto citotóxicos como no
citotóxicos (Ferlazzo, G., y C. Münz. 2004. NK cell compartments and
their activation by dendritic cells. J. Immunol.
172:1333-1339). Se usó la activación con receptor
activador NKG2D como control negativo por su incapacidad para
mediar la producción de citocinas por sí mismo en células NK humanas
(André, P., R. Castriconi, M. Espeli, N. Anfossi, T. Juarez, S.
Hue, H. Conway, F. Romagne, A. Dondero, M. Nanni, S.
Caillat-Zucman, D.H. Raulet, C. Bottino, E. Vivier,
A. Mástta, y P. Paul. 2004. Comparative analysis of human NK cell
activation induced by NKG2D and natural cytotoxicity receptors. Eur.
J. Immunol. 34:961-971.; Raulet, D.H. 2003. Roles
of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat. Rev. Immunol.
3:781-790). Los resultados indican que la
reticulación de CD160-AcM conduce a que
NK-SP produzcan el mismo patrón de liberación de
citocinas, concretamente altos niveles de
IFN-\gamma, y bajas cantidades de
TNF-\alpha e IL-6, pero ni
IL-4 ni IL-10 (figura 2), que la
activación con ligando fisiológico HLA-C (tabla I).
El uso de una Ig de control que correspondía con el isotipo no
condujo a tal secreción. A continuación, se analizó la producción de
citocinas tras la reticulación del receptor CD16 con el AcM 3G8
específico. Esto activó la producción tanto de
IFN-\gamma como de TNF-\alpha
pero no de IL-6 (figura 2). De manera importante,
mientras que la cantidad de TNF-\alpha era
comparable tras el acoplamiento de CD160 o de CD16, la producción
de IFN-\gamma mediada por reticulación con CD16
fue \sim30 veces inferior a la secreción obtenida tras el
acoplamiento de CD160. Tal como se esperaba, la reticulación con Ac
de NKG2D no activó una producción de citocinas significativa. Estos
datos demuestran adicionalmente que la reticulación con Ac del
receptor CD160 sobre células NK-SP citotóxicas da
como resultado un perfil de citocinas único similar al observado
tras la interacción con ligando fisiológico HLA-C.
Debe observarse que aún no se ha notificado la producción de
IL-6 por un subconjunto de células NK citotóxicas
tras activación de los receptores activadores. IL-6
es una citocina multifuncional que actúa en el sistema inmunitario y
un informe reciente ha mostrado que algunos linfocitos infiltrantes
de tumores producían altas concentraciones de IL-6,
bloqueando la actividad anti-LAK de la célula
tumoral TGF-\beta1 (Hsiao, Y.W., K.W. Liao, S.W.
Hung, y R.M. Chu. 2004. Tumor-Infiltrating
Lymphocyte Secretion of IL-6 Antagonizes
Tumor-Derived TGF-beta1 and
Restores the Lymphokine-Activated Killing Activity.
J. Immunol. 172: 1508-1514).
La activación de células NK depende de
receptores activadores que normalmente están funcionalmente
silenciados por receptores inhibitorios, incluyendo los receptores
de tipo inmunoglobulina citolíticos (KIR) que reconocen diferentes
grupos alélicos de moléculas HLA-A, -B o -C.
Previamente se notificó que la actividad citotóxica activada tras
el acoplamiento de CD160 se inhibía mediante el acoplamiento
conjunto del receptor inhibitorio CD158b (Le Bouteiller, P., A.
Barakonyi, J. Giustiniani, F. Lenfant, A.
Marie-Cardine, M. Aguerre-Girr, M.
Rabot, I. Hilgert, F. Mami-Chouaib, J. Tabiasco, L.
Boumsell, y A. Bensussan. 2002. Engagement of CD160 receptor by
HLA-C is a triggering mechanism used by circulating
natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 99:16963-16968). Por tanto se
investigó si los receptores inhibitorios también controlaban la
producción de citocinas mediada por CD160. Se usaron
NK-SP de donantes que expresaban porcentajes
variables de población celular que llevaba receptor inhibitorio
CD158b. Se analizó la expresión en la superficie celular de CD160,
así como CD158b, NKG2D y otros marcadores de células NK mediante
citometría de flujo con NK-SP purificadas, recién
aisladas. La figura 3A muestra los resultados obtenidos con un
donante representativo. Un subconjunto principal de
NK-SP expresa CD160, mientras que todas ellas son
CD56^{+}, CD3^{-} y CD16^{+} (figura 3A, panel superior).
Mientras que la totalidad de la población de NK-SP
es NKG2D^{+}, sólo un subconjunto expresa el receptor inhibitorio
CD158b. La doble tinción confirma que las NK-SP
CD160^{+} eran CD3^{-}, y principalmente CD56^{dim} y
CD16^{+} (figura 3A, panel inferior). Además, se encontró que sólo
subpoblaciones de células CD160^{+} también expresaban CD158b o
NKG2D (figura 3A, panel inferior). Tal como se esperaba, se
encontró que la reticulación mediada por AcM de CD160 y no del
receptor NKG2D condujo a la producción de
IFN-\gamma, TNF-\alpha e
IL-6 y que la co-reticulación de
ambos receptores inhibitorios CD158b y CD160 redujo
significativamente la producción de citocinas (figura 3B). No se
produjo una reducción de este tipo cuando un Ac de control que
correspondía con el isotipo sustituyó al AcM frente a CD158b. Se
obtuvieron resultados similares con cinco donantes diferentes de
NK-SP que contenían porcentajes variables
(\sim8-30%) de subconjunto de NK CD158b^{+}
entre las células NK-SP purificadas. Ya que sólo una
subpoblación de SP-NK expresó CD158b, esto puede
explicar por qué la modulación por disminución de la secreción de
citocinas sólo era parcial en los experimentos. Puede especularse
que otros KIR, que interaccionan con diferentes alelos de HLA,
también pueden contribuir a tal control de CD160 induciendo la
producción de citocinas y por tanto participar en la tolerancia de
células NK en una situación fisiológica normal. También se examinó
si el acoplamiento conjunto de NKG2D podía sinergizarse con CD160
para producir un aumento de la señal estimulante. Se encontró que la
reticulación simultánea de NKG2D, cuyo nivel se regula por
incremento tras la activación de IL-2, y receptores
activadores CD160 no inducía una señal positiva acumulativa en
comparación con la estimulación mediante el receptor CD160 solo
(figura 3B). Esto confirma resultados anteriores que muestran que la
activación de NKG2D humanas mediante reticulación con AcM
específico no inducía la activación de la secreción de citocinas
(André, P., R. Castriconi, M. Espeli, N. Anfossi, T. Juarez, S.
Hue, H. Conway, F. Romagne, A. Dondero, M. Nanni, S.
Caillat-Zucman, D.H. Raulet, C. Bottino, E. Vivier,
A. Mástta, y P. Paul. 2004. Comparative analysis of human NK cell
activation induced by NKG2D and natural cytotoxicity receptors. Eur.
J. Immunol. 34:961-971). Sin embargo, la
estimulación de células NK activadas policlonales con ligandos
fisiológicos ULBP o MICA recombinantes unidos a plástico podía
activar la producción de GM-CSF e
IFN-\gamma (André, P., R. Castriconi, M. Espeli,
N. Anfossi, T. Juarez, S. Hue, H. Conway, F. Romagne, A. Dondero, M.
Nanni, S. Caillat-Zucman, D.H. Raulet, C. Bottino,
E. Vivier, A. Mástta, y P. Paul. 2004. Comparative analysis of human
NK cell activation induced by NKG2D and natural cytotoxicity
receptors. Eur. J. Immunol. 34:961-
971).
971).
El receptor CD160, cuya expresión está limitada
al subconjunto de células NK-SP citotóxicas
efectoras CD56^{dim} CD16^{brillante}, aparece como un receptor
activador único dependiente de la clase I de CMH que puede promover
la secreción de citocinas tras una unión de ligando específica. En
primer lugar, HLA-C, ligando principal de CD160, se
expresa constitutivamente, lo que se diferencia de los
auto-ligandos que pueden inducirse o ligandos
inducidos por patógenos de los demás receptores de activación de NK
expresados en subconjuntos de linfocitos NK tanto citotóxicos como
no citotóxicos. Los ligandos de NKG2D humano son las moléculas MICA
y MICB inducidas por estrés que se expresan predominantemente por
células de origen epitelial o ULBP codificada por patógeno (Raulet,
D.H. 2003. Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat.
Rev. Immunol. 3:781-790). Además, NKG2D no puede
activar por sí mismo la producción de IFN-\gamma
en seres humanos (Carayannopoulos, L., y W. Yokoyama. 2004.
Recognition of infected cells by natural killer cells. Curr. Opin.
Immunol. 16:26-33). El receptor de poliovirus
recientemente descrito (CD155) y nectina 2 (CD112), ligandos del
receptor coactivador DNAM-1, también se expresan
principalmente en tejidos estresados (Mástta, L., y A. Mástta. 2004.
Unravelling natural killer cell function: triggering and inhibitory
human NK receptors. Embo J. 23:255-259). Los
ligandos de NCR son moléculas distintas de CMH, incluyendo
hemaglutinina-neuraminidasa de VS para NKp44 y NKp46
(Carayannopoulos, L., y W. Yokoyama. 2004. Recognition of infected
cells by natural killer cells. Curr. Opin. Immunol.
16:26-33). Al contrario que los receptores
mencionados anteriormente, CD16 sólo está presente en el subconjunto
de linfocitos NK-SP citotóxicos efectores y su
ligando es la parte Fc de IgG. En segundo lugar, los KIR
estimulantes y el receptor activador CD94/NKG2C que sólo se
expresan por un subconjunto de linfocitos NK-SP
citotóxicos, también interaccionan con moléculas de clase I de HLA
constitutivas, incluyendo HLA-C para el primero,
tienen dominios citoplásmicos cortos sin motivo de señalización
conocido (Cerwenka, A., y L. Lanier. 2001. Natural Killer cells,
viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49).
Además, estos receptores activadores se asocian con moléculas
adaptadoras para iniciar la señalización (Lanier, L. 2003. Natural
killer cell receptor signaling. Curr. Opin. Immunol.
15:308-314), lo que se diferencia de la molécula de
superficie celular anclada a GPI CD160 (Le Bouteiller, P., A.
Barakonyi, J. Giustiniani, F. Lenfant, A.
Marie-Cardine, M. Aguerre-Girr, M.
Rabot, I. Hilgert, F. Mami-Chouaib, J. Tabiasco, L.
Boumsell, y A. Bensussan. 2002. Engagement of CD160 receptor by
HLA-C is a triggering mechanism used by circulating
natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 99:16963-16968). 2B4/CD244 es un
receptor de células NK que proporciona una señal
co-estimulante a otros receptores de activación
incluyendo NCR o NKG2D (Mástta, L., M. Mingari, C. Bottino, D.
Pende, R. Biassoni, y A. Mástta. 2003. Cellular and molecular basis
of natural killer and natural killer-like activity.
Immunol. Letters 88:89-93).
Datos de este estudio muestran que la
estimulación del receptor CD160 en células NK puede conducir a la
potenciación tanto de la inmunidad innata (mediante destrucción
celular específica) como de la inmunidad adaptativa (mediante
secreción de citocinas). Sorprendentemente, se ha mostrado que el
ligando HLA-C de CD160 está protegido frente a la
degradación o endocitosis mediada por proteínas derivadas de VMG US2
o US11 (Tortorella, D., B. Gewurz, M. Furman, D. Schust, y H.
Ploegh. 2000. Viral subversion of the immune system. Ann. Rev.
Immunol. 18:861-926) o proteínas de
VIH-1 Nef (Cohen, G., R. Gandhi, D. Davis, O.
Mandelboim, B. Chen, J. Strominger, y D. Baltimás. 1999. The
selective downregulation of class I Major Histocompatibility Complex
proteins by HIV-1 protects
HIV-infected cells from NK cells. Immunity
10:661-671), respectivamente. Esto sugiere que CD160
todavía puede ser funcional poco después de la infección viral.
Las señales que transforman una célula NK en
reposo circulante en una célula activada que secreta citocinas
in vivo no se entienden completamente. Esto depende
principalmente del resultado de señales derivadas de receptores
activadores e inhibitorios tras el acoplamiento con sus ligandos
específicos. Sabiendo que los receptores inhibitorios CD158a/CD158b
se acoplan a moléculas de HLA-C en células diana, se
plantea la hipótesis de que el nivel de expresión de
HLA-C puede ser un factor clave para activar los
receptores o bien KIR o bien CD160. Cuando el nivel de
HLA-C es normal, el acoplamiento del receptor
inhibitorio KIR controlará a CD160. En cambio, cuando el nivel de
expresión de HLA-C se modula por disminución, los
receptores KIR pueden no estar ya eficazmente acoplados,
permitiendo que tenga lugar la función de activación del receptor CD
160.
En conclusión, este estudio demuestra que la
activación funcional del receptor de células NK CD160 por el
ligando fisiológico HLA-C inicia tanto la
citotoxicidad como la producción de citocinas tras la activación
óptima del receptor. Los presentes resultados sugieren fuertemente
que CD 160 media las funciones efectoras activadoras mediante una
ruta de señalización única para limitar la viremia y la carga
tumoral o las células infectadas con patógenos.
Ejemplo
2
Se mantuvieron células endoteliales
microvasculares humanas (HMVEC) y HUVEC [HUVEC
CC-2517, y HMVEC-C neonatales
(CC-2505); Cambrex Bio Science, Walkersville,
Maryland, EE.UU.; véase http://www.cambrex.
com/Content/bioscience/Cat-Nav.oid.435] en EBM (BioWhittaker) complementado con un 5% de SBF y 1 ng/ml de VEGF o FGF-2 (R & D Systems, Minneapolis, IL) cada dos días. Las células T Jurkat humanas están disponibles de la ATCC número TIB152.
com/Content/bioscience/Cat-Nav.oid.435] en EBM (BioWhittaker) complementado con un 5% de SBF y 1 ng/ml de VEGF o FGF-2 (R & D Systems, Minneapolis, IL) cada dos días. Las células T Jurkat humanas están disponibles de la ATCC número TIB152.
Se produjeron células Jurkat transfectadas con
CD160 (Jurkat-CD160) mediante transfección de CD160
en células Jurkat según se notifica por Anumantha, A., A.
Bensussan, L. Boumsell, A. Christ, R. Blumberg, S. Voss, A. Patel,
M. Robertson, L. Nadler, y G. Freeman, 1998 ("Cloning of BY55, a
novel Ig superfamily member expressed on NK cells, CTL, and
intestinal intraepithelial lymphocytes", Journal of Immunology
161:2780). NK92 es una línea de células NK humana que expresan
CD160 (ATCC número CRL-2407).
Se purificaron células T CD4^{+} a partir de
CMSP usando el sistema de separación MACS (Miltenyi Biotec, Auburn,
CA). Se diseñó mediante ingeniería el gen monocatenario de fusión
sHLA-G1-\beta2m conectando el
último residuo del dominio \alpha3 de HLA-G con el
primer codón de la secuencia \beta2m humana mediante un
espaciador de 15 residuos (Fournel, S., M.
Aguerre-Girr, A. Campan, L. Salauze, A. Berrebi, Y.
Lone, F. Lenfant, y P. Le Bouteiller. 1999. Soluble
HLA-G: purification from eucaryotic transfected
cells and detection by a specific ELISA. American Journal of
Reproductive Immunology 42:22). Se purificaron
sHLA-G1 y sHLA-G1mono a partir de
sobrenadantes de cultivo de células eucariotas, usando columnas de
inmunoafinidad, tal como se describió anteriormente (Fournel, S.,
M. Aguerre-Girr, A. Campan, L. Salauze, A. Berrebi,
Y. Lone, F. Lenfant, y P. Le Bouteiller. 1999. Soluble
HLA-G: purification from eucaryotic transfected
cells and detection by a specific ELISA. American Journal of
Reproductive Immunology 42:22). Se expresó VEGF 165 en un sistema de
baculovirus tal como se describió (Plouët, J., F. Moro, S.
Bertagnolli, N. Coldeboeuf, H. Mazarguil, S. Clamens, y F. Bayard.
1997. Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth
factor 189-amino acid form by urokinase is required
for its mitogenic effect. J Biol Chem 272:13390). Los AcM usados
incluyeron:
- -
- CL1-R2 (IgG1 anti-CD160; hibridoma TM60 disponible de C.N.C.M. Instituto Pasteur 25, rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15 FRANCIA con el número de depósito de C.N.C.M. = I-3204),
- -
- anti-CD8 (B9.11, Coulter Immunotech, Marsella, Francia),
- -
- anti-CD85j (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA, USA),
- -
- anti-CD 106 (1G11 Coulter-Immunotech),
- -
- controles de isotipo IgG1 o IgG2a de ratón dializados (Coulter-Immunotech).
Se produjeron tetrámeros de
HLA-G esencialmente tal como se describió
anteriormente (Allan, D. S., M. Colonna, L. L. Lanier, T. D.
Churakova, J. S. Abrams, S. A. Ellis, A. J. McMichael, y V. M.
Braud. 1999. Tetrameric complexes of human histocompatibility
leukocyte antigen (HLA)-G bind to peripheral blood
myelomonocytic cells. J Exp Med 189:1149), usando el autopéptido
sintético RIIPRHLQL (SEQ ID NO: 7) y tras la adición de
estreptavidina-PE (Pharmingen) (Lee, N., A. R.
Malacko, A. Ishitani, M. C. Chen, J. Bajorath, H. Marquardt, y D. E.
Geraghty. 1995. The membrane-bound and soluble
forms of HLA-G bind identical sets of endogenous
peptides but differ with respect to TAP association. Immunity
3:591). El marcaje de HUVEC, Jurkat y Jurkat-CD160
mediante tetrámeros de HLA-G conjugados con PE se
realizó a 37ºC durante 1 h. Para Jurkat-CD160 y
Jurkat, se reticularon tetrámeros con AcM W6/32
anti-HLA clase I. Había células de carcinoma de
pulmón de Lewis disponibles de ECACC [European Collection of Cell
Cultures (Colección europea de cultivos celulares); Health
Protection Agency; Porton Down; SP4 0JG Salisbury, Wiltshire RU]
(línea de células de carcinoma de pulmón de ser humano de raza
blanca COR-L23/R; número de depósito ECACC
96042339).
Para el análisis de proliferación, se sembraron
HUVEC (8 x 10^{3}) en placas de 12 pocillos recubiertas con
gelatina al 0,3%. Se incubaron las células con solución salina o
VEGF (1 ng/ml) en presencia o ausencia de diversas concentraciones
de sHLA-G1 o sHLA-G1mono. 7 días
después, se tripsinizaron las células y se contaron en un contador
ZM de Coulter (Margency, Francia). Se realizaron ensayos de
migración con BAEC o HUVEC confluentes con crecimiento detenido. Se
cortaron monocapas celulares con una espátula de caucho. Se lavaron
las placas con medio libre de suero y se fotografió cada pocillo
con un aumento de 100x. Entonces se incubaron las placas durante 16
h en medio libre de suero que contenía sHLA-G1 o
sHLA-G1mono (100 ng/ml) en presencia o no de VEGF
(50 ng/ml). Se tomó una segunda fotografía de cada pocillo y se
contaron las células que habían migrado superponiendo las dos
fotografías.
Se trataron VEGF y sHLA-G1 con
yodo con el procedimiento de Iodogen con una actividad específica de
240.000 y 110.000 cpm/ng, respectivamente (Plouët, J., F. Moro, S.
Bertagnolli, N. Coldeboeuf, H. Mazarguil, S. Clamens, y F. Bayard.
1997. Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth
factor 189-amino acid form by urokinase is required
for its mitogenic effect. J Biol Chem 272:13390). Los pocillos que
contenían 2x10^{5} HUVEC privadas de suero o bien se trataron
previamente con 50 ng/ml de VEGF o sHLA-G1 a 37ºC
durante diversos intervalos de tiempo (0,1-24 h) o
bien se procesaron inmediatamente para realizar ensayos de unión. En
resumen, se aclararon las placas en DMEM frío complementado con un
0,2% de gelatina y Hepes 20 mM, pH 7,3 y se incubaron a 4ºC durante
2 h con 2 ng/ml de ^{125}I-VEGF o
sHLA-G1 en ausencia o presencia de ligando sin
marcar. Entonces se aclararon las células en el mismo medio y se
lisaron en tampón RIPA y se contó la radiactividad en un contador
gamma Packard.
Se diluyó factor de crecimiento reducido
Matrigel (BD Biosciences) en colágeno (1/6 v/v) y se mantuvo en
hielo. Se añadieron 160 \mul de esta disolución a cada pocillo de
portaobjetos de cultivo de 8 pocillos recubiertos previamente con
colágeno de cola de rata tipo I y se dejaron a 37ºC durante 1 h.
Tras la formación de gel, se sembró una suspensión de HUVEC,
mezclada o no con control, FGF-2,
sHLA-G1 o AcM frente a CD160 sobre geles de
Matrigel/colágeno durante 24 h a 37ºC en un incubador humidificado
con CO_{2} al 5%. Se cuantificó la angiogénesis tal como se
describió anteriormente (Ruggeri B, Singh J, Gingrich D, Angeles T,
Albom M, Yang S, Chang H, Robinson C, Hunter K, Dobrzanski P,
Jones-Bolin S, Pritchard S, Aimone L,
Klein-Szanto A, Herbert JM, Bono F, Schaeffer P,
Casellas P, Bourie B, Pili R, Isaacs J, Ator M, Hudkins R, Vaught J,
Mallamo J, Dionne C. "CEP-7055: a novel, orally
active pan inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor
tyrosine kinases with potent antiangiogenic activity and antitumor
efficacy in preclinical models", Cancer Res. 2003 Sep 15;
63(18):5978-91; Erratum in: Cancer Res. 2003
Nov 1; 63(21):7543. En resumen, se retiró el medio de
cultivo, se aclararon las células dos veces con PBS y se fijaron
durante 30 min. a temperatura ambiente en una disolución de PFA al
4%. Entonces, se lavaron las células dos veces con PBS y se tiñeron
con tinción Trichrom de Masson. Se midió el grado de red
microcapilar usando un sistema de análisis de imágenes asistido por
ordenador automatizado (Imagenia, Biocom, Les Ulis, Francia), y se
determinó la longitud total de los capilares en cada pocillo. Se
calculó la longitud de red microcapilar media (\mum) para cada
condición experimental. Se realizaron experimentos por triplicado y
se repitieron 3
veces.
veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Se rasparon HMVEC subconfluentes en normoxia o
en hipoxia (24 horas de incubación a 37ºC en una atmósfera de
O_{2} al 5%) o HUVEC (Biowitthaker) en PBS-BSA y
se incubaron o no con 100 ng/ml de sHLA-G1 a 4ºC.
Tras 2 h se incubaron las células con o bien AcM específicos de
CD8, CD85d, CD85j (Plouët, J., F. Moro, S. Bertagnolli, N.
Coldeboeuf, H. Mazarguil, S. Clamens, y F. Bayard. 1997.
Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor
189-amino acid form by urokinase is required for its
mitogenic effect. J Biol Chem 272:13390.1), CD106 (BD),
CL1-R2 BY55 (Fournel, S., M.
Aguerre-Girr, A. Campan, L. Salauze, A. Berrebi, Y.
Lone, F. Lenfant, y P. Le Bouteiller. 1999. Soluble
HLA-G: purification from eucaryotic transfected
cells and detection by a specific ELISA. American Journal of
Reproductive Immunology 42:22) o bien Ac de control isotípicos, 20
\mug/ml, seguido por IgG de cabra anti-ratón
conjugado con F(ab')_{2}-FITC. No se
excluyó ninguna célula viable mediante el uso de yoduro de
propidio. Se analizaron las células mediante un citómetro de flujo
Coulter-Epics
ELITE.
ELITE.
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectaron transcritos de CD160 mediante
RT-PCR usando los siguientes cebadores:
5'-3' (sentido) TGCAG
GATGCTGTTGGAACCC (SEQ ID NO: 1) y 3'-5' (inverso) TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC (SEQ ID NO: 2). Se confirmó la calidad de ADNc mediante la amplificación de \beta-actina usando los siguientes cebadores: 5'-3' GCGGGAAATCGTGCGTGCGTGACA (SEQ ID NO: 3) y 3'-5' GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG (SEQ ID NO: 4). Las condiciones de amplificación para CD160 y \beta-actina fueron 95ºC durante 45 s, 60ºC 30 s, y 72ºC durante 1 min., para 35 ciclos. Para la secuenciación de CD160, se usó una Taq High Fidelity (Invitrogen). Se purificó el producto de PCR (qiaex II, Qiagen) y se analizó con los siguientes cebadores: BY01 (5'-3', sentido) (TGCAG
GATGCTGTTGGAACCC; SEQ ID NO: 1), BY03 (3'-5', inverso) (TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC; SEQ ID NO: 2; BY02 (5'-3', sentido) CAGCTGAGACTTAAAAGGGATC; SEQ ID NO: 5) y BY04 (3'-5', inverso) (CAC
CAACACCATCTATCCCAG; SEQ ID NO: 6).
GATGCTGTTGGAACCC (SEQ ID NO: 1) y 3'-5' (inverso) TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC (SEQ ID NO: 2). Se confirmó la calidad de ADNc mediante la amplificación de \beta-actina usando los siguientes cebadores: 5'-3' GCGGGAAATCGTGCGTGCGTGACA (SEQ ID NO: 3) y 3'-5' GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG (SEQ ID NO: 4). Las condiciones de amplificación para CD160 y \beta-actina fueron 95ºC durante 45 s, 60ºC 30 s, y 72ºC durante 1 min., para 35 ciclos. Para la secuenciación de CD160, se usó una Taq High Fidelity (Invitrogen). Se purificó el producto de PCR (qiaex II, Qiagen) y se analizó con los siguientes cebadores: BY01 (5'-3', sentido) (TGCAG
GATGCTGTTGGAACCC; SEQ ID NO: 1), BY03 (3'-5', inverso) (TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC; SEQ ID NO: 2; BY02 (5'-3', sentido) CAGCTGAGACTTAAAAGGGATC; SEQ ID NO: 5) y BY04 (3'-5', inverso) (CAC
CAACACCATCTATCCCAG; SEQ ID NO: 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se tripsinizaron células de carcinoma de pulmón
de Lewis subconfluentes, se lavaron dos veces y se resuspendieron
en PBS. Se inocularon 2.10^{5} células por vía subcutánea en el
flanco lateral posterior derecho de ratones C57B16 hembra
anestesiados (pentobarbital, i.p.) (IFFA CREDO, Francia). Se
sacrificaron los ratones 21 días tras la inyección de células con
una sobredosis de pentobarbital; se extrajeron los tumores y se
fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (Sigma) durante la
noche a 4ºC, se incrustaron en parafina (Embedder Leica) y después
se cortaron secciones (5 \mum) con un micrótomo (Leica). Tras la
rehidratación (tolueno/etanol/PBS), se calentaron los portaobjetos
durante 20 min. en una disolución de tampón citrato a pH 6,1. Se
colocaron secciones en un dispositivo de autotinción DAKO y se
incubaron con tampón de bloqueo TNB (kit TSA, NEN), reactivo de
bloqueo de peroxidasa (Dako) y reactivo de bloqueo de
inmunoglobulinas Mouse on Mouse (Vector Laboratories). Se tiñeron
vasos tumorales con el anticuerpo monoclonal CL1-R2
a una concentración final de 10 \mug/ml (dilución 1/500 de la
disolución) durante 30 min. a temperatura ambiente. Entonces se
incubaron las secciones con IgG de cabra
anti-conejo marcada con biotina durante 10 min.
seguido por incubación con complejo avidina-biotina
(Vector Laboratories) durante 30 min. Entonces se tiñeron las
secciones con DAB (Vector Laboratories) y se contratiñeron con
hematoxilina. Se visualizaron tejidos inmunoteñidos en un
microscopio Nikon (E-800) y se digitalizaron usando
una cámara DMX 1200 (Nikon) con un objetivo de 40X.
VEGF es el factor mitogénico y motogénico más
potente para CE vasculares. Por tanto, se investigó si
sHLA-G1 podría interferir con las funciones de VEGF
en CE in vitro. Se encontró que sHLA-G1
inhibía la proliferación de HUVEC inducida por VEGF (figura 4A)
mientras que no afectaba a la proliferación basal de estas células.
En cambio, cuando se fusionó sHLA-G1 con \beta2m,
la proteína monocatenaria no afectó a la proliferación de CE
inducida por VEGF, sugiriendo por tanto que el plegamiento de la
molécula era crítico para su actividad biológica. Además,
sHLA-G1 inhibió la proliferación inducida por VEGF
de CE bovinas derivadas de microvasos de glándulas suprarrenales o
de la aorta, sugiriendo un mecanismo conservado entre las especies y
el órgano de origen de las
CE.
CE.
En un ensayo de migración usando HUVEC como
modelo de células endoteliales, no se produjo ninguna migración
tanto si se añadía sHLA-G1 o
sHLA-G1mono como si no en ausencia de VEGF (figura
4B). En cambio, tras la adición de VEGF, se detectó un aumento
significativo en el número de células que migraron. En estas
condiciones, la adición de sHLA-G1 inhibió la
migración, mientras que sHLA-G1 mono no tuvo ningún
efecto significativo (figura 4B). Para evaluar si
sHLA-G1 podía bloquear la formación de tubos tras la
estimulación mediante factores pro-angiogénicos, se
sometieron HUVEC a FGF-2 en el modelo de Matrigel.
Para este fin, se diluyó Matrigel con colágeno para limitar la
angiogénesis espontánea que se produce normalmente tras 3 días en
cultivo. En la figura 4C se muestra la morfología de las células en
Matrigel y en la figura 4D se muestra la cuantificación de la
longitud total de túbulos. Los resultados indican que
FGF-2 indujo una potente respuesta angiogénica y que
la adición de sHLA-G1 a FGF-2
inhibió significativamente la formación de tubos.
En conjunto, estos resultados demuestran que
sHLA-G1 puede inhibir la formación de vasos in
vitro, la migración y la proliferación de CE inducida por
factor pro-angiogénico.
En este estudio, se usaron tanto
^{125}I-VEGF como
^{125}I-sHLA-G1 como ligandos. La
unión total de ligandos radiomarcados a células HUVEC a 4ºC era
dependiente del tiempo y alcanzó el equilibrio 45 min. tras el
comienzo del experimento. Tras 60 min., la incubación con ligando
sin marcar disoció casi totalmente la unión de
^{125}I-VEGF o
^{125}I-sHLA-G1 de las células
endoteliales. Por tanto, se realizaron experimentos de unión en
equilibrio fijando el tiempo de incubación a 60 min.
Independientemente del radioligando usado, la unión total fue
dependiente de la dosis y la unión no específica, medida en
presencia de una alta concentración de ligandos sin marcar, fue
lineal con la concentración de radioligando. La unión no específica
no superó el 20% de la unión total. En experimentos de competición
usando ^{125}I-sHLA-G1 como
ligando, aunque sHLA-G1 desplazó rápidamente la
unión a HUVEC con valores de CI_{50} en un intervalo nanomolar,
VEGF incubado previamente o no con las células no afectó a esta
unión (figura 2A). En experimentos de competición usando ahora
^{125}I-VEGF como ligando, aunque VEGF desplazó
rápidamente la unión de ^{125}I-VEGF a HUVEC con
valores de CI_{50} en un intervalo nanomolar,
sHLA-G1 incubado previamente o no con las células no
afectó a esta unión (figura 2B). Estos resultados demuestran que
sHLA-G1 podía unirse específicamente a células
endoteliales y que esta unión no estaba modulada por VEGF. Además,
se demuestra claramente que sHLA-G1 no interfirió
con los receptores de VEGF en células endoteliales.
Usando AcM específicos y análisis mediante
citometría de flujo, se encontró que HUVEC no expresaban CD8, ni
CD85j. En cambio, estas células se teñían fuertemente mediante un
AcM anti-CD160 (figura 6A) como HMVEC. Para
proporcionar evidencias adicionales de que CD160 se expresaba por
HUVEC, se realizaron análisis de RT-PCR con estas
células mediante comparación con células control CD160^{+} (NK92)
y CD160^{-} (T CD4^{+}), usando cebadores específicos para
CD160. De manera similar a NK92, se detectó ARNm de CD160 en HUVEC,
mientras que las células T CD4^{+} eran negativas (figura 6B).
Entonces se aislaron ADNc de HUVEC y NK92 y se secuenciaron. La
alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de proteínas
CD160 de HUVEC y NK92 mostró que ambas eran similares a la
secuencia de CD160 ya descrita (Anumantha, A., A. Bensussan, L.
Boumsell, A. Christ, R. Blumberg, S. Voss, A. Patel, M. Robertson,
L. Nadler, y G. Freeman. 1998. Cloning of BY55, a novel Ig
superfamily member expressed on NK cells, CTL, and intestinal
intraepithelial lymphocytes. Journal of Immunology 161:2780)
(figura 6C). En conjunto estos datos demuestran que CD160 se
expresaba por CE.
Habiendo mostrado que CD160 estaba presente en
CE, se investigó si sHLA-G1 podía ser un posible
ligando. Se demostró la interacción directa de CD160 con
sHLA-G1 en HUVEC usando tetrámeros de
HLA-G1. En primer lugar se mostró que esos
tetrámeros se unían específicamente a Jurkat-CD160,
pero no a Jurkat sin transfectar (figura 7A), demostrando la
especificidad de CD160 para el ligando sHLA-G1.
Cuando se incubaron HUVEC con tetrámeros de HLA-G1,
se detectó una clara tinción, sugiriendo que sHLA-G1
se unía a CD160 expresado por estas células (figura 7A). Se evaluó
adicionalmente la interacción
CD160-sHLA-G1 mediante citometría de
flujo con HUVEC que se incubaron previamente o no con
sHLA-G1. Se encontró que la incubación previa de
HUVEC con sHLA-G1 modulaba por disminución la
expresión en la superficie celular de CD160 (figura 7B). Esto
demuestra que sHLA-G1 interacciona directamente con
CD160 en la superficie celular de HUVEC.
A continuación, se investigó si la reticulación
CD160-AcM podía imitar la actividad
anti-angiogénica de sHLA-G1. Usando
el ensayo con Matrigel in vitro, se encontró que la
reticulación CD160-AcM conducía a la inhibición del
crecimiento de vasos de túbulos mediado por FGF2 (figura 8). Estos
datos demuestran adicionalmente que CD160, expresado por CE, era un
receptor funcional que podía activar una respuesta celular
anti-angiogénica.
Aunque muchos de los procesos fenotípicos
individuales en la angiogénesis tales como la migración celular o
la formación de tubos endoteliales pueden inducirse mediante
condiciones de cultivo hipóxicas, se determinó la expresión de
CD160 en HMVEC cultivadas en condiciones hipóxicas (Luttun, A., M.
Autiero, M. Tjwa, y P. Carmeliet. 2004. Genetic dissection of tumor
angiogenesis: are P1GF y VEGFR-1 novel
anti-cancer targets? Biochim Biophys Acta 1654:79).
Usando AcM frente a CD160 específicos y análisis mediante citometría
de flujo, se encontró que la hipoxia aumentaba fuertemente la
expresión de CD160 en células endoteliales (figura 9).
Finalmente, se observó una fuerte tinción para
CD160 en CE en tumores de LLC (figuras 10A, 10B, 10C, 10D) mientras
que no se observó ninguna tinción con IgG no específica. Las células
tumorales no expresaron CD160 pero las CE de vasos linfáticos en la
periferia del tumor o los microvasos dentro del tumor expresaron un
alto nivel de CD160.
En este estudio, se identificó un nuevo
receptor, CD160, que podía activar una respuesta
anti-angiogénica en células endoteliales. Se
demostró, por primera vez, que este receptor dependiente de la clase
I de CMH se expresa por
CE.
CE.
CD160 activa la inhibición de la angiogénesis
inducida por VEGF o FGF-2 in vitro
tras el acoplamiento con su ligando fisiológico,
sHLA-G1, o tras la reticulación con AcM específico
(CL1-R2).
CD160 se diferencia del receptor CD36 descrito
anteriormente, una glicoproteína transmembrana unida mediante
trombospondina 1 (TSP-1), un potente inhibidor de la
angiogénesis (Dawson, D. W., S. F. Pearce, R. Zhong, R. L.
Silverstein, W. A. Frazier, y N. P. Bouck. 1997. CD36 mediates the
in vitro inhibitory effects of
thrombospondin-1 on endothelial cells. J Cell Biol
138:707). Al contrario que CD36, CD160 es una molécula anclada con
GPI que no tiene un dominio transmembrana, ni cola citoplasmática
(Anumantha, A., A. Bensussan, L. Boumsell, A. Christ, R. Blumberg,
S. Voss, A. Patel; M. Robertson, L. Nadler, y G. Freeman. 1998.
Cloning of BY55, a novel Ig superfamily member expressed on NK
cells, CTL, and intestinal intraepithelial lymphocytes. Journal of
Immunology
161:2780).
161:2780).
Se encontró además que sHLA-G1
era un ligando de CD160 de CE. Sabiendo que diversas moléculas de
clase I de HLA pueden unirse a CD160 (Le Bouteiller, P., A.
Barakonyi, J. Giustiniani, F. Lenfant, A.
Marie-Cardine, M. Aguerre-Girr, M.
Rabot, I. Hilgert, F. Mami-Chouaib, J. Tabiasco, L.
Boumsell, y A. Bensussan. 2002. Engagement of CD160 receptor by
HLA-C is a triggering mechanism used by circulating
natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc Natl Acad
Sci USA 99:16963.; Agrawal, S., J. Marquet, G. J. Freeman, A. Tawab,
P. Le Bouteiller, P. Roth, W. Bolton, G. Ogg, L. Boumsell, y A.
Bensussan. 1999. Cutting edge: MHC class I triggering by a novel
cell surface ligand costimulates proliferation of activated human T
cells. J Immunol 162:1223), otras moléculas de clase I de CMH
solubles también pueden activar este receptor para ejercer funciones
anti-angiogénicas. De hecho, se observó que una
HLA-B7 soluble recombinante también podía inhibir la
proliferación de HUVEC. Estas observaciones sugieren que la función
anti-angiogéncia de sHLA-G1 y
sHLA-B7 podría generalizarse a todas las HLA
solubles.
solubles.
La actividad anti-angiogénica de
sHLA-G1 notificada en el presente documento es la
primera función no inmunitaria descrita hasta la fecha. La
regulación espacial y temporal de la angiogénesis en el punto de
contacto maternofetal desempeña un importante papel para garantizar
un suministro adecuado de sangre para alimentar al embrión en
desarrollo, lo que sugiere que hay factores de acción local que
regulan el crecimiento vascular (Ong, S., G. Lash, y P. N. Baker.
2000. Angiogenesis and placental growth in normal and compromised
pregnancies. Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol
14:969). sHLA-G1 se secreta mediante trofoblastos
extravellosos, incluyendo trofoblasto endovascular (Morales, P. J.,
J. L. Pace, J. S. Platt, T. A. Phillips, K. Morgan, A. T. Fazleabas,
y J. S. Hunt. 2003. Placental cell expression of
HLA-G2 isoforms is limited to the invasive
trophoblast phenotype. J Immunol 171:6215) que sustituye a las CE
de las arterias espirales maternas, aumentando de ese modo varias
veces el diámetro de estos vasos (Loke, Y., y A. King. 2000.
Immunology of implantation. Baillière's Clinical Obstetrics
Gynaecology 14: 827). Se plantea la hipótesis de que el efecto
anti-angiogénico de sHLA-G1 podría
contribuir a tal sustituición. La falta de expresión de
HLA-G en placentas preeclámpticas, caracterizadas
por una escasa invasión citotrofoblástica y un flujo reducido de
sangre materna a la unidad feto-placenta (Lim, K.
H., Y. Zhou, M. Janatpour, M. McMaster, K. Bass, S. H. Chun, y S. J.
Fisher. 1997. Human cytotrophoblast differentiation/invasion is
abnormal in pre-eclampsia. Am J Pathol 151:1809),
favorece tal hipótesis.
Se ha mostrado que la hipoxia regula la
expresión de múltiples marcadores endoteliales angiogénicos como el
receptor CD54, CD105 o tie-2. La sobreexpresión de
tie-2 sugiere que está implicado en una respuesta
angiogénica positiva a la hipoxia. La regulación por incremento de
CD160 mediante hipoxia puede generar una regulación negativa de la
angiogénesis y puede impedir la formación de nuevos vasos. Además,
ensayos inmunohistoquímicos en tumor de ratón con anticuerpo frente
a CD160 muestran que este receptor no se expresa por las propias
células tumorales pero se expresa por CE de la vasculatura tumoral.
Todos estos resultados demuestran que CD160, regulado por
incremento mediante hipoxia, es un receptor de señalización
inhibitorio para la angiogénesis y que su activación puede ser útil
para la terapia anti-angiogénica experimental para
impedir el crecimiento de células tumora-
les.
les.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se obtuvieron células CD4^{+} de sangre
periférica (SP) recién aisladas de linfocitos de individuos normales
usando el kit de aislamiento de células CD4 inmunomagnético
(Miltenyi Biotec). Se mostró que la pureza de
CD4^{+}-SP era >98% de
CD3^{+}CD4^{+}CD8^{-} mediante citometría de flujo. Se
cultivaron adicionalmente CD4^{+}-SP durante
varios días (entre 3 y 6 días) en un medio de cultivo convencional
que contenía el 10% de suero AB humano inactivado por calor
complementado con una alta concentración de IL-15.
Se detectaron los transcritos de CD160 mediante
RT-PCR usando los siguientes cebadores:
- 5'-3' (sentido): TGCAGGATGCTGTTGGAACCC
- (SEQ ID NO: 8);
- 3'-5' (inverso): TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC
- (SEQ ID NO: 9).
En la figura 11 se muestran resultados
ilustrativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se sembraron 0,2X10^{6} células en una placa
de 6 pocillos, se les privó de suero durante 24 h y entonces se
trataron con sHLA-G1 (1 \mug/ml), AcM
CL1-R2 frente a CD160 (10 \mug/ml) o
Ig-G1 control (10 \mug/ml) durante 50 h en
presencia de VEGF (50 ng/ml). Al final del tratamiento, se
recogieron las células flotantes mediante centrifugación, mientras
que se recogieron las células adherentes mediante disolución de
tripsina-EDTA para producir una única suspensión
celular. Entonces se sedimentaron las células mediante
centrifugación y se lavaron dos veces con PBS. Se identificó la
muerte de células apoptóticas mediante doble tinción con
anexina-V conjugada con FITC recombinante
(isotiocianato de fluoresceína) y PI (yoduro de propidio), usando el
kit de detección de apoptosis con anexina V-FITC
(DAKO) según las instrucciones del fabricante. Se analizaron las
células mediante citometría de flujo en un instrumento FACScan
(Becton Dickinson) usando el detector de señal de fluorescencia 1
(FL1) para los conjugados de FITC y el detector de señal FL3 para
PI. Se registraron diez mil acontecimientos para cada muestra. Se
analizaron los datos usando el software CellQuest.
Figura 18a: demuestra que el receptor CD160 se
expresa en la superficie celular de HUVEC y HMVEC pero no de
fibroblastos humanos en cultivo primario ni en células de músculo
liso.
Figura 18b: demuestra que CL1-R2
activa la apoptosis específica de HUVEC y no de fibroblastos.
Figura 18c: indica que el anticuerpo monoclonal
anti-CD160 CL1-R2 imita el efecto
anti-angiogénico del ligando natural
HLA-G1 soluble de CD160. Tanto
HLA-G1 soluble así como el anticuerpo monoclonal
anti-CD60 median la apoptosis específica de células
endoteliales (HUVEC), siendo ineficaz el control de isotipo IgG1.
Por consiguiente, los experimentos de unión a anexina V establecen
la especificidad de este efecto: el anticuerpo monoclonal
CL1-R2 induce la apoptosis de HUVEC que expresan
CD160 pero no de fibroblastos primarios negativos para
CD160.
CD160.
\newpage
Ejemplo
5
HLA-G es una molécula de clase
Ib del complejo mayor de histocompatibilidad cuya distribución
tisular constitutiva está principalmente limitada a células
trofoblásticas en el punto de contacto
maternal-fetal durante el embarazo. En este estudio
se demuestra la capacidad de la isoforma HLA-G1
soluble (sHLA-G1) para inhibir la migración y
proliferación de células endoteliales inducida por factor de
crecimiento endotelial vascular, y para disminuir la formación de
tubos de tipo capilar inducida por factor de crecimiento de
fibroblastos 2. Se identifican posibles mecanismos mediante los
cuales se produce esto: sHLA-G1 induce la apoptosis
mediante unión a CD160, un receptor anclado a
glicosilfosfatidilinositol expresado por células endoteliales.
Además, se muestra que el anticuerpo monoclonal específico
anti-CD160 CL1-R2 imita la
inhibición mediada por sHLA-G1 de la formación de
tubos de células endoteliales y la inducción de la apoptosis. Por
tanto, el acoplamiento de CD160 en células endoteliales puede ser
esencial para la inhibición de la angiogénesis. La propiedad
anti-angiogénica mediada por
sHLA-G1/CD160 puede participar en la remodelación
vascular de arterias espirales maternas durante el embarazo, y
ofrece una atractiva diana terapéutica para impedir la
neovascularización patológica ya que se encontró que CD160 se
expresa fuertemente en la vasculatura de un tumor murino.
HLA-G es un gen de clase Ib
mayor de histocompatibilidad humano caracterizado por una región
promotora única, un polimorfismo limitado, una distribución tisular
constitutiva limitada y la aparición de varios transcritos de corte
y empalme que codifican para proteínas o bien unidas a membrana o
bien solubles^{1}. La isoforma HLA-G1 soluble
(sHLA-G1) secretada activamente se deriva de ARNm
que conserva el intrón 4^{2}, que contiene un codón de parada que
impide la traducción del dominio transmembrana. Esta isoforma de
sHLA-G1 que conserva el intrón de 37 kDa se asocia
con la \beta2-microglobulina
(\beta2m)^{2}. La expresión predominante de
sHLA-G1 en la placenta en el momento en el que se
reprimen moléculas polimórficas de clase Ia HLA-A y
HLA-B concuerda con importantes funciones
inmunológicas durante el embarazo^{3}. sHLA-G1
induce la apoptosis de células NK y T CD8^{+} activadas^{4,5} y
regula por disminución la respuesta de
alo-proliferación de células T CD4^{+6}. La
observación de que algunos anticuerpos monoclonales
anti-HLA-G (AcM) se unían a células
endoteliales de la placenta^{7.8} condujo a la hipótesis de que
HLA-G también puede participar en la modulación de
angiogénesis de la placenta y la remodelación de los vasos
uterinos^{7}. Varias observaciones adicionales están en línea con
tal función novedosa de HLA-G: en primer lugar, un
defecto en la expresión de HLA-G en citotrofoblastos
extravellosos está asociado con preeclampsia^{9,10}, una
complicación común del embarazo en la que se suprime la invasión
trofoblástica endovascular de HLA-G^{+} de
arterias espirales maternas, comprometiendo el flujo sanguíneo al
punto de contacto materno^{9}; en segundo lugar, se ha mostrado
que HLA-G inhibía la migración transendotelial de
células NK^{11} y la adhesión de células NK activadas sobre
células endoteliales^{12}. Hasta la fecha, no se ha tratado el
posible papel de sHLA-G1 en la modulación de
la
angiogénesis.
angiogénesis.
La angiogénesis, la formación de nuevos
capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes, es un
componente crucial del desarrollo y la diferenciación vascular
embrionaria, la curación de heridas y la regeneración de órganos,
pero también contribuye a la evolución de patologías que dependen de
la neovascularización, incluyendo crecimiento tumoral, diabetes,
enfermedad ocular isquémica y artritis
reumatoide^{13-15}. Aunque los mediadores más
importantes de la angiogénesis, las familias del factor de
crecimiento endotelial (VEGF) y del factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF), están bien definidos^{16}, la angiogénesis
existe como un proceso complejo en el que están implicados
múltiples productos génicos expresados por diferentes tipos de
células, contribuyendo todos a una secuencia integrada de
acontecimientos^{17}.
Para someter a prueba la hipótesis de que
sHLA-G1 es un regulador de la actividad de células
endoteliales, se investigó su efecto in vitro. Este estudio
demuestra que sHLA-G1 inhibe la angiogénesis
inducida por VEGF y FGF e induce la apoptosis de células
endoteliales mediante interacción con el receptor CD160 anclado a
glicosilfosfatidilinositol (GPI)^{18.19} expresado en
células endoteliales. De manera interesante, se demuestra mediante
inmunohistoquímica realizada ex vivo que CD160 se expresa a
nivel vascular en un modelo de tumor de ratón.
VEGF es el factor mitogénico y motogénico más
potente para células endoteliales^{16}. Por tanto, se investigó
si sHLA-G1 podía interferir con las funciones de
VEGF in vitro. sHLA-G1 recombinante
purificada, cuando se añadió de manera exógena a HUVEC, inhibió la
respuesta proliferativa frente a VEGF de una manera dependiente de
la dosis (figura 12a). En cambio, la proteína monocatenaria
sHLA-G1 fusionada con \beta2m
(sHLA-G1mono) no tuvo ningún efecto, lo que indica
que el plegamiento de sHLA-G1 era crítico para su
actividad biológica. Además, sHLA-G1 también
inhibió la proliferación mediada por VEGF de células endoteliales
bovinas derivadas de microvasos de glándula suprarrenal o aorta
(datos no mostrados), lo que sugiere un mecanismo conservado entre
especies y células endoteliales que se originan de diferentes
tejidos.
Entonces se examinó el efecto de
sHLA-G1 sobre la migración de células endoteliales,
usando un ensayo de migración. Cuando se incubaron HUVEC en
ausencia de VEGF, se produjo una migración marginal, espontánea,
tanto si se añadía sHLA-G1 como si no (figura 12b,
sin tratar). En cambio, tras la adición de VEGF, se detectó un
aumento significativo en el número de células migradas. En estas
condiciones, la adición de sHLA-G1 inhibió su
migración (figura 12b, tratado con VEGF). No se observó la
inhibición de la migración con sHLA-G1mono.
A continuación se evaluó la capacidad de
sHLA-G1 para inhibir la formación de túbulos
capilares por células endoteliales cultivadas en Matrigel.
sHLA-G1 inhibió significativamente la formación
similar a tubos inducida por FGF-2 (figura 12c,
morfología y figura 12d, cuantificación). En conjunto, estos
hallazgos indican que sHLA-G1 inhibe in
vitro la formación de tubos capilares, la migración y la
proliferación de células endoteliales mediada por factor
pro-angiogénico.
Con el fin de determinar los mecanismos
implicados en estos efectos inhibitorios inducidos por
sHLA-G1, se examinó, usando microscopía en
intervalos de tiempo, si se producían cambios morfológicos
apoptóticos en células endoteliales tras el tratamiento con
sHLA-G1. Usando células endoteliales derivadas de
HUVEC, se encontró que la incubación de esas células con medio
condicionado que contenía sHLA-G1 inducía claramente
la apoptosis, según se determinó mediante microscopía de imágenes
digitales en intervalos de tiempo (figura 13a, b). Imágenes del
final del experimento (figura 13b) y datos de vídeo muestran que la
morfología de las células tratadas con sHLA-G1 se
caracteriza por una contracción citoplasmática y nuclear y un cambio
a un aspecto brillante de fase, así como la formación de
ampollas/vesículas de membrana. En cambio, la incubación de esas
células en medio condicionado de control no tuvo ningún efecto. Los
experimentos en los que se usó sHLA-G1 recombinante
(100 ng/ml) mostraron efectos apoptóticos similares (figura 13c,d).
El uso del inhibidor de caspasas de amplio espectro
zVAD-fmk impidió la apoptosis mediada por
sHLA-G1 recombinante (figura 13c,d). La inducción de
la apoptosis por sHLA-G1 se demostró adicionalmente
mediante la detección de poli(ADP-ribosa)
polimerasa (PARP) escindida mediante análisis de
inmunotransferencia de tipo Western (figura 13e).
A continuación, era importante identificar el
receptor implicado en los efectos inhibitorios mediados por
sHLA-G1 sobre células endoteliales. En primer lugar
se sometió a prueba si sHLA-G1 interfería con los
receptores de VEGF, realizando experimentos de unión sometida a
ensayo mediante radiorreceptor a 4ºC en HUVEC incubadas durante 2
horas (tiempo de equilibrio) con ^{125}I-VEGF o
^{125}I-sHLA-G1 en presencia de
diversas concentraciones de competidores fríos. En primer lugar se
analizó la unión de
^{125}I-sHLA-G1 a HUVEC y se
encontró que los competidores fríos VEGF o FGF-2 no
tenían ningún efecto, mientras que sHLA-G1 sin
marcar inhibió esta unión como función de la concentración con
valores de CI_{50} en el intervalo nanomolar (figura 14a). En
experimentos de competición usando ^{125}I-VEGF
como ligando, se encontró que VEGF frío desplazaba rápidamente su
unión a HUVEC con valores de CI_{50} en un intervalo nanomolar,
mientras que sHLA-G1 no tenía ningún efecto (figura
14b). Además, se encontró que el competidor frío
sHLA-G1 no inhibía la unión de
^{125}I-VEGF a transfectantes
PAEC-VEGF-R2 o
PAEC-NPL1 (datos no mostrados). Sin embargo otros
inhibidores de la migración y proliferación dependiente de VEGF,
tales como dopamina^{20}, pueden actuar mediante internalización
de receptores de VEGF sin competir con la unión celular a VEGF. La
incubación previa de HUVEC con VEGF a 37ºC eliminó casi totalmente
la unión de ^{125}I-VEGF en el plazo de 1 h,
mientras que la de sHLA-G1 hasta 24 h no tenía
ningún efecto sobre su unión (datos no mostrados), demostrando así
que no moduló la internalización o la expresión de receptores de
VEGF. Estos resultados demuestran que sHLA-G1 se
unió específicamente a células endoteliales sin interferir con los
receptores de VEGF.
Entonces se investigó si HUVEC expresaban
algunos de los receptores de HLA-G descritos hasta
la fecha, incluyendo CD8^{4}, CD85d^{21}, CD85j^{21} y
CD160^{22}. El análisis con citometría de flujo reveló que se
tiñeron HUVEC mediante AcM anti-CD160, aunque no
con niveles constantes, pero no mediante AcM
anti-CD8, anti-CD85d ni
anti-CD85j (figura 15a). De manera similar, HMVEC
también se unieron a AcM anti-CD160 (figura 15a),
así como las células endoteliales bovinas (datos no mostrados), lo
que sugiere que el epítopo de CD160 reconocido por el AcM se
conservaba entre especies. Para demostrar adicionalmente que CD160
se expresa por HUVEC, se realizó un análisis de
RT-PCR en esas células mediante comparación con
células control CD160^{+} (línea NK92 de células NK) y
CD160^{-} (T CD4^{+}), usando cebadores específicos para CD160.
De manera similar a NK92, se detectó ARNm de CD160 en HUVEC,
mientras que las células T CD4^{+} eran negativas (figura 15b).
Entonces se aislaron ADNc de HUVEC y NK92 y se secuenciaron. La
alineación de la secuencia de aminoácidos prevista de proteínas
CD160 de HUVEC y NK92 mostró que ambas eran similares a la secuencia
de CD160 ya descrita^{19}, con la excepción de dos residuos
sustituidos que indican una posible forma alélica (figura 15c).
Para demostrar que CD160 también se expresa en
células endoteliales in vivo y que su expresión no podía
resultar de las condiciones de cultivo, se realizó una tinción
inmunohistoquímica específica de un tumor de ratón de carcinoma de
pulmón de Lewis injertado. Se encontró que el AcM
anti-CD160 teñía fuertemente las células
endoteliales de microvasos en la periferia (figura 16a,b) y el
interior del tumor (figura 16c,d), mientras que no se detectó
ninguna tinción con control isotípico de IgG (datos no mostrados).
En cambio, las células tumorales permanecieron sin tinción. Tal
reactividad del AcM anti-CD160
CL1-R2 no es sorprendente ya que la identificación
y secuenciación previas de ADNc que codifica para CD160 tanto humano
como de ratón revelaron una fuerte homología entre las dos
especies^{19}.
Entonces se demostró que sHLA-G1
sí que se unía eficazmente al receptor CD160 expresado por células
endoteliales. En primer lugar se encontró que un tetrámero de
HLA-G1 se unía específicamente a HUVEC como lo hacía
en Jurkat transfectadas con CD160 (figura 17a). La interacción
directa de sHLA-G1-CD160 en HUVEC se
demostró adicionalmente mostrando que la incubación previa de HUVEC
con sHLA-G1 recombinante bloquea específicamente la
unión del AcM anti-CD160 (figura 17b), mientras que
una incubación previa con VEGF no lo hizo (datos no mostrados).
Para demostrar adicionalmente que la función de
sHLA-G está mediada mediante la interacción con
CD160, se sometió a prueba si el AcM anti-CD160
soluble podía imitar la actividad anti-angiogénica
de sHLA-G1 en el ensayo de Matrigel in vitro
y el efecto proapoptótico. Los resultados mostraron claramente que
la adición de 1 a 10 \mug/ml de AcM CL1-R2
purificado condujo a la inhibición del crecimiento de vasos de
túbulos mediado por FGF-2 (figura 17c) y la
inducción de la apoptosis endotelial (figura 17d). Estos datos
demuestran adicionalmente que CD160 expresado por células
endoteliales es un receptor funcional que puede activar una
respuesta celular anti-angiogénica.
En este estudio, se demostró que la molécula
sHLA-G1 podía ejercer una función no inmunitaria,
concretamente inhibición de la angiogénesis. La regulación espacial
y temporal de la vasculatura en el punto de contacto
materno-fetal desempeña un papel importante para
garantizar un suministro de sangre adecuado para alimentar al
embrión en desarrollo, lo que sugiere que hay factores que actúan
localmente que regulan las células vasculares^{23}.
sHLA-G1 se secreta por trofoblastos extravellosos,
incluyendo trofoblasto endovascular^{3} que sustituye a las
células endoteliales y remodela las arterias espirales maternas,
aumentando de ese modo el diámetro de estos vasos varias
veces^{24}. Se plantea la hipótesis de que los efectos de
sHLA-G1 sobre células endoteliales pueden
contribuir a tal sustitución. Los defectos en la expresión de
HLA-G, incluyendo la disminución de
HLA-G soluble en placentas preeclámpticas,
caracterizadas por una escasa invasión citotrofoblástica y un flujo
reducido de sangre materna a la unidad
feto-placenta^{9.10}, favorecen tal hipótesis.
Se han notificado diferentes mecanismos para
explicar la actividad de inhibidores de la angiogénesis, incluyendo
la inducción de la apoptosis de células endoteliales^{25}, la
inhibición de la actividad de metaloproteinasas de la
matriz^{26}, o la quimiorrepulsión de células endoteliales^{27}.
En este informe se demuestran novedosas acciones inhibitorias de
sHLA-G1, incluyendo el bloqueo significativo de la
formación de vasos, la proliferación y migración de células
endoteliales. Además, se sugiere que estos efectos pueden suponer la
inducción de la apoptosis de células endoteliales ya que las
células endoteliales tratadas con sHLA-G1 mostraron
progresivamente una morfología apoptótica. Todavía queda por
demostrar si esta apoptosis está mediada por la expresión de FasL
endotelial, como en células T CD8^{+} activadas^{4}. Resulta
interesante que recientemente se ha demostrado un papel para la
apoptosis y las interacciones Fas/FasL en la remodelación de
arterias uterinas durante el embarazo^{28}.
El efecto inhibitorio directo de
sHLA-G1 sobre la formación de vasos está muy
probablemente mediado mediante el receptor CD160 funcional, ya que
el AcM anti-CD160 CL1-R2 imita la
inhibición de la formación de túbulos capilares inducida por
FGF-2 por células endoteliales cultivadas en
Matrigel y la inducción de apoptosis endotelial. Al contrario que
otros inhibidores de la angiogénesis tales como semaforina 3F que es
un competidor de la unión de VEGF a receptor neuropilina^{27},
sHLA-G1 actúa directamente sobre el receptor CD160.
Sabiendo que diversas moléculas de clase I de HLA pueden unirse a
CD160^{29}, no puede descartarse que otras moléculas de clase I
de CMH solubles también puedan activar este receptor para ejercer
funciones anti-angiogénicas. En conjunto estos
hallazgos proporcionan importantes informaciones mecanísticas en la
acción anti-angiogénica de sHLA-G1.
Se necesita investigación adicional para determinar las rutas de
señalización usadas por células endoteliales y células NK tras el
acoplamiento de CD160 y que conducen a la apoptosis para las
primeras y a la producción de citocinas^{30} y
citotoxicidad^{29} para las últimas.
Además de la clara importancia en el entorno
placentario/uterino, la identificación de CD160 como receptor de
señalización inhibitorio para la angiogénesis puede ser útil para la
terapia anti-angiogénica experimental para prevenir
el crecimiento de células tumorales. El análisis inmunohistoquímico
de un tumor de injerto de ratón mostró que CD160, codificado por un
gen conservado en esta especie^{31}, estaba presente en células
endoteliales de la vasculatura tumoral pero no se expresaba por
células tumorales. Los objetivos futuros son por tanto examinar el
posible efecto anti-angiogénico mediado por
CD160/sHLA-G1 en diferentes tumores y explorar el
posible uso terapéutico de CD160 en la regulación de la
neovascularización patológica.
Células y reactivos. Se mantuvieron células
endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC) y células
endoteliales microvasculares humanas (HMVEC) (BioWhittaker, San
Diego, CA) en EBM (BioWhittaker) complementado con un 5% de SBF y 1
ng/ml de VEGF o FGF-2 (R & D Systems,
Minneapolis, IL) cada dos días. Las células SGHEC-7
son una línea celular derivada de HUVEC, cultivadas tal como se
describió anteriormente^{32}. Se produjeron localmente células
endoteliales de aorta porcinas
(PAEC)-VEGF-R2 (KDR), transfectantes
PAEC-NPL1, células T Jurkat humanas y Jurkat
transfectadas con CD160
(Jurkat-CD160)^{29}. NK92 es una línea de
células NK humanas que expresan CD160^{29}. Se purificaron
células T CD4^{+} a partir de CMSP usando el sistema de separación
MACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las células PC3 de
adenocarcinoma de próstata transfectadas con el vector PCDNA que
contenía ADNc de sHLA-G1 que conservaba el intron 4
y células PC3 transfectadas con vector vacío
(PC3-neo)^{33} se hicieron crecer hasta la
confluencia durante 4 días y se recogieron los medios condicionados.
Se extrajeron los medios, se centrifugaron para eliminar residuos
celulares y se almacenaron a -20ºC. Se diseñó mediante ingeniería
el gen monocatenario de fusión sHLAG1-\beta2m
conectando el último residuo del dominio \alpha3 de
HLA-G con el primer codón de la secuencia \beta2m
humana mediante un espaciador de 15 residuos^{34}. Se purificaron
sHLA-G1 y sHLA-G1mono a partir de
sobrenadantes de cultivo de células eucariotas, usando columnas de
inmunoafinidad, tal como se describió anteriormente^{34}. Se
expresó VEGF 165 en un sistema de baculovirus tal como se
describió^{35}. Los AcM usados incluyeron CL1-R2
(IgG1) anti-BY55/CD160^{29}, producido en uno de
los laboratorios, anti-CD8 (OKT8, Coulter
Immunotech), anti-ILT4/CD85d (donación de M.
Colonna), anti-ILT2/CD85j,
anti-CD106 (Beckton Dickinson) y controles de
isotipo IgG1 o IgG2a de ratón dializados (DAKO o Sigma). Se
produjeron tetrámeros de HLA-G1 esencialmente tal
como se describió anteriormente^{36}, usando autopéptido
sintético RIIPRHLQL^{37} y tras la adición de
estreptavidina-PE (Pharmingen). Se realizó el
marcaje de HUVEC, Jurkat y Jurkat-CD160 mediante
tetrámeros de HLA-G conjugados con PE a 37ºC durante
1 h. Para Jurkat-CD160 y Jurkat, se reticularon los
tetrámeros con AcM W6/32 anti-clase I de HLA, tal
como se describió anteriormente^{22}.
Ensayos de migración y proliferación de
células endoteliales. Para el análisis de proliferación, se
sembraron HUVEC en placas de 12 pocillos (8.000 células/pocillo)
recubiertas con gelatina al 0,3% en PBS. Se incubaron las células
con solución salina o VEGF (1 ng/ml) en presencia o ausencia de
diversas concentraciones de sHLA-G1 o
sHLA-G1mono. Siete días después, se tripsinizaron
las células y se contaron usando un contador ZM de Coulter. Se
realizaron ensayos de migración con HUVEC o BAEC confluentes con
crecimiento detenido. Se cortaron monocapas celulares con una
espátula de caucho, se lavaron con medio libre de suero y se
fotografió cada pocillo con un aumento de 100x. Entonces se
incubaron las placas durante 16 h en medio libre de suero que
contenía sHLA-G1 o sHLA-G1mono (100
ng/ml) en presencia o no de VEGF (50 ng/ml). Se tomó una segunda
fotografía de cada pocillo y se contaron las células que habían
migrado superponiendo las dos fotografías.
Unión celular de VEGF y
sHLA-G1. Se radiomarcaron VEGF y
sHLA-G1 recombinantes purificados con Na^{125}I
hasta una actividad específica de 2,4 x 10^{4} y 1,1 x 10^{5}
cpm/ng, respectivamente^{35}. Los pocillos que contenían 2 x
10^{5} HUVEC privadas de suero o bien se trataron previamente con
50 ng/ml de VEGF o sHLA-G1 a 37ºC durante diversos
intervalos de tiempo (0,1-24 h) o bien se procesaron
inmediatamente para realizar ensayos de unión. En resumen, se
aclararon las placas en DMEM frío complementado con un 0,2% de
gelatina y Hepes 20 mM (pH 7,3) y se incubaron a 4ºC durante 2 h
con 2 ng/ml de ^{125}I-VEGF o
^{125}I-sHLA-G1 en ausencia o
presencia de concentraciones indicadas de competidores fríos.
Entonces se aclararon las células en el mismo medio, se lisaron en
tampón RIPA y se contó la radiactividad en un contador \gamma.
Formación de tubos capilares in
vitro . Se diluyó factor de crecimiento reducido Matrigel (BD
Biosciences) en colágeno (1/6 v/v) y se mantuvo en hielo. Se
añadieron 160 \mul de esta disolución a cada pocillo de
portaobjetos de cultivo de 8 pocillos recubiertos previamente con
colágeno de cola de rata tipo I y se dejaron a 37ºC durante 1 h. Se
sembró una suspensión de HUVEC, mezclada o no con control,
FGF-2, sHLA-G1 o AcM frente a CD160
en geles de Matrigel/colágeno durante 24 h a 37ºC. Se cuantificaron
los túbulos mediante microscopía tal como se describió
anteriormente^{38}. En resumen, se retiró el medio de cultivo, se
aclararon las células dos veces con PBS y se fijaron durante 30
min. a temperatura ambiente en una disolución de PFA al 4%.
Entonces, se lavaron las células dos veces con PBS y se tiñeron con
Trichrom de Masson. Se midió el grado de red microcapilar usando un
sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador automatizado
(Imagenia, Biocom), y se determinó la longitud total de los
capilares en cada pocillo. Se calculó la longitud de red
microcapilar media (\mum) para cada condición experimental. Se
realizaron experimentos por triplicado y se repitieron tres
veces.
Análisis mediante citometría de flujo. Se
rasparon HUVEC o HVMEC subconfluentes en PBS-EDTA y
se incubaron en presencia o ausencia de 100 ng/ml de
sHLA-G1 a 4ºC. Tras 2 h, se incubaron las células
con AcM específico anti-CD8, -CD85d, -CD85j, -CD106
o CL1-R2 anti-CD160 o control de
isotipo Ig (20 \mug/ml) seguido por IgG
anti-ratón conjugado con
F(ab')_{2}-FITC o con PE. Se excluyeron
células no viables mediante el uso de yoduro de propidio. Se
analizaron las muestras en un citómetro de flujo ELITE de
Coulter-Epics.
RT-PCR y secuenciación de
ADNc. Se detectaron transcritos de CD160 mediante
RT-PCR usando los siguientes cebadores:
5'-TGCAGGATGCTGTTGGAACCC-3' (SEQ ID
NO: 8) y
3'-TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC-5' (SEQ
ID NO: 9). Se confirmó la calidad de ADNc mediante amplificación de
\beta-actina usando los cebadores apropiados. Las
condiciones de amplificación para CD160 y
\beta-actina fueron 95ºC durante 45 s, 60ºC 30 s,
y 72ºC durante 1 min. Para la secuenciación de CD160, se usó una
Taq High Fidelity (Invitrogen). Se purificó el producto de PCR
(qiaex II, Qiagen) y se analizó con los siguientes cebadores: BY01
(5'-TGCAGGATGCTGTTGGAACCC-3' (SEQ ID
NO: 8)), BY03
(3'-TCAGCCTGAACTGAGAGTGCCTTC-5' (SEQ
ID NO: 9)), BY02 (5'-CAGCTGAGACT
TAAAAGGGATC-3' (SEQ ID NO: 5)) y BY04 (3'-CACCAACACCATCTATCCCAG-5' (SEQ ID NO: 6)).
TAAAAGGGATC-3' (SEQ ID NO: 5)) y BY04 (3'-CACCAACACCATCTATCCCAG-5' (SEQ ID NO: 6)).
Inmunohistoquímica. Se tripsinizaron
células de carcinoma de pulmón de Lewis subconfluentes, se lavaron
dos veces y se resuspendieron en PBS. Se inyectaron 2.10^{5}
células por vía subcutánea en la región dorsal de la espalda media
de ratones C57B16 hembra (IFFA CREDO, Francia). Se extrajeron los
tumores en el día 21, se fijaron en formalina al 10% (Sigma)
durante la noche a 4ºC y se incrustaron en parafina (Embedder
Leica). Se colocaron secciones de 5 \mum en un dispositivo de
autotinción DAKO y se incubaron con tampón de bloqueo TNB (kit TSA,
NEN), reactivo de bloqueo de peroxidasas (DAKO) y reactivo de
bloqueo de inmunoglobulinas de ratón (Vector Laboratories). Se
incubaron las secciones con AcM anti-CD160
CL1-R2 (10 \mug/ml), seguido por IgG de cabra
anti-ratón marcado con biotina y complejo
avidina-biotina (Vector Laboratories). Se tiñeron
con DAB (Vector Laboratories), se contratiñeron con hematoxilina, se
visualizaron en un microscopio Nikon (E-800) y se
digitalizaron usando una cámara DMX 1200 (Nikon) con un objetivo de
40X.
Microscopía en intervalos de tiempo. Se
sembraron células SGHEC-7 en placas de 6 pocillos
(2,5x10^{5} células/pocillo) en medio de cultivo normal. Tras 15
h, se añadieron a los pocillos medios condicionados de células
PC3-sG1 o PC3-neo,
sHLA-G1 recombinante (100 ng/ml), AcM
anti-CD160 CL1-R2
(1-10 \mug/ml), control de isotipo IgG1 (10
\mug/ml) o zVAD-fmk (50 \mumol/l, Calbiochem).
Se transfectó la placa en un microscopio de fluorescencia invertido
IX70 de Olympus con una platina motorizada y una cámara CCD enfriada
y se cerró en una cámara calentada, humidificada, a 37ºC con
CO_{2} al 5% en aire. Se tomaron imágenes cada 15 min. durante
36-50 h y se analizaron secuencias en intervalos de
tiempo usando ImagePro Plus (Media Cybernetics). En cada campo de
visión se eligieron al azar 40 células. Se repitieron los
experimentos al menos cuatro veces. Se puntuaron las células
apoptóticas según el momento en el que se observó por primera vez
una morfología apoptótica clara^{39}.
Análisis de inmunotransferencia de tipo
Western de la expresión de PARP escindida. Se sembraron células
endoteliales SGHEC-7 en placas de cultivo. Tras 16
h se estimularon las células con sHLA-G1
recombinante (100 ng/ml) durante 60 h. Se lisaron las células en
tampón RIPA con PMSF 0,1 mg/ml, aprotinina 30 \mul/ml y
ortovanadato de sodio 1 mmol/l a 4ºC durante 30 min. Se separaron
las muestras mediante SDS-PAGE y se transfirieron a
una membrana de nitrocelulosa. Tras la incubación en tampón de
bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente, se incubó la membrana
con anticuerpo policlonal de conejo anti-PARP
escindido humano (Promega) durante 1 h. Se añadió IgG
anti-conejo-peroxidasa (A6154,
Sigma) durante 1 h. Se llevó a cabo la detección de anticuerpos
unidos a la membrana mediante quimioluminiscencia (ECLPlus,
Amersham).
Análisis estadístico. Los resultados se
expresan como media \pm EEM o DE de "n" experimentos
independientes y se evalúan usando la prueba de la U de
Mann-Whitney o la prueba ANOVA según sea apropiado y
el software Everstat o GraphPadPrism considerándose P<0,05 como
estadísticamente significativo.
1. Le Bouteiller, P. &
Blaschitz, A. The functionality of HLA-G is
emerging. Immunol. Rev. 167,233-244
(1999).
2. Ishitani, A. & Geraghty, D.
E. Alternative splicing of HLA-G transcripts yields
proteins with primary structures resembling both class I and class
II antigens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,
3947-3951 (1992).
3. Morales, P. J. et al. Placental
cell expression of HLA-G2 isoforms is limited to the
invasive trophoblast phenotype. J. Immunol. 171,
6215-6224 (2003).
4. Fournel, S. et al. Cutting
Edge: Soluble HLA-G1 triggers CD95/CD95
ligand-mediated apoptosis in activated CD8+ cells
by interacting with CD8. J. Immunol. 164,
6100-6104 (2000).
5. Contini, P. et al. Soluble
HLA-A,-B,-C and -G molecules induce apoptosis in T
and NK CD8+ cells and inhibit cytotoxic T cell activity through CD8
ligation. Eur. J. Immunol. 33, 125-134
(2003).
6. Lila, N.,
Rouas-Freiss, N., Dausset, J.,
Carpentier, A. & Carosella, E. D. Soluble
HLA-G protein secreted by allospecific CD4+ T cells
suppresses the allo-proliferative response: A CD4+ T
cell regulatory mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,
12150-12155 (2001).
7. Blaschitz, A. et al.
Endothelial cells in chorionic fetal vessels of first trimester
placenta express HLA-G. Eur. J. Immunol. 27,
3380-3388 (1997).
8. Dye, J. F. et al. Phenotype of
the Endothelium in the Human Term Placenta. Placenta 22,
32-43 (2001).
9. Lim, K. H. et al. Human
cytotrophoblast differentiation/invasion is abnormal in
pre-eclampsia. Am. J. Pathol. 151,
1809-1818 (1997).
10. Yie, S. M., Li, L. H.,
Li, Y. M. & Librach, C. HLA-G
protein concentrations in maternal serum and placental tissue are
decreased in preeclampsia. Am. J. Obstet. Gynecol. 191,
525-529 (2004).
11. Dorling, A., Monk, N. &
Lechler, R. HLA-G inhibits the
transendothelial migration of human NK cells. Eur. J.
Immunol. 30, 586-593 (2000).
12. Forte, P. et al.
HLA-G Inhibits Rolling Adhesion of Activated Human
NK Cells on Porcine Endothelial Cells. J. Immunol. 167,
6002-6008 (2001).
13. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis.
Nature 386, 671-674 (1997).
14. Carmeliet, P. Angiogenesis in health
and disease. Nat. Med. 9, 653-660
(2003).
15. Folkman, J. Angiogenesis in cancer,
vascular, rheumatoid and other disease. Nat. Med. 1,
27-31 (1995).
16. Ferrara, N., Gerber, H. P.
& LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors.
Nat. Med. 9, 669-76. (2003).
17. Ferrara, N. Vascular endothelial
growth factor and the regulation of angiogenesis. Recent Prog.
Horm. Res. 55, 15-35; discussion
35-36 (2000).
18. Maiza, H. et al. A novel
80-kD cell surface structure identifies human
circulating lymphocytes with natural killer activity. J. Exp.
Med. 178, 1121-1126 (1993).
19. Anumantha, A. et al. Cloning
of BY55, a novel Ig superfamily member expressed on NK cells, CTL,
and intestinal intraepithelial lymphocytes. J. Immunol. 161,
2780-2790 (1998).
20. Basu, S. et al. The
neurotransmitter dopamine inhibits angiogenesis induced by vascular
permeability factor/vascular endothelial growth factor. Nat.
Med. 7, 569-574 (2001).
21. Shiroishi, M. et al. Human
inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and
ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind
preferentially to HLA-G. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 100, 8856-8861 (2003).
22. Agrawal, S. et al. Cutting
edge: MHC class I triggering by a novel cell surface ligand
costimulates proliferation of activated human T cells. J.
Immunol. 162, 1223-1226 (1999).
23. Ong, S., Lash, G. &
Baker, P. N. Angiogenesis and placental growth in normal and
compromised pregnancies. Baillieres Best Pract. Res. Clin. Obst.
Gynaecol. 14, 969-980 (2000).
24. Loke, Y. & King, A.
Immunology of implantation. Baillière's Clin. Obst. Gynaecol.
14, 827-837 (2000).
25. Folkman, J. Angiogenesis and
apoptosis. Sem. Cancer Biol. 13, 159-167
(2003).
26. Kim, Y. M. et al. Endostatin
inhibits endothelial and tumor cellular invasion by blocking the
activation and catalytic activity of matrix metalloproteinase.
Cancer Res 60, 5410-5453 (2000).
27. Bielenberg, D. R. et al.
Semaphorin 3F, a chemorepulsant for endothelial cells, induces a
poorly vascularized, encapsulated, nonmetastatic tumor phenotype.
J. Clin. Invest. 114, 1260-1271
(2004).
28. Ashton, S. et al. Uterine
spiral artery remodeling involves endothelial apoptosis induced by
extravillous trophoblast through Fas/FasL interactions.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 25, 102-108
(2005).
29. Le Bouteiller, P. et al.
Engagement of CD160 receptor by HLA-C is a
triggering mechanism used by circulating natural killer (NK) cells
to mediate cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,
16963-16968 (2002).
30. Barakonyi, A. et al. Cutting
Edge: Engagement of CD160 by its HLA-C physiological
ligand triggers a unique cytokine profile secretion in the
cytotoxic peripheral blood NK cell subset. J. Immunol. 173,
5349-5354 (2004).
31. Bensussan, A. BY55 (CD160).
Protein Review Web 1, 72-73
(2000).
32. Cartwright, J. E., Whitley, G.
S. & Johnstone, A. P. The expression and release of
adhesion molecules by human endothelial cell lines and their
consequent binding of lymphocytes. Exp. Cell. Res. 217,
329-335 (1995).
33. Solier, C. et al. Secretion of
pro-apoptotic intron 4-retaining
soluble HLA-G1 by human villous trophoblast.
Eur. J. Immunol. 32, 3576-3586
(2002).
34. Fournel, S. et al. Soluble
HLA-G: purification from eucaryotic transfected
cells and detection by a specific ELISA. Am. J. Reprod.
Immunol. 42, 22-29 (1999).
35. Plouët, J. et al.
Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor
189-amino acid form by urokinase is required for
its mitogenic effect. J. Biol. Chem. 272,
13390-13396 (1997).
36. Allan, D. S. et al. Tetrameric
complexes of human histocompatibility leukocyte antigen
(HLA)-G bind to peripheral blood myelomonocytic
cells. J. Exp. Med. 189, 1149-1156
(1999).
37. Lee, N. et al. The
membrane-bound and soluble forms of
HLA-G bind identical sets of endogenous peptides
but differ with respect to TAP association. Immunity 3,
591-600 (1995).
38. Ruggeri, B. et al.
CEP-7055: a novel, orally active pan inhibitor of
vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases with
potent antiangiogenic activity and antitumor efficacy in preclinical
models. Cancer Res. 63, 5978-5991
(2003).
39. Dash, P. R., Cartwright, J.
E., Baker, P. N., Johnstone, A. P. &
Whitley, G. S. Nitric oxide protects human extravillous
trophoblast cells from apoptosis by a cyclic
GMP-dependent mechanism and independently of caspase
3 nitrosylation. Exp. Cell. Res. 287,
314-324 (2003).
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante se dirige únicamente a ayudar al lector y no forma parte
del documento de patente europea. Incluso si se ha procurado el
mayor cuidado en su concepción, no se pueden excluir errores u
omisiones y el OEB declina toda responsabilidad a este respecto.
- \bullet WO 9821240 A [0004] [0039]
- \bullet US 5482858 A [0061]
- \bullet WO 03018048 A [0006] [0007] [0008] [0027]
- \bullet US 6207804 B1 [0061]
- \bullet WO 8801649 A [0060] [0061]
- \bullet WO 9413806 A [0069]
- \bullet US 4946778 A [0060] [0061]
- \bullet US 5877291 A [0069]
- \bullet US 5260203 A [0060] [0061]
- \bullet US 5892020 A [0069]
- \bullet WO 8809344 A [0061]
- \bullet WO 9311161 A [0069]
- \bullet US 5132405 A [0061]
- \bullet US 6515110 B1 [0069]
- \bullet US 5091513 A [0061]
- \bullet US 6121424 A [0069]
- \bullet US 5258498 A [0061]
- \bullet US 6027725 A [0069]
- \bullet US 5476786 A [0061]
- \bullet US 5869620 A [0069]
\bullet Molecular Cloning, A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor [0040]
\bullet Current Protocols i? Molecular
Biology. Wiley-Inter-science,
1992 [0040]
\bulletMiller et al. Design,
Construction, and in vitro analysis of multivalent
antibodies. The Journal of Immunology, 2003, vol. 170,
4854-4861 [0070]
\bulletBruyns E;
Marie-Cardine A; Kirchgessner H;
Sagolla K; Shevchenko A; Mann M;
Autschbach F; Bensussan A; Meuer S;
Schraven B. T cell receptor (TCR) interacting molecule
(TRIM), a novel disulfide-linked dimer associated
with the TCR-CD3-zeta complex,
recruits intracellular signalling proteins to the plasma membrane.
J Exp Med., 03 August 1998, vol. 188 (3),
561-75 [0082] [0083]
\bulletNikolova et al.
BY55/CD160 acts as a co-receptor in TCR signal
transductíon of a human circulating cytotoxic effector T lymphocyte
subset lacking CD28 expression. International Immunology,
2002, vol. 14 (5), 445-451 [0084] [0108]
\bulletBruyns E;
Marie-Cardine A; Kirchgessner H;
Sagolla K; Shevchenko A; Mann M;
Autschbach F; Bensussan A; Meuer S;
Schraven B. T cell receptor (TCR) interacting molecule
(TRIM), a novel disulfide-linked dimer associated
with the TCR-CD3-zeta complex,
recruits intracellular signalling proteins to the plasma membrane.
J Exp Med., 03 August 1998, vol, 188 (3),
561-75 [0106] [0107]
\bulletCook, E. B.; J. L.
Stahl; L. Lowe; R. Chen; E. Morgan; J.
Wilson; R. Varro; A. Chan; F. M.
Graziano; N. P. Barney. Simultaneous measurement of
six cytokines in a single sample of human tears using
microparticle-based flow cytometry: allergics
vs. non-allergics. J. Immunol. Meth.,
2001, vol. 254, 109-118 [0120]
\bulletFerlazzo, G.; C. Münz.
NK cell compartments and theiractivation by dendritic cells. J.
Immunol., 2004, vol. 172, 1333-1339
[0127]
\bulletAndré, P.; R.
Castriconi; M. Espeli; N. Anfossi; T.
Juárez; S. Hue; H. Conway; F. Romagne;
A. Dondero; M. Nanni. Comparative analysis of human NK
cell activation induced by NKG2D and natural cytotoxicity receptors.
Eur. J. Immunol., 2004, vol. 34,
961-971 [0127] [0128]
\bulletRaulet, D. H. Roles of the
NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat. Rev. Immunol.,
2003, vol. 3, 781-790 [0127] [0129]
\bulletHsiao, Y. W.; K. W.
Liao; S. W. Hung; R. M. Chu.
Tumor-Infiltrating Lymphocyte Secretion of
IL-6 Antagonizes Tumor-Derived
TGF-betal and Restores the
Lymphokine-Activated Killing Activity. J.
Immunol., 2004, vol. 172, 1508-1514
[0127]
\bulletLe Bouteiller, P.; A.
Barakonyl; J. Giustiniani; F. Lenfant; A.
Marie-Cardine; M.
Aguerre-Girr; M. Rabot; I.
Hilgert; F. Mami-Chouaib; J.
Tabiasco. Engagement of CD160 receptor by
HLA-C is a triggering mechanism used by circulating
natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 2002, vol. 99,
16963-16968 [0128] [0129]
\bulletCarayannopoulos, L.; W.
Yokoyama. Recognition of infected cells by natural killer
cells. Curr. Opin. Immunol., 2004, vol. 16,
26-33 [0129]
\bulletMoretta, L.; A. Moretta.
Unravelling natural killer cell function: triggering and inhibitory
human NK receptors. Embo J., 2004, vol. 23,
255-259 [0129]
\bulletCarayannopoulos, L.; W.
Yokoyama. Recognition of infected cells by natural killer
cells. Curr. Opin. Immunol., vol. 16, 26-33
[0129]
\bulletCerwenka. A. ;L. Lanier.
Natural Killer cells, viruses and cáncer. Nat. Rev. Immunol.,
2001, vol. 1, 41-49 [0129]
\bulletLanier, L. Natural killer cell
receptor signaling. Curr. Opin. Immunol., 2003, vol.
15, 308-314 [0129]
\bulletMoretta, L.; M. Mingari;
C. Bottino; D. Pende; R. Biassoni; A.
Moretta. Cellular and molecular basis of natural killer and
natural klller-like activity. Immunol.
Letters, 2003, vol. 88, 89-93 [0129]
\bulletTortorella, D.; B.
Gewurz; M. Furman; D. Schust; H. Ploegh.
Viral subversión of the immune system. Ann. Rev. Immunol.,
2000, vol. 18, 861-926 [0130]
\bulletCohen, G.; R. Gandhi; D.
Davis; O. Mandelboim; B. Chen; J.
Strominger; D. Baltimore. The selective downregulation
of class I Major Histocompatibility Complex proteins by
HIV-1 protects HIV-infected cells
from NK cells. Immunity, 1999, vol. 10,
661-671 [0130]
\bulletAnumantha, A.; A.
Bensussan; L. Boumsell; A. Christ; R.
Blumberg; S. Voss; A. Patel; M.
Robertson; L. Nadler; G. Freeman. Cloning of
BY55, a novel Ig superfamily member expressed on NK cells, CTL, and
intestinal intraepithelial lymphocytes. Journal of
Immunology, 1998, vol. 161, 2780 [0134] [0147] [0154]
\bulletFournel, S.; M.
Aguerre-Girr; A. Campan; L.
Salauze; A. Berrebi; Y. Lone; F.
Lenfant; P. Le Bouteiller. Soluble
HLA-G: purification from eucaryotic transfected
cells and detection by a specific ELISA. American Journal of
Reproductlve Immunology, 1999, vol. 42, 22 [0135]
[0140]
\bulletPlouët, J.; F. Moro; S.
Bertagnolli; N. Coldeboeuf; H. Mazarguil; S.
Clamens; F. Bayard. Extracellular cleavage of the
vascular endothelial growth factor 189-amino acid
form by urokinase is required for its mitogenic effect. J Biol
Chem, 1997, vol. 272, 13390 [0135] [0138]
\bulletAllan, D. S.; M.
Colonna; L. L. Lanier; T. D. Churakova; J. S.
Abrams; S. A. Ellis; A. J. McMichael; V. M.
Braud. Tetrameric complexes of human histocompatibility
leukocyte antigen (HLA)-G bind to peripheral blood
myelomonocytic cells. J Exp Med, 1999, vol. 189, 1149
[0136]
\bulletLee, N.; A. R. Malacko;
A. Ishitani; M. C. Chen; J. Bajorath; H.
Marquardt; D. E. Geraghty. The
membrane-bound and soluble forms of
HLA-G bind identical sets of endogenous peptides but
differ with respect to TAP association. Immunity,
1995, vol. 3, 591 [0136]
\bulletRuggeri B; Singh J;
Gingrich D; Angeles T; Albom M; Yang S;
Chang H; Robinson C; Hunter K;
Dobrzanski P. CEP-7055: a novel, orally active pan inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases with potent antiangiogenic activity and antitumor efficacy in preclinical models. Cancer Res., 15 September 2003, vol. 63 (18), 5978-91 [0139]
Dobrzanski P. CEP-7055: a novel, orally active pan inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases with potent antiangiogenic activity and antitumor efficacy in preclinical models. Cancer Res., 15 September 2003, vol. 63 (18), 5978-91 [0139]
\bulletCancer Res., 01 November 2003,
vol. 63 (21), 7543 [0139]
\bulletPlouët, J.; F. Moro; S.
Bertagnolli; N. Coldeboeuf; H. Mazarguil; S.
Clamens; F. Bayard. Extracellular cleavage of the
vascular endothelial growth factor 189-amino acid
form by urokinase is required for its mitogenic effect. J Biol
Chem, 1997, vol. 272, 13390.1 [0140]
\bulletDawson, D. W.; S. F.
Pearce; R. Zhong; R. L. Silverstein; W. A.
Frazier; N. P. Bouck. CD36 mediates the In
vitro inhibitory effects of thrombospondin-1 on
endothelial cells. J Cell Biol, 1997, vol. 138, 707
[0154]
\bulletLe Bouteiller, P.; A.
Barakonyi; J. Giustiniani; F. Lenfant; A.
Marie-Cardine; M.
Aguerre-Girr; M. Rabot; I.
Hilgert; F. Mami-Chouaib; J.
Tabiasco. Engagement of CD160 receptor by
HLA-C is a triggering mechanism used by circulating
natural killer (NK) cells to mediate cytotoxicity. Proc Natl Acad
Sci USA, 2002, vol. 99, 16963 [0155]
\bulletAgrawal, S.; J. Marquet;
G. J. Freeman; A. Tawab; P. Le Bouteiller; P.
Roth; W. Bolton; G. Ogg; L. Boumsell; A.
Bensussan. Cutting edge: MHC class I triggering by a novel
cell surface ligand costimulates proliferation of activated human T
cells. J Immunol, 1999, vol. 162, 1223 [0155]
\bulletOng, S.; G. Lash; P. N.
Baker. Angiogenesis and placental growth in normal and
compromised pregnancies. Baillieres Best Pract Res Clin Obstet
Gynaecol, 2000, vol. 14, 969 [0156]
\bulletMorales, P. J.; J. L.
Pace; J. S. Platt; T. A. Phillips; K.
Morgan; A. T. Fazleabas; J. S. Hunt. Placental
cell expression of HLA-G2 isoforms is limited to the
invasive trophoblast phenotype. J Immunol, 2003, vol.
171, 6215 [0156]
\bulletLoke, Y.; A. King.
Immunology of implantaron. Baillière's Clinical Obstetrics
Gynaecology, 2000, vol. 14, 827 [0156]
\bulletLim, K. H.; Y. Zhou; M.
Janatpour; M. McMaster; K. Bass; S. H.
Chun; S. J. Fisher. Human cytotrophoblast
differentiation/invasion is abnormal in preeclampsia. Am J
Pathol, 1997, vol. 151,1809 [0156]
\bulletLe Bouteiller, P.;
Blaschitz, A. The functionality of HLA-G is
emerging. Immunol. Rev., 1999, vol. 167,
233-244 [0187]
\bulletIshitani, A.; Geraghty,
D. E. Alternative splicing of HLA-G transcripts
yields proteins with primary structures resembling both class I and
class II antigens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992,
vol. 89, 3947-3951 [0187]
\bulletMorales, P. J. et al.
Placental cell expression of HLA-G2 isoforms is
limited to the invasive trophoblast phenotype. J. Immunol.,
2003, vol. 171, 6215-6224 [0187]
\bulletFournel, S. et al.
Cutting Edge: Soluble HLA-G1 triggers CD95/CD95
ligand-mediated apoptosis in activated CD8+ cells by
interacting with CD8. J. Immunol., 2000, vol. 164,
6100-6104 [0187]
\bulletContini, P. et al.
Soluble HLA-A,-B,-C and -G molecules induce
apoptosis In T and NK CD8+ cells and inhibit cytotoxic T cell
activity through CD8 ligation. Eur. J. Immunol., 2003,
vol. 33, 125-134 [0187]
\bulletLila, N.;
Rouas-Freiss, N.; Dausset, J.;
Carpentier, A.; Carosella, E. D. Soluble
HLA-G protein secreted by
allo-specific CD4+ T cells suppresses the
allo-proliferative response: A CD4+ T cell
regulatory mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2001, vol. 98, 12150-12155 [0187]
\bulletBlaschitz, A. et al.
Endothelial cells in chorionic fetal vessels of first trimester
placenta express HLA-G. Eur. J. Immunol.,
1997, vol. 27, 3380-3388 [0187]
\bulletDye, J. F. et al.
Phenotype of the Endothelium in the Human Term Placenta.
Placenta, 2001, vol. 22, 32-43
[0187]
\bulletLim, K. H. et al. Human
cytotrophoblast differentiation/invasion is abnormal in
pre-eclampsia. Am. J. Pathol., 1997,
vol. 151, 1809-1818 [0187]
\bulletYie, S. M.; Li, L. H.;
Li, Y. M.; Librach, C. HLA-G protein
concentrations in maternal serum and placental tissue are decreased
in preeclampsia. Am. J. Obstet. Gynecol., 2004, vol.
191, 525-529 [0187]
\bulletDorling, A.; Monk, N.;
Lechler, R. HLA-G inhibits the
transendothelial migration of human NK cells. Eur. J.
Immunol., 2000, vol. 30, 586-593
[0187]
\bulletForte, P. et al.
HLA-G Inhibits Rolling Adhesión of Activated Human
NK Cells on Porcine Endothelial Cells. J. Immunol.,
2001, vol. 167, 6002-6008 [0187]
\bulletRisau, W. Mechanisms of
angiogenesis. Nature, 1997, vol. 386,
671-674 [0187]
\bulletCarmeliet, P. Angiogenesis in
health and disease. Nat. Med., 2003, vol. 9,
653-660 [0187]
\bulletFolkman, J. Angiogenesis in
cáncer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat. Med.,
1995, vol. 1, 27-31 [0187]
\bulletFerrara, N.; Gerber,
H.P.; LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors.
Nat. Med., 2003, vol. 9, 669-76
[0187]
\bulletFerrara, N. Vascular
endothelial growth factor and the regulation of angiogenesis.
Recent Prog. Horm. Res., 2000, vol. 55,
15-3535-36 [0187]
\bulletMaiza, H. et al. A novel
80-kD cell surface structure identifies human
circulating lymphocytes with natural killer activity. J. Exp.
Med., 1993, vol. 178,1121 -1126 [0187]
\bulletAnumantha, A. et al.
Cloning of BY55, a novel Ig superfamily member expressed on NK
cells, CTL, and intestinal intraepithelial lymphocytes. J.
Immunol., 1998, vol. 161, 2780-2790
[0187]
\bulletBasu, S. et al. The
neurotransmitter dopamine inhibits angiogenesis induced by vascular
permeability factor/vascular endothelial growth factor. Nat.
Med., 2001, vol. 7, 569-574 [0187]
\bulletShiroishi, M. et al.
Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2
(ILT2) and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind
preferentially to HLA-G. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 2003, vol. 100, 8856-8861 [0187]
\bulletAgrawal, S. et al.
Cutting edge: MHC class I triggering by a novel cell surface ligand
costimulates proliferation of activated human T cells. J.
Immunol., 1999, vol. 162, 1223-1226
[0187]
\bulletOng, S.; Lash, G.;
Baker, P. N. Angiogenesis and placental growth in normal and
compromised pregnancies. Baillieres Best Pract. Res. Clin. Obst.
Gynaecol., 2000, vol. 14, 969-980
[0187]
\bulletLoke, Y.; King, A.
Immunology of implantaron. Baillière's Clin. Obst. Gynaecol.,
2000, vol. 14, 827-837 [0187]
\bulletFolkman, J. Angiogenesis and
apoptosis. Sem. Cancer Biol., 2003, vol.
13,159-167 [0187]
\bulletKim, Y. M. et al.
Endostatin inhibits endothelial and tumor cellular invasion by
blocking the activation and catalytic activity of matrix
metalloproteinase. Cancer Res, 2000, vol. 60,
5410-5453 [0187]
\bulletBielenberg, D. R. et al.
Semaphorin 3F, a chemorepulsant for endothelial cells, induces a
poorly vascularized, encapsulated, nonmetastatic tumor phenotype.
J. Clin. Invest., 2004, vol. 114,
1260-1271 [0187]
\bulletAshton, S. et al.
Uterine spiral artery remodeling involves endothelial apoptosis
induced by extravillous trophoblast through Fas/FasL interactions.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2005, vol. 25,
102-108 [0187]
\bulletLe Bouteiller, P. et al.
Engagement of CD160 receptor by HLA-C is a
triggering mechanism used by circulating natural killer (NK) cells
to mediate cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2002, vol. 99, 16963-16968 [0187]
\bulletBarakonyi, A. et al.
Cutting Edge: Engagement of CD160 by its HLA-C
physiological ligand triggers a unique cytokine profile secretion in
the cytotoxic peripheral blood NK cell subset. J. Immunol.,
2004, vol. 173, 5349-5354 [0187]
\bulletBensussan, A. BY55 (CD160).
Protein Review Web, 2000, vol. 1,
72-73 [0187]
\bulletCartwright, J. E.;
Whitley, G. S.; Johnstone, A. P. The expression and
release of adhesión molecules by human endothelial cell lines and
their consequent binding of lymphocytes. Exp. Cell. Res.,
1995, vol. 217, 329-335 [0187]
\bulletSolier, C. et al.
Secretion of pro-apoptotic intron
4-retaining soluble HLA-G1 by human
villous trophoblast. Eur. J. Immunol., 2002, vol. 32,
3576-3586 [0187]
\bulletFournel, S. et al.
Soluble HLA-G: purification from eucaryotic
transfected cells and detection by a specific ELISA. Am. J.
Reprod. Immunol., 1999, vol. 42, 22-29
[0187]
\bulletPlouët, J. et al.
Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor
189-amino acid form by urokinase is required for its
mitogenic effect. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272,
13390-13396 [0187]
\bulletAlian, D. S. et al.
Tetrameric complexes of human histocompatibility leukocyte antigen
(HLA)-G bind to
peripheral blood myelomonocytic cells. J. Exp. Med., 1999, vol. 189, 1149-1156 [0187]
peripheral blood myelomonocytic cells. J. Exp. Med., 1999, vol. 189, 1149-1156 [0187]
\bulletLee, N. et al. The
membrane-bound and soluble forms of
HLA-G bind identical sets of endogenous peptides but
differ with respect to TAP association. Immunity,
1995, vol. 3, 591-600 [0187]
\bulletRuggeri, B. et al.
CEP-7055: a novel, orally active pan inhibitor of
vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases with
potent antiangiogenic activity and antitumor efficacy in preclinical
models. Cancer Res., 2003, vol. 63,
5978-5991 [0187]
\bulletDash, P. R.; Cartwright,
J. E.; Baker, P. N.; Johnstone, A. P.; Whitley,
G. S. Nitric oxide protects human extravillous trophoblast cells
from apoptosis by a cyclic GMP-dependent mechanism
and independently of caspase 3 nitrosylation. Exp. Cell.
Res., 2003, vol. 287, 314-324 [0187]
<110> INSERM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Aplicaciones angiogénicas e
inmunogénicas de compuestos específicos anti-CD160
obtenibles a partir de AcM CL1-R2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FNI/MJS - BCT050223 Bensussan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgcaggatgc tgttggaacc c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> ligador tetrámero
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Claims (21)
1. Compuesto anti-CD160
seleccionado del grupo que consiste en AcM
anti-CD160 CL1-R2 obtenible a partir
del hibridoma depositado como CNCM I-3204, un
fragmento conservativo de dicho AcM CL1-R2 y un
derivado conservativo de dicho AcM CL1-R2 que
comprende al menos un fragmento de CL1-R2, en el que
dicho compuesto anti-CD160 puede competir con el
AcM anti-CD160 CL1-R2 por la unión a
CD160, y es suficientemente específico de CD160 para unirse a CD160
sin unirse a al menos CD8\alpha\beta.
2. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1, caracterizado porque además no se une a CD85j.
3. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un fragmento conservativo de
dicho AcM CL1-R2 seleccionado del grupo que consiste
en un fragmento Fab, un Fab', un F(ab)_{2}, un
F(ab')_{2} y un Fv de dicho AcM
CL1-R2.
4. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un derivado conservativo de
dicho AcM CL1-R2, que comprende al menos un
compuesto scFv que comprende al menos una región
CL1-R2 VH de CL1-R2 unida a al
menos una región CL1-R2 VL de CL1-R2
a través de un ligador peptídico (L).
5. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
4, caracterizado porque dicho derivado conservativo es un
scFv monovalente.
6. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
4, caracterizado porque dicho derivado conservativo es un
scFv multivalente.
7. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un derivado conservativo de
dicho AcM CL1-R2 que comprende un multímero de scFv
derivado de dicho AcM CL1-R2, unido a un
fragmento
Fc.
Fc.
8. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un derivado conservativo de
dicho AcM CL1-R2 que comprende al menos un fragmento
Fv de CL1-R2 unido a un Fc humano.
9. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un derivado conservativo de
dicho AcM CL1-R2 obtenible añadiendo uno o más Fab
derivados de dicho AcM CL1-R2 en el extremo
C-terminal de cada cadena H del AcM
CL1-R2 de longitud completa.
10. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un derivado conservativo de
dicho AcM CL1-R2 obtenible uniendo covalentemente
AcM CL1-R2 de longitud completa entre sí para formar
una forma de Ac agregado.
11. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 ó 2, caracterizado porque es un derivado conservativo de
dicho AcM CL1-R2 obtenible uniendo dos o más Fabs de
cabeza a cola.
12. Compuesto
anti-CD-160, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque comprende
además una inmunotoxina y/o un radioelemento.
13. Compuesto
anti-CD-160, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque es un
compuesto soluble.
14. Compuesto
anti-CD-160, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque es un
compuesto que comprende al menos un sitio de unión a CD160 y al
menos un sitio de unión a CD158b.
15. Compuesto
anti-CD-160, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque es un
compuesto agregado.
16. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
1 a 12, caracterizado porque dicho compuesto agregado
comprende al menos tres sitios de unión a CD 160 y ningún sitio de
unión a CD158b.
17. Fármaco que comprende un compuesto
anti-CD160 según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 16.
18. Compuesto anti-CD 160, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 como fármaco
anti-angiogénico.
19. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
18, caracterizado porque dicho fármaco
anti-angiogénico está destinado a su uso en la
prevención o el tratamiento de un tumor.
20. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
18, caracterizado porque dicho fármaco
anti-angiogénico está destinado a su uso en la
prevención o el tratamiento de preeclampsia o eclampsia.
21. Compuesto
anti-CD-160, según la reivindicación
18, caracterizado porque dicho fármaco
anti-angiogénico está destinado a su uso en la
prevención o el tratamiento de diabetes, y/o una enfermedad ocular
isquémica, y/o artritis reumatoide.
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