ES2346894T3 - Sistema de expresion de un promotor ramnosa. - Google Patents

Abstract

Un método para producir un anticuerpo en un huésped procariota, que comprende las etapas de: a) construcción de un vector que comprende la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa, ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo y ii) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, en donde la unidad transcripcional comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de inicio de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción constituida por la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de las proteínas de enlace periplásmicas seleccionadas del grupo constituido por LamB y MalE y, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora, b) transformación de un huésped procariota con dicho vector, c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular bajo condiciones apropiadas, d) recuperación de dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular.

Description

Sistema de expresión de un promotor ramnosa.

La presente invención se refiere a un método para producir anticuerpos en huéspedes procariotas, utilizando vectores que comprenden la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende

a) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo

b) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de proteínas de enlace periplasmáticas, en particular LamB y Ma1E, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora.

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Antecedentes de la invención

Muchos sistemas han sido descritos para la expresión heteróloga de ácidos nucleicos que codifican por ejemplo, polipéptidos tales como proteínas recombinantes en sistemas procariotas. Sin embargo, la mayoría de sistemas de expresión de genes heterólogos en sistemas procariotas huésped se han basado exclusivamente en un conjunto limitado de promotores bacterianos. La mayoría de los promotores procariotas ampliamente utilizados han incluido los promotores lactosa [lac] (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33, 103-109), y triptófano [trp] (Goeddel et al., 1980, Nature (London) 287, 411-416), y los promotores híbridos derivados de estos dos [tac y trc] (Brosius, 1984, Gene 27:161-172; Amann and Brosius, 1985, Gene 40,183-190). Otros sistemas de promotor inducible tales como el promotor inducible araB por arabinosa (WO 86 04356), el promotor ramnosa rhaSB inducible por la L-ramnosa (WO 03068956) o el promotor ramnosa rhaBAD inducible por la L-ramnosa (WO 2004/050877) han sido descritos también para la expresión heteróloga de las proteínas. WO 2004/050877 describe el uso de un promotor rhaBAD para la expresión heteróloga de nitrilasa en E. coli. Después de la inducción con L-ramnosa, se podría obtener actividad de la nitrilasa en ensayos de células en reposo. Sin embargo, en particular para la expresión de polipéptidos complejos tales como los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos es ventajoso para exportar el polipéptido del citoplasma a ubicaciones no-citoplasmáticas (secreción) utilizando secuencias señal, ya que la sobreproducción de proteínas heterólogas en el citoplasma a menudo se acompaña por el plegado incorrecto y la segregación en agregados insolubles (cuerpos de inclusión). Sin embargo, ya que la secuencia señal puede influenciar la formación de la estructura secundaria y terciaria en la región madura de los polipéptidos secretores, la elección de la secuencia señal apropiada en combinación con un promotor útil es importante para la alta producción de polipéptidos funcionales. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos para la producción de anticuerpos en sistemas de expresión procariotas.

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Resumen de la invención

La presente invención resuelve este problema proporcionando un método para producir un anticuerpo en un huésped procariota, que comprende las etapas de:

a) construcción de un vector que comprende la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo y ii) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, en donde la unidad transcripcional comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de iniciación de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción compuesta de la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de proteínas de enlace periplásmicas seleccionadas del grupo compuesto de LamB y MalE y, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora,

b) transformación de un huésped procariota con dicho vector,

c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular bajo condiciones apropiadas,

d) recuperación de dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular.

Otras ventajas serán aparentes para aquellos de habilidad en el oficio a partir de una revisión de la resultante descripción detallada, que proviene con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos, y las reivindicaciones anexas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1 muestra el plásmido pBW22-Fab-H que contiene el promotor inducible por L-ramnosa (PrhaBAD), secuencias que codifican por las secuencias señal ligadas operablemente a la cadena ligera (ompA-VL3-CL) y la cadena pesada (phoA-VH-CH) de un fragmento Fab, y una región de terminación de la transcripción (rrnB).

Fig. 2 muestra el plásmido pBLL15 que contiene un promotor inducible por melibiosa (PmelAB2), secuencias que codifican por secuencias señal ligadas operablemente a la cadena ligera (ompA-VL3-CL) y la cadena pesada (phoA- VH-CH) de un fragmento Fab, y una región de terminación de la transcripción (rrnB).

Fig. 3 muestra los resultados del ensayo dot blot (con cadena ligera anti-humana para detectar Fab, peroxidasa alcalina conjugada) de extractos de lisozima de las cepas W3110 no inducidas (-) e inducidas (+) con los diferentes plásmidos de expresión. Los intervalos de tiempo se indican.

Fig. 4 muestra el plásmido pAKL14 que contiene el promotor inducible por L-ramnosa (PrhaBAD) y los genes Fab-H con las secuencias señal alteradas.

Fig. 5 muestra el ensayo dot blot de extractos de lisozima de cepa W3110 (pAKL14) inducida por L-ramnosa y no inducida (-). El tiempo cuando las muestras fueron tomadas se indica (con cadena ligera anti-humana para detectar Fab, peroxidasa alcalina conjugada).

Fig. 6 muestra el ensayo Western blot de extractos de lisozima de cepa W3110 inducida por L-ramnosa (pAKL14). El tiempo después de la inducción, cuando las muestras fueron tomadas se indica (con cadena ligera anti-humana para detectar Fab, peroxidasa alcalina conjugada). Senda 1: Estándar (1.28 \mug); senda 2: W3110 (pAKL14), ind., 3 h; senda 3: W3110 (pAKL14), ind., 5 h; senda 4: W3110 (pAKL14), ind., 7 h; senda 5: W3110 (pAKL14), ind., 12 h; senda 6: W3110 (pAKL14), ind., 23 h; senda 7: W3110 (pAKL14), no ind., 23 h.

Fig. 7 muestra SDS-PAGE de extractos de lisozima de diferentes cepas W3110 con altas concentraciones del anticuerpo Fab-H. Las cepas que producen la cadena ligera y pesada sin secuencias señal se utilizan como una referencia negativa (senda 1: Marcador; senda 2: W3110 (pMx9-HuCAL-Fab-H); senda 3: W3110 (pBW22-Fab-H); senda 4: W3110 (pBLL1 5), senda 5: W3110 (pAYL14); senda 6: Estándar (2 \mug)).

Fig. 8 muestra el plásmido pAKL15E que contiene el promotor inducible por melibiosa (PmelAB2) y los genes Fab-H con secuencias señal alteradas.

Fig. 9 muestra SDS-PAGE de extractos de lisozima de la cepa W3110 (pAKL15E) en la presencia o ausencia de la melobiasa inductora. La posición de la cadena ligera y pesada se indica (senda 1: Marcador; senda 2: W3110 (pAKL15E), no inducida; senda 3: W3110 (pAKL15E), inducida).

Fig. 10 muestra el plásmido pBW22-pelB-S1 que comprende el promotor inducible por L-ramnosa rhaBAD, una secuencia que codifica para un péptido señal PelB ligado operablemente a una secuencia que codifica para un anticuerpo de cadena sencilla (scFv, S1), y una región de terminación de la transcripción (rrnnB).

Fig. 11 muestra SDS-PAGE para extractos crudos de cepa W3110 no inducida (-) e inducida (+) (pBW22-pelB-S1). Las muestras fueron tomadas después de diferentes intervalos de tiempo como se indica. Se analizaron las fracciones de la proteína soluble e insoluble después del tratamiento de lisozima. Una flecha indica la proteína scFv. M = Mark12, estándar de peso molecular de Invitrogen.

Fig. 12 muestra el plásmido pJOE4782 de rango de huésped amplio que comprende el promotor inducible por L-ramnosa rhaBAD en combinación con los genes de las proteínas reguladoras RhaS y RhaR del operón L-ramnosa de Escherichia coli. El plásmido pJOE4782 además contiene una secuencia que codifica para un péptido señal MalE ligado operablemente a una secuencia que codifica para la proteína indicadora GFP.

Fig. 13 muestra el plásmido pAKLP2 que comprende el promotor inducible por L-ramnosa rhaBAD y una secuencia (nitA) que codifica para una proteína Nitrilasa.

Fig. 14 muestra un SDS-PAGE de células de la cepa KT2440 de Pseudomonas putida inducida (pAKLP2). Las muestras fueron tomadas después de diferentes intervalos de tiempo como se indica. Una flecha indica la proteína Nitrilasa. M = Mark12, estándar de peso molecular de Invitrogen.

Fig. 15 muestra el plásmido pAKLP1 que comprende el promotor inducible por L-ramnosa rhaBAD y las secuencias que codifican por las cadenas pesadas y ligeras de Fab-M, que se ligan operablemente a una secuencia que codifica para el péptido señal OmpA y una secuencia que codifica para el péptido señal PhoA, respectivamente.

Fig. 16 muestra SDS-PAGE de células de la cepa Pseudonionas putida inducida KT2440 (pAKLP1). Las muestras fueron tomadas después de diferentes intervalos de tiempo como se indica. Las flechas indican las cadenas pesadas y ligeras FabM. M = Mark12, estándar de peso molecular de Invitrogen.

Fig. 17 muestra SDS-PAGE de fermentación muestras de la cepa de Escherichia coli W3110 (pBW22-pelB-S1). Las muestras fueron tomadas después de diferentes intervalos de tiempo (en horas) como se indica. Una flecha indica la proteína scFv. M = Mark12, estándar de peso molecular de Invitrogen.

Descripción detallada de la invención

Como se utiliza en este documento, las siguientes definiciones se suministran con el fin de facilitar el entendimiento de la presente invención.

Un "vector expresable en un huésped" o "vector de expresión" es una construcción de ácido polinucleico, generada recombinante o sintéticamente, con una serie de elementos específicos del ácido polinucleico que permiten la transcripción de una secuencia de ácido nucleico particular en una célula huésped. Por lo general, este vector incluye una unidad transcripcional que comprende una secuencia de ácido nucleico particular que se transcribe ligada operablemente a un promotor. Un vector expresable en un huésped puede ser por ejemplo un plásmido autónomo o de auto replicación, un cósmido, un fago, un virus o un retrovirus.

Los términos "huésped", "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se utilizan intercambiablemente en este documento para indicar una célula procariota en la cual uno o más vectores o secuencias aislados y purificados del ácido nucleico de la invención han sido introducidos. Se entiende que tales términos se refieren no solo a la célula sujeto particular sino también a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a ya sea influencias de mutación o ambientales, tal progenie no puede, de hecho, ser idéntica a la célula madre, pero aún se incluyen dentro del alcance del término como se utiliza en este documento.

El término "comprende" se utiliza generalmente en el sentido de incluir, que es para decir que permite la presencia de una o más características o componentes.

"Promotor" como se utiliza en este documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una unidad transcripcional. Una "región promotora" es una región reguladora capaz de unir la ARN polimerasa en una célula y la iniciación de la transcripción de una secuencia codificante secuencia abajo (dirección 3'). Dentro de la región promotora se encontrará un sitio de iniciación de transcripción (convenientemente definida mediante mapeo con nucleasa S1), así como los dominios de enlace de la proteína (secuencias consenso) responsables para el enlace de ARN polimerasa tal como la región putativa -35 y la caja Pribnow.

"Operón L-ramnosa" se refiere al operón rhaSR-rhaBAD como se describe para la E. coli en Holcroft and Egan, 2000, J. Bacteriol. 182 (23), 6774-6782. El operón rhaBAD es un operón catabólico regulado positivamente que transcribe RhaB, RhaA y RhaD divergente del otro operón rha, rhaSR, con aproximadamente 240 bp de ADN que separa sus sitios de inicio de transcripción respectivo. El operón rhaSR codifica los dos activadores específicos de la L-ramnosa RhaS y RhaR. RhaR regula la transcripción de rhaSR, mientras que RhaS une en ADN en dirección 5' en -32 a -81 relativo al sitio de inicio de la transcripción de rhaBAD. Adicionalmente el operón intergénico rhaSR-rhaBAD contiene sitios de enlace de CRP en las posiciones -92,5 (CRP 1) relativo al sitio de inicio de la transcripción de rhaBAD y sitios de enlace de CRP en las posiciones -92,5 (CRP 2), -115,5 (CRP 3) y 116,5 (CRP 4) relativo al sitio de inicio de la transcripción de rhaSR así como un sitio de enlace por RhaR que abarca -32 a -82 relativo al sitio de inicio de la transcripción de rhaSR.

Con "región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa" se entiende el operón rhaBAD que consiste esencialmente del sitio de iniciación de transcripción rhaBAD, la región -35 putativa, la caja Pribnow, el sitio de enlace de CRP, CPR1, el sitio de enlace para RhaS relativo al sitio de inicio de la transcripción de rhaBAD así como los sitios de enlace de CRP, CRP 2-4 y el sitio de enlace para RhaR relativo al sitio de inicio de la transcripción de rhaSR. Con "promotor rhaBAD" se entiende el promotor del operón rhaBAD que consiste esencialmente del sitio de iniciación de transcripción rhaBAD, la región -35 putativa, la caja Pribnow, el sitio de enlace para RhaS y el sitio de enlace CRP1 región relativa al sitio de inicio de la transcripción de rhaBAD, y el sitio de enlace de CRP CRP4 o una parte de este, relativa al sitio de inicio de la transcripción de rhaSR.

"CRP" significa "Proteína reguladora del catabolito". "CRP" por lo general se refieren en el oficio como "proteína receptor de AMP cíclica", que tiene el significado comparable. CRP es una proteína reguladora controlada por AMP cíclica (cAMP) que media la activación de los operones catabólicos tales como el operón L-ramnosa.

Un "potenciador" es una secuencia de ácido nucleico que actúa para potenciar la transcripción de una unidad transcripcional independiente de la identidad de la unidad transcripcional, la posición de la secuencia en relación con la unidad transcripcional, o la orientación de la secuencia. Los vectores de la presente invención opcionalmente incluyen potenciadores.

"Unidad transcripcional" como se utiliza en este documento se refiere a una secuencia de ácido nucleico que normalmente se transcribe en una molécula de ARN sencilla. La unidad transcripcional puede contener un gen (monocistronico) o dos (dicistronico) o más genes (policistronico) que codifican para moléculas de polipéptido funcionalmente relacionadas.

Una secuencia de ácido nucleico se "liga operablemente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una secuencia señal se liga operablemente al ADN para una proteína, si se expresa como una preproteína que participa en la secreción de la proteína; un promotor se liga operablemente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o una región de iniciación de traducción tal como un sitio de enlace de ribosoma se liga operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica por ejemplo, un polipéptido si se coloca de modo que se facilite la traducción del polipéptido. La unión se puede lograr mediante el enlace en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los ligadores o adaptadores de oligonucleotidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional.

"Ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" o " ácidos nucleicos o secuencias de ácido nucleico aislados y purificados" como se refieren en la presente invención pueden ser ADN, ARN, o híbrido de ADN/ARN. En caso de que el ácido nucleico o la secuencia de ácido nucleico se localicen en un vector es usualmente ADN. El ADN del que se hace referencia en este documento puede ser cualquier secuencia de polidesoxinucleótido, incluyendo, por ejemplo ADN bicatenario, ADN monocatenario, ADN bicatenario en donde una o ambas hebras se componen de dos o más fragmentos, ADN bicatenario en donde una o ambas hebras tienen un esqueleto fosfodiester no interrumpido, ADN que contiene una o más porciones de cadena sencilla y una o más porciones de cadena doble, ADN bicatenario en donde las hebras de ADN son completamente complementarias, ADN bicatenario en donde las hebras de ADN son solo parcialmente complementarias, ADN circular, ADN covalentemente cerrado, ADN lineal, ADN covalentemente ligado en cruz, ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN semi-sintético, ADN biosintético, ADN aislado naturalmente, ADN digerido de enzima, ADN de cizallamiento, ADN marcado, tal como ADN radiomarcado y ADN fluorocromo-marcado, ADN que contiene una o más especies de ácido nucleico que no ocurren naturalmente. Las secuencias de ADN se pueden sintetizar mediante técnicas estándar de química, Por ejemplo, el método fosfotriéster o vía métodos de síntesis automatizados y métodos de PCR. La secuencia purificada y aislada de ADN también se puede producir por técnicas enzimáticas.

El ARN del que se hace referencia en este documento puede ser por ejemplo ARN bicatenario, ARNc, ARN bicatenario, ARN bicatenario en donde una o ambas hebras se componen de dos o más fragmentos, ARN bicatenario en donde una o ambas hebras tienen un esqueleto fosfodiester no interrumpido, ARN que contiene una o más porciones de cadena sencilla y una o más porciones de cadena doble, ARN bicatenario en donde las hebras del ARN son completamente complementarias, ARN bicatenario en donde las hebras de ARN son solo parcialmente complementarias, ARN covalentemente ligado en cruz, ARN digerido de enzimas, ARN de cizallamiento, ARNm, ARN sintetizado químicamente, ARN semi-sintético, ARN biosintético, ARN aislado naturalmente, ARN marcado, tal como ARN radiomarcado y ARN fluorocromo marcado, ARN que contiene una o más especies de ácido nucleico que no ocurren naturalmente.

Con "variantes" o "variantes de una secuencia" se entiende una secuencia de ácido nucleico que varía de la secuencia referencia mediante sustituciones conservadoras de ácido nucleico, por lo cual uno o más ácidos nucleicos se sustituyen por otros con las mismas características. Las variantes abarcan tanto las secuencias degeneradas, secuencias con deleciones e inserciones, siempre y cuando tales secuencias modificadas muestren la misma función (funcionalmente equivalente) como la secuencia referencia.

Como se utiliza en este documento, los términos "polipéptido", "péptido", "proteína", "polipeptídico" y "peptídico" se utilizan intercambiablemente para designar una serie de residuos de aminoácido conectados al otro por enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de residuos adyacentes.

El término "secuencia aislada y purificada del ácido nucleico" se refiere al estado en el cual la secuencia de ácido nucleico será, de acuerdo con la presente invención. La secuencia de ácido nucleico será libre o sustancialmente libre de material con el cual se asocia naturalmente, tal como otros ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se preparan (por ejemplo cultivo celular) cuando dicha preparación es por tecnología recombinante realizada in vitro o in vivo.

Los términos "transformación", "transformado" o "introducción de un ácido nucleico en una célula huésped" indican cualquier proceso en donde un ácido nucleico extracelular como un vector, con o sin material de acompañamiento, entra a una célula huésped. El término "transformado de célula" o "célula transformada" significa la célula o su progenie, en la cual el ácido nucleico extracelular ha sido introducido y de esta manera hospeda el ácido nucleico extracelular. El ácido nucleico puede ser introducido en la célula de tal manera que el ácido nucleico sea replicable, ya sea como un integrante cromosomal o como un elemento cromosomal extra. La transformación de células huésped apropiadas con por ejemplo un vector de expresión se puede lograr por métodos bien conocidos tales como microinyección, electroporación, bombardeo de partículas o por métodos químicos tales como transformación mediada por el fosfato de calcio, descritos por ejemplo en Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory o en Ausubel et al. 1994, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons.

La "secuencia de ácido nucleico heteróloga" o "secuencia heteróloga de ácido nucleico a un huésped" significa una secuencia de ácido nucleico que codifica por ejemplo, un producto de expresión tal como un polipéptido que es extraño al huésped ("expresión heteróloga" o "producto heterólogo") i. e. una secuencia de ácido nucleico, que se origina de un donante diferente del huésped o una secuencia de ácido nucleico sintetizada químicamente que codifica por ejemplo, un producto de expresión tal como un polipéptido que es extraño al huésped. En caso de que el huésped sea una especie procariota particular, la secuencia heteróloga del ácido nucleico preferiblemente se origina a partir de un género o familia diferente, más preferido de un orden o clase diferente, en particular a partir de un subgrupo diferente (división) y más particularmente a partir de un dominio diferente (imperio) de organismos.

La secuencia heteróloga del ácido nucleico que se origina a partir de un donante diferente a partir del huésped se puede modificar, antes de que se introduzca en una célula huésped, mediante mutaciones, inserciones, deleciones o sustituciones de ácidos nucleicos sencillos o una parte de la secuencia heteróloga del ácido nucleico, siempre y cuando tales secuencias modificadas muestren la misma función (funcionalmente equivalente) como la secuencia referencia. Una secuencia heteróloga del ácido nucleico de la que se ha referencia en este documento abarca tanto las secuencias nucleicas que se originan de un dominio diferente (imperio) de organismos tales como a partir de eucariotas (de origen eucariota) tales como por ejemplo anticuerpos humanos que han sido utilizado en bibliotecas de expresión en fago y de cuales ácidos nucleicos sencillos como una parte de la secuencias del ácido nucleico que han sido modificadas de acuerdo con el "uso del codón" de un huésped procariota.

La "secuencia señal" o "secuencia del péptido señal" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de amoniácido pequeña (i.e., péptido señal) presente en el terminal NH_{2} de ciertas proteínas que normalmente se exportan por las células a ubicaciones no-citoplasmáticas (por ejemplo, secreción) o que son componentes de la membrana. Los péptidos señal dirigen el transporte de proteínas a partir del citoplasma a ubicaciones no-citoplasmáticas.

La "región de iniciación de la traducción" es una región señal que promueve el inicio de la traducción y que funciona como el sitio de enlace del ribosoma tal como la secuencia Shine Dalgarno.

La "región de terminación de la transcripción" se refiere a una secuencia que causa que la ARN polimerasa termine la transcripción. La región de terminación de la transcripción, usualmente es parte de una unidad transcripcional y aumenta la estabilidad del ARNm.

El "anticuerpo" se refiere a una clase de proteínas plasmáticas producidas por las células-B del sistema inmune después de la estimulación por un antígeno. Los anticuerpos de mamífero (i.e. Humano) son inmunoglobulinas de la clase Ig G, M, A, E o D. El término "anticuerpo" como se utiliza para los propósitos de esta invención incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos anti-idiotípicos y auto-anticuerpos presentes en enfermedades autoinmunes, tales como diabetes, esclerosis múltiples y artritis reumatoide así como anticuerpos quiméricos. Se conoce que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "liviana" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción terminal amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principales responsables del reconocimiento del antígeno. La porción terminal carboxi de cada cadena define una región constante ante todo responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican tanto como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos.

El término anticuerpo se utiliza en el sentido de anticuerpos completos y fragmentos de enlace de estos. Los fragmentos de enlace incluyen fragmentos de cadena sencilla, fragmentos Fv y fragmentos Fab.

El término "anticuerpo de cadena sencilla" incluye tales formatos de anticuerpo no-natural que combinan solo las regiones de enlace de antígenos de anticuerpos sobre una sola cadena polipeptídica plegada de forma estable. Como tales, los anticuerpos de cadena sencilla son de tamaño considerablemente más pequeño que las inmunoglobulinas clásicas pero retienen las propiedades de enlace específicas del antígeno de los anticuerpos. Los anticuerpos de cadena sencilla se utilizan ampliamente para una variedad de diferentes aplicaciones, incluyendo, como por ejemplo herramientas terapéuticas, de diagnóstico, de investigación etc.

El término fragmento Fab, algunas veces se utiliza en el oficio en el sentido del fragmento de enlace que resulta de la conversión de la papaína de un anticuerpo intacto. Los términos Fab' y F(ab')2, algunas veces se utilizan en el oficio para referirse a los fragmentos de enlace de anticuerpos intactos generados por la conversión de la pepsina. En el contexto de la presente invención, Fab se utiliza para referirse genéricamente a los fragmentos de enlace de cadena doble de anticuerpos intactos que tienen al menos sustancialmente dominios variables completos de cadena ligera y pesada suficiente para enlaces específicos de antígeno, y partes de las regiones constantes de cadena ligera y pesada suficientes para mantener la asociación de las cadenas ligeras y pesadas. Un ejemplo de este Fab se describe en Skerra et al., 1988, Science 240(4855), 1038-41, por ejemplo. Un fragmento Fab por ejemplo del idiotipo IgG puede o no contener al menos uno de los dos residuos de cisteina que forman los dos enlaces disulfuro inter-cadena entre las dos cadenas pesadas en la inmunoglobulina intacta. Por lo general, los fragmentos Fab se forman por complejos de una cadena liviana de longitud completa o sustancialmente de longitud completa con una cadena pesada que comprende el dominio variable y al menos el dominio CH1 de la región constante. Además, la cisteina del terminal C en la cadena liviana se puede reemplazar con una serina u otro aminoácido para eliminar el enlace disulfuro intercadena entre las cadenas pesadas y ligeras de acuerdo con la presente invención.

Además se abarcan los anticuerpos quiméricos que son anticuerpos cuyos genes de cadena ligera y pesada han sido construidos, por lo general mediante ingeniería genética, a partir de segmentos de gen de inmunoglobulina (por ejemplo, segmentos que codifican la región variable y los segmentos que codifican la región constante), por ejemplo, que pertenece a diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón se pueden unir a segmentos constantes (C) humanos, tales como IgG1 e IgG4. Un anticuerpo quimérico típico es de esta manera una proteína híbrido compuesta del dominio de enlace de antígeno o V a partir de un anticuerpo de ratón y un dominio C o efector de un anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos tienen la misma especificidad y afinidad de enlace o similar como un ratón u otro anticuerpo no-humano que proporciona las regiones variables del anticuerpo.

El término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana incluyendo ya sea maduración de afinidad de diseño, natural o artificial. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis específicas de sitio o aleatorias in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ratón, han sido injertadas en secuencias de marco humano (i. e. anticuerpos humanizados). Las variantes funcionales de tales "anticuerpos humanos", por ejemplo versiones truncadas de estos o muteinas de diseño donde por ejemplo, residuos individuales de prolina o cisteina han sido diseñados por medio de la ingeniería genética bien conocida en el oficio se abarcan por el término, en contraste. Ejemplos de estos, se pueden encontrar por ejemplo en WO 98/02462. Sin embargo, el término solo se relaciona con la secuencia de aminoácido de dicho anticuerpo, con independencia de cualquier glicosilación u otra modificación química del esqueleto peptídico.

El vector utilizado en el método de acuerdo con la invención es preferiblemente un plásmido autonómico o de auto-replicación, un cósmido, un fago, un virus o un retrovirus. Una amplia variedad de combinaciones huésped/vector se pueden emplear en la expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas del anticuerpo. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir de segmentos de secuencias de ácido nucleico cromosomal, no-cromosomal y/o sintético. Los vectores apropiados incluyen vectores con rango de huésped específico tales como vectores específicos para por ejemplo E. coli, así como vectores con un amplio rango de huésped tal como vectores útiles para bacteria Gram-negativa. Los plásmidos "Baja copia", "media-copia" así como "alta copia" se pueden utilizar.

Los vectores útiles para por ejemplo, la expresión en E. coli son: pQE70, pQE60 y pQE-9 (QIAGEN,Inc. ); pBluescript Vektoren, Phagescript Vektoren, pNH8A,pNH16a,pNH 18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc.); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Bio-tech, Inc. ); pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pACYC177, pACYC184, pRSF1010 y pBW22 (Wilms et al., 2001, Biotechnology y Bioengineering, 73 (2) 95-103) o derivados de estos, tales como plásmido pBW22-Fab-H o plásmido pAKL14. Otros plásmidos útiles son bien conocidos por alguien de habilidad en el oficio y se describen por ejemplo en "Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

Los vectores preferidos que se utilizan en el método de la presente invención son plásmidos autonómicos o de auto-replicación, son más preferidos los vectores con rango de huésped específico, por ejemplo tal como vectores específicos para E. coli.

Más preferidos son pBR322, pUC18, pACYC177, pACYC184, pRSF1010 y pBW22 o derivados de estos tales como pBW22-Fab-H o pAKL14, en particular pBW22-Fab-H o pAKL14, más particularmente pAKL14.

En una modalidad preferida, la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa es el promotor rhaBAD. En una modalidad preferida particularmente, el promotor rhaBAD consiste de la secuencia SEQ ID NO.1, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta. Preferiblemente la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa, el promotor rhaBAD y el promotor rhaBAD compuesto de la secuencia SEQ ID NO.1, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta son del operón L-ramnosa de E. coli.

En otra modalidad preferida de la invención, el vector expresable en un huésped procariota comprende una parte de la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa ligado operablemente a una unidad transcripcional, adicionalmente, las secuencias que codifican los activadores específicos de la L-ramnosa RhaS y RhaR, incluyendo sus respectivas secuencias del promotor nativo. En la expresión las proteínas RhaS y RhaR controlan la actividad del promotor rhaBAD.

Como péptidos señal de la secuencia señal procariota de las proteínas de enlace periplasmáticas para azúcares, aminoácidos, vitaminas e iones, tales como PelB (Erwinia chrysantemi, precursor de Pectato liasa), PelB (Erwinia carotovora, precursor de Pectato liasa), PelB (Xanthomonas campestris, precursor de Pectato liasa), LamB (E. coli, precursor de Maltoporina), MalE (E. coli, precursor de la proteína de enlace de la Maltosa), Bla (E. coli, Beta-lactamasa), OppA (E. coli, proteína de enlace del oligopéptido periplásmico), TreA (E. coli, precursor de trehalasa periplásmica), MppA (E. coli, precursor de la proteína de enlace del péptido mureina periplásmica), BglX (E. coli, precursor de la beta-glucosidasa periplásmica), ArgT (E. coli, precursor de la proteína periplásmica de enlace lisina-arginina-ornitina), MalS (E. coli, precursor de alfa-amilasa), HisJ (E. coli, precursor de la proteína periplásmica enlace Histidina), XylF (E. coli, D-Xilosa-enlace precursor de la proteína periplásmica), FecB (E. coli, precursor de la proteína periplásmica enlace dicitrato), OmpA (E. coli, precursor de la proteína A membrana exterior) y PhoA (E. coli, precursor de la fosfatasa alcalina) se pueden utilizar.

De acuerdo con la invención, la secuencia señal se selecciona de los péptidos señal LamB de E. coli (precursor de la maltoporina) y MalE (precursor de la proteína de enlace de la Maltosa).

En caso de que una unidad transcripcional dicistronica o policistronica se utilice, se pueden aplicar secuencias señal diferentes o idénticas ligadas operablemente a cada uno de los cistrones. Preferiblemente diferentes secuencias señal se utilizan en el citado caso.

Las secuencias señal que se emplean en los vectores de expresión de la presente invención se pueden obtener comercialmente o sintetizar químicamente. Por ejemplo, las secuencias señal se pueden sintetizar de acuerdo con el método triester fosforamidita de fase sólida descrito, por ejemplo, en Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981), utilizando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). La purificación de los oligonucleótidos se puede llevar a cabo ya sea mediante electroforesis en gel de acrilamida nativa o por HPLC de intercambio aniónico, como se describe en Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983).

De acuerdo con la presente invención, la unidad transcripcional además comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5', del punto de iniciación de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción se compone de la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico. La secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2) usualmente se localiza en dirección 5' directamente adyacente al punto de iniciación de la traducción de la unidad transcripcional que puede ser ATG, GTG o TTG.

Por lo general, dicha unidad transcripcional además comprende una región de terminación de la transcripción seleccionada de rrnB, ARN I, T7Te, rrnB T1, trp a L126, trp a, tR2, T3Te, P14, tonB t, y trp a L153. Preferiblemente, se utiliza la secuencia terminadora transcripcional rrnB.

La secuencia heteróloga del ácido nucleico, utilizada de acuerdo con la presente invención codifica un producto de expresión que es extraño al huésped.

La secuencia heteróloga del ácido nucleico, se puede modificar de acuerdo con el "uso del codón" del huésped.

De acuerdo con la presente invención la secuencia heteróloga del ácido nucleico codifica un anticuerpo y más preferiblemente un fragmento Fab. En particular un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más particularmente un fragmento Fab humano se codifica por la secuencia de ácido nucleico. El fragmento Fab humano codificado por la secuencia de ácido nucleico es preferiblemente tanto un fragmento de anticuerpo humano como un fragmento de anticuerpo humano que fue injertado con al menos una CDR a partir de otras especies de mamíferos.

En una modalidad más preferida, el fragmento Fab humano es un HuCAL-Fab completamente humano, según se obtiene de una biblioteca de fago de anticuerpo humano basada en el marco de consenso, artificial, que fue asignada al azar artificialmente en el CDR como se describe por Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296 (1), 57-86.

En otra modalidad opcional más preferida, el fragmento Fab humano, injertado en CDR, opcionalmente quimérico, es un no-HuCAL-Fab en contraposición a la definición anterior de HuCAL-Fab, que en el caso de un fragmento Fab completamente humano preferiblemente significa que no comparte el marco de secuencia de consenso HuCAL pero sus porciones de secuencia no-CDR son al menos 70% más preferiblemente 85%, más preferiblemente 95% idénticas en la secuencia de aminoácido a las respectivas secuencias gennline-codificadas de cadenas ligeras y pesadas variables y constantes, adicionalmente y más preferiblemente que sus CDRs se obtienen directamente a partir de secuencias genómicas que ocurren naturalmente de células linfoides incluyendo eventos de maduración de afinidad genómica.

El fragmento Fab preferiblemente se deriva de un anticuerpo IgG y no contiene residuos de cisteina que forman los dos enlaces disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas en la inmunoglobulina intacta. En particular, la cadena pesada y la ligera del anticuerpo o preferiblemente del fragmento Fab, se codifican por una unidad transcripcional dicistrónica, mientras que cada cadena se liga operablemente a una secuencia señal procariota seleccionada de péptidos señal de proteínas de enlace periplasmáticos por azúcares, aminoácidos, vitaminas e iones y una región idéntica de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de iniciación de la traducción de la unidad transcripcional. Preferiblemente, la región de iniciación de traducción consiste de la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2).

El orden y la distancia en la cual la secuencia señal y la secuencia heteróloga del ácido nucleico se organizan dentro de los vectores de expresión se pueden variar. En modalidades preferidas, la secuencia señal es 5' (en dirección 5') a la secuencia del ácido nucleico que codifica por ejemplo, el anticuerpo. La secuencia del péptido señal y la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se pueden separar por cero a aproximadamente 1000 aminoácidos. En modalidades preferidas, la secuencia del péptido señal y la secuencia del ácido nucleico que codifica el anticuerpo son directamente adyacentes la una a la otra, i.e. se separan por cero ácidos nucleicos.

Preferiblemente, la región del promotor rhaBAD y la unidad transcripcional ligada operablemente del vector utilizado en el método de la presente invención consiste de la secuencia SEQ ID NO. 3, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

Más preferiblemente, la región del promotor rhaBAD y la unidad transcripcional ligada operablemente del vector utilizado en el método de la presente invención consiste de la secuencia SEQ ID NO. 4, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

La expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede regular por la cantidad de L-ramnosa disponible para el huésped procariota. Por lo general, la cantidad de L-ramnosa en los medios del huésped procariota cultivado es entre 0.01 y 100 g/l preferiblemente entre 0.1 y 10 g/l, más preferiblemente entre 1 y 5 g/l.

De acuerdo con la invención, la secuencia heteróloga del ácido nucleico codificada para un anticuerpo y más preferiblemente para un fragmento Fab, mientras que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo o el fragmento Fab se expresan en cantidades iguales, conduciendo de esta manera, a altas concentraciones de anticuerpo funcional o fragmento Fab. En particular un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado más particular un fragmento Fab humano, más particularmente un fragmento Fab humano como se describe anteriormente se codifica por la secuencia heteróloga del ácido nucleico. Con el fin de obtener altas concentraciones de anticuerpo funcional o fragmento Fab, es esencial tener una cantidad igual de las cadenas pesadas y ligeras que se expresan. En el caso de que una de ambas cadenas se sobre produzca en comparación con la otra cadena, los agregados inmunoreactivos de alto peso molecular no-reducibles se pueden construir, lo cual es indeseable. Se ha encontrado sorprendentemente que utilizando el método de la presente invención altos títulos de anticuerpos funcionales se pueden obtener mientras que solo muy bajas cantidades de cadenas livianas o pesadas sobre producidas o agregados inmunoreactivos de alto peso molecular se construyen. Por lo general, menos del 20%, preferiblemente menos del 10% de la cantidad expresada del anticuerpo o fragmento Fab se expresan como cadenas livianas o pesadas sobre producidas o agregados inmunoreactivos de alto peso molecular. La cantidad de las cadenas pesadas y ligeras sobre producidas y los agregados inmunoreactivos de alto peso molecular se pueden medir mediante el análisis de extractos del huésped, que expresa el anticuerpo o el fragmento Fab tal como extractos de lisozima de la célula huésped cultivada utilizando SDS-PAGE o Western
blot.

La secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo que se utiliza en el método de esta invención se puede aislar de acuerdo con protocolos de PCR estándar y métodos bien conocidos en el oficio. Dicha secuencia purificada y aislada de ADN además puede comprender una o más secuencias reguladoras, como se conoce en el oficio por ejemplo un potenciador, usualmente empleado para la expresión del producto codificado por la secuencia de ácido
nucleico.

Con el fin de seleccionar las células huésped con éxito y transformarlas de forma estable con el vector o la secuencia aislada y purificada de un ácido nucleico de un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, resistencia a los antibióticos) se pueden introducir en las células huésped junto con la secuencia de ácido nucleico de interés. El gen que codifica un marcador de selección se puede localizar en el vector o en la secuencia aislada y purificada de un ácido nucleico o se puede opcionalmente co-introducir de forma separada por ejemplo en un vector separado. Varios marcadores de selección se pueden utilizar incluyendo aquellos que confieren resistencia a los antibióticos, tales como higromicina, ampicilina y tetraciclina. La cantidad del antibiótico se puede adaptar como se desee con el fin de crear condiciones selectivas. Por lo general, se utiliza un marcador de selección. También genes indicadores tales como proteínas fluorescentes se pueden introducir en las células huésped junto con la secuencia de ácido nucleico de interés, con el fin de determinar la eficiencia de la transformación.

Una amplia variedad de células huésped procariotas, se puede utilizar para la expresión heteróloga de las secuencias de ácido nucleico. Estos huéspedes pueden incluir cepas de células Gram-negativas tales como E. coli y Pseudomonas, o células Gram positivas tales como Bacillus y Streptomyces. Preferiblemente, la célula huésped es una célula Gram-negativa, más preferiblemente una célula E. coli. La E. coli que se puede utilizar es por ejemplo, las cepas TG1, W3110, DH1, XL1-Blue y Origami, que son comercialmente disponibles o se pueden obtener vía el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany). Más preferiblemente, se utiliza W3110. La célula huésped puede o no metabolizar L-ramnosa. Una célula huésped que es normalmente capaz de absorber y metabolizar L-ramnosa como la E. coli se puede modificar para que sea deficiente en una o más funciones relacionadas con la absorción y/o metabolismo de L-ramnosa. La deficiencia de una o más funciones relacionadas con la absorción y/o metabolismo de L-ramnosa se puede lograr, por ejemplo mediante la supresión o bloqueo de la expresión de un gen codificado por una proteína relacionada con la absorción y/o metabolismo de L-ramnosa tal como el gen rhaB codificado por L-ramnulosa quinasa. Esto se puede hacer mediante técnicas conocidas tales como mutagénesis basada en el uso de transposón o mutación knock-out. Por lo general, el huésped procariota corresponde a las secuencias señal elegidas, por ejemplo en el caso que secuencias señal de E. coli se utilicen, la célula huésped es usualmente un miembro de la misma familia de la enterobacterias, más preferiblemente la célula huésped es una cepa E. coli.

Como sistema de cultivo celular de cultivo continuo o discontinuo tales como cultivo en lote o cultivo en lote de alimentación se pueden aplicar en tubos de cultivo, matraces oscilantes o fermentadores bacterianos. Las células huésped usualmente se cultivan en medios convencionales como se conoce en el oficio tales como medios complejos como "medios nutrientes de caldo de levadura" o un medio que contiene glicerol como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65 o un medio de sal mineral como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1. El medio preferido para llevar a cabo la expresión de dicho polipéptido es un medio que contiene glicerol, más preferiblemente el medio descrito por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65.

El medio se puede modificar como apropiado por ejemplo, adicionando otros ingredientes tales como soluciones reguladoras, sales, vitaminas o aminoácidos. También diferentes medios o combinaciones de medios se pueden utilizar durante el cultivo de las células. Preferiblemente, los medios utilizados como medios básicos no deberían incluir L-ramnosa, con el fin de lograr una regulación ajustada del promotor de la región de L-ramnosa. La L-ramnosa usualmente se adiciona después de que el cultivo ha logrado un OD_{600} apropiado dependiendo del sistema de cultivo. Por lo general, la cantidad de L-ramnosa en los medios del huésped procariota cultivado está entre 0.01 y 100 g/l, preferiblemente entre 0.1 y 10 g/l, más preferiblemente 1 y 5 g/l. Para el cultivo en lote el OD_{600} usual es usualmente 0.4 o más. Los rangos de pH apropiados son por ejemplo 6 - 8 preferiblemente 7 -7.5, temperaturas de cultivo apropiadas están entre 10 y 40, preferiblemente entre 20 y 37ºC. Las células se incuban usualmente siempre y cuando hasta que la máxima cantidad de producto expresado se ha acumulado, preferiblemente entre 1 hora y 20 días, más preferiblemente entre 5 horas y 3 días. La cantidad de producto expresado depende del sistema de cultivo utilizado. En el cultivo de matraz oscilante usualmente el producto expresado en la cantidad de 0.5 g/l de medio de cultivo se puede producir con un huésped transformado con el vector de la presente invención. Utilizando un cultivo de fermentador en un modo de lote y/o lote de alimentación producto expresado en la cantidad de usualmente más del 0.5 g/l caldo de fermentación, preferiblemente más de 1 g/l, más preferiblemente más de 1.3 g/l se pueden obtener.

Después de la expresión en la célula huésped, el producto expresado, que es el anticuerpo, luego se puede recuperar a partir del cultivo de células huésped. La cadena pesada y la cadena liviana normalmente cada una se expresan en la célula huésped y se secretan en el periplasma de la célula. Los péptidos señal codificados por las secuencias señal en el vector de expresión luego se procesan a partir de las cadenas de inmunoglobulina. Las cadenas pesadas y ligeras maduras luego se ensamblan para formar un anticuerpo intacto o un fragmento Fab. Con el fin de obtener un rendimiento máximo del producto expresado, las células usualmente se cosechan en el final del cultivo y se lisan, tal como el lisado mediante el tratamiento con lisozima, sonicación o French Press. Por lo tanto, el anticuerpo usualmente primero se obtiene como lisado crudo de las células huésped. Este luego se puede purificar mediante procedimientos de purificación de proteínas estándar conocidos en el oficio que pueden incluir precipitación diferencial, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, isoelectroenfoque, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, y de inmunoafinidad. Estos métodos bien conocidos y rutinariamente practicados se describen en, por ejemplo, Ausubel et al., supra., and Wu et al. (eds.), Academic Press Inc., N.Y.; Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology. Las inmunoglobulinas o fragmentos Fab producidas recombinantemente también pueden ser purificados con cromatografía de inmunoafinidad mediante el pasaje a través de una columna que contiene una resina el cual ha unido a estas moléculas diana a las que las inmunoglobulinas expresadas se pueden unir específica-
mente.

Aquellos de habilidad en el oficio apreciaran que la invención descrita en este documento es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes de aquellas específicamente descritas. La presente descripción por consiguiente se debe considerar en todos los aspectos ilustrados y no limitativo, el alcance de la invención que se indica por las Reivindicaciones anexas.

La descripción anterior se comprenderá más completamente con referencia a los siguientes Ejemplos. Tales Ejemplos, son, sin embargo, ejemplos de métodos de la práctica de la presente invención y no tienen la intención de limitar el alcance de la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de plásmidos de expresión con promotores regulados positivamente

El genoma de Escherichia coli W3110 fue escaneado para operones regulados positivamente. Basándose en los datos genómicos que están disponibles en la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html) promotores catabólicos regulados positivamente fueron identificados y analizados para su uso en plásmidos de expresión. Los promotores estrictamente se deberían regular e inducir mediante un compuesto económico y no-toxico y por consiguiente útil industrialmente. Los siguientes promotores de diferentes operones catabólicos regulados positivamente fueron elegidos

- promotor prp (propionato inducible)

- promotor gutA (glucitol inducible)

- promotor melAB2 (melibiosa inducible)

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Los fragmentos de ADN precisos que contienen los elementos promotor, fueron seleccionados basándose en la información disponible de los sitios de enlace regulador correspondiente. El ADN cromosomal de Escherichia coli fue aislado, por el método de Pitcher et al., 1989, Letters in Applied Microbiology 8, 151-156. Los fragmentos del promotor se amplificaron a partir del ADN cromosomal de la cepa W3110 por PCR, utilizando los siguientes cebadores. Los sitios de restricción de ClaI y AflII se subrayan. Las secuencias de los fragmentos son como sigue:

1

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(Sitio de enlace para CRP 2 se resalta en color gris claro y sitios de enlace para MeIR se resaltan en color negro).

Los fragmentos fueron separados por electroforesis en gel de agarosa y aislados mediante el kit extracción en gel QiaexII de Qiagen (Hilden, Germany). Los fragmenteos aislados se cortaron con ClaI y AflII y se ligaron con pBW22 corte-ClaI/AflII (Wilms et al., 2001, Biotechnology and Bioengineering, 73 (2), 95-103). Los plásmidos resultantes que contienen el promotor prp (pBLL5), el promotor gutA (pBLL6) y el promotor melAB2 (pBLL7) son idénticos excepto por la región promotora ligada. La secuencia de los fragmentos insertados del promotor fue confirmada por secuenciación (Microsynth GmbH, Balgach, Switzerland).

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Ejemplo 2 Construcción de plásmidos de expresión del fragmento Fab

Como una alternativa a un promotor lac IPTG-inducible (plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H, Knappik et al., 1985, Gene 33, 103-119), diferentes sistemas de expresión regulados positivamente, fueron analizados por su capacidad de producir fragmentos de anticuerpos Fab-H. El fragmento Fab-H fue amplificado fuera del plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H por PCR utilizando los cebadores Fab-5 (5'-aaa cat atg aaa aag aca gct atc-3') y Fab-3 (5'-aaa aag ctt tta tca gct ttt cgg ttc-3'). El fragmento de PCR se cortó con NdeI y HindIII y se insertó el corte-NdeI/HindIII en pBW22 (Volff et al., 1996, Mol. Microbiol. 21, 1037-1047) para crear el plásmido pBW22-Fab-H (Figura 1) que contiene el promotor rhaBAD inducible por ramnosa (SEQ ID NO.1). El mismo fragmento de PCR se insertó a los diferentes plásmidos de expresión con promotores inducibles. Los plásmidos de expresión (putativos) que contienen el Fab-H resultante, son pBLL13 que contiene el promotor prp, pBLL14 que contiene el promotor gutA y pBLL15 que contiene el promotor melAB2 (Figura 2). La secuencia del inserto Fab-H del plásmido pBW22-Fab-H fue confirmada por secuencia-
ción.

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Ejemplo 3 Expresión del fragmento Fab

La cepa W3110 (DSM 5911, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) fue transformada con los diferentes plásmidos de expresión. Los plásmidos fueron aislados a partir de los clones que resultan de las diferentes transformaciones y se comprobaron vía análisis de restricción. Excepto el plásmido pBLL14, todos los plásmidos tuvieron el patrón de restricción esperado. El plásmido pBLL14 re-aislado mostró un tamaño y patrón de restricción alterados, fue sugerido que es debido a los eventos de recombinación. Por consiguiente, la cepa W3110 (pBLL14) no fue probada en los siguientes ensayos. Las cepas restantes fueron evaluadas por su capacidad para secretar los fragmentos de anticuerpos Fab-H activamente plegados. Esta prueba de productividad se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 4. Los siguientes inductores fueron adicionados en una concentración del 0.2%

pBW22-Fab-H

L(+)-Ramnosa monohidrato

pBLL13

Propionato de sodio

pBLL15

D(+)-Melibiosa monohidrato

\quad

D(+)-Rafinosa monohidrato

\quad

D(+)-Galactosa

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Los resultados de los experimentos dot blot se muestran en la Figura 3.

Las cepas W3110 (pBW22-Fab-H) y W3110 (pBLL15) inducidas por ramnosa- y melibiosa- mostraron prometedores resultados de dot blot: el aumento de las señales en el tiempo y casi ninguna actividad de fondo. La porción de los fragmentos de anticuerpos plegados activamente se cuantificó a través de un ELISA. Los resultados se resumen en la siguiente Tabla 1.

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TABLA 1 Resultados de ELISA de los derivados W3110 con los diferentes plásmidos de expresión. Se indica el tiempo después de la inducción. Los cultivos no inducidos después de 22 o 25 h. se midieron como controles no inducidos y los resultados de la cepa W3110 (pMx9-HuCAL-Fab-H) y TG1F'- (pMx9-HuCAL-Fab-H) se utilizan como referencias. La concentración de Fab-H se da en mg/100 de OD_{600}/L (n.d. no determinado)

3

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Todas las cepas crecieron bien sin ninguna inhibición de crecimiento en la presencia o ausencia del inductor correspondiente hasta un OD_{600} entre 4 y 6. Los plásmidos de expresión pBW22-Fab-H (que contiene SEQ ID NO. 3) y pBLL15 llegaron a los títulos más altos del fragmento del anticuerpo después de la inducción durante la noche. La cepa W3110 inducida por melibiosa (pBLL15) mostró un aumento retardado en la formación de fragmentos de anticuerpos activos en comparación con el sistema inducido por ramnosa (pBW22-Fab-H).

La cepa W3110 inducible por ramnosa (pBW22-Fab-H) se probó en el Sistema de Monitoreo de Actividad Respiratoria (RAMOS, ACBiotec, Jülich, Germany), un sistema de medición novedoso para la determinación en línea de actividades de respiración en matraces oscilantes. En comparación con el experimento de matraz oscilante normal, el título del anticuerpo (que fue medido vía ELISA) fue el doble (703.64 mg/L/100 OD_{600} después de 23 h de inducción). El crecimiento optimizado utilizando el equipo RAMOS favorece la producción de fragmentos de anticuerpos
activos.

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Ejemplo 4 Inducción de la melibiosa en matraces oscilantes

E. coli W3110 que lleva el plásmido pBLL15, se probó por su capacidad para producir fragmentos de anticuerpos plegados activamente Fab-H. Los cultivos durante la noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 100 \mug/ml de Ampicilina, 37ºC] fueron diluidos (1:50) en 20 ml de medio de glicerol fresco (como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, mientras que la solución de vitamina se utilizó como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1 y se incubó a 30ºC. La melobiosa (0.2%) se adicionó cuando los cultivos alcanzaron un OD_{600} de aproximadamente 0.4. Las muestras (1ml) fueron tomadas en diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y los pellets fueron almacenados a -20ºC. Las células congeladas fueron lisadas de acuerdo con el tratamiento descrito anteriormente con lisozima y los sobrenadantes fueron analizados mediante los ensayos dot blot y ELISA. Se obtuvieron 504,28 mg/L/100 OD_{600} de fragmentos de anticuerpos Fab-H funcionales.

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Ejemplo 5 Aparición de agregados de alto peso molecular

Con el fin de averiguar si los agregados de alto peso molecular se producen, un western blot de extractos de la cepa W3110 (pBLL15), el cual mostró el título más alto de anticuerpos (Tabla 1), se llevó a cabo utilizando el conjugado anti-humano Fab-H + AP. El cultivo se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 4. Las muestras fueron tomadas después de 9, 12 y 23 horas después de la inducción con melibiosa. Las concentraciones más bajas de agregados de alto peso molecular corresponden a títulos más altos de fragmentos funcionales de anticuerpos. La elección del sistema de expresión parece influir en la manera en la cual los fragmentos de anticuerpos se forman: funcionales o en agregados.

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Ejemplo 6 Influencia de péptidos señal

La base de datos del genoma de E. coli se utilizó para buscar los péptidos señal útiles que podrían ser utilizados en combinación con los fragmentos Fab-H VL3-CL y VH-CH. Las secuencias señal a partir de las proteínas de enlace periplásmicas para azúcares, aminoácidos, vitaminas e iones fueron elegidas. Estas proteínas periplásmicas representan un grupo relativamente homogéneo que ha sido estudiado más extensivamente que otras proteínas periplásmicas. Dado que son generalmente abundantes, sus secuencias señal tienen que asegurar un transporte eficiente a lo largo de la membrana interna en el periplasma. Todas las posibles combinaciones del péptido señal Fab fueron comprobadas por su péptido de secuencia y la probabilidad del sitio de conversión utilizando el servidor de la web SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/#submission) como se muestra en la siguiente Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

4

6

7

Las siguientes seis combinaciones fueron elegidas:

- LamB-VL3-CL (precursor de la maltoporina)

- MalE-VH-CH (precursor de la proteína de enlace de la Maltosa)

- Bla-VL3-CL (Beta-lactamasa)

- TreA-VH-CH (Precursor trehalasa periplásmica)

- ArgT-VL3-CL (precursor de la proteína periplásmica enlace-lisina-arginina-ornitina)

- FecB-VH-CH (Hierro (III) precursor de la proteína periplásmica enlace-dicitrato

Las fusiones de genes para generar el péptido señal (SP) para las fusiones VL3-CL y VH-CH se llevan a cabo con solapamiento de los cebadores de PCR y se resumen en la siguiente amplificación de la Tabla 3

8

9

Las fusiones de la secuencia de los péptidos señal con las secuencias VL3-CL y VH-CH se realizaron como se describe en otra parte (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K. and Pease, L.R. (1989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68). Los genes SP-VL3-CL se cortaron con enzimas de restricción NdeI y PstI y se ligaron en el corte-NdeI/PstI pBW22 y en pBLL7. Los plásmidos resultantes se cortaron con PstI y HindIII y se ligaron con los genes SP-VH-CH corte-PstI/HindIII. Dado que la integración de los genes bla-VL3-CL y fecB-VH-CH no fue posible solo el plásmido de la expresión Fab-H que contiene los genes lamB-VL3-CL y malE-VH-CH se pudo probar. Un plásmido de la expresión lamB-VL3-CL/malE-VH-CH que contiene el promotor inducible por ramnosa (pAKL14) fue obtenido. Los genes lamB-VL3-CL/malE-VH CH que fueron aislados a partir del plásmido pAKL15 (ejemplo 7) como el fragmento AflII/HindIII fueron ligados en pBLL7 corte-AflII/HindIII para obtener pAKL15E. La Figura 4 y 8 ilustran los plásmidos de expresión de lamB-VL3-CL/malE-VH-CH pAKL14 y pAKL15E.

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Ejemplo 7 Influencia de las regiones iniciación de la traducción en la expresión Fab

Los genes Fab-H del plásmido pAKL14 (que contiene SEQ ID NO. 4) y el plásmido PAWL15E contiene la misma secuencia de ADN 5' del codón inicial (región de iniciación de la traducción) mientras que en el plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H original, las regiones de iniciación de la traducción de ambos genes Fab-H son diferentes. Una comparación de las secuencias de las regiones de iniciación de la traducción del plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H y pAKL14/pAKL15E se muestra en la siguiente Tabla 4:

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10

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La productividad de la cepa W3110 (pAKL14) se probó en matraces oscilantes como se describe en el ejemplo 4. La cepa creció bien en la presencia o ausencia de L-ramnosa. Eso significa que la producción de Fab-H no influye en la viabilidad de las células. Como se muestra en la Figura 5 los resultados de dot blot parecieron prometedores.

Para analizar la presencia de agregados no-reducibles de alto peso molecular un Western blot se llevó a cabo (Figura 6). Aunque los agregados de alto peso molecular aparecen después de un tiempo de inducción de 5 horas su cantidad solo aumenta ligeramente después de 23 h. El cultivo no-inducido muestra bandas de alto peso molecular que se pueden deber a una débil producción base no-específica. Los valores de ELISA correspondientes se dan en la siguiente Tabla 5 (concentración de Fab-H (mg/L/100 OD_{600}) en extractos de lisozima de la cepa W3110 no inducida e inducida por ramnosa (pAKL14)).

11

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Las nuevas construcciones del péptido señal (en combinación con las señales de iniciación de la traducción modificada) de nuevo aumenta el título del fragmento de anticuerpo de 328.62 mg/L/100 OD_{600} (plásmido pBW22-Fab-H que contiene la construcción del gen MOR a partir del plásmido pMx9-HuCAL-Fab-H) a 596.14 mg/L/100 OD_{600} (plásmido pAKL14) y a 878.86 mg/L/100 OD_{600} (plásmido pAKL15E). La secuenciación de los genes lamB-VL3-CL y malE-VH-CH en pAKL14 reveló tres intercambios base que se supone, se debe a la construcción de los genes de fusión por dos reacciones de PCR consecutivas. Los intercambios base conducen a los siguientes cambios de aminoácido (los aminoácidos erróneos se destacan):

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12

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La cadena liviana de Fab-H lleva dos errores (D50N, K63N) y la cadena pesada un intercambio de aminoácido (F156L). Para restablecer los dos fragmentos de la secuencia de Fab-H original a partir del plásmido pAKL14 (fragmento SexAI/BamHI de 138 bp y BssHII/HindIII 310 bp) fueron intercambiados contra los fragmentos homólogos del plásmido pBW22-Fab-H (que lleva la secuencia del gen Fab-H sin cambiar). El plásmido pAKL15 resultante lleva la secuencia Fab-H correcta. El intercambio de los tres aminoácidos no tuvo efecto aparente en las propiedades Fab-H completas ya que el pI fue sin cambio. Por consiguiente la capacidad de la cepa W3110 (pAKL15) para producir fragmentos funcionales de los anticuerpos Fab-H, se consideró que era similar a la cepa W3110 (pAKL14) y no fue analizada.

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(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

La productividad del fragmento del anticuerpo Fab-H se podría aumentar utilizando diferentes estrategias de optimización. La siguiente Tabla 6 resume las mejoras:

13

Las cepas que produjeron altos títulos del anticuerpo Fab-H fueron analizadas vía SDS-PAGE (Figura 7). Las concentraciones de Fab-H funcionales más altas, se midieron en cepas que producen una cantidad balanceada de cadena ligera y pesada (sendas 4 y 5). Las cepas inducibles por ramnosa, que llevan el fragmento Fab-H tales como W3110 (pBW22-Fab-H) (senda 3) sobreproducen fuertemente la cadena liviana.

Ejemplo 8 Inducción de la melibiosa en matraces oscilantes

W3110 de E. coli que lleva el plásmido pAKL15E (Figura 8) se probó por su capacidad de producir fragmentos de anticuerpos plegados activamente Fab-H. Los cultivos durante la noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 100 \mug/ml de Ampicilina, 37ºC] fueron diluidos (1:50) en 20 ml de medio de glicerol fresco (como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, mientras que la solución de vitamina se utilizó como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1_y se incubó a 30ºC. La melibiosa (0.2%) se adicionó cuando los cultivos alcanzaron un OD_{600} de aproximadamente 0.4. Las muestras (1 ml) fueron tomadas a diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y los pellets fueron almacenados a -20ºC. Las células congeladas fueron lisadas de acuerdo con el tratamiento descrito anteriormente con lisozima y los sobrenadantes fueron analizados en ensayos SDS-PAGE y ELISA. La cepa inducible por melibiosa, que lleva los genes Fab-H con los péptidos señal alterados (lamB-VL3-CL/malE-VH-CH) mostró los títulos más altos del anticuerpo Fab-H (Tabla 6). Las cadenas ligera y pesada de Fab-H fueron producidas en cantidades iguales (Figura 9).

Ejemplo 9 Producción intracelular de los fragmentos de anticuerpos

Las cepas huésped de Origami proporcionaron las mutaciones en ambos genes de la tioredoxina reductasa (trxB) y glutationa reductasa (gor), aumentando la formación del enlace disulfuro y permitiendo el plegamiento de la proteína en el citoplasma bacteriano. Para construir los genes VL3-CL y VH-CH sin regiones del péptido señal, se utilizaron los siguientes cebadores:

14

Los correspondientes genes VL3-CL y VH-CH se amplificaron y se comprobaron vía un análisis de restricción. El fragmento VL3-CH corte NdeI/PstI fue integrado en el plásmido pBW22 corte NdeI/PstI. El plásmido resultante se cortó con PstI y HindIII y se ligó con el fragmento VH-CH corte PstI/HindIII para conseguir el plásmido pJKL6. El plásmido fue transformado en la cepa Origami y como referencia la cepa W3110. La productividad de las cepas W3110 (pJKL6) y Origami (pJKL6) se probó en matraces oscilantes como se describe en el ejemplo 4. Para analizar la presencia de fragmentos funcionales de anticuerpos y agregados no-reducibles de alto peso molecular, se llevó a cabo un Western blot. Ambas cepas escasamente producen cualquiera de los fragmentos funcionales de los anticuerpos. La cepa W3110 acumula agregados de alto peso molecular con aumentos de los tiempos de inducción (W3110) mientras que la cepa Origami no produce fragmentos de anticuerpos. Los correspondiente valores de ELISA se dan en la siguiente Tabla 7 (concentración de Fab-H (mg/L/100 OD_{600}) en extractos de lisozima de cepas Origami (pJKL6) y W3110 (pJKL6) no inducidas e inducidas por ramnosa):

15

Ejemplo 10 Inducción de la ramnosa de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv, S1) en matraces oscilantes

El gen scFv fue aislado vía PCR utilizando los cebadores 5-S (5'-aaa cat atg aaa tac cta ttg cct acg gc-3') y 3-S1 (5'-aaa aag ctt act acg agg aga cgg-3'). La proteína S1 correspondiente contiene una secuencia señal PelB que es responsable del transporte de la proteína con el periplasma de E. coli. El fragmento de PCR se cortó con NdeI y HindIII y se insertó en pBW22 corte-NdeI/HindIII para crear el plásmido pBW22-pelB-S1 que contiene el promotor rhaBAD inducible por ramnosa (Figura 10). La secuencia del inserto S1 del plásmido pBW22-pelB-S1 fue confirmada por secuenciación. La cepa W3110 (DSM 5911, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) fue transformada con el plásmido pBW22-pelB-S1. Los plásmidos fueron aislados a partir de diferentes clones y se verificaron mediante análisis de restricción. E. coli W3110 (pBW22-pelB-S1) se probó por su capacidad de producir S1 soluble. Los cultivos durante la noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 100 \mug/ml de Ampicilina, 37ºC] fueron diluidos (1:50) en 20 ml de medio de glicerol fresco [como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, con la excepción de la solución de vitamina (como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1)] y se incubó a 30ºC. Se adicionó ramnosa (0.2%) cuando los cultivos alcanzaron un OD_{600} de aproximadamente 0.4. Las muestras (1 ml) fueron tomadas a diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y los pellets fueron almacenados a -20ºC. Las células congeladas fueron lisadas de acuerdo con el tratamiento descrito anteriormente con lisozima y los sobrenadantes y los pellets de proteína insoluble fueron analizados vía SDS-PAGE (Figura 11) y un Bioanalizador. La mayoría de la proteína S1 (mg/L/100 OD_{600}) fue producida en la fracción de la proteína soluble.

Ejemplo 11

Construcción de un plásmido de expresión de ramnosa de rango de huésped amplio para Pseudomonas y bacterias relacionadas

Los siguientes experimentos de clonación se realizaron en Escherichia coli JM109. El vector de clonación de rango de huésped amplio pBBR1MCS-2 (NCBI número de acceso U23751) se cortó con AgeI/NsiI. El gen lacZ\alpha fue suprimido y reemplazado por los oligonucleótidos 3802 (5'-tgt taa ctg cag gat cca agc tta-3') y 3803 (5'-ccg gta agc ttg gat cct gca gtt aac atg ca-3') para conseguir el plásmido pJOE4776.1. El fragmento rhaRSP fue proporcionado por el plásmido pJKS408 (sin publicar) el cual contiene el fragmento rhaRS genómico (2 kb) de Escherichia coli JM109. El plásmido pJKS408 se cortó con BamHI/HindIII y se ligó con el fragmento eGFP del corte BamHI/HindIII (0.7 kb) de plásmido pTST101 [Stumpp, T., Wilms, B., Altenbuchner, J. (2000): Ein neues, L-Ramnosa-induzierbares Expressionssystem für Escherichia coli. Biospectrum 6, 33-36]. El fragmento rhaRSPma1E-eGFP (4 kb) fue aislado vía NsiI/HindIII del plásmido resultante pJOE4030.2 y se integra en el pJOE4776.1. Plásmido pJOE4776.1 corte-NsiI/HindIII (Figura 12) contiene la región del promotor rhaBAD en combinación con los genes de las proteínas reguladoras RhaS y RhaR del operón de la ramnosa de Escherichia coli en un esqueleto del plásmido de rango de huésped amplio.

Ejemplo 12 Inducción de la ramnosa de una nitrilasa en matraces oscilantes

El gen de la nitrilasa se cortó con NdeI y BamHI a partir del plásmido pDC12 (Kiziak et al., 2005) y se insertó en pJOE4782.1 corte-NdeI/BamHI para crear el plásmido pAKLP2 que contiene el promotor rhaBAD inducible por L-ramnosa (Figura 13). E. coli XL1-Blue fue transformada con el plásmido pAKLP2 como una etapa intermedia. Los plásmidos fueron aislados a partir de diferentes clones y se verificaron mediante el análisis de restricción. Pseudomonas putida KT-2440 (DSM 6125, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) fue transformada con los plásmido pAKLP2 aislados a partir de E. coli XL1blue(pAKLP2). Pseudomonas putida KT-2440 (pAKLP2) se probó por su capacidad para producir nitrilasa. Los cultivos durante la noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 50 \mug/ml de canamicina, 30ºC] fueron diluidos en 20 ml de medio de glicerol fresco [como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, con la excepción de la solución de vitamina (como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1)] a un OD_{600} de aproximadamente 0.1 y se incubó a 30ºC. L-ramnosa (1.0%) se adicionó cuando los cultivos alcanzaron un OD_{600} de aproximadamente 0.25. Las muestras (1 ml) fueron tomadas a diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y los pellets fueron almacenados a -20ºC. Los pellets fueron resuspendidos en solución reguladora Tris/HCl (50 mM, pH 8.0) y las suspensiones celulares fueron analizadas vía SDS-PAGE (Figura
14).

Ejemplo 13 Inducción de L-ramnosa a partir de un fragmento anticuerpo (FabM) en matraces oscilantes

El gen Fab-M se cortó con NdeI y BamHI a partir del plásmido pBW22-FabM y se insertó en pJOE4782.1 corte-NdeI/BamHI, para crear el plásmido pAKLP1 que contiene el promotor rhaBAD inducible por L-ramnosa (Figura 15). E. coli XL1-Blue fue transformada con el plásmido pAKLP1 como una etapa intermedia. Los plásmidos fueron aislados a partir de diferentes clones y se verificaron por análisis de restricción. Pseudomonas putida KT-2440 (DSM 6125, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) fue transformada con el plásmido pAKLP1 aislado a partir de E. coli XL1blue(pAKLP1). Pseudomonas putida KT-2440 (pAKLP1) se probó por su capacidad para producir Fab-M. Los cultivos durante la noche [en medio NYB (10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro de sodio) suplementado con 50 \mug/ml de canamicina, 30ºC] fueron diluidos en 20 ml de medio de glicerol fresco [como se describe por Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65, con la excepción de la solución de vitamina (como se describe por Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1)] a un OD_{600} de aproximadamente 0.1 y se incubó a 30ºC. Se adicionó L-ramnosa (1.0%) cuando los cultivos alcanzaron un OD_{600} de aproximadamente 0.25. Las muestras (1 ml) fueron tomadas a diferentes intervalos de tiempo, se centrifugaron y los pellets fueron almacenados a -20ºC. Los pellets se resuspendieron en solución reguladora Tris/HCl (50 mM, pH 8.0) y las suspensiones celulares fueron analizadas vía SDS-PAGE (Figura 16).

Ejemplo 14 Expresión del anticuerpo de cadena única utilizando un sistema de secreción de Escherichia coli en fermentación de alta densidad celular

Escherichia coli W3110 fue transformada con el plásmido pBW22-pelB-S1. Los plásmidos fueron aislados a partir de diferentes clones y se verificaron mediante el análisis de restricción y un clon se utilizó para otros experimentos. Los pre-cultivos en matraz oscilante fueron inoculados a partir de colonias únicas en medio de fase del lote de Lonza. El pre-cultivo se utilizó para inocular un fermentador de 20 L. Las células se cultivaron de acuerdo con el régimen de fermentación de alta densidad celular de Lonza. Las muestras (10 ml) del cultivo fueron tomadas en diferentes puntos de tiempo antes de y después de la inducción con ramnosa. Las células fueron separadas a partir del medio de fermentación por centrifugación a 10'000 g. El análisis en gel de SDS de muestras a partir del medio de fermentación libre de células muestra una banda de proteína a 28.4 kD con densidad de aumento. Esta proteína es el anticuerpo de cadena sencilla S1 liberado del cultivo que crece en el medio de fermentación. Una cuantificación del contenido de la proteína S1 con un Bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Palo Alto, USA) indicó una acumulación de hasta 2 g/L/100 OD_{600} de proteína S1 en el caldo de fermentación después de la inducción con ramnosa. Después del tratamiento con lisozima del pellet celular, el pellet de la proteína insoluble solo contenía trazas de la proteína S1 mientras que la fracción de la proteína soluble (sobrenadante) mostró una banda de proteína S1 fuerte, correspondiente a aproximadamente 1g/L/100 OD_{600} (ver Figura 17).

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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<110> LONZA AG

\hskip1cm

MORPHOSYS AG

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<120> Sistema de expresión del promotor ramnosa

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<130> B14870/EP

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<160> 4

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 129

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<212> ADN

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<213> Escherichia coli

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<220>

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<221> misc_feature

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<223> promotor rhaBAD

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<400> 1

16

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<210> 2

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<211> 13

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<212> ADN

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<213> Escherichia coli

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<220>

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<221> misc_feature

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<223> Región de iniciación de Traducción

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

aggagatata cat

\hfill

13

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<210> 3

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<211> 1616

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<212> ADN

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<213> Escherichia coli

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<220>

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<221> misc_feature

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<223> secuencia que contiene el promotor rhaBAD y ompA-VL3-CL y phoA-VH-CH

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<400> 3

17

18

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<210> 4

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<211> 1639

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<212> ADN

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<213> Escherichia coli

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<220>

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<221> misc_feature

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<223> secuencia que contiene el promotor rhaBAD y lamB-VL3-CL y malE-VH-CH

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<400> 4

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19

20

Claims (10)

1. Un método para producir un anticuerpo en un huésped procariota, que comprende las etapas de:

a) construcción de un vector que comprende la región del promotor rhaBAD del operón L-ramnosa, ligado operablemente a una unidad transcripcional que comprende i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo y ii) una secuencia señal procariota ligada operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, en donde la unidad transcripcional comprende una región de iniciación de traducción en dirección 5' del punto de inicio de la traducción de dicha unidad transcripcional, dicha región de iniciación de traducción constituida por la secuencia AGGAGATATACAT (SEQ ID NO. 2), mientras que dicha región de iniciación de traducción se liga operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico, mientras que dicha secuencia señal procariota se selecciona de los péptidos señal de las proteínas de enlace periplásmicas seleccionadas del grupo constituido por LamB y MalE y, mientras que la expresión de dicha secuencia de ácido nucleico se controla por dicha región promotora,

b) transformación de un huésped procariota con dicho vector,

c) permitir la expresión de dicho polipéptido en un sistema de cultivo celular bajo condiciones apropiadas,

d) recuperación de dicho polipéptido a partir del sistema de cultivo celular.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho promotor rhaBAD consiste de la secuencia SEQ ID NO. 1, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región del promotor rhaBAD y dicha unidad transcripcional ligada operablemente consiste de la secuencia SEQ ID NO. 3, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha región del promotor rhaBAD y dicha unidad transcripcional ligada operablemente consiste de la secuencia SEQ ID NO. 4, una secuencia complementaria de esta y las variantes de esta.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo producido es un fragmento Fab.

6. El método de la reivindicación 5, en donde las cadenas pesada y ligera del fragmento Fab se expresan en dicho sistema de cultivo celular en cantidades iguales.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde la cadena pesada y la ligera de dicho fragmento Fab se codifican por una unidad transcripcional dicistrónica, mientras que cada cadena se liga operablemente a dicha secuencia señal procariota y una región de iniciación de traducción idéntica en dirección 5' del punto de inicio de la traducción de dicha unidad transcripcional.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha unidad transcripcional además comprende una región de terminación de la transcripción, que es la secuencia terminadora transcripcional rrnB.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho vector es un plásmido autonómico o de auto-replicación, un cósmido, un fago o un virus.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, mientras que la expresión de dicho anticuerpo se realiza en medio que contiene glicerol.