JP5069124B2 - ラムノースプロモーター発現系 - Google Patents
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Description
前記転写単位が、
a)前記宿主に対して異種である核酸配列と、
b)前記核酸配列に機能的に連結された原核生物のシグナル配列であって、前記原核生物のシグナル配列が、糖、アミノ酸、ビタミンおよびイオンのための周辺質結合タンパク質のシグナルペプチドから選択されるシグナル配列とを含み、かつ
前記核酸配列の発現が、前記プロモーター領域によって制御される、ベクターに関する。
a)前記宿主に対して異種である核酸配列と、
b)前記核酸配列に機能的に連結された原核生物のシグナル配列であって、前記原核生物のシグナル配列が、糖、アミノ酸、ビタミンおよびイオンのための周辺質結合タンパク質のシグナルペプチドから選択されるシグナル配列とを含み、かつ
前記核酸配列の発現が、前記プロモーター領域によって制御される、ベクターを提供することである。
また、原核生物の宿主における核酸配列の制御された異種発現のための前記新規なベクターの使用; L-ラムノース オペロンのrhaBADプロモーター領域を含む宿主において発現可能な単離および精製された核酸配列、異種ヌクレオチド配列、ならびに糖、アミノ酸、ビタミンおよびイオンのための周辺質結合タンパク質のシグナルペプチドから選択された原核生物のシグナル配列; 前記ベクターで形質転換された原核生物の宿主または前記単離および精製された核酸配列;前記ベクターを使用して宿主においてポリペプチドを産生する方法; ならびにプロモーター領域、異種核酸配列および配列AGGAGATATACATからなる翻訳開始領域を含むベクターが提供される。
a)前記宿主に対して異種である核酸配列と、
b)前記核酸配列に機能的に連結された原核生物のシグナル配列であって、前記原核生物のシグナル配列が、糖、アミノ酸、ビタミンおよびイオンのための周辺質結合タンパク質のシグナルペプチドから選択されるシグナル配列とを含み、かつ
前記核酸配列の発現が、前記プロモーター領域によって制御される、ベクターに関する。
好ましくは、rhaBADプロモーター領域、および本発明のベクターの機能的に連結された転写単位は、配列番号3の配列、これに相補的な配列およびこれらの変異配列からなる。
前記転写単位が、
a) 前記宿主に対して異種である核酸配列と、
b) 前記核酸配列に機能的に連結された原核生物のシグナル配列であって、前記原核生物のシグナル配列が、糖、アミノ酸、ビタミンおよびイオンのための周辺質結合タンパク質のシグナルペプチドから選択されるシグナル配列とを含み、かつ
前記核酸配列の発現が、前記プロモーター領域によって制御される、核酸配列を提供する。rhaBADプロモーターは、好ましいプロモーター領域である。より好ましくは、単離および精製された核酸配列は、配列番号1の配列、これに相補的な配列およびこれらの変異配列からなる。
b)原核生物の宿主を前記ベクターで形質転換する工程と、
c)適切な条件下で細胞培養系において前記ポリペプチドを発現させる工程と、
d)前記ポリペプチドを細胞培養系から回収する工程。
前記転写単位が、
a) 前記宿主に対して異種である核酸配列と、
b) 前記転写単位の翻訳の開始点の上流にある翻訳開始領域であって、前記転写開始領域が、配列AGGAGATATACAT(配列番号2)からなる、翻訳開始領域とを含み、かつ
前記転写開始領域が、前記核酸配列に機能的に連結され、かつ前記核酸配列の発現が前記プロモーター領域によって制御される、ベクターである。
b)原核宿主を前記ベクターで形質転換する工程と、
c)適切な条件下で細胞培養系において前記ポリペプチドを発現させる工程と、
d)前記ポリペプチドを前記細胞培養系から回収する工程。
例1
正に制御されたプロモーターでの発現プラスミドの構築
大腸菌W3110ゲノムを、正に制御されたオペロンについてスキャンした。KEGGデータベース上の利用可能なゲノムデータに基づいて(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html)、正に制御された異化プロモーターを、発現プラスミドにおけるその使用のために同定かつ分析した。プロモーターは厳密に制御されるべきであり、かつ安価かつ無毒で導入されるべきである(つまり、産業的にも有用な化合物であるべきである)。以下の異なる正に制御された異化プロモーターを選択した。
−gutAプロモーター(誘導性グルシトール)
−melAB2プロモーター(誘導性メリビオース)
Fab断片発現プラスミドの構築
IPTG-誘導性lacプロモーターに対する代替として(プラスミドpMx9-HuCAL-Fab-H, Knappik et al., 1985, Gene 33, 103-119)、異なる正に制御された発現系をFab-H抗体断片を産生するその能力について分析した。Fab-H断片を、プライマーFab-5(5’-aaa cat atg aaa aag aca gct atc-3’)およびFab-3 (5’-aaa aag ctt tta tca gct ttt cgg ttc-3’)を使用してPCRによってプラスミドpMx9-HuCAL-Fab-Hで増幅した。PCR断片をNdeIおよびHindIIIで切断、かつNdeI/HindIII-切断pBW22に挿入し(Volff et al., 1996, Mol. Microbiol. 21, 1037-1047)、L-ラムノース誘導性rhaBADプロモーター(配列番号1)を含むプラスミドpBW22-Fab-H(図1)を創出した。同じPCR断片を誘導性プロモーターをもつ異なる発現プラスミドに挿入した。得られたFab-H含有(推定上の)発現プラスミドは、prpプロモーターを含むpBLL13、gutAプロモーターを含むpBLL14およびmelAB2プロモーターを含むpBLL15(図2)である。プラスミドpBW22-Fab-HのFab-H 挿入の配列はシークエンシングによって確認した。
Fab断片の発現
株W3110 (DSM 5911, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)を、異なる発現プラスミドで形質転換した。プラスミドを、異なる形質転換体から得られたクローンから単離し、制限分析を介してチェックした。プラスミドpBLL14を除いて、全てのプラスミドは、予期された制限パターンを有していた。再度単離されたプラスミドpBLL14は、組換えが原因と考えられる変化したサイズおよび制限パターンを示した。従って、株W3110 (pBLL14)については以下のアッセイにおける試験を行わなかった。残りの株については、活性が倍加されたFab-H抗体断片を分泌する能力について試験を行った。この生産性試験は例4において記載されたように行った。以下の誘導物質を0.2%の濃度において加えた。
pBLL13 プロピオン酸ナトリウム
pBLL15 D(+)-メリビオース一水和物
D(+)-ラフィノース一水和物
D(+)-ガラクトース
振盪フラスコ内におけるメリビオースの誘導
プラスミドpBLL15をもつ大腸菌W3110を、活性が倍加されたFab-H抗体断片を産生するその能力について試験した。終夜培養液 [NYB培地中(10 g/lトリプトン、5 g/l酵母抽出物、5 g/l塩化ナトリウム) 100 μg/mlのアンピシリンを補充、37 °C] を、20 mlの新鮮グリセロール培地中で稀釈した(1:50)(Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65によって記載されたように稀釈)。一方、ビタミン溶液を、Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1によって記載されたように使用し、かつ30℃でインキュベートした。培養液が約0.4のOD600に達したとき、メリビオース(0.2%)を加えた。サンプル(1 ml)を異なる時間間隔で採取し、遠心してペレットを−20℃で貯蔵した。凍結した細胞を上述したリゾチーム処理によって溶解させ、上清をドットブロットおよびELISAアッセイにおいて分析した。機能的Fab-H抗体断片の504.28 mg/L/100 OD600 を得た。
高分子量凝集塊の出現
高分子量凝集塊が産生されるか否かを見るために、最も高い抗体力価(表1)を示した株W3110 (pBLL15)の抽出物のウェスタンブロットを、抗ヒトFab-H + AP抱合体を使用して行った。培養を例4に記載されたとおりに行った。メリビオースで誘導後9、12および23時間してサンプルを採取した。より低濃度の高分子量凝集塊が、より高い力価の機能的抗体断片に対応する。発現系の選択は、抗体断片が形成され:機能的または凝集塊になることに影響を与えるようである。
シグナルペプチドの影響
大腸菌のゲノムデータベースを使用して、Fab-H断片VL3-CLおよびVH-CHと組み合わせて使用され得る有用なシグナルペプチドを探索した。糖、アミノ酸、ビタミンおよびイオンについて周辺質結合タンパク質からのシグナル配列を選択した。これらの周辺質タンパク質は、他の周辺質タンパク質よりもより広範な研究がなされた比較的均質な群を表わす。これらは一般的には大量に存在するので、これらのシグナル配列は内膜を超えて周辺質へ効果的に輸送されなければならない。全ての可能なシグナルペプチドFab組み合わせを、以下の表2において示したようなSignalPウェブサーバー(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/#submission)を使用して、その配列ペプチドおよび切断サイト可能性について調べた。
- LamB-VL3-CL (マルトポリン前駆体)
- MalE-VH-CH (マルトース結合タンパク質前駆体)
- Bla-VL3-CL (β-ラクタマーゼ)
- TreA-VH-CH (周辺質トレハラーゼ前駆体)
- ArgT-VL3-CL (リシン-アルギニン-オルニチン-結合周辺質タンパク質前駆体)
- FecB-VH-CH (鉄(III)ジシトラート-結合周辺質タンパク質前駆体)
Fab発現上の翻訳開始領域の影響
プラスミドpAKL14(配列番号4を含む)およびプラスミドpAKL15EののFab-H遺伝子は、開始コドンの同じDNA配列5’(翻訳開始領域)を含む。最初のプラスミドpMx9-HuCAL-Fab-Hにおいて、両Fab-H遺伝子の翻訳開始領域は異なる。プラスミドpMx9-HuCAL-Fab-HおよびpAKL14/pAKL15Eの翻訳開始領域配列の比較は、以下の表4において示される。
振盪フラスコにおけるメリビオースの誘導
プラスミドpAKL15E(図8)を含む大腸菌W3110は、活性が倍加されたFab-H抗体断片を産生するその能力について試験された。終夜培養液 [NYB培地中(10 g/lトリプトン、5 g/l酵母抽出物、5 g/l塩化ナトリウム) 100 μg/mlのアンピシリンを補充、37 °C] を、20 mlの新鮮グリセロール培地中で稀釈した(1:50) (Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65によって記載されたように稀釈)。一方、ビタミン溶液を、Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1によって記載されたように使用し、かつ30℃でインキュベートした。培養液が約0.4のOD600に達したとき、メリビオース(0.2%)を加えた。サンプル(1 ml)を異なる時間間隔で採取し、遠心してペレットを-20℃で貯蔵した。凍結された細胞を上述したリゾチーム処理に基づいて溶解し、上清をSDS-PAGEおよびELISAアッセイにおいて分析した。変化したシグナルペプチド(lamB-VL3-CL/malE-VH-CH)でFab-H遺伝子を含むメリビオース誘導株は、最大のFab-H抗体力価を示した(表6)。Fab-Hの軽鎖および重鎖は等量において産生された(図9)。
抗体断片の細胞内生産
Origami宿主株は、ジスルフィド結合の形成を増強する、チオレドキシン レダクターゼ(trxB)およびグルタチオン レダクターゼ(gor)遺伝子の両方において変異を提供し、細菌細胞質内におけるタンパク質の折り畳みを可能にする。シグナルペプチド領域のないVL3-CLおよびVH-CH遺伝子を構築するために、以下のプライマーを使用した。
振盪フラスコ内の単鎖抗体(scFv, S1)のラムノース誘導
scFv遺伝子を、プライマー5-S (5’-aaa cat atg aaa tac cta ttg cct acg gc-3’) および 3-S1 (5’-aaa aag ctt act acg agg aga cgg-3’)を使用してPCRを介して単離した。対応するS1タンパク質は、大腸菌の周辺質に対するタンパク質の輸送に原因のあるPelBシグナル配列を含む。PCR断片は、NdeI および HindIII で切断され、NdeI/HindIII-切断 pBLL7に挿入され、ラムノース誘導rhaBADプロモーター(図10)を含むプラスミドpBW22-pelB-S1を作製した。プラスミドpBW22-pelB-S1のS1挿入の配列は、シークエンシングによって確認された。株W3110 (DSM 5911, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) をプラスミドpBLL7-pelB1-S1で形質転換した。プラスミドは、異なるクローンから単離され、かつ制限分析によって検証された。大腸菌W3110 (pBLL7-pelB-S1) は、可溶性S1を産生するその能力について試験を受けた。終夜培養液 [NYB培地中(10 g/l トリプトン、5 g/l 酵母抽出物、5 g/l 塩化ナトリウム) 100 μg/mlのアンピシリンを補充、37 ℃] を、20 mlの新鮮グリセロール培地中で稀釈し(1:50) [Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65に記載されたように稀釈、但しビタミン溶液を除く(Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1によって記載されたように)]、30℃でインキュベートした。培養液が約0.4のOD600に達したときにラムノース(0.2%)を加えた。サンプル(1 ml )を異なる時間間隔で採取し、遠心してペレットを-20℃で貯蔵した。凍結細胞を上述したリゾチーム処理に基づいて溶解し、上清および不溶性タンパク質ペレットをSDS-PAGE(図11)およびバイオアナライザーを介して分析した。S1タンパク質(mg/L/100 OD600)の大部分は、可溶性タンパク質画分において産生された。
シュードモナスおよび近縁の細菌のための広範な宿主領域のラムノース発現プラスミドの構築
次のクローニング実験は、大腸菌JM109において行われた。広範な宿主領域のクローニングベクターpBBR1MCS-2 ( NCBI 受託番号 U23751)を、AgeI/NsiIで切断した。lacZα遺伝子を削除し、オリゴヌクレオチド3802(5'-tgt taa ctg cag gat cca agc tta-3')および3803(5'-ccg gta agc ttg gat cct gca gtt aac atg ca-3’)によって置換し、プラスミドpJOE4776.1を得た。rha RSP 断片は、大腸菌JM109のゲノム rha RS断片(2kb)を含むプラスミドpJKS408(未発表)によって与えられた。プラスミドpJKS408をBamHI/HindIIIで切断し、プラスミドpTST101のBamHI/HindIII切断eGFP断片(0.7kb)にライゲートした [Stumpp, T., Wilms, B., Altenbuchner, J. (2000): Ein neues, L-Rhamnose-induzierbares Expressionssystem fur Escherichia coli. Biospectrum 6, 33-36]。rhaRSPmalE-eGFP断片(4kb)は、得られたプラスミドpJOE4030.2からNsiI/HindIIIを介して単離され、NsiI/HindIII切断pJOE4776.1に統合された。プラスミドpJOE4776.1 (図12) は、広範な宿主領域のプラスミド バックボーンにおける大腸菌のラムノース オペロンの調節タンパク質RhaSおよびRhaRの遺伝子と結合したrhaBADプロモーター領域を含む。
振盪フラスコ内におけるニトリラーゼのラムノースの誘導
ニトリラーゼ遺伝子を、プラスミド pDC12(Kiziak、2005年)からNdeIおよびBamHIで切断し、NdeI/BamHI切断pJOE4782.1に挿入し、L-ラムノース誘導rhaBADプロモーター(図13)を含むプラスミドpAKLP2を作製した。大腸菌XL1-Blueは、中間工程としてプラスミドpAKLP2で形質転換された。プラスミドは異なるクローンから単離され、制限分析によって確認された。Pseudomonas putida KT-2440 (DSM 6125, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) は、大腸菌XL1 blue (pAKLP2)から単離されたプラスミドpAKLP2で形質転換された。Pseudomonas putida KT-2440 (pAKLP2) は、ニトリラーゼを生成するその能力について試験を行った。終夜の培養液 [ NYB 培養液中 (10 g/l トリプトン、 5 g/l 酵母抽出物、5 g/l 塩化ナトリウム) 50 μg/ml の カナマイシンを補充、30℃] を、20 ml の新鮮グリセロール培地中において約0.1のOD600まで稀釈し [Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65に記載されたように稀釈、但しビタミン溶液を除く(Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1によって記載されたように)]、かつ30℃でインキュベートした。培養液が約0.25のOD600に到達したときにL-ラムノース(1.0%)を加えた。サンプル(1 ml )を異なる時間間隔で採取し、遠心してペレットを-20℃で貯蔵した。ペレットをトリス/HClバッファー(50 mM、pH 8.0)において再懸濁し、細胞懸濁液をSDS-PAGEを介して分析した(図14)。
撹拌フラスコ内における断片抗体(FabM)のL-ラムノースの誘導
Fab-M遺伝子を、プラスミドpBW22-FabMからNdeIおよびBamHIで切断し、NdeI/BamHI切断pJOE4782.1に挿入し、L-ラムノース誘導rhaBADプロモーターを含むプラスミドpAKLP1(図15)を作製した。大腸菌XL1-Blue は、中間工程としてプラスミドpAKLP1で形質転換された。プラスミドは異なるクローンから単離され、制限分析によって確認された。Pseudomonas putida KT-2440 (DSM 6125, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany) は、大腸菌XL1 blue (pAKLP2)から単離されたプラスミドpAKLP2で形質転換された。Pseudomonas putida KT-2440 (pAKLP2) は、ニトリラーゼを生成するその能力について試験を行った。終夜の培養液 [ NYB 培養液中 (10 g/l トリプトン、 5 g/l 酵母抽出物、5 g/l 塩化ナトリウム) 50 μg/ml の カナマイシンを補充、30℃] を、20 ml の新鮮グリセロール培地中において約0.1のOD600まで稀釈し [Kortz et al., 1995, J. Biotechnol. 39, 59-65に記載されたように稀釈、但しビタミン溶液を除く(Kulla et al., 1983, Arch. Microbiol, 135, 1によって記載されたように)]、かつ30℃でインキュベートした。培養液が約0.25のOD600に到達したときにL-ラムノース(1.0%)を加えた。サンプル(1 ml )を異なる時間間隔で採取し、遠心してペレットを-20℃で貯蔵した。ペレットをトリス/HClバッファー(50 mM、pH 8.0)において再懸濁し、細胞懸濁液をSDS-PAGEを介して分析した(図16)。
高細胞密度の発酵において大腸菌分泌系を使用した単鎖抗体の発現
大腸菌W3110を、プラスミドpBW22-pelB-S1で形質転換した。プラスミドは異なるクローンから単離され、制限分析によって確認され、一つのクローンがさらなる実験のために使用された。振盪フラスコ内の前培養液は、Lonzaのバッチ相培地内の単一のコロニーから接種を受けた。前培養を使用して20 Lの発酵槽に接種した。細胞をLonzaの高細胞密度発酵法に従って増殖させた。培養液のサンプル(10 ml)を、ラムノース誘導前後の異なる時間点で採取した。細胞を10’000 gの遠心分離によって発酵培地から分離した。無細胞発酵培地からのサンプルのSDSゲル分析は、増加した密度で28.4 kDにタンパク質のバンドを示す。このタンパク質は、増殖培地から発酵培地に放出された単鎖抗体S1である。Agilent 2100 バイオアナライザーで行われたS1タンパク質の定量化(Agilent, Palo Alto, USA)は、ラムノース誘導後の発酵ブロス中において2g/L/100 OD600 S1タンパク質までの蓄積を示した。細胞ペレットのリゾチーム処理後、不溶性タンパク質ペレットは、微量のS1タンパク質のみを含むが、可溶性タンパク質画分(上清)は、約1 g/L/100 OD600に相当する強いS1タンパク質バンドを示した(図17を参照)。
Claims (10)
- a)i)抗体をコードする核酸配列と、
ii)周辺質結合タンパク質LamBおよびMalEのシグナルペプチドから選択された、前記核酸配列に対して機能的に連結された原核生物のシグナル配列と
を含む転写単位に機能的に連結されたL-ラムノース オペロンのrhaBADプロモーター領域を含むベクターを構築することと、
ここで、前記転写単位は、当該転写単位の翻訳の開始点の上流の翻訳開始領域を含み、前記翻訳開始領域が配列AGGAGATATACAT(配列番号2)からなり、前記翻訳開始領域が前記核酸配列に対して機能的に連結され、当該核酸配列の発現が前記プロモーター領域によって制御される、
b)前記ベクターで大腸菌を形質転換することと、
c)適切な条件下で細胞培養系において抗体を発現させることと、
d)前記抗体を前記細胞培養系から回収することと
を含む大腸菌において抗体を産生する方法。 - 前記rhaBADプロモーターが、配列番号1の配列、またはその相補的な配列からなる請求項1に記載の方法。
- 前記rhaBADプロモーター領域および前記機能的に連結された転写単位が、配列番号3の配列またはその相補的な配列からなる請求項1に記載の方法。
- 前記rhaBADプロモーター領域および前記機能的に連結された転写単位が、配列番号4の配列またはその相補的な配列からなる請求項1に記載の方法。
- 前記産生された抗体がFab断片である請求項1に記載の方法。
- 当該Fab断片の重鎖および軽鎖が、等量で前記細胞培養系において発現される請求項5に記載の方法。
- 前記Fab断片の当該重鎖および当該軽鎖が、ジシストロニックな転写単位によってコードされ、当該各鎖が前記原核生物のシグナル配列と前記転写単位の当該翻訳の開始点の上流にある同一の翻訳開始領域とに対して機能的に連結される請求項5または6に記載の方法。
- 前記転写単位が転写終結領域をさらに含み、当該転写終結領域がrrnB転写終結配列である請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが、自律的または自己複製的プラスミド、コスミドまたはファージである請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体の発現が、グリセロール含有培地中において行われる請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
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