ES2346506A1 - "ciclooligoros anfifilicos policationicos y su uso como transportadores moleculares.". - Google Patents
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Abstract
Ciclooligosacáridos anfifílicos policatiónicos y su uso como transportadores moleculares. La presente invención se refiere a un grupo de ciclooligosacáridos anfifílicos policatiónicos que, debido a su estructura molecular, pueden ser usados como transportadores de moléculas al interior de las células. Asimismo, la presente invención también se refiere al uso de dichos compuestos en la elaboración de un medicamento, al uso de este medicamento para terapia génica y a una composición farmacéutica que comprenda uno de dichos compuestos.
Description
Ciclooligosacáridos anfifílicos policatiónicos y
su uso como transportadores moleculares.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se encuadra dentro del
campo de la biología molecular y biomedicina. Específicamente, se
refiere a un grupo de ciclooligosacáridos anfifílicos
policatiónicos, a su uso como transportador de moléculas al interior
de las células, al uso de dichos compuestos en la elaboración de un
medicamento, al uso de este medicamento para terapia génica y a una
composición farmacéutica que comprenda uno de dichos compuestos.
El uso de compuestos macrocíclicos como moldes
moleculares para lograr un alineamiento preciso de elementos
funcionales representa una estrategia interesante para el diseño de
receptores o ligandos artificiales capaces de emular los
acontecimientos supramoleculares que se producen en organismos vivos
o de interferir con ellos. Los ciclomaltooligosacáridos
(ciclodextrinas, CDs) son, en este sentido, plataformas
macrocíclicas privilegiadas para estos fines, ya que combinan
biocompatibilidad, disponibilidad, una estructura simétrica tubular
con caras bien diferenciadas y son susceptibles de funcionalización
química controlada (Vargas-Berenguel et al.
2007. Mini-Rev. Org. Chem. 4,
1-14; García Fernández et al. 2006. J.
Ind. Phenom. Macrocycl. yhyuyujjuChem. 56,
149-159). Además, los derivados de ciclodextrina
tienen la capacidad de incluir otras moléculas en su cavidad interna
para formar complejos de inclusión. Por ejemplo, CDs químicamente
modificadas se han incorporado en polímeros policatiónicos que son
capaces de complejar y liberar eficazmente plásmidos de ADN (ADNp)
con biocompatibilidad y eficacia elevadas (Davis y Brewster. 2004.
Nat. Rev. Drug. Discov. 3, 1023-1035). La
superficie de las partículas correspondientes puede
modificarse
posteriormente mediante la unión no covalente de entidades químicas que pueden interactuar con la cavidad de la CD.
posteriormente mediante la unión no covalente de entidades químicas que pueden interactuar con la cavidad de la CD.
Los ejemplos mencionados ponen de manifiesto el
interés de los derivados policatiónicos de CDs para la complejación
y el transporte de otras moléculas, especialmente si son de
naturaleza aniónica. Sin embargo, su carácter polimérico y
polidisperso representa una limitación importante para el desarrollo
de aplicaciones, en particular en el campo de la biomedicina. Se han
preparado algunos ejemplos de derivados de CDs de naturaleza
molecular mediante la funcionalización de los hidroxilos primarios
de los ciclooligosacáridos naturales, pero su eficacia a la hora de
proteger una biomolécula como el ADN y conducirla a una célula diana
es relativamente baja (Srinivasacchari et al. 2008. J.
Am. Chem. Soc. 130, 4618-4627; Mourtzis et
al. 2008. Chem. Eur. J. 14, 4188-4200).
Aunque dicha eficacia puede aumentarse proporcionando carácter
anfifílico a las CDs policatiónicas (Díaz-Moscoso
et al. 2008. Chem. Commun.
2001-2003), la elaboración de este tipo de
compuestos está muy limitada por la baja eficacia que en general
tienen los métodos de acoplamiento múltiple sobre las CDs. Existe
por tanto una necesidad de desarrollar nuevas estructuras de
ciclodextrinas policatiónicas anfifílicas que puedan prepararse con
alta eficacia y que sean capaces de complejar y transportar
eficazmente otras moléculas, incluyendo en particular biomoléculas
polianiónicas tales como ácidos nucleicos (ADN o ARN).
Los autores de la presente invención han
encontrado una familia de derivados macrocíclicos anfifílicos
policatiónicos con unas propiedades que los convierten en vehículos
idóneos para introducir moléculas al interior de las células.
En un primer aspecto, la presente invención se
refiere a un compuesto de fórmula (I)
donde:
\global\parskip1.000000\baselineskip
- \quad
- n es 4, 5 ó 6;
- \quad
- R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} o acilo; donde al menos uno de R^{1} y R^{2} es diferente de H;
- \quad
- X se selecciona entre -CH_{2}- o -CH_{2}YR^{3};
- \quad
- donde Y se selecciona entre O ó S, R^{3} es -(CH_{2})_{p}-NH-CO-(CH_{2})_{q}- donde p y q pueden tener independientemente un valor comprendido entre 1 y 10.
- \quad
- R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente entre hidrógeno y -(CH_{2})_{r}-[(NH)-(CH_{2})_{s}]_{t}-NH_{2}; donde r puede tener un valor comprendido entre 1 y 10, s puede tener un valor entre 2 y 10 y t puede tener un valor comprendido entre 0 y 4.
- \quad
- o sus sales orgánicas o inorgánicas.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente invención el término
"alquilo" se refiere a radicales de cadenas de hidrocarburos
lineales o ramificadas, que consisten en átomos de carbono e
hidrógeno, que pueden o no contener insaturaciones, que tienen de
uno a veinte átomos de carbono y que están unidas al resto de la
molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo,
n-propilo, i-propilo, n- butilo,
t-butilo, n-pentilo, etc. Los
radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o
más sustituyentes tales como un arilo, halógeno, hidroxilo,
alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo,
amino, nitro, mercapto, alquiltio, etc.
El término "acilo" se refiere, en la
presente invención, a un derivado de ácido carboxílico por
eliminación de un grupo hidroxilo. Los grupos acilo tienen como
fórmula general Ra-CO-, donde Ra es un grupo alquilo
con las acepciones anteriores y preferiblemente se refiere a grupos
alquilo (C_{1}-C_{20}). donde alquilo es como
definido anteriormente.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), donde R^{1} y
R^{2} son C_{2}-C_{14} alquilo o acilo.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), donde X es
-CH_{2}-.
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), donde X es
-CH_{2}YR^{3} Y es azufre, R^{3} es
-(CH_{2})_{p}-NH-CO-(CH_{2})_{q}-,
p es 2 y q es 1.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I), donde R^{4} y
R^{5} son
-(CH_{2})_{r}[(NHMCH_{2})_{s}]_{t}-NH_{2},
donde r tiene un valor de 1, s tienen un valor de 2 y t tiene un
valor comprendido entre 0 y 4.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde su sal se
selecciona entre el grupo formado por acetato, trifluoroacetato,
propionato, benzoato, metanosulfonato y
trifluorometanosulfonato.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde su sal se
selecciona entre el grupo formado por cloruro, bromuro y yoduro. Más
preferiblemente, dicha sal es cloruro.
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere al compuesto de fórmula (I) donde n es 5.
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) que se selecciona
entre el siguiente grupo:
-
Heptakis[6-(4-aminometil-1H-1,2,3-triazol-1-il)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(4-(2,2-diaminoetilaminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(4-(2,2-diaminoetilaminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-6-desoxi-2,3-di-O-miristoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(2-(4-aminometil-1H-1,2,3-triazol-1-il)acetamidoetiltio)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]ciclomaltohep-
taosa
taosa
-
Heptakis[6-(2-(4-(2,2-diaminoetilaminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)
acetamidoetiltio)-6-desoxi-2,3-di-O-hexa-
noil]ciclomaltoheptaosa
noil]ciclomaltoheptaosa
En una realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde alguno de
los grupos amino terminales está sustituido con un fluorocromo.
En la presente invención, el término
"fluorocromo" se refiere a un componente de una molécula que
hace que ésta sea fluorescente. Es un grupo funcional de la molécula
que absorberá energía de una longitud de onda específica y la
volverá a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda (es
decir, con menor energía). La cantidad de energía emitida y su
longitud de onda dependen tanto del propio fluorocromo como de su
ambiente químico. Algunos ejemplos de fluorocromos que pueden ser
empleados en la presente invención, pero sin limitarse, son
rodamina, fluoresceína o dansilo.
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde alguno de
los grupos amino terminales está sustituido con un grupo que
incorpora al menos un ligando capaz de ser reconocido por un
receptor celular.
En la presente invención, el término "receptor
celular" se refiere a un componente de la superficie de la célula
que reconoce o interacciona de manera específica con una molécula o
"ligando". La interacción del ligando con el receptor celular
puede favorecer, por ejemplo, la distribución selectiva a una
determinada célula diana.
Más preferiblemente, este ligando se selecciona
entre un mono u oligosacárido, un anticuerpo monoclonal o un
derivado de ácido fólico. Aún más preferiblemente, el mono u
oligosacárido se selecciona entre mañosa, galactosa, glucosa,
N-acetilglucosamina, ácido siálico, lactosa ó un
oligosacárido formado a partir de cualquiera de ellos o sus
combinaciones.
En la presente invención el término
"monosacárido" se refiere a los glúcidos más sencillos, que no
se hidrolizan, es decir, que no se descomponen para dar otros
compuestos, conteniendo de tres a seis átomos de carbono. Su fórmula
empírica es (CH_{2}O)_{n} donde n \geq 3. La
cadena carbonada de los monosacáridos no está ramificada y todos los
átomos de carbono menos uno contienen un grupo alcohol (-OH). El
átomo de carbono restante tiene unido un grupo carbonilo (C=O). Si
este grupo carbonilo está en el extremo de la cadena se trata de un
grupo aldehido (-CHO) y el monosacárido recibe el nombre de aldosa.
Ejemplos de aldosas, pero sin limitarse a, son gliceraldehído,
eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa,
glucosa, mañosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa. Si el carbono
carbonílico está en cualquier otra posición, se trata de una cetona
(-CO-) y el monosacárido recibe el nombre de cetosa. Ejemplos de
cetosa, pero sin limitarse a, son dihidroxiacetona, eritrulosa,
ribulosa, xilulosa, sicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa.
En la presente invención el término
"oligosacárido" se refiere a un polímero formado a partir de
monosacáridos unidos por enlaces O-glicosídicos, con
un número de unidades monoméricas entre 3 y 10. Dentro de los
oligosacáridos destacan los disacáridos, que son oligosacáridos
formados por la unión de dos monosacáridos iguales o distintos
mediante enlace O-glucosídico (con pérdida de una
molécula de agua), mono o dicarbonílico, que además puede ser
\alpha o \beta en función del -OH hemiacetal o hemicetal. Los
disacáridos más comunes son, sin limitarse a, glucoas, fructosa,
lactosa, maltosa, isomaltosa, trehalosa y celobiosa.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
del compuesto de fórmula (I) como vehículo transportador de, al
menos, una molécula al interior de una célula.
El término "transportador" o
"carrier", tal y como se utiliza en la presente descripción, se
refiere a la capacidad del compuesto de la invención para
transportar una molécula al interior de una célula. En el ejemplo 2
de la patente, se utiliza un ácido nucleico como molécula para
ilustrar el potencial del compuesto de la invención para actuar como
transportador penetrante de células. Sin embargo, la molécula que
puede ser introducida mediante el uso del compuesto de la invención
puede ser de muy diversa naturaleza, por ejemplo, pero sin
limitarse, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico, un
péptido, una proteína, una glicoproteína, un carbohidrato, un
lípido, un glicolípido, una sonda fluorescente o un medicamento. En
el ejemplo 2, el plásmido de ADN se administra a células de ovario
de hámster chino tipo salvaje (CHO-k1; nº ATCC
CCL-61). Sin embargo, el compuesto de la invención
es útil para introducir una molécula en otros tipos de células
eucariotas y también en células procariotas.
Una realización preferida de este aspecto de la
invención se refiere al uso de los compuestos de la invención como
transportadores de ácidos nucleicos al interior de una célula.
El ácido nucleico, puede ser un ácido
desoxirribonucleico, como, por ejemplo, pero sin limitarse, ADN de
cadena doble, ADN de cadena simple o ADN circular, o un ácido
ribonucleico, como por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ARN de
interferencia de señal (siRNA). El compuesto de la invención puede
ser empleado para introducir más de un tipo de molécula, por
ejemplo, dos secuencias de ADN diferentes.
En una realización más preferida el ácido
nucleico es ADN. En una realización aún más preferida, el ADN es de
cadena doble. En una realización aún más preferida, el ADN de cadena
doble es circular.
En otra realización más preferida el ácido
nucleico es ARN. En una realización aún más preferida, el ARN es un
ARN de interferencia de señal (siRNA).
\newpage
Los transportadores de ácidos nucleicos también
se denominan vectores. Tal como se utiliza en la presente invención
el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el
proceso de transferencia de un ácido nucleico exógeno al interior de
una célula, permitiendo de este modo la vehiculación del ácido
nucleico al interior de una célula.
El compuesto de la invención se puede emplear,
por tanto, como agente de transformación o de transfección. El
término "transformación", tal y como se utiliza en la presente
descripción, se refiere a la introducción de un ácido nucleico
exógeno al interior de una célula procariota. El término "agente
de transformación", tal y como se utiliza en la presente
descripción, se refiere a un transportador penetrante de un ácido
nucleico al interior de una célula procariota. El término
"transfección", tal y como se utiliza en la presente
descripción, se refiere a la introducción de un ácido nucleico
exógeno al interior de una célula eucariota. El término "agente de
transfección", tal y como se utiliza en la presente descripción,
se refiere a un transportador penetrante de un ácido nucleico al
interior de una célula eucariota.
Una realización preferida de este aspecto de la
invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) como agente
de transformación de ácidos nucleicos al interior de una célula
procariota.
Otra realización preferida de este aspecto de la
invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) como agente
de transfección de ácidos nucleicos al interior de una célula
eucariota.
El compuesto de la invención puede servir para
transportar, al menos, una molécula con capacidad terapéutica al
interior de una célula de un organismo, preferiblemente un mamífero
y, más preferiblemente, un humano. En el ejemplo 2, se muestra la
capacidad del los compuesto de la invención para introducir un ácido
nucleico en el interior de una célula eucariota. Por tanto, el
compuesto de la presente invención es útil como vector capaz de
transferir un ácido nucleico profiláctico, de diagnóstico o
terapéutico en el contexto de la terapia génica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un
medicamento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
al uso del medicamento descrito anteriormente para terapia
génica.
El término ``medicamento para terapia génica,
tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un
producto obtenido mediante un conjunto de procesos de fabricación
destinados a transferir, bien in vivo bien ex vivo, un
ácido nucleico profiláctico, de diagnóstico o terapéutico a células
animales, preferiblemente humanas, y su posterior expresión in
vivo. La transferencia genética supone un sistema de expresión
contenido en un sistema de distribución conocido como vector, de
origen viral o no viral, que puede incluirse asimismo en una célula
animal. Entre los medicamentos de terapia génica se encuentran, pero
sin limitarse los siguientes, ácido nucleico desnudo, vectores no
virales, vectores virales o células modificadas genéticamente, Puede
tratarse de medicamentos de terapia génica basados en células
autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de
otro ser humano) o xenogénicas (de animales).
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la
composición farmacéutica comprende, además, un vehículo
farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida de la
presente invención, la composición farmacéutica comprende además,
junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio
activo.
Como se emplea aquí, los términos "principio
activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente
activa", "ingrediente activo" o "ingrediente
farmacéuticamente activo" se refiere a cualquier componente que
potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto
diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o
prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función
del cuerpo del ser humano u otros animales.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden formularse para su administración en una variedad de formas
conocidas en el estado de la técnica. Tales composiciones y/o sus
formulaciones pueden administrarse a un animal y, más
preferiblemente, a un mamífero, incluyendo a un humano, en una
variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a parenteral,
intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal,
intraestromal, intraaricular, intrasinovial, intratecal,
intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiaca,
intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, o
tópica.
La dosificación para obtener una cantidad
terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como,
por ejemplo, edad, peso, sexo o tolerancia del animal. En el sentido
utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la
composición farmacéuticamente efectiva que produzca el efecto
deseado y, en general, vendrá determinada entre otras causas, por
las características propias de dicha composición farmacéutica y del
efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" o
"vehículos" farmacéuticamente aceptables que pueden ser
utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el
estado de la técnica.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Figura 1. Muestra una representación esquemática
de la síntesis de derivados de \betaCD policatiónicos anfifílicos
rígidos 9-11.
Figura 2. Muestra una representación esquemática
de la síntesis de derivados de \betaCD policatiónicos anfifílicos
flexibles 16 y 17.
Figura 3. Representa un ensayo de desplazamiento
por electroforesis en gel que muestra la unión de los derivados de
\betaCD anfifílicos (9-11, 16 y 17) o no
anfifílicos 18 y 19) al ADNp al aumentar las relaciones de N/P (a) y
la cuantificación de la intensidad de las bandas (b).
Figura 4. Muestra la cuantificación de la
intensidad relativa (valor de ADNp sin tratar igual a 100) de la
suma de bandas electroforéticas de ADNp relajado y superenrollado
correspondientes a las muestras de ADNp complejadas con la
ciclodextrinas policatiónicas anfifílicas 9-11, 16 y
17 y tratadas con ADNasa I. Los datos representan la desviación
estándar de la media (n = 4). Se incluyen los datos para los
derivados no anfifílicos 18 y 19 como elementos de comparación.
Figura 5. Muestra la eficacia de la transfección
de genes in vitro de los complejos con ADNp de
9-11,16 y 17 en células CHO-k1 en
comparación con complejos derivados de derivados policatiónicos no
anfifílicos (18 y 19), poliplejos basados en Lipofectamine™ 2000
(LP) y ADN desnudo (control). Los datos representan la desviación
estándar de la media (n = 8).
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la
naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen
solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los
ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el
campo de aplicación de la misma.
Materiales. Los siguientes derivados,
utilizados en la preparación de los compuestos de la invención, se
prepararon siguiendo métodos descritos en la bibliografía:
.-
heptakis(6-azido-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil)ciclomaltoheptaosa
(1) (Defaye et al. WO2008009831).
.-
heptakis(6-azido-6-desoxi-2,3-di-O-miristoil)ciclomaltoheptaosa
(2) (Defaye et al. WO2008009831).
.-
N-(terc-butoxicarbonil)propargilamina (3) (Wu
et al. 2007. J. Org. Chem. 72,
2897-2905),
.-
bis[2-(terc-butoxicarbonilamino)etil]amina
(Westerberg et al. 1989. J. Med. Chem. 32,
236-243), y
.- heptahidrocloruro de
heptakis[6-(2-aminoetiltio)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]-ciclomaltoheptaosa
(5) (Díaz-
Moscoso et al. 2008. Chem. Commun. 2001-2003).
Moscoso et al. 2008. Chem. Commun. 2001-2003).
3-[Bis(2-(terc-butoxicarbonilamino)etil)amino]propino
(4) se preparó a partir de
bis[2-(terc-butoxicarbonilamino)etil]amina
como se detalla: a una solución de
bis[2-(terc-butoxicarbonilamino)etil]amina
(872 mg, 2,86 mmol) y Et_{3}N (1,2 mL, 8,6 mmol, 3,0 eq) en
CH_{3}CN (15 mL), se añadió bromuro de propargilo (0.90 mL, 8,6
mmol, 3,0 eq) y la mezcla se agitó a ta durante 2 h. Se eliminó el
disolvente a vacío y el residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (100
mL), se lavó con agua (3 x 30 mL), se secó (MgSO_{4} y se
concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en
columna (30:1 en CH_{2}Cl_{2}-MeOH).
Rendimiento: 567 mg (58%); R_{f} = 0.22 (50:1
CH_{2}Cl_{2}-MeOH); ^{1}H NMR (300 MHz,
CDCl_{3}): \delta 4.93 (bs, 2 H, NH), 3.42 (d, 2 H,
^{4}J_{H,H} = 2.4 Hz, CH_{2}C\equivCH), 3.20
(q, 4 H, ^{3}J_{H,H} = 5.7 Hz, CH_{2}NHBoc), 2.64 (t, 4
H, CH_{2}CH_{2}NHBoc), 2.20 (t, 1 H, C\equivCH), 1.45 (s, 18
H, CMe_{3}); ^{13}C NMR (75.5 MHz, CDCl_{3}): \delta 156.0
(CO), 79.2 (C_{q}), 77.9 (C\equivCH), 73.4
(C\equivCH), 52.8 (CH_{2}CH_{2}NHBoc), 41.8
(HC\equivCCH_{2}), 38.0 (CH_{2}NHBoc), 28.4
(CMe_{3}). EM-ESI: m/z 364.2 [M +
Na]^{+}, 342.2 [M + H]^{+}.
El plásmido pEGFP-N3 (n° de
registro de Genbank: U57609) se obtuvo de Clontech Laboratories,
Palo Alto, CA). Este plásmido de 4729 pb codifica una variante
desplazada hacia el rojo de GFP de tipo salvaje. El plásmido se
purificó a partir de bacterias transfectadas usando procedimientos
habituales (Sterzel et al. 1985. Anal. Biochem. 147,
462-467). La concentración de ADN se midió usando un
procedimiento fluorimétrico usando el colorante Hoechst 33258.
A una disolución de 1 (765 mg, 0,28 mmol) y
N-terc-butoxicarbonilpropargilamina
(3, 405 mg, 2,59 mmol, 1,3 eq) en acetona (10 ml) se añadieron
Cul\cdot(EtO)_{3}P (71 mg, 200 \mumol, 0,3 eq) y
DIPEA (0,34 ml, 0,29 mmol, 1 eq) y la mezcla de reacción se sometió
a reflujo durante 3 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y
el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna (50:1
\rightarrow 20:1 de CH_{2}Cl_{2}-MeOH).
Rendimiento: 871 mg (81%). R_{f} 0,47 (15:1 de
CH_{2}Cl_{2}-MeOH); [\alpha]_{D} =
+24,7 (c 1,0, CHCl_{3}). RMN "^{1}"H (500 MHz,
CDCl_{3}, 313 K): \delta 7,62 (s, 7 H, =CH), 5,45 (s, 7 H,
H-1), 5,40 (s, 7 H, NHBoc), 5,38 (t, 7 H,
J_{2,3} = J_{3,4} = 8,0 Hz, H-3),
4,86 (da, 7 H, J_{6a,6b} = 13,7 Hz, H-6a),
4,75 (dd, 7 H, J_{1,2} = 2,1 Hz, H-2), 4,57
(sa, 7 H, H-6b), 4,48 (sa, 7 H,
H-5), 4,29 (dd, 7 H, ^{2}J_{H,H} = 15,2 Hz,
J_{CH,NH} = 5,4 Hz, CHaNHBoc), 4,18 (dd, 7 H,
J_{CH,NH} = 3,0 Hz, CHbNHBoc), 3,55 (t, 7 H,
J_{4,5} = 8,0 Hz, H-4),
2,36-2,13 (m, 28 H, CH_{2}CO), 1,57 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1,40 (s, 63 H, CMe_{3}), 1,30 (m, 56
H, CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,90
(t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,0 Hz, CH_{3}). RMN ^{13}C
(125,7 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 172,9, 171,6 (CO éster),
155,8 (CO carbamato), 145,2 (C-4 triazol), 124,6
(C-5 triazol), 96,4 (C-1), 79,5
(C-4, C_{q}), 70,1 (C-3), 69,8
(C-5), 69,6 (C-2), 50,2
(C-6), 36,1 (CH_{2}NHBoc), 33,8 (CH_{2}CO),
31,4, 31,2 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 28,3 (CMe_{3}),
24,3 (CH_{2}CH_{2}CO), 22,3 (CH_{2}CH_{3}),
13,8 (CH_{3}). EM-ESI: m/z 1908,1 [M + 2
Na]^{2+}.
A una disolución de 1 (156 mg, 58 \mumol) y
3-bis[2-(terc-
butoxicarbonilamino)etil]aminopropino (4, 182 mg, 0,53
mmol, 1,3 eq) en acetona (10 ml) se añadió
Cul(EtO)_{3}P (15 mg, 41 \mumol, 0,1 eq) y la
mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 h. El disolvente
se evaporó a vacío y el residuo se purificó por cromatografía en
columna (30:1 \rightarrow 9:1 de
CH_{2}Cl_{2}-MeOH). Rendimiento: 256 mg (87%);
R_{f} = 0,61 (9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH);
[\alpha]_{D} = +25,9 (c 1,0, CH_{2}Cl_{2});
RMN ^{1}H (400 MHz, CDCl_{3}, 323 K): \delta 7,73 (s, 7 H,
=CH), 5.44 (d, 7 H, J_{1,2} = 3.2 Hz, H-1),
5,36 (t, 7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 8,7 Hz,
H-3), 5,21 (sa, 14 H, NHBoc) 4,90 (da, 7 H,
J_{6a,6b} = 13,6 Hz, H-6a), 4,75 (dd, 14 H,
H-2, H-6b), 4,51 (m, 7 H,
H-5), 3,78, 3,74 (2 d, 14 H, ^{2}J_{H,H}
= 15,6 Hz, CH_{2}N), 3,53 (t, 7 H, J_{4,5} = 8,5 Hz,
H-4), 3,16 (q, 28 H, ^{3}J_{H,H} = 5,6
Hz, CH_{2}NHBoc), 2,56 (t, 28 H,
CH_{2}CH_{2}NHBoc), 2,45-2,13 (m, 28 H,
CH_{2}CO), 1,60 (m, 28 H, CH_{2}CH_{2}CO), 1,44 (sa,
126 H, CMe_{3}), 1,30-1,20 (m, 56 H,
CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,94,
0,93 (2 t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,2 Hz,
^{3}J_{H,H} = 6,8 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C (100,6
MHz, CDCl_{3}, 323 K): \delta 172,7, 171,5 (CO éster), 156,0 (CO
carbamato), 143,6 (C-4 triazol), 125,4
(C-5 triazol), 96,5 (C-1), 78,8
(C-4, C_{q}), 70,0 (C-3), 69,7
(C-5), 69,3 (C-2), 53,0
(CH_{2}CH_{2}NHBoc), 50,0 (C-6), 48,0
(CH_{2}N), 38,5 (CH_{2}NHBoc), 33,8, 33,5 (CH_{2}CO),
31,1, 31,0 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 28,3
(CMe_{3}), 24,1 (CH_{2}CH_{2}CO), 22,1
(CH_{2}CH_{3}), 13,6 (CH_{3}); EM-ESI:
m/z 2558,2 [M + 2 Na]^{2+}, 1713,6 [M + 3
Na]^{3+}.
Una disolución de
heptakis[6-azido-6-desoxi-2,3-di-O-miristoil]ciclomaltoheptaosa
(2, 50 mg, 11 \mumol),
3-bis[2-(terc-butoxicarbonilamino)etil]aminopropino
(4, 34 mg, 0,1 mmol, 1,3 eq), Cul(EtO)_{3}P (3 mg,
8 \mumol, 0,1 eq) y N-etildiisopropilamina (13
\mul, 80 \mumol, 1 eq) en acetona (5 ml) se sometió a reflujo
durante 6 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y el
residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 \rightarrow
9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH) para dar un sólido amorfo.
Rendimiento: 61,3 mg (80%). [\alpha]_{D} = +26,2
(c 0,9, CH_{2}Cl_{2}): R_{f} = 0,51 (9:1 de
CH_{2}Cl_{2}-MeOH); RMN ^{1}H (500 MHz,
CDCl_{3}, 333 K): \delta 7,28 (s, 7 H, =CH), 5.45 (s, 7 H,
H-1), 5,38 (t, 7 H, J_{2,3} =
J_{3,4} = 9,2 Hz, H-3), 5,19 (sa, 14 H,
NHBoc), 4,90 (d, 7 H, J_{6a,6b} - 13,7 Hz,
H-6a), 4,75 (dd, 14 H, J_{1,2} = 3,6 Hz,
H-2, H-6b), 4,53 (m, 7 H,
H-5), 3,78 (2d, 14 H, ^{2}J_{Ha,Hb} =
15,7 Hz, CH_{2}N), 3,55 (t, 7 H, J_{4,5} = 8,1 Hz,
H-4), 3,18 (qa, 28 H, ^{3}J_{H,H} = 5,2
Hz, CH_{2}NHBoc), 2,58 (sa, 28 H,
CH_{2}CH_{2}NHBoc), 2,44-2,15 (m, 28 H,
CH_{2}CO), 1,60-1,54 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1.46 (s, 126 H, CMe_{3}),
1,38-1,29 (m, 280 H, (CH_{2})_{10}), 0,92
(t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 6,5 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C
(125,7 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 172,9, 171,7 (CO éster),
156,2 (CO carbamato), 143,6 (C-4 triazol), 125,7
(C-5 triazol), 96,6 (C-1), 79,0
(C-4, C_{q}), 70,1 (C-3), 69,7
(C-5, C-2), 53,1
(CH_{2}CH_{2}NHBoc), 50,1 (C-6), 48,0
(CH_{2}N), 38,4 (CH_{2}NHBoc), 34,0, 33,7 (CH_{2}CO),
31,9 (CH_{3}CH_{2}CH_{2}), 29,8-28,9
(CH_{3}CH_{2}CH_{2}(CH_{2})_{7}), 28,5
(CMe_{3}), 24,6 (CH_{2}CH_{2}CO), 22,5
(CH_{3}CH_{2}), 14,0 (CH_{3}); EM-ESI:
m/z 2228,6 [M + 2 Na + H]^{3+}, 1681,2 [M +K + 2 Na
+ H]^{4+}.
El tratamiento del hepta o tetradecacarbamato
correspondiente (6-8, 33 \mumol) con
TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:1, 2 ml) a temperatura
ambiente durante 2 h, seguido de evaporación de los disolventes y
liofilización en una disolución diluida de HCl, dio
9-11 puros.
El compuesto 9 responde a la fórmula (I) en la
que n = 5, los grupos R^{1} y R^{2} son iguales y representan
hexanoilo (CH_{3}(CH_{2})4CO-), X es CH_{2}, y
R^{4} y R^{5} son iguales y representan hidrógeno, en forma de
la correspondiente sal de heptahidrocloruro.
Rendimiento: 106,4 mg (99%);
[\alpha]_{D} = +31,5 (c 1,0, MeOH); RMN ^{1}H
(500 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta 7,98 (s, 7 H, =CH), 5,49 (t,
7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 9,3 Hz,
H-3), 5,46 (s, 7 H, H-1), 4,88 (d, 7
H, J_{6a,6b} = 14,0 Hz, H-6a), 4,78 (dd, 7
H, J_{1,2} = 2,1 Hz, H-2), 4,65 (s, 7 H,
H-6b), 4,53 (sa, 7 H, H-5), 3,91 (s,
14 H, CH_{2}NH_{2}), 3,67 (t, 7 H, J_{4,5} =
8,5 Hz, H-4), 2,47-2,21 (m, 28 H,
CH_{2}CO), 1,64 (m, 28 H, CH_{2}CH_{2}CO), 1,36 (m, 56
H, CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,94
(t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,0 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C
(125,7 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta 174,3, 173,4 (CO éster),
145,5 (C-4 triazol), 126,8 (C-5
triazol), 98,1 (C-1), 78,8 (C-4),
71,5 (C-5), 71,1 (C-3,
C-2), 51,6 (C-6), 36,5
(CH_{2}NH_{2}), 35,0, 34,9 (CH_{2}CO), 32,5, 32,4
(CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 25,5
(CH_{2}CH_{2}CO), 23,4 (CH_{2}CH_{3}), 14,2
(CH_{3}); EM (ESI): m/z 1023,9 [M + 3 H]^{3+},
1535,3 [M + 2 H]^{2+}.
El compuesto 10 responde a la fórmula (I) en la
que n = 5, los grupos R^{1} y R^{2} son iguales y representan
hexanoilo (CH_{3}(CH_{2})_{4}CO-), X es
CH_{2}, y R^{3} y R^{4} son iguales y representan
2-aminoetilo
(NH_{2}(CH_{2})_{2}-). en forma de la
correspondiente sal de tetradecahidrocloruro.
Rendimiento: 136,4 mg (99%);
[\alpha]_{D} = +18,5 (c 1,0, MeOH); RMN ^{1}H
(500 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta 8,11 (s, 7 H, =CH), 5,60 (t,
7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 9,9 Hz, H- 3), 5,59 (s, 7
H, H-1), 5,15 (dd, 7 H, J_{6a,6b} = 15,2
Hz, J_{5,6a} = 2,5 Hz, H-6a), 4,58 (dd, 7
H, J_{5,6b} = 3,0 Hz, H-6b), 4,57 (m, 14 H,
J_{1,2} = 3,5 Hz, H-2,
H-5), 3,91, 3,89 (2 d, 14 H,
^{2}J_{Ha,Hb} = 15,3 Hz, CH_{2}N), 3,54 (t, 7 H,
J_{4,5} = 8,9 Hz, H-4), 3,15 (t, 28 H,
^{3}J_{H,H} = 6,0 Hz, CH_{2}NH_{2}), 2,83 (t,
28 H, CH_{2}CH_{2}NH_{2}), 2,49-2,17
(m, 28 H, CH_{2}CO), 1,73-1,58 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1,37 (m, 56 H, CH_{2}CH_{3},
CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 0,94, 0,92 (2 t, 42 H,
^{3}J_{H,H} = 7,1 Hz, ^{3}J_{H,H} = 6,9 Hz,
CH_{3}); RMN ^{13}C (125,7 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta
175,7, 174,6 (CO éster), 144,6 (C-4 triazol), 129,7
(C-5 triazol), 99,2 (C-1), 79,4
(C-4), 73,0 (C-2), 72,9
(C-5), 71,7 (C-3), 53,0
(CH_{2}CH_{2}NH_{2}), 52,6 (C-6), 48,3
(CH_{2}N), 39,4 (CH_{2}NH_{2}), 36,3, 36,2
(CH_{2}CO), 33,9, 33,7 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}),
26,8 (CH_{2}CH_{2}CO), 24,7 (CH_{2}CH_{3}),
15,6 (CH_{3}); EM-ESI: m/z 1837 [M + 2
H]^{2+}, 1225,0 [M + 3 H]^{3+}, 919,0 [M + 4
H]^{4+}, 735,4 [M + 5 H]^{5+}.
El compuesto 11 responde a la fórmula (I) en la
que n = 5, los grupos R^{1} y R^{2} son iguales y representan
miristoilo (tetradecanoilo;
CH_{3}(CH_{2})_{12}CO-), X es CH_{2}, y
R^{4} y R^{5} son iguales y representan
2-aminoetilo
(NH_{2}(CH_{2})_{2}-), en forma de la
correspondiente sal de tetradecahidrocloruro.
Rendimiento: 178,8 mg (99%);
[\alpha]_{D} = +30,7 (c 0,9, CH_{2}Cl_{2});
RMN ^{1}H (500 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta 8,12 (s, 7 H,
=CH), 5,61 (t, 7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 9,3 Hz,
H-3), 5,60 (s, 7 H, H-1), 5,13 (d, 7
H, J_{6a,6b} = 13,9 Hz, H-6a), 4,97 (d, 7
H, H-6b), 4,57 (m, 14 H, H-2,
H-5), 3,90 (2d, 14 H, ^{2}J_{H,H} = 15,3
Hz, CH_{2}N), 3,55 (t, 7 H, J_{4,5} = 9,2 Hz,
H-4), 3,16 (t, 28 H, ^{3}J_{H,H} = 5,5
Hz, CH_{2}NH_{2}), 2,82 (t, 28 H,
CH_{2}CH_{2}NH_{2}), 2,50-2,15 (m, 28
H, CH_{2}CO), 1,80-1,55 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1,50-1,25 (m, 280 H,
CH_{3} (CH2_{2})_{10}CH_{2}CH_{2}CO), 0,93
(t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 6,6 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C
(125,7 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 172,9, 171,8 (CO éster),
142,0 (C-4 triazol), 126,9 (C-5
triazol), 96,6 (C-1), 76,7 (C-4),
70,4 (C-5, C-2), 69,1
(C-3), 50,4 (CH_{2}CH_{2}NH_{2}),
49,9 (C-6), 45,7 (CH_{2}N), 36,7
(CH_{2}NH_{2}), 33,6 (CH_{2}CO), 31,7,
29,8-29,1, 22,3 (CH_{3}
(CH_{2})_{10}CH_{2}CH_{2}CO), 24,6, 24,5
(CH_{2}CH_{2}CO), 13,0 (CH_{3});
EM-ESI: m/z 2622,0 [M + 2 H]^{2+},
1748,4 [M + 3H]^{3+}, 1311,7 [M + 4 H]^{4+},
1049,7 [M + 5 H]^{5+}.
A una disolución del heptahidrocloruro 5 (500
mg, 0,16 mmol) en DMF seca (10 ml), bajo atmósfera de Ar, se añadió
en porciones DMAP (270 mg, 2,24 mmol, 2 eq) y la mezcla se agitó
durante 15 min. Se añadió anhídrido cloroacético (570 mg, 3,36 mmol,
3 eq) y la reacción se agitó adicionalmente durante la noche a ta.
El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió
en CH_{2}Cl_{2}, se lavó con agua ligeramente acidificada (3 x
20 ml), NaHC03 acuoso saturado (3 x 20 ml) y agua (3 x 20 ml). La
fase orgánica se secó (MgS04), se filtró y se concentró. El residuo
se purificó por cromatografía en columna (30:1 de
CH_{2}Cl_{2}-MeOH). Rendimiento: 325 mg (59%);
R_{f} = 0,53 (9:1 de
CH_{2}Cl_{2}-MeOH); [\alpha]_{D} =
+80,3 (c 1,0, CH_{2}Cl_{2}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}l
500 MHz, 313 K) \delta 5,35 (t, 7 H, J_{2,3} =
J_{3,4} = 9,5 Hz, H-3), 5,14 (d, 7 H,
J_{1,2} = 4 Hz, H-1), 4,80 (dd, 7 H,
H-2) 4,21 (m, 7 H, J_{4,5} = 9,0 Hz,
J_{5,6a} = 2,5 Hz, J_{5,6b} = 5,0 Hz,
H-5) 4,11 (2 d, 14 H, ^{2}J_{H,H} = 15,0 Hz,
CH_{2}Cl), 3,82 (t, 7H, H-4), 3,55 (m, 14 H,
CH_{2}NH_{cist}), 3,16 (dd, 7H, J_{6a,6b} = 14,0
Hz, H-6a), 3,10 (dd, 7H, H-6b), 2,85
(2dt, 14 H, ^{2}J_{H,H} = 13,5 Hz, ^{3}J_{H,H}
= 6,5 Hz, CH_{2}S_{cist}), 2,43-2,17 (m, 28 H,
CH_{2}CO), 1,70-1,57 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1,36-1,29 (m, 56 H,
CH_{2}CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{3}), 0,92 (2
t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,0 Hz, ^{3}J_{H,H} =
7,5 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C (125,7 MHz, CDCl_{3}, 313 K)
\delta 173,3, 171,7 (CO éster), 166,5 (CO amida), 96,6
(C-1), 78,6 (C-4), 71,3
(C-5), 70,5(C-2) 70,3
(C-3), 42,7 (CH_{2}Cl), 39,4
(CH_{2}NH_{cist}), 34,1, 33,8 (CH_{2}CO,
C-6), 32,9 (CH_{2}S_{cist}), 31,4, 31,3
(CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 24,3
(CH_{2}CH_{2}CO), 22,3 (CH_{2}CH_{3}), 13,8
(CH_{3}); EM-ESI: m/z 1175,3 [M + 3
Na]^{3+}, 1752 [M + 2 Na]^{2+}, 3477,7 [M +
Na]+.
A una disolución de 12 (109 mg, 31 \mumol) en
DMF seca (10 ml), bajo atmósfera de Ar, se añadió NaN_{3} (43 mg,
0,66 mmol, 3 eq) y la mezcla se agitó durante la noche. El
disolvente se eliminó a vacío y el residuo se disolvió en
CH_{2}Cl_{2} (50 ml), se lavó con H_{2}O (3 x 15 ml), se secó
(MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El residuo resultante se
purificó por cromatografía en columna (50:1 \rightarrow 30:1 de
CH_{2}Cl_{2}:MeOH).Rendimiento: 93,2 mg (89%); R_{f} =
0,48 (9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH), [\alpha]_{D} = +94,0
(c 1,0, CH_{2}Cl_{2}); RMN ^{1}H (CDCl_{3}, 300 MHz)
\delta 5,34 (t, 7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 9,6 Hz,
H-3), 5,12 (d, 7 H, J_{1,2} = 3,6 Hz,
H-1), 4,80 (dd, 7 H, H-2) 4,17 (m, 7
H, H-5) 4,02 (s, 14 H, CH_{2}N_{3}), 3,82 (t, 7
H, J_{4,5} = 8,7 Hz, H-4) 3,51 (m, 14 H,
CH_{2}NH_{cist}), 3,10 (m, 14 H, H-6a,
H-6b), 2,82 (2 dt, 14 H, ^{2}JH,H = 13,8
Hz, ^{3}J_{H,H} = 7,2 Hz, CH_{2}S_{cist}),
2,44-2,12 (m, 28 H, CH_{2}CO)
1,62-1,55 (m, 28 H, CH_{2}CH_{2}CO),
1,34-1,30 (m, 56 H, CH_{2}CH_{2}CH_{3},
CH_{2}CH_{3}), 0,92 (2 t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 11,1
Hz, ^{3}J_{H,H} = 11.4 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C (75,5
MHz, CDCl_{3}, 313 K) \delta 173,7, 172,0 (CO éster), 167,7 (CO
amida), 96,7 (C-1), 78,8 (C-4), 71,5
(C-5), 70,8 (C-2), 70,5
(C-3), 52,8 (CH_{2}N_{3}), 39,2
(CH_{2}NH_{cist}), 34,3, 34,1 (CH_{2}CO), 33,8
(C-6), 33,1 (CH_{2}S_{cist}), 31,7, 31,6
(CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 24,7
(CH_{2}CH_{2}CO), 22,7 (CH_{2}CH_{3}), 14,2
(CH_{3}); EM-ESI: m/z 1774,6 [M + 2
Na]^{2+}.
A una disolución de 13 (45 mg, 13 \mumol) y 3
(40 mg, 0,12 mmol, 1,3 eq) en acetona (5 ml) se añadieron
(EtO)_{3}P\cdotCul (3 mg, 9 \mumol, 0,1 eq) y DI PEA
(15 \mul, 90 \mumol, 1 eq) y la mezcla se sometió a reflujo
durante 4 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y el
residuo se purificó por cromatografía en columna (20:1 \rightarrow
9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH). Rendimiento: 53 mg (89%);
R_{f} = 0,4 (9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH);
[\alpha]_{D} = +67,6 (c 1,0, CH_{2}Cl_{2});
RMN ^{1}H (CD_{3}OD, 500 MHz, 323 K) \delta 7,90 (s, 7 H,
=CH), 5,32 (t, 7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 8,5 Hz,
H-3), 5,15 (d, 7 H, J_{1,2} = 3,6 Hz,
H-1), 5,13 (s, 14 H, CH_{2}CONH), 4,87 (dd,
7 H, H-2), 4,34 (s, 14 H, CH_{2}NHBoc),
4,28 (m, 7 H, H-5), 3,84 (t, 7 H, J_{4,5} =
8,0 Hz, H-4), 3,54 (m, 14 H, CH_{2}NH_{cist}),
3,40 (m, 7 H, H-6a), 3,08 (dd, 7 H,
J_{6a,6b} = 13,9 Hz, J_{5,6b} = 7,0 Hz,
H-6b), 2,88 (m, 14 H, CH_{2}S_{cist}),
2,50-2,22 (m, 28 H, CH_{2}CO),
1,70-1,57 (m, 28 H, CH_{2}CH_{2}CO), 1,42
(s, 63 H, CMe_{3}), 1,40-1,30 (m, 56 H,
CH_{2}CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{3}), 0,96, 0,95 (2 t,
42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,0 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C
(125,7 MHz, CD_{3}OD): \delta 174,5, 173,3 (CO éster), 167,9 (CO
amida), 158,1 (CO carbamato), 147,4 (C-4 triazol),
125,7 (C-5 triazol), 98,3 (C-1),
80,6 (C-4, C_{q}), 72,9 (C-5),
72,1 (C-3), 71,6 (C-2), 53,4
(CH_{2}CONH), 40,7 (CH_{2}NH_{cist}), 37,0
(CH_{2}NHBoc) 35,1 (CH_{2}CO), 32,6, 32,5
(CH_{2}CH_{2}CH_{3}, CH_{2}S_{cist},
C-6), 28,9 (CMe_{3}), 25,5
(CH_{2}CH_{2}CO), 23,4 (CH_{2}CH_{3}), 14,4
(CH_{3}); EM-ESI: (m/z) 4606,9 [M + Na]+,
2317,9 [M + 2 Na]^{2+}, 1552,2 [M + 3
Na]^{3+}.
A una disolución de 13 (48 mg, 14 \mumol) y 4
(44 mg, 0,13 mmol, 1,3 eq) en acetona (5 ml) se añadieron
Cul\cdot(EtO)_{3}P (4 mg, 10 \mumol, 0,1 eq) y DIPEA (17 \mul, 0,1 mmol, 1 eq) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 h. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 \rightarrow 9:1 de CH_{2}Cl_{2}-MeOH) para dar 15. Rendimiento: 65 mg (79%); R_{f} = 0,36 (9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH); [\alpha]_{D} = +51,5 (c 1,0, CH_{2}Cl_{2}); RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 7,81 (s, 7 H, =CH), 5,34 (s, 14 H, NHBoc) 5,26 (t, 7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 7,9 Hz, H-3), 5,10 (m, 21 H, CH_{2}CONH, H-1), 4,76 (da, 7 H, H-2), 4,14 (sa, 7 H, H-5), 3,81 (sa, 14 H, CH_{2}N), 3,72 (ta, 7H, J_{4,5} = 6,95 Hz, H-4), 3,44 (m, 14 H, CH_{2}NH_{cist}), 3,18 (sa, 14 H, CH_{2}NHBoc), 2,98 (sa, 7 H, H-6a), 2,80 (sa, 14 H, CH_{2}S_{cist}), 2,73 (sa, 7 H, H-6b), 2,58 (s, 14 H, CH_{2}CH_{2}NHBoc), 2,42-2,10 (m, 28 H, CH_{2}CO), 1,65-1,50 (m, 28 H, CH_{2}CH_{2}CO), 1,42 (s, 126 H, CMe_{3}), 1,38-1,20 (m, 56 H, CH_{2}CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{3}), 0,95- 0,84 (2 t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,3 Hz, ^{3}J_{H,H} = 7,0 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C (125,7 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 173,4, 171,6 (CO éster), 166,0 (CO amida), 156,3 (CO carbamato) 144,1 (C-4 triazol), 125,1 (C-5 triazol), 96,6 (C-1), 79,1 (C-4, C_{q}), 71,4 (C-5), 70,4 (C-3, C-2), 53,3 (CH_{2}CONH), 52,4 (CH_{2}CH_{2}NHBoc), 48,3 (CH_{2}N), 39,4 (CH_{2}NH_{cist}), 38,4 (CH_{2}NHBoc) 34,0, 33,8 (CH_{2}CO), 32,9 (C-6, CH_{2}S_{cist}), 31,3, 31,2 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 28,5 (CMe_{3}), 24,3 (CH_{2}CH_{2}CO), 22,3 (CH_{2}CH_{3}), 13,8 (CH_{3}); EM-ESI: m/z 2969,7 [M + 2 Na]^{2+}, 2959,0 [M+ H + Na]^{2+}.
Cul\cdot(EtO)_{3}P (4 mg, 10 \mumol, 0,1 eq) y DIPEA (17 \mul, 0,1 mmol, 1 eq) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 h. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 \rightarrow 9:1 de CH_{2}Cl_{2}-MeOH) para dar 15. Rendimiento: 65 mg (79%); R_{f} = 0,36 (9:1 de CH_{2}Cl_{2}:MeOH); [\alpha]_{D} = +51,5 (c 1,0, CH_{2}Cl_{2}); RMN ^{1}H (500 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 7,81 (s, 7 H, =CH), 5,34 (s, 14 H, NHBoc) 5,26 (t, 7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 7,9 Hz, H-3), 5,10 (m, 21 H, CH_{2}CONH, H-1), 4,76 (da, 7 H, H-2), 4,14 (sa, 7 H, H-5), 3,81 (sa, 14 H, CH_{2}N), 3,72 (ta, 7H, J_{4,5} = 6,95 Hz, H-4), 3,44 (m, 14 H, CH_{2}NH_{cist}), 3,18 (sa, 14 H, CH_{2}NHBoc), 2,98 (sa, 7 H, H-6a), 2,80 (sa, 14 H, CH_{2}S_{cist}), 2,73 (sa, 7 H, H-6b), 2,58 (s, 14 H, CH_{2}CH_{2}NHBoc), 2,42-2,10 (m, 28 H, CH_{2}CO), 1,65-1,50 (m, 28 H, CH_{2}CH_{2}CO), 1,42 (s, 126 H, CMe_{3}), 1,38-1,20 (m, 56 H, CH_{2}CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{3}), 0,95- 0,84 (2 t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,3 Hz, ^{3}J_{H,H} = 7,0 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C (125,7 MHz, CDCl_{3}, 313 K): \delta 173,4, 171,6 (CO éster), 166,0 (CO amida), 156,3 (CO carbamato) 144,1 (C-4 triazol), 125,1 (C-5 triazol), 96,6 (C-1), 79,1 (C-4, C_{q}), 71,4 (C-5), 70,4 (C-3, C-2), 53,3 (CH_{2}CONH), 52,4 (CH_{2}CH_{2}NHBoc), 48,3 (CH_{2}N), 39,4 (CH_{2}NH_{cist}), 38,4 (CH_{2}NHBoc) 34,0, 33,8 (CH_{2}CO), 32,9 (C-6, CH_{2}S_{cist}), 31,3, 31,2 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}), 28,5 (CMe_{3}), 24,3 (CH_{2}CH_{2}CO), 22,3 (CH_{2}CH_{3}), 13,8 (CH_{3}); EM-ESI: m/z 2969,7 [M + 2 Na]^{2+}, 2959,0 [M+ H + Na]^{2+}.
El tratamiento del hepta o tetradecacarbamato
correspondiente (14 ó 15, 19 \mumol) con
TFA-CH_{2}Cl_{2} (1:1, 2 ml) a ta durante 2 h,
seguido de evaporación de los disolventes y liofilización en una
disolución diluida de HCl, dio 16 y 17 puros.
El compuesto 16 responde a la fórmula (I) en la
que n = 5, los grupos R^{1} y R son iguales y representan
hexanoilo (CH_{3}(CH_{2})_{4}CO-), X es
-CH_{2}S(CH_{2})_{2}-, y R^{4} y R^{5} son
iguales y representan hidrógeno, en forma de la correspondiente sal
de heptahidrocloruro.
Rendimiento: 72 mg (91%);
[\alpha]_{D} = +22,1 (c 0,8, MeOH); RMN ^{1}H
(500 MHz, CD_{3}OD, 323 K): \delta 8,21 (s, 7 H, =CH), 5,34 (t,
7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 7,9 Hz,
H-3), 5,26 (s, 14 H, CH_{2}CONH), 5,16 (d,
7 H, J_{1,2} = 3,2 Hz, H-1), 4,85 (dd, 7 H,
H-2), 4,33 (s, 14 H, CH_{2}NH_{2}), 4,29
(sa, 7 H, H-5), 3,87 (t, 7 H, J_{4,5} = 7,9
Hz, H-4), 3,54 (m, 14 H,
CH_{2}NH_{cist}), 3,42 (da, 7 H, J_{6a,6b} =
11,4 Hz, H-6a), 3,12 (dd, 7 H, J_{5,6b} =
4,3 Hz, H-6b), 2,91 (m, 14 H, CH_{2}S_{cist}),
2,50-2,20 (m, 28 H, CH_{2}CO), 1,65 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1,45-1,30 (m, 56 H,
CH_{2}CH_{2}CH_{3}, CH_{2}CH_{3}),
1,00-0,92 (2 t, 42 H, ^{3}J_{H,H} = 7,3
Hz, ^{3}J_{H,H} = 6,9 Hz, CH_{3}); RMN ^{13}C (100,3
MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta 173,3, 171,9 (CO éster), 166,3 (CO
amida), 139,7 (C-4 triazol), 126,0
(C-5 triazol), 96,8 (C-1), 79,2
(C-4), 71,2 (C-5), 70,4
(C-3), 70,1 (C-2), 51,8
(CH_{2}CONH), 39,1 (CH_{2}NH_{cist}), 34,9
(CH_{2}NH_{2}), 33,6 (CH_{2}CO, CH_{2}S_{cist},
C-6), 31,5, 31,1 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}),
24,1 (CH_{2}CH_{2}CO), 22,0 (CH_{2}CH_{3}),
13,0, 12,8 (CH_{3}). EM-ESI: m/z 1976,6 [M
+ 2 Na]^{2+}, 1317,8 [M + 3 Na]^{3+}, 988,1 [M
+
2 H + 2 Na]^{4+}.
2 H + 2 Na]^{4+}.
El compuesto 17 responde a la fórmula (I) en la
que n = 5, los grupos R^{1} y R^{2} son iguales y representan
hexanoilo (CH_{3}(CH_{2})_{4}CO-), X es
-CH_{2}S(CH_{2})_{2}-, y R^{4} y R^{5} son
iguales y representan 2-aminoetilo
(NH_{2}(CH_{2})_{2}-), en forma de la
correspondiente sal de tetradecahidrocloruro.
Rendimiento: 81,0 mg (91%).
[\alpha]_{D} = +39,6 (c 1,0 en MeOH); RMN ^{1}H
(500 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta 8,05 (s, 7 H, =CH), 5,36 (t,
7 H, J_{2,3} = J_{3,4} = 8,7 Hz,
H-3) 5,21 (s, 14 H, CH_{2}CONH), 5,17 (d,
7 H, J_{1,2} = 3,5 Hz, H-1), 4,83 (dd, 7 H,
H-2), 4,21 (sa, 7 H, H-5), 3,90 (sa,
21 H, CH_{2}N, H-4), 3,52 (m, 14 H,
CH_{2}NH_{cist}), 3,15 (t, 14 H,
CH_{2}NH_{2}, ^{3}J_{H,H} = 5,5 Hz), 3,11 (m,
7 H, H-6a), 2,88 (m, 21 H, CH_{2}S_{cist},
H-6b), 2,84 (t, 7 H,
CH_{2}CH_{2}NH_{2}), 2,50-2,22 (m, 28
H, CH_{2}CO), 1,73-1,58 (m, 28 H,
CH_{2}CH_{2}CO), 1,43-1,30 (m, 56 H,
CH_{2}CH_{3}), 0,99-0,91 (2 t, 42 H,
^{3}J_{H,H} = 6,9 Hz, ^{3}J_{H,H} = 5,8 Hz,
CH_{3}); RMN ^{13}C (125,7 MHz, CD_{3}OD, 313 K): \delta
176,0, 174,7 (CO éster), 169,2 (CO amida), 145,4
(C-4 triazol), 128,5 (C-5 triazol),
99,5 (C-1), 81,8 (C-4), 74,5
(C-5), 73,0 (C-3,
C-2), 54,4 (CH_{2}CONH), 53,4
(CH_{2}CH_{2}NH_{2}), 49,1 (CH_{2}N), 42,0
(CH_{2}NH_{cist}), 39,6 (CH_{2}NH_{2}) 36,4, 36,3
(CH_{2}CO), 33,8, 33,7 (CH_{2}CH_{2}CH_{3}),
32,0 (C-6, CH_{2}S_{cist}) 26,8
(CH_{2}CH_{2}CO), 24,7 (CH_{2}CH_{3}), 15,7,
15,6 (CH_{3}).
Preparación de complejos a partir de
derivados policatiónicos anfifílicos de \betaCD y plásmido
pEGFP-N3. El plásmido pEGFP-N3,
usado para la preparación de los complejos de ADN y para el ensayo
de transfección, es un plásmido de 4729 pb (pares de bases). Las
cantidades de derivados policactiónicos anfifílicos de \betaCD
usados se calcularon según la concentración de ADN deseada de 0,02
mg/ml (fosfato 50 \muM), la relación de N/P, el peso molecular y
el número de cargas positivas en el derivado de CD seleccionado. Los
experimentos se realizaron para N/P 5, 10, 30 y 50. El ADN se diluyó
en agua mili-Q hasta una concentración final de
fosfato 50 \muM, luego se añadió la cantidad deseada de derivado
de CD a partir de un disolución madre de 20 mg/ml (1:2 de
Me_{2}SO-agua). La preparación se removió con
vórtex durante unos pocos segundos y se incubó durante 30
minutos.
La capacidad de las nuevas CD policatiónicas
anfifílicas para complejar, proteger y transfectar el ADNp fue
analizada mediante ensayos de desplazamiento por electroforesis en
gel, ensayo de protección frente a la acción de ADNasa y análisis de
la eficiencia de transfección del plásmido pEGFP-N3
en células eucariotas, detallados a continuación.
Ensayo de retardo por electroforesis en
gel. La capacidad de unión del complejo ADN- \betaCD
anfifílica policatiónica se analizó por electroforesis en gel. Las
disoluciones madre de derivados de \betaCD se prepararon en
Me_{2}SO-agua 1:2, mientras que el ADN se disolvió
en NaCl 150 mM. El ADN de pEGFP-N3 (10 \mul a 0,1
\mug/\mul) se mezcló con un volumen igual de derivado de
\betaCD usando relaciones de N/P de 0 a 10 y se incubó durante 30
min a temperatura ambiente antes de la adición de tampón de carga (2
\mul). Una alícuota (5 \mul) de cada muestra se sometió a
electroforesis en gel de agarosa (0,8% p/v) en tampón TAE
(Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM). La electroforesis
se llevó a cabo a 7 V/cm y los geles se tiñeron después de la
electroforesis con bromuro de etidio. La cuantificación de la
intensidad de las bandas se realizó con el software NIH Image
(Rasband et al. 1995. Microbeam Analysis Soc. J. 4,
137-149). Se ha asignado un valor de 100 a la
intensidad de la banda correspondiente al ADN desnudo.
Ensayos de protección de ADNasa. El ADN
de pEGFP-N3 (10 \mul a 0,1 \mug/\mul) se
mezcló con un volumen igual de disolución madre de derivado de
\betaCD usando N/P = 5 y se incubó durante 30 min a temperatura
ambiente. A la mezcla se añadieron 15 \mul de una disolución de
ADNasa I (0,1 mg/ml en Tris HCl 50 mM, pH 8, 2000 U/mg) y se incubó
durante 45 minutos a 37°C. Después de la digestión se añadieron 20
\mul de una disolución de SDS al 10% y las muestras se incubaron
durante 2 h a 85°C. Finalmente, una alícuota (20 \mul) de cada
muestra se sometió a electroforesis en gel de agarosa (0,8% p/v) en
tampón TAE.
Cultivo celular y ensayos de transfección de
ADN. Se cultivaron células de ovario de hámster chino tipo
salvaje (CHO-k1; nº ATCC CCL-61) en
medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 10%
(v/v) de suero bovino fetal, glutamina plus 2 mM, 100 U/ml de
penicilina y 0,1 \mug/ml de estreptomicina. Antes de la
transfección, las células se sembraron en 24 placas de pocilios y se
incubaron durante 24 h para alcanzar una confluencia de células del
80-90%. Para los experimentos de transfección, el
plásmido pEGFP-N3 (1 \mug) se mezcló con el
derivado de CD correspondiente a relaciones de N/P de 0,1 a 20 a
temperatura ambiente durante 20 minutos en un volumen final de 20
\mul. La mezcla se diluyó hasta 0,5 ml con DMEM sin suero y se
añadió a cada pocilio. Las células sin transfectar y el
pEGFP-N3 desnudo se usaron como controles negativos.
Como control positivo se realizó un experimento de transfección
usando 1 \mul de Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen) y 1,0 \mug de
ADN, según las instrucciones del fabricante. Las células se
incubaron con las mezclas de ADN-\betaCD
policatiónica anfifílica durante 18 h, luego se eliminó el medio de
transfección y las células se cultivaron adicionalmente en medio
DMEM más 10% de SBF durante un periodo adicional de 48 h.
Ensayos de fluorescencia y de proteínas.
Las células transfectadas se lavaron tres veces con PBS y se
añadieron 600 \mul de tritón X-100 al 0,5% en PBS.
Las placas se agitaron durante 10 min a temperatura ambiente, el
lisado se recuperó y la fluorescencia se cuantificó en un
fluorímetro Shimadzu RF-5301 PC con longitudes de
onda de excitación de 460 nm (5 nm) y de emisión de 510 nm (10 nm).
La concentración de proteínas se midió usando el ensayo de proteínas
de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.).
Los datos sobre las capacidades relativas de
complejación de ADNp (plásmido de pEGFP-N3 que
codifica GFP) de las nuevas CD policatiónicas anfifílicas a
diferentes valores de N/P (relación entre nitrógenos protonables en
el vehículo de CD/grupos fosfato en el plásmido), el grado de
protección del plásmido en los complejos correspondientes frente a
la acción de ADNasa y la eficiencia para promover la transfección
(células CHO-k1) se presentan en las figuras 3, 4 y
5, respectivamente. Los derivados de \betaCD modificados por una
única cara 18 y 19 se usaron como compuestos de control para evaluar
la influencia de la anfifilicidad en la interacción entre los
macrociclos policatiónicos anfifílicos de la invención y ADNp.
Aunque la arquitectura dendrítica 19 es mucho más eficaz que el
derivado de heptamina 18 en la compactación del ADNp y en la
protección de la degradación por ADNasa, ninguno de ellos pudo
promover la transfección de genes en un grado significativo.
\vskip1.000000\baselineskip
El derivado heptacatiónico tetradecahexanoilado
9 presentó capacidades de complejación de ADNp mejoradas en
comparación con el análogo no anfifílico
18. A pesar de ello, el plásmido todavía
permanece accesible a la ADNasa en los complejos 9:ADNp
correspondientes y los niveles de transfección permanecieron muy
bajos. Los beneficios conferidos por la anfifilicidad resultan mucho
más evidentes cuando se comparó el comportamiento dentro de la serie
de derivados anfifílicos policatiónicos ramificados 19, 10 y 11. El
compuesto 10, que posee cadenas de hexanoato, dio lugar a complejos
10:ADNp estables que garantizaban la protección completa del ADNp
del entorno para valores de N/P superiores a 4. Además, mostraron
eficiencias de transfección sorprendentemente altas, análogas a las
obtenidas usando Lipofectamine™ 2000. El aumento de la longitud de
las cadenas de acilo de hexanoato a tetradecanoato no alteró la
eficiencia de complejación, como se observa en los datos para 11,
pero disminuyó drásticamente la capacidad de transfección, lo que
destaca la importancia de poder ajustar el balance
hidrófobo-hidrófilo no sólo para optimizar la
formación de nanopartículas de CD policatiónica
anfifílica-ADN, sino también para los procesos
adicionales que conducen a la internalización de células y la
expresión génica. La facilidad y eficacia con que este ajuste puede
realizarse en el caso de los compuestos de formula (I) es una
característica importante de la presente invención.
Los compuestos 16 y 17 reproducen la decoración
de poliaminotriazol/tetradeca-O-hexanoílo de 10 y 11 en la
cara primaria y secundaria de la \betaCD, respectivamente, pero
incorporan un brazo espaciador entre los anillos de triazol y el
núcleo macrocíclico que dota al sistema de una flexibilidad mucho
mayor. Un análisis de los datos correspondientes indicó aumentos
moderados en la estabilidad del complejo 16:ADNp, en la eficacia en
la protección de ADNp contra la acción de ADNasa y en la eficiencia
de la transfección de ADN en comparación con el correspondiente
complejo 10:ADNp. Inesperadamente, los datos para 11 y 17 no
mostraron la misma tendencia, siendo en este caso más ventajoso el
motivo rígido en comparación con la arquitectura flexible.
En conjunto, los ejemplos recogidos ilustran la
utilidad de los macrociclos policatiónicos anfifílicos de la
invención como sistemas de transporte de moléculas y biomoléculas al
interior de células, en especial de compuestos polianiónicos como
loa ácidos nucleicos. Un aspecto muy importante de la invención es
que los macrociclos policatiónicos anfifílicos objeto de la misma
pueden prepararse mediante la combinación de procedimientos
sintéticos muy eficaces, que permiten acceder a macromoléculas
completamente homogéneas. La estrategia bidireccional orientada
hacia la diversidad molecular, ilustrada en los ejemplos anteriores,
es especialmente adecuada para la realización de estudios
estructura-actividad y de optimización. Se ha
mostrado que la flexibilidad molecular, la densidad de carga y el
equilibrio hidrófobo-hidrófilo son parámetros
críticos que pueden ajustarse con exactitud en los compuestos objeto
de la invención.
Claims (24)
1. Compuesto de fórmula (I)
donde:
- \quad
- n es 4, 5 ó 6;
- \quad
- R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{20} acilo C_{2}-C_{20}; donde al menos uno de R^{1} y R^{2} es diferente de H;
- \quad
- X se selecciona entre -CH_{2}- o -CH_{2}YR^{3};
- \quad
- donde Y se selecciona entre oxígeno o azufre, R^{3} es -(CH_{2})_{p}-NH-CO-(CH_{2})_{q}- donde p y q pueden tener independientemente un valor comprendido entre 1 y 10.
- \quad
- R^{4} y R^{5} se seleccionan independientemente entre hidrógeno y -(CH_{2})_{r}[(NH) -(CH_{2})_{s}]_{t}NH_{2}; donde r puede tener un valor comprendido entre 1 y 10, s puede tener un valor entre 2 y 10 y t puede tener un valor comprendido entre 0 y 4,
- \quad
- o sus sales orgánicas o inorgánicas.
2. Compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 1, donde R^{1} y R^{2} son
C_{2}-C_{14} alquilo o acilo.
3. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, donde X es -CH_{2}-.
4. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde X es -CH_{2}YR^{3}, Y es
azufre, R^{3} es
-(CH_{2})_{p}-NH-CO-(CH_{2})_{q}-
p es 2 y q es 1.
5. Compuesto de fórmula (I) según las cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, donde R^{4} y R^{5} son
-(CH_{2})_{r}-[(NH)-(CH_{2})_{s}]_{t}-NH_{2},
donde r tiene un valor de 1, s tienen un valor de 2 y t tiene un
valor comprendido entre 0 y 4.
6. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, donde su sal se selecciona entre el
grupo formado por acetato, trifluoroacetato, propionato, benzoato,
metanosulfonato y trifluorometanosulfonato.
7. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, donde su sal se selecciona entre el
grupo formado por cloruro, bromuro y yoduro.
8. Compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 6, donde su sal es cloruro.
9. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, donde n es 5.
10. Compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 1 que se selecciona entre el siguiente grupo:
-
Heptakis[6-(4-aminometil-1H-1,2,3-triazol-il)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(4-(2,2-diaminoetilaminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(4-(2,2-diaminoetilaminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-6-desoxi-2,3-di-O-miristoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(2-(4-aminometil-1H-1,2,3-triazol-1-il)acetamidoetiltio)-6-desoxi-2,3-di-O-hexanoil]ciclomaltoheptaosa
-
Heptakis[6-(2-(4-(2,2-diaminoetilaminometil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)acetamidoetiltio)-6-desoxi-2,3-di-O-hexa-
noil]ciclomaltoheptaosa.
noil]ciclomaltoheptaosa.
11. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, donde alguno de los grupos amino
terminales está sustituido con un fluorocromo.
12. Compuesto de fórmula (I) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, donde alguno de los grupos amino
terminales está sustituido con un grupo que incorpora al menos un
ligando capaz de ser reconocido por un receptor celular.
13. Compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 12 donde el ligando se selecciona entre un mono u
oligosacárido, un anticuerpo monoclonal o un derivado de ácido
fólico.
14. Compuesto de fórmula (I) según la
reivindicación 13 donde el mono u oligosacárido se selecciona entre
mañosa, galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina,
ácido siálico, lactosa ó un oligosacárido formado a partir de
cualquiera de ellos o sus combinaciones.
15. Uso del compuesto de fórmula (I) según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 como transportadores de,
al menos, una molécula al interior de una célula procariota o
eucariota.
16. Uso del compuesto según la reivindicación 15
donde la molécula es de la lista que comprende: ácido nucleico,
ácidos nucleico peptídico, péptido, proteína, glicoproteína,
carbohidrato, lípido o glicolípido.
17. Uso del compuesto según la reivindicación 16
donde la molécula es un ácido nucleico.
18. Uso del compuesto según la reivindicación 17
donde la molécula es ADN.
19. Uso del compuesto según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18 donde la célula es eucariota.
20. Uso del compuesto de fórmula (I) según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la elaboración de un
medicamento.
21. Uso del compuesto de fórmula (I) según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para terapia génica.
22. Composición farmacéutica que comprende el
compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 14.
23. Composición farmacéutica según la
reivindicación 22 que además comprende un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
24. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 22 ó 23 que además comprende otro principio
activo.
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070142324A1 (en) * | 2003-10-24 | 2007-06-21 | Commissariat A L'energie Atomique | Amphiphilic cyclodextrin derivatives, method for preparation thereof and uses thereof |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2008009831A2 (fr) * | 2006-07-21 | 2008-01-24 | Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs | Derives de cyclodextrines amphiphiles |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| MUNTEANU, M. et al. "{}Supramolecular structures based on dimeric combinations of cyclodextrin and adamantante via click chemistry"{}. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2008, Volumen 62, páginas 197-202. Ver página 197, resumen e introducción; página 198, esquema 1, compuesto 3. * |
| MUNTEANU, M. et al. "Supramolecular structures based on dimeric combinations of cyclodextrin and adamantante via click chemistry". Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2008, Volumen 62, páginas 197-202. Ver página 197, resumen e introducción; página 198, esquema 1, compuesto 3. * |
| PIETRZIK, N. et al. "{}Dimerization of propargyl and homopropargyl 6-azido-6-deoxy-glycosides upon 1,3-dipolar cycloaddition"{}. Beilstein Journal of Organic Chemistry 2008, Volumen 4, Número 30. Ver especialmente página 1, resumen; páginas 4-5, tabla 1. * |
| PIETRZIK, N. et al. "Dimerization of propargyl and homopropargyl 6-azido-6-deoxy-glycosides upon 1,3-dipolar cycloaddition". Beilstein Journal of Organic Chemistry 2008, Volumen 4, Número 30. Ver especialmente página 1, resumen; páginas 4-5, tabla 1. * |
| SRINIVASACHARI, S. et al. "{}Polycationic beta-cyclodextrin "{}Clic Clusters"{}: Monodisperse and Versatile Scaffolds for Nucleic Acid Delivery"{}. Journal of the American Chemical Society 2008, Volumen 130, Número 14, páginas 4618-4627. [Disponible en línea el 14.03.2008]. Ver página 4618, resumen e introducción; página 4620, esquema 3; fórmulas 8 y 9; página 4626, conclusión. * |
| SRINIVASACHARI, S. et al. "Polycationic beta-cyclodextrin "Click Clusters": Monodisperse and Versatile Scaffolds for Nucleic Acid Delivery". Journal of the American Chemical Society 2008, Volumen 130, Número 14, páginas 4618-4627. [Disponible en línea el 14.03.2008]. Ver página 4618, resumen e introducción; página 4620, esquema 3; fórmulas 8 y 9; página 4626, conclusión. * |
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