ES2345673T3

ES2345673T3 - Eritropoyetina en dosis subpolicitemicas para el tratamiento de la diabetes.

Info

Publication number: ES2345673T3
Application number: ES07001689T
Authority: ES
Inventors: Ferdinand Hermann Dr. Bahlmann; Hermann Prof. Dr. Haller
Original assignee: Epoplus GmbH and Co KG
Current assignee: Epoplus GmbH and Co KG
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2023-07-25
Also published as: US20100247451A1; DK1779862T3; AU2003255290A1; ATE468132T1; HK1081841A1; DK1526867T3; JP2010280670A; KR20100077033A; PT1526867E; CN101099860B; NO20051002L; AU2009200748A1; CA2710100A1; CY1108052T1; HRP20100187A2; PL395151A1; IS2671B; JP4727988B2; WO2004012759A2; IL166401A0

Abstract

Empleo de la eritropoyetina para la preparación de una composición farmacéutica para la terapia de la diabetes mellitus, en donde la eritropoyetina (EPO) se emplea en dosis subpolicitémicas de 1 a 90 unidades (IU) de EPO/kg de peso corporal/semana.

Description

Eritropoyetina en dosis subpolicitémicas para el tratamiento de la diabetes.

La presente invención se refiere al empleo de la eritropoyetina para la obtención de una composición farmacéutica para la terapia de la diabetes mellitus en donde la eritropoyetina (EPO) se emplea en dosis subpolicitémicas de 1 a 90 unidades (IU) de EPO/kg de peso corporal/semana.

El endotelio vascular es una capa de células, la cual reviste los vasos sanguíneos. El endotelio separa la sangre de las otras capas de los vasos, en donde el endotelio no sólo representa una barrera pasiva, sino que interviene activamente en la regulación del tono vascular. En consecuencia, se habla también de una vasodilatación dependiente del endotelio. Debido a su posición, el endotelio está expuesto permanentemente al esfuerzo hemodinámico y al esfuerzo metabólico. En estados patológicos como por ejemplo una alta presión sanguínea, elevados valores de LDL, una limitada función renal, o un azúcar en sangre elevado, tienen lugar a menudo defectos funcionales del endotelio, a los cuales pueden seguir a continuación daños morfológicos materiales, como la formación de placas ateroescleróticas. Una señal muy temprana de una función endotelial alterada o respectivamente reducida, o respectivamente una disfunción endotelial, es una disminución de la vasodilatación dependiente del endotelio.

En la enfermedad cardíaca coronaria (KHK), pero también en presencia de factores de riesgo sin KHK, por ejemplo, la hipertonicidad, la hiperlipoproteinemia o la diabetes, los defectos funcionales del endotelio se manifiestan por una producción disminuida de NO (= EDRF) y una elevada producción de endotelina. Altos niveles en plasma de endotelina conducen a un crecimiento conjunto anormal de las células, irritaciones, proliferación vascular y una fuerte vasoconstricción. Los trastornos funcionales del endotelio se caracterizan además por una reforzada producción de moléculas de adhesión como el ICAM-1 y el VCAM-1, por lo cual los trombocitos y monocitos se adhieren en gran medida al endotelio. A consecuencia de ello tiene lugar una elevación del tono vascular. Con ello se forma en los más diferentes sistemas, un desequilibrio, en donde la vasoconstricción, adhesión, agregación, coagulación, ateroesclerosis y arterotrombosis salen favorecidas. El mismo estrés mental conduce a una disfunción medible del endotelio, la cual puede durar hasta 4 horas.

Las células del endotelio toman parte también en la formación de nuevos vasos sanguíneos. La formación de vasos sanguíneos es importante en un gran número de procesos, como por ejemplo la embriogénesis, el ciclo femenino de reproducción, la curación de heridas, el crecimiento de tumores y en las zonas de neovascularización isquémica. Originariamente, la formación postnatal de vasos sanguíneos, a saber la formación de vasos sanguíneos después del nacimiento, se atribuía principalmente a procesos angiogenéticos. Bajo angiogénesis se entiende la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante la creación de capilares a partir de un sistema de vasos ya existente. En la angiogénesis se reduce en primer lugar la membrana basal que rodea los vasos sanguíneos mediante enzimas proteolíticas y se fragmenta la matriz extracelular en el espacio perivascular. Los estímulos angiógenos liberados con ello, ocasionan que las células endoteliales diferenciadas ya existentes, migren en dirección al estímulo quimiotáctico, con lo que proliferan simultáneamente y son transformadas. Mediante la yuxtaposición de las células endoteliales se forman nuevos bucles vasculares con un lumen en forma de capilar. A continuación tiene lugar la síntesis de una nueva membrana basal.

Nuevas investigaciones muestran, sin embargo, que la formación de nuevos vasos sanguíneos en un organismo adulto descansa no solamente en la angiogénesis, sino también sobre mecanismos vasculogenéticos. Con el término vasculogénesis se entiende la formación de nuevos vasos a partir de las células progenitoras endoteliales diferenciadas in situ. El dogma, de que la vasculogenesis está limitada por la embriogénesis fue refutado por la detección de células progenitoras endoteliales (EPC) en la sangre periférica de hombres y animales sanos. Con el empleo de modelos animales pudo comprobarse que las células progenitoras endoteliales originadas en la médula ósea participaban activamente en la neovascularización. También se demostró que en las regiones isquémicas se fija un subgrupo de leucocitos específicos CD34-positivos, los cuales expresaban antígenos específicos del endotelio. Además se podían obtener a partir de las células CD 133^{+}- y CD34^{+}, células progenitoras endoteliales in vitro (EPC), las cuales contribuyen significativamente a la formación de vasos sanguíneos en organismos adultos (Asahara et al., Science, 275 (1997), 964-967; Crosby et al., Circ. Res., 87 (2000), 728-730; Gehling et al., Blood, 95 (2000), 3106-3112). Además se demostró que la inyección de células CD34^{+} aisladas o células progenitoras endoteliales cultivadas, aceleraba la restauración del flujo sanguíneo en los ratones diabéticos (Schatteman et al., J. Clin. Invest., 106 (2000), 571-578) y mejoraba la neovascularización in vivo (Asahara et al., Circ. Res., 85 (1999), 221-228; Crosby et al., Circ. Res., 87 (2000), 728-730; Murohara et al., J. Clin. Invest., 105 (2000), 1527-1536). Además, pudo demostrarse que una neovascularización inducida mediante células CD34^{+} mejoraba la función cardíaca (Kocher et al., Nat. Med., 7 (2001), 430-436).

Sin embargo, los mecanismos subyacentes en la movilización y diferenciación de las células progenitoras endoteliales no se han aclarado todavía completamente. Investigaciones biológicas moleculares y celulares sugieren que diferentes citocinas y factores angiógenos de crecimiento actúan estimulando la movilización de las células progenitoras endoteliales en la médula ósea. Así, es conocido, que los factores proangiógenos como los VEGF y GM-CSF pueden aumentar el número de células progenitoras endoteliales (Asahara et al., EMBO J., 18 (1999), 3964-3972; Takahashi et al., Nat. Med., 5 (1999), 434-438). En el caso del VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) (``factor de crecimiento endotelial vascular), se trata de una proteína presente en diferentes isoformas, la cual se une a los dos receptores de la tirosinaquinasa VEGF-R1 (flt-1) y VEGF-R2 (flk-1), los cuales se encuentran por ejemplo sobre la superficie de las células endoteliales en crecimiento (Wernert et al., Angew. Chemie, 21 (1999), 3432-3435). La activación de los receptores VEGF conduce a través del camino Ras-Raf-MAP-quinasa a la expresión de proteinasas e integrinas específicas sobre la superficie de células endoteliales o respectivamente células progenitoras endoteliales y finalmente a la iniciación de la proliferación y migración de estas células en dirección al estímulo angiógeno. En el caso del GM-CSF (factor estimulante de colonias macrófagas de granulocitos) se trata de una citocina que hasta ahora se conocía ante todo por la estimulación de los glóbulos blancos de la sangre, inclusive los neutrófilos, macrófagos y eosinófilos. Del PIGF (factor de crecimiento de la placenta) se sabe que estimula la movilización de las células progenitoras endoteliales, pero en cambio no estimula su proliferación. A partir de investigaciones de Llevadot et al., (J. Clin. Invest., 108 (2001), 399-405), se desprende que los inhibidores de la HMG-CoA-reductasa, en particular la estatina, los cuales se emplean como medicamentos para disminuir los lípidos, y reducen la morbilidad y mortalidad de una enfermedad coronaria, pueden movilizar células progenitoras endoteliales. Dimmeler et al., (J. Clin. Invest., 108 (2001), 391-397) pudieron demostrar además que las estatinas como la atorvastatina y la simvastatina, mejoraban significativamente in vitro e in vivo, la diferenciación de las células progenitoras endoteliales en células mononucleares y células madre CD34^{+}, las cuales fueron aisladas de la sangre periférica. Así, el tratamiento de ratones con estatina condujo a un mayor número de células progenitoras endoteliales diferenciadas, en donde la estatina mostraba la misma intensa acción que el VEGF.

La estimulación de la movilización y/o diferenciación de células progenitoras endoteliales constituye una nueva estrategia terapéutica importante para aumentar la neovascularización postnatal, en particular la vasculogénesis, y para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una disfunción de las células progenitoras endoteliales y/o células endoteliales.

La presente invención toma como base el problema técnico, de preparar un método, según el cual pueda lograrse un tratamiento de las enfermedades relacionadas con una disfunción endotelial de las células progenitoras, por ejemplo, la diabetes mellitus.

La presente invención soluciona este problema técnico mediante el método de emplear la eritropoyetina según la reivindicación independiente de la patente.

Según la invención se comprobó sorprendentemente que un tratamiento con eritropoyetina condujo a la movilización fisiológica de las células progenitoras endoteliales, en donde el número de células progenitoras endoteliales circulantes aumentó, y se indujo su diferenciación en particular en dosis comparativamente pequeñas de EPO. Además, se equilibraron en determinados estados patológicos los déficits funcionales aparecidos de las células progenitoras endoteliales. Pudo demostrarse según la invención, que en los pacientes con enfermedades renales crónicas en el estadio terminal, el número de células madre circulantes es igual que en los voluntarios sanos, aunque éstas, en estos pacientes han perdido la capacidad para la diferenciación de las células endoteliales mediante células progenitoras endoteliales. Así, en pacientes con enfermedad renal crónica, el número de células que son capaces de adhesión y muestran un fenotipo de célula endotelial, disminuye claramente en comparación con voluntarios sanos. Según la invención se comprobó entonces, que después del tratamiento de estos pacientes con eritropoyetina, el número de células madre circulantes aumentó significativamente más del 50%. A este respecto se elevó espectacularmente en particular el número de células que desarrollan un fenotipo endotelial. Como se detectó mediante un test funcional de cultivo celular, la capacidad deteriorada en pacientes con enfermedad renal crónica, de las células progenitoras endoteliales para la adhesión, aumentó alrededor de tres veces. La capacidad de las células progenitoras endoteliales diferenciadas, respectivamente de las células endoteliales, para la adhesión, es una de las premisas fundamentales para la formación de nuevos tejidos y/o vasos. La eritropoyetina puede inducir de esta forma, la neovascularización, en particular la vasculogénesis, en tejidos u órganos, en los cuales se liberan los correspondientes estímulos vasculógenos o angiógenos.

La eritropoyetina (en adelante, llamada EPO), puede emplearse para la estimulación de la movilización fisiológica de las células progenitoras endoteliales, en la proliferación de las células progenitoras endoteliales, en la diferenciación de las células progenitoras endoteliales en células endoteliales y/o para la migración de células progenitoras endoteliales en dirección a un estímulo vasculógeno o angiógeno en un cuerpo humano o animal, en particular en un organismo adulto. Según la invención, la eritropoyetina puede por lo tanto emplearse de manera ventajosa para la estimulación de la nueva formación de vasos mediante la vasculogénesis en tejidos u órganos, en los cuales están presentes alteraciones patológicas de los vasos. Debido a la estimulación de las células progenitoras endoteliales mediante la eritropoyetina, puede inducirse además también la formación de tejidos endoteliales. Según la invención, la eritropoyetina puede por lo tanto emplearse también para el tratamiento de enfermedades del cuerpo humano o animal, las cuales están relacionadas con una disfunción de las células progenitoras endoteliales y/o las células endoteliales, por ejemplo de la diabetes mellitus.

En relación con la presente invención, con el término "eritropoyetina" o respectivamente "EPO" se comprende una substancia, que controla el crecimiento, la diferenciación y la maduración de las células madre mediante los eritroblastos en eritrocitos. La eritropoyetina es una glicoproteína que contiene 166 aminoácidos, tres posiciones de glicosilación y un peso molecular de aproximadamente 34.000 Da. En el marco de una diferenciación inducida por EPO de células progenitoras de eritrocitos, se induce la síntesis de la globulina y la síntesis del complejo Häm así como el aumento del número de receptores de la ferritina. Por este motivo, las células pueden absorber más hierro y sintetizar hemoglobina funcional. En los eritrocitos maduros la hemoglobina se une al oxígeno. Con ello, los eritrocitos o respectivamente la hemoglobina contenida en su interior juegan un papel clave para el suministro de oxígeno al organismo. Estos procesos se resuelven mediante el metabolismo de la EPO con un correspondiente receptor sobre la superficie celular de las células progenitoras de eritrocitos (Graber y Kranz, Ann. Rev. Med. 29 (1978), 51-56).

La eritropoyetina se forma principalmente en los riñones aunque en pequeñas cantidades también en el hígado y en el cerebro. La eritropoyetina se encuentra también en pequeñas cantidades en el suero y se separa por lo menos en parte, en la orina bajo condiciones fisiológicas. Los pacientes con insuficiencia renal pueden generar solamente una insuficiente cantidad de eritropoyetina (en adelante, llamada EPO), y padecen por lo tanto una anemia. Es conocida la solución de compensar los problemas de falta de eritropoyetina mediante la administración de eritropoyetina. Otros empleos clínicos de la eritropoyetina son la aplicación de la eritropoyetina en anemias yatrógenas después de la quimioterapia o terapia por rayos en enfermedades malignas o infecciones víricas (patente EP 0 456 153 B1). A partir de la patente 4.732.889, es conocido el empleo de composiciones que contienen eritropoyetina para el tratamiento de las anemias asociadas con la artritis reumatoide. A partir de la patente WO 88/03808, es conocido el tratamiento de la hemocromatosis con composiciones que contienen EPO.

El concepto aquí utilizado de "eritropoyetina" comprende la EPO de cualquier procedencia, en particular la EPO de procedencia humana o animal. El compuesto aquí empleado no comprende el EPO de procedencia natural, es decir las formas tipo salvaje de EPO, sino también sus derivados, sus análogos, sus modificaciones, muteínas, mutantes u otros, siempre que presenten las acciones biológicas de la eritropoyetina de tipo salvaje.

En relación con la presente invención se comprende bajo la denominación "derivados", los equivalentes funcionales o descendientes de la eritropoyetina, los cuales se obtienen mediante el mantenimiento de la estructura básica de la eritropoyetina mediante la substitución de uno o varios átomos o grupos de moléculas, respectivamente, radicales de moléculas, en particular mediante la substitución de cadenas de azúcares como el etilenglicol, y/o sus secuencias de aminoácidos, y se diferencian de la proteína eritropoyetina que se encuentra en la naturaleza en hombres o animales, por lo menos en una posición, aunque sin embargo presenta en esencia un alto grado de homología en el plano de los aminoácidos y una actividad biológica comparable. Los derivados de la eritropoyetina como pueden emplearse por ejemplo en la presente invención, son entre otros, conocidos a partir de la patente WO 94/25055, de la patente EP 0 148 605 B1, ó de la patente WO 95/05465.

"Homología" significa en particular una identidad en las secuencias de por lo menos un 80%, de preferencia por lo menos un 85% y con particular preferencia por lo menos más del 90%, 95%, 97% y 99%. La expresión "homología" ya conocida por el experto, significa el grado de parentesco entre dos o varias moléculas de polipéptido, el cual se determina por la coincidencia entre las secuencias. A este respecto, una coincidencia puede significar tanto una coincidencia idéntica como también un intercambio conservador de aminoácidos.

El concepto "derivado" comprende según la invención también las proteínas de fusión, en las cuales en la parte del terminal N, ó respectivamente en la parte del terminal C, existen dominios funcionales de otra proteína. En una versión de la invención, esta otra proteína, es por ejemplo, el GM-CSF, VEGF, PIGF, una estatina u otro factor, el cual presenta un efecto estimulador sobre las células progenitoras endoteliales. En otra versión de la invención, la otra proteína puede tratarse también de un factor, que tiene un efecto estimulante sobre las células endoteliales diferenciadas, por ejemplo la angiogenina o el bFGF (factor básico de crecimiento del fibroblasto). Del bFGF se conoce que este factor de crecimiento ejerce una fuerte actividad mitogénica y quimiotáctica sobre las células endote-
liales.

Las diferencias entre un derivado de eritropoyetina y la eritropoyetina nativa pueden haber surgido, por ejemplo, mediante mutaciones, como por ejemplo supresiones, substituciones, inserciones, adiciones, intercambio de bases y/o recombinaciones de las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de los aminoácidos de la eritropoyetina. Naturalmente puede tratarse a este respecto de variaciones de secuencias que aparecen de forma natural, por ejemplo de secuencias de otro organismo o de secuencias que han mutado de forma natural o mutaciones, las cuales fueron introducidas con ayuda de medios habituales ya conocidos en el campo de la especialidad, como por ejemplo agentes químicos y/o agentes físicos, dirigidos a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la eritropoyetina. En conexión con la invención, el concepto "derivado" comprende también moléculas de eritropoyetina mutadas, a saber las eritropoyetina-muteínas.

Según la invención, pueden emplearse también análogos de péptidos o análogos de proteínas de la eritropoyetina. En conexión con la presente invención, el concepto "análogos", comprende aquellos compuestos, que no presentan ninguna secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina pero que su estructura tridimensional es muy similar a la eritropoyetina y por ello presentan una actividad biológica comparable. En el caso de análogos de la eritropoyetina puede tratarse por ejemplo de compuestos que para la unión de la eritropoyetina con sus receptores responsables contienen radicales de aminoácidos en una conformación adecuada y por ello pueden tener propiedades de superficie esenciales similares a las de la eritropoyetina en el campo de las uniones. Este tipo de compuestos están descritos por ejemplo en Wrighton et al., Science, 273 (1996), 458.

La EPO empleada según la invención, puede obtenerse de diferentes maneras, por ejemplo mediante el aislamiento a partir de la orina humana o a partir de la orina o plasma (incluido el suero), de pacientes que sufren de anemia aplásica (Miyake et al., J.B.C. 252 (1977), 5558). La EPO humana puede obtenerse por ejemplo también a partir de cultivos de tejidos de células de cánceres renales humanos (JA-OS 55790/1979), a partir de células de linfoblastos humanos, los cuales presentan la capacidad de formar EPO humana (JA-OS 40411/1982), y a partir de un cultivo de hibridomas obtenido por fusión celular de una línea de células humanas. La EPO puede también obtenerse por procedimientos de tecnología genética, obteniendo por medio del ADN ó ARN adecuado, que codifica la correspondiente secuencia de aminoácidos de la EPO, la deseada proteína mediante técnica genética, por ejemplo en una bacteria, una levadura, una línea celular vegetal o animal. Este tipo de procedimientos están por ejemplo descritos en la patente EP 0 148 605 B2, ó la EP 0 205 564 B2 así como la EP 0 411 678 B1.

En conexión con la presente invención se comprende con la expresión "células progenitoras endoteliales" (EPC), células que circulan en el torrente sanguíneo, las cuales poseen la capacidad de la diferenciación de las células endoteliales. Las células progenitoras endoteliales que aparecen durante el desarrollo del embrión, son angioblastos. En los células progenitoras endoteliales que se encuentran en los organismos de adultos, son células similares a los angioblastos, las cuales pueden obtenerse a partir de células mononucleares, en particular, de monocitos CD34^{-}CD14^{+} y/o células madre CD34^{+}, las cuales han sido aisladas de la sangre periférica.

En conexión con la presente invención se comprende bajo el término "movilización" o "movilización fisiológica", el proceso de activación de células madre y/o células progenitoras a partir de la médula ósea mediante factores de crecimiento, de manera que las células madre, o respectivamente las células progenitoras, alcanzan el torrente sanguíneo, en particular en la sangre periférica.

En conexión con la presente invención se comprende bajo el término "proliferación", la capacidad de las células de multiplicarse y para la subsiguiente división en dos o más células hijas. La estimulación inducida por la EPO de las células progenitoras endoteliales, se refiere particularmente al número, y con ello a la forma de dividirse, de las células progenitoras endoteliales.

En conexión con la presente invención se comprende bajo el término "diferenciación" de células progenitoras endoteliales, el desarrollo de células mononucleares procedentes de la médula ósea mediante células progenitoras endoteliales en células endoteliales. Bajo el término "células endoteliales" se comprenden aquellas células, las cuales forman el endotelio, es decir el revestimiento celular de una monocapa de los vasos y cavidades serosas. Las células endoteliales se caracterizan porque liberan substancias vasoactivas, por ejemplo substancias vasodilatadoras como el EDRF (factor de relajación derivado del endotelio) o substancias constrictoras como la endotelina, factores para la inhibición o activación de la coagulación de la sangre, y factores para la regulación de la permeabilidad de los vasos. Las células endoteliales sintetizan también componentes de los tejidos de unión subendoteliales, en particular el colágeno de tipo IV y V, proteínas de células adhesivas como la laminina, la fibronectina, y la trombospondina, factores de crecimiento, como por ejemplo para células musculares lisas, y factores para la formación de nuevos vasos.

En conexión con la presente invención se comprende bajo el término "migración" de las células progenitoras endoteliales, que las células progenitoras endoteliales que se encuentran en el torrente sanguíneo, se desplazan en dirección a un estímulo vasculógeno o angiógeno, y se concentran en la zona del estímulo vasculógeno o angiógeno. Bajo la expresión "estímulo vasculógeno" se comprende un estímulo químico en un tejido o vaso sanguíneo de un cuerpo humano o animal, el cual actúa específicamente sobre las células progenitoras endoteliales y cuyo desplazamiento se dirige al lugar del cuerpo de donde procede el estímulo químico. Mediante un estímulo vasculógeno se induce de esta forma el proceso de la vasculogénesis. Bajo la expresión "estímulo angiógeno" se comprende un estímulo químico en un tejido o vaso sanguíneo de un cuerpo humano o animal, el cual actúa específicamente sobre las células endoteliales diferenciadas y cuya migración tiene lugar al lugar del cuerpo de donde procede el estímulo químico. El estímulo angiógeno provoca de esta forma la inducción de la angiogénesis.

En la invención, el empleo de la eritropoyetina es para la obtención de una composición farmacéutica para la terapia de estados de enfermedad o enfermedades del cuerpo humano o animal, las cuales están en conexión con una disfunción de las células progenitoras endoteliales, o de enfermedades secundarias causadas por las primeras, por ejemplo la diabetes mellitus.

En conexión con la presente invención se comprenden bajo los términos "enfermedades", "estados de enfermedad" o "afecciones", transtornos de los procesos de la vida en órganos o en organismos completos, con la consecuencia de alteraciones corporales, psicológicas o respectivamente intelectuales, subjetivamente sensibles u objetivamente detectables. Según la invención se trata en particular de enfermedades que están en conexión con una disfunción de las células progenitoras endoteliales, es decir enfermedades que o bien son una consecuencia de una disfunción de este tipo, de células, o bien están inducidas por estas células. Bajo el término "enfermedades inducidas por otras enfermedades" se comprenden enfermedades secundarias, es decir, una segunda enfermedad que aparece en el cuadro de la enfermedad primaria.

En conexión con la presente invención se comprende bajo el término "disfunción" de células progenitoras endoteliales, un transtorno de las funciones celulares esenciales, como por ejemplo, actividades metabólicas, respuestas a estímulos, motilidad, comportamiento a la división o comportamiento a la diferenciación de estas células. Una disfunción de las células progenitoras endoteliales puede por ejemplo consistir en que estas células no proliferan o proliferan en una medida insuficiente. Dado que mediante el empleo de la eritropoyetina se estimula la proliferación de las células progenitoras endoteliales, se puede equilibrar con ello el comportamiento deficitario de la división tanto de las células progenitoras endoteliales como también de las células endoteliales ya diferenciadas, y elevar el número de células progenitoras endoteliales o respectivamente de células endoteliales. Una disfunción de las células progenitoras endoteliales puede por ejemplo consistir en la capacidad transtornada de estas células para la diferenciación de las células endoteliales. La disfunción de las células progenitoras endoteliales puede también ser causada por una transtornada capacidad para la adhesión y/o su transtornada capacidad para la migración en dirección de un estímulo angiógeno o vasculógeno. Dichas disfunciones de las células progenitoras endoteliales pueden conducir a que por ejemplo la nueva formación de tejidos endoteliales y/o la vasculogénesis sea afectada o impedida. Una disfunción de las células progenitoras endoteliales puede ser también una causa patógena, por ejemplo, hipertonicidad, hiperlipoproteinemia, uremia o diabetes. La disfunción de las células progenitoras endoteliales puede manifestarse por ejemplo, por una producción disminuida de NO (=EDRF) por NO-sintasas (NOS) de L-arginina, una elevada producción de endotelina y/o una mayor producción de moléculas de adhesión como ICAM-1 y VCAM-1.

Según la invención, en el caso de las enfermedades que están en conexión con una disfunción de las células progenitoras endoteliales, se trata de la diabetes mellitus.

Con el término "diabetes mellitus" se comprenden diferentes formas de transtornos del metabolismo de la glucosa con diferentes etiologías y sintomáticas. Para la aparición de complicaciones diabéticas de origen vascular, es particularmente responsable el sistema AGE-RAGE. Los AGEs (Advanced Glycation Endproducts) ("Productos finales avanzados de la glicación") aparecen mediante una serie compleja de reacciones después de una exposición de larga duración de proteínas o lípidos con azúcares reductores, por ejemplo, glucosa. La formación de AGEs tiene lugar durante el proceso normal de envejecimiento así como en mayor medida en la diabetes mellitus y en la enfermedad de Alzheimer. Mediante la unión de los AGEs tiene lugar un estrés oxidante, la activación del factor de transcripción NF-\kappaB, y con ello un entorpecimiento de la hemeostasis endotelial.

La presente invención para la obtención de una composición farmacéutica se refiere así, al empleo de la eritropoyetina para la terapia de la diabetes mellitus.

Según la invención, está previsto que la eritropoyetina se administre en una dosis terapéuticamente efectiva a un paciente, que sea suficiente para curar el estado de una enfermedad antes mencionada, en particular una enfermedad, que está en conexión con una disfunción de las células progenitoras endoteliales, o para prevenir este estado, para cortar la progresión de dicha enfermedad y/o para aliviar los síntomas de dicha enfermedad. La dosis a administrar a un paciente depende de muchos factores, por ejemplo, de la edad, del peso corporal, del sexo del paciente, de la gravedad de las enfermedades, etc.

Según la invención la eritropoyetina se emplea en todos los compuestos, procedimientos y composiciones de la presente instrucción en muy pequeñas cantidades, las cuales se encuentran entre las cantidades empleadas conocidas, en donde particularmente in vivo, es decir, por paciente, se administran dosis de EPO de 200 a 2000 unidades (IU; unidades internacionales)/semana, de preferencia dosis de 500 a 2000 IU/semana, según la gravedad de la enfermedad y en función de la función renal. En las dosis previstas según la invención de 200 a 2000 unidades (IU)/semana y por paciente, en particular de 500 a 2000 IU/semana y por paciente, se trata de dosis subpolicitémicas, es decir dosis que no conducen a una eritrocitosis con valores del hematocrito mayores del 50%. Las dosis subpolicitémicas previstas según la invención, corresponden a dosis semanales de aproximadamente 1 a 90 unidades (IU) de EPO/kg de peso corporal, en particular 1 a 45 IU de EPO/kg de peso corporal, o una dosis semanal equivalente de Aranesp de 0,005 a 0,45 \mug/kg de peso corporal, en particular 0,005 a 0,225 \mug/kg de peso corporal. El Aranesp se trata de una EPO doble PEGuilada. La dosis de 200 a 2000 unidades/semana por paciente, en particular de 500 a 2000 IU/semana y por paciente, que está prevista según la invención para el tratamiento de enfermedades o estados de enfermedad, que van acompañados de una disfunción de las células progenitoras endoteliales, es muy pequeña en comparación con las dosis iniciales habituales empleadas en la terapia de las anemias renales, de 50-150 IU/kg de peso corporal/semana (en donde por regla general se empieza con 4000-8000 IU/semana, aunque en el caso de un resultado no satisfactorio de la terapia, también puede ser esencialmente mayor).

La invención se refiere al empleo de la eritropoyetina y/o sus derivados como substancia activa para la obtención de una composición farmacéutica o de un medicamento para la terapia de la diabetes mellitus, la cual está en conexión con una disfunción de las células progenitoras endoteliales.

Según la invención se comprende con el término "substancia activa", una substancia propia del cuerpo o extraña al cuerpo, la cual por contacto con las moléculas diana o las células diana o los tejidos diana, influye en las funciones específicas de tejidos, órganos u organismos, de una manera diferente. Según la invención está también previsto que la eritropoyetina como substancia activa de la composición farmacéutica según la invención, en contacto con las células progenitoras endoteliales influye en la proliferación, diferenciación y/o migración de un organismo humano o animal, de manera que las disfunciones de las células progenitoras endoteliales se equilibran y combate con eficacia las enfermedades aparecidas a causa de estas disfunciones, las alivia o elimina, o respectivamente, estas enfermedades pueden ser eficazmente evitadas.

En conexión con la presente invención se comprende con la expresión "composición farmacéutica" o "medicamento", una mezcla utilizada para los fines del diagnóstico terapéutico y/o profiláctico, a saber, una mezcla estimuladora o restauradora de la salud de un cuerpo humano o animal, la cual comprende por lo menos una substancia activa obtenida por vía natural o sintética que produce el efecto terapéutico. La composición farmacéutica puede ser, tanto una mezcla sólida como también una mezcla líquida. Por ejemplo, una de las substancias activas comprendidas por la composición farmacéutica puede contener uno o varios componentes farmacéuticamente aceptables. Además, la composición farmacéutica puede comprender habitualmente aditivos ya empleados en el campo de la especialidad, estabilizadores, substancias para acabado, agentes de separación, agentes dispersantes, emulsionantes u otras substancias empleadas habitualmente para la preparación de composiciones farmacéuticas.

Según la invención, está previsto en particular, el empleo de la eritropoyetina y/o un derivado de la misma como substancia activa para la preparación de un medicamento para la terapia de la diabetes mellitus.

La composición farmacéutica según la invención puede ser apropiada tanto para la administración tópica como también para la administración sistémica.

En una versión preferida de la invención está previsto que la composición farmacéutica se emplee mediante la administración parenteral, en particular intravenosa, intramuscular, intracutánea o subcutánea. De preferencia, el medicamento que contiene la eritropoyetina, se presenta en forma de una inyección o infusión.

En otro modo de empleo, está previsto que la composición farmacéutica que contiene la eritropoyetina sea administrada por vía oral. Por ejemplo, el medicamento que contiene la eritropoyetina se administra en una forma líquida de administración como puede ser, una solución, una suspensión, una emulsión, o una forma de administración sólida, como un comprimido.

En otra forma de empleo, está previsto que la composición farmacéutica sea administrada por vía pulmonar, o sea apropiada para administrar por inhalación. Según la invención está previsto pues, que la eritropoyetina sea administrada en una forma terapéuticamente efectiva directamente a los pulmones del paciente. Esta forma de administración de la eritropoyetina hace posible una rápida toma de una dosis de eritropoyetina a un paciente, sin que deba recurrirse a una inyección. En la absorción de la eritropoyetina mediante los pulmones pueden cederse considerables cantidades de eritropoyetina mediante los pulmones al torrente sanguíneo, lo cual conduce a cantidades elevadas de eritropoyetina en el torrente sanguíneo. En una versión preferida de la invención, la composición farmacéutica a absorber mediante los pulmones, es una solución acuosa o no acuosa, o un polvo seco. En caso de que el medicamento que contiene la eritropoyetina para ser administrada por vía pulmonar comprenda la misma en forma de un polvo seco, las partículas de eritropoyetina contenidas presentan un diámetro inferior a 10 \mum, de manera que el medicamento pueda alcanzar zonas distales de los pulmones del paciente. En una versión particularmente preferida de la invención está previsto que el medicamento a administrar por vía pulmonar esté presente en forma de un aerosol.

Una versión particularmente preferida de la invención se refiere al empleo de la eritropoyetina para la preparación de una composición farmacéutica para la terapia de la citada enfermedad, la cual con una disfunción de las células progenitoras endoteliales está en conexión, en donde la composición farmacéutica junto con la eritropoyetina como substancia activa contenga otros substancia activa adicional para la estimulación de las células progenitoras endoteliales.

De preferencia, esta otra substancia activa es una substancia activa la cual estimula en particular la movilización fisiológica de las células progenitoras endoteliales de la médula ósea. Según la invención, esta otra substancia activa puede ser también una substancia activa que estimula en particular el comportamiento a la división, a saber, la proliferación de las células progenitoras endoteliales. Según la invención existe también la posibilidad de que la otra substancia activa estimule en particular el comportamiento a la diferenciación y/o la migración y/o el comportamiento a la migración de las células progenitoras endoteliales. Con particular preferencia, esta otra substancia activa estimuladora de las células progenitoras endoteliales, es el VEGF, PIGF, GM-CSF, un inhibidor de la HMG-CoA-reductasa, en particular una estatina como la simvastatina, mevastatina o la atorvastatina, y/o un dador de NO, en particular, la L-arginina.

Según la invención está también previsto que por lo menos otra substancia, estimule en particular las células endoteliales diferenciadas, es decir, su proliferación y/o su migración, aunque no estimule sus células progenitoras endoteliales. Con particular preferencia, se trata a este respecto, del bFGF (factor básico del crecimiento de fibroblastos) o la angiogenina.

Otros perfeccionamientos ventajosos de la invención se desprenden de las reivindicaciones secundarias.

La invención se aclarará con mayor exactitud a la vista de las siguientes figuras y ejemplos.

La figura 1 muestra los resultados de un análisis FACS de células madre CD34^{+} circulantes (cSC). (A-D): muestras de pacientes; (E-F): controles isotípicos. Las cSC disminuyeron a la vista de la expresión adicional del marcador CD34 (B y F), y se identificaron a la vista de la característica, escasa a mediana, expresión del antígeno CD45 (Cund G), y a la vista de las características propiedades de dispersión de la luz (D y H). La cantidad absoluta de cSC fue calculada por cada 100.000 mono- y linfocitos.

La figura 2 muestra una determinación cuantitativa de células madres circulantes mediante la citometría de flujo. La figura muestra el efecto en función del tiempo del tratamiento con eritropoyetina mediante el empleo de la rhEPO (eritropoyetina recombinante humana), después de 0, 2, 4, 6, y 8 semanas, n = 11, los valores corresponden a valores medios +/- la desviación estándar. Las medianas están representadas por líneas.

*: p < 0,01 en comparación a 2 semanas; \Box.\Box.p < 0,05 en comparación a 4 semanas, #: p < 0,05 en comparación a 8 semanas.

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La figura 3 muestra una determinación cuantitativa de células progenitoras endoteliales cultivadas (EPC). La figura muestra, que el tratamiento con rhEPO aumenta la cantidad relativa de EPCs. Las EPC se aislaron antes del tratamiento renal de los pacientes con rhEPO así como 2, 4, 6 y 8 semanas después del tratamiento de los pacientes con rhEPO, y se caracterizaron a la vista de su capacidad de adhesión y de los dos marcadores acLDL-Dil y UEA-1 FITC. n=11, los valores corresponden a valores medios +/- la desviación estándar. Las líneas representan medianas.

*: p < 0,01 frente al periodo antes del tratamiento;

#: p < 0,001 frente al período antes del tratamiento.

La figura 4 muestra la determinación cuantitativa de células progenitoras endoteliales cultivadas (EPC). La figura muestra que la cantidad absoluta de EPCs disminuye significativamente antes del inicio de una terapia con rhEPO, en comparación con voluntarios sanos de diferentes edades y sexo. Los pacientes con anemia muestran también una evidente disfunción de las EPC, cuando se les compara con las personas del control. 8 semanas después del comienzo de la terapia con rhEPO para la anemia renal, se equilibra este disminuido número de EPC funcionales. Las EPC se aislaron antes del tratamiento de los pacientes renales con rhEPO así como 2, 4, 6 y 8 semanas después del tratamiento de los pacientes con rhEPO, y se caracterizaron a la vista de su capacidad de adhesión y de los dos marcadores acLDL-Dil y UEA-1 FITC. n = 11. Está representado como ejemplo, el transcurso de las 8 semanas y el conjunto de controles. Los valores absolutos están representados por una parte como valores individuales. Además, están representados los diagramas de cajetines (percentiles 90-avo/75-avo/50-avo/25-avo y 10-avo, así como el valor medio). Como controles sanos sirvieron los voluntarios escogidos por edad y sexo, en los cuales se aislaron análogamente las EPC y se caracterizaron (n = 11).

La figura 5 muestra el efecto de la eritropoyetina sobre la curación de heridas. La figura muestra que en el tratamiento con eritropoyetina de una herida en la piel, estandarizada, que había sido efectuada en los ratones mediante un punzón de tejidos, la herida se cerró completamente ya después de siete a ocho días, mientras que en el tratamiento de la herida con solución fisiológica de sal común (solución salina), la herida sólo se cerró completamente después de trece a catorce días. El tratamiento con eritropoyetina, respectivamente solución fisiológica de sal común, empezó 7 días antes de provocar la herida de la piel. La eritropoyetina recombinante humana fue administrada una vez por semana mediante una inyección s.c. (subcutánea) (0,1 \mug/kg de Aranesp) (en cada grupo, n = 5).

La figura 6 muestra que la eritropoyetina disminuye la pérdida de función renal después de un fracaso renal (insuficiencia renal aguda). Se utilizaron ratas Sprague Dawley (250-300 g) en el estudio. La ratas se narcotizaron con cetamina (120 mg/kg) y Rompun (10 mg/kg). Uno de los grupos del estudio recibió 0,1 \mug/kg de peso corporal, de Aranesp una vez por día antes de la inducción de la insuficiencia renal aguda. Como comparación se empleó un grupo de animales del estudio, los cuales fueron inyectados s.c. simultáneamente cada vez con sal común. Mediante la colocación de una pinza arterial sobre las arterias renales derechas se interrumpió el flujo sanguíneo en el riñón durante 45 minutos. En este tiempo se efectuó en el lado izquierdo una nefrectomía. Una operación similar se efectuó en otro grupo de control. En este caso, se abrió el abdomen, se dejó libre la arteria renal izquierda, aunque la alimentación sanguínea no se interrumpió, y se extirpó el riñón contralateral derecho. Todos los animales fueron narcotizados durante 60 minutos, y 24 horas después de la operación fueron sacrificados. La isquemia de 45 minutos con la subsiguiente reperfusión de los riñones derechos restantes, condujo en los animales tratados con sal común a una masiva aguda pérdida de la función renal. Esto se reflejó en un valor de la creatinina en suero, la cual 24 horas después de la reperfusión de la isquemia fue 7 veces mayor que el valor antes de la reperfusión de la isquemia (p < 0,05). Por el contrario, los animales tratados con Aranesp análogo a la eritropoyetina, mostraron solamente un aumento de cuatro veces los valores de creatinina en suero un día después de la inducción del daño por la reperfusión de la isquemia. En el lado izquierdo de los animales nefrectomizados con los riñones derechos operados de forma similar, no ocurrió ningún aumento de los valores de retención. La figura muestra la concentración de creatinina en suero de los animales tratados con EPO (IR + EPO), los animales tratados con NaCl (IR) y los animales operados de forma simulada (Schein-OP), antes de la herida por la reperfusión de la isquemia (IR), y 24 horas después. De la figura se desprende que la concentración de creatinina en suero en los animales tratados con Aranesp 24 horas después de la herida por la reperfusión de la isquemia, frente al control sin (tratamiento con NaCl) casi se redujo a la mitad.

La figura 7 muestra las curvas de supervivencia Kaplan-Mayer, de dos grupos de estudio después de la inducción de una insuficiencia renal crónica, la cual fue tratada o bien con Aranesp o bien con NaCl. En el estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley de 8 semanas de edad. Las ratas fueron narcotizadas con cetamina (120 mg/kg) y Rompun (10 mg/kg). A dichas ratas se les extirpó el riñón derecho el día 0, el cual enseguida después de la extracción se fijó en formalina para un estudio histológico. En el riñón izquierdo, se ligaron las arterias segmentadas, las cuales alimentan el polo superior e inferior del riñón. Con ello, se provocó un infarto renal de las áreas renales correspondientes y sólo quedó funcionando el tercio central del riñón. Una vez por semana se administró Aranesp (0,1 \mug/kg de peso corporal) a la ratas, o bien NaCl, por inyección s.c. Los animales tratados con Aranesp, un análogo de la eritropoyetina, presentaron una significativa ventaja de supervivencia con respecto a los animales tratados con sal común (p = 0,027; test Log Rank).

Las figuras 8-15 muestran cortes de riñón en microscopio óptico, 6 semanas después de la inducción de una insuficiencia renal crónica, en dos grupos de estudio, los cuales fueron tratados, o bien con Aranesp o bien con NaCl, y sus curvas de supervivencia Kaplan-Mayer están representadas en la figura 7.

La figura 8 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento de una vez por semana de NaCl, empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resulta a partir de la extracción del riñón derecho y del ligamento de las arterias segmentadas que alimentan los polos superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra una arteria de tamaño mediano preglomerular con una característica proliferación de la pared de los vasos en forma de cáscara de cebolla, en una grave lesión por hipertensión, una así llamada, nefro- esclerosis maligna con endarteritis Fahr.

La figura 9 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con NaCl una vez por semana, cada vez, empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resulta de la extracción del riñón derecho y del ligamento de las arterias segmentadas, que alimentan el polo superior y el polo inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra la gloméruloesclerosis florida focal-segmental, de la llamada FSGS proliferativa (glomérulo de la derecha). El otro glomérulo (de la izquierda) muestra un colapso isquémico del convoluto de lazos. En la parte inferior de la figura puede verse un pequeño vaso con graves daños endoteliales. Los cambios histológicos observados corresponden a un daño orgánico por hipertensión o respectivamente cambios en el marco de una nefropatía por sobrecarga después de 5/6 nefrectomías.

La figura 10 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con NaCl una vez por semana en cada caso, empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un periodo de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resultó de la extracción del riñón derecho y del ligamento de las arterias segmentadas, que alimentan el polo superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra una esclerosis casi completa o respectivamente, la destrucción de un glomérulo compensatorio aumentado, con una marcada hialinosis o respectivamente necrosis fibrinoide de las arteriolas aferentes pertenecientes al mismo.

La figura 11 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con NaCl una vez por semana en cada caso, empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resultó de la extracción del riñón derecho y del ligamento de las arterias segmentadas que alimentan el polo superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra una pequeña arteria preglomerular con una característica proliferación de las paredes del vaso en forma de cáscara de cebolla y una necrosis de la pared en una lesión por hipertensión grave, de una así llamada nefroesclerosis maligna (comparar con la parte derecha de la figura). A la izquierda puede verse una arteriola normal (todavía) no lesionada.

La figura 12 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con Aranesp (EPO) una vez a la semana, en cada caso, (0,1 \mug/kg de Aranesp) empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resultó de la eliminación del riñón derecho y del ligamento de las arterias segmentadas que alimentan el polo superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra un glomérulo normal con un delicado vaso aferente. En el intersticio del túbulo no se ha podido comprobar ningún hallazgo patológico.

La figura 13 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con Aranesp (EPO) una vez por semana, en cada caso, (0,1 \mug/kg de Aranesp) empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resultó de la extirpación del riñón derecho y del ligamento de las arterias segmentadas, que alimentan el polo superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra un glomérulo normal con un delicado vaso aferente (aumento de 630 veces). En el intersticio del túbulo no se pudo comprobar ningún hallazgo patológico.

La figura 14 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con Aranesp (EPO) una vez por semana, en cada caso, (0,1 \mug/kg de Aranesp) empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resultó de la extirpación del riñón derecho y el ligamiento de las arterias segmentadas, que alimentan el polo superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra un glomérulo normal con un delicado vaso aferente. En el intersticio del túbulo no se pudo comprobar ningún hallazgo patológico.

La figura 15 muestra los cambios histológicos en una rata Sprague-Dawley con insuficiencia renal crónica después de un tratamiento con Aranesp (EPO) una vez por semana, en cada caso, (0,1 \mug/kg de Aranesp) empezando directamente después de la inducción de la insuficiencia renal crónica durante un período de tiempo de 6 semanas. La insuficiencia renal crónica resultó de la extirpación del riñón derecho y el ligamiento de las arterias segmentadas, que alimentan el polo superior e inferior del riñón, del riñón izquierdo. La figura muestra un glomérulo normal con un delicado vaso aferente (aumento de 630 veces). En el intersticio del túbulo no se pudo comprobar ningún hallazgo patológico.

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Ejemplo de comparación 1

Acción del EPO en pacientes con anemia renal

Se investigó la acción de la eritropoyetina en pacientes con anemia renal (Hb < 10,5 g/dl) como consecuencia de una enfermedad renal en estadio terminal (insuficiencia renal preterminal; aclaramiento de creatinina < 35 ml/minuto). 11 pacientes fueron tratados durante un período de tiempo de por lo menos 8 semanas con eritropoyetina en dosis semanales de una media de 5000 IU de rhEPO (eritropoyetina recombinante humana) por vía intravenosa o respectivamente, subcutánea. Después del tratamiento con eritropoyetina las células progenitoras endoteliales de la sangre de los pacientes se investigaron durante un período de tiempo de 20 semanas, en las que después de 0, 2, 4, 6 y 8 semanas, se analizaron las células progenitoras endoteliales con respecto a su número así como también a su status diferencial, mediante citometría de flujo y un test de cultivo.

En el caso de las células sanguíneas madre periféricas circulantes (CPBSC) se trata de una pequeña población de células las cuales expresan tanto el antígeno CD34 como también el antígeno CD45. Sobre la base de las normas ISHAGE, se desarrolló un test para la determinación del número de células CPBSC mediante una citometría de flujo (Sutherland et al., J. Hematother., 5 (1996), 213-226). Con el empleo de este test se determinó tanto la muestra de expresión de las células CD34 y CD45 así como también la morfología de las células madre. De esta manera se determinó tanto el número absoluto de CPBSC por \mul, también la cantidad porcentual de CPBSC en el número total de leucocitos.

La figura 1 muestra los resultados de un análisis FACS de las células madre CD34^{+} sobre la base de la normativa ISHAGE.

La figura 2 muestra la cantidad de células madres CD34^{+} determinadas mediante el análisis FACS durante un período de tiempo de 8 semanas.

Test del cultivo de células

Se aislaron células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMCs) mediante centrifugación por densidades mediante un aparato Ficoll, de muestras de sangre humana correspondientes al procedimiento descrito en Asahara, Science, 275 (1997), 964-967. Las células fueron plaqueadas en placas de cultivo con fibronectina, y conservadas en medio basal EC. El medio basal EC está constituido por EBM-2-Basalmedium (de la firma Clonetics) y EGM-2 Quots (hEGF; GA-1000 (gentamicina, anfotericina-B) FBS, VEGF, hFGF-B (w/heparina), R^{3}-IGF-1, ácido ascórbico, heparina). Después de un cultivo de 4 días se eliminaron por lavado las células no adherentes de la placa. Las células adherentes restantes, se trataron con tripsina y se sembraron de nuevo. A continuación se cultivaron durante 3 días más. Las células con el fenotipo endotelial se identificaron por una coloración positiva respecto a dos distintos marcadores endoteliales en el día 7 después del aislamiento. A este respecto, se trata de una lipoproteína acetilada marcada con Dil, de pequeña densidad (acLDL-Dil) y aglutinina-1 de Ulex europaeus (UEA-1). Los resultados de este estudio están representados en la figura 3.

Los resultados muestran que la eritropoyetina de las células progenitoras endoteliales se movilizan, y que el número de células progenitoras endoteliales circulantes puede aumentar. A este respecto, se equilibran déficits funcionales que aparecen en determinadas circunstancias patológicas como por ejemplo, la anemia renal. Estos resultados están representados en la figura 4.

Mediante una citometría de flujo se determinó que en los pacientes con enfermedad renal en el estadio terminal, la cantidad de células madres circulantes CD34^{+} correspondía a la cantidad de células madres circulantes CD34^{+} en la sangre de voluntarios sanos. Después de empezar el tratamiento con eritropoyetina, aumentó significativamente el número de células madres CD34^{+} en el torrente sanguíneo en más de un 50%. Mediante el empleo del test del cultivo celular se determinó, que después del tratamiento con eritropoyetina, el número de células que desarrollaban un genotipo endotelial aumentaba espectacularmente. En un test de cultivo celular funcional, la capacidad fuertemente deteriorada de las células progenitoras endoteliales aumentó más del triple.

Ejemplo comparativo 2

Mejor curación de las heridas mediante el empleo sistémico de la rhEPO

Ratones FVB/N fueron narcotizados mediante anestesia por inhalación con isofloran. Se eliminó el pelo de las dos patas traseras con ayuda de una loción depiladora y se desinfectó con alcohol al 70%. Mediante un punzón desechable para biopsias de tejido de 4 mm, estéril, se provocó una herida en la piel sobre el flanco derecho del ratón, en cada caso. El lado contrario sirvió como control interno. Se efectuó una vez, un blindaje antibiótico postoperatorio con penicilina G (20.000 unidades/kg). Durante el período de tiempo de todo el estudio se efectuó una vez a la semana una inyección subcutánea de Aranesp, un análogo de la eritropoyetina recombinante humana (0,1 \mug/kg de peso corporal), durante todo el tiempo del estudio. El tratamiento empezó siete días antes de la extracción del trozo de tejido. Los resultados están representados en la figura 5. Estos muestran que la administración de la EPO acelera considerablemente el proceso de curación de las heridas.

Ejemplo de comparación 3

Disminución de la progresión de la insuficiencia renal crónica mediante tratamiento con eritropoyetina

Ratas Sprague-Dawley de ocho semanas de edad se narcotizaron con cetamina (120 mg/kg) y Rompun (10 mg/kg). Se extirpó el riñón derecho el día 0, el cual se fijó enseguida después de la extracción con formalina para un estudio histológico. En el riñón izquierdo se ligaron las arterias segmentadas que alimentan el polo superior e inferior del riñón. Con ello se provocó un infarto renal de la correspondiente área del riñón, del cual quedó funcionando solamente la tercera parte central del riñón. Las ratas recibieron una vez a la semana por inyección (s.c.) el Aranesp, un análogo de la eritropoyetina, en una dosis de 0,1 \mug/kg de peso corporal, o NaCl como control.

La figura 7 muestra las curvas de supervivencia de Kaplan-Mayer de ambos grupos del estudio. Los animales tratados con Aranesp tienen una evidente mejor supervivencia en comparación con los animales de control tratados con sal común.

En las figuras 12-15 se muestra que después del tratamiento con eritropoyetina, el tejido del riñón no muestra ningún cambio patológico, mientras que después del tratamiento con NaCl son visibles graves alteraciones patológicas (comparar las figuras 8-11). Otros estudios histológicos muestran que en los animales tratados con Aranesp puede observarse un evidente mayor grosor de los vasos (CD31) que en los animales tratados con sal común (datos no mostrados).

Ejemplo de comparación 4

Disminución de la progresión de la insuficiencia renal aguda

Para este estudio se emplearon ratas Sprague-Dawley con un peso corporal de 250 a 300 g. Uno de los grupos del estudio recibió una vez al día antes de la inducción de la insuficiencia renal, Aranesp en una dosis de 0,1 \mug/kg de peso corporal. Las ratas fueron narcotizadas con cetamina (120 mg/kg de peso corporal) y Rompun (10 mg/kg). Como comparación sirvió un grupo de animales del estudio los cuales fueron inyectados s.c. en cada caso con sal común simultáneamente. El flujo sanguíneo en el riñón se interrumpió durante 45 minutos colocando una pinza arterial sobre la arteria renal del riñón derecho. En este tiempo se efectuó en el lado izquierdo una nefrectomía. En otro grupo de control se efectuó una operación simulada. En este caso se abrió el abdomen, se dejó libre la arteria renal izquierda, aunque no se interrumpió el aporte de sangre, y se extirpó el riñón contralateral derecho. Todos los animales fueron narcotizados durante un periodo de tiempo de 60 minutos, y 24 horas después de la operación, se sacrificaron.

La isquemia de 45 minutos con la subsiguiente reperfusión del riñón derecho restante, condujo en los animales tratados con sal común a una masiva aguda pérdida de función renal. Esta encontró su expresión en un valor de creatinina en suero aumentada alrededor del factor 7 (p < 0,05). Por el contrario, los animales tratados con Aranesp, un análogo de la eritropoyetina, mostraron solamente un aumento cuatro veces mayor del valor de la creatinina en suero un día después de la inducción de la lesión por reperfusión de la isquemia. En el caso de los animales nefrectomizados en el lado izquierdo con riñones derechos operados simuladamente, no se observó ningún aumento de los valores de retención. Los resultados están representados en la figura 6.

Claims

1. Empleo de la eritropoyetina para la preparación de una composición farmacéutica para la terapia de la diabetes mellitus, en donde la eritropoyetina (EPO) se emplea en dosis subpolicitémicas de 1 a 90 unidades (IU) de EPO/kg de peso corporal/semana.

2. Empleo de la eritropoyetina para la preparación de una composición farmacéutica para la terapia de la diabetes mellitus, en donde la composición farmacéutica se obtiene para la administración de la eritropoyetina (EPO) en dosis subpolicitémicas de 1 a 90 unidades (IU) de EPO/kg de peso corporal/semana.

3. Empleo según la reivindicación 1 ó 2, en donde la composición farmacéutica es apropiada para la administración parenteral, en particular intravenosa, intramuscular, intracutánea o subcutánea.

4. Empleo según la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde la composición farmacéutica está preparada como inyección o infusión.

5. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición farmacéutica es apropiada para la administración pulmonar.

6. Empleo según la reivindicación 5, en donde la composición farmacéutica está preparada como solución acuosa, solución no acuosa, o como un polvo.

7. Empleo según la reivindicación 5 ó 6, en donde la composición farmacéutica está en forma de un preparado de aerosol.

8. Empleo según la reivindicación 1 ó 2, en donde la composición farmacéutica es apropiada para la administración oral.

9. Empleo según la reivindicación 8, en donde la composición farmacéutica está preparada como una solución, suspensión, emulsión, o en comprimidos.

10. Empleo según una de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la composición farmacéutica contiene por lo menos otra substancia activa para la estimulación de las células progenitoras endoteliales.

11. Empleo según la reivindicación 10, en donde la otra substancia activa, es el VEGF, PIGF, GM-CSF, un inhibidor de la HMG-CoA-reductasa, y/o un dador de NO.

12. Empleo según la reivindicación 11, en donde el inhibidor de la HMG-CoA-reductasa es una estatina como la simvastatina, mevastatina o atorvastatina.

13. Composición farmacéutica para emplear en la terapia de la diabetes mellitus, en donde la eritropoyetina (EPO) está contenida en dosis subpolicitémicas para la administración de 1 a 90 unidades (IU) de EPO/kg de peso corporal/semana.

14. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 13, en donde la composición farmacéutica es adecuada para la administración parenteral, en particular intravenosa, intramuscular, intracutánea o subcutánea.

15. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 13 ó 14, en donde la composición farmacéutica está preparada como inyección o infusión.

16. Composición farmacéutica para emplear según una de las reivindicaciones 13 a 15, en donde la composición farmacéutica es apropiada para la administración pulmonar.

17. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 16, en donde la composición farmacéutica está preparada como solución acuosa, solución no acuosa, o como polvo.

18. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 16 ó 17, en donde la composición farmacéutica está en forma de un preparado de aerosol.

19. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 13, en donde la composición farmacéutica es apropiada para la administración oral.

20. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 19, en donde la composición farmacéutica, está preparada como una solución, suspensión, emulsión o en comprimidos.

21. Composición farmacéutica para emplear según una de las reivindicaciones 13 a 20, en donde la composición farmacéutica contiene por lo menos otra substancia activa para la estimulación de las células progenitoras endoteliales.

22. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 21, en donde la otra substancia activa es el VEGF, PIGF, GM-CSF, un inhibidor de la HMG-CoA-reductasa, y/o un dador de NO.

23. Composición farmacéutica para emplear según la reivindicación 22, en donde el inhibidor de la HMG-CoA-reductasa es una estatina como la simvastatina, mevastatina o la atorvastatina.