ES2345184T3 - Extractos anti-bacterianos a partir de mammea americana. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutico y la composición preparada en un método que comprende - extracción de un material vegetal en cloruro de metileno, - contacto del material extraído con un sistema cromatográfico de separación, y - elución del sistema cromatográfico de separación con una fase móvil polar para obtener una composición, en donde el material vegetal es de Mammea Americana, en donde la composición tiene actividad antimicrobiana, y en donde la composición farmacéutica se utiliza como un medicamento.

Description

Extractos anti-bacterianos a partir de Mammea americana.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al aislamiento y el uso de los compuestos extraídos y purificados de una planta, que tienen actividad anti-microbiana y anti-micobacteriana.

Antecedentes de la invención

El género Mycobacterium incluye numerosas especies bacterianas que causan enfermedad en el hombre, otros mamíferos, y aves. Por ejemplo, M. tuberculosis es el agente causal de la enfermedad infecciosa más frecuente en el mundo de hoy, la tuberculosis. The World Health Organization (WHO) reportó que 1.7 billones de personas (o aproximadamente un tercio de la población mundial) están o han sido infectados en algún momento de sus vidas por la M. tuberculosis. Kochi, A. Tubercle 72:1-6 (1991). Se estima que 10 a 15 millones de personas en EE. UU., tienen infecciones latentes. Morbidity and Mortality Weekly Report 39(RR-8):9-12 (1990). Se calcula que 8 millones de nuevos casos clínicos de tuberculosis ocurren en todo el mundo por año y aproximadamente 3 millones de personas mueren cada año. Morbidity and Mortality Weekly Report 42 (49):961-964 (1993).

Las micobacterias del complejo MAC (fundamentalmente M. avium y M. intracellulare) son patógenos oportunistas en pacientes con SIDA. Aproximadamente el 43% de los pacientes con SIDA en etapas avanzadas de la enfermedad sufren infecciones por MAC. Nightingale et al., J. Infect. Dis. 165:1082-1085 (1992). Además de las infecciones relacionadas con el SIDA, se piensa que M. paratuberculosis, una subespecie de M. avium se asocia con la enfermedad de Crohn, una enfermedad inflamatoria del intestino. Chiodini, R. J. Clin. Micro. Rev. 2:90-117 (1989).

Las micobacterias adicionales que se consideran patógenos humanos, incluyen M. leprae, M kansasii, M. marinum, complejo M. fortuitum, M. bovis, M. scrofulaceu, y M. ulcerans. Baron, S., editor, MEDICAL MICROBIOLOGY, Second Edition, pages 562-564 Addison-Wesley Pub. Co., Menlo Park, CA (1996); Wayne, L. G. et al., Clin. Micro. Rev. 5:1-25 (1992). Existe un estimado de 5.5 millones de casos de infecciones de M. leprae en todo el mundo. Nordeen, S. K. et al., Int. J. Lepr. 63:282-287 (1993).

M. paratuberculosis también causa una inflamación intestinal en rumiantes, más comúnmente conocida como enfermedad de Johne. Thoen, C. O. et al., Rev. Infect. Dis. 3:960-972 (1981). El ganado que resulta positivo para M. paratuberculosi se sacrifica y destruye. La incidencia entre los rebaños en todo el país normalmente oscila entre el 3% y 18%. Merkal, R. S. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 190:676-680 (1987). El impacto financiero de esta enfermedad en la industria láctea excede \textdollar1.5 billones anualmente. Whitlock, R. PROCEED. OF THE THIRD INTERNAT. COLLOQ. PARATUBERCUL., pp.514-522 (1991). M. bovis es otra micobacteria de importancia en medicina veterinaria. M. fortuitum es una bacteria del suelo que ha sido aislada de lesiones en animales y humanos. M. avium causa una enfermedad en los pollos, una grave preocupación para la industria avícola. M. marinum infecta los animales de sangre caliente y el pescado; también ha sido aislado a partir de granulomas superficiales en las extremidades de humanos.

Los extractos de varias cientos de especies de plantas han sido probados a la fecha para actividad anti-cancerosa, anti-microbiana, anti-bacteriana y, algunas veces, anti-micobacteriana. El extracto total o, algunas veces el aceite del tejido de planta que va desde hoja, tronco, y raíz, se demostró que tiene varios niveles de actividad. En la mayoría de los casos, la composición química del material no ha sido descrita. Para una revisión, ver Newton et al., Phytother. Res., 14:303-322 (2000). Ver también Soliman et al., Flavour and Fragrance Journal, 9(1): 29-33 (1994); Hebda, Dissertation Abstracts International, 53(4-C): 737 (1991); Robbs, Dissertation Abstracts International, 58(6-B): 3009 (1997); Kurtulik, Dissertation Abstracts International, 43(4-B): 1050 (1982); Oguntimein, Dissertation Abstracts International, 42(02-B): 577 (1981); Frame et al., P. R. Health Sci. J., 17: 243-252 (1998); Lall et al., J Ethnopharmacol, 66: 347-354 (1999); y Rastogi et al., FEMS Immuno. Med. Microbiol. 20: 267-273 (1998). Por lo tanto, permanece una necesidad para la identificación de compuestos químicos puros y efectivos anti-micobacteriano. Generalmente, los resultados fueron decepcionantes en lo que respecta a la identificación de extractos de planta de plomo con actividad antimicobacteriana. Ver Newton (2000) supra. Sin embargo, ver Rejab et al., Phytotherapy Research, 14: 303-322 (2000), George et al., Phytotherapy Research, 14: 303-322 (2000), y Lall et al, supra.

La naturaleza lipoidal de la pared celular micobacteriana parece contribuir a la supervivencia de la micobacteria haciéndolas resistentes al secado y condiciones ácidas o alcalinas. Por ejemplo, las micobacterias sobreviven a condiciones ácidas o alcalinas y a la esterilización con calor de duración limitada. Se ha demostrado que el Mycobacterium es una bacteria dura, difícil de controlar. Nuevas micobacterias infectivas se pueden recuperar después de varios meses de cultivos viejos o superficies contaminadas. Se necesitan nuevos agentes que puedan controlar la contaminación bacteriana.

Un nuevo temor de tuberculosis ha resultado de los reportes sobre brotes con cepas resistentes a multifármacos de M. tuberculosis (MTB) en los Estados Unidos. Estas cepas son resistentes a al menos la mayoría de los fármacos antituberculóticos importantes, isoniacida y rifampicina. La frecuencia de la tuberculosis resistente a los multifármacos en EE. UU., se reporto que es 3-7% y cerca del 19% en New York. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevos y efectivos agentes antimicobacterianos para reemplazar o adicionar a aquellos en uso en la actualidad.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutico y una composición preparada por el método descrito a continuación, en donde la composición farmacéutica se utiliza como un medicamento para inhibir particularmente el crecimiento de un mycobacterium.

De acuerdo con la invención, la composición se prepara en un método que comprende la extracción de un material vegetal en cloruro de metileno, contacto del material extraído con un sistema cromatográfico de separación, y la elución del sistema cromatográfico de separación con una fase móvil polar para obtener una composición. El material vegetal se obtiene de Mammea Americana y la composición tiene actividad antimicrobiana.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la invención, se proporciona un método para inhibir el crecimiento de un mycobacterium, que comprende la administración de la composición obtenida por el método anterior. La micobacteria es M. avium, M. bovis, M. intracellulare, M. kansaii, M. leprae, M. marinum, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. fortuitum, M. tuberculosis, o M. ulcerans.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un análisis por Cromatografía de Gases/Espectroscopia de Masas (GC/MS) de una fracción activa de Mammea Americana. El material se preparó por combinación de 4 corridas de HPLC, se concentra a 1 gota a la cual se le adicionaron aproximadamente 0.3 ml de metanol. 10 \mul se analizaron por GC/MS. Los picos fueron identificados. El pico a 13 minutos es el cobaltoceno, 1,1',2,2',3,3'.4,4'-octomet, el pico pasados justo 30 minutos es estigmastan-3,5-dieno, y el pico pasados justo 36 minutos es la friedelina.

La Figura 2 es un análisis de Gas Masa/Espectroscopia de Masas (GC/MS) de una fracción activa de Marchantaceae polymorpha (ejemplos comparativos). El material se preparó por combinación de 8 corridas de HPLC, se concentró a 1 gota a la cual se le adicionaron aproximadamente 0.3 ml de metanol. Se analizaron 10 \mul por GC/MS. Los picos fueron identificados. El pico a 13 minutos es el cobaltoceno, 1,1',2,2.'',3,3',4,4'-octomet.

La Figura 3 es un análisis Gas Masa/Espectroscopia de Masas (GC/MS) de una fracción activa de Callistemon citrinus (ejemplos comparativos). El material se preparó por combinación de 4 corridas de HPLC, se concentró a 1 gota a la cual se le adicionaron aproximadamente 0.3 ml de metanol. Se analizaron 10 \mul por GC/MS. Los picos fueron identificados. El pico justo antes de los 20 minutos es la galoxolide, seguido por un pico que comprende benzil salicilato.

Descripción detallada de la invención

La invención fue posible gracias a la identificación y aislamiento de las fracciones y los compuestos purificados de plantas, que demostraron que tienen actividad antimicrobiana. De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición preparada por un método de preparación de una composición que tiene actividad antimicrobiana. El método comprende la extracción de un material vegetal en cloruro de metileno, el contacto del material extraído con un sistema de separación por cromatografía, y la elución del extracto a partir del sistema de separación por cromatografía con una fase móvil polar para obtener una composición que tiene actividad antimicrobiana. El material vegetal es de Mammea Americana. Se describen también los extractos de Marchantaceae polymorpha, o Callistemon citrinus.

Cualquier parte de la planta se puede someter al procedimiento de extracción. Por ejemplo, semillas, tronco, hojas, flor, o savia de planta pueden ser el material vegetal que se extrae con un solvente orgánico. De acuerdo a una modalidad preferida, el material vegetal es la hoja.

El solvente orgánico es el cloruro de metileno. Las soluciones reguladoras o sales se pueden adicionar de una manera que es bien conocida por un experto en el oficio. También se describen otros solventes. Un solvente que une el hidrógeno puede ser, por ejemplo, un solvente que contiene hidroxi, un carboxi, o una amina. Se describe como solvente un alcohol, tal como el etanol. De acuerdo con la presente invención, el solvente es el cloruro de metileno. Los procedimientos de extracción actuales son bien conocidos en el oficio. Por ejemplo, ya sea agitando en un solvente o con un goteo del solvente sobre el tejido de la planta puede ser utilizado.

El sistema cromatográfico de separación puede ser de cualquier tipo apropiado. Cualquier sistema de separación que permita el uso de una fase móvil polar puede ser utilizado en la invención. Preferiblemente, el sistema cromatográfico de separación tendría suficiente capacidad para la separación de tanto material vegetal como sea posible. Por ejemplo, la separación puede ser cromatografía de capa delgada (TLC), una columna de sefadex o sefarosa, DEAE-celulosa, o un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En una modalidad preferida, la separación cromatográfica es un sistema de HPLC. De acuerdo con una modalidad, una columna basada en amida se
utiliza.

Cualquier fase móvil polar puede ser utilizada, para obtener un compuesto aislado y puro o grupo de compuestos. Generalmente, una fase móvil más polar se prefiere sobre una fase móvil menos polar. Preferiblemente, el solvente puede comprender un solvente polar y una sal, tal como NaCl, o ácido fosfórico. La fase móvil polar puede comprender un solvente que une el hidrógeno. El solvente que une el hidrógeno debería, por ejemplo, ser un solvente basado en un hidroxi, carboxi, o una amina. En una modalidad, el solvente de la fase móvil contiene un alcohol. De acuerdo a una modalidad preferida el solvente de la fase móvil es el metanol, y, en conformidad con una modalidad más preferida, la fase móvil polar comprende una mezcla de metanol y ácido fosfórico. De acuerdo con una modalidad preferida la fase móvil metanol-ácido fosfórico comprende de 1 mM a al menos aproximadamente 20 mM de ácido fosfórico, de preferencia cerca de 10 mM. La fase móvil polar puede ser isocrática, i.e. una concentración, o puede ser un gradiente de 1% a 99%.

Las fracciones se recolectan y analizan mediante cualquiera de las técnicas analíticas apropiadas, por ejemplo por visualización ultra-violeta del material eluido como una función del tiempo, o por el uso de TLC. Una fracción que tiene actividad anti-microbiana luego se identifica. Una vez que se conoce un conjunto de condiciones, entonces puede convertirse en el estándar para la recolección de fracciones o compuestos activos, por ejemplo, el tiempo de retención en una columna bajo un conjunto de condiciones es una guía para otro aislamiento de fracciones o compuestos activos purificados de la misma planta.

Las fracciones aisladas, así como los compuestos aislados y purificados de estas fracciones se evaluaron para la actividad antimicrobiana. Las fracciones y compuestos que tienen actividad antimicrobiana de ahora en adelante en lo sucesivo se refieren como "activo".

Por ejemplo, una actividad anti-microbiana se puede demostrar por el contacto del material extraído, la fracción purificada y aislada, o un compuesto purificado y aislado, o una composición de estos, con un microbio y determinando la susceptibilidad del microbio. El microbio puede ser cualquier microbio, por ejemplo, una bacteria, un hongo, o un protozoo. Preferiblemente, el microbio es una bacteria. Más preferiblemente, la bacteria es del género Escherichia o el género Mycobacterium. Más preferiblemente incluso, el Mycobacterium es una bacteria patogénica, patogénica al hombre, animales o aves. Más preferiblemente, la bacteria es M. tuberculosis.

Un experto en el oficio sabrá como determinar la susceptibilidad mediante ensayos estándar, bien conocidos en el oficio. El experto en el oficio sabrá cómo llevar a cabo el ensayo incluyendo los controles apropiados, negativos y positivos, para asegurar que los resultados del ensayo sean significativos. El ensayo elegido podría depender del organismo probado para la susceptibilidad. Para ejemplos de ensayos micobacterianos (los cuales se pueden convertir fácilmente por un experto para probar otros microbios) ver Newton et al, supra (2000). Por ejemplo, más comúnmente, los métodos de prueba empleados son la difusión de disco y los métodos de dilución en caldos. En el método de difusión de disco, discos de papel impregnados con el extracto sometido a la prueba se colocan en un medio semi-sólido (basado en agar) que ha sido inoculado con la micobacteria. Después de la incubación, se miden las zonas de inhibición de crecimiento bacteriano alrededor de los discos. En el método de dilución en caldo, la concentración mínima necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano (concentración inhibitoria mínima, MIC) se determina utilizando una serie de tubos que contienen diluciones seriales del extracto en caldos inoculados.

Para la selección de alto rendimiento, se conocen métodos rápidos que puede ser automatizados; estos han sido revisados por Gordon et al., Phytotherapy Research 14:303-322 (1996). Por ejemplo, midiendo la evolución de ^{14}CO_{2} de M. tuberculosis cultivado en medio que contiene ácido palmítico-^{14}C constituye la base para el sistema BACTE (Becton-Dickinson, Oxford, UK). El sistema BACTE se utiliza para la prueba de susceptibilidad de aislados clínicos y pueden proporcionar resultados en unos pocos días en comparación con 3-4 semanas para los métodos convencionales. Chung et al., Phytotherapy Research 14: 303-322 (1995) desarrolló un ensayo basado en la medición de la absorción del uracilo radiomarcado en M. aurum.

Se desarrollaron ensayos, en los cuales la viabilidad de la micobacteria se determina utilizando ya sea luciferasa bacteriana o de luciérnaga. La enzima bacteriana utiliza flavina reducida (producida por la micobacteria viable) para oxidar un sustrato de aldehído adicionado (decanal) que se acompaña por la producción de luz a 490 nm. La luciferasa de luciérnaga depende del ATP generado por la micobacteria a decarboxilato luciferina, resultando en la producción de luz a 562 nm. La producción de la luz se puede medir fácilmente utilizando un luminómetro en los sistemas de alto rendimiento. Varias especies de micobacterias, incluyendo M. tuberculosis, han sido modificadas genéticamente mediante la inserción de los genes para la producción de luciferasa bacteriana; solo los bacilos viables emiten luz cuando se adiciona decanal y no existe la necesidad del crecimiento, de tal manera que la prueba de susceptibilidad se puede llevar a cabo rápidamente. Del mismo modo, el gen para la luciferasa de luciérnaga ha sido incorporado en un número de especies de micobacterias incluyendo M. Aurum. Id.

Los métodos colorimétricos son apropiados para utilizar en placas de microtitulación y los resultados se pueden obtener fácilmente utilizando un espectrofotómetro. Gomez-Florex et al. J. Clin. Microbiol. 33: 1842-1846 (1995) reportó como ensayo para la prueba contra el complejo M. avium que depende de la capacidad de bacterias viables para reducir el dimetiltiazoldifeniltetrazolio a formazan. Otro método similar utiliza el colorante redox azul Alamar, que cambia de color azul a rosa en la presencia de M. tuberculosis viable (Yajko et al., J. Clin. Microbiol. 33:2324-2327 (1995).

Puede ser útil evaluar la capacidad de los compuestos de plantas para inhibir M. tuberculosis en los macrófagos humanos cultivados. Esto se puede llevar a cabo mediante la metodología de Crowle and May, Antimicrob. Agents Chemother. 34:2217-2222 (1990).

Un experto en el oficio apreciará que una fracción, compuesto o compuestos "aislados y puros" siempre van acompañados de algún otro material. En este documento, una fracción, compuesto o compuestos "aislados y puros" hace referencia a una fracción, compuesto o compuestos, que es al menos 100, preferiblemente 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o más de 10000 veces más abundante en peso, o volumen, o peso/volumen a su peso, o volumen, o peso/volumen en el material inicial (en este documento, el tejido de la planta). Por otra parte, un experto puede expresar "aislado y purificado" en términos de pureza. Si es así, la fracción activa, compuesto, o compuestos de la invención son al menos 70%, preferiblemente, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, o más puros, en relación con el material inicial (en este documento, el tejido de la planta).

Inicialmente, el tejido de Mammea Americana, Marchantaceae polymorpha (por comparación), y Callistemon citrinus (por comparación), fue extraído, por separado con etanol y se demostró que el extracto tenía actividad contra E. coli y M. smegmatis. El análisis por Cromatografía de Gases/Espectroscopia de Masas (GC/MS) y la comparación del perfil resultante con el perfil de los compuestos conocidos, reveló un gran grupo de compuestos en el extracto. Por ejemplo, los compuestos conocidos se pueden identificar por este método comparando el perfil con perfiles conocidos en bases de datos. Una base de datos preferible, es una biblioteca de patrones de craqueo molecular, denominado como la Biblioteca de Espectroscopia de Masas 129K NIST, disponible de National Institute of Standards and Technology, Washington, DC. Cuando el mismo grupo de extracción y análisis (actividad anti-microbiana y GC/MS) se realizó en material vegetal adicional, pero el solvente de extracción fue cloruro de metileno, el número de compuestos identificados en el extracto anti-microbiano activo fue menor (por lo tanto cada uno más puro). Más interesante, a pesar del hecho que el compuesto activo estaba presente en ambos extractos, hubo pocas coincidencias entre los compuestos en los extractos con etanol y con cloruro de metileno (y para algunas plantas sin solapamiento). Ver las Tablas 2-4. Estas proporcionan una indicación que solo unos o muy pocos compuestos fueron responsables para la actividad anti-microbiana en cada planta, y si más de un compuesto, los compuestos activos tienen propiedades de solubilidad muy similares, ya que se co-purifican en dos diferentes sistemas de extracción.

Los extractos de cloruro de metileno a partir de Mammea Americana, Marchantaceae polymorpha (por comparación), o Callistemon citrinus (por comparación) se separaron en un sistema de HPLC. Las fracciones activas se identificaron. Los compuestos activos después se identificaron. Los compuestos a partir de la Mammea Americana incluyen cobaltoceno-octomet, estigmastan-3,5-dieno, y friedelina. Además, la estimación de las propiedades químicas de los compuestos en el extracto antes del fraccionamiento indica que uno o más de \alpha-cariofileno, \beta-cariofileno, óxido de cariofileno, ciclododecano, ácido acético, y un terpeno también pueden estar presentes en cantidades de trazas (i.e. no detectable por GC/MS, bajo las condiciones descritas en este documento).

Los compuestos a partir de Marchantaceae polymorpha (por comparación) incluyen ácido acético, cobaltoceno-octomet, y \beta-mirceno. Además, la estimación de las propiedades químicas de los compuestos en el extracto antes del fraccionamiento indica que el ácido hexadecanoico también puede estar presente en cantidades de trazas.

Los compuestos a partir del Callistemon citrinus (por comparación) incluyen galoxilide, benzil salicilato, eucaliptol, y \alpha-pipeno. Además, la estimación de las propiedades químicas de los compuestos en el extracto antes del fraccionamiento indica que uno o más del 3-ciclohexano-1-metanol, canfeno, 1,4-cicloprop-azuleno, o fitol también pueden estar presentes en cantidades de trazas.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutico y una composición preparada por el método descrito anteriormente se proporcionan de acuerdo con una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende el cobaltoceno-octomet, estigmastan-3,5-dieno, y friedelina. La composición farmacéutica además puede comprender al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de \alpha-cariofileno, \beta-cariofileno, óxido de cariofileno, friedelina, ciclododecano, ácido acético, y un terpeno.

También se describe una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutico y al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de galoxolide, benzil salicilato, eucaliptol, y \alpha-pipeno y una composición que comprende galoxolide, benzil salicilato, eucaliptol, y \alpha-pipeno, que además opcionalmente comprende al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de 3-ciclohexano-1-metanol, canfeno, 1,4-cicloprop-azuleno, y fitol.

La composición farmacéutica puede incluir sales y portadores farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas derivadas a partir de ácidos minerales, tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como ácido tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico, y arilsulfónico. Un ejemplo de ácido arilsufónico es el ácido p-toluenosulfónico. Por ejemplo, un grupo carboxilo del compuesto o fracción se pueden convertir a sales conocidas por aquellos de habilidad promedio en el oficio, por ejemplo, una sal de un metal alcalino (por ejemplo, sodio o potasio), metal alcalinotérreo (por ejemplo, calcio), o amonio de sal. La presente invención además proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto (o compuesto o fracción) descrito anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

Generalmente, la composición farmacéutica de la presente invención como se describe anteriormente será administrada en una composición farmacéutica a un individuo infectado o sospechoso de estar infectado por un microbio patogénico, por ejemplo un mycobacterium. Aquellos que experimentan o a punto de someterse a la quimioterapia se puede tratar con los compuestos o fracciones por separado o en conjunción con otros tratamientos, según el caso. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una limitación del crecimiento del microbio patogénico. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis efectiva terapéuticamente". Las cantidades efectivas para un uso terapéutico o profiláctico dependerán de, por ejemplo, la etapa y severidad de la enfermedad que se trata, la edad, el peso, y el estado general de salud del paciente, y el juicio del médico prescriptor. El tamaño de la dosis también será determinado por el compuesto o la fracción seleccionada, método de administración, tiempo y frecuencia de administración así como la existencia, naturaleza, y magnitud de cualquiera de los efectos secundarios adversos que puedan acompañar la administración de un compuesto o fracción particular y el efecto fisiológico deseado. Será apreciado por alguien de habilidad en el oficio que varios estados de la enfermedad pueden necesitar un tratamiento prolongado que involucra administraciones múltiples, tal vez utilizando una serie de diferentes compuestos o fracciones de la invención en cada una o varias rondas de
administración.

La dosis y regímenes de dosificación apropiados se pueden determinar por técnicas convencional de rango de detección conocidas por aquellos de habilidad en el oficio. Generalmente, el tratamiento se inicia con dosificaciones más pequeñas que son menores que la dosis óptima del compuesto o fracción. Después de esto, la dosificación se aumenta, mediante pequeños incrementos hasta que el efecto óptimo, bajo las circunstancias, se alcanza. El presente método inventivo puede involucrar la administración de aproximadamente 0.1 \mug a aproximadamente 50 mg de uno o más de los compuestos o fracciones por kg de peso corporal del individuo. Para un paciente de 70 kg, las dosificaciones de aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 200 mg del compuesto o fracción deberían ser utilizadas más comúnmente, dependiendo de la respuesta fisiológica del paciente, según se determina por la medición de la limitación o inhibición del crecimiento del patógeno.

Se debe tener en cuenta que las composiciones de la presente invención se pueden emplear en muchos estados de la enfermedad incluyendo situaciones que amenazan la vida o que amenazan potencialmente la vida. Es posible y se puede considerar deseable por el médico tratante administrar algún o sustancial exceso de la composición. Las administraciones múltiples o únicas de los compuestos o fracciones se pueden llevar a cabo con niveles de dosis y patrón que se seleccionan por el médico tratante.

Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico están destinadas a la administración parenteral, tópica, oral o local y generalmente comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y una cantidad del ingrediente activo suficiente para inhibir el crecimiento del microbio patogénico. El portador puede ser cualquiera de aquellos utilizados convencionalmente y se limita solo por las consideraciones químico-físicas, tales como solubilidad y pérdida de reactividad con el compuesto o fracción, y por la ruta de administración.

El portador farmacéuticamente aceptable (o excipiente) es preferiblemente uno que sea inerte químicamente al compuesto o fracción o el compuesto activo y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad bajo las condiciones de uso. Tales portadores farmacéuticamente aceptables preferiblemente incluyen solución salina (por ejemplo, solución salina al 0.9%), Cremophor EL (que es un derivado de aceite de castor y óxido de etileno disponible de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (por ejemplo, 5% de Cremophor EL/5% de etanol/90% de solución salina, 10% de Cremophor EL/90% de solución salina, o 50% de Cremophor EL/50% de etanol), propileno glicol (por ejemplo, 40% de propileno glicol/10% de etanol/50% de agua), polietileno glicol (por ejemplo, 40% de PEG400/60% de solución salina), y alcohol (por ejemplo, 40% de t-butanol/60% de agua). Un portador farmacéutico preferido es el polietileno glicol, tal como PEG 400, y particularmente una composición que comprende 40% de PEG 400 y 60% de agua o solución salina. La elección del portador será determinada en parte por el compuesto o fracción particular elegidos, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. En consecuencia, existe una amplia variedad de formulaciones apropiadas de la composición farmacéutica de la presente
invención.

Las siguientes formulaciones para la administración oral, con aerosol, parenteral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intramuscular, interperitoneal, rectal, y vaginal son solamente como ejemplos y no son de ninguna manera limitantes. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas vía parenteral, por ejemplo, vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intradérmica, o intramuscular. Por lo tanto, la invención proporciona las composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución del compuesto o fracción disuelta o suspendida en un portador apropiado aceptable para la administración parenteral, incluyendo soluciones acuosas y no-acuosas, de inyección estéril isotónica.

En general, los requisitos para los portadores farmacéuticos efectivos para composiciones parenterales son bien conocidos por aquellos de habilidad en el oficio. Ver Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986). Tales composiciones incluyen soluciones que contienen anti-oxidantes, soluciones reguladoras, bacteriostáticos, y solutos que suministran la formulación isotónica con la sangre del receptor pretendido, y suspensiones estériles acuosas y no-acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes de espesor, estabilizantes, y conservantes. El compuesto o fracción puede ser administrado en un diluente fisiológicamente aceptable en un portador farmacéutico, tal como un líquido estéril o mezcla de líquidos, incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionados, un alcohol, tal como etanol, isopropanol, o hexadecil alcohol, glicoles, tal como propileno glicol o polietileno glicol, dimetilsulfoxido, glicerol cetales, tal como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, tal como poli(etilenoglicol) 400, un aceite, un ácido graso, un éster de ácido graso o glicérido, o un glicérido de ácido graso acetilado con o sin la adición de un agente tensoactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, o carboximetilcelulosa, o agentes emulsificantes y otros adyuvantes
farmacéuticos.

Aceites útiles en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animal, vegetal, y sintético. Ejemplos específicos de aceites útiles en tales formulaciones incluyen aceite de cacahuete, soja, ajonjolí, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina, y mineral. Los ácidos grasos apropiados para utilizar en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico, y ácido isoesteárico. El oleato etílico y el isopropil miristato, son ejemplos de ésteres de ácidos grasos apropiados.

Los jabones apropiados para utilizar en formulaciones parenterales incluyen sales de metal alcalino graso, amonio, y trietanolamina, y los detergentes apropiados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, dimetil dialquil amonio haluros, y alquil piridinio haluros, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, alquilo, arilo, y olefina sulfonatos, alquilo, olefina, éter, y monoglicérido sulfatos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos, y copolímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfotéricos tales como, por ejemplo, sales de amonio cuaternario alquilo-\beta-aminopropionatos, y 2-alquilo-imidazolina, y (e) mezclas de estos.

Las formulaciones parenterales normalmente contendrán de aproximadamente 0.5% o menos de aproximadamente 25% o más en peso del ingrediente activo o compuesto o fracción en solución. Se pueden utilizar conservantes y soluciones reguladoras. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección, tales composiciones pueden contener uno o más agentes tensoactivos no-iónicos que tienen un balance hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de agente tensoactivo en dichas formulaciones normalmente variará de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso. Los agentes tensoactivos apropiados incluyen ésteres de ácido graso de sorbitan polietileno, tal como sorbitan monooleato y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrofóbica, formados por la condensación de óxido de propileno con el propileno glicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en dosis de unidad o recipientes multi-dosis sellados, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en una condición de (liofilizado) que requiere solo de la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos, gránulos, y comprimidos
estériles.

Las formulaciones tópicas, incluyendo aquellas que son útiles para liberación transdérmica de fármacos, son bien conocidas por aquellos de habilidad en el oficio y son apropiadas en el contexto de la presente invención para aplicación en la piel.

Las formulaciones apropiadas para la administración oral pueden consistir de (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva del compuesto o fracción disuelta en diluentes, tales como agua, solución salina, o jugo de naranja; (b) cápsulas, sobres, tabletas, pastillas, y comprimidos medicinales, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del compuesto o fracción, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y (e) emulsiones apropiadas. Las formulaciones líquidas puede incluir diluentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico, y los alcoholes de polietileno, ya sea con o sin la adición de un agente tensoactivo, agente de suspensión, o agente de emulsificación farmacéuticamente aceptable. Las formas de cápsulas pueden ser del tipo normal de gelatina dura o blanda que contiene, por ejemplo, agentes tensoactivos, lubricantes, y rellenos inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, y almidón de maíz. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, sodio croscarmeloso, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico, y otros excipientes, colorantes, diluentes, agentes de estandarización, agentes desintegrantes, agentes de humectación, conservantes, agentes saborizantes, y excipientes farmacológicamente compatibles. Las formas de pastillas pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como las pastillas que comprenden un compuesto o fracción en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia, emulsiones, geles, y similares que contienen, además del compuesto o fracción, dichos excipientes según se conocen en el oficio.

La composición de la presente invención, sola o en combinación con otros componentes apropiados, se pueden hacer en formulaciones en aerosol que se administran vía inhalación. Los compuestos o fracciones se suministran preferiblemente en forma dividida finamente a lo largo con un agente tensoactivo y un propulsor. Los porcentajes típicos del compuesto o fracción activa pueden ser aproximadamente 0.01% a aproximadamente 20% en peso, de preferencia cerca de 1% a aproximadamente 10% en peso. El agente tensoactivo debe, por supuesto, no ser tóxico, y preferiblemente soluble en el propulsor. Representativos de dichos agentes tensoactivos son los ésteres o ésteres parciales de ácido grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, laurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico con un alcohol polihídrico alifático o su anhídrido cíclico. Ésteres mezclados, tales como glicéridos mezclados o naturales se pueden emplear. El agente tensoactivo puede constituir de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 20% en peso de la composición, preferiblemente de aproximadamente 0.25% a aproximadamente 5%. El balance de la composición es ordinariamente propulsor. Un portador también puede ser incluido según se desee, por ejemplo, lecitina para la administración intranasal. Estas formulaciones en aerosol se pueden colocar en propulsores presurizados aceptables, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno, y similares. También se pueden formular como productos farmacéuticos para preparaciones no-presurizadas, tales como en un nebulizador o un atomizador. Tales formulaciones en aerosol se pueden utilizar para atomizar la
mucosa.

Adicionalmente, la composición se puede hacer en supositorios, mediante la mezcla con una variedad de bases, tales como bases emulsificantes o bases solubles en agua. Las formulaciones apropiadas para administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas, o fórmulas en aerosol que contienen, además del ingrediente activo, tales portadores que se conocen en el oficio por ser apropiados.

La concentración de los compuestos en la composición de la presente invención en las formulaciones farmacéuticas puede variar, por ejemplo, a partir de menos de aproximadamente 1%, usualmente o al menos cerca del 10%, tanto como del 20% al 50% o más en peso, y se pueden seleccionar fundamentalmente por volúmenes de fluidos, y viscosidades, en conformidad con el modo particular de administración seleccionado.

Por lo tanto, una composición farmacéutica típica para la infusión intravenosa se podría hacer para contener 250 ml de solución de Ringer estéril, y 100 mg del compuesto o fracción. Los métodos actuales para preparar compuestos o fracciones administrables por vía parenteral serán conocidos o aparentes para aquellos de habilidad en el oficio y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985).

Será apreciado por alguien de habilidad en el oficio que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente del presente método inventivo, se pueden formular como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina, o liposomas. Los liposomas pueden servir para dirigir los compuestos o fracciones a un tejido particular, tal como tejido linfoide o células hepáticas cancerosas. Los liposomas también se pueden utilizar para aumentar la vida media del compuesto o fracción. Muchos métodos están disponibles para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980), y U.S. Patent Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para inhibir el crecimiento de un mycobacterium, que comprende la administración de una composición obtenida por el método anterior y que comprende un portador y al menos un compuesto seleccionado de cobaltoceno-octomet, estigmastan, 3,5,-dieno, galoxolide, benzil salicilato, eucaliptol, y \alpha-pipeno. La composición se formula apropiadamente para el almacenamiento y se destina para utilizar como un agente de limpieza. En consecuencia, además puede comprender agentes de limpieza que no deberían interferir con la actividad química de los agentes químicos enumerados anteriormente. La formulación de dicha solución de limpieza y la inclusión de agentes de limpieza generales se puede hacer fácilmente por un experto, teniendo en cuenta las consideraciones de química teórica, y la estabilidad y eficacia de la solución se puede probar fácilmente por el experto. La prueba incluirá un bio-ensayo tal como los ensayos anti-microbianos. La preparación y composición de dicha solución de limpieza también está dentro del alcance de la invención.

La solución de limpieza es activa contra al menos micobacterias o E. coli. A continuación se da una lista de micobacterias y sub agrupaciones que se inhiben por los compuestos activos, las fracciones activas, y los métodos de la invención. Grupo o complejo Mycobacterium o especie Mycobacterium, y más preferido, un complejo Mycobacterium tal como complejo M. tuberculosis (MTB), complejo M. avium (MAC), complejo MAIS y complejo M. fortuitum, se inhibieron, así como crecimiento rápido y crecimiento lento (i.e. tiempo de generación promedio menor de 60 minutos en condiciones estándar de laboratorio) incluyendo micobacteria especificada y fotocromógenos no especificados, no-fotocromógenos, escotocromógenos, y especialmente M. africanum, M. asiaticum, M. avium, M. bovis, M. bovis (BCG), M. butyricum, M. chelonae, M. duvalii, M. flavescens, M. fortuitum, M. gastri, M. gordonae, M. haemophilum, M. intracellulare, M. kansasii, M. leprae, M. lepraemurium, M. linda, M. lufu, M. marinum, M. malmoense, M. microti, M. mucoscum, M. nonchromogenicum, M. paratuberculosis, M. peregrinum, M. phlei, M. rhodochrous, M. scrofulaceum, M. shimoidei, M. simiae, M. smegmatis, M. szulgai, M. terrae, M. thermoresistable, M. triviale, M. tuberculosis, M. ulcerans, M. vaccae, M. xenopi, y serovats de estos. M. kansasii, M. marinum, M. simiae y M. asiaticum son ejemplos de fotocromógenos. M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. gordonae y M. flavescens son ejemplos de escotocromógenos. M avium, M. intracellulare, M. gastri, M. malmoense, M. terrae y M. triviale son todos los ejemplos de no-fotocromógenos. M. africanum, M. avium, M. bovis, M. haemophilum, M. intracellulare, M. kansasii, M. malmoense, M. marinum, M microti, M paratuberculosis, M scrofulaceum, M. simiae, M. szulgai, M. tuberculosis, y M. xenopi son todos ejemplos de crecimiento lento (que necesita más de siete días) de la especie micobacteriana. M. chelonei, M. flavescens, M. fortuitum, M. gordonae, M. leprae, M. phlei, M. smegmatis, M. terrae, M. ulcerans son todos ejemplos de crecimiento rápido (que necesita menos de siete días para el desarrollo de colonias en placas) de la especie micobacteriana. M. Tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis (BCG), y M. microti son miembros del complejo MTB. M. avium y M. intracellulare son los miembros del complejo MAC; existen al menos tres distintos grupos serológicos de M. avium, y más de 25 serotipos de M. intracellulare.

La presente invención, de este modo por lo general descrita, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a título de ejemplo y no tienen la intención de ser limitantes de la presente invención.

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Ejemplo 1

Comparativo

Este ejemplo demuestra que extractos etanólicos de planta Mammea americana, Callistemon citrinus (por comparación), y Merchantia polymorpha (por comparación) tienen significante actividad anti-micobacteriana, pero toxicidad limitada para el camarón y toxicidad no detectable para los mamíferos.

Aproximadamente 3 libras de hojas de plantas a partir de 50 especies de plantas fueron secadas en estufa a 42ºC., y se molieron en una licuadora. 30 gm, del material molido fueron extraídos en 300 ml de etanol absoluto (Spectrum Products laboratory, Garden, CA) agitando a temperatura ambiente por 24-36 hrs. El líquido luego se filtró en papel Whatman #4, luego #2 (VRW Scientific Laboratory, Willard, OH) y se evaporó a 40ºC en un evaporador rotatorio Buchi/Beckman (VRW Scientific Laboratory, Willard, OH). Para la prueba, el material fue resuspendido en metanol, a las concentraciones deseadas.

La actividad de cada extracto fue probada en M. smegmatis 607 (ATCC, Rockville, MD). Se realizó un ensayo de difusión agar-disco, en paralelo con el ensayo de extractos de otras plantas, y 10 \mug de estreptomicina, agua y metanol como controles. Bauer et al., Amer. J. Clin. Path., 21:941-946 (1985). Se realizaron revestimientos múltiples de cada concentración y control del extracto, y los resultados de la zona de inhibición se tabularon y promediaron. Entre otros extractos de plantas probados, la Mammea americana, Callistemon citrinus, y Merchantia polymorpha se encontraron que eran más activos contra M. smegmatis, mostrando una zona de inhibición medible y reproducible cuando al menos 25 \mug, 25 \mug, y 50 \mug, respectivamente, del extracto resuspendido fue probado. Frame et al., supra
(1998).

La actividad de los extractos se probó también en M. tuberculosis 27294 (una cepa sensible a la estreptomicina, ATCC, Rockville, MD) por el método BACTEC-460, en donde la inhibición del crecimiento se monitorea en cultivos crecidos en cultivos líquidos en la presencia de la sustancia de ensayo o controles, mediante la medición del ^{14}CO_{2} aspirado a partir del vial de prueba. Los resultados se presentan como cambios diarios en velocidades de crecimiento o índices de crecimiento (GI) del cultivo probado en relación con cultivos de control negativos (agua adicionada al cultivo). Frame et al., supra (1998); and Siddiqi, Bactec TB sistema: Product and Procedure Manual, Becton Dickinson Diagnostic Instrument System, Towson, MD (1989). Aproximadamente 4.1 ml del cultivo se cultivaron por hasta 12 días y GI se determinaron diariamente, iniciando en el día 4. Una vez más, extractos adicionales de plantas, y estreptomicina (concentración final 50 \mug/ml), agua, una muestra sin tratar, y metanol (25 \mul y 50 \mul en un volumen de 4.1 ml) fueron utilizados como controles, y los resultados de 3-6 repeticiones de cada cultivo del crecimiento fueron promediados. Los efectos de los extractos de la planta fueron de naturaleza transitoria, i.e., después de numerosos días, la resistencia al tratamiento volvió a aparecer. Esto sugiere que los extractos de Mammea americana, Callistemon citrinus, y Merchantia polymorpha tienen modos bacteriostáticos de acción (en oposición a bacteriocidico). Mediante este ensayo, M. tuberculosis mostró sensibilidad al extracto de Mammea americana, Callistemon citrinus y Merchantia polymorpha a 50 \mug, 50 \mug, y 100 \mug, respectivamente. La sensibilidad del extracto de planta de M. smegmatis a Mammea Americana fue aproximadamente equivalente a la sensibilidad a estreptomicina. Ver la Tabla 1, donde los resultados de 3-6 lecturas para cada concentración del extracto se tabularon y donde un indicador del índice de crecimiento de control negativo (\nabla GI) fue > 30.

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1

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Por lo tanto, mediante dos diferentes sistemas de ensayo, se demostró que cada uno de los extractos de las plantas a partir de Mammea Americana, Callistemon citrinus, y Merchantia polymorpha tienen significante actividad contra dos diferentes especies de micobacterias.

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Ejemplo 2

Muestra que no existe significante toxicidad a los mamíferos asociada con los extractos de plantas de Mammea Americana, Callistemon citrinus (por comparación), o Merchantia polymorpha (por comparación).

Grupos de ratones criados por cruce de razas 7 CF-1 (machos de 50 días de edad, peso medio 30 gm) SASCO, Charles River Laboratories (Wilmington, MA) fueron probados por administración peritoneal a cada grupo de 500 \mug de un extracto de planta resuspendido en metanol, durante un periodo de 15 días, en inyecciones diarias de 100 \mul. Los extractos de plantas probados incluyen Mammea Americana, Callistemon citrinus, y Merchantia polymorpha. Dos grupos de ratones que reciben solución salina (100 \mul) o mezcla de solución salina y metanol (50 \mul cada uno) fueron utilizados como controles.

Los ratones permanecieron en observación por un periodo de un mes y los siguientes parámetros se midieron en una base diaria: los cambios en actividad, consistencia fecal, condición del pelo, lesiones cutáneas, alteraciones oculares, apetito (ingesta de agua y alimentos), pérdida de peso, cambios de temperatura y mortalidad.

En general, los seis extractos derivados de las plantas incluidos en el presente trabajo fueron bien tolerados en la prueba de toxicidad de los ratones. Un ratón inoculado con extracto de Marcanria polymorpha murió en el día 13 debido a la sepsis causada por la perforación del intestino durante la inoculación. Otro ratón inyectado con Callistemon citrinus murió en el día 15, después de experimentar la pérdida de apetito y peso por tres días consecutivos. El resultado de la necropsia realizada un día después de que este ratón se encontró muerto, mostró una causa indeterminada de muerte.

Se concluye que los ratones expuestos a aproximadamente 16.7 \mug del extracto de planta por gm de peso corporal no indicaron efectos tóxicos de los extractos de la planta.

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Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que el extracto anti-micobacteriano se puede obtener mediante solventes de extracción alternativos y que un extracto con cloruro de metileno produce una fracción activa más pura.

En una etapa preliminar que podría indicar la probabilidad de purificar un compuesto activo a partir de Mammea Americana, Merchantia polymorpha (por comparación), y Callistemon citrinus (por comparación), se llevó a cabo una extracción con solventes orgánicos alternativos. Sí un extracto con actividad anti-micobacteriana por extracción con solventes orgánicos alternativos se puede obtener, debería incrementar la probabilidad que el componente activo es un compuesto solo o un grupo de compuestos muy pequeño que podrían ser aislados como una fracción pura. El solvente alternativo probado fue el cloruro de metileno.

Aproximadamente 5 gm de tejido foliar en polvo se extrajo en 100 ml de cloruro de metileno absoluto, mediante la agitación durante 4 hrs. a temperatura ambiente. El material extraído se probó mediante un ensayo de difusión en agar, en general, como se describe anteriormente para las pruebas de los extractos con etanol. El extracto con cloruro de metileno demostró una actividad anti-micobacteriana medible y reproducible contra M. smegmatis 607
(ATCC).

Las Tablas 2, 3, y 4 presentan una al lado de la otra, los principales ingredientes en extractos con etanol y extractos con cloruro de metileno de Mammea Americana, Merchantia polymorpha, y Callistemon citrinus, respectivamente, según se determina por el análisis de Cromatografía de Gases/Espectroscopia de Masas (GC/MS). La extracción con etanol fue más efectiva en la retención del material soluble como se indica por el peso del material extraído. En porcentaje en peso de material inicial, la extracción con etanol produjo 18.7%, 1.6%, y 24.2%, mientras que el cloruro de metileno produjo 1.46%, 0.26%, y 0.73% de Mammea Americana, Merchantia polymorpha, y Callistemon citrinus, respectivamente. Adicionalmente, como se puede observar de la lista en paralelo de los compuestos identificados por GC/MS en las Tablas 2-4, existen más pocos compuestos en los extractos con cloruro de metileno. Por lo tanto, el compuesto activo parece que es más puro cuando se aísla mediante la extracción con cloruro de
metileno.

2

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3

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(Continuación)

4

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5

(Continuación)

6

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Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que los extractos de plantas de Mammea Americana, Merchantia polymorpha, y Callistemon citrinus se pueden purificar en fracciones que tienen una mayor actividad anti-micobacteriana.

Es notable de las Tablas 2-4 que las fracciones del etanol y cloruro de metileno contienen pocos compuestos en común. Esto sugiere que el o los compuestos activos pueden ser un componente menor del extracto y no discernible fácilmente cuando un GC/MS total se realiza. Si el compuesto(s) anti-micobacteriano(s) se puede separar en una fracción que contiene incluso menos componentes, puede ser posible aislar una gran cantidad de la fracción activa que debería ser sometido al análisis de GC/MS instaurado para identificar el compuesto activo de cada planta de la invención.

Una separación y aislamiento por HPLC de una fracción activa fue ensayada. La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) se realizó utilizando una Columna Discovery RP-Amida C-16, 15 cm de longitud, 4.6 mm de ancho (Supelco, Bellefort, PA). Una concentración isocrática, i.e. estable, de una fase de solvente polar fue utilizada. La fase del solvente consistió de ácido fosfórico diluido en metanol. La velocidad de flujo fue 2 ml/minuto. Por lo tanto, la salida es dependiente del MW (MW más grande sale después) y de la polaridad. Cuanto más polar el compuesto, más rápidamente se solubiliza en el solvente, pero se retiene más tiempo en la fase estática de la columna que retiene los compuestos más polares. Las fracciones fueron monitoreadas por UV, a una longitud de onda de 254 nm. Una a tres fracciones por extracto de la planta, fueron recolectadas en los tiempos indicados. Como se puede observar en la Tabla 5, las fracciones individuales que tienen fuertes actividades contra E. coli y contra M. smegmatis se identificaron y el análisis GC/MS identificó los compuestos presentes en estas fracciones. Ver, por ejemplo, Las Figuras 1-3. Basándonos en la estimación de la polaridad relativa y los pesos moleculares de los compuestos identificados para las respectivas plantas en el extracto total con cloruro de metileno, los compuestos en la columna más a la derecha de la tabla 5 "Compuestos Adicionales" enumera los compuestos que no se observan en la fracción activa del extracto de las respectivas plantas, pero que probablemente puedan estar presentes en cantidades más pequeñas ("cantidades trazas") en la fracción activa y que pueden contribuir a la actividad anti-micobacte-
riana.

Se ha demostrado ahora que una fracción activa, purificada y compuestos individuales pueden ser aislados e identificados como los compuestos activos de extractos de plantas que tienen actividad anti-micobacteriana.

7

El uso de los términos "un" y "uno" y "el" y los referentes similares en el contexto de describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se han de interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otra manera en este o en clara contradicción por el contexto. La relación de los rangos de valores incluidos tienen simplemente la intención de servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique de otra manera en el presente, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si fueran enumerados individualmente en este. La palabra "aproximadamente", cuando se acompaña de un valor numérico, se debe interpretar como la indicación de una desviación de hasta e inclusive del 10% del valor numérico indicado. Todos los métodos descritos en este, se pueden realizar en cualquier orden apropiado a menos que se indique de otra manera en este o de otra manera en clara contradicción por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en este documento, tiene solamente la intención de clarificar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación se debería interpretar como una indicación de cualquier elemento no-reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

Las modalidades preferidas de esta invención se describen en este, incluyendo el mejor método conocido por los inventores para realizar la invención. Por supuesto, las variaciones de aquellas modalidades preferidas llegaran a ser aparentes para aquellos de ordinaria habilidad en el oficio bajo la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen dichas variaciones según el caso, y los inventores pretenden que la invención pueda ser practicada de otra manera a las descritas específicamente en este documento. En consecuencia, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia en cuestión relatada en las reivindicaciones anexas al presente según lo permite la ley aplicable. Por otra parte, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las posibles variaciones de estos se abarca por la invención a menos que se indique de otra manera en este o de otra manera en clara contradicción con el contexto.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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Claims (11)

1. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéutico y la composición preparada en un método que comprende

-

extracción de un material vegetal en cloruro de metileno,

-

contacto del material extraído con un sistema cromatográfico de separación, y

-

elución del sistema cromatográfico de separación con una fase móvil polar para obtener una composición,

en donde el material vegetal es de Mammea Americana, en donde la composición tiene actividad antimicrobiana, y en donde la composición farmacéutica se utiliza como un medicamento.

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2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde dicha planta es Mammea Americana mamey Amarillo.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde dicha composición comprende estigmastan-3,5-dieno y opcionalmente cobaltoceno-octomet.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la actividad antimicrobiana es contra un mycobacterium.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde el mycobacterium es M. avium, M. bovis, M. intracellulare, M. kansaii, M. leprae, M. marinum, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. fortuitum, M. tuberculosis, o M. ulcerans.

6. Un método para inhibir el crecimiento de un mycobacterium in vitro, que comprende la administración de una composición como se define en la reivindicación 1.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho mycobacterium es M. avium, M. bovis, M. intracellulare, M. kansaii, M. leprae, M. marinum, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. fortuitum, M. tuberculosis, o M. ulcerans.

8. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para inhibir el crecimiento de un mycobacterium.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, en donde dicho mycobacterium está en un mamífero y dicho mamífero es un humano o un bovino.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 o 9, en donde dicho medicamento es para ser administrado por vía oral.

11. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde dicha composición comprende un portador farmacéutico, estigmastan-3,5-dieno, y cobaltoceno-octomet.