ES2343576T3 - Metodo para disminuir el contenido de organismos patogenos presentes en productos alimenticios. - Google Patents

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Abstract

Método para mejorar la supresión de crecimiento de patógenos tal como Listeria spp. en un producto alimenticio fermentado, dicho método comprende las fases de: (i) proporcionar un material alimenticio, (ii) mezclar el material alimenticio con un cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las características de la matriz alimenticia durante la fermentación, (iii) mezclar el material alimenticio con al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina. (iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii) a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación siendo llevado a cabo a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y caracterizado además por el hecho de que, la acidificación adicional provocada por el cultivo adjunto es 0.5 unidad de pH o inferior permitiendo al mismo tiempo una producción de bacteriocina en una cantidad suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas de Listeria expresada como log cfu/g de producto fermentado que es 2 o más al final de la maduraración, y obtener el producto alimenticio fermentado.

Description

Método para disminuir el contenido de organismos patógenos presentes en productos alimenticios.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de mejoramiento de la seguridad microbiana en la producción de productos alimenticios. En particular la presente invención se refiere a cepas microbianas útiles para la reducción de la cantidad de organismos patógenos p.ej. la Listeria cuando se añade a productos alimenticios fermentados, tal como un producto cárnico fermentado.
Técnica anterior
Durante la producción de productos alimenticios fermentados, tal como p.ej. productos embutidos, más a menudo se aplica un cultivo iniciador para controlar el proceso de fermentación en vez de confiar en la flora de desarrollo natural. Comúnmente, el cultivo iniciador comprende una combinación de una o más bacterias del ácido láctico (LAB) y una o más especies de las familias Micrococcaceae y Stafilococcaceae. Durante el proceso de fermentación las bacterias del ácido láctico producen principalmente ácido láctico por lo cual el pH desciende al valor de pH deseado dependiendo del cultivo y de las condiciones de procesamiento (temperatura, tipo/contenido de azúcar etc.) y el producto alimenticio producido.
Mientras que las bacterias de ácido láctico son responsables principalmente de la formación ácida, las especies Micrococcaceae y especies Stafilococcaceae son responsables del incremento de la formación del sabor por la producción de compuestos no volátiles y volátiles mediante diferentes fases de reacción bioquímica. Adicionalmente, las Micrococcaceae spp. y Streptococcaceae spp. son responsables de la velocidad e intensidad de formación de color, en particular en tipos de embutidos fermentados.
Las Micrococcaceae spp. y Streptococcoceae spp. son muy sensibles al pH bajo ya que su crecimiento se ralentiza drásticamente cuando el pH se reduce a un pH por debajo de 5.0. En p.ej. la fabricación de embutidos secos es esencial para el sabor y formación de color de los productos cárnicos que el perfil de acidificación se controle bien y que no se altere de lote a lote. En particular, una disminución rápida del pH puede comprometer la calidad y resultar en un perfil de sabor menos maduro y menos complejo, que obligará al fabricante del producto alimenticio a madurar el producto alimenticio durante un periodo de tiempo más largo para alcanzar la misma intensidad de sabor (Tjeneretal., 2003).
En la fabricación de productos alimenticios fermentados la presencia de organismos patógenos como Listeria monocytogenes puede ser un problema si las materias primas están contaminadas. Durante la producción de p.ej. embutidos fermentados, la Listeria monocytogenes normalmente disminuirá en números durante la fermentación y periodo de maduración, debido, en primer lugar a la formación de ácido láctico, el resultante descenso de pH y debido a la reducción de actividad de agua provocada por el proceso de secado posterior. No obstante, bastante a menudo, un número considerable de Listeria monocytogenes sobrevive. Esto puede causar un problema de seguridad grave ya que el consumo de alimentos infectados puede dar lugar a infecciones listeriales letales (listeriosis).
A fin de reducir la presencia de microorganismos patógenos en el producto alimenticio, cierta bacteria de ácido láctico que produce bacteriocinas incluyendo cepas de Pediococcus y ciertas cepas de Lactobacillus, se ha añadido al cultivo iniciador para producir bacteriocinas, algunas de las cuales mata y/o inactiva los organismos patógenos y por consiguiente reduce su concentración en el producto.
Foegeding et al. (1992) describen la eficacia de la pediocina producida in situ por Pediococcus acidilactici como componente antilistérico. No obstante, la fermentación de embutidos se llevó a cabo a 38ºC lo que provocó una producción extensiva de ácido y por lo tanto un descenso muy rápido en el pH. Como se menciona anteriormente un descenso rápido del pH compromete la calidad general del producto y resulta en un perfil con sabor menos maduro y menos complejo. Por lo tanto, la influencia adversa de Pediococcus acidilactici, en la calidad general del producto resultante hace el método inadecuado para fermentaciones de alimentos donde se aplican las condiciones y características mencionadas anteriormente.
El modelo de utilidad BA1994 00266 describe un cultivo iniciador bacteriano de ácido láctico que comprende un Pediococcus spp. productora de bacteriocina, y Lactococcus seleccionada productora de bavaricina útil para inhibir los organismos patógenos de p.ej. Listeria en productos cárnicos incluidos los productos embutidos fermentados.
Evidentemente, Pediococcus spp. a menudo no son bien calificados como cultivos iniciadores en la fabricación de productos alimenticios aunque las especies se conocen por su potencial para disminuir la cantidad de organismos patógenos p.ej. Listeria.
Por lo tanto, hay una necesidad persistente en la industria de poder disminuir la cantidad de organismos patógenos y al mismo tiempo obtener las características óptimas del producto alimenticio fermentado p.ej. el perfil de acidificación, sabor y desarrollo de color.
Resumen de la invención
Por consiguiente, en aspectos interesantes, se proporcionan métodos para A) fabricar un producto alimenticio fermentado y B) para disminuir la concentración de Listeria spp. (en particular Listeria monocytogenes en un producto alimenticio fermentado. Dichos métodos comprenden las fases de:
(i) proporcionar un producto alimenticio,
(ii) mezclar el producto alimenticio con un cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las características de la matriz alimenticia durante la fermentación (p.ej. una acidificación deseada),
(iii) mezclar el producto alimenticio con al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina,
(iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii) a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación llevado a cabo a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y se caracteriza además por el hecho de que la acidificación adicional provocada por el cultivo adjunto es 0,5 unidad de pH o inferior mientras que permite una producción de bacteriocina en una cantidad suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas de Listeria expresada como Log CFU/g de producto fermentado que es 2 o más al fin de la maduración, y obtener el producto alimenticio fermentado.
Descripción detallada
Antes de una discusión de los aspectos detallados y formas de realización de la invención se proporciona una definición de los términos específicos utilizados en la presente.
Como se utiliza en la presente, el término "fermentación" o "fermentación alimenticia" se refiere al proceso de cambios bioquímicos p.ej. una acidificación en material animal y/o vegetal (es decir una matriz alimenticia), que implica la actividad de células microbianas vivas bajo condiciones aeróbicas y/o anaeróbicas para obtener un producto alimenticio de la calidad deseada.
El término "cultivo adjunto" se ha de entender como un cultivo microbiano que se puede añadir a una matriz alimenticia y que produce un producto bacteriostático y/o bacteriocrítico (p.ej. bacteriocinas y antibióticos) sin afectar adversamente al perfil deseado de la fermentación de dicha matriz alimenticia. Preferiblemente, el cultivo adjunto no afecta adversamente el perfil de acidificación durante la fabricación del producto alimenticio.
Se deduce que las "condiciones subóptimas para el crecimiento" se ha de entender como las condiciones de crecimiento que permiten que el cultivo adjunto, al añadirse a la matriz alimenticia, se comporte como se ha descrito anteriormente.
El término "cultivo iniciador" se refiere a una preparación que contiene células microbianas que se destina a la inoculación de una matriz alimenticia para someterla a la fermentación. El cultivo iniciador se destina a proporcionar el cambio deseado en las características de la matriz alimenticia durante la fermentación (p.ej. una acidificación deseada). Típicamente, un cultivo iniciador proliferará durante el proceso de fermentación.
Un "agente bioprotector" se ha de entender como un organismo vivo que ejerce su efecto bioprotector cuando se añade a una matriz alimenticia sin afectar adversamente la matriz alimenticia.
El efecto bioprotector se define como un efecto logrado por la producción de un producto bacteriostático y/o bacteriocrítico, mediante el cual la presencia y/o actividad de organismos indeseados p.ej. Listeria monocytogenes se inhibe y/o disminuye.
En el presente contexto, el término "microorganismo" se utiliza en su significado normal. Por lo tanto, en su significado más amplio, el término "microorganismo" se destina a cubrir algas, protozoos, virus, bacterias y hongos. Los microorganismos preferidos son las bacterias y hongos, en particular bacterias, tal como la bacteria del ácido láctico.
La expresión "Bacterias del Ácido Láctico (LAB)" designa un grupo de bacterias Gram positivas, catalasa negativas, no motiles, microaerofílicas o anaeróbicas que fermentan el azúcar con la producción de ácidos incluyendo ácido láctico como el ácido producido predominantemente, ácido acético, ácido fórmico y ácido propiónico. Las bacterias de ácido láctico más útiles industrialmente se encuentran entre las especies de Lactococcus, especies de estreptococo, especies de Enterococcus, especies de Lactobacillus, especies de Leuconostoc, especies de Pediococcus y especies de bifidobacterium.
Las cepas de cultivo iniciador de bacterias de ácido láctico comúnmente utilizadas se dividen generalmente en organismos mesofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo a aproximadamente 30ºC y organismos termofílicos que tienen temperaturas de crecimiento óptimo en la gama de aproximadamente 40 hasta aproximadamente 45ºC. Organismos típicos pertenecientes al grupo mesofílico incluyen Lactococcus lactis, Lactococcus lactis. subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroide subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. Lactobacillus paracasei subsp. paracasei. Las especies bacterianas de ácido láctico termofílico incluyen como ejemplos Streptococcus thermophilus, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii. subsp. bulgaricus y Lactobacillus acidophilus.
También las bacterias estrictas anaeróbicas pertenecientes al género Bifidobacterium incluyendo Bifidobacterium bifídum y Bifidobacterium longum se utilizan comúnmente como cultivos iniciadores lácteos y se incluyen generalmente en el grupo de bacterias del ácido láctico. Adicionalmente, se utilizan especies de Propionibacterium como cultivos iniciadores lácteos, en particular en la fabricación de queso. Adicionalmente, los organismos pertenecientes al género Brevibacterium se utilizan comúnmente como cultivos iniciadores alimenticios.
Otro grupo de cultivos iniciadores microbianos son los cultivos fúngicos, incluyendo cultivos de levadura y cultivos de hongos filamentosos, que se utilizan particularmente en la producción de determinados tipos de queso y bebidas. Ejemplos de cultivos de hongos utilizados actualmente incluyen Penicillium roqueforti, Penicillium candidum, Geotrichum candidum, Torula kéfir, Saccharomyces kéfir y Saccharomyces cerevisiae.
En la producción y almacenamiento de productos alimenticios fermentados un problema persistente es la contaminación potencial del material alimenticio por organismos patógenos tal como Listeria spp. A fin de superar este problema los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que al aplicar al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas al material alimenticio, es posible reducir la cantidad de organismos patógenos sin influenciar el perfil de fermentación y por lo tanto la calidad sensorial deseada del producto alimenticio. Este efecto se obtiene al someter la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas a condiciones de fermentación que son subóptimas para el crecimiento del Pediococcus acidilactici. Típicamente, tales condiciones serán óptimas para el crecimiento del cultivo iniciador y lo más sorprendentemente se descubrió que tales condiciones permiten una alta producción de bacteriocinas por Pediococcus acidilactici. Por consiguiente, la presente invención permite al fabricante de alimentos seleccionar y utilizar las recetas y condiciones de procesamiento garantizando el desarrollo óptimo p.ej. acidificación del cultivo iniciador y a la vez garantizar la seguridad alimentaria óptima añadiendo al cultivo adjunto de la presente invención en cualquier punto adecuado en el tiempo durante el proceso de fermentación.
Como se menciona anteriormente, el cultivo iniciador y el cultivo adjunto se pueden añadir al material alimenticio en cualquier orden. El tiempo transcurrido entre la adición del primer cultivo iniciador y el cultivo adjunto a la adición del segundo es de 0 segundos, p.ej. como máximo 10 segundos, tal como como máximo 30 segundos, p.ej. como máximo 1 minuto, tal como como máximo 5 minutos, p.ej. como máximo 10 minutos, tal como como máximo 60 minutos, p.ej. como máximo 300 minutos, tal como como máximo 600 minutos, p.ej. como máximo 1 día, tal como como máximo 2 días, p.ej. como máximo 3 días, tal como como máximo 4 días, p.ej. como máximo 6 días.
En una forma de realización preferida de la presente invención el cultivo iniciador se añade al mismo tiempo o antes de que añadir el cultivo adjunto al material alimenticio.
La invención es exitosa para reducir y/o inhibir la cantidad y/o actividad de cualquier organismo patógeno sensible a las bacteriocinas producidas por Pediococcus spp., tal como la pediocina, en particular Listeria spp. tal como Listeria monocytogenes.
Se ha demostrado que la reducción en organismos patógenos se puede proporcionar al mezclar el material alimenticio que contiene los organismos patógenos con una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas. En particular, se prefiere la cepa de Pediococcus acidilactici B-LC-20 (DSM 10313) comercializada por Chr.Hansen A/S bajo la marca registrada SafePro™. No obstante se contempla que otras cepas de Pediococcus acidilactici productoras de bacteriocinas pueden proporcionar las mismas características y efectos ventajosos.
El efecto de la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas es más probablemente debido a la tendencia de tales especies de Pediococcus a producir bacteriocinas capaces de matar, inactivar y/o inhibir organismos patógenos. Hasta ahora no se ha sabido que la capacidad de Pediococcus acidilactici para inhibir organismos patógenos p.ej. Listeria, no necesariamente tiene que causar un aumento general en la acidificación cuando se añade como un cultivo adjunto. La temperatura óptima de crecimiento para las especies de Pediococcus tal como Pediococcus acidilactici es de aproximadamente 40ºC o incluso más alto. No obstante, la mayoría de cultivos iniciadores utilizados para las fermentaciones alimenticias desarrollan óptimamente, es decir resultan en la deseada calidad sensorial del producto, a temperaturas inferiores a 30ºC. Por lo tanto, previamente no era siempre adecuado incluir Pediococcus acidilactici a fin de controlar p.ej. Listeria ya que no se pudo establecer un compromiso razonable entre las condiciones óptimas para el iniciador frente a las condiciones óptimas para la cepa Pediococcus. La presente invención permitirá al fabricante de alimentos seleccionar libremente los deseados organismos de cultivo iniciadores y realizar la fermentación alimenticia en condiciones que son óptimas para el desarrollo deseado del producto alimenticio. Al mismo tiempo la seguridad alimentaria se puede garantizar al añadir el cultivo adjunto de la presente invención sin influir adversamente en el perfil de la fermentación.
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Obviamente, cuando el experto en la materia entiende que la producción de bacteriocinas por Pediococcus acidilactici no está vinculada a un aumento en la actividad de acidificación será posible probar las condiciones que favorecen la producción de la bacteriocinas sin ninguna producción significante de ácido. Tales condiciones, con un impacto en el crecimiento de organismos microbianos, son bien conocidas por el experto en la materia. Incluyen, pero de forma no limitativa, la actividad del agua, condiciones atmosféricas, humedad relativa (RH), nutrientes tal como la fuente de carbono, fuente de nitrógeno etc. y otros aditivos tales como minerales, vitaminas etc.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para reducir la concentración de Listeria spp. en un producto alimenticio fermentado.
En el presente contexto el término "reducir la concentración" se refiere a una reducción en la cantidad de un organismo patógeno. Una reducción se puede proporcionar al matar, inactivar o inhibir la actividad del organismo patógeno. En una forma de realización de la presente invención un 100% de los organismos patógenos se matan, inactivan o inhiben, tal como al menos un 90%, p.ej. al menos un 75%, tal como al menos un 50%, p.ej. al menos un 40%, tal como al menos un 30%, p.ej. al menos un 25%, tal como al menos un 20%, p.ej. al menos un 10%, tal como al menos un 5%, p.ej. al menos un 1%.
En determinadas aplicaciones, una "estabilización" de los organismos patógenos que pueden estar presentes en la matriz alimenticia será suficiente para volver seguro el alimento. Por lo tanto, el cultivo adjunto garantiza que los organismos patógenos que están presentes en la matriz alimenticia no aumenten en números.
Dicho método comprende las fases de:
(i) proporcionar un material alimenticio,
(ii) mezclar el material alimenticio con un cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las características de la matriz alimenticia durante la fermentación (p.ej. una acidificación deseada),
(iii) mezclar el material alimenticio con al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas,
(iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii) a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación siendo conducido a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y que se caracteriza además por el hecho de que la acidificación adicional provocada por el cultivo adjunto es 0,5 unidad de pH o inferior permitiendo a la vez la producción de bacteriocinas en una cantidad suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas de Listeria expresada como Log cfu/g de producto fermentado que es 2 o más al final de la maduración, y obtener el producto alimenticio fermentado.
El producto alimenticio fermentado se puede someter a un proceso de secado simultáneamente con el proceso de fermentación en la fase (iv) y/o después del proceso de fermentación en la fase (iv) para obtener un producto alimenticio seco fermentado.
Varios productos alimenticios se pueden producir por el método según la presente invención a condición de que el material alimenticio se fermente. Ejemplos de productos alimenticios fermentados incluyen, pero no se limitan a productos lácteos tales como diferentes productos de queso, producto cárnico fermentado, tal como embutidos p.ej. embutidos untables y secos y jamón, pescado fermentado y verduras fermentadas.
El producto alimenticio fermentado se fabrica al proporcionar un material alimenticio que se somete a un proceso de fermentación y opcionalmente el producto alimenticio fermentado se somete a un proceso de secado a fin de proporcionar un producto alimenticio fermentado seco.
A fin de reducir la concentración de organismos patógenos, se desea que esta reducción se pueda proporcionar sin alterar significativamente la calidad del producto alimenticio final, es decir el fabricante de alimentos puede aplicar el cultivo a su receta actual o preferida sin embargo sin cambiar la receta o condiciones de procesamiento. Para obtener el efecto deseado, un cultivo de Pediococcus acidilactici productor de bacteriocinas se aplica a un material alimenticio como un cultivo adjunto, que se separa del cultivo iniciador. En el presente contexto "cultivo adjunto" es un cultivo que se añade al material alimenticio o se une con el cultivo iniciador, pero que no forma parte del cultivo iniciador, es decir el cultivo adjunto es un cultivo adicional no intencionado para "producir" el producto alimenticio fermentado, sino para suministrar una ventaja tecnológica adicional; en este caso un efecto de muerte, inactivación o inhibición hacia los organismos patogénicos. En el presente contexto "cultivo adjunto" y "especies de Pediococcus productoras de bacteriocina" se utilizan de forma intercambiable y el cultivo adjunto se utiliza para ilustrar adicionalmente las características específicas de la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas.
La fabricación del producto alimenticio fermentado está siendo controlada y realizada por el cultivo iniciador solo. El cultivo iniciador es responsable del desarrollo de un grupo no limitativo de parámetros de calidad tal como la acidificación, la reducción en enlace de agua y actividad del agua, apariencia general, color, textura, olor, aroma, gusto, sabor y otros parámetros sensoriales y tecnológicos. Por lo tanto, se proporciona una mínima, o preferiblemente ninguna, influencia en los parámetros de calidad del cultivo adjunto.
A fin de limitar o eliminar la influencia de la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas en los parámetros de calidad, el proceso de fermentación se lleva a cabo en condiciones subóptimas para el crecimiento de la producción de Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas como se ha descrito anteriormente.
En una forma de realización específica de la presente invención el proceso opcional de secado se lleva a cabo en condiciones que son subóptimas para el crecimiento de Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas a fin de proporcionar un efecto de acidificación limitado y permitir una alta producción de bacteriocinas.
En el presente contexto el término "acidificación limitada" se refiere a la influencia de al menos un cultivo adjunto en acidificación. En una forma de realización preferida de la presente invención la acidificación limitada proporciona una diferencia en valor de pH provocada por el cultivo adjunto de 0,5 unidad de pH o inferior, tal como 0,25 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,1 unidad de pH o inferior, tal como 0,25 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,075 unidad de pH o inferior, tal como 0,06 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,05 unidad de pH o inferior, tal como 0,04 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,03 unidad de pH o inferior, tal como 0,02 unidad de pH o inferior, p.ej. 0,01 unidad de pH o inferior.
En una forma de realización preferida de la presente invención las condiciones de crecimiento subóptimas se proporcionan cambiando la temperatura.
A fin de proporcionar condiciones de crecimiento subóptimas respecto al cultivo adjunto durante el proceso de fermentación, la temperatura en el proceso de fermentación es igual a o inferior a 30ºC, tal como igual a o inferior a 28ºC, p.ej. igual a o inferior a 26ºC, tal como igual a o inferior a 24ºC.
A fin de proporcionar condiciones de crecimiento subóptimas durante el proceso de secado respecto al cultivo adjunto, la temperatura en el proceso de secado es igual a o inferior a 30ºC, tal como igual a o inferior a 25ºC, p.ej. igual a o inferior a 20ºC, tal como igual a o inferior a 15ºC, tal como igual a o inferior a 10ºC, p.ej. igual a o inferior a 5ºC.
Cuando se mezcla el cultivo adjunto con el material alimenticio que bien comprende el cultivo iniciador o que posteriormente se mezcla con un cultivo iniciador, la concentración del al menos un cultivo adjunto aumenta el nivel de inoculación de las bacterias de ácido láctico totales como máximo 1000 veces, p.ej. como máximo 500 veces, tal como como máximo 100 veces, p.ej. como máximo 50 veces, tal como como máximo 10 veces, p.ej. como máximo 8 veces, tal como como máximo 5 veces, p.ej. como máximo 4 veces, tal como como máximo 3 veces, p.ej. como máximo 2 veces.
En una forma de realización preferida de la presente invención al menos un cultivo adjunto se añade en una concentración en la gama de 10^{2} -10^{10} CFU/g de producto, p.ej. en la gama de 10^{2}-10^{9} CFU/g de producto, tal como en la gama de 10^{3} -10^{9} CFU/g de producto, p.ej. en la gama de 10^{4}-10^{9} CFU/g de producto, tal como en la gama de 10^{2}-10^{8} CFU/g de producto, p.ej. en la gama de 10^{2}-10^{7} CFU/g de producto, tal como en la gama de 10^{3}-10^{7} CFU/g de producto, p.ej. en la gama de 10^{4}-10^{7} CFU/g de producto, tal como en la gama de 10^{5}-10^{7} CFU/g de producto, p.ej. en la gama de 10^{8}-10^{7} CFU/g de producto tal como en la gama de 10^{3}-10^{6} CFU/g de producto, p.ej. en la gama de 10^{3}-10^{5} CFU/g de producto, tal como en la gama de 10^{2}-10^{4} CFU/g de producto.
En la forma de realización actualmente preferida de la invención, el cultivo adjunto se añade en una gama de 5 x 10^{6} - 9 x 10^{7} CFU/g de producto.
En una forma de realización preferida de la presente invención el material alimenticio y/o el producto alimenticio seco fermentado se analiza por contenido de organismos patógenos. Si el contenido de los organismos excede un predeterminado nivel aceptable el cultivo adjunto se puede añadir al material alimenticio a fin de matar, inactivar o inhibir los organismos patógenos.
En el caso de que el material alimenticio se analiza por contenido de organismos patógenos y que se establece que el contenido excede un nivel predeterminado aceptable, el cultivo adjunto se puede añadir directamente al material alimenticio para matar, inactivar o inhibir los organismos patógenos.
En el caso que el producto alimenticio fermentado seco se analice por contenido de organismos patógenos y se establezca que el contenido excede un nivel predeterminado aceptable, los lotes de materiales alimenticios producidos posteriormente se mezclan con el cultivo adjunto para matar, inactivar o inhibir los organismos patógenos.
Bajo las condiciones del método de la invención la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocinas se puede añadir a una fermentación alimenticia sin afectar adversamente al perfil de la fermentación. Por lo tanto, las especies se pueden utilizar como cultivos adjuntos para garantizar la seguridad microbiana del producto alimenticio fermentado.
Naturalmente, las características utilizadas para describir el método de la invención también se aplicarán cuando la cepa se utilice como un cultivo adjunto como se ha descrito anteriormente.
En formas de realización específicas, el cultivo adjunto se proporciona en un paquete adecuado. Tales paquetes pueden ser p.ej. una bolsa, un tetra-Pak, una lata y cualquier otro medio adecuado descrito en la técnica para contener especies microbianas.
Preferiblemente, el paquete o material correspondiente de marketing dispone de instrucciones que indican las condiciones de fermentación que son subóptimas para el crecimiento de la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina.
Además, el cultivo adjunto se puede proporcionar en cualquier forma adecuada p.ej. en una forma congelada o liofilizada.
En una forma de realización preferida el cultivo adjunto es una preparación liofilizada de B-LC-20 (DSM 10313) proporcionada por Chr.Hansen A/S bajo la marca registrada SafePro™
La cepa aislada es útil para los objetivos de la invención que se describen en la presente. Adicionalmente, se contempla que la Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina se puede utilizar como un agente bioprotector para mejorar la seguridad de todos los productos alimenticios.
Aunque, la invención se centra en la aplicación del cultivo adjunto durante una fermentación alimenticia, está dentro del ámbito de aplicación de la presente invención que el cultivo adjunto se puede añadir a una matriz alimenticia que no se somete a un proceso de fermentación.
Una muestra de la cepa se ha depositado según el tratado de Budapest en el International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure. El depósito se hizo el 24 de Octubre de 1995 bajo el número de acceso DSM 10313.
La invención se ilustra además en los siguientes ejemplos, no limitativos y en los dibujos, donde
La Fig 1. A y B ilustran el desarrollo del pH durante la maduración de embutidos aplicados con o sin B-LC-20 junto con un cultivo iniciador Chr. Hansen Bactoferm™ de fermentación rápida. Los embutidos se fermentaron a 24- 20ºC durante 3 días, seguido de la maduración a entre 18 a 16ºC durante 11 días, y
Fig 2. A y B ilustran el desarrollo del pH durante la maduración de embutidos aplicados con o sin BLC-20 junto con un cultivo iniciador Chr. Hansen Bactoferm™ de fermentación tradicional. Los embutidos se fermentaron a 24-20ºC durante 4 días, seguido de la maduración a entre 18 a 14ºC durante 17 días.
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Ejemplos Ejemplo 1 Influencia de B-LC-20 en el desarrollo pH en carne picada para embutidos
Se demuestra la influencia del cultivo adjunto en la acidificación y un resumen de los perfiles encontrados de pH/tiempo al aplicar B-LC-20 a la carne picada para embutidos. La Tabla 1 muestra el desarrollo del pH durante el periodo de fermentación como se determinó cada segundo día y la Tabla 2 muestra el desarrollo del pH como se determinó continuamente desde las 0 a 68 horas.
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TABLA 1 Desarrollo del pH en carne picada para embutidos determinado cada segundo día
1
TABLA 2 Desarrollo de pH en carne picada para embutidos determinado por medición continua
2 
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Los resultados muestran que no hay ninguna influencia significante en el pH final en cuanto a la adición del cultivo adjunto en forma de B-LC-20 junto con el cultivo de control como comparación con la adición del cultivo de control solo. B-LC-20 se añadió en una concentración de 1.1 x 10^{7} CFU/g de carne picada para embutidos. Se añadió el cultivo de control en una concentración de bacterias de ácido láctico total de 3.3 x 10^{6} CFU/g.
Se demuestra que hay una ligera influencia de B-LC-20 durante las primeras 20-60 horas, pero la diferencia máxima entre las dos curvas es de 0.06 unidad de pH que está bien dentro de la variación normal encontrada entre lote y lote en producciones de embutidos reales.
El cultivo iniciador del control consiste en una mezcla de lactobacilli, pediococci, micrococci y staphylococci.
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Ejemplo 2 Influencia de B-CL-20 en la reducción de Listeria Resumen de ensayos
Se realizaron dos ensayos independientes para evaluar el comportamiento de Listeria en embutidos a lo largo del proceso de maduración. Se fabricaron tres lotes en cada ensayo. Uno con el cultivo iniciador de control no activo contra la Listeria y dos lotes con el cultivo iniciador de control junto con un cultivo iniciador antilisteria añadido en dos concentraciones diferentes (B-LC-20, Chr. Hansen A/S). Cada lote se inoculó con un cóctel de cinco cepas de Listeria monocytogenes (aproximadamente 10^{3} CFU/g) en el momento de la fabricación.
La maduración se hizo en una cámara de prueba en un entorno adaptado versátil de modelo Sanyo MLR-350H, con un periodo de fermentación durante 72h a 14ºC con 80%RH.
En los tiempos seleccionados se tomaron muestras de tres embutidos de cada lote para determinar las cuentas de bacterias de Listeria y ácido láctico, pH y pérdida de peso.
El comportamiento de Listeria fue similar en ambos ensayos, mostrando diferencias importantes entre el lote de control (A) y el lote al que se le añadieron los cultivos con contenido de antilisteria (B y C) donde la Listeria disminuyó 2 log cfu/g (ensayo 1) y 3 log cfu/g en el ensayo 2. No se observó ninguna diferencia significante en las cuentas de Listeria entre los lotes B y C. En conclusión el mencionado resultado señala que el cultivo bacteriano B-LC-20 resultó ser un cultivo adecuado para los embutidos fabricados según la presente formulación, mostrando una reducción adicional de Listeria después del periodo de fermentación y hasta el final de la maduraración en comparación con el cultivo iniciador de control solo.
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Metodología
Una prueba de estimulación de Listeria en embutidos secos a lo largo del proceso de maduración se diseñó según el siguiente protocolo. Dos ensayos independientes (ensayo 1 y ensayo 2) se realizaron en el Institut de Recerca I Tecnología Agroalimentáries (IRTA), de Monells, España. Se evaluó la actividad anti-Listeria del cultivo de bacterias del ácido lático B-LC-20 en dos concentraciones diferentes.
Cultivos bacterianos
El cultivo anti-listeria B-LC-20 de Chr. Hansen y el cultivo iniciador de control se almacenaron liofilizados (-20ºC) hasta su uso.
Listeria monocytogenes: dos cepas fueron de la colección de la cepa de IRTA, es decir, la cepa CTC1011 y CTC1034; y tres cepas fueron suministradas por Chr. Hansen (P01, P05, P15). Cada cepa se crió por separado en el medio estándar IRTA "TSBYE" y se almacenó liofilizada (-20ºC). Se determinaron cuentas viables antes de cada prueba a fin de calcular la dilución apropiada para alcanzar la inoculación esperada en la mezcla de carne (aproximadamente 10^{3} CFU/g).
Fabricación
Se fabricaron tres lotes (de 12 Kg cada uno).
Lote A de control (cultivo iniciador) + cóctel de Listeria monocytogenes
Lote B de control (cultivo iniciador) + B-LC-20 concentración baja
Lote C de control (cultivo iniciador) + B-LC-20 concentración alta
Los cultivos bacterianos se añadieron por separado en el momento de la mezcla. Primero se añadió el cóctel de L. monocitogenes (en 20 ml de solución salina), seguido del cultivo iniciador y el cultivo adjunto.
Condiciones de maduración
La fermentación y secado de los embutidos se hizo en una cámara de ensayo en ambiente versátil adaptado del modelo Sanyo MLR-350H.
La fermentación se llevó a cabo durante 72h a 24ºC con RH >90%.
Después del periodo de fermentación las condiciones se ajustaron para el secado hasta el día 29 a 14ºC con el 80% de RH.
Análisis
Durante la fermentación y secado, se midió el pH y pérdida de peso en 3 embutidos marcados por lote, diariamente durante la primera semana y con un intervalo de 3-4 días durante las últimas 3 semanas.
Análisis microbianos
Tres embutidos diferentes de cada lote (A, B, C) se analizaron a cada tiempo de muestreo (días: cero (después de 4 horas), 2, 7, 14 y 29). Cada muestra consistía en 25 gramos de un embutido previamente homogenizado.
La determinación de Listeria se hizo a cada tiempo de muestreo, excepto el día 0, por la Técnica del Número más probable (MPN) en caldo base "Fraser" (Oxoid) + suplemento selectivo Half Fraser (Oxoid) (48 horas, a 37ºC) seguido de la confirmación de tubos positivos en Base de Agar selectiva Palcam para Listeria (Merck) + Suplemento selectivo según Van Netten et al. (Merck) (48 horas, a 37ºC).
Las cuentas de Listeria en el tiempo cero se hicieron por extendiendo las apropiadas diluciones en placas de agar Palcam suplementadas e incubando a 37ºC durante 72 horas. Las cuentas de bacterias del ácido lático se realizaron a cada tiempo de muestreo en MRS Agar. (72 horas a 30ºC bajo condiciones anaeróbicas).
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Listeria spp. y cuentas de bacterias del ácido láctico a lo largo de la maduración de embutidos secos en el ensayo 1
3
Los lotes se inocularon de la siguiente manera:
Lote A (cultivo iniciador de control, 3.0 x 10^{6} CFU/g), lote B (cultivo iniciador de control + B-LC-20 de concentración baja (2.9 X 10^{7} CFU/g de carne picada), lote C (cultivo iniciador de control + B-LC-20 de concentración alta (5.6 x 10^{7} CFU/g de carne picada). Todos los lotes se inocularon con un cóctel de 5 cepas diferentes de Listeria monocytogenes (CTC1011, CTC1034; P01; P05, P15).
TABLA 2 pH y pérdida de peso a lo largo de la maduración de embutidos secos en el ensayo 1
4
5 
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TABLA 3 Cuentas de Listeria spp. y de bacterias del ácido láctico a lo largo de la maduración de embutidos secos en el ensayo 2
6
Los lotes se inocularon de la siguiente manera:
Lote A (cultivo iniciador de control, 2.6 x 10^{6} CFU/g), lote B (cultivo iniciador de control + B-LC-20 de concentración baja (1.5 x 10^{7} CFU/g), lote C (cultivo iniciador de control + B-LC-20 concentración alta (5.9 x 10^{7} CFU/g).
Todos los lotes se inocularon con un cóctel de 5 cepas diferentes de Listeria monocytogenes (CTC1011, CTC1034; P01; P05, P15).
TABLA 4 pH y pérdida de peso a lo largo de la maduración de embutidos secos en el ensayo 2
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8
Discusión
Se realizaron dos ensayos independientes para valorar el comportamiento de Listeria en embutidos a lo largo del proceso de maduración. Se fabricaron tres lotes en cada prueba. Un control con cultivo iniciador no activo contra Listeria y dos lotes con el mismo cultivo iniciador más un cultivo adjunto antilisteria añadido a dos concentraciones diferentes (B-LC- 20) en cada lote. Cada lote se inoculó con un cóctel de cinco cepas de Listeria monocytogenes (aprox. 1 03 cfu/g) en el momento de la fabricación.
En ambos ensayos y después de 2 días de fermentación la Listeria disminuyó. Las cuentas en el lote B y C fueron inferiores que en el lote A. Estas diferencias entre el lote de control A y los lotes inoculados con los cultivos antilisteriales aumentaron hasta el fin de la maduraración. En el ensayo 1, al final de la maduración, la Listeria disminuyó 1 Log cfu/g en el lote A mientras que en el lote B y C la Listeria se redujo más de 2 Log cfu/g. En el ensayo 2 al final de la maduración la Listeria disminuyó 1.8 (Log cfu/g) en el lote A, y más de 3 Logs en el lote B y C.
Las cuentas de bacterias del ácido láctico alcanzaron el máximo después de 2 días de fermentación con valores similares al final del proceso en cada lote (alrededor de 108 cfu/g) en ambos ensayos. La curva de pH fue similar para los diferentes lotes en ambos ensayos. El pH mínimo se registró después de 4 días en el ensayo 1 y después de 3 días en el ensayo 2 a pesar de que el pH en el tiempo cero era más alto en el ensayo 2. La caída de pH en los lotes de control fue similar en ambos ensayos a la caída de pH en el lote con el cultivo adjunto añadido. \DeltapH fue de entre 1.22 - 1.24 en el lote A después de 3-4 días de fermentación, y entre 1.26 - 1.34 en los lotes B y C. Las pequeñas diferencias fueron provocadas probablemente por la glucosa extra añadida con la bolsa de cultivo adjunto. La pérdida de peso mostró un perfil similar en ambos ensayos sin diferencias entre los lotes.
Conclusión
El cultivo B-LC-20 demostró ser un cultivo adjunto protector adecuado para embutidos fermentados fabricados según la presente formulación, mostrando una reducción adicional de Listeria después del periodo de fermentación y hasta el fin de la maduración, en comparación con un cultivo iniciador de control solo.
En general, la adición de inoculo extra de bacterias de ácido láctico reduce el tiempo para el comienzo de la fermentación (la fase de latencia) y de ese modo acelera el ritmo de la acidificación en general. Al aumentar el inoculo por 10 veces (de 5-10^{5} a 5-10^{6} CFU/g) la fase de latencia de acidificación para un embutido fermentado de tipo noreuropeo típico se redujo a la mitad y el tiempo para alcanzar un pH de 5.3 y 4.9 se redujo un 25 y 30%, respectivamente.
La adición de B-LC-20 a la receta de embutidos en el Ejemplo 2, ensayo 1 dio lugar a un nivel de inoculación aumentada de bacterias del ácido láctico total de aprox. 15 veces, de 3\cdot10^{6} a entre 3\cdot10^{7}-6\cdot10^{7}. Se esperaba que la fase de latencia se redujese considerablemente y el tiempo para alcanzar pH 4.9 se redujese al menos un 30%. Esta reducción esperada no tuvo lugar, el pH alcanzó 4.9 después de 2 días para los tres lotes, es decir la adición de un cultivo adjunto tal como B-LC-20 a la receta existente no aceleró el tiempo de acidificación como se esperaba. En el ejemplo 1, la velocidad de acidificación de la tabla 1 y 2 no aumentó significativamente tampoco.
Por lo tanto, los inventores de la presente invención descubrieron sorprendentemente que el uso de un cultivo adjunto tal como B-LC-20 proporciona una reducción anti-listerial única para embutidos fermentados ya que se descubrió que Pediococcus acidilactici es un productor fuerte de pediocina (que destruye Listeria monocytogenes) a temperaturas de fermentación europea (<26ºC) aunque no es un acidificador fuerte a esta temperatura.
La reducción de Listeria es provocada principalmente por la pediocina producida por un cultivo adjunto tal como B-LC-20 en el material alimenticio durante la fermentación y proceso de secado. El efecto de pediocina es un fenómeno bien conocido en la bibliografía. No obstante, la singularidad del cultivo adjunto (B-LC-20) y el método aquí descrito es que el fabricante de alimentos puede utilizar el cultivo adjunto junto con el cultivo de acidificación normal ya que no altera el perfil general de la acidificación y la calidad del producto significativamente. Como se menciona anteriormente, el perfil de acidificación es de máxima importancia para la calidad sensorial. Por lo tanto, el fabricante no necesita cambiar su receta actual o condiciones de procesamiento, pero obtendrá la ventaja de reducción en números de Listeria.
Ejemplo 3 Influencia del cultivo adjunto en el perfil de acidificación de diferentes embutidos fermentados
La influencia del cultivo adjunto B-LC-20 en el perfil de acidificación de cuatro tipos de embutidos fermentados con cultivos iniciadores diferentes se demuestran en las Figuras 1 y 2. En todos los casos, la adición del cultivo adjunto en la carne picada para embutidos junto con el cultivo iniciador no influenció el perfil de acidificación de los embutidos significativamente. Además, evaluaciones internas sensoriales mostraron que la calidad sensorial de los embutidos se mantuvo sin cambios por la adición de B-LC-20.
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Tjener, K., Stahnke, L. H., Andersen, L., Martinussen, J. 2003. "A fermented meat model system for studies of microbial aroma formation". Meat Science, 66(1), 211-218.
Modelo de utilidad BA 1994 00266
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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. Bibliografía de no patentes citada en la descripción
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\sqbulletTjener, K. Stahnke, L. H. Andersen, L. Martinussen, J. A fermented meat model system for studies of microbial aroma formation Meat Science, 2003, vol. 66, no. 1. 211-218 [0092]

Claims (13)

1. Método para mejorar la supresión de crecimiento de patógenos tal como Listeria spp. en un producto alimenticio fermentado, dicho método comprende las fases de:
(i) proporcionar un material alimenticio,
(ii) mezclar el material alimenticio con un cultivo iniciador proporcionando el cambio deseado en las características de la matriz alimenticia durante la fermentación,
(iii) mezclar el material alimenticio con al menos un cultivo adjunto en forma de una Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina.
(iv) someter la mezcla obtenida en la fase (iii) a un proceso de fermentación, dicho proceso de fermentación siendo llevado a cabo a una temperatura que es igual a o inferior a 30ºC y caracterizado además por el hecho de que, la acidificación adicional provocada por el cultivo adjunto es 0.5 unidad de pH o inferior permitiendo al mismo tiempo una producción de bacteriocina en una cantidad suficientemente alta como para resultar en una reducción de cuentas de Listeria expresada como log cfu/g de producto fermentado que es 2 o más al final de la maduraración, y obtener el producto alimenticio fermentado.
2. Método según la reivindicación 1, en donde el proceso de fermentación se está llevando a cabo a una temperatura igual a o inferior a 25ºC.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde el producto alimenticio fermentado se somete a un proceso de secado simultáneamente con el proceso de fermentación en la fase (iv) y/o después del proceso de fermentación en la fase (iv) para obtener un producto alimenticio fermentado seco.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la diferencia máxima en valor de pH provocado por la adición de al menos un cultivo adjunto es 0.25 unidad de pH o menos.
5. Método según la reivindicación 4, en donde la temperatura en el proceso de fermentación es igual a o inferior a 28ºC.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la adición de al menos un cultivo adjunto aumenta el nivel de inoculación de bacterias de ácido láctico totales al menos 1000 veces.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde al menos un cultivo adjunto se añade en una concentración en la gama de 10^{2} -10^{10} CFU/g de producto.
8. Método según la reivindicación 7, en donde el al menos un cultivo adjunto se añade en una concentración de 2 x 10^{7} CFU/g de producto.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el producto alimenticio fermentado se selecciona del grupo que consiste de productos lácteos fermentados.
10. Uso de una cepa de Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina como cultivo adjunto para la supresión de Listeria spp. en un producto alimenticio fermentado, en donde dicho cultivo, cuando se añade a un proceso de fermentación de alimentos, se está sometiendo a una temperatura igual a o inferior a 30ºC, produciendo así bacteriocina mientras afecta el perfil de acidificación de la fermentación de 0.5 unidad de pH o menos.
11. Uso según la reivindicación 10, en donde la cepa Pediococcus acidilactici productora de bacteriocina es la cepa Pediococcus acidilactici DSM 10313.
12. Uso según la reivindicación 10 u 11, en donde la condición que es subóptima para el crecimiento es una temperatura igual a o inferior a 26ºC.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 -13, en donde el cultivo adjunto es una preparación liofilizada de DSM 10313 proporcionada por Chr. Hansen A/S bajo la marca SafePro.
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