ES2343448A1 - Procedimiento quimo-enzimatico para la sintesis de 1-deoxi-d-xilulosa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento quimo-enzimático para la síntesis de 1-deoxi-D-xilulosa. Procedimiento para la obtención de 1-deoxi-D-xilulosa que comprende la adición aldólica de benciloxiacetaldehído a hidroxiacetona catalizado por FSA para obtener 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa; y posterior eliminación del grupo bencilo del aducto, 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa, mediante hidrogenolisis catalítica para dar lugar a 1-deoxi-D-xilulosa.
Description
Procedimiento quimo-enzimático
para la síntesis de
1-deoxi-D-xilulosa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento quimo-enzimático para la síntesis de
1-deoxi-D-xilulosa.
Por tanto, la invención se encuadra en el sector químico y
biotecnológico.
La
1-deoxi-D-xilulosa
es una pentulosa de gran importancia pues se incorpora con facilidad
a la ruta metabólica del mevalonato (independiente de metileritriol
fosfato) para la biosíntesis de isoprenoides, que tienen lugar en
bacterias y plantas. El interés en la biosíntesis de difosfato de
tiamina, fosfato de piridoxal e isoprenoides ha despertado muchas
expectativas en la
1-deoxi-D-xilulosa
para usos biotecnológicos. Por ejemplo la
1-deoxi-D-xilulosa
es particularmente valiosa en la producción biotecnológica de
terpenos, ketocarotenoides o vitamina B6, entre otros productos
de
interés.
interés.
En la actualidad existen diferentes síntesis
quimo-enzimáticas para la obtención de
1-deoxi-D-xilulosa.
Algunos de los métodos de síntesis de este compuesto tienen un
número de etapas elevado. En una de estas síntesis se describe la
reacción entre un tioanálogo del fosfato de dihidroxiacetona (DHAP)
y la hidroxiacetona (HA), biocatalizada con la enzima fructosa
bifosfato aldolasa (Duncan, R.; Drueckhammer, D. G., (1996), J.
Org. Chem., 61, (2), 438-439), obteniéndose el
compuesto mediante unas cuatro etapas de síntesis. Además, como
consecuencia de que el procedimiento tenga al menos cuatro etapas,
los rendimientos globales de síntesis no son muy altos.
En otros procedimientos de síntesis se han
utilizado anticuerpos monoclonales como catalizadores (Shabat, D.,
et al., (1999), Tetrahedron Lett.. 40, (8),
1437-1440), como el anticuerpo monoclonal Ab 38C2.
En estos momentos los anticuerpos monoclonales como catalizadores
están en desuso debido a su compleja obtención y los pobres
resultados en cuanto a eficiencia catalítica. En el caso del uso de
Ab 38C2, el rendimiento de la reacción catalítica es de un 32% y el
rendimiento global es del 23% sin contar con las etapas de
purificación.
En consecuencia, el encontrar una metodología
simple y efectiva para la producción de
1-deoxi-D-xilulosa
es de clara importancia estratégica para la producción de
metabolitos importantes a partir de cultivos de plantas o
bacterias.
La presente invención proporciona un
procedimiento quimo-enzimático útil para la
preparación de
1-deoxi-D-xilulosa
basado en la utilización de la enzima
D-fructosa-6-fosfato
aldolasa (FSA).
Un primer aspecto de la presente invención se
refiere a un procedimiento para la obtención de
1-deoxi-D-xilulosa
(esquema 1), que comprende las siguientes etapas:
- a)
- la adición aldólica de benciloxiacetaldehído a hidroxiacetona catalizado por FSA para obtener 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa; y
- b)
- eliminación del grupo bencilo del aducto, 5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa, mediante hidrogenolisis catalítica para dar lugar a 1-deoxi-D-xilulosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrogenolisis catalítica del paso (b) del
procedimiento de la invención consiste en la adición de H_{2} en
presencia de un catalizador, preferiblemente un catalizador
metálico.
"Catalizador metálico" se refiere en esta
invención a un catalizador cuya función en procesos de hidrogenación
es conocida por un experto en la materia. Preferiblemente este
catalizador metálico se puede seleccionar del grupo que comprende
Pd, Ni, Pt, Ru o Rh. Más preferiblemente el catalizador metálico es
Pd/C.
El procedimiento de la invención presenta
ventajas con respecto a las síntesis
quimo-enzimáticas existentes en el estado de la
técnica, al tener un número de etapas menor, rendimientos globales
más altos y una muy alta estereoquímica. Así, por ejemplo:
- la FSA utiliza HA en la reacción de adición
aldólica en lugar del tioanálogo de DHAP, eliminándose un total de 4
etapas sintéticas (sin contar la preparación del tioanálogo de DHAP
y del benciloxiacetaldehído) en comparación con la metodología con
aldolasas DHAP-dependientes, mencionadas en los
antecedentes. En la presente invención se elimina el paso de
hidrólisis del grupo tiofosfato.
- La obtención y purificación de la FSA es
simple y de bajo coste. Como biocatalizador la FSA es estable a 4ºC
como mínimo durante siete meses sin perdida de actividad, y además
no utiliza ni genera residuos tóxicos, como sí ocurre, por ejemplo,
en el caso de utilizar las DHAP-aldolasas, al
emplear dihidroxiacetona (DHA) en presencia de sales de arsénico,
producto altamente tóxico y, por tanto, peligroso para la salud y el
medio ambiente.
- El benciloxiacetaldehído como sustrato da
lugar a una reacción aldólica altamente estereoselectiva, mientras
que la utilización de glicolaldehído da lugar a epimerización del
producto en C3. De esta forma, se procedió a una síntesis según el
esquema 1 utilizando glicolaldehído, dando lugar a un 51% de
rendimiento global de un material que es mezcla 80:20 de dos
diastereoisomeros tal y como se indica:
Esquema
1
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mientras que el rendimiento global del proceso
de síntesis descrito en la presente invención, utilizando
benciloxiacetaldehído, es de un 70%.
- FSA tiene capacidad de controlar la
estereoquímica de la adición aldólica y, por tanto, la configuración
de los nuevos centros estereogénicos creados depende del enzima y no
de los reactivos de la adición aldólica.
Es conocida la capacidad sintética de la FSA de
catalizar la adición aldólica entre la DHA y el
gliceraldehído-3-fosfato para formar
fructosa-6-fosfato (Schürmann, M.;
Sprenger, G. A. (2001) J. Biol. Chem. 276, 11055). También es
conocida su capacidad sintética en adiciones aldólicas de DHA con
otros aldehídos tipo glicolaldehído,
D-gliceraldehído y D-eritrosa. Sin
embargo, en ningún caso los aductos de adición aldólica catalizados
por FSA fueron caracterizados inequívocamente por técnicas
espectroscópicas ni la estereoquímica de estos aductos resuelta. Por
tanto, no podía deducirse a priori que el aldehído de
benciloxiacetaldehído fuera sustrato o reactivo de la FSA ni que la
estereoquímica final de la reacción fuera la adecuada para el
producto de la presente invención.
En una realización preferida de la presente
invención, la enzima
D-fructosa-6-fosfato
aldolasa se corresponde con la FSA de E. coli de SEQ ID
NO:1.
En dicha realización preferida de la presente
invención, la FSA utilizada ha sido clonada en la cepa E.
coli MC4100, derivada de la cepa de E. coli
K-12 (Schürmann, M.; Sprenger, G. A. J. Biol.
Chem. (2001) 276 11055; Casadaban, M. J. (1976) J. Mol. Biol.
104, 541-555) y purificada posteriormente. Dicha FSA
consiste en la forma salvaje de enzima
D-fructosa-6-fosfato
aldolasa que de forma natural se expresa en E. coli y cuya
secuencia de aminoácidos se corresponde con la SEQ ID NO:1.
Cualquier otra enzima
D-fructosa-6-fosfato
aldolasa (FSA) salvaje puede ser aislada e identificada en otros
microorganismos gracias a la información y procedimientos existentes
en el estado de la técnica y a la descripción de la presente
invención. Por lo tanto, una realización preferida de la presente
invención lo constituye el procedimiento de invención donde la
enzima FSA es una enzima de secuencia análoga a la SEQ ID NO:1.
En el sentido utilizado en esta descripción, el
término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de
aminoácidos que pueda ser aislada de un microorganismo o por
mutagénesis dirigida y que posea la capacidad de adición aldólica
entre la DHA y un benciloxiacetaldehído aceptor. En general, una
secuencia de aminoácidos análoga es sustancialmente homóloga a la
secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido
utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente
homóloga" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión
tienen un grado de identidad de, al menos, un 30%, preferentemente
de, al menos, un 75%, más preferentemente de, al menos, un 85%, o
aún más preferentemente de, al menos, un 95%.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se
pretende que sean limitativos de la presente invención.
\newpage
Ejemplo
A continuación se ilustrará la invención
mediante unos ensayos realizados por los inventores que ponen de
manifiesto la estereoselectividad y efectividad del procedimiento de
la invención (Esquema 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
2
1^{er}
Paso
HA (0.68 g, 9.2 mmol) y aldolasa FSA en polvo
(0.113 g, 47 U) se disolvieron en tampón ácido bórico/borato 50 mM
pH 7.0 (80 mL). A esta mezcla se le añadió benciloxiacetaldehído
(1.16 g, 7.7 mmol) disuelto en DMF (20 mL). La mezcla de reacción se
colocó en un agitador orbital (120 rpm) a 25ºC. Transcurridas 24 h
la conversión alcanzó el 99%. La purificación por cromatografía de
columna con gel de sílice (elución con una mezcla de acetato de
etilo/hexano de 4:1 a 1:1) proporcionó 1.2 g, (71%) de
5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa.
[\alpha]D22 = +58.2 (c 1.12 en CH_{2}Cl_{2}) (valores
de la literatura (Giner, J.-L., New and efficient synthetic routes
to
1-deoxy-D-xylulose.
(1998) Tetrahedron Lett., 39, (17),
2479-2482). [\alpha]D20 = +52.5 (c 1.17 en
CH_{2}Cl_{2})) 1H NMR (500 MHz, CD3OD) = 7.30 (m, 5H), 4.54 (s,
2H), 4.21 (d, J=1.9, 1H), 4.16 (td, J=2.0, 6.2, 1H), 3.64 (sistema
AB, J=6.5, 9.5, 1H), 3.55 (sistema AB, J=6.2, 9.5, 1H), 2.22 (s,
3H). 13C NMR (101 MHz, CD3OD) = 212.1, 139.7, 129.5, 129.0, 128.8,
78.9, 74.5, 72.1, 72.0, 26.8.
2º
Paso
5-O-bencil-1-deoxi-D-xilulosa
fue disuelta en metanol (100 mL), se añadió 10% Pd/C como
catalizador (100 mg) y se agitó a temperatura ambiente bajo presión
de H_{2} (50 psi) durante la noche (aproximadamente 12 h). A
continuación se filtró la mezcla a través de una membrana de nylon
de 0,45 mm y se evaporó el disolvente; el residuo se disolvió en
agua y se liofilizó para dar
1-deoxi-D-xilulosa
como un sólido blanco (600 mg, 99%). [\alpha]D22 = +54.1 (c
1.11 en H_{2}O) (valores de la literatura (Kennedy, I. A.;
Hemscheidt, T.; Britten, J. F.; Spenser, I. D.,
1-Deoxy-D-xylulose
(1995) Can. J. Chem., 73, (8), 1329-37).
[\alpha]D20 = +22.4 (c 1.10 en H_{2}O)
[\alpha]D22 = +8.8 (c 1.9 en CH_{3}OH)(valores de la
literatura (Blagg, B. S. J.; Poulter,n C. D., Synthesis of
1-Deoxy-D-xylulose
and
1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate.
(1999) J. Org. Chem., 64, (5), 1508-151,
[\alpha]D20 = - 1.7 (c 1.8 en CH_{3}OH)).
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC) y Bioglane SLNE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento
quimo-enzimático para la síntesis de
1-deoxi-D-xilulosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> ES1641.202
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Procedimiento de obtención de
1-deoxi-D-xilulosa
que comprende las siguientes etapas:
- a.
- la adición aldólica de benciloxiacetaldehído a hidroxiacetona catalizado por la enzima D-fructosa-6-fosfato aldolasa (FSA); y
- b.
- eliminación del grupo bencilo del compuesto obtenido en (a) mediante hidrogenólisis catalítica.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
donde en el paso (b) la hidrogenólisis se lleva a cabo en presencia
de un catalizador metálico seleccionado del grupo que comprende Pd,
Ni, Pt, Ru o Rh.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
donde el catalizador es Pd/C.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la enzima FSA del paso (a) tiene la
secuencia aminoacídica SEQ ID NO:1.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde FSA es una enzima cuya secuencia
aminoacídica presenta una identidad de al menos un 75% con SEQ ID
NO:1.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
donde FSA es una enzima cuya secuencia aminoacídica presenta una
identidad de al menos un 85% con SEQ ID NO:1.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
donde FSA es una enzima cuya secuencia aminoacídica presenta una
identidad de al menos un 95% con SEQ ID NO:1.
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