ES2343411T3 - Procedimientos para identificar agentes biologicamente activos y combinaciones sinergicas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para identificar combinaciones muy sinérgicas de agentes biológicamente activos, que comprende: i. seleccionar una biblioteca de activos potenciales en los que se busca sinergia; ii. identificar un subconjunto de compuestos S(1) que presenten actividad significativa ensayando cada componente de la biblioteca para su actividad en un Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías, siendo dicho ensayo un ensayo de alto rendimiento que incorpora lo suficiente de un sistema biológico completo de modo que las múltiples vías para las que se busca la sinergia sean activas e interaccionen en el ensayo, y teniendo un rango útil conocido de detectabilidad; iii. identificar un subconjunto de mezclas binarias denominado S(2) que presenten sinergia, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de S(1) en mezclas binarias con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde la concentración del componente S(1) en la mezcla binaria se ajusta usando un Protocolo de Escala de Componente Único en el que uno o más componentes S(1) identificados en la etapa (ii) se diluyen repetidamente y se vuelven a ensayar en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías y se determina una concentración en la que la actividad en dicho ensayo es λ CMáx,1, donde λ es un factor de escala en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,5, y CMáx,1 es la actividad máxima realmente detectable en el extremo superior del rango útil del Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías; iv. identificar un subconjunto de mezclas sinérgicas ternarias, S(3), por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas binarias S(2) en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(2) usadas en la mezcla ternaria se ajustan usando un Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar S(2) a un valor λ CMáx,1, donde λ y CMáx,1 son como se han definido en (iii) anteriormente y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(3) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(3) de esa mezcla; y v. opcionalmente realizar una o más etapas adicionales para identificar un subconjunto de combinaciones sinérgicas de N componentes, denominado S(N), donde N es un número entero mayor de 3, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas que contienen (N-1) componentes, denominadas S(N-1) e identificadas de una manera análoga a la etapa iv), en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo los componentes que mostraron actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(N-1) usadas en las mezcla de N componentes se ajustan usando el Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar la mezcla S(N-1) a un valor λ CMáx,1, donde λ y CMáx,1 son como se han definido en (iii) anteriormente, y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(N-1) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(N-1) de esa mezcla.
Description
Procedimientos para identificar agentes
biológicamente activos y combinaciones sinérgicas.
La presente solicitud reivindica el beneficio de
la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/457.859 presentada
el 26 de marzo de 2003; la Solicitud Provisional de Estados Unidos
Nº 60/457.860 presentada el 26 de marzo de 2003; la Solicitud
Provisional de Estados Unidos Nº 60/457.861 presentada el 26 de
marzo de 2003; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº
60/483.564 presentada el 28 de junio de 2003.
La invención se refiere a un procedimiento para
identificar agentes biológicamente activos y combinaciones de
dichos agentes activos que actúan de forma sinérgica juntos para
crear una respuesta biológica mucho más potente que la que pueda
conseguir cualquier agente activo solo.
La sinergia entre agentes biológicamente activos
es un fenómeno bien conocido. Habitualmente la sinergia se descubre
de forma causal o como resultado de la deducción de que debe tener
lugar sinergia a partir de la compresión del proceso biológico. Por
ejemplo, se esperaría que la combinación de penicilina con un
inhibidor de penicilinasa (la enzima que degrada la penicilina)
produjera un mayor rendimiento antibiótico - que de hecho lo
hace.
Como ha aumentado el conocimiento científico de
la complejidad de los procesos vivos, ha llegado a quedar claro que
el grado al que está afectado cualquier punto final biológico único
por muchas vías diferentes es mucho mayor que el que se había
esperado. En particular, ha llegado a quedar claro que las células
de mamífero y otras células tienen una enorme redundancia en sus
vías. En ninguna parte a quedado esto más claro que en los
resultados de experimentos de eliminación génica en los que la
deleción completa de un gen que se cree que tiene una función
crítica a menudo resiste sin efecto detectable sobre el
organismo.
Una consecuencia de esta complejidad es que
muchos efectos finales biológicos deseables pueden conseguirse de
forma más fácil interviniendo simultáneamente en varias vías, y/o en
múltiples puntos dentro de dichas vías, en lugar de centrándose en
el hallazgo de un único agente muy potente para que actúe en un
punto central vital dentro de la red de vías.
Un modo particularmente claro para entender este
fenómeno es considerar el concepto habitual de la "etapa
limitante de la velocidad". Convencionalmente, en biología, se
cree que hay una etapa dentro de una vía que es habitualmente
limitante de la velocidad, es decir, la inhibición de esa etapa
tendrá efecto inmediato sobre la vía completa mientras que la
inhibición de otras etapas tendrá poco o ningún efecto. Dichas
etapas limitantes de la velocidad son por tanto la diana normal
para el desarrollo de fármacos. Considérese, son embargo, lo que
sucede en un sistema complejo, muy interconectado de vías. Cuando se
inhibe la etapa limitante de la velocidad por un agente activo,
otras vías dentro del sistema compensan esa inhibición. En esta
nueva configuración "compensada", diferentes vías pueden
llegar a ser limitantes de la velocidad y se conseguirá un impacto
mucho mayor sobre el sistema global añadiendo un agente que actúe
sobre esta nueva etapa limitante de la velocidad que el que se
conseguiría inhibiendo adicionalmente la etapa limitante de la
velocidad original. Se aplica la misma lógica cuando se añade un
tercer agente a la mezcla - es probable que incluso una tercera vía
llegue a ser limitante de la velocidad cuando se han inhibido ambas
vías limitantes de la velocidad iniciales.
Este paradigma de "múltiple intervención
activa" como fuente de sinergia es de relevancia cuando se desea
el descubrimiento de agentes biológicamente activos, incluyendo en
la industria farmacéutica. El enfoque, sin embargo, es de
particular interés en sectores de la industria tales como
cosméticos, productos de cuidado personal o suplementos de la dieta
donde las normas reguladoras no hacen uso de la dificultad de
mezclas complejas de agentes activos. Es de particular importancia
en estos sectores el potencial de combinaciones de agentes activos
que individualmente son de baja potencia y amplia especificidad que
pueden, en combinación, ser muy potentes y muy selectivos. Esta
propiedad de una combinación de ser más potente y/o selectiva que lo
esperado en base a los componentes individuales se define en este
documento como "sinergia", y la mezcla de ingredientes que
presenta esta sinergia es lo que se entiende por una mezcla
"sinérgica".
Descubrir dichas combinaciones muy eficaces, es
decir, mezclas sinérgicas, de agentes activos es, sin embargo,
desafiante. La causalidad no es un modo válido ya que la cantidad de
combinaciones potenciales de agentes es asombrosamente grande. Por
ejemplo, hay trillones de posibles combinaciones de factor 5 de
incluso una gana relativamente pequeña de 5000 agentes
potenciales.
El ensayo de todas las posibles combinaciones de
una biblioteca de agentes químicos es raras veces un modo práctico
para hallar sinergias de más de dos componentes. Borisy y col.
(documento WO 03/021264) muestran que por el uso de procedimientos
de ensayo de rendimiento extremadamente elevado es posible descubrir
sinergias de dos componentes a partir de bibliotecas del tamaño más
modesto pero no ofrece la manera de manipular la enrome cantidad de
posibles combinaciones a partir de bibliotecas más grandes o cuando
se usan combinaciones de más de 3 componentes.
Incluso cuando se selecciona una combinación
particular de agentes químicos, puede ser desafiante determinar si
la combinación es sinérgica. El modo clásico de hacer esto es a
través del "procedimiento del tablero de damas" en el que se
prepara una matriz en la que cada componente de la combinación se
ensaya a un intervalo de concentraciones. Para una única
combinación de 5 agentes químicos, cada uno se ensaya a 10
concentraciones, de modo que un tablero de damas de 5 dimensiones
implicaría 10^{5} ensayos. Berenbaum (Advances in Cancer
Research, vol. 35, pág. 269-335, 1981 y Journal of
Infectious Diseases, vol. 137, pág. 122-130, 1978)
describe un modo más eficaz para ensayar la sinergia entre
múltiples agentes químicos, pero este procedimiento aún requiere
aproximadamente 100 ensayos para una única combinación de factor 5
de agentes químicos.
Por tanto, la enorme cantidad de posibles
combinaciones, unida a la necesidad de muchos ensayos por
combinación, ha hecho hasta ahora que la búsqueda sistemática de
sinergias de múltiples agentes químicos sea impracticable.
La otra estrategia de descubrimiento normal para
deducir combinaciones potenciales a partir del conocimiento del
mecanismo también está limitada en su potencial por las siguientes
razones.
Muchos puntos finales de organismos vivos están
afectados por múltiples vías. Estas vías a menudo no son conocidas,
y incluso cuando lo son, los modos en que las vías interaccionan
para producir el efecto final biológico a menudo son desconocidos.
Por efecto final biológico se entiende el efecto biológico final que
se desea del agente o combinación, por ejemplo, la estimulación del
crecimiento del cabello o la ralentización o la reversión del
proceso de envejecimiento de la piel. Para complicar más la
situación, muchos agentes activos potenciales tiene amplia
especificidad (en lenguaje farmacéutico son "fármacos sucios" -
como la aspirina) y por lo tanto afectan simultáneamente a
múltiples vías. Las herramientas matemáticas y los bancos de datos
necesarios para modelar y por tanto comprender dicha complejidad,
aún no existen y por tanto raramente puede conseguirse el uso de
descubrimiento "basado en el mecanismo" de múltiples
sinergias.
Se describió un enfoque útil pero limitado para
hallar combinaciones muy sinérgicas de agentes en el documento WO
02/02074. En este caso, se identificaron varias etapas específicas
dentro de la vía de metabolismo del retinol, que se predijo, sobre
fundamentos teóricos, que actuaban sinérgicamente entre sí. Se
identificaron los activos eficaces sobre cada etapa a través de
ensayos muy específicos tales como inhibición enzimática y se
ensayó la serie más pequeña resultante de compuestos activos en
combinaciones de elevado orden. Se hallaron elevados niveles de
sinergia. Este enfoque, sin embargo, está limitado a un caso
especial en el que la vía de interés está bien comprendida y por
tanto puede modelarse de forma teórica.
Por tanto sigue existiendo una necesidad urgente
de procedimientos eficaces capaces de descubrir estas múltiples
sinergias, particularmente aquellas que implican múltiples vías no
comprendidas o mal comprendidas, de un modo oportuno y rentable.
Una ventaja particularmente significativa de la
estrategia experimental y los procedimientos descritos en este
documento es la probabilidad aumentada de identificar combinaciones
muy sinérgicas de materiales biológicamente activos que requieren
cantidades inaplicablemente grandes de ensayos experimentales.
Una ventaja adicional especialmente cuando se
usa con los procedimientos de ensayo de la invención es la capacidad
de utilizar procedimientos experimentales de elevado rendimiento en
modelos biológicos que incorporan las características de múltiples
vías de sistemas reales de interés.
Una ventaja adicional más de la estrategia y los
procedimientos es en la identificación de combinaciones muy
sinérgicas que serán adecuadas para su uso por seres humanos.
Éstas y otras ventajas llegarán a estar claras a
partir de la descripción de la invención.
Se han considerado las siguientes patentes y
publicaciones adicionales:
- \quad
- Systematic discovery of multicomponent therapeutics de Alexis A. Borisy, Peter J. Elliott, Nicole W. Hurst, Margaret S. Lee, Joseph Leha'r, E. Roydon Price, George Serbedzija, Grant R. Zimmemann, Michael A. Foley, Brent R. Stockwell, y Curtis T. Keith. Proceedings of New York Academy of Science, 24 de junio de 2003, Vol. 100, parte 13, pág. 7977-7982. Esta publicación describe los principio de porqué se espera que existe sinergia biológica impredecible entre agentes y demuestra la detección de sinergias binarias entre bibliotecas de fármacos potenciales usando un procedimiento convencional para ensayar todas las posibles sinergias binarias entre fármacos de la biblioteca. Se requieren 36 ensayos para cada combinación binaria y se desarrollan ensayos extremadamente simples y de rendimiento ultra elevado para hacer posible la enrome cantidad de ensayos necesarios para sondear sinergias meramente binarias dentro de la biblioteca. No se hacen sugerencias de que sean posibles estrategias experimentalmente más eficaces para descubrir sinergias y el procedimiento se claramente inaplicable si se buscan órdenes de sinergia de factor 3 o mayores a causa de la gran cantidad de experimentos necesaria.
El documento GB 2242978 (Phillpot y col.)
describe un procedimiento para evaluar materiales para el
crecimiento capilar o la actividad de pigmentación por el cual se
cultivan folículos capilares microdiseccionados individualmente en
medio de cultivo. Este procedimiento es el procedimiento
convencional usado por casi todos los grupos de investigación que
necesitan un ensayo de crecimiento capilar in vitro
(habiéndose abandonado la patente). El procedimiento, sin embargo,
es fundamentalmente inadecuado para cualquier aplicación de elevado
rendimiento debido al laborioso procedimiento para microdiseccionar
folículos capilares.
Ninguna de las referencias citadas anteriormente
muestra los procedimientos específicos para evaluar materiales
biológicamente activos y para identificar combinaciones sinérgicas
como se describe en este documento. Se desconoce cualquier técnica
previa que muestre la estrategia de diseño experimental o ensayos
descritos en este documento.
La presente invención describe un procedimiento
in vitro para la identificación de combinaciones muy
sinérgicas de materiales biológicamente activos usando una
estrategia experimental altamente eficaz que permite que se
identifiquen dichas combinaciones con muchos menos experimentos que
como sería el caso usando estrategias experimentales conocidas en la
técnica.
Más específicamente, la invención es un
procedimiento in vitro para identificar combinaciones muy
sinérgicas de agentes biológicamente activos que implica:
- i.
- seleccionar una biblioteca de activos potenciales en los que se busca sinergia;
- ii.
- identificar un subconjunto de compuestos S(1) que presenten actividad significativa ensayando cada componente de la biblioteca para su actividad en un Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías, siendo dicho ensayo un ensayo de alto rendimiento que incorpora lo suficiente de un sistema biológico completo de modo que las múltiples vías para las que se busca la sinergia sean activas e interaccionen en el ensayo, y teniendo un rango útil conocido de detectabilidad;
- iii.
- identificar un subconjunto de mezclas binarias denominado S(2) que presenten sinergia, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de S(1) en mezclas binarias con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde la concentración del componente S(1) en la mezcla binaria se ajusta usando un Protocolo de Escala de Componente Único en el que uno o más componentes S(1) identificados en la etapa (ii) se diluyen repetidamente y se vuelven a ensayar en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías y se determina una concentración en la que la actividad en dicho ensayo es \lambda C_{Máx,1}, donde \lambda es un factor de escala en el intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,5, y C_{Máx,1} es la actividad máxima realmente detectable en el extremo superior del rango útil del Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías;
- iv.
- identificar un subconjunto de mezclas sinérgicas ternarias, S(3), por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas binarias S(2) en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(2) usadas en la mezcla ternaria se ajustan usando un Protocolo de Escala de Múltiples Componentes u otros criterios de selección de modo que se vuelva a graduar S(2) a un valor \lambda C_{Máx,1}, donde \lambda y C_{Máx,1} son como se han definido en (iii) anteriormente y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(3) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(3) de esa mezcla; y
- v.
- opcionalmente realizar una o más etapas adicionales para identificar un subconjunto de combinaciones sinérgicas de N componentes, denominado S(N), donde N es un número entero mayor de 3, por ensayo en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas sinérgicas que contienen (N-1) componentes, denominadas S(N-1) e identificadas de una manera análoga a la etapa iv), en combinación con sustancialmente cada componente de la biblioteca incluyendo los componentes que mostraron actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde las concentraciones de los componentes S(N-1) usadas en las mezcla de N componentes se ajustan usando el Protocolo de Escala de Múltiples Componentes u otros criterios de modo que se vuelva a graduar la mezcla S(N-1) a un valor \lambda C_{Máx,1}, donde \lambda y C_{Máx,1} son como se han definido en (iii) anteriormente, y por lo cual se elimina cualquier componente de la mezcla S(N-1) que esté contribuyendo solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(N-1) de esa mezcla.
Pueden identificarse potencialmente mezclas muy
sinérgicas usando la estrategia experimental resumida anteriormente
que puede usarse por seres humanos y presentar actividad
significativa en una diversidad de efectos finales biológicos.
También se describe en este documento una serie de procedimientos o
ensayos que se usan para identificar agentes que muestran actividad
biológica máxima dirigida al efecto final biológico específico.
Estos efectos finales biológicos abarcan la estimulación del
crecimiento del cabello, anti-envejecimiento de la
piel, control de la placa dental y la resolución del acné. Los
ensayos comparten las propiedades comunes de ser capaces de usar un
formato de alto rendimiento así como de incorporar muchas de las
múltiples vías que están implicadas en o controlan el efecto final
biológico real.
La invención se basa en el uso de un sistema de
ensayo que cumple ciertos criterios críticos junto con un nuevo
diseño experimental que perite la rápida identificación de sinergias
de orden superior.
El sistema de ensayo debe tener capacidad de
elevado rendimiento. El término alto rendimiento se aplica a un
ensayo que puede automatizarse y realizarse de forma económica a una
escala mayor de 100 ensayos por día, preferiblemente mayor de 1000
ensayos por día mucho más preferiblemente a una escala de varios
miles de ensayos por día. En el descubrimiento convencional de
fármacos, dichos ensayos de alto rendimiento son muy simples y muy
específicos. Por ejemplo pueden ser ensayos de unión a receptor,
ensayos de inhibición enzimática y etcétera. En la presente
invención dichos ensayos simples no son adecuados. El ensayo debe
incorpora lo suficiente del sistema biológico completo de modo que
las múltiples vías para las que se busca la sinergia sean activas y
estén interaccionando en el ensayo. La complejidad necesaria de los
ensayos varía con el efecto final biológico diana.
Por ejemplo, un ensayo que mide una respuesta de
un cultivo celular, tal como la proliferación o diferenciación,
puede ser satisfactorio cuando el efecto final biológico deseado
sobre el organismo completo se produce de forma fiable por el
cambio en el único tipo celular cultivado. Ejemplos dichos ensayos
serían la diferenciación de queratinocitos cultivados como ensayo
para predecir la mejora en el estado de la piel o la inhibición de
la síntesis de triglicéridos en un cultivo de sebocitos para
predecir la reducción de oleaginosidad de la piel.
Para un fenómeno biológico más complejo, por
ejemplo, el crecimiento de cabellos donde se controla el crecimiento
del cabello por interacciones complejas, inter alia, los
queratinocitos de los bulbos capilares y los fibroblastos de las
papilas dérmicas, el ensayo ideal contendría todos los múltiples
tipos celulares que interaccionan para formar el cabello. Por
tanto, se preferiría un sistema de cultivo de órganos que realmente
haga crecer el cabello, aunque podrían usarse ensayos más simples
tales como cultivo de células de las papilas dérmicas o células de
la vaina de la raíz externa si se buscara una serie sinérgica de
activos dentro de un único tipo celular del folículo capilar.
Obviamente el ensayo también debe ser
reproducible y suficientemente sensible de modo que tenga un
"rango útil de detectabilidad" adecuado, es decir, un rango de
trabajo práctico. Es importante que este rango útil de
detectabilidad, sea conocido para utilizar la estrategia de diseño
experimental de forma eficaz. En particular, es crítico determinar
la actividad máxima detectable de forma fiable en el extremo
superior del rango útil del Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples
Vías. Este valor se denomina C_{Máx,1}.
Los ensayos que son adecuados como se ha
descrito anteriormente se llaman en este documento "Ensayos de
alto de rendimiento de múltiples vías".
El diseño experimental para utilizar este
sistema de ensayo es claramente diferente del usado
convencionalmente en el descubrimiento de fármacos.
Se espera que puedan ser útiles agentes en el
cóctel final de activos aunque no tengan efecto medible por sí
mismos. Esto es una consecuencia de los principios de redundancia y
compensación expuestos en los antecedentes de la invención. Por
tanto, el diseño experimental que podría ser obvio para un
especialista habitual de la técnica - para identificar una
pluralidad de ingredientes individualmente eficaces y después
realizar una matriz de experimentos para ensayar todas las
combinaciones de los agentes eficaces - perdería muchas de las
combinaciones más importantes u eficaces.
En su lugar, debe usarse un nuevo diseño
experimental por el que:
a) Se ensaya una biblioteca de agentes activos
potenciales en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías a
una concentración máxima apropiada y se identifican aquellos con
actividad significativa. La concentración máxima apropiada es
relativamente arbitraria y puede verse influida por, por ejemplo, el
coste o solubilidad del agente particular. No existe la necesidad
de que todos los agentes de la biblioteca estén presentes a la misma
concentración.
b) Algunos o todos los activos del subconjunto
(S(1)) que tienen actividad significativa en el Ensayo de
Alto Rendimiento de Múltiples Vías tienen su respuesta a dosis
determinada en un Protocolo de Escala de Componente Único. El
término actividad significativa se define en este documento como una
actividad en el ensayo que es al menos el 5% de C_{Máx,1}. Este
protocolo es un estudio de respuesta a dosis convencional en el que
el activo se diluye repetidamente y se vuelve a ensayar en el Ensayo
de Alto Rendimiento de Múltiples Vías, para determinar la
concentración a la que tiene un efecto menor del máximo. El nivel
óptimo del efecto variará con la sensibilidad y variabilidad del
sistema de ensayo y puede variar de aproximadamente el 50% a menos
del 1% de la respuesta máxima encontrada en el ensayo para cualquier
material ensayado en la fase a). Por tanto, el Protocolo de Escala
de Componente Único proporciona un medio para ajustar la
concentración de los componentes S(1) llevados delante de
modo que la actividad se regule de nuevo a un valor \lambda
C_{Máx,1}, donde \lambda es un factor de escala factor en el
intervalo de aproximadamente 0,01 a 0,5, y C_{Máx,1} es la
actividad máxima realmente detectable en el extremo superior del
rango útil del Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías;
c) Algunos o todos los activos del subconjunto
S(1) después se ensayan a su concentración mínimamente eficaz
en una combinación binaria con cada agente químico de la biblioteca
original de agentes potenciales a su concentración ensayada original
si eran inactivos en la etapa (a) o a su concentración mínimamente
eficaz si eran activos en la etapa (a).
d) Aquellas combinaciones de compuestos que dan
un rendimiento mayor en el ensayo binario que cualquiera de los dos
componentes individuales se identifican como que muestran sinergia
binaria y se clasifican como miembros del subconjunto
S(2).
e) Alguno o todos los activos del subconjunto
S(2) tienen estudios de respuesta a dosis realizados usando
un Protocolo de Escala de Múltiples Componentes para determinar la
concentración de componentes de la mezcla que proporciona una
mezcla que tiene un efecto menor del máximo en el ensayo que se está
usando. El Protocolo de Escala de Múltiples Componentes es un
estudio de respuesta a dosis que usa el Ensayo de Alto Rendimiento
de Múltiples Vías por el cual se varían independientemente la
concentración de cada componente de la mezcla. Para combinaciones
binarias, producirá una superficie de respuesta a dosis
bidimensional, para combinaciones ternarias una superficie de
respuesta a dosis tridimensional y etcétera para órdenes superiores
de combinaciones. Para todas las combinaciones (mezclas) diferentes
de los componentes sencillos, habrá múltiples proporciones y
concentraciones de los componentes que dan el mismo nivel de
actividad. La base de la selección de qué proporción llevarse
adelante no es crítica y estará influida por la aplicación. Por
ejemplo, podría ser la proporción que da la concentración total más
baja de activos, o el coste combinado más bajo de activos o el valor
clogP promedio más elevado (donde P se define como el coeficiente
de reparto de octanol/agua) o cualquier otro criterio que sería
favorable en el uso final ideado. Se prefiere que este Protocolo de
Escala de Múltiples Componentes se realice de forma exhaustiva ya
que esto maximizará la probabilidad de hallar las combinaciones
óptimas de componentes en la mezcla, sin embargo, pueden
sustituirse protocolos menos exhaustivo con la condición de que se
identifique al menos una mezcla que muestre un efecto menor que el
máximo para llevarlo adelante al siguiente ciclo. Independientemente
de los criterios usados, el punto clave es graduar de nuevo la
actividad de la combinación S(2) ensayada de modo que su
actividad se \lambda C_{Máx,1}.
f) Las etapas c) a e) se repiten, combinando
cada agente químico de la biblioteca original con la concentración
eficaz menor de la máxima de las combinaciones binarias del
subconjunto S2. Estos ciclos pueden continuarse de forma
indefinida, ensayando la concentración de cada componente de la
biblioteca de activos potenciales con el subconjunto
S(N-1) para identificar el subconjunto
S(N) de combinaciones de N activos, por tanto identificando
combinaciones sinérgicas que contienen cualquier cantidad deseada de
compuestos, N.
Los elementos únicos de esta estrategia son:
- -
- que las concentraciones de los agentes activos se reducen continuamente según se completan ciclos de modo que las combinaciones de activos a las que se añadirá el compuesto de ensayo tienen una eficacia menor que la máxima en el ensayo. En otras palabras, la estrategia busca concentraciones inferiores de activos para conseguir una actividad dada en lugar de buscar actividades siempre mayores,
- -
- los agentes químicos candidatos no se excluyen de los últimos ciclos justo porque se muestran ineficaces en la única exploración química inicial o en ciclos tempranos. Este requisito proviene directamente del concepto de que múltiples vías controlan efectos finales biológicos complicados.
En cada fase, cuando se realiza el Protocolo de
Escala de Múltiples Componentes para la combinación de activos,
puede hallarse que activos que eran muy eficaces en ciclos tempranos
han llegado a ser marginalmente eficaces, haciendo que su papel sea
innecesario por las combinaciones de los otros activos. En ese caso,
dichos activos pueden eliminarse de ciclos de ensayo adicionales.
Por tanto es posible que en un ciclo en el que, por ejemplo, una
combinación ternaria de agentes se combina con la biblioteca de
agentes únicos, la producción a la siguiente fase sea otra mezcla
ternaria, o incluso de forma concebible una mezcla binaria, en lugar
de una mezcla cuaternaria.
Como es posible que compuestos esenciales en
ciclos tempranos en el proceso de descubrimiento ya no sean
necesarios en ciclos posteriores, es posible incluir en la
biblioteca original de activos potenciales, compuestos que son
eficaces pero no pueden usarse en las composiciones finales - por
razones tales como toxicidad, protección de patentes, restricciones
reguladoras, costes etc. Esto es particularmente deseable en la
situación en la que, en la primerísimo ronda de ensayo de compuestos
individuales, se descubren pocos o ningún compuesto eficaz.
La estrategia expuesta anteriormente requerirá
muchos menos ensayos que un ensayo exhaustivo de todas las
combinaciones de todos los activos candidatos, incluso si cada
material en el subconjunto S(N) se lleva adelante al
posterior ciclo - véase tabla 1. Sin embargo, hay una modificación
aún más potente para la estrategia que produce incluso menos
ensayos.
En la mayoría de los sistemas biológicos
complejos, el punto final de interés (por ejemplo, crecimiento del
cabello) se controlará por una serie muy grande y muy interconectada
de vías. En muchos casos, esta serie será funcional como un único
sistema muy interrelacionado, en otros, los subconjuntos de la serie
más grande mostrarán interconexiones particularmente fuertes dentro
del subconjunto y por consiguiente funcionarán como un subsistema
dentro del sistema más grande. Pueden descubrirse combinaciones muy
sinérgicas de agentes activos dentro de cada subsistema (o dentro
del sistema completo si no hay subsistemas eficaces) con la
condición de que en cada ciclo de la estrategia expuesto
anteriormente, se seleccione al menos un activo (o combinación de
activos para ciclos posteriores) que actúe sobre el subsistema para
el progreso a la siguiente fase, donde se combinará con cada
miembro de la biblioteca original de activos. Si se completen
suficientes ciclos, hasta el punto en el que no se encuentren
sinergias adicionales o sean de pequeño efecto, entonces la
combinación más eficaz de activos sinérgicos surgirá al final del
proceso.
Por tanto, es posible seleccionar, de forma
bastante arbitraria, una cantidad relativamente pequeña de agentes
eficaces (o combinación de agentes para ciclos posteriores) a partir
del subconjunto S(i), donde i es la cantidad de componentes
de cada subconjunto (igual a 1-N), para llevar
adelante a futuros ciclos. Si como resultado de esto se rechaza un
compuesto en una fase particular, aunque finalmente demostrarse ser
un componente vital de la mezcla de activos elevadamente sinérgica
final, se recapturaría en posteriores ciclos porque cada miembro de
la biblioteca se vuelve a ensayar en cada ciclo.
La cantidad de activos que debe llevarse
adelante en cada ciclo es relativamente arbitraria y estará
controlada en parte por el coste y la dificultad del ensayo
particular. En principio podrá llevarse adelante un único activo o
combinación en cada ciclo, pero eso podría producir una combinación
sinérgica de activos que se halla que actúa solamente dentro de un
único subsistema, con otros subsistemas potencialmente importantes
desatendidos. Es deseable, por lo tanto, que se seleccione una
cantidad suficiente de activos en cada fase para hacer
estadísticamente probable que cada subsistema esté afectado por al
menos un activo. Por tanto, los miembros reales de cada subconjunto
S(1) a S(N-1) ensayados en combinación
con la biblioteca completa pueden representar solamente una pequeña
cantidad de miembros del subconjunto. Esta cantidad pequeña puede
incluir hasta aproximadamente 10 y más preferiblemente hasta
aproximadamente 5 miembros.
La Tabla 1 ilustra la cantidad de ensayos
necesaria usando las diferentes estrategias descritas anteriormente
para descubrir combinaciones sinérgicas de factor 5 de una
biblioteca de 5000 ingredientes dentro de la cual el 1% (50)
muestra actividad en el ensayo cuando se ensayan como agentes únicos
y el 1% muestra sinergia en cualquier ciclo dado cuando se añaden a
la mezcla S(N) a partir del ciclo previo.
La expresión "biblioteca de ingredientes"
se usa en un sentido amplio para denominar la colección de agentes
químicos que se está ensayando empleando la estrategia experimental
descrita en este documento. La base de elección de la biblioteca de
ingredientes usada en la estrategia variará con la aplicación. Los
ejemplos no limitantes de bibliotecas útiles incluyen:
- -
- para aplicaciones en productos cosméticos, toda o parte de la colección de agentes químicos aprobada para su uso en cosméticos en, por ejemplo, la lista EINECS o el diccionario CTFA de compuestos cosméticos.
- -
- para aplicaciones farmacéuticas, toda o parte de la colección de fármacos Rx y OTC aprobados para todas o una selección de indicaciones
- -
- para aplicaciones farmacéuticas, toda o parte de la colección de fármacos candidatos que no progresaron a través del proceso de aprobación regulador
- -
- productos naturales incluyendo productos que son por si mismos mezclas complejas de agentes químicos. En la estrategia descrita anteriormente, dichas mezclas complejas pueden tratarse como miembros sencillos de la biblioteca.
- -
- bibliotecas combinatorias de agentes químicos sintetizados tales como los descritos en "A reagent-based strategy for the design of large combinatorial libraries: a preliminary experimental validation". Makara GM, Nash H, Zheng Z, Orminati JP, Wintner EA, Mol. Divers. 2003; 7(1):3-14 y en "Combinatorial chemistry and peptide library methods to characterize protein fosfatases". Vetter SW, Zhang ZY. Methods Enzymol. 2003; 366: 260-82.
Aunque es aconsejable que se use la biblioteca
completa a lo largo de todos los ciclos repetidos de la estrategia,
es permisible eliminar agentes químicos de, o añadir agentes
químicos a, la biblioteca en ciclos posteriores sin invalidar la
estrategia.
Aunque la descripción detallada anterior
constituye las realizaciones más favorecidas del procedimiento,
estará claro para un especialista en la técnica que pueden
eliminarse o modificarse ciertas etapas sin desviarse de los
elementos clave de la invención expuestos anteriormente.
Este procedimiento para descubrir sinergias de
orden superior en sistemas biológicos es aplicable a una amplia
gama de procesos biológicos incluyendo, aunque sin restricción,
crecimiento del cabellos, envejecimiento de la piel y otros
tejidos, manipulación de la pigmentación, control de la producción
de sebo, tratamiento de la caspa, inhibición o modulación del
crecimiento microbiano, estimulación del metabolismo de las grasas,
modulación de la inflamación, reducción de la síntesis de
colesterol, prevención del daño oxidativo y cualquier otro proceso
biológico en el que exista un Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías cuyo comportamiento esté controlado por múltiples
etapas o vías biológicas. En muchos casos, sin embargo no existen
Ensayos de Alto de Rendimiento de Múltiples Vías y deben inventarse
para permitir aplicar la estrategia a un beneficio final o efecto
final biológico particular. En los siguientes Ejemplos
1-4, se describen nuevos Ensayos de Alto de
Rendimiento de Múltiples Vías para varias aplicaciones preferidas
del procedimiento, es decir, efectos finales biológicos para los
que se busca sinergia. Los Ejemplos 5-8 describen
aplicaciones para el procedimiento donde pueden usarse Ensayos de
Alto de Rendimiento de Múltiples Vías ya conocidos para los
especialistas en la técnica.
Pueden usarse productos identificados por los
procedimientos descritos en este documento, es decir, mezclas
sinérgicas de ingredientes biológicamente activos, para conseguir
una diversidad de efectos finales biológicos especí-
ficos.
ficos.
Por ejemplo, en la estimulación del crecimiento
del cabello, una manera preferida para usar las combinaciones
sinérgicas identificadas siguiendo los procedimientos descritos en
detalle en el Ejemplo 1 es en composiciones de champú, y
acondicionadores del cabello.
Las composiciones de champú son bien conocidas
en la técnica cosmética y generalmente son mezclas acuosas de alguno
o todos los siguientes componentes:
- -
- tensioactivos que generalmente son mezclas de componentes aniónicos, anfotéricos y no iónicos (de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 20% en peso de la composición)
- -
- acondicionadores tales como polímeros catiónicos, siliconas, aceites, y tensioactivos catiónicos (de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 10% en peso de la composición)
- -
- aditivos estéticos tales como perfumes, colorantes, opacificantes, agentes nacarescentes, espesantes y agentes de suspensión (generalmente menos del 10% en peso de la composición)
Las composiciones de acondicionador del cabello
pueden ser de tipo con aclarado o sin aclarado y también son
conocidas en la técnica. Dichas composiciones generalmente
contienen:
- -
- acondicionadores tales como aceras dispersables en agua, aceites, tensioactivos catiónicos, tensioactivos no iónicos, polímeros, siliconas (generalmente de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 25% en peso de la composición)
- -
- auxiliares de peinado tales como diversos polímeros formadores de aplícala solubles en agua, polímeros insolubles y látex (generalmente menos del 5% en peso de la composición)
- -
- aditivos estéticos tales como perfumes, colorantes, opacificantes, agentes nacarescentes, espesantes y agentes de suspensión (generalmente menos del 10% en peso de la composición)
Se da una descripción de la formulación de
composiciones de champú por Wells en la patente de Estados Unidos Nº
US5573709. Se da una descripción de la formulación de composiciones
de acondicionador del cabello por Ansher-Jackson y
col. en la patente de Estados Unidos Nº US5100657.
Los siguientes ejemplos se muestran como
ilustraciones de la invención y no se pretende que limiten de ningún
modo su alcance.
Una aplicación particularmente preferida es el
efecto final biológico de crecimiento del cabello. El crecimiento
del cabello es un fenómeno complejo. Ya se conocen varias vías que
influyen en el crecimiento del cabello y es muy probable que estén
implicadas muchas otras vías, aún sin descubrir. Por lo tanto, es un
sistema biológico que probablemente es susceptible a combinaciones
muy sinérgicas de ingredientes activos.
Hay muchas referencias en la bibliografía
científica a procedimientos que miden el efecto de agentes activos
sobre el crecimiento del cabello. El procedimiento más validad
implica el uso de animales vivos con agentes aplicados de forma
tópica o proporcionados de forma sistémica. Los sistemas in
vitro para medir el efecto de agentes sobre el crecimiento del
cabello han sido, en contraste, desafiantes de desarrollar. Los
sistemas más satisfactorios han implicado la disección manual de
folículos capilares individuales, de vibrisas de roedores o de piel
humana (véase Philpott, documento GB 2 242 978A). En ambos casos, el
procedimiento es laborioso y como resultado la cantidad de agentes
activos potenciales que se puede ensayar es muy limitada. En
principio, el cultivo de pequeñas biopsias de piel que contienen
folículos capilares intactos podría ser capaz de un rendimiento
mayor de activos potenciales. Sin embargo, los intentos por cultivar
piel de este modo usando sistemas de "cultivo orgánico"
normales han fallado porque el folículo capilar no ha logrado
mantener un patrón de crecimiento normal no más de unos pocos días
(por ejemplo, Li L, Margolis LB, Paus R, Hoffman RM, Hair shaft
elongation, follicle growth, and spontaneous regression in
long-term, gelatin
sponge-supported histoculture of human scalp skin. Proc Trail Acad Sci USA. Sep de 1992 15; 89(18): 8764-8-).
sponge-supported histoculture of human scalp skin. Proc Trail Acad Sci USA. Sep de 1992 15; 89(18): 8764-8-).
Otros sistemas in vitro incluyen el
cultivo de células de las papilas dérmicas o queratinocitos de
folículos capilares pero, aunque son prácticos y con capacidad de
elevado rendimiento, estos sistemas no logran imitar la complejidad
el cabello intacto y por tanto son propensos a muchos resultados
falsos positivos y falsos negativos.
El cultivo de pequeños trozos de piel intacta en
condiciones convencionales es una técnica bien establecida en
biociencia. Normalmente, la piel se corta con una queratotomo a un
grosor de aproximadamente 0,5 mm antes de colocarse en cultivo, de
otro modo la difusión limitada de nutrientes a través de las capaz
dérmicas gruesas provocaría pérdida de crecimiento o incluso
necrosis de las capas epidérmicas. Por tanto, estos procedimientos
no han sido valiosos en el cultivo de folículos capilares intactos
en forma de cortes por etapas con queratotomo a través del
folículo. Como se ha indicado anteriormente, los intentos por
cultivar piel de grosor completo provocan una pérdida bastante
rápida del crecimiento organizado de los folículos capilares, quizá
debido a la incapacidad de los nutrientes de penetrar en el folículo
capilar en cantidades suficientes.
Se ha descubierto sorprendentemente que esta
limitación puede superarse por el cultivo simple de pequeños trozos
de piel de grosor completo en medios de cultivo convencionales a
temperatura reducida, en los que los folículos continúan creciendo
con arquitectura normal durante muchos días. La temperatura de
cultivo debe reducirse por debajo de la temperatura de cultivo
convencional de 37 grados C, hasta al menos 30 grados y
preferiblemente hasta 20-25 grados o incluso
temperaturas inferiores. Este procedimiento de cultivar folículos
capilares dentro de trozos completos de piel, y las técnicas de
medición asociadas descritas a continuación se conocen como
"Cultivo Orgánico de Piel Completa a Baja Temperatura".
Sin desear quedar ligado a la teoría, se cree
que la base para este fenómeno recae en los diferentes efectos de
la temperatura sobre los procesos del crecimiento y la respiración
celular (donde una pequeña disminución en la temperatura tiene un
gran efecto sobre la velocidad de crecimiento y respiración) y de la
difusión de pequeñas moléculas a través de la piel (donde la
dependencia de la temperatura es mucho menor). Por tanto, a
temperaturas inferiores, los folículos capilares metabólicamente
menos activos no agotan en exceso los nutrientes disponibles para
ellos a partir de la difusión desde el medio de cultivo.
Esta innovación clave permite que se mantengan
cultivos de trozos completos de piel que contienen uno o más
folículos capilares lo suficiente para evaluar activos que modulen
el crecimiento del cabello - típicamente, 3-10
días.
Las realizaciones preferidas del procedimiento
incluyen
1) Reducir la temperatura del cultivo hasta por
debajo de aproximadamente 30 C como se ha descrito anterior-
mente.
mente.
2) El uso de medio de cultivo libre de suero tal
como Medio de Eagle modificado por Dulbecco o medio E de Williams
para minimizar el fenómeno de epibolia en el que las capaz
epidérmicas crecer hasta encerrar completamente la muestra de piel
(véase, Stenn KS, Dvoretzky I. Human serum and epithelial spread in
tissue culture. Arch Dermatol Res. Feb de 1979 23;264
(1):3-15).
3) La eliminación de las capas superficiales de
la piel que comprenden la epidermis y la parte del folículo capilar
por encima de la glándula sebácea antes de cultivar la piel. Esto
puede conseguirse fácilmente usando un queratotomo ajustado a
aproximadamente 0,2 mm. El resultado de esto es un área aumentada
para la difusión de nutrientes en la piel y consumo reducido de
nutrientes por los queratinocitos epidérmicos de crecimiento
activo. En estas condiciones, se sostiene el crecimiento de
folículos capilares durante tiempos más largos o con menos cambios
de medio.
4) El uso de pequeños trozos de piel que
contienen solamente uno o unos pocos folículos - típicamente entre
1 mm y 6 mm de diámetro. El uso de dichos pequeños trozos de piel
provoca que, sin embargo, una proporción significativa de folículos
capilares se dañen porque los folículos típicamente no descansan de
forma perpendicular a la superficie de la piel y muchos folículos
cuyas partes superiores descansan dentro del trozo de piel tienen
sus partes inferiores cortadas transversalmente por la superficie de
corte del trozo de piel. Este problema puede mitigarse por el uso
de uno de tres nuevos dispositivos de corte descritos a continuación
que proporcionan una superficie de corte que es mucho más probable
que esté en una dirección paralela al folículo y por tanto es mucho
menos probable que diseccione el folículos por debajo de la glándula
sebácea;
- a.
- El nuevo dispositivo de corte de piel consta de una serie de hojas afiladas separadas por un hueco de 1-8 mm, mantenidas en un ángulo establecido o un ángulo ajustable a la vertical y contenidas dentro de un elemento portador. El ensamblaje de las hojas puede dirigirse en un trozo de piel de forma manual o por una prensa accionada con energía, preferiblemente con la fuerza de la prensa alineada paralela a las hojas del dispositivo. Después se usa un dispositivo similar para cortar las tiras de piel en ángulos rectos al primer corte y con un ángulo de hoja seleccionado para minimizar el daño de los folículos. Normalmente será posible alinear el trozo de piel cortada de modo que el primer corte se haga a un ángulo de aproximadamente 30 de la vertical (dependiendo de las fuentes de la piel) mientras que el segundo corte puede ser vertical. Un ejemplo simple y preferido de este dispositivo implica hojas de afeitar convencionales o más grandes ensartadas sobre dos rodillos metálicos ensartados con arandelas ligeramente más grandes entre cada hoja para proporcionar el espaciado de 1-6 mm. Las hojas y las arandelas después se sujetan juntas apretando palometas en cada extremo del rodillo. El ángulo de las hojas, si no está a 90 grados de los rodillos, se ajusta ensartando insertos conformados sobre los rodillos entre la hoja más externa en cada extremo y su palometa asociada.
- b.
- El nuevo dispositivo de corte es similar al descrito en a) pero remplaza las hojas de afeitar con ruedas de corte circulares, montadas sobre un rodillo de soporte y con insertos conformados similares ensamblados en cada extremo del rodillo para inclinar las hojas circulares al ángulo deseado.
- c.
- El nuevo dispositivo de corte de la piel consta de una serie de troqueles de biopsia circulares de un diámetro de 1-8 mm situado en un ensamblaje a un ángulo fijo de la vertical de modo que cuando se dirige en la muestra de piel, los troqueles cortan de forma paralela a la dirección del folículo capilar.
En todos los dispositivos de corte descritos es
ventajoso colocar una lámina de cera blanda o plástico por debajo de
la piel para evitar el daño a los bordes de corte cuando se cortan a
través de la piel.
En un caso, el Cultivo Orgánico de Piel Completa
a Baja Temperatura es un cultivo miniaturizado de piel que contiene
folículos capilares viables intactos por debajo de la glándula
sebácea, idealmente tiene una parte significativa de la epidermis
retirada, y se mantiene en un medio de cultivo libre de suero a una
temperatura por debajo de aproximadamente 30 C y cuyo crecimiento
del cabello se mide por una técnica de alto rendimiento.
En cualquier procedimiento in vitro para
evaluar el efecto de sustancias sobre el crecimiento del cabello,
es necesario medir la velocidad de crecimiento del cabello con
suficiente exactitud para detectar un activo biológico candidato
eficaz. Se han usado muchos métodos con éxito en el pasado. Estos
incluyen medir el aumento en la longitud de forma microscópica y
medir la incorporación de aminoácidos marcados con radioisótopos. La
medición del crecimiento del cabello en un cultivo de piel de
grosor completo es desafiante, sin embargo, ya que el examen
microscópico directo es difícil y demasiado laborioso para cualquier
aplicación de alto rendimiento y la incorporación de radioisótopo se
confunde con la incorporación de isótopo en estructuras diferentes
del cabello.
Un aspecto adicional de este procedimiento, por
lo tanto, es el desarrollo de varias herramientas de medición
nuevas para su uso sobre cabello que crece dentro de pequeños trozos
de piel completa y con capacidad de uso en una modalidad de alto
rendimiento. Los tres métodos específicos de medición descritos a
continuación satisfacen estos requisitos:
1) Al final del experimento de cultivo, la
biopsia de piel puede disolverse usando una exposición secuencia o
concurrente a una mezcla de proteasas que preferiblemente incluye
colagenasa. Este procedimiento puede usarse sobre piel completa
pero es particularmente eficaz cuando se ha eliminado la epidermis
antes del experimento de cultivo (véase la realización preferida 2
anterior). Opcionalmente, esta etapa puede combinarse con disolución
de la piel parcialmente disuelta en dodecil sulfato sódico caliente
combinado con un agente reductor tal como ditiotreitol o
2-mercaptoetanol. Al final de este procedimiento, el
eje capilar permanece intacto y puede medirse para su longitud y
diámetro usando un microscopio y herramientas de software de
análisis de imágenes convencionales. Este procedimiento es muy
adecuado para la automatización por sistemas robóticas
convencionales ya que todas las fases de digestión pueden
realizarse en placas de múltiples pocillos y los extractos solubles
pueden retirarse por herramientas de pipeteo convencionales. El
cabello residual puede examinarse de forma microscópica in
situ en la placa de múltiples pocillos usando una fase
automatizada para mover el microscopio de un pocillo a otro. El
efecto del activo potencial de crecimiento del cabello se determina
por comparación de la longitud final del cabello en el ensayo de
prueba en comparación con un ensayo de control que carece del
activo.
2) Se sabe que colorantes fluorescentes tales
como rodamina se han usado como marcadores en un cebo, para
determinar cuando los animales silvestre comen el cebo. El
colorante, una vez ingerido, se incorpora en el cabello en
crecimiento de modo que la posición del colorante fluorescente a lo
largo del eje del cabello indica el tiempo desde que el animal
comió el cebo (Spurr, E.B (2002). Rhodamina B as a systemic hair
marker for assessment of bait acceptance by stoats (Mustela
erminae), New Zealand J. Zoology, 29, 187). Este fenómeno es aplica
al problema de medición del crecimiento del cabello in vitro
añadiendo un colorante fluorescente que se incorpora fuertemente
durante la formación del cabello en crecimiento al medo de cultivo
mientras los cabellos están creciendo. Los colorantes adecuados
incluyen, aunque sin limitación, Rodamina B (mencionada), rodamina
6G y rodamina 110. El colorante puede añadirse de forma continua al
cultivo de modo que esté marcada la longitud completa del cabello
producido en cultivo, o puede añadirse el colorante en pulsos de
modo que el cabello muestre bandas de fluorescencia, cuya
separación indica que cuánto crecimiento de cabello ha sucedido
entre las exposiciones al colorante. En cualquier caso, es necesario
aislar el cabello de la piel en la que está incrustado para
visualizar las zonas fluorescentes en el cabello usando microscopía
fluorescente. Esta separación puede realizarse usando cualquiera de
los procedimientos expuestos en 1) anteriormente. En ciertos casos,
puede suceder una débil unión del colorante fluorescente al eje del
cabello existente pero este colorante unido débilmente puede
eliminarse fácilmente lavando el cabello con una solución de
tensioactivo suave
3) El crecimiento de cabellos puede marcarse con
aminoácidos radiactivos y aislarse al final del periodo de cultivo
por los procedimientos expuestos en 1) anteriormente. Este último
procedimiento obvia la interferencia por incorporación de
radioisótopos en tejido diferente de la fibra capilar.
Como se ha indicado anteriormente, el ensayo del
folículo capilar aislado descrito por Phillpot (documento
GB 2 242 978A) es un excelente modelo para medir el efecto de activos potenciales sobre el crecimiento del cabello, pero es de utilidad limitada para la aplicación descrita en este documento, y no se puede aumentar en escala para formatos de alto rendimiento. Hay tres razones para esto. En primer lugar, como se ha descrito, el aislamiento de folículos capilares individuales es lento y laborioso haciendo que sea problemático el aislamiento de suficientes folículos para un ensayo de alto rendimiento. En segundo lugar, la medición del crecimiento del cabello en dichos cultivos también es problemático. La medición directa del alargamiento del cabello por examen microscópico es un excelente procedimiento pero es demasiado lento y muy laborioso para su uso rutinario en un formato de alto rendimiento que implica que hacer múltiples mediciones repetidas de la longitud de cada folículo capilar individual. La incorporación de timidina radiactiva es conveniente pero no es capaz de distinguir el crecimiento organizado del desorganizado del cabello y por tanto es poco fiable. Se aplica el mismo asunto a la incorporación de otros radioisótopos tales como aminoácidos. En tercer lugar, los procedimientos publicados se restringen a fuentes de folículos capilares que están restringidos de forma intrínseca, o vibrisas de roedores (que están restringidas en cantidad) o piel humana (que está restringida en disponibilidad y es muy variable). Ninguno de los procedimientos publicados es adecuado para el aislamiento de folículos en grandes cantidades a partir de fuentes de piel fácilmente disponibles tales como piel dorso-lateral de roedores o piel de cerdo.
GB 2 242 978A) es un excelente modelo para medir el efecto de activos potenciales sobre el crecimiento del cabello, pero es de utilidad limitada para la aplicación descrita en este documento, y no se puede aumentar en escala para formatos de alto rendimiento. Hay tres razones para esto. En primer lugar, como se ha descrito, el aislamiento de folículos capilares individuales es lento y laborioso haciendo que sea problemático el aislamiento de suficientes folículos para un ensayo de alto rendimiento. En segundo lugar, la medición del crecimiento del cabello en dichos cultivos también es problemático. La medición directa del alargamiento del cabello por examen microscópico es un excelente procedimiento pero es demasiado lento y muy laborioso para su uso rutinario en un formato de alto rendimiento que implica que hacer múltiples mediciones repetidas de la longitud de cada folículo capilar individual. La incorporación de timidina radiactiva es conveniente pero no es capaz de distinguir el crecimiento organizado del desorganizado del cabello y por tanto es poco fiable. Se aplica el mismo asunto a la incorporación de otros radioisótopos tales como aminoácidos. En tercer lugar, los procedimientos publicados se restringen a fuentes de folículos capilares que están restringidos de forma intrínseca, o vibrisas de roedores (que están restringidas en cantidad) o piel humana (que está restringida en disponibilidad y es muy variable). Ninguno de los procedimientos publicados es adecuado para el aislamiento de folículos en grandes cantidades a partir de fuentes de piel fácilmente disponibles tales como piel dorso-lateral de roedores o piel de cerdo.
Los folículos capilares pueden aislarse en gran
cantidad a partir de piel normal, incluyendo piel
dorso-lateral de roedores y piel de cerdo, por el
siguiente nuevo procedimiento descrito en este documento como una
alternativa a la disección individual. En piel en la que el bulbo
capilar no sobresale por debajo de la dermis en la grasa
subcutánea, se retira la grasa subcutánea por raspado u otro
procedimiento apropiado. La piel después de corta horizontalmente
usando un instrumento apropiado tal como queratotomo, a una
profundidad tal que el cabello se corta de forma transversal lo
suficiente por encima del bulbo capilar para dejar bulbo capilar
intacto con al menos aproximadamente 2 mm de eje de cabello unido.
La dermis restante después se trata con una solución de colagenasa
durante un tiempo suficiente para soltar los folículos de su unión a
la dermis residual. Esto puede observarse fácilmente cuando los
folículos pueden soltarse de la dermis residual indagando suavemente
con fórceps.
Cuando los folículos se han soltado, la dermis
se dispersa suavemente usando cualquiera de varios procedimientos
de rotura incluyendo, aunque sin restricción, el uso de un
homogeneizador de cuchilla a baja velocidad, el uso de un
homogeneizador de tupo tubo y émbolo con un gran hueco entre el tubo
y el émbolo, dispersión ultrasónica de baja frecuencia o frotamiento
manual de la dermis contra un tamiz de tamaño apropiado.
Los folículos aislados después se separan de la
dermis residual por tamizado por centrifugación diferencial o en
gradiente de densidad o pueden dejarse mezclados con la dermis
residual.
Los folículos aislados se transfieren a pocillos
de una placa de múltiples pocillos. Una técnica rápida preferida es
suspender los folículos en medio de cultivo con agitación y tomar
alícuotas de las muestras de folículos usando un sistema de pipeteo
automático con boquilla ancha en cada pocillo de modo que cada
pocillo contenga una pluralidad de folículos. Los folículos se
cultivan en condiciones convencionales tales como las descritas por
Philpott (como ejemplos no restrictivos, medio E de Williams a 37
grados C).
Los folículos preparados de este modo están
significativamente más contaminados con otros tejidos cutáneos que
en el caso de micro-disección. Esto hace que la
medición del crecimiento del cabello sea más difícil. El examen
microscópico automatizado está complicado por la presencia de trozos
extraños de incorporación de isótopo tisular que se confunde con la
captación variable de isótopo en tejido extraño. Sin embargo, el uso
de las técnicas descritas anteriormente en "medición del
crecimiento del cabello" y en particular el uso de Rodamina o
colorantes fluorescentes relacionados supera estas dificultades y
hace que el ensayo sea adecuado para aplicaciones de alto
rendimiento.
En un caso, en el Ensayo del Folículo Capilar
Aislado, se retiran folículos individuales de dermis seccionada en
un estado viable a través de la acción de la colagenasa seguido de
dispersión suave, se cultivan en un medio de cultivo adecuado y se
mide su crecimiento capilar por una técnica con capacidad de alto
rendimiento y que no está afectada por la presencia de tejidos
contaminantes en el cultivo.
En el contexto del crecimiento capilar, es
deseable incluir fármacos de prescripción tales como finasterida,
minoxidil, análogos de vitamina D y ácido retinoico, que se sabe que
tienen actividad de crecimiento del cabello, en la biblioteca
original aunque dichos materiales no pueden usarse en el cóctel
final de activos. La presencia de estos potentes agentes en los
ciclos tempranos del procedimiento, provocará que se descubra una
mayor cantidad de sinergias, algunas de las cuales pueden demostrar
ser suficientemente fuertes para permitir la eliminación del fármaco
de prescripción del cóctel final son pérdida completa de
actividad.
Una biblioteca preferida de agentes químicos
candidatos es una seleccionada entre agentes químicos conocidos
dentro de las industrias del cuidador personal y farmacéutica como
seguros para su uso, y que por tanto requieren poca o ninguna
experimentación toxicológica adicional antes de su venta. Pueden
seleccionarse listas de agentes químicos adecuados de la lista
EINECS europea y el Cosmetic Toiletries and Fragrance Association
Dictionary of Cosmetic Ingredients. La biblioteca de compuestos
también puede contener artículos individuales que so realmente
mezclas de múltiples agentes químicos, por ejemplo, mezclas de
isómeros, productos de reacciones químicas que contienen múltiples
agentes químicos o productos naturales complejos tales como
extractos vegetales.
Una biblioteca preferida adicional de
ingredientes candidatos es el subconjunto de la 10ª edición del CTFA
Dictionary of Cosmetic Ingredients identificado por remisión dentro
de la versión en CD ROM del diccionario como que tiene cualquier
forma de actividad biológica.
Una biblioteca preferida adicional de agentes
químicos candidatos incluye aquellos agentes químicos que, a partir
del conocimiento actual incompleto de forma admitida de las vías que
influyen en el crecimiento capilar, puede esperarse que tengan
potencial para la modulación del crecimiento capilar. Estos incluyen
las siguientes clases, a) a f).
a) Retinol o sus ésteres, opcionalmente
combinados con agentes tales como los descritos en el documento WO
02/02074 (estimuladores de retinol).
b) Los complejos de iones cobre con péptidos
cortos como se describe en el documento US 6.017.888 y especialmente
los péptidos modificados de forma hidrófoba o hidrófila mencionados
en este documento
c) Minoxidil, melatonina, cetoconazol, extracto
de fenogreco, ácido fosfatídico y piritiona de zinc
d) productos naturales que proporcionan
actividad anti-hipertensiva incluyendo, aunque sin
limitación:
Hawthorne, corteza de Arjuna, hoja de Olivo,
muérdago europeo, mielenrama, semillas de comino negro, Nigella
sativa, forskolina, serpentaria de la India, ajo, Coenzima Q1.0,
ácido grasos omega 3 y sus ésteres y glicéridos, extracto de
ginseng
e) Productos naturales que contienen
antiandrógenos incluyendo, aunque sin limitación: palma enana,
ortiga mayor (urtica dioica)
f) Agentes químicos capaces de unirse al
receptor de vitamina D incluyendo ácido litocólico
g) agonistas (activadores) de la vía de
señalización de Hedgehog como se describe en la patente de Estados
Unidos 6.639.051.
Los productos de crecimiento capilar puede estar
en muchas formas - las lociones tópicas para el cuero cabelludo son
las más habituales pero para sistemas activos suficientemente
potentes sería ventajoso su incorporación en champús o
acondicionadores. Para activos a suministrar adecuadamente al cuero
cabelludo a partir de composiciones de aclarado, es preferible que
sean muy hidrófobos, de forma ideal con un coeficiente de reparto en
octanol agua mayor de 100 (es decir, un clog P>2), y más
preferiblemente mayor de 1000 (clog P>3). Por consiguiente, un
criterio de selección tanto para la biblioteca original de
compuestos como para los compuestos que progresan a través de los
múltiples ciclos del procedimiento, puede ser el coeficiente de
reparto. Este criterio de selección puede formalizarse como un
coeficiente de reparto en octanol/agua elevado (por ejemplo,
>1000) cuando los activos tienen que formularse en un producto
de aclarado y puede aplicarse no solamente a los procedimientos
descritos dentro de esta solicitud, sino también a sistemas activos
sinérgicos descubiertos a través de otros procedimientos, por
ejemplo, los descritos en el documento WO 02/02074.
Se dan ejemplos específicos del procedimiento
general de este ejemplo en la siguiente tabla
La regeneración de la piel envejecida es un
proceso complejo que implica interacciones recíprocas entre la
dermis y la epidermis. La regeneración satisfactoria implica cambios
en los compartimentos tanto dérmico como epidérmico. Por tanto,
para un sistema modelo que tenga la mejor posibilidad de predecir el
beneficio clínico, el modelo debe contener tanto epidermis como
dermis y deben ser posibles mediciones de los efectos de activos
sobre ambos compartimentos.
Hasta la fecha, no se ha publicado ningún
procedimiento de alto rendimiento que cumpla estos criterios. Se
han desarrollado cultivos organotípicos en los que se cultivan
juntos fibroblastos y queratinocitos sobre un soporte adecuado y se
han aumentado a escala hasta una escala industrial. El elevado
precio de dichos cultivos es, sin embargo, prohibitivo para
aplicaciones de alto rendimiento y, en cualquier caso, la relevancia
de los cambios en la matriz dérmica muy artificial es
cuestionable.
El cultivo orgánico de piel es una técnica bien
establecida y los cultivos pueden mantenerse durante muchos días.
Dichos cultivos son por tanto el sistema de elección para ensayar el
efecto de las actividades antienvejecimiento. Sin embargo, no hay
informes de de ningún aumento en escala satisfactorio de dichos
cultivos orgánicos a los varios miles de semanas necesarios para
aplicaciones de alto rendimiento. Los obstáculos son dos. Primero
está la dificultada de preparar realmente grandes cantidades de
dichos cultivos. Típicamente los trozos de piel se colocan
manualmente sobre soportes especiales en placas de cultivo tisular
relativamente grandes, una técnica que es difícil de aumentar en
escala. En segundo lugar existe la dificultada de medir los cambios
en la piel cultivada. El procedimiento ideal para hacerlo es la
histología, pero con procedimientos convencionales de histología
sería imposible de aumentar a escala hasta una escala de alto
rendimiento.
Se han ideado dos nuevos procedimientos para
superar estos problemas y permitir el uso de cultivos orgánicos
analizados por histología a alto rendimiento. Estos ensayos se
describen a continuación.
i. Se corta la piel con un queratotomo o
dermatomo de modo que la piel consta de epidermis completa y una
cantidad suficiente de dermis de soporte. Se corta esta piel
queratotomada en pequeños trozos usando un aparato adecuado y se
transfieren trozos individuales a placas de 96 pocillos,
preferiblemente usando un dispositivo de sección para coger y
transferir varios trozos de piel simultáneamente. Un dispositivo
preferido para esta fase es una serie de hojas de afeitado o discos
conformados similar al descrito para el ensayo de Cultivo Orgánico
de Piel Completa a Baja Temperatura donde las hojas o discos están
espaciados a 3 mm. Cuando la piel se corta dos veces en ángulos
rectos con este dispositivo, se producen 3 mm cuadrados de piel en
una serie de modo que cada 3^{er} cuadrado está en registro con
la posición de los pocillos en las placas de 96 pocillos, que están
espaciados con centros de 9 mm. Después se facilita la rápida
transferencia de muchos trozos directamente en placas de 96 pocillos
con la ayuda de un dispositivo de succión.
ii. Se cultivan los trozos de piel con un medio
adecuado, preferiblemente libre de suero. En una realización
preferida, la superficie del estrato córneo de la piel queratotomada
se hace adherirse a una capa de material que es más ligero que el
agua, por ejemplo, cera, espuma plástica, etc. - antes de cortarla
en trozos. Los trozos individuales entonces flotan sobre el medio de
cultivo en virtud de esta capa ligera de material.
iii. Al final del periodo de cultivo, se retiran
los trozos de piel de los pocillos de la placa de cultivo,
preferiblemente usando un dispositivo de succión para coger varios
trozos de piel de una vez y transferirlos a un molde adecuado en el
que pueden apilarse en 12 columnas de 8 trozos u 8 columnas de 12
trozos.
iv. Se procesan los 96 trozos, mientras aún
están montados en el molde, convencionalmente para la histología de
modo que los 96 trozos finalmente se monten en un único bloque
(parafina u otro material de montaje)
v. Las secciones de microtomo se eliminan del
bloque resultante de modo que cada sección microtomada contiene
secciones transversales de los 96 trozos de piel
vi. Se procesan las secciones para la
histología, histoquímica o inmunohistoquímica para detectar
marcadores relevantes de regeneración cutánea, por ejemplo, grosor
epidérmico aumentado, restauración de la arquitectura de membrana
basal normal, deposición de nuevo colágeno, etc.
vii. Se examinan los portaobjetos resultantes
usando un microscopio automatizado con una fase motorizada y
software de análisis de imágenes apropiado.
En un caso el Ensayo de Cultivo Orgánico de
Histología de Alto Rendimiento conlleva un cultivo viable de trozos
en miniatura de epidermis con al menos una parte de dermis asociada
en un ensamblaje de múltiples pocillos, seguido de la impregnación
de grandes cantidades de trozos de piel cultivada en un único bloque
y el seccionamiento histológico del ensamblaje completo y la
histología, histoquímica o inmunohistoquímica automatizada de
secciones histológicas realizadas en un modo de alto
rendimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
i. Se usa un queratotomo o dermatomo para cortar
láminas de piel que contienen la epidermis completa y suficiente
dermis de soporte
ii. Usando un tamiz de seda u otro procedimiento
apropiado, se aplica una silicona u otro compuesto apropiado a la
superficie de la piel para segmentar la superficie en áreas
diferentes de piel preparada por barreras de silicona coincidiendo
el patrón resultante con el de los pocillos en una placa de cultivo
tisular de 96 o 384 pocillos convencional.
iii. Se monta la piel resultante en un
ensamblaje de modo que pueda flotar intacta sobre el medio de
cultivo tisular
iv. Se aplican los compuestos de ensayo,
disueltos en un vehículo adecuado tal como una mezcla de
etanol/poliol, a la superficie de la piel usando un sistema de
pipeteo automatizado. Esta etapa puede repetirse durante el
transcurso del cultivo.
v. Después de completarse el periodo de cultivo,
la piel se corta en tiras que contienen 8 o 12 sitos de tratamiento
y se apilan las tiras unas encima de otras. Se procesa este
ensamblaje para la histología como una única muestra grande y se
analiza histológicamente como en el Ensayo de Cultivo Orgánico de
Histología de Alto Rendimiento.
Este segundo procedimiento tiene la ventaja
considerable de que incorpora el suministro transdérmico de los
materiales activos en el ensayo y por lo tanto será más probable
predecir las formulaciones clínicamente eficaces.
Por tanto, el Ensayo de Cultivo Orgánico de
Histología de Alto Rendimiento de Aplicación Tópica es un cultivo
de una lámina de epidermis viable y dermis asociada, repartida en un
patrón de regiones aisladas a las que pueden aplicarse de forma
tópica que diferentes soluciones de ensayo, por la aplicación de una
película de barrera superficial, seguido de la impregnación de
grandes cantidades de trozos de piel cultivada en un único bloque y
el seccionamiento histológico del ensamblaje completo y la
histología, histoquímica o inmunohistoquímica automatizada de
secciones histológicas realizada de un modo de alto rendimiento.
Una biblioteca preferida para este ejemplo es el
subconjunto de la 10ª Edición del CTFA Dictionary of Cosmetic
Ingredients identificado por remisión dentro de la versión en CD ROM
del diccionario como que tiene cualquier forma de actividad
biológica.
El acné es una afección compleja y
multifactorial. Dos de los factores más críticos sin embargo, se
cree que son el crecimiento de P. Acnes y el bloqueo del
conducto folicular por hipercornificación del estrato córneo
folicular bajo la influencia de la interleuquina 1 alfa (IL1)
(véase, Assessment of etiologic agents in acne pathogenesis.
Burkhart CN, Gottwald L. Skinmed. Jul-Ago de 2003;
2(4):222-8 y Modeling the infundibulum in
acne. Guy R, Kealey T. Dermatology. 1998; 196 (1)). Sin embargo,
ninguno de estos factores se modela fácilmente en un modo de alto
rendimiento.
En el caso de P. Acnes, aunque la
medición de la inhibición del crecimiento por procedimientos
bacteriológicos convencionales es directa, dichos procedimiento son
indicadores muy malos de beneficio clínico. Se combinan dos factores
para hacer esto así - el hecho de que P. Acnes in vivo
crece en un entorno lleno de sebo únicos y que la bacteria está
físicamente localizada de forma profunda en un conducto estrecho
lleno de sebo en la piel, haciendo nada fácil que el activo
antibacteriano tenga acceso a la bacteria.
Un nuevo ensayo que supera estos dos problemas
es inocular P. Acnes (u otros organismos) en sebo sintético
y bombear el sebo inoculado en un tubo de plástico estrecho de
diámetro similar al conducto folicular. El tubo lleno después se
corta en longitudes de 2-8mm que se colocan en
pocillos de una placa de múltiples pocillos (96 ó 384). Los
segmentos del tubo se exponen a activos incorporados en
formulaciones que pueden imitar lo que se usarán clínicamente, por
ejemplo, formulaciones de aclarado con tensioactivos tales como
champúes. Después del de periodo de exposición deseado, los
segmentos del tubo se aclaran y se incuban para permitir el
crecimiento de las bacterias supervivientes. Las bacterias se
extraen del tubo usando un disolvente que disuelve el sebo
sintético. Después se estima la cantidad de bacterias usando un
procedimiento convencional tal como fluorescencia de ADN.
En una realización preferida de este ensayo, se
siembra P. Acnes adquirido de la National Type Culture
Collection en un sebo sintético del 50% de triglicéridos, el 20% de
escualeno, el 10% de colesterol, el 10% de ácido graso libre, el 5%
de agua y el 5% de caseína hidrolizada a una densidad de 100.000 por
ml. La suspensión resultante se bombea en tubos de HPLC de plástico
convencionales. Se cortan secciones de 3 mm de los tubos usando una
hoja de cuchilla rotatoria unida a un carrete controlado que
contiene los tubos y las secciones de los tubos metidos en placas
de 96 pocillos. Se introducen alícuotas de los agentes de ensayo,
disueltas en una solución al 10% de un producto de limpieza facial
a los pocillos durante un periodo de 1 minuto para estimular las
condiciones de lavado normales y después se retira. Los pocillos se
aclaran en agua estéril y después se añade solución salina para
mantener la hidratación del sebo en los segmentos del tubo. Las
placas se incuban a 37 grados durante 24 horas y se retira la
solución salina y se remplaza con hexano al 66%, etanol al 33%. Las
placas se agitan en un agitador rotatorio durante 2 horas, tiempo en
el cual el sebo se ha disuelto y las bacterias están presentes en
suspensión en el disolvente. Se toma una alícuota de la suspensión
resultante y se diluye en triton X100 al 1%. Se añade colorante
Picogreen como se describe en "Characterization of PicoGreen
reagent and development of a fluorescence-based
solution assay for double-stranded DNA
quantitation". Singer VL, Jones LJ, Yue ST, Haugland RP. Anal
Biochem. Jul de 1997 1, 249(2).228-38 y se
determina el contenido de ADN por medición de la fluorescencia.
Por tanto, el ensayo de P. Acnes de
Folículo Estimulado es un cultivo de P. Acnes dispersado en
un análogo sintético de sebo humano y mantenido dentro de trozos de
tubos de dimensiones similares al conducto sebáceo, que se expone a
agentes antibacterianos en condiciones realistas y donde se mide el
crecimiento de P. Acnes superviviente por un procedimiento de
alto rendimiento tal como fluorescencia de ADN.
En el caso de hipercornificación inducida por
IL, pueden usarse ensayos muy similares a los dos descritos en el
ejemplo "tratamiento de envejecimiento de la edad", con la
diferencia clave de que se añade al medio de cultivo una cantidad
suficiente (justa) de IL1 para inducir la hipercornificación al
medio de cultivo. El grado de hipercornificación se determina por
histología de alto rendimiento y microscopía automatizada
exactamente como para el antienvejecimiento excepto en que se usa un
marcador de cronificación tal como un cambio en las propiedades de
unión del colorante del estrato córneo. Como ejemplos no limitantes,
la tinción con eosina muestra estrato córneo hipercornificado como
un rojo más intenso que el estrato córneo normal. Como alternativa,
se puede medir la pérdida de la capa granular, detectada por
inmunotinción con un anticuerpo contra profilagrina (Scott IR,
Harding CR: Filaggrin breakdown to water
binding-compounds during development of the rat
stratum-corneum is controlled by the water activity
of the environment. Dev Biol 115: (1) 84-92 May de
1986)
En cualquier caso, el punto final medido es
entonces la reducción por un activo aplicado del grado de
hipercornificación inducida por IL 1.
Por tanto, el Ensayo de Inhibición de la
Hipercornificación Inducida por IL1 conlleva (i) un cultivo viable
de trozos en miniatura de epidermis con al menos una parte de dermis
asociada en un ensamblaje de múltiples pocillos, o (ii) un cultivo
de una lámina de epidermis viable y dermis asociada, repartida en un
patrón de regiones aisladas a las que pueden aplicarse de forma
tópica diferentes soluciones de ensayo, por la aplicación de una
película de barrera superficial; en cualquier caso usando un medio
de cultivo que contiene un nivel de IL1 suficiente para causar la
hipercornificación; seguido de la impregnación de grandes cantidades
de trozos de piel cultivados en un único bloque y el seccionamiento
histológico del ensamblaje completo y la histología, histoquímica o
inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizada
de un modo de alto rendimiento.
Una biblioteca preferida para este ejemplo es el
subconjunto de la 10ª Edición del CTFA Dictionary of Cosmetic
Ingredients identificado por remisión dentro de la versión de CD ROM
del diccionario como que tiene cualquier forma de actividad
biológica.
Aunque la placa dental es esencialmente de
origen microbiano, los ensayos microbiológicos convencionales no
logran predecir de forma precisa el efecto de un producto oral en la
inhibición del crecimiento de la placa. Esto se debe al menos en
parte al hecho de que en la placa dental los microbios crecen en
forma de una biopelícula en una matriz compleja que reduce tanto el
acceso de los agentes antimicrobianos a los microbios como los
cambios en el comportamiento de bioquímico de los microbios de modo
que respondan de forma bastante diferente al agente antimicrobiano
que si crecieran de forma planctónicamente, es decir, libres en
suspensión. Se han hecho esfuerzos por crear modelos precisos de
placa dental y el más exitosos ha sido películas de placa cultivadas
en condiciones quimiostáticas con flujo continuo de medo sobre la
placa (véase, Chemostat flow cell system: an in vitro model
for the evaluation of antiplaque agents. J Dent Res. Nov de 1994;
73(11):1748-55) Herles S, Olsen S, Afflitto
J, Gaffar A. Dichos modelos han demostrado ser indicadores
superiores de beneficio dental pero han sido demasiado incómodos de
aumentar en escala para alto rendimiento.
Un nuevo modo para conseguir alto rendimiento en
dichos ensayos es remplazar el uso de un quimiostato por la
eliminación y remplazo regular de una fracción del medio en una
placa de 96 o 384 pocillos usando un pipeteador automatizado. El
flujo del medio sobre la placa en crecimiento puede simulares por
agitación rotatoria suave o ladeado de la placa de múltiples
pocillos. El medio puede ser medio estéril fresco o puede ser el
resultado de un quimiostato convencional más grande, almacenado a
baja temperatura hasta que se necesita, que puede contener
microorganismos del plancton. La biopelícula de placa puede dejarse
crecer sobre la superficie de la placa de plástico o sobre un
inserto de a hidroxiapatita o capa de hidroxiapatita recubierta
sobre la superficie de plástico.
Una modificación adicional de este procedimiento
permite la fácil simulación de las condiciones normales de
crecimiento de la placa en la boca, es decir, que están disponibles
nutrientes a altas concentraciones pero solamente durante cortos
tiempos, es decir, en y después de las comidas. El uso del
pipeteador robótico ideado anteriormente hace fácil "impulsar"
el crecimiento de la placa con nutrientes a cualquier frecuencia que
se desee. Dichos pipeteadores robóticos están disponibles a partir
de una diversidad de fabricantes. Un ejemplo particularmente
adecuado es el Genesis RSP disponible en Tecan US, P.O. Box 13953,
Research Triangle Park, NC 27709, USA, que puede usarse en
combinación con el sistema TRAC que permite la transferencia
automática de placas desde el pipeteador hasta y desde una
incubadora.
Un modo preferido de usar estas biopelículas de
placa cultivadas en un ensayo para la prevención del crecimiento de
la placa dental es permitir que la biopelícula se desarrolle
completamente como se ha descrito anteriormente y después
eliminarla parcialmente con abrasión mecánica en presencia de un
dentífrico diluido u otro producto de cuidado oral que contenga
el(los) activo(s) de interés. Esto puede simular las
condiciones reales de uso. La eliminación parcial puede
conseguirse, por ejemplo, raspando un área definida libre de placa
usando una herramienta de raspado. Como alternativa, se fabrica un
surco en cuya superficie crece la biopelícula, después la
superficie puede apoyarse exhaustivamente usando un cepillo
rotatorio mecánico, dejando solamente la placa en el surco
protegido. En cualquier caso, después del aclarado del producto de
ensayo, la biopelícula se expone de nuevo a medio de crecimiento
(opcionalmente con los mismos cambios regulares de medio que cuando
estaba creciendo) y el tiempo que tarda la biopelícula de placa en
crecer desde el surco protegido o de llenar el área de la que se
retiró la placa, es la medida de la eficacia del agente ensayado.
Esto se mide fácilmente tiñendo la biopelícula con a un colorante -
tal como el usado en productos orales de descripción y explorando
la placa con un microscopio automático o, más simplemente, usando un
explorador de lecho plano convencional. El colorante habitual es
D&C Rojo 28 y puede adquirirse fácilmente para su uso en
productos tales como Plaque-Finder^{TM} de
Professional Dental Technologies, Inc. P.O. Box 3749, Batesville AR
72501.
El análisis de imágenes automatizado de la
imagen resultante para detectar el área con colorante y la
intensidad proporciona una medida cuantitativa de recrecimiento de
la placa.
Si se desean medidas repetidas del progreso del
recrecimiento de la biopelícula de placa, puede evitarse el uso del
colorante visualizando la placa por un procedimiento de contraste
óptico tal como microscopía de contraste de fases.
Por tanto, el Ensayo de Recrecimiento de
Biopelícula de Placa implica el crecimiento de una biopelícula de
placa en placas de múltiples pocillos preferiblemente en condiciones
de reposición de medio que simula aproximadamente las condiciones
de quimiostato, seguido de la eliminación parcial de la biopelícula
usando abrasión mecánica en presencia de los agentes de ensayo y la
detección de la velocidad de recrecimiento de la biopelícula,
opcionalmente usando una agente de descripción, mediante detección y
análisis automatizado de imágenes.
Una biblioteca adecuada de ingredientes para su
uso en este ejemplo comprende agentes con efecto antibacteriano
conocido seleccionados del CTFA Dictionary of Cosmetic Ingredients,
polímeros capaces de unirse a hidroxiapatita tales como Gantrez,
tensioactivos que pueden alterar la función de la membrana,
inhibidores del metabolismo energético tal como fluoruro sódico,
inhibidores de la síntesis de hidratos de carbono y productos
naturales que se cree que son agentes antiplaca eficaces tales como
extracto de raíz del neem.
Se descubren fácilmente combinaciones sinérgicas
de activos eficaces para eliminar o prevenir el crecimiento de
microorganismos usando la estrategia descrita en esta solicitud.
Pueden usarse ensayos microbiológicos de alto rendimiento
convencionales con poca modificación. En un ejemplo preferido, se
usa una biblioteca que consta de todos los conservantes y biocidas
enumerados en EINECS o CTFA Dictionary of Cosmetic Ingredients,
junto con extractos vegetales de los que se ha informado que tienen
actividad microbiana y tensioactivos. Los activos o combinaciones
se disuelven en una formulación diluida diseñada para imitar el
producto final mientras está en uso. Se añaden microorganismos
relevantes a la mezcla de activos en la formulación diluida y se
incuban durante un tiempo similar durante el cual estarían expuestos
los organismos durante el uso típico del producto. Al final del
periodo de tiempo, se diluyen pequeñas alícuotas de la mezcla en el
menos 20 veces en medio de cultivo microbiano y la mezcla
resultante se incuba para permitir que crezcan los microorganismos
supervivientes. También puede emplearse un inactivador que contiene,
por ejemplo, un disolvente hidrófobo o emulsionante. La turbidez de
la mezcla se mide a intervalos y el retardo en alcanzar una turbidez
dada, se compara con un experimento de control en el que no se
usaron activos antimicrobianos; es una medida de la inhibición del
crecimiento microbiano conseguido. Este ensayo completo se realiza
convenientemente en placas de 384 pocillos con sistemas
automatizados de pipeteo de 96 o 384 canales.
El olor corporal y axilar está causado por la
acción de microorganismos sobre secreciones corporales,
particularmente secreciones de glándulas apocrinas. Pueden usarse
ensayos microbiológicos convencionales para descubrir combinaciones
sinérgicas de activos que eliminan o inhiben el crecimiento de los
microorganismos relevantes.
Pueden identificarse mezclas sinérgicas de
ingredientes capaces de reducir la sebogénesis por las glándulas
sebáceas de, por ejemplo, la cara y reduciendo de este modo el rigor
de oleaginosidad facial usando el procedimiento de esta patente, una
biblioteca de ingredientes biológicamente activos del CTFA
Dictionary of Cosmetic Ingredients y un ensayo de alto rendimiento
basado en el descrito por Harirchian y col. en el documento US
20040018948 en el que se exponen cultivos secundarios de sebocitos
humanos al agentes p mezcla de interés en presencia de acetato
radiomarcado y se mide la incorporación de acetato radiomarcado en
triglicéridos durante la diferenciación de los sebocitos.
Los nuevos procedimientos, sistemas de ensayo y
estrategia experimental descritos en este documento facilitan
enormemente el descubrimiento de agentes y mezclas sinérgicas que
son biológicamente activas en una diversidad de efectos finales. Por
consiguientes, la invención es muy relevante para la industria
farmacéutica en general para el descubrimiento de fármacos pero es
particularmente relevante para las industrias de cosméticos, cuidado
personal y suplementos nutricional donde la explotación de mezclas
sinérgicas es de gran relevancia.
Claims (26)
1. Un procedimiento in vitro para
identificar combinaciones muy sinérgicas de agentes biológicamente
activos, que comprende:
i. seleccionar una biblioteca de activos
potenciales en los que se busca sinergia;
ii. identificar un subconjunto de compuestos
S(1) que presenten actividad significativa ensayando cada
componente de la biblioteca para su actividad en un Ensayo de Alto
Rendimiento de Múltiples Vías, siendo dicho ensayo un ensayo de
alto rendimiento que incorpora lo suficiente de un sistema biológico
completo de modo que las múltiples vías para las que se busca la
sinergia sean activas e interaccionen en el ensayo, y teniendo un
rango útil conocido de detectabilidad;
iii. identificar un subconjunto de mezclas
binarias denominado S(2) que presenten sinergia, por ensayo
en el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una
parte de S(1) en mezclas binarias con sustancialmente cada
componente de la biblioteca, incluyendo componentes que mostraban
actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii), donde la
concentración del componente S(1) en la mezcla binaria se
ajusta usando un Protocolo de Escala de Componente Único en el que
uno o más componentes S(1) identificados en la etapa (ii) se
diluyen repetidamente y se vuelven a ensayar en el Ensayo de Alto
Rendimiento de Múltiples Vías y se determina una concentración en
la que la actividad en dicho ensayo es \lambda C_{Máx,1}, donde
\lambda es un factor de escala en el intervalo de aproximadamente
0,01 a 0,5, y C_{Máx,1} es la actividad máxima realmente
detectable en el extremo superior del rango útil del Ensayo de Alto
Rendimiento de Múltiples Vías;
iv. identificar un subconjunto de mezclas
sinérgicas ternarias, S(3), por ensayo en el Ensayo de Alto
Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas
sinérgicas binarias S(2) en combinación con sustancialmente
cada componente de la biblioteca, incluyendo componentes que
mostraban actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii),
donde las concentraciones de los componentes S(2) usadas en
la mezcla ternaria se ajustan usando un Protocolo de Escala de
Múltiples Componentes de modo que se vuelva a graduar S(2) a
un valor \lambda C_{Máx,1,} donde \lambda y C_{Máx,1} son
como se han definido en (iii) anteriormente y por lo cual se elimina
cualquier componente de la mezcla S(3) que esté contribuyendo
solamente de forma marginal a la eficacia de la mezcla S(3)
de esa mezcla; y
v. opcionalmente realizar una o más etapas
adicionales para identificar un subconjunto de combinaciones
sinérgicas de N componentes, denominado S(N), donde N es un
número entero mayor de 3, por ensayo en el Ensayo de Alto
Rendimiento de Múltiples Vías de todo o una parte de las mezclas
sinérgicas que contienen (N-1) componentes,
denominadas S(N-1) e identificadas de una
manera análoga a la etapa iv), en combinación con sustancialmente
cada componente de la biblioteca, incluyendo los componentes que
mostraron actividad marginal o ninguna actividad en la etapa ii),
donde las concentraciones de los componentes
S(N-1) usadas en las mezcla de N componentes
se ajustan usando el Protocolo de Escala de Múltiples Componentes de
modo que se vuelva a graduar la mezcla S(N-1)
a un valor \lambda C_{Máx,1}, donde \lambda y C_{Máx,1} son
como se han definido en (iii) anteriormente, y por lo cual se
elimina cualquier componente de la mezcla
S(N-1) que esté contribuyendo solamente de
forma marginal a la eficacia de la mezcla
S(N-1) de esa mezcla.
S(N-1) de esa mezcla.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que los subconjuntos de S(1) a
S(N-1) ensayados en combinaciones con
miembros de la biblioteca contienen solamente uno o una pequeña
cantidad de los componentes.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en le que la biblioteca de activos potenciales
comprende activos seleccionados de la lista EINECS europea.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la biblioteca de activos potenciales
comprende activos seleccionados del Cosmetics, Toiletries and
Fragrance Association Dictionary of Compounds.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en
el que la biblioteca de activos potenciales es un subconjunto del
Cosmetics, Toiletries and Fragrance Association Dictionary of
Compounds seleccionado en base a los presentados en ese volumen
como que tienen actividad biológica.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la biblioteca de activos potenciales
comprende activos seleccionados de al menos de las clases
seleccionadas entre el grupo constituido por retinol y sus ésteres,
estimuladores de retinol, péptidos cortos con o sin modificación
hidrófoba o formación de complejos con cobre, minoxidil, productos
naturales que proporcionan actividad hipertensiva, productos
naturales que contienen antiandrógenos, y agentes químicos capaces
de unirse al receptor de vitamina D.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de crecimiento del
cabello.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías es el Ensayo del Folículo Capilar Aislado,
comprendiendo dicho ensayo una multiplicidad de cultivos de
folículos capilares individuales contenidos en un medio de cultivo
adecuado en el que dichos folículos se retiran de la dermis
seccionada en un estado viable a través de la acción de la
colagenasa, y en el que el crecimiento capilar se mide por una
técnica de medición de alto rendimiento que no está afectada por la
presencia de tejidos contaminantes en el cultivo.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la técnica de medición del crecimiento
capilar de alto rendimiento comprende la visualización de un agente
fluorescente incorporado en el cabello en crecimiento.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías es el Ensayo de Cultivo Orgánico de Piel Completa a
Baja Temperatura, comprendiendo dicho ensayo una multiplicidad de
cultivos miniaturizados de piel mantenida en un medio de cultivo
libre de suero a una temperatura por debajo de aproximadamente
30ºC, en el que dicha piel contiene folículos capilares viable
intactos por debajo de la glándula sebácea, y en el que el
crecimiento capilar se mide por una técnica de medición de alto
rendimiento.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, en el que la técnica de medición del crecimiento
capilar de alto rendimiento comprende la visualización de un agente
fluorescente incorporado en el cabello en crecimiento.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto biológico de
anti-envejecimiento de la piel.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías es el Ensayo de Cultivo Orgánico de Histología de
Alto Rendimiento, comprendiendo dicho ensayo las etapas de tratar
simultáneamente con agentes de ensayo cultivos viables de trozos de
epidermis que tienen al menos una parte de su dermis asociada
intacta, estando contenidos dichos trozos de epidermis en u
ensamblaje de múltiples pocillos, en el que dicho tratamiento está
seguido de la impregnación de grandes cantidades de trozos de piel
cultivados en un único bloque y el seccionamiento histológico del
ensamblaje completo y la histología, histoquímica o
inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizadas
en un modo de alto rendimiento.
14. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías es el Ensayo de Cultivo Orgánico de Histología de
Alto Rendimiento de Aplicación Tópica, comprendiendo dicho ensayo un
cultivo de una lámina de epidermis viable y dermis asociada,
repartido por la aplicación de una película de barrera superficial
en un patrón de regiones aisladas a las que pueden aplicarse de
forma tópica diferentes muestras de ensayo, seguido, después de
dicho tratamiento, por la impregnación de grandes cantidades de
trozos de piel cultivados en un único bloque y el seccionamiento
histológico del ensamblaje completo y la histología, histoquímica o
inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizadas
en un modo de alto rendimiento.
15. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías es predictivo de la resolución o prevención del
acné.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo
de P. Acnes de Folículo Estimulado, comprendiendo dicho
ensayo un cultivo de P. Acnes dispersado en un análogo
sintético de sebo humano y mantenido en un ensamblaje que comprende
trozos de tubos de dimensiones similares al conducto sebáceo,
estando dicho ensamblaje expuesto a agentes antibacterianos en
condiciones reales y en el que el crecimiento de P. Acnes
superviviente se mide por una técnica de medición de alto
rendimiento.
17. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que el Ensayo de Alto Rendimiento de Múltiples Vías es el Ensayo
de Inhibición de la Hipercornificación Inducida por IL1,
comprendiendo dicho ensayo un cultivo viable de trozos en miniatura
de epidermis con al menos una parte de dermis asociada en un
ensamblaje de múltiples pocillos, o un cultivo de una lámina de
epidermis viable y dermis asociada, repartido por la aplicación de
una película de barrera superficial en un patrón de regiones
aisladas a las que pueden aplicarse de forma tópica diferentes
muestras de ensayo, en cualquier caso usando un medio de cultivo que
contiene un nivel de IL1 suficiente para causar hipercornificación;
seguido de la impregnación de grandes cantidades de trozos de piel
cultivados en un único bloque y el seccionamiento histológico del
ensamblaje completo y la histología, histoquímica o
inmunohistoquímica automatizada de secciones histológicas realizadas
en un modo de alto rendimiento.
18. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control de la
placa dental.
19. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 18, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías es el Ensayo de Recrecimiento de Biopelícula de
Placa, comprendiendo dicho ensayo el crecimiento de una biopelícula
de placa en placas de múltiples pocillos en condiciones de
reabastecimiento de medio que simula aproximadamente las
condiciones de quimiostato, seguido de la eliminación parcial de la
biopelícula usando abrasión mecánica en presencia de los agentes de
ensayo y la detección de la velocidad de recrecimiento de la
biopelícula, opcionalmente usando un agente de descripción, mediante
una detección de imágenes automatizada.
20. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de inhibición o
control del crecimiento microbiano.
21. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control de la
pigmentación cutánea.
22. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control del
sebo.
23. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el Ensayo de Alto Rendimiento de
Múltiples Vías aborda el efecto final biológico de control de
caspa.
24. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que \lambda es menor o igual a 0,2.
25. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que \lambda es menor o igual a 0,1.
26. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que N es un número entero entre 3 y 10.
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