TW201804155A - 用於化妝產品的毒物試驗 - Google Patents

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Abstract

本發明是關於確定化妝產品中是否存在毒物的方法，其包含使硬骨魚胚胎與該化妝產品的樣品或來自該化妝產品的樣品的提取物接觸並確定該樣品或來自該樣品的該提取物對該胚胎是否產生毒性效應。

Description

用於化妝產品的毒物試驗
本發明是關於用於確定化妝產品中是否存在毒物的方法。具體而言，本發明是關於在試驗中使用硬骨魚胚胎以確定化妝產品中毒物的存在的方法。
隨著現代化及全球化的興起，消費產品(諸如化妝品)在到達消費者前，會經歷許多其中具有潛在有毒化學品進入這些產品的製程。美國環境保護署(US Environmental Protection Agency)追蹤或管制100,000種以上化學品(物質登記服務資料簡報(Substance Registry Services Fact Sheet)，可在ofmpub.epa.gov/sor_internet/registry/substreg/educationalresources獲得)，且許多這些化學品的毒性(特別是這些化學品與其他化學品組合時的總生物毒性)尚未被很好地研究。鑒於會進入化妝產品中的潛在有毒化學品及化學品組合的龐大數量，確保化妝產品的安全性對現代測試工業是巨大挑戰。
迄今為止，化妝產品的毒性測試仍很大程度上是依賴於化學特異性測試、尤其化學分析。例如，一回顧文獻與本技藝的整體狀態相關，且其關於測定化妝產品中經許可的成分的萃取及層析技術的技術知識(Analytica Chimica Acta 915,(2016)pp.1-26)。雖然化學特異性測試是 靈敏及精確的，但其無法檢測不意欲特定測試的未知毒物；此使得未預期的毒物未能被檢測到。即使在其中樣品的化學組成詳細已知的情形下，由於缺少關於化學混合物的效應的知識，其有效毒性不一定能可靠地預測。實務經驗與研究已顯示，化學特異性量測僅有約20%的機會鑑別出未知樣品的真實毒性，此意味著高達80%的毒物未能被鑑別出來。
因此，需要用於確定化妝產品中是否存在毒物的新穎方法。例如，一文獻提供吡啶硫酮鋅(zinc pyrithione，Zpt)的早期生命階段的試驗，以及將包含或不包含Zpt的商品化的洗髮精於斑馬魚及日本青鱂(Medaka)進行試驗(Environmental Research Section A 81,81-83,1999)。美國第2013/152222號專利公開案與轉基因魚及其用途相關，特別是偵測雌激素(estrogenic)及抗雌激素(anti-estrogenic)化合物、監控環境中類雌激素的活性及闡述肝臟再生的用途。然而，仍有需要發展偵測樣品中毒物的生物試驗。
本揭示內容提供確定化妝產品中是否存在毒物的方法，其包含使硬骨魚胚胎與化妝產品的樣品或來自化妝產品的樣品的提取物接觸並確定該樣品或該提取物是否對胚胎產生毒性效應，其中對胚胎的毒性效應可指示在化妝產品中存在毒物。可使用本揭示內容的方法測試的例示性化妝產品闡述於章節4.2中。在一些實施例中，提取物包含有機溶劑提取物(例如，甲醇提取物)。在其他實施例中，提取物包含有機及無機溶劑提取物(例如，甲醇及水提取物)。製備來自用於毒性測試的化妝產品的提取物的方法闡述於下文的章節4.3及4.4及編號的實施例9至21中。
在一些實施例中，本揭示內容的測試方法包含確定樣品或提取物是 否對硬骨魚胚胎產生毒性效應，例如急性效應(例如，畸形或死亡)或特定效應(例如，雌激素活性干擾)。在一些實施例中，測試方法包含使硬骨魚胚胎與有機溶劑提取物或有機及無機溶劑提取物接觸，該有機溶劑提取物或有機及無機溶劑提取物藉由或是藉由如下文的章節4.3、章節4.4或編號的實施例9至21的一者中所述的製程可獲得。確定化妝產品中是否存在毒物的例示性方法闡述於下文的章節4.5及編號的實施例1至64中。在一些實施例中，硬骨魚是青鱂或斑馬魚胚胎(如章節4.5.1-4.5.2中所述)，且在一些實施例中可是轉基因的。可使用本揭示內容的方法確定的急性及特定毒性效應分別闡述於章節4.5.3及4.5.4中。例示性急性毒性效應包括死亡及畸形，且例示性特定毒性效應包括雌激素活性干擾、雄激素活性干擾、異型生物質效應、心臟毒性效應及肝毒性效應。
本揭示內容提供的樣品測試方法可用於(例如)評估化妝產品的樣品或來自化妝產品的提取物的總生物毒性效應。本揭示內容的方法可以高通量方式用於測試大量樣品，提供(例如)確定大量化妝產品的生物安全性的方法。
4.1.概述
本發明提供一種測定化妝產品樣品中的毒性概況的生物分析方法。與檢測特定毒物的化學方法的顯著不同在於本發明的生物分析得到樣品的整體毒物概況，其可作為樣品毒性的指標。相對於化學分析，在用於本發明方法的前處理過程中，並無任何毒性物質添加於樣品中，且用於本方法的試劑不會與樣品反應並改變樣品的毒性。因此，本發明提供一種測定化妝產品中整體毒性的方法。
在一方面，本發明提供一種測定化妝產品中整體毒性的方法，其包含：(a)將溶劑與化妝品產品結合以得到具整體毒性的溶劑提取物；(b)將硬骨魚胚胎與a)的溶劑提取物接觸；及(c)測定該提取物是否對該胚胎具毒性作用；其中對該胚胎具毒性作用顯示化妝產品的整體毒性。
本揭示內容提供確定化妝產品中是否存在毒物的方法。方法包含使硬骨魚胚胎與化妝產品的樣品或來自化妝產品的樣品的提取物接觸並確定該樣品或提取物是否對胚胎產生毒性效應，其中對胚胎的毒性效應指示化妝產品中存在毒物。有利地，本揭示內容的方法可用於監測化妝品的總生物毒性，相比下，化學特異性測試通常僅檢測一種類型的毒物或一組毒物的存在。可使用本揭示內容的方法測試的例示性化妝產品闡述於章節4.2中。用於製備來自化妝產品的樣品的提取物的製程詳細闡述於章節4.3及4.4中，且確定化妝產品樣品或化妝產品提取物中是否存在毒物的方法闡述於章節4.5中。
4.2.化妝產品
化妝產品可為意欲與人類或動物身體的各個外部部分(表皮、毛髮系統、指甲、唇及外生殖器)或與牙齒及口腔的黏膜接觸以便唯一地或主要來使其清潔、使其具香氣、改變其外觀及/或消除身體氣味及/或保護其或使其保持處於良好狀態的任何物質或混合物。在一些實施例中，化妝產品是意欲施用至人體的產品。
化妝產品的例示性類別包括但不限於用於皮膚(例如，手、臉、腳等)的霜劑、乳液、洗劑、凝膠及油；面膜；粉底(例如，液體、膏狀物、粉 末)；化妝粉、浴後粉、衛生粉等；香皂、除臭皂等；香水、化妝水及古龍水(eau de Cologne)；洗浴混合物(例如，鹽、泡沫、油、凝膠等)；脫毛劑；除臭劑及止汗劑；護髮產品(例如，染髮劑及漂色劑、用於燙髮、順髮及固定的產品、定型產品、清潔產品(例如，洗劑、粉、洗髮精)、調理產品(例如，洗劑、霜劑、油)、美髮產品(例如，洗劑、髮膠、潤髮油))；剃鬚產品(例如，霜劑、泡沫、洗劑等)；用於化妝及自臉部及眼部卸妝的產品(例如，卸妝劑)；意欲施加至唇的產品；用於護理牙齒及口腔的產品；用於指甲護理及化妝的產品；用於外部私處衛生的產品；日光浴產品；用於無陽光曬黑的產品；皮膚增白產品；及抗皺產品。
例示性化妝品包括面膜、香水、止汗劑、除臭劑、牙膏、洗髮精、精油、卸妝劑、清潔產品、染髮劑、粉底、遮瑕膏、防曬劑、保濕劑、抗皺霜、眼影膏、眼線膏、睫毛膏、腮紅、唇膏、唇彩、指甲油、精華液、眼霜、晚霜、日霜、BB霜、夜用凝露、日用凝露、護手霜、頸霜、抗老化霜、沐浴乳、洗髮精及護髮素。在一些實施例中，化妝品是粉底。在一些實施例中，化妝品是遮瑕膏。在一些實施例中，化妝品是防曬劑。在一些實施例中，化妝品是保濕劑。在一些實施例中，化妝品是抗皺霜。在一些實施例中，化妝品是眼影膏。在一些實施例中，化妝品是眼線膏。在一些實施例中，化妝品是睫毛膏。在一些實施例中，化妝品是腮紅。在一些實施例中，化妝品是唇膏。在一些實施例中，化妝品是唇彩。在一些實施例中，化妝品是指甲油。在一些實施例中，化妝品是精華液。在一些實施例中，化妝品是眼霜。在一些實施例中，化妝品是晚霜。在一些實施例中，化妝品是日霜。在一些實施例中，化妝品是BB霜。在一些實施例中，化妝品是夜用凝露。在一些實施例中，化妝品是日用凝露。在一些實 施例中，化妝品是護手霜。在一些實施例中，化妝品是頸霜。在一些實施例中，化妝品是抗老化霜。在一些實施例中，化妝品是沐浴乳。在一些實施例中，化妝品是卸妝劑。在一些實施例中，化妝品是染髮劑。在一些實施例中，化妝品是洗髮精。在一些實施例中，化妝品是護髮素。
可使用本揭示內容的方法測試的化妝產品的樣品包括全部化妝產品(例如，一管面霜的全部內容物)或其一部分。術語「樣品」亦包括已稀釋於溶劑中的化妝產品樣品(例如，稀釋於水或硬骨魚培養基中的水可混溶化妝品的樣品)。
4.3.化妝產品提取物
可用於本揭示內容的毒性測試方法中的提取物可自化妝產品(例如先前闡述於章節4.2中的那些)的樣品加以製備。可用於本揭示內容的毒性測試方法中的提取物較佳是有機溶劑提取物或有機及無機溶劑提取物。術語「有機溶劑」當與術語「有機溶劑提取物」結合使用時是指用於自化妝產品的樣品提取化合物的特定有機溶劑或有機溶劑的混合物，且不一定是指其中提取物可在任何給定時間溶解的溶劑。舉例而言，藉由使用甲醇自樣品提取化合物而製備的提取物仍是甲醇提取物，即使在其中在提取之後提取物經處理去除甲醇的情形下亦是如此。因此，舉例而言，已經乾燥去除甲醇並隨後再溶解或重新懸浮於另一溶劑(例如二甲基亞碸)中的甲醇提取物仍是甲醇提取物，即使處於其現有狀態的提取物含有除甲醇的外的另一溶劑。同樣地，術語「有機溶劑」及「無機溶劑」當與術語「有機溶劑及無機溶劑的提取物」結合使用時是指用於自化妝產品的樣品提取化合物的有機及無機溶劑。
可用於製造有機溶劑提取物的有機溶劑包括甲醇、二甲基亞碸 (DMSO)、乙腈、丙酮、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、氯仿、己烷及其混合物。較佳有機溶劑包括能夠溶解極性及非極性有機分子的有機溶劑，例如甲醇及DMSO。例示性無機溶劑是水。在一些實施例中，使用甲醇來製造有機溶劑提取物。在其他實施例中，使用DMSO來製造有機溶劑提取物。在其他實施例中，使用甲醇與DMSO的混合物來製造有機溶劑提取物。在一些實施例中，使用甲醇與水的混合物來製造有機及無機溶劑提取物。在一些實施例中，使用DMSO與水的混合物來製造有機及無機溶劑提取物。
有機溶劑提取物藉由包含以下的製程可獲得：將化妝產品的樣品與有機溶劑(例如，甲醇)組合以形成混合物、混合該混合物、自該混合物分離含有有機溶劑的相並回收提取物。有機溶劑的體積可基於樣品的量及/或性質(例如，樣品的稠度)來選擇或改變。與樣品組合以形成混合物的有機溶劑的體積(例如)約1.5倍至約10倍樣品重量或體積。亦即，當該樣品為液體時，該溶劑的體積為樣品體積的約1.5至約10倍；當該樣品為固體或半固體時，該溶劑的體積為樣品重量的約1.5至約10倍(例如，約1.5至約8倍、約2倍至約5倍、約1.5倍至約3倍、約2倍至約4倍或約2倍至約4倍樣品重量或體積)。在一些實施例中，有機溶劑(例如，甲醇)的體積是至少3倍樣品重量或體積。與較低的有機溶劑對樣品比率對比，較高的有機溶劑對樣品比率在一些情形下可容許較高量的毒物提取；然而，較高的有機溶劑對樣品比率產生更稀的提取物，端視於提取物的稀釋程度，其可需要在毒性試驗中測試提取物前濃縮。
將混合物混合可藉由(例如)搖動混合物、渦旋(vortex)混合物、音波處理混合物或其組合來進行。在一些實施例中，混合包含渦旋及音波處理混合物。
自混合物分離含有有機溶劑的相包含使混合物離心以自該混合物分離含有有機溶劑的相。或者，可在重力下分離各相，但與使用離心分離混合物相比，在重力下分離混合物可需要更長時間完成。對於含有不完全可溶或不溶於有機溶劑的固體顆粒(例如，閃光劑或礦物顆粒)的化妝品而言，可使用過濾以自混合物分離含有有機溶劑的相(例如，使用重力、離心或真空過濾)。
在分離後，有機溶劑提取物可藉由(例如)以下回收：藉由吸管從其他相吸移含有有機溶劑的相、傾析所分離的相或使用分液漏斗分離各相(例如，當非使用離心分離各相時)。
用於獲得有機溶劑提取物的製程可包括使用一或多種鹽及/或糖以助於將毒物自化妝產品的樣品提取至有機溶劑。舉例而言，形成混合物可包含將化妝產品的樣品與有機溶劑及與以下組合：(i)鹽(例如，氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鎂、乙酸鈉、乙酸銨、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、無水硫酸鈣、或其組合)、及/或(ii)糖(例如，單醣及/或二醣，例如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、蔗糖及其混合物)。在一些實施例中，鹽是氯化鈉。在一些實施例中，糖是蔗糖。使用無水鹽有助於吸收可存在於混合物中的水且可用來提供脫水有機溶劑提取物。在本揭示內容的上下文中，且除非上下文另有要求，否則未明確鑑別為呈水合或無水形式的鹽涵蓋鹽的水合及無水形式兩者。舉例而言，「氯化鈣」涵蓋氯化鈣的無水及水合形式(即，CaCl2(H2O)x，其中x=0、1、2、4或6)。亦可將鹽及/或糖添加至化妝產品的樣品與有機溶劑的預形成的混合物，例如直至混合物經鹽及/或糖飽和為止(例如，如藉由在混合物內觀察到不溶解的鹽或糖晶體所指示)。然後，可自混合物分離含有有機溶劑的相並 回收有機溶劑提取物，例如如先前段落中所述。
用於獲得有機溶劑提取物的製程亦可包括脫水步驟及/或去脂步驟。脫水步驟可包含將有機溶劑提取物與一或多種無水鹽(例如，先前段落中所述的無水鹽的一或多者)組合，視情況將混合物混合並然後自該混合物分離含有有機溶劑的相。去脂步驟可包含用非極性溶劑將有機溶劑提取物洗滌至少一次(例如，一次、兩次或三次)。舉例而言，可使用C5-C8烷烴(例如，正戊烷、正己烷、正庚烷或正辛烷)。在一些實施例中，用於去脂的溶劑包含己烷。如本文中所用，「己烷」是指正己烷。作為對如上文所述的進行有機溶劑提取然後用非極性溶劑洗滌的備選方案，可藉由使用己烷作為溶劑以自化妝產品提取化合物並然後使用極性有機溶劑(例如乙腈)使己烷提取物經受溶劑提取來獲得去脂的有機溶劑提取物。
在一些實施例中，當有機溶劑是甲醇或DMSO時，則不進行前兩段中所述的步驟(即，在製程中不使用鹽及/或糖，且不進行此段中所述的脫水及去脂步驟)。在一些實施例中，當有機溶劑是乙腈、丙酮、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、氯仿、己烷及其混合物時，則進行前兩段中所述的一些或所有步驟。包括前兩段中所述步驟的例示性提取方案闡述於下文的章節4.4中。
所回收的有機溶劑提取物(例如，根據先前段落中任一段所述的製程所製備)可經進一步處理，例如，濃縮提取物、自提取物去除一些或全部有機溶劑或將提取物稀釋於適用於毒性試驗的溶劑中。可藉由(例如)在氮流下或使用旋轉蒸發器部分乾燥提取物濃縮有機溶劑提取物。可藉由(例如)在氮流下或使用旋轉蒸發器乾燥提取物將有機溶劑提取物完全乾燥來去除有機溶劑。在乾燥後，可然後將有機溶劑提取物再溶解或懸浮於第二 有機溶劑中。在一些實施例中，第二有機溶劑是適用於如章節4.5中所述的毒性試驗的溶劑。例示性第二有機溶劑包括甲醇、二甲基亞碸及其混合物。
當提取中使用的有機溶劑適用於毒性試驗時，則不必乾燥提取物並將提取物再溶解或懸浮於另一溶劑中。相反，提取物可(例如)經濃縮並然後稀釋於另一溶劑中、不經濃縮即稀釋於另一溶劑中或不經濃縮或稀釋即直接用於試驗。在一些實施例中，提取物在用於毒性試驗前既未經乾燥亦未經濃縮。舉例而言，使用甲醇作為有機溶劑製得的有機溶劑提取物可直接用於毒性試驗或可在用於試驗前經稀釋，而在稀釋前未經濃縮。在用於毒性試驗前可用於稀釋有機溶劑提取物的溶劑包括水及硬骨魚培養基。
有機及無機溶劑提取物可類似於有機溶劑提取物來製備，唯使用有機及無機溶劑的組合而非有機溶劑來製備提取物。在一些實施例中，有機及無機溶劑是以3：7至7：3(例如，3：7至7：3、4：6至6：4或1：1)的比率使用。在一些實施例中，比率是4：6或6：4。在一些實施例中，有機溶劑是甲醇且無機溶劑是水。在一些實施例中，甲醇對水的比率是3：7、4：6、1：1、6：4或7：3。在一些實施例中，甲醇對水的比率是4：6。在其他實施例中，甲醇對水的比率是6：4。
有機及無機溶劑提取物藉由包含以下的製程可獲得：將化妝產品的樣品、有機溶劑(例如，甲醇)及無機溶劑(例如，水)組合以形成混合物、混合該混合物、自該混合物分離含有有機溶劑及無機溶劑的相並回收提取物。有機溶劑與無機溶劑的總體積(即，總溶劑體積)可基於樣品的量及/或性質(例如，樣品的稠度)來選擇或改變。總溶劑體積是(例如)約1.5倍至約10倍樣品重量或體積(例如，約1.5倍至約8倍、約2倍至約5倍、約1.5倍至 約3倍、約2倍至約4倍或約2倍至約4倍樣品重量或體積)。在一些實施例中，總溶劑體積是樣品重量的至少3倍。
混合可藉由(例如)以下來進行：搖動混合物、渦旋混合物、音波處理混合物或其組合。在一些實施例中，混合包含渦旋並音波處理混合物。
自混合物分離含有有機溶劑及無機溶劑的相包含使混合物離心以自該混合物分離含有有機溶劑及無機溶劑的相。或者，可在重力下分離各相，但與使用離心分離混合物相比，在重力下分離混合物需要更長時間完成。對於含有固體顆粒且不完全溶解或不溶於有機溶劑與無機溶劑混合物中的化妝品而言，可使用過濾自混合物分離含有有機溶劑及無機溶劑的相(例如，使用重力、離心或真空過濾)。
在分離後，有機或無機溶劑提取物可藉由(例如)以下回收：藉由吸管從其他相吸移含有有機及無機溶劑的相、傾析所分離的相，或使用分液漏斗分離各相(例如，當非使用離心作用分離各相時)。
所回收的有機及無機溶劑提取物可經進一步處理，例如濃縮提取物、自提取物去除一些或所有有機及無機溶劑，或將提取物稀釋於適用於毒性試驗的溶劑中。可藉由(例如)在氮流下或使用旋轉蒸發器部分乾燥提取物，以濃縮有機及無機溶劑提取物。可藉由(例如)在氮流下或使用旋轉蒸發器乾燥提取物，將有機及無機溶劑提取物完全乾燥以去除有機及無機溶劑。乾燥後，然後將有機及無機溶劑提取物再溶解或懸浮於第二有機溶劑中。在一些實施例中，第二有機溶劑是適用於如章節4.5中所述的毒性試驗的溶劑。例示性第二有機溶劑包括甲醇、二甲基亞碸及其混合物。
當提取中所使用的有機及無機溶劑二者均適用於毒性試驗時，則不必乾燥提取物並將提取物再溶解或懸浮於另一溶劑中。相反，提取物可 (例如)經濃縮並然後稀釋於另一溶劑中、不經濃縮即稀釋於另一溶劑中或不經濃縮或稀釋即直接用於試驗。在一些實施例中，提取物在用於毒性試驗前既未經乾燥亦未經濃縮。舉例而言，使用甲醇作為有機溶劑及水作為無機溶劑製得的有機及無機溶劑提取物可直接用於毒性試驗或可稀釋後用於試驗，而在稀釋前不經濃縮。在用於毒性試驗前可用於稀釋有機及無機溶劑提取物的溶劑包括水及硬骨魚細胞培養基。
4.4.例示性提取方案
以下方案是可用於自化妝產品(例如自非水可混溶的化妝產品)製備甲醇提取物的例示性方案。
1)將化妝產品的樣品與一定量的甲醇組合以形成混合物；2)視情況藉由渦旋及音波處理該混合物，使該混合物混合；3)使該混合物離心；及4)自該混合物分離上清液，藉此獲得甲醇提取物。
藉由上文所述方案獲得的甲醇提取物可直接用於毒性試驗或可在無濃縮或溶劑去除步驟的情形下用溶劑(例如水或硬骨魚培養基)稀釋。
以下方案是用於自化妝產品(例如自非水可混溶的化妝產品)製備甲醇與水提取物的例示性方案。
1)將化妝品的樣品與一定量的甲醇與一定量的水組合以形成混合物；2)視情況藉由渦旋並音波處理該混合物使該混合物混合；3)使該混合物離心；及4)自該混合物分離上清液，藉此獲得甲醇與水的提取物。
藉由上文所述方案獲得的甲醇提取物可直接用於毒性試驗或可在無 濃縮或溶劑去除步驟的情形下用溶劑(例如水或硬骨魚培養基)稀釋。
以下方案是用於自化妝產品(例如自非水可混溶的化妝產品)製備乙腈提取物的例示性方案。
1)將化妝產品的樣品與一定量的乙腈組合以形成混合物，並視情況混合該混合物；2)添加氯化鈉至該混合物直至飽和為止，並視情況混合該混合物；3)自該混合物分離含有乙腈的相(例如，藉由離心)，以獲得乙腈提取物；4)添加無水硫酸鈉至該乙腈提取物直至飽和為止，以形成第二混合物，並視情況混合該第二混合物；5)自該第二混合物分離含有乙腈的相(例如，藉由離心)，以獲得脫水的乙腈提取物；6)用己烷洗滌該脫水的乙腈提取物，並視情況重複一次以獲得脫水及去脂的乙腈提取物；及7)自該脫水及去脂的乙腈提取物去除乙腈並將該脫水及去脂的乙腈提取物再溶解於甲醇中。
4.5.測試毒性效應
硬骨魚胚胎是用以篩選/鑑別測試樣品的生物效應(例如，毒性效應)的有效活體內模型系統，且使用魚(例如，斑馬魚及青鱂魚)胚胎鑑別的不良效應可預測對於人類的不良效應。根據歐洲法規，魚胚胎未定義為受保護的動物而可用作動物備選(指令2010/63/EU；Halder等人,2010,Integrated Environmental Assessment Management.6：484-491)。
本揭示內容的篩選試驗需要使硬骨魚胚胎與化妝產品的樣品或來自 化妝產品的樣品的提取物接觸並確定該提取物是否對胚胎產生毒性效應。舉例而言，若化妝品是水可混溶的，則化妝產品的樣品可不經提取即用於毒性試驗中。在一些實施例中，水可混溶的化妝品是稀釋於(例如)水或硬骨魚培養基中，並然後用於篩選試驗中(例如，稀釋10至200倍)。對於非水可混溶的化妝品而言，較佳使用有機溶劑(例如，甲醇)或有機及無機溶劑(例如，甲醇及水)提取物。
可用於本揭示內容的篩選試驗中的硬骨魚胚胎可為各種淡水、微鹹水或鹹水(海水)魚物種，包括(但不限於)以下屬的魚：青鱂屬(Oryzias)、斑馬魚屬(Danio)及胖頭鱥屬(Pimephales)。青鱂屬中的魚屬怪頜鱂科(Adrianichthyidae)且包括(例如)黑點青鱂(Oryzias melastigma，別名恒河青鱂(Oryzias dancena)(海洋或微鹹水青鱂)、青鱂魚(Oryzias latipes)(日本青鱂(Japanese medaka))、西裡伯斯青鱂(Oryzias celebensis)、花斑青鱂(Oryzias marmoratus)、印尼青鱂(Oryzias matanensis)、黑青鱂(Oryzias nigrimas)(黑色直頜青鱂(black buntingi))、直頜青鱂(Oryzias orthognathus，buntingi)及深青鱂(Oryzias profundicola)。斑馬魚屬中的魚屬鯉科(Cyprinidae family)且包括(例如)斑馬丹尼魚(Danio rerio)(斑馬魚)、閃電斑馬魚(Danio albolineatus)、珍珠斑馬魚(Danio abolineatus)、虹帶斑馬魚(Danio choprae)、長須斑馬魚(Danio dangila)、藍帶斑馬魚(Danio erythromicron)、緬甸斑馬魚(Danio feegradei)、克氏斑馬魚(Danio kerri)、網紋斑馬魚(Danio kyathit)、銀河斑馬魚(Danio margaritatus)、粗管小竹斑馬魚(Danio meghalayensis)、黑帶斑馬魚(Danio nigrofasciatus)及玫瑰斑馬魚(Danio roseus)。胖頭鱥屬中的魚屬鯉科且包括鈍吻胖頭鱥(Pimephales notatus，鈍吻鯉科小魚 (bluntnose minnow))、肥頭鰷魚(Pimephales promelas，黑頭呆魚(fathead minnow))、嬌胖頭鱥(Pimephales tenellus，苗條鯉科小魚(slim minnow))及凝胖頭鱥(Pimephales vigilax，大頭鯉科小魚(bullhead minnow))。在特定實施例中，魚胚胎是日本或微鹹水青鱂魚、斑馬魚或黑頭呆魚胚胎。微鹹水青鱂魚及斑馬魚的具體優點分別闡述於章節4.5.1及4.5.2中。
毒性效應可為急性毒性效應(如章節4.5.3中所述)或特定毒性效應(如章節4.5.4中所述)。
魚胚胎可為轉基因或非轉基因的。非轉基因魚可用於(例如)檢測化妝產品的樣品或來自化妝產品的提取物中的急性毒性效應(例如，毒性)，如章節4.5.3中所述。轉基因魚胚胎在篩選特定效應時尤其有用，例如，用於檢測化妝產品的樣品或來自化妝產品的提取物中的雌激素化合物及抗雌激素化合物，如下文章節4.5.4.1中所述。
篩選試驗可以高通量或半高通量方式進行，例如，在多孔板(例如，24、96或384孔板)中，及/或具有陽性及/或陰性對照(例如，僅作為陰性對照的介質及已知在特定試驗中作為陽性對照產生毒性效應的試劑)。可以一式兩份或一式三份測試試驗中的每一樣品或提取物。可使用每一樣品或每一提取物的多個稀釋物來進行試驗。
4.5.1.青鱂魚
微鹹水青鱂魚(黑點青鱂)原產於巴基斯坦、印度、緬甸及泰國的沿海水域及淡水(Naruse,1996,Fish Biol.L.Medaka 8：1-9)，並可在0千分率(ppt)至高達35ppt的範圍內不同鹽度的水中繁榮生長。另外，此微鹹水青鱂魚對於轉基因研發具有許多優點，包括：(1)尺寸較小(成魚2-3cm)； (2)世代時間相對較短(2-3個月)；(3)雙型性別(例如，雌性的臀鰭具有平坦的遠端表面，而雄性臀鰭的遠端表面由於分開的較長鰭條而凸起)；(4)高多產的繁殖能力；(5)半透明的卵及仔魚(直至受精後15天)，此有助於DNA顯微注射針的定位及內部器官的觀察；及(6)可適應用於產生其他青鱂物種(例如，青鱂魚)的轉基因魚的各種轉基因技術。
鑒於微鹹水青鱂魚繁殖的高度多產能力，可全年誘導此魚的產卵，且每一對雌性及雄性魚在室內維持的條件下(例如，28±1℃及14小時-光/8小時-黑暗的恆定光循環，並飼以市售無激素片狀食品及鹽水蝦(豐年蝦(Artemia salina))每天可產20-30個卵多達若干個月。卵通常在28±1℃下11至15天內孵化。
黑點青鱂及青鱂魚的兩個青鱂物種具有較高的形態學、生理學及基因體相似性，且雖然青鱂魚首先用於產生轉基因魚，但轉基因技術易於適於微鹹水青鱂黑點青鱂(Chen等人，2008,Ectoxicol.Environ.Saf 71：200-208；Chen等人，2009,Comp.Biochem.Physiol.C.Toxicol.Pharmacol.149：647-655)。
可將青鱂培育至透明狀的(例如，參見美國專利第6,737,559號)，此進一步有助於篩選試驗、尤其涉及檢測報導基因表現或活性程度的那些。
4.5.2.斑馬魚
研究已顯示，斑馬魚是預測人類藥物的毒性的良好模型。在斑馬魚與哺乳動物物種之間存在緊密的生理及遺傳相似性，且研究者已使用大量藥理學相關的化合物對斑馬魚毒性終點進行了系統性評估。
作為實驗工具，斑馬魚具有一系列的優點，例如光學透明性、高繁殖力及快速外部發育。基因及蛋白質表現中形態學及調節的變化可藉助使 用螢光蛋白容易地進行試驗。相對較小的身體尺寸可以使多隻斑馬魚裝入多孔板中，此使得實驗擴增時是個容易的過渡時期。此外，使得斑馬魚成為用於篩選試驗的有吸引力的工具的其他原因有：與魚飼養相關聯的相對較便宜的成本，綜合與斑馬魚可達成的後代的頻率。
4.5.3.急性毒性效應
可量測本揭示內容的化妝產品的樣品及化妝產品提取物的急性有毒效應，例如在整個生物體層面上的死亡及畸形。
以斑馬魚為例，斑馬魚胚胎毒性測試是基於靜態或半靜態系統中新近受精卵的48小時暴露。諸如卵與胚胎的凝固、未能發育體節、缺少心跳以及尾部與卵黃不分離的各種終點是毒性的指示。這些終點可在(例如)24、48、72及96小時之後記錄，並用於計算化妝產品的樣品或化妝產品提取物的LC50值。類似終點可在日本青鱂魚及黑頭呆魚中量測(參見Braunbeck及Lammer，2006，Background Paper on Fish Embryo Toxicity Assays，可自www.oecd.org/chemicalsafety/testing/36817242.pdf獲得)。
4.5.4.特定毒性效應
亦可針對特定效應(即，對特定組織、器官或激素系統的效應)對本揭示內容的化妝產品的樣品及化妝產品提取物進行試驗。尤其感興趣的試驗包括針對心臟毒性、耳毒性、癲癇易感性、內分泌干擾、胃腸道運動性、肝毒性、皮膚色素沉著改變、肌肉毒性、胰臟毒性、誘癌作用、神經毒性及腎臟毒性的那些(例如，參見Sarvaiya等人，2014，Veterinary Clinical Science 2(3)：31-38, Peterson and MacRae, 2011, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52：433-53, Eimon and Rubenstein, 2009, Expert Opin.Drug Metab.Toxicol.5(4)：393-401，及其中引用的關於試驗細節的參考文獻)。
在某些態樣中，可藉由檢測由於硬骨魚胚胎暴露於化妝產品樣品或化妝產品提取物所致的基因表現的改變來量測特定毒性效應。為便於觀察基因表現的改變，可使用其中將感興趣的調節序列(例如，誘導型啟動子)可操作地連接至報導基因序列的轉基因硬骨魚胚胎。調節序列可來自正研究的魚物種或不同的魚物種，只要其在所試驗的魚物種中表現適當即可。可檢測及/或量測在化妝產品樣品或化妝產品提取物暴露後報導基因與(陰性及/或陽性)對照相比表現的改變。
適宜報導基因序列對於熟習此項技術者將顯而易見。舉例而言，適宜報導蛋白包括可藉由組織化學方法檢測的螢光蛋白及酶。報導基因序列可引入至含有適當外源性調節元件(例如，啟動子及3’未轉譯區，例如如美國專利第9,043,995號中所述)的構築體中的硬骨魚基因體中，或可敲入至內源性遺傳位點(例如使用Kimura等人，2014,Scientific Reports 4：6545,doi：10.1038中所述的方法)中。
螢光蛋白為此項技術所熟知。螢光蛋白的實例包括(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)、增強的綠色螢光蛋白(EGFP)、紅色螢光蛋白(CFP及紅色FP，RFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、黃色螢光蛋白(YFP)及這些蛋白質的螢光變體。異源螢光基因(術語基因在此上下文中是指任何編碼序列，具有或不具有控制序列)可是(例如)編碼DsRed2、ZsGreen1及ZsYellow1的基因。異源螢光基因可編碼任何天然或變體標記蛋白，包括綠色螢光蛋白(GFP)、增強的綠色螢光蛋白(eGFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、增強的黃色螢光蛋白(eYFP)、藍色螢光蛋白(BFP)、增強的藍色螢光蛋白(eBFP)、青 色螢光蛋白(CFP)及增強的青色螢光蛋白(eCFP)。
可藉由組織化學方法檢測的酶亦為此項技術所熟知。酶的實例包括(但不限於)螢光素酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、鹼性磷酸酶、氯黴素乙醯基轉移酶及乙醇去氫酶。根據特定實施例，酶是螢光素酶。術語「螢光素酶」意欲表示在稱為螢光素的受質存在下催化或起始生物發光反應的所有蛋白質。螢光素酶可來自產生生物發光的任何生物體或系統(例如，參見美國專利第6,152,358號)。舉例而言，螢光素酶可來自海紫羅蘭科(Renilla)(美國專利第5,418,155號及第5,292,658號)、來自東部螢火蟲(Photinus pyralis)或來自源氏螢火蟲(Luciola cruciata)(美國專利第4,968,613號)。
直接(例如，藉由量測報導基因mRNA的量)或間接(例如，藉由量測報導蛋白的量及/或活性)檢測蛋白質報導基因的技術是習用的。許多這些方法及分析技術可在諸如以下的參考文獻中找到：Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人編輯(Greene Publishing Associates,Inc.與John Wiley & Sons,Inc.的合資企業)，Enzyme Immunoassay，Maggio編輯(CRC Press,Boca Raton,1980)；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，T.S.Work及E.Work編輯(Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,1985)；Principles and Practice of Immunoassays，Price及Newman編輯(Stockton Press,NY,1991)；及諸如此類。
在特定實施例中，量測報導基因表現產物(例如，蛋白質)的量及/或活性。螢光標記物(例如eGFP)可藉由檢測其在細胞(例如，在微鹹水青鱂魚或斑馬魚胚胎中)中的螢光進行檢測。舉例而言，可在螢光顯微鏡下觀 察螢光，且若期望，可進行定量。可直接檢測而不需要添加外源因子的報導基因(例如eGFP)對於檢測或評價魚胚胎發育期間的基因表現是較佳的。經工程化在感興趣的啟動子控制下表現螢光報導基因的轉基因魚胚胎可提供用於分析空間及時間表現模式的快速即時活體內系統。
4.5.4.1.內分泌干擾物試驗
內分泌干擾物是在某些劑量下可干擾哺乳動物中內分泌(或激素)系統的化學品。這些干擾會造成癌性腫瘤、出生缺陷及其他發育病症。特定而言，內分泌干擾物與以下的發生相關：學習障礙、嚴重注意力缺失症、認知及腦發育問題；身體的變形；乳癌、前列腺癌、甲狀腺及其他癌症(參見Gore等人，2015,Endocrine Reviews 36(6)：593-602.doi：10.1210/er.2015-1093)。內分泌干擾物的一個熟知的實例是雙酚A，一種常見於塑膠瓶、塑膠食品容器、牙科材料及金屬的食品與嬰兒配方罐的襯裡中的化學品。雙酚A與糖尿病、乳癌及前列腺癌、精子數減少、生殖問題、早期青春期、肥胖症及神經學問題的升高率相關。
內分泌干擾物可在具有標記蛋白的編碼序列的轉基因硬骨魚胚胎中進行評估，該標記蛋白可操作地連接至對多種內分泌系統的干擾物敏感的啟動子。由於在不同內分泌系統中運行的若干種激素共用共同亞單位，故使用來自共同亞單位中的一者的啟動子容許同時研究多個激素系統。此一亞單位的一個實例是醣蛋白亞單位α(gsuα)，其編碼激濾泡素β、黃體促素β及促甲狀腺激素(TSH)β的共用α亞單位。斑馬魚的gsuα啟動子是可操作地連接至標記蛋白的編碼序列並用於檢測內分泌干擾化學品的啟動子的實例(Cheng等人，2014,Toxicology and Applied Pharmacology 278：78-84)，且可用於篩選如本文中所述的化妝產品中內分泌干擾化學品的存 在。
許多內分泌干擾物具有雌激素、增強雌激素或抗雌激素的性質。為評估本揭示內容的化妝產品樣品及化妝產品提取物的雌激素、增強雌激素及抗雌激素性質，化妝產品樣品或化妝產品提取物可在具有可操作地連接至標記蛋白的編碼序列的雌激素反應啟動子的硬骨魚胚胎中進行試驗。在一些實施例中，雌激素反應啟動子是來自青鱂魚(例如，黑點青鱂及青鱂魚)的絨毛膜促性激素基因，例如絨毛膜促性激素H或絨毛膜促性激素L。絨毛膜促性激素H及L是硬骨魚的卵包膜(絨毛膜)的內層亞單位的前體蛋白質，且絨毛膜促性激素H及絨毛膜促性激素L二者的基因表現對雌激素物質有反應(例如，參見Yamaguchi等人，20l5,J Appl Toxicol.35(7)：752-8).在一些實施例中，絨毛膜促性激素H啟動子用來試驗化妝產品樣品或化妝產品提取物的雌激素干擾物活性。已顯示，絨毛膜促性激素H啟動子對於監測海洋環境中的雌激素化學品是高度敏感的生物標記(Chen等人，2008,Ecotoxicol Environ Saf.71(1)：200-8).適用於試驗化妝產品樣品及化妝產品提取物的雌激素活性的絨毛膜促性激素H啟動子構築體的實例揭示於美國專利第9,043,995號中。在其他實施例中，使用絨毛膜促性激素L啟動子。在其他實施例中，雌激素反應啟動子是腦芳香酶B啟動子(在斑馬魚中稱為cyp19a1b啟動子)。斑馬魚cyp19a1b基因展現對雌激素的強烈敏感性，且是雌激素模擬物的敏感性靶標，並已成功地可操作地連接至轉基因魚中的標記基因(例如GFP)(例如，參見Brion等人，2012,PLoS ONE 7(5)：e36069.doi：10.1371/journal.pone.0036069)。在另一實施例中，雌激素敏感性啟動子是卵黃蛋白原啟動子(例如如Schreurs等人，2004,Environmen.Sci.Technol.34：4439-44中所述)。
其他內分泌干擾物具有雄激素、增強雄激素或抗雄激素性質。化妝產品樣品及化妝產品提取物的雄激素、增強雄激素及抗雄激素性質可在具有可操作地連接至標記蛋白的編碼序列的雄激素反應啟動子的硬骨魚胚胎中進行評估。在一些實施例中，雄激素反應性啟動子是三刺魚(G.aculeatus)spiggin啟動子，其對雄激素有反應但對尤其雌激素及糖皮質激素不展現活性(例如，參見Sebillot等人，2014,Environ.Sci.Technol.48：10919-28)。
然而其他內分泌干擾物具有甲狀腺干擾性質，例如，其干擾下丘腦-垂體-甲狀腺(HPT)軸。化妝產品樣品及化妝產品提取物的甲狀腺/HPT干擾性質可在具有可操作地連接至標記蛋白的編碼序列的甲狀腺激素(TH)反應啟動子的硬骨魚胚胎中進行評估。在一些實施例中，甲狀腺反應啟動子是促甲狀腺激素亞單位β(TSHβ)啟動子，與其他亞單位相比，其對於TSH是唯一的。促甲狀腺激素是涉及TH及促甲狀腺激素釋放激素(TRH)的反饋迴路的一部分。特定而言，當存在低含量的TH時，下丘腦分泌TRH以刺激垂體釋放TSH，此進而刺激甲狀腺分泌TH，且相反的反饋迴路在存在高含量的TH時發生。TSHβ啟動子對於HPT軸是可用的生物標記物。可使用的TSH β啟動子的實例是斑馬魚TSH β啟動子(例如，參見Ji等人，2012,Toxicology and Applied Pharmacology 262：149-155)。
4.5.4.2.異型生物質試驗
異型生物質是存在於生物體內的外來化學物質。異型生物質可分組為抗氧化劑、致癌物、藥物、環境污染物、食品添加劑、烴及農藥。污染物(例如戴奧辛及多氯聯苯)被視為異型生物質。身體會藉由異型生物質代謝作用將異型生物質去除。此是由去活化及排泄異型生物質組成，且是藉 助藉由肝微粒體細胞色素P450酶系統所催化的反應主要發生在肝臟中。
為評估本揭示內容的化妝產品樣品及化妝產品提取物的異型生物質性質，化妝產品樣品及化妝產品提取物可在具有可操作地連接至標記蛋白的編碼序列的異型生物質反應啟動子的硬骨魚胚胎中進行試驗。在一些實施例中，啟動子是細胞色素P450啟動子，例如，斑馬魚P450 1A(Cyp1a)啟動子(例如Boon及Gong，2013,PLOS ONE8(5)：e64334中所闡述)。
本揭示內容的化妝品樣品及化妝品提取物的異型生物質性質亦可利用使用7-乙氧基試鹵靈(7-ethoxyresorufin)作為受質的活體內乙氧基試鹵靈-O-脫乙基酶(EROD)活性試驗進行評估，例如如Liu等人，2014,Environmental Toxicology 31(2)：201-10中所闡述。
4.5.4.3.肝毒性試驗
斑馬魚一直作為藥物誘導的肝毒性模型進行研究。斑馬魚在受精後的若干天的透明度使得能夠對包括肝臟的內部器官進行活體內視覺觀察。斑馬魚在48小時受精後(HPF)完成原發性肝臟形態發生。當暴露於肝毒物時，可目視評估肝臟形態學的變化(Hill等人，2012,Drug Metabolism Reviews 44(1)：127-140)。研究者已開發出可研究用以評估肝毒性的各種終點：肝臟變性、肝臟大小及形狀的變化及卵黃囊滯留(參見He等人，2013,Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 67：25-32)。這些參數可在斑馬魚中進行試驗以評估本揭示內容的化妝產品樣品或化妝產品提取物的肝毒性，且類似參數可用於對化妝產品樣品或化妝產品提取物在不同魚(例如青鱂)中的肝毒性進行試驗。
4.5.4.4.心臟毒性試驗
硬骨魚胚胎提供研究心臟毒性的理想模型系統，此乃因其透明度及 無覆蓋的心臟使得其可容易地觀察。以斑馬魚為例，心臟是由心室及心房組成，且這些發育迅速。在受精後24小時(hpf)觀察心管及心跳，且然後在72hpf前完成管循環、腔室形成及血液循環。
可藉由評估諸如以下的參數試驗化妝產品樣品及化妝產品提取物的心臟毒性：硬骨魚胚胎的心率、節律性(例如，房室傳導阻斷(AV阻斷)、心律不整)；循環及形態學(例如，心包水腫；出血、心室腫脹)。
心臟特異性啟動子BMP4可用於驅動容許觀察心臟形態的標記基因的表現。紅血球特異性啟動子gata1可用於驅動標記基因的表現，此容許觀察血液循環速率(參見Wu等人，2013,Toxicol.Sci.136(2)：402-412，及其中引用的參考文獻)。
這些參數可在斑馬魚或青鱂中進行試驗以評估本揭示內容的化妝產品樣品或化妝產品提取物的心臟毒性。
5.實例 5.1.實例1：BB霜提取物製備
提取由品牌A、B及C製造的三種SPF50的BB霜並測試急性毒性及雌激素活性。將BB霜以3倍體積的甲醇萃取。每一樣品經渦旋、超音波及離心。收集上清液並保存於-20℃直到進行測試。
5.2.實例2：BB霜提取物的急性毒性測試
使用斑馬魚(斑馬丹尼魚)AB品系胚胎測試如實例1中所述製備的提取物的急性毒性。將BB霜提取物稀釋至斑馬魚胚胎培養基(含有294.0mg/L的脫水氯化鈣、123.3mg/L的七水合硫酸鎂、63.0mg/L碳酸氫鈉及5.5mg/L的氯化鉀的去離子水)中，濃度為0.85μl/ml、1.88μl/ml、4.13μl/ml、9.09μl/ml及20.00μl/ml。將4-128個細胞階段的斑馬魚 AB品系胚胎以1個胚胎/孔暴露於96孔板中的提取物稀釋物。每一濃度用20個胚胎測試。包括斑馬魚胚胎培養基及3.7mg/L二氯苯胺分別作為陰性及陽性對照。在26℃下暴露48小時後，在立體顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎並將凝固、尾部未分離且不具有心跳的魚胚胎標記為死亡的。計算每一濃度的死亡率作為急性毒性終點。陰性對照的死亡率為5%，且陽性對照的死亡率為60%。表1顯示急性毒性測試結果。在三種BB霜提取物中，對於斑馬魚胚胎，品牌C毒性最高且品牌B毒性最低。
Figure TW201804155AD00001
5.3.實例3：BB霜提取物的雌激素活性
使用如美國專利第9,043,995號的實例1中所述產生的絨毛膜促性激素H-eGFP轉基因青鱂(黑點青鱂)遊走期胚胎測試如實例1中所述製備的提取物的雌激素活性。將BB霜提取物稀釋至青鱂(黑點青鱂)胚胎培養基(速溶海洋鹽溶解於去離子水中，使鹽度為0.2%)中，濃度為1.0μl/ml。17β-雌二醇亦以1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L及10.0μg/L作為陽性對照進行測試。培養基作為陰性對照進行測試。每一濃度含有3個重複，其中每一重複含有8個遊走期胚胎。在26℃下暴露24小時後，在綠色螢光顯微鏡下觀察遊走期胚胎並使用相同成像設置自腹側成像。陰性對照及來自品牌B的樣品的提取物在遊走期胚胎肝臟中未誘導出可觀察的綠色螢光。來自品牌A及品牌C的樣品的提取物在遊走期胚胎肝臟中誘導出可觀察的綠色螢光。
5.4.實例4：防曬霜試驗
提取品牌A、B及C的SPF50的防曬霜並測試急性毒性及雌激素活性。將防曬霜與甲醇混合(w/v=1：3)。經渦旋及超音波後，將樣品離心從而分相。將上清液分離並保存於-20℃直到進行測試。
該防曬霜樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該防曬霜中是否存在毒物是可被鑑別的。下表2及表3顯示這些防曬霜的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00002
Figure TW201804155AD00003
5.5.實例5：紙面膜試驗
擠壓品牌A、B及C的紙面膜以得到用於急性毒性及雌激素活性測試的溶液；或將其與甲醇混合(w/v=1：3)，經渦旋、超音波及離心後得到用於測試的上清液。
該紙面膜樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2 節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示這些紙面膜中是否存在毒物是可被鑑別的。下表4及表5顯示這些紙面膜的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00004
Figure TW201804155AD00005
5.6.實例6：嬰兒霜試驗
提取品牌A、B及C的嬰兒霜並測試急性毒性及雌激素活性。將嬰兒霜與甲醇混合(w/v=1：3)。經渦旋及超音波後，將樣品離心從而分相。將上清液分離並保存於-20℃直到進行測試。
該嬰兒霜樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示這些嬰兒霜中是否存在毒物是可被鑑別的。下表6及表7顯示這些嬰兒霜的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00006
Figure TW201804155AD00007
5.7.實例7：嬰兒油試驗
提取品牌A、B及C的嬰兒油並測試急性毒性及雌激素活性。將嬰兒油與甲醇混合(w/v=1：3)。經渦旋及超音波後，將樣品離心從而分相。將上清液分離並保存於-20℃直到進行測試。
該嬰兒油樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示這些嬰兒油中是否存在毒物是可被鑑別的。下表8及表9顯示這些嬰兒油的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00008
Figure TW201804155AD00009
Figure TW201804155AD00010
5.8.實例8：止汗劑試驗
通過與甲醇混合(w/v=1：3)，並經渦旋、超音波及離心提取品牌A、B及C的止汗劑，從而取得用於測試的上清液；或樣品於稀釋至魚培養基進行測試前不進行前處理。
該止汗劑樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示這些止汗劑中是否存在毒物是可被鑑別的。下表10及表11顯示這些止汗劑的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00011
Figure TW201804155AD00012
5.9.實例9：口紅試驗
萃取品牌A、B及C的口紅從而進行急性毒性及雌激素活性測試。將口紅與甲醇混合(w/v=1：3)。經渦旋及超音波後，將樣品離心從而分相。將上清液分離並保存於-20℃直到進行測試。
該口紅樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該口紅中是否存在毒物是可被鑑別的。下表12及表13顯示這些口紅的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00013
Figure TW201804155AD00014
5.10.實例10：嬰兒軟膏試驗
萃取品牌A、B及C的嬰兒軟膏從而進行急性毒性及雌激素活性測試。將軟膏與甲醇混合(w/v=1：3)。經渦旋及超音波後，將樣品離心從而分相。將上清液分離並保存於-20℃直到進行測試。
該軟膏樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該軟膏中是否存在毒物是可被鑑別的。下表14及表15顯示這些軟膏的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00015
Figure TW201804155AD00016
5.11.實例11：凝露試驗
通過與甲醇混合(w/v=1：3)，並經渦旋及超音波來提取品牌A、B及C的凝露，並經離心取得用於測試的上清液；或樣品於稀釋至魚培養基進行測試前不進行前處理。
該凝露樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該凝露中是否存在毒 物是可被鑑別的。下表16及表17顯示這些凝露的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00017
Figure TW201804155AD00018
5.12.實例12：卸妝劑試驗
通過與甲醇混合(w/v=1：3)，並經渦旋、超音波及離心來提取品牌A(液體類)、B(油類)及C(粉類)的卸妝劑，從而取得用於測試的上清液。
該卸妝劑樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該卸妝劑中是否存在毒物是可被鑑別的。下表18及表19顯示這些卸妝劑的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00019
Figure TW201804155AD00020
Figure TW201804155AD00021
5.13.實例13：精油試驗
通過與甲醇混合(w/v=1：3)，並經渦旋、超音波及離心來提取品牌A、B及C的精油，從而取得用於測試的上清液。
該精油樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該精油中是否存在毒物是可被鑑別的。下表20及表21顯示這些精油的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00022
Figure TW201804155AD00023
Figure TW201804155AD00024
5.14.實例14：精華液試驗
通過與甲醇混合(w/v=1：3)，並經渦旋、超音波及離心來提取品牌A、B及C的精華液，從而取得用於測試的上清液。
該精華液樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該精華液中是否存在毒物是可被鑑別的。下表22及表23顯示這些精華液的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00025
Figure TW201804155AD00026
5.15.實例15：香水試驗
通過與甲醇混合(w/v=1：3)，並經渦旋、超音波及離心來提取品牌A、B及C的香水，從而取得用於測試的上清液。
該香水樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該香水中是否存在毒物是可被鑑別的。下表24及表25顯示這些香水的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00027
Figure TW201804155AD00028
5.16.實例16：洗髮精試驗
萃取品牌A、B及C的洗髮精從而進行急性毒性及雌激素活性測試。將洗髮精與甲醇混合(w/v=1：3)。經渦旋及超音波後，將樣品離心從而分相。將上清液分離並保存於-20℃直到進行測試。
該洗髮精樣品的急性毒性及雌激素活性的測試是依照描述於前述5.2節(實例2)及5.3節(實例3)中的方法來進行的。結果顯示該洗髮精中是否存在毒物是可被鑑別的。下表26及表27顯示這些洗髮精的急性毒性及雌激素活性數據。
Figure TW201804155AD00029
Figure TW201804155AD00030
6.特定實施例
本揭示內容藉由以下特定實施例例示。
1.一種測定化妝產品中整體毒物的方法，其包含：(a)將溶劑與化妝品產品結合以得到具整體毒性的溶劑提取物；(b)將硬骨魚胚胎與a)的溶劑提取物接觸；及(c)測定該提取物是否對該胚胎具毒性作用；其中對該胚胎具毒性作用顯示化妝產品的整體毒性。
2.如實施例1的方法，其中該化妝產品是面膜、香水、止汗劑、除臭劑、牙膏、洗髮精、精油、卸妝劑、清潔產品、染髮劑、粉底、遮瑕膏、防曬劑、保濕劑、抗皺霜、眼影膏、眼線膏、睫毛膏、腮紅、唇膏、唇彩、指甲油、精華液、眼霜、晚霜、日霜、BB霜、夜用凝露、日用凝露、護手霜、頸霜或抗老化霜。
3.如實施例1或實施例2的方法，其中該化妝產品是水可混溶的化 妝產品。
4.如實施例1或實施例2的方法，其中該化妝產品是水不可混溶性化妝產品。
5.如實施例1至4中任一實施例的方法，其中步驟(a)包含使該胚胎與來自該化妝產品的樣品的提取物接觸。
6.如實施例5方法，其中該提取物是有機溶劑提取物，視情況其中該有機溶劑包含甲醇、二甲基亞碸(DMSO)、乙腈、丙酮、甲苯、二乙醚、二氯甲烷、氯仿、己烷或其混合物。
7.如實施例6的方法，其中該有機溶劑能夠溶解極性及非極性有機化合物，視情況其中該有機溶劑包含甲醇、DMSO或其組合。
8.如實施例7的方法，其中該有機溶劑是甲醇。
9.如實施例5至8中任一實施例的方法，其中該提取物藉由包含以下的製程可獲得：將該化妝產品的樣品與該有機溶劑組合以形成混合物，混合該混合物，自該混合物分離含有該有機溶劑的相並回收該提取物，且其中該製程視情況進一步包含：(a)將該混合物與第一鹽及/或糖組合至該混合物，然後自該混合物分離含有該有機溶劑的相，視情況其中該鹽包含氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鎂、乙酸鈉、乙酸銨、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、無水硫酸鈣或其組合，且視情況其中該糖包含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、果糖、麥芽糖、蔗糖或其組合；(b)使該含有該有機溶劑的相與第二鹽組合以形成第二混合物，視情況混合該第二混合物，並自該第二混合物分離含有該有機溶劑的相，視情況其中該第二鹽是選自無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水氯化鈣、無水硫 酸鈣或其組合；(c)用非極性溶劑、視情況己烷將該有機溶劑提取物洗滌至少一次、視情況兩次；(d)(a)至(c)的任何組合；或(e)無(a)至(c)，例如，當有機溶劑包含甲醇及/或DMSO時。
10.如實施例9的方法，其中分離含有該有機溶劑的相包含使該混合物離心。
11.如實施例10的方法，其中該提取物是上清液或其濃縮形式。
12.如實施例9至12中任一實施例的方法，其中該混合包含渦旋及/或音波處理該混合物。
13.如實施例5的方法，其中該提取物是有機及無機溶劑提取物，視情況其中該有機溶劑包含甲醇、DMSO或其組合。
14.如實施例13的方法，其中該有機溶劑能夠溶解極性及非極性有機化合物，視情況其中該有機溶劑包含甲醇、DMSO或其組合。
15.如實施例14的方法，其中該有機溶劑是甲醇。
16.如實施例13至15中任一實施例的方法，其中該無機溶劑是水。
17.如實施例13至16中任一實施例的方法，其中提取物藉由包含以下的製程可獲得：將該化妝產品的樣品與這些有機及無機溶劑組合以形成混合物、混合該混合物、自該混合物分離含有該有機溶劑的相並回收該提取物。
18.如實施例17的方法，其中分離含有該有機溶劑的相包含使該混合物離心。
19.如實施例18的方法，其中該提取物是上清液或其濃縮形式。
20.如實施例17至19中任一實施例的方法，其中該混合包含渦旋及/或音波處理該混合物。
21.如實施例17至20中任一實施例的方法，其中該有機及無機溶劑是以3：7至7：3的比率使用，視情況其中該比率是4：6或6：4。
22.如實施例5至21中任一實施例的方法，其在步驟(a)前進一步包含自該化妝產品的該樣品製備該提取物。
23.如實施例22的方法，其中該提取物是藉由包含如實施例9至22中任一實施例中所述的這些步驟的製程製備。
24.如實施例23的方法，其中該提取物是藉由產生如實施例6至23中任一實施例所鑑別的提取物的類型的製程製備，例如就實施例6而言，該製程包含用有機溶劑製備該提取物，且就實施例7而言，該製程包含用能夠溶解極性及非極性有機化合物的溶劑製備該提取物等等。
25.如實施例24的方法，其中該方法包含如實施例9至21中任一實施例所例示的這些步驟。
26.如實施例1至4中任一實施例的方法，其中該化妝品是水可混溶的液體化妝產品且其中步驟(a)包含使硬骨魚胚胎與該化妝產品的樣品接觸。
27.如實施例1至26中任一實施例的方法，其中該硬骨魚胚胎是遊走期胚胎。
28.如實施例1至27中任一實施例的方法，其中該硬骨魚胚胎是青鱂胚胎、斑馬魚胚胎或黑頭呆魚胚胎。
29.如實施例28的方法，其中該硬骨魚胚胎是轉基因青鱂胚胎或轉基因斑馬魚胚胎。
30.如實施例1至29中任一實施例的方法，其中該毒性效應包含急性效應。
31.如實施例30的方法，其中該急性效應包含死亡、畸形或其組合。
32.如實施例1至29中任一實施例的方法，其中該毒性效應包含特定效應。
33.如實施例32的方法，其中該特定效應是內分泌活性干擾。
34.如實施例33的方法，其中該內分泌活性干擾是雌激素活性干擾、雄激素活性干擾或甲狀腺活性干擾。
35.如實施例33或實施例34的方法，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的醣蛋白亞單位α(gsuα)啟動子，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化。
36.如實施例34的方法，其中該內分泌活性干擾是雌激素活性干擾且其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的雌激素敏感性啟動子，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化。
37.如實施例36的方法，其中該雌激素敏感性啟動子是芳香酶B啟動子，且視情況其中該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎或青鱂胚胎。
38.如實施例36的方法，其中該雌激素敏感性啟動子是絨毛膜促性激素啟動子，該絨毛膜促性激素啟動子視情況為絨毛膜促性激素H啟動子或絨毛膜促性激素L啟動子，且視情況其中該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎或青鱂胚胎。
39.如實施例36的方法，其中該雌激素敏感性啟動子是卵黃蛋白原啟動子，且視情況其中該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎或青鱂胚胎。
40.如實施例34的方法，其中該內分泌活性干擾是雄激素活性干擾，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的雄激素敏感性啟動子，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化。
41.如實施例40的方法，其中該雄激素敏感性啟動子是spiggin啟動子，且其中該硬骨魚胚胎視情況為青鱂胚胎或斑馬魚胚胎。
42.如實施例34的方法，其中該內分泌活性干擾是甲狀腺活性干擾，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的甲狀腺激素(TH)敏感性啟動子，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化。
43.如實施例42的方法，其中該TH敏感性啟動子是促甲狀腺激素亞單位β(TSHβ)啟動子，且其中該硬骨魚胚胎視情況為青鱂胚胎或斑馬魚胚胎。
44.如實施例32的方法，其中該特定效應是異型生物質效應，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的異型生物質敏感性啟動子，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化。
45.如實施例44的方法，其中該異型生物質敏感性啟動子是P450 1A啟動子，且其中該硬骨魚胚胎視情況為青鱂胚胎或斑馬魚胚胎。
46.如實施例32的方法，其中該特定效應是異型生物質效應，且其 中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測乙氧基試鹵靈-O-脫乙基酶(EROD)活性的變化。
47.如實施例32的方法，其中該特定效應是心臟毒性效應，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測心臟發育及/或血液循環速率的改變。
48.如實施例47的方法，其中該胚胎具有可操作地連接至標記基因的BMP4啟動子，且其中檢測或量測心臟發育的改變包含監測標記基因表現。
49.如實施例47的方法，其中該胚胎具有可操作地連接至標記基因的gata1啟動子，且其中檢測或量測血液循環速率的改變包含監測標記基因表現。
50.如實施例32的方法，其中該特定效應是肝毒性效應，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測肝臟發育的變化。
51.如實施例35至45、48及49中任一實施例的方法，其中該啟動子對於該硬骨魚胚胎是天然的。
52.如實施例35至45、48及49中任一實施例的方法，其中該啟動子對於該硬骨魚胚胎並非天然的。
53.如實施例52的方法，其中該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎且該啟動子對於青鱂魚是天然的。
54.如實施例53的方法，其中該啟動子對於黑點青鱂或青鱂魚是天然的。
55.如實施例52的方法，其中該硬骨魚胚胎是青鱂胚胎，且該啟動 子對於斑馬魚是天然的。
56.如實施例55的方法，其中該青鱂胚胎是黑點青鱂胚胎或青鱂魚胚胎。
57.如實施例36至45、48、49或51至56中任一實施例的方法，其中該標記基因編碼螢光蛋白。
58.如實施例57的方法，其中該螢光蛋白是綠色螢光蛋白(GFP)、青色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(dsRFP)、螢光素酶(Luc)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、13-半乳糖苷酶(LacZ)或β-葡萄糖醛酸苷酶(Gus)。
59.如實施例36至45、48、49或51至56中任一實施例的方法，其中標記基因編碼在比色試驗中可檢測的酶。
60.如實施例59的方法，其中該酶是螢光素酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、鹼性磷酸酶、氯黴素乙醯基轉移酶或乙醇去氫酶。
61.如實施例1至60中任一實施例的方法，其是在多孔板、視情況24孔板、96孔板或384孔板中進行。
62.如實施例1至61中任一實施例的方法，其中試驗一個以上的化妝產品樣品。
63.如實施例62的方法，其中每一樣品是以一式兩份或一式三份進行試驗。
64.如實施例1至63中任一實施例的方法，其包含試驗化妝產品樣品或提取物的多個稀釋物。
儘管已說明並闡述各個特定實施例，但應瞭解，可在不背離本揭示 內容的精神及範圍下做出各種改變。
7.參考文獻引用
本申請案中所引用的所有出版物、專利、專利申請案及其他文件均出於所有目的以全文引用的方式併入本文中，其併入程度如同出於所有目的將每一個別出版物、專利、專利申請案或其他文件個別地指明以引用的方式併入一般。在本文中所併入的參考文獻的一或多者的教示與本揭示內容之間存在不一致的情形下，意欲指本說明書的教示。

Claims (15)

  1. 一種測定化妝產品中整體毒性的方法，其包含：(a)將溶劑與化妝品產品結合以得到具整體毒性的溶劑提取物；(b)將硬骨魚胚胎與a)的溶劑提取物接觸；及(c)測定該提取物是否對該胚胎具毒性作用；其中對該胚胎具毒性作用顯示化妝產品的整體毒性。
  2. 如請求項1的方法，其中該化妝產品是面膜、香水、止汗劑、除臭劑、牙膏、洗髮精、精油、卸妝劑、清潔產品、染髮劑、粉底、遮瑕膏、防曬劑、保濕劑、抗皺霜、眼影膏、眼線膏、睫毛膏、腮紅、唇膏、唇彩、指甲油、精華液、眼霜、晚霜、日霜、BB霜、夜用凝露、日用凝露、護手霜、頸霜或抗老化霜。
  3. 如請求項1或請求項2的方法，其中該化妝產品是(i)水可混溶的化妝產品或(ii)水不可混溶的化妝產品。
  4. 如請求項1的方法，其中該提取物是(i)有機溶劑提取物或(ii)有機及無機溶劑提取物。
  5. 如請求項4的方法，其中該無機溶劑是水。
  6. 如請求項4或5的方法，其中該提取物藉由包含以下的製程可獲得： (a)將該化妝產品的樣品與該有機溶劑組合以形成混合物，(b)將該混合物混合，視情況藉由渦旋及/或音波處理該混合物，(c)自該混合物分離含有該有機溶劑的相，視情況藉由離心該混合物，及(d)回收該提取物，視情況其中該提取物是為上清液或其濃縮形式。
  7. 如請求項4或5的方法，其中該提取物藉由包含以下的製程可獲得：(a)將該化妝產品的樣品與該有機溶劑及該無機溶劑組合以形成混合物，(b)將該混合物混合，視情況藉由渦旋及/或音波處理該混合物，(c)自該混合物分離含有該有機溶劑及無機溶劑的相，視情況藉由離心該混合物，及(d)回收該提取物，視情況其中該提取物是為上清液或其濃縮形式。
  8. 如請求項7的方法，其中這些有機及無機溶劑是以3：7至7：3的比率使用，視情況其中該比率是4：6或6：4。
  9. 如請求項4或5的方法，其進一步包含在步驟(a)前自該化妝產品的該樣品製備該提取物。
  10. 如請求項1或2的方法，其中該化妝品是水可混溶液體化妝產品，且其中步驟(a)包含使硬骨魚胚胎與該化妝產品的樣品接觸。
  11. 如請求項1、2、4及5中任一項的方法，其中該硬骨魚胚胎是：a)遊走期胚胎；及/或b)青鱂胚胎，視情況是轉基因青鱂胚胎；斑馬魚胚胎，視情況是 轉基因斑馬魚胚胎；或黑頭呆魚胚胎。
  12. 如請求項1、2、4及5中任一項的方法，其中該毒性效應包含：I)急性效應，其視情況包含死亡、畸形或其組合；或II)特定效應，其中該特定效應視情況為：A)內分泌活性干擾，其視情況為雌激素活性干擾、雄激素活性干擾或甲狀腺活性干擾，視情況其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的醣蛋白亞單位α(gsuα)啟動子，視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化；B)雌激素活性干擾，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的雌激素敏感性啟動子，視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化，且視情況其中：a)該雌激素敏感性啟動子是芳香酶B啟動子，且視情況其中該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎或青鱂胚胎；b)該雌激素敏感性啟動子是絨毛膜促性激素啟動子，該絨毛膜促性激素啟動子視情況為絨毛膜促性激素H啟動子或絨毛膜促性激素L啟動子，且視情況其中該硬骨魚胚胎是青鱂胚胎；或c)該雌激素敏感性啟動子是卵黃蛋白原啟動子，且視情況其中該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎或青鱂胚胎；C)雄激素活性干擾，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚 胎，其包含可操作地連接至標記基因的雄激素敏感性啟動子，視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化，且其中該雄激素敏感性啟動子是spiggin啟動子且視情況其中該硬骨魚胚胎視情況為青鱂胚胎或斑馬魚胚胎；D)甲狀腺活性干擾，其中該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的甲狀腺激素(TH)敏感性啟動子，視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化，視情況其中該TH敏感性啟動子是促甲狀腺激素亞單位β(TSHβ)啟動子，且其中該硬骨魚胚胎視情況為青鱂胚胎或斑馬魚胚胎；E)異型生物質效應，其中a)該硬骨魚胚胎是轉基因硬骨魚胚胎，其包含可操作地連接至標記基因的異型生物質敏感性啟動子，視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測該標記基因的表現的變化，視情況其中該異型生物質敏感性啟動子是P450 1A啟動子，且其中該硬骨魚胚胎視情況為青鱂胚胎或斑馬魚胚胎；或b)確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測乙氧基試鹵靈-O-脫乙基酶(ethoxyresorufin-O-deethylase,EROD)活性的變化，且視情況其中該硬骨魚胚胎是青鱂胚胎或斑馬魚胚胎；F)心臟毒性效應，視情況其中確定該樣品或該提取物是否對 該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測心臟發育及/或血液循環速率的改變，且視情況其中a)該胚胎具有可操作地連接至標記基因的BMP4啟動子，且其中檢測或量測心臟發育的改變包含監測標記基因表現；或b)該胚胎具有可操作地連接至標記基因的gata1啟動子，且其中檢測或量測血液循環速率的改變包含監測標記基因表現；或G)該特定效應是肝毒性效應，且視情況其中確定該樣品或該提取物是否對該胚胎產生毒性效應包含檢測或量測肝臟發育的變化；其中對於A至F的每一者而言，該標記基因視情況：a)編碼螢光蛋白，其視情況為綠色螢光蛋白(GFP)、青色螢光蛋白(CFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(dsRFP)、螢光素酶(Luc)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、13-半乳糖苷酶(LacZ)或β-葡萄糖醛酸苷酶(Gus)；或b)編碼可在比色試驗中檢測的酶，視情況其中該酶是螢光素酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、鹼性磷酸酶、氯黴素乙醯基轉移酶或乙醇去氫酶；且其中對於A至F的每一者而言，該啟動子：a)對於該硬骨魚胚胎是天然的；或b)對於該硬骨魚胚胎是非天然的，視情況其中：i)該硬骨魚胚胎是斑馬魚胚胎且該啟動子對於青鱂魚是天 然的，其中該青鱂魚視情況是黑點青鱂(Oryzias melastigma)或青鱂魚(Oryzias latipes)；或ii)該硬骨魚胚胎是青鱂胚胎且該啟動子對於斑馬魚是天然的，其中該青鱂胚胎視情況是黑點青鱂胚胎或青鱂魚胚胎。
  13. 如請求項1、2、4及5中任一項的方法，其中：a)該方法是在多孔板、視情況24孔板、96孔板或384孔板中進行；b)試驗一個以上的化妝產品樣品，視情況其中每一樣品是以一式兩份或一式三份進行試驗；c)該方法包含試驗化妝產品樣品或提取物的多個稀釋物；或d)(a)至(c)的任何組合。
  14. 如請求項1的方法，其中與樣品組合以形成混合物的有機溶劑的體積(例如)可為約1.5倍至約10倍樣品重量或體積。
  15. 如請求項1的方法，當該樣品為液體時，該溶劑的體積為該樣品體積的約1.5至約10倍；當該樣品為固體或半固體時，該溶劑的體積為樣品重量的約1.5至約10倍。
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