ES2341753T3 - Electroporacion controlada. - Google Patents

Abstract

Un método para realizar la electroporación de una célula biológica de una manera controlada, que comprende: (a) colocar una célula biológica en un medio eléctricamente conductor y aplicar un voltaje a través del medio; (b) detectar continuamente la proporción de la corriente eléctrica a través del medio frente al voltaje a través del medio; y (c) ajustar la magnitud del voltaje aplicado de acuerdo con cambios en la proporción de corriente frente a voltaje detectados para conseguir un grado de electroporación controlado de la célula biológica; en el que un aumento en la proporción de corriente frente a voltaje a través de una célula biológica se produce cuando la membrana celular se hace permeable debido a la formación de poros, daño celular u otros modos de formación de poros en la membrana.

Description

Electroporación controlada.

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la electroporación y transferencia de masa a través de las membranas celulares en general y al transporte de iones a través de una membrana celular en particular.

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Antecedentes de la invención

La electroporación es una técnica que se usa para introducir especies químicas en células biológicas y se realiza exponiendo las células a un potencial eléctrico que atraviesa la membrana celular. Aunque su mecanismo no se comprende por completo, se piensa que la electroporación implica la degradación de la bicapa lipídica de la membrana celular conduciendo a la formación de poros transitorios o permanentes en la membrana que permite que las especies químicas entren en la célula por difusión. El potencial eléctrico se aplica típicamente en impulsos y tanto si la formación de poros es reversible como irreversible depende de parámetros tales como la amplitud, longitud, forma y velocidad de repetición de los impulsos, además del tipo y etapa de desarrollo de la célula. Como un método de introducción de especies químicas en las células, la electroporación ofrece numerosas ventajas: es simple de usar; puede usarse para tratar poblaciones enteras de células simultáneamente; puede usarse para introducir esencialmente cualquier macromolécula en una célula; puede usarse con una amplia diversidad de líneas celulares primarias o establecidas y es particularmente eficaz con determinadas líneas celulares; y puede usarse tanto en células procariotas como eucariotas sin modificaciones o adaptaciones importantes para el tipo de célula y origen. La electroporación se usa actualmente en células en suspensión o en cultivo, así como en tejidos y órganos.

La electroporación se realiza actualmente colocando una o más células, en suspensión o en tejidos, entre dos electrodos conectados a un generador que emite impulsos de un campo eléctrico de alto voltaje. La formación de poros o permeabilización de la membrana se produce en los polos de la célula que son los sitios en las membranas celulares que orientan directamente los electrodos y por tanto los sitios en los que el potencial de transmembrana es mayor. Desgraciadamente, el grado de permeabilización que se produce en la electroporación varía con el tipo de célula y también varía entre células de una población determinada. Además, como el procedimiento se realiza en grandes poblaciones de células cuyas propiedades varían entre las células individuales en la población, las condiciones de electroporación únicamente pueden seleccionarse para tratar las cualidades promedio de la población celular; el procedimiento practicado actualmente no puede adaptarse a las características específicas de células individuales. Un asunto particular es que en determinadas condiciones, el potencial eléctrico es demasiado bajo para que una membrana celular se haga permeable, mientras que en otras condiciones la electroporación puede inducir la formación irreversible de poros y la muerte celular. Un campo eléctrico elevado, por ejemplo, puede producir así un aumento de la eficacia de transfección en una parte de una población celular causando al mismo tiempo la muerte celular en otra. Un problema adicional con los métodos de electroporación conocidos es que la eficacia de la transfección por electroporación a veces puede ser baja. En el caso del ADN, por ejemplo, para conseguir la transformación eficaz de la célula se necesita una gran cantidad de ADN en el medio circundante.

Muchos de los problemas identificados anteriormente son una consecuencia del hecho de que el proceso de electroporación tanto en células individuales como en tejidos no puede controlarse en tiempo real. Actualmente no existen medios para determinar en tiempo real cuándo una célula entra en un estado de electroporación. Como resultado, la consecuencia de un protocolo de electroporación únicamente puede determinarse mediante las consecuencias eventuales de los procesos de transferencia de masa y su efecto en la célula. Esto sucede mucho tiempo después de haberse producido la transferencia de masa bajo electroporación. La presente invención considera estos y otros defectos de los métodos actuales de electroporación.

También relevante para la presente invención son las técnicas actuales para el estudio y control de transferencia de masa a través de las membranas celulares. El conocimiento de la transferencia de masa a través de las membranas celulares en la naturaleza, tanto en células que funcionan normalmente como en células enfermas, es valioso en el estudio de determinadas enfermedades. Además, la capacidad para modificar y controlar la transferencia de masa a través de las membranas celulares es una herramienta útil para realizar investigación y terapia en la biotecnología y la medicina moderna. La introducción o eliminación de especies químicas tales como ADN o proteínas de la célula para controlar la función, fisiología o comportamiento de la célula proporcionan información valiosa con respecto a los procesos fisiológicos normales y anómalos de la célula.

El método más común para efectuar y estudiar la transferencia de masa a través de una membrana celular es poner la célula en contacto con una solución que contiene el compuesto que va a transportarse a través de la membrana, con o sin electroporación. Este método de transferencia masivo no permite controlar o medir con precisión la transferencia de masa a través de la membrana. La composición de la disolución en sitios específicos no se conoce y es variable. Además, cuando un campo eléctrico está presente, la intensidad local del campo variará de un punto al otro. Adicionalmente, la superficie de la célula que se expone a la solución no está bien definida. Las áreas superficiales celulares varían entre células en una determinada población y esto conduce a diferencias significativas entre las células en la cantidad de transferencia de masa. Debido a estas razones, la cantidad de transferencia de masa conseguida por procesos de transferencia en masa no es uniforme entre las células y la cantidad real transferida para cualquier célula particular no puede determinarse.

Hasta ahora los intentos realizados para superar las limitaciones de las técnicas de transferencia en masa incluyen técnicas para tratar células individuales que incluyen la inyección mecánica (microinyección) de los compuestos químicos a través de la membrana celular o la electroporación con microelectrodos. En las técnicas de inyección, una aguja penetra en la membrana para suministrar un agente químico, localizando la aplicación del agente químico en una región pequeña cercana al punto de inyección. Esto requiere manipular la célula con la mano humana, una técnica que es difícil de realizar, laboriosa y no reproducible fácilmente. La electroporación con microelectrodos experimenta estos problemas así como la carencia de cualquier medio para detectar el inicio de electroporación en una célula individual. La presente invención también considera estos problemas.

El documento US-A-4 946 793 describe un dispositivo para modificar membranas vesiculares y que puede usarse para modificar las mismas membranas usando el ajuste de impedancia. Vesículas tales como células se someten a múltiples impulsos cuando las células están presentes en una suspensión para modificar las membranas celulares de una manera que hace que las células sean más susceptibles a la fusión de materiales exógenos.

El documento US-A-5 134 070 describe un dispositivo y un método para cultivar células en un electrodo. Un cultivo monocapa de células se somete a un campo eléctrico y las células pueden estar presentes en un disco de cultivo que puede ser eléctricamente conductor. Se usa un electrodo metálico para someter a las células a un campo eléctrico intermitente o continuo que ayuda transfectando las células con materiales exógenos.

Sumario de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para realizar la electroporación en una célula biológica de una manera controlada, que comprende:

(a)

colocar una célula biológica en un medio eléctricamente conductor y aplicar un voltaje a través del medio;

(b)

detectar ininterrumpidamente la proporción de corriente eléctrica a través del medio frente al voltaje a través del medio; y

(c)

ajustar la magnitud del voltaje aplicado de acuerdo con cambios en la proporción de corriente frente al voltaje detectada para conseguir un grado de electroporación controlado de la célula biológica;

en el que se produce un aumento en la proporción corriente frente al voltaje a través de una célula biológica cuando la membrana celular se hace permeable debido a la formación de poros, daño celular y otros modos de formación de poros en la membrana celular.

En lo sucesivo en este documento se describen y se ilustran dispositivos, sistemas y métodos que hacen posible controlar exactamente la transferencia de material a través de una membrana celular. La información obtenida del control de la transferencia de material a través de una membrana celular puede aplicarse directamente para deducir información con respecto a la célula y/o su membrana. De manera alternativa, la información obtenida del control puede aplicarse para controlar la transferencia de material a través de la membrana celular tal como controlando la aplicación de corriente eléctrica. Los dispositivos y sistemas descritos e ilustrados hacen posible transferir moléculas cargadas y en particular especies iónicas, a través de una membrana celular y controlar exactamente que dicha transferencia suceda. Cuando se realiza la electroporación usando estos dispositivos, sistemas y métodos, la información obtenida del control de la transferencia de las partículas cargadas a través de la membrana se usa para controlar el proceso de transferencia de masa a través de una membrana celular. Específicamente, el sistema se usa para obtener mediciones y cambios de la impedancia eléctrica a través de una membrana celular mientras que las propiedades de transferencia de masa de la célula cambian por la aplicación de la corriente eléctrica. Por tanto, la información obtenida en los cambios de impedancia eléctrica producidos por la aplicación de corriente eléctrica se usa, en tiempo real, para controlar la transferencia de moléculas cargadas a través de una membrana celular.

Puede usarse un dispositivo o sistema dentro del método para transferir una amplia diversidad de materiales dentro o fuera de la célula biológica para obtener un resultado deseado. El proceso puede realizarse en una célula individual, un grupo de células, células dentro de un cultivo celular o dentro de un organismo vivo, por ejemplo, células dentro de invertebrados y vertebrados incluyen mamíferos así como plantas. Cuando el proceso se realiza en una pluralidad de células (por ejemplo, un tejido) puede usarse un proceso de formación de imágenes del tejido y ajustar la corriente eléctrica en tiempo real basándose en imágenes. Una tecnología de formación de imágenes que puede aplicarse es la tomografía de impedancia eléctrica (EIT). Esta tecnología se basa en diferencias en los atributos bioeléctricos dentro del cuerpo o un organismo (por ejemplo, un ser humano) para producir una imagen. En el método de la invención las imágenes EIT pueden usarse de la misma manera que se usa la etapa de medición cuando el proceso se realiza en una sola célula biológica. En esencia, la tecnología EIT hace posible "observar" el efecto del flujo de corriente eléctrica aumentado resultante de la electroporación proporcionando de esta manera información que puede usarse para ajustar exactamente el flujo de corriente eléctrica de manera que las membranas celulares se permeabilizan pero no se desestabilicen permanentemente.

El método puede consistir en enviar una corriente eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto por un medio eléctricamente conductor comprendiendo tejido. El tejido puede estar presente dentro de un organismo vivo tal como un vertebrado o invertebrado y específicamente incluye mamíferos y seres humanos. Después de enviar la corriente se crea una imagen del tejido en la que la imagen se basa en un parámetro eléctrico tal como la impedancia eléctrica del tejido. Usando la imagen como una guía se ajusta un parámetro eléctrico para obtener un grado deseado de electroporación de las células biológicas en el tejido. La electroporación cambiará la impedancia eléctrica y el cambio puede visualizarse en la imagen creada. El parámetro eléctrico ajustado puede ser cualquier parámetro tal como corriente, voltaje o una combinación de ambos. En una realización preferida se coloca un material en el medio eléctricamente conductor tal como inyectándose en el tejido y, basándose en la imagen, se realiza el ajuste de la corriente, de tal manera que el material se transfiere dentro de las células biológicas del tejido. La imagen creada es preferiblemente una imagen de la impedancia creada a partir de aportes de corriente conocidos y voltaje de aporte medido usando un algoritmo de reconstrucción. La imagen de la impedancia puede crearse a partir de un aporte de voltaje conocido, un aporte de corriente medido o combinación del aporte de voltaje conocido y aporte de corriente medido.

Para llevar a cabo este método un dispositivo puede incluir un medio para crear una corriente eléctrica a través de un medio eléctricamente conductor. El dispositivo adicionalmente incluye un medio para analizar un primer parámetro eléctrico del medio eléctricamente conductor para crear una imagen y un medio para ajustar un segundo parámetro eléctrico basándose en la imagen para obtener un grado de electroporación deseado de las células biológicas en el medio eléctricamente conductor. El primer parámetro eléctrico es preferiblemente la impedancia eléctrica y el segundo parámetro eléctrico se selecciona preferiblemente del grupo constituido por corriente, voltaje o una combinación de ambos. Preferiblemente la corriente se crea mediante una pluralidad de electrodos colocados alrededor de un área de tejido sobre el cual se va a realizar la electroporación.

La presente invención surge en parte del descubrimiento de que el inicio y el grado de electroporación en una célula biológica puede correlacionarse con cambios en la impedancia eléctrica (cuyo término se usa en este documento para referirse a la proporción de corriente frente a voltaje) de la célula biológica o de un medio conductor que incluye la célula biológica. Se produce un aumento en la proporción de corriente frente a voltaje a través de una célula biológica cuando la membrana celular se hace permeable debido a la formación de poros o debido al daño celular u otros modos de formación de poros en la membrana celular. Del mismo modo, se produce una disminución en la proporción de corriente frente a voltaje a través de un fluido conductor que fluye cuando se extrae fluido de una célula biológica en la región entre los electrodos en una célula eléctrica a través de flujo. Por tanto controlando la impedancia de la célula biológica o de una solución electrolítica en la que se suspende la célula, puede detectarse el momento en el que se produce la formación de poros en la membrana celular, así como el grado relativo de permeabilidad de la membrana celular debido a la formación de poros. Esta información puede usarse entonces para establecer que una célula determinada ha experimentado en realidad electroporación o para controlar el proceso de electroporación dirigiendo la selección de los parámetros eléctricos del proceso por ejemplo la magnitud del voltaje. Este descubrimiento también es útil en la electroporación simultánea de multitud de células en un cultivo celular o en vertebrados, invertebrados o plantas. Realizaciones específicas aplican la invención en mamíferos incluyendo seres humanos. El proceso proporciona una indicación directa de la ocurrencia real de electroporación y una indicación del grado de electroporación promediado de todas las células que se someten al proceso. El descubrimiento también es útil en la electroporación de tejido biológico (masas de células biológicas con membranas contiguas) por las mismas razones.

Los beneficios de este proceso incluyen un elevado nivel de control sobre el inicio y grado de electroporación, junto con un conocimiento más detallado de la ocurrencia y grado de permeabilidad creado en células individuales particulares o masas de células. Cuando se aplica a células individuales o a una sucesión de células individuales, este proceso garantiza que las células individuales se han vuelto efectivamente permeables y se han transformado efectivamente por la introducción de especies químicas. El proceso también ofrece la capacidad de aumentar la eficacia de electroporación evitando variaciones en el entorno eléctrico que destruiría algunas células teniendo al mismo tiempo un efecto insuficiente en otras.

La invención puede entenderse describiendo una sola realización que implica el uso de un dispositivo o sistema eléctrico en el cual puede colocarse una célula biológica y que contiene una barrera que dirige el flujo de corriente eléctrica y por tanto el flujo de iones a través de una trayectoria de flujo que pasa a través de la célula biológica mientras que permite sustancialmente que ninguna corriente eléctrica evite la célula biológica. En algunas de estas realizaciones, la invención implica el uso de un aparato que contiene dos cámaras retenedoras de líquido separadas por una barrera que es sustancialmente impermeable a una corriente eléctrica. La barrera contiene una abertura que es más pequeña que la célula biológica por lo que la célula biológica una vez alojada en la abertura tapará o cerrará la abertura. Para conseguir la electroporación, la célula biológica se sujeta sobre la abertura por medios mecánicos, químicos y/o bioquímicos, preferiblemente de una manera reversible de modo que la célula biológica pueda después extraerse sin dañar la célula biológica. Una vez sujeta la célula biológica sobre la abertura, se impone un voltaje entre las dos cámaras y a través de la célula biológica alojada en la abertura. El paso de corriente entre las cámaras está limitado por tanto a una trayectoria que pasa a través de la abertura y por tanto a través de la célula biológica. Controlando la relación corriente-voltaje en la célula eléctrica, se detecta el inicio de la electroporación y se controla el grado de formación de poros, para asegurar que se produce la electroporación y para prevenir la excesiva formación de poros y la muerte celular. Se facilita por tanto al usuario un conocimiento y control muy preciso del estado de y del flujo a través de la membrana celular biológica.

En otra serie de realizaciones, esta invención es útil en el transporte difusivo de especies químicas dentro o fuera de una célula biológica. En estas realizaciones, el aparato se divide de nuevo en dos cámaras separadas por una barrera y la célula biológica se aloja a través de una abertura en la barrera de tal manera que el paso de líquido alrededor de la célula de una cámara a la otra se evita sustancialmente. Una solución líquida de la especie a introducir en la célula biológica se coloca en una o en las dos cámaras. La concentración de la especie en la solución difiere de la de la célula (mayor o menor, dependiendo de si se pretende introducir o extraer la especie de la célula) o la concentración en una cámara difiere de la de la otra cámara.

En métodos preferidos de la aplicación de esta invención para el transporte difusivo, las soluciones en las dos cámaras difieren de concentración de manera que la fuerza conductora para el transporte difusivo es entre las mismas dos cámaras en lugar de entre las cámaras y el interior de la célula biológica. El seguimiento conocido y controlado de las concentraciones en cada una de las dos cámaras sobre una base periódica o continua a medida que avanza la difusión, junto con el conocimiento exacto de las dimensiones de la abertura, permite al usuario observar y controlar exactamente la proporción y cantidad de las especies que entran en la célula. El tiempo de difusión puede controlarse imponiendo cambios gradualmente en las concentraciones en cualquier cámara o en ambas cámaras, imponiendo o eliminando por lo tanto el diferencial de concentración. Una aplicación de interés particular es la combinación de este tipo de transporte difusivo de una especie química con la electroporación controlada como se describe en el párrafo anterior.

Además de ser útil en conexión con la tecnología de electroporación la presente invención puede proporcionar información valiosa con respecto a una célula o grupo de células o tejidos que contienen un grupo de células controlando la impedancia eléctrica y por lo tanto proporcionando información con respecto a la integridad de una membrana celular. Específicamente, las mediciones se realizan con respecto al movimiento de partículas cargadas a través de una membrana celular. Estas mediciones se relacionan con la cantidad de corriente eléctrica necesaria para realizar la difusión a través de una membrana celular. La información obtenida puede analizarse directamente o compararse con mediciones previas de un mismo tejido o mediciones realizadas en tejidos enfermos o normales proporcionando por lo tanto una indicación de la cantidad de cambio que se ha producido en el tejido que se mide (basándose en mediciones anteriores de los mismos tejidos) o la cantidad de varianza entre el tejido que se mide y el tejido con membranas celulares deterioradas (por ejemplo células enfermas) o una célula o tejido normal. El método se realiza de una manera similar al usado para realizar la electroporación. Sin embargo, no es necesario añadir materiales al medio que rodea a las células. El dispositivo es similar porque se divide en dos partes con un electrodo positivo en un lado y un electrodo negativo en el otro lado separados por una barrera colocándose las células a lo largo de las aberturas de la barrera de manera que se permite el paso de partículas cargadas a través de la célula y a través de la abertura en la barrera desde un electrodo al otro. La barrera impide o elimina completamente el flujo de las partículas cargadas excepto a través de las aberturas. La medición de la impedancia eléctrica entre los electrodos hace posible distinguir entre células con una membrana intacta y células con membranas deterioradas. Para realizar las mediciones con mayor precisión es posible hacer determinaciones con respecto a la integridad de una membrana celular normal en relación con a una membrana celular deteriorada (por ejemplo, enferma).

Cada una de las diversas realizaciones de esta invención puede usarse con dos o más (es decir, una pluralidad de) células biológicas simultáneamente o masas celulares tales como en tejido que puede ser en un animal o planta durante el proceso. El aparato descrito anteriormente puede adaptarse para usar con dos o más células biológicas colocando la barrera de manera que la corriente o transporte difusivo se limite a una trayectoria de flujo que pasa a través de todas las células impidiendo al mismo tiempo la circunvalación alrededor de las células. Una aplicación adicional de los conceptos de esta invención es la electroporación de las células biológicas suspendidas en un líquido fluido. Los electrodos se colocan en posiciones fijas en el canal de flujo y se impone un voltaje entre los electrodos mientras se controla la corriente que pasa entre los electrodos. Las células biológicas que entran en la región entre los electrodos disminuirán la corriente, sirviendo la impedancia como una indicación de la presencia de una o más células en la región y opcionalmente también como una señal para iniciar la aplicación de un mayor voltaje suficiente para conseguir la electroporación.

Una aplicación adicional del método de la invención es la electroporación de células biológicas presentes dentro de un tejido cuyo tejido puede estar presente dentro de un organismo vivo tal como un mamífero. Los electrodos se colocan en posiciones fijas dentro del tejido y se aplica al voltaje entre los electrodos mientras se controla la corriente que pasa entre los electrodos. Las células biológicas con membranas intactas en la región entre los electrodos aumentará la impedancia eléctrica. Por consiguiente, una medición de la impedancia eléctrica proporciona una indicación de la presencia de una o más células en la región. La electroporación disminuirá la cantidad de impedancia medida. Cuando el proceso se realiza sobre un tejido entonces la medición de la impedancia eléctrica es un promedio estadístico de las células presentes entre los electrodos.

La metodología de electroporación de la invención puede realizarse en tejidos en un organismo vivo usando una tecnología de formación de imágenes que hace posible determinar cuándo (y preferiblemente hasta que punto) se transforman las membranas celulares para permitir el flujo de corriente eléctrica a través de sus membranas. La tecnología de formación de imágenes preferida es la tomografía de impedancia eléctrica (EIT) que proporciona una imagen cambiada creada a partir de información en diferencias en atributos bio-eléctricos del tejido en el que se realiza la formación de imagen. Una imagen EIT típica se adquiere inyectando corrientes eléctricas en el cuerpo y midiendo los voltajes resultantes a través de una matriz de electrodos. Una imagen de impedancia se produce por tanto a partir de entradas de corriente conocida y los datos de voltaje medidos usando un algoritmo de reconstrucción. La EIT es particularmente apropiada para la implementación de la invención en tejidos porque realmente mapea impedancias eléctricas. Por lo tanto, la región de tejido que experimentará electroporación y en el cual, consecuentemente, la impedancia eléctrica equivalente de las células cambiará formará imágenes mediante EIT. La imagen se usa para ajustar los parámetros eléctricos (por ejemplo, flujo de corriente eléctrica) de una manera que permita que se produzca la electroporación sin dañar las membranas celulares.

Entre las ventajas que ofrece esta invención con respecto a la técnica anterior están la posibilidad de tratar células individualmente y de ajustar las condiciones de tratamiento a las necesidades de las células individuales. En realizaciones en las que se aplica voltaje, el control de la impedancia aporta al usuario conocer la presencia o ausencia de poros y mostrar el progreso de la formación de poros y si la formación irreversible de poros podría conducir a que se produzca la muerte celular.

Una ventaja del aparato de barrera y apertura es la elevada sensibilidad de la proporción de señal frente a interferencia en virtud de su restricción de la corriente con respecto a la trayectoria del flujo de corriente que pasa a través de la abertura.

Otra ventaja adicional es la capacidad del aparato y del método para integrarse en un sistema automatizado en el que la condición de cada célula se controla mediante instrumentación y las células individuales se alojan en la abertura y después se eliminan en momentos regidos por las condiciones controladas.

Un aspecto de la invención es un método de control de la electroporación de células biológicas en tiempo real ajustando un parámetro eléctrico (por ejemplo, voltaje y/o corriente) aplicado a un sistema basado en mediciones en tiempo real de cambios en la corriente detectada.

Una característica de la invención es que pueden aplicarse los conceptos generales para realizar la electroporación en una célula, en células múltiples, en un tejido o en áreas de tejidos en un animal vivo.

Una ventaja de la invención es que puede obtenerse una cantidad exacta de electroporación y evitar el daño celular controlando cualquier parámetro eléctrico determinado (por ejemplo, corriente y/o voltaje) aplicado basándose en mediciones en tiempo real de cambios en la corriente que relaciona la cantidad de electroporación a obtener.

Otra ventaja de la invención es que puede usarse para transfectar células con secuencias de nucleótidos sin necesidad de integrar las secuencias en un vector viral para el transporte, evitando de esta manera las especificidades celulares de dichos vectores.

Aún otras ventajas son que el proceso puede realizarse de manera relativamente rápida con un grado relativamente bajo de experiencia técnica.

Otra ventaja adicional es que el proceso puede usarse para transfectar células sin generar una respuesta inmune.

Aún otra ventaja es que el proceso no se limita por el tamaño del ADN (es decir, la longitud de las secuencias de ADN) y la cantidad de ADN introducido en una célula puede controlarse.

Otra característica de la invención es que pueden usarse tecnologías de formación de imagen tales como la EIT para detectar cambios en la impedancia en un volumen de células.

Otra característica de la invención es que puede usar la EIT para mapear la impedancia de un área de tejido y por lo tanto detectar cambios en la impedancia celular en un volumen de células para ajustar cualquier parámetro eléctrico determinado (por ejemplo, flujo de corriente y/o voltaje) para obtener la electroporación deseada.

Estas y otras características, ventajas, y objetos de la invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una sección transversal de un dispositivo de microdifusión útil en la práctica de la presente invención para infundir una célula biológica con una especie química sin la ayuda de una corriente eléctrica para efectuar la electroporación.

La Fig. 2 es una sección transversal de un dispositivo de microelectroporación útil en la práctica de la presente invención para conseguir la formación de poros en una célula biológica y opcionalmente para infundir la célula con una especie química con la ayuda de electroporación.

La Fig. 3a es una sección transversal longitudinal de un dispositivo de electroporación de acuerdo con esta invención, diseñado para una suspensión móvil de células biológicas.

La Fig. 3b es una sección transversal del dispositivo mostrado en la Fig. 3a.

La Fig. 4 es un gráfico de corriente frente a voltaje o una serie de experimentos de electroporación realizados usando un dispositivo de microelectroporación de estructura similar a la de la Fig. 2.

Las Figs. 5a, 5b, 5c, 5d son gráficos de corriente frente a voltaje en una serie de experimentos de electroporación adicionales realizados usando un dispositivo de microelectroporación similar al de la Fig. 2.

La Fig. 6a muestra el flujo de corriente alrededor de las células antes de la electroporación y la Fig. 6b muestra el flujo de corriente eléctrica a través de las células después (durante) la electroporación.

La Fig. 7 muestra un sistema de tomografía de impedancia eléctrica (EIT) típico para usar con la invención.

La Fig. 8a es una imagen del flujo de corriente a través de las células con electroporación irreversible y la Fig. 8b es una imagen del flujo de corriente a través de las células con electroporación reversible.

La Fig. 9a es una vista esquemática gráfica de una retícula de elementos finitos mostrando una región circular de tejido rodeada por electrodos (puntos oscuros) - - - el dominio tiene dos impedancias diferentes.

La Fig. 10 muestra esquemáticamente la configuración típica del electrodo, variables eléctricas medidas y líneas equipotenciales en un dominio circular que tiene una inclusión con una impedancia eléctrica diferente.

La Fig. 11 muestra una imagen real en la parte superior izquierda mientras que en la parte inferior derecha se muestra el mapeo de impedancia que muestra el mapeo de impedancia diferencial.

Descripción de la invención y realizaciones específicas

Antes de describir los dispositivos y métodos presentes incluyendo los métodos para realizar la electroporación, ha de entenderse que esta invención no se limita a métodos y dispositivos particulares descritos, y por tanto, por supuesto, puede variar. También ha de entenderse que la terminología usada en este documento es con el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención se limitará únicamente mediante las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre los límites superior e inferior de este intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado se incluye dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo y cada intervalo en el que cualquiera, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos menores también está incluido dentro de la invención, sometido a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o los dos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia y a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en este documento se incorporan en el mismo por referencia para divulgar y describir los métodos y/o materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones.

Debe observarse que como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "y", "el" incluye referentes plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, con respecto a "una célula biológica" incluye una pluralidad de dichas células biológicas y con respecto a "un electrodo" incluye con respecto a uno o más electrodos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, y así sucesivamente.

Las publicaciones descritas en este documento se proporcionan exclusivamente para su descripción anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo indicado en este documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no otorgue derecho a tal publicación precedente en virtud de la invención anterior. Además, los datos de publicación proporcionados podrán ser diferentes a los datos de publicación actuales que podrán necesitarse para confirmarse de manera independiente.

Definiciones

El término "electrodo" pretende significar cualquier material conductor, preferiblemente un metal, más preferiblemente un metal no corrosivo que se usa para establecer el flujo de corriente eléctrica de un electrodo a otro electrodo. "Eléctricamente conductor" significa para transmitir la corriente eléctrica que puede referirse de alguna manera, por ejemplo, a corriente o voltaje. Los electrodos se fabrican con diversos materiales eléctricamente conductores diferentes y pueden ser aleaciones o metales puros tales como cobre, oro, platino, acero, plata, cloruro de plata y aleaciones de los mismos. Adicionalmente, el electrodo puede estar compuesto por un no metal que es eléctricamente conductor tal como un material basado en silicona usado en relación con microcircuitos. Los electrodos típicos usados en electroporación de tejidos preferiblemente tienen forma de varilla, forma de placa plana o estructuras en forma de aguja hueca. Los electrodos pueden usarse para suministrar corriente eléctrica continuamente o para suministrar impulsos. Los electrodos pueden ser específicos con respecto a la aplicación y pueden estar formados por placas paralelas de acero inoxidable, cables implantados, pares de agujas y matrices de aguja. Los expertos en la materia diseñaran electrodos específicos que son particularmente útiles en relación con los resultados deseados para obtener la electroporación de acuerdo con la presente invención.

El término "tejido" significará una pluralidad de células. Las células pueden ser del mismo tipo o de diversos tipos diferentes. Estas células se organizan preferiblemente para realizar una función específica. Los tejidos incluyen tejidos presentes dentro de un organismo vivo así como tejido extraído y puede referirse a situaciones in vivo o in vitro. Adicionalmente, el tejido puede ser de cualquier organismo incluyendo plantas y animales o un tejido desarrollado usando ingeniería genética y por tanto ser de una fuente artificial. En una realización el tejido es una pluralidad de células presentes dentro de una zona distinta de un ser humano.

El término "dispositivo" y "dispositivo de electroporación" se usa de manera intercambiable en este documento para describir cualquier dispositivo que se divulga y se describe en todo el documento. El dispositivo preferible incluye un primer electrodo y un segundo electrodo en el que el primer y segundo electrodo está conectado a una fuente de electricidad para proporcionar a los electrodos carga positiva y negativa respectivamente. El dispositivo preferiblemente también incluye un medio para impedir el flujo de electricidad entre los dos electrodos excepto a través de una o más aberturas específicas. Por ejemplo el medio para impedir el flujo puede ser un material no conductor que tiene una o más aberturas en su interior en el que las aberturas se diseñan para sujetar específicamente una célula biológica o un grupo de células biológicas. Por lo tanto la corriente eléctrica debe fluir a través de la abertura y a través de las células hacia el otro electrodo. El dispositivo también incluye preferiblemente un medio para medir el flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. Los medios para medir pueden incluir un voltímetro, amperímetro o cualquier dispositivo conocido por los expertos en la materia que pueda medir el flujo de corriente eléctrica de cualquier manera. Adicionalmente, el dispositivo preferiblemente incluye un medio para ajustar la cantidad de flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. Por lo tanto el voltaje, corriente u otro parámetro deseado de flujo de corriente eléctrica pueden ajustarse específicamente basándose en el flujo medido para obtener la electroporación óptima de la célula o células colocadas entre los electrodos. Cuando se usa el término "electroporación" no significa necesariamente que el dispositivo se va a usar para transferir un compuesto tal como un fármaco o una secuencia de ADN en una célula.

Las expresiones "fuente de energía", "fuente de electricidad" y similares, se usan de manera intercambiable en este documento para describir cualquier medio para proporcionar energía eléctrica, corriente o voltaje creando por lo tanto un flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. El dispositivo preferiblemente es capaz de proporcionar un modo y amplitud controlados y puede proporcionar corriente DC (corriente continua) o corriente AC (corriente alterna) constante, proporcionar voltaje por impulso o voltaje continuo. Los dispositivos preferidos son capaces de voltaje de decaimiento exponencial, voltaje de rampa, corriente de rampa o cualquier otra combinación. Por ejemplo, puede usarse un suministro energético en combinación con una microplaca del tipo usado en relación con microprocesadores y proporcionar una amplificación de energía de alta velocidad en relación con un circuito de pared convencional que proporciona corriente alterna a 110 voltios. La forma del impulso puede generarse por un dispositivo microprocesador tal como un desarrollo informático Toshiba en un programa LabView con alimentación de salida a un amplificador de energía. Un amplio intervalo de diferentes proveedores de energía comercialmente disponibles puede proporcionar la función deseada. El potencial eléctrico suministrado para la electroporación generalmente se indica en términos de gradientes de voltaje que se crea en la región afectada que se define en unidades de V/cm creadas en el tejido. Los intervalos incluyen un intervalo de 10 V/cm a 100.000 V/cm o más preferiblemente 100 V/cm a 10.000 V/cm. Sin embargo, el intervalo es específico de la amplificación y puede extenderse fuera del intervalo para cualquier aplicación deseada. Los impulsos eléctricos varían de microsegundos a milisegundos en general. Sin embargo, dependiendo de los resultados deseados, pueden utilizarse otros intervalos de impulsos.

Invención en general

Aunque esta invención se extiende a una diversidad de estructuras, métodos y aplicaciones, esta parte de la memoria descriptiva ilustrará determinadas estructuras y métodos específicos con detalle, a partir de los cuales los conceptos de la invención se pondrán de manifiesto en su totalidad.

Para llevar a cabo el método de la invención puede usarse una amplia variedad de dispositivos y sistemas diferentes. El dispositivo debe comprender primer electrodo que tiene un primer voltaje y un segundo electrodo que tiene un segundo voltaje. Además, el dispositivo comprenderá un medio para detectar el flujo de las partículas cargadas entre los electrodos y un medio para variar la corriente eléctrica entre los electrodos basándose en los datos obtenidos por la detección de cambios en el flujo de las partículas cargadas entre los electrodos. Preferiblemente el dispositivo comprende además un componente que evita o reduce sustancialmente el flujo de las partículas cargadas entre los electrodos excepto el flujo que se produce a través de una o más células biológicas colocadas entre el primer y segundo electrodo.

Puede añadirse al medio cualquier material deseado para transferir ese material dentro de una célula que está presente en el medio. Además, la invención no incluye necesariamente una etapa de proceso de inclusión de un material en el medio que vaya a introducirse en el interior de una célula. El proceso puede realizarse simplemente para determinar cambios que se producen en una membrana celular basándose en la corriente eléctrica aplicada. Esta información puede ser valiosa para determinar características sobre la célula o grupos de células presentes en el medio y, específicamente, puede usarse para comparar información con células normales y enfermas o para determinar las diferencias entre células previamente ensayadas y las que se van a ensayar actualmente.

La primera estructura que se describirá es una célula de electroporación con un soporte interno para sujetar una sola célula biológica y una barrera interna que restringe el flujo de corriente eléctrica en la célula eléctrica a una trayectoria de flujo que pasa a través de la célula biológica. Cuando no se aplica voltaje, la estructura puede usarse sólo para transporte difusivo, sin ayuda de voltaje inducido para la formación de poros.

La configuración de la barrera y las dos cámaras en realizaciones que incluyen dos cámaras, no es crítica para la invención y puede variar ampliamente sirviendo al mismo tiempo aún para los propósitos y ventajas de la invención. Sin embargo, como las células biológicas son de tamaño microscópico, el tipo de aparato preferido para realizar esta invención en cada una de sus formas variadas es uno en el que la estructura en su conjunto y/o sus cámaras son del tamaño de microplacas electrónicas fabricadas por técnicas de microfabricación tales como las usadas en la fabricación de microplacas electrónicas. Además se prefiere que las cámaras estén construidas como cámaras de paso de flujo para permitir el paso de fluidos en flujo continuo, flujo intermitente o flujo en la dirección del usuario y para permitir cambios de concentraciones, presión y otras condiciones según sea necesario para conseguir el control restringido sobre el paso de especies a través de la membrana celular biológica. Por consiguiente, una estructura preferida y un método de fabricación del aparato son los que implican la formación del aparato en capas o plaquetas con aberturas apropiadas que forman pasos de flujo cuando las capas o plaquetas están unidas entre sí.

Las cámaras de paso de flujo ofrecen la ventaja de permitir la entrada y extracción sucesiva de células individuales de manera que pueden tratarse un gran número de células en sucesión. Las cámaras de paso de flujo también permiten el suministro de soluciones empobrecidas de soluto para mantener constantemente cuando se desee los gradientes de concentración. Una función adicional de las cámaras de paso de flujo es el aumento y disminución de la presión, una función que es útil para diversos propósitos como se describe a continuación.

El soporte para la célula biológica en esta estructura puede ser cualquier estructura que sujete la célula biológica en una posición fija y que permita el paso de corriente eléctrica. El soporte más conveniente es una abertura en la barrera. La sujeción de una célula biológica sobre la abertura sirve para cerrar, sellar o tapar la abertura, dirigiendo de esta manera el paso de la corriente eléctrica, el transporte difusivo o ambos, a través de la célula y eliminando o minimizando la filtración alrededor de la célula. Un medio mecánico conveniente para conseguir esto es imponer un diferencial de presión a través de la abertura en una dirección que presionará la célula contra la abertura. El diámetro de la abertura será menor que el de la célula y después de introducirse en el aparato la célula pasará hacia el interior de una de la dos cámaras. Aumentando la presión en la cámara en la que se encuentra la célula, o disminuyendo la presión en la otra cámara, la célula quedará presionada contra la abertura, cerrándola. Una vez completado el procedimiento, la célula se libera fácilmente de la abertura igualando las presiones en las dos cámaras o invirtiendo el diferencial de manera que la presión más elevada está en la cámara distinta a la cámara en la que se ha introducido la célula. El flujo de líquido en la cámara en la que se ha introducido la célula retirará entonces la célula de la abertura, exponiendo la abertura para otra célula.

Un método alternativo para sellar la abertura con la célula es usando un recubrimiento en la superficie de la barrera o por encima del borde de la abertura, de una sustancia que se una a la membrana celular. Como las membranas celulares biológicas están cargadas negativamente, el recubrimiento puede ser un sustrato que lleve una carga positiva, tal como polilisina, poliarginina o polihistidina. La muestra biológica puede dirigirse a la abertura por un diferencial de presión a través de la abertura y sujetarse mediante el recubrimiento. Una vez completado el procedimiento, la célula puede liberarse del recubrimiento aumentado momentáneamente el caudal del líquido en la cámara en el lado de la abertura de la célula o imponiendo un diferencial de presión inverso a través de la abertura para sacar a la célula de la abertura.

El tamaño de la abertura no es crítico para la invención siempre que la abertura exponga un área superficial suficiente en la membrana celular para conseguir el grado deseado de transferencia de masa o el paso de una corriente eléctrica o ambos, dentro de un período de tiempo controlable y económicamente razonable. El tamaño óptimo variará por tanto con las células particulares a tratar o a estudiar. En general, la abertura es preferiblemente circular o aproximadamente de forma circular y dependiendo del tamaño de la célula, preferiblemente el diámetro varía de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 micrómetros, más preferiblemente de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 50 micrómetros y más preferiblemente de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros. La barrera en la que se forma el orificio y que separa las dos cámaras preferiblemente es de un material dieléctrico rígido que es impermeable tanto al agua como a los solutos y que mantendrá un diferencial de presión suficiente para sujetar a una célula contra la abertura. Para dispositivos que se fabrican por técnicas de microfabricación, un material conveniente para la barrera es el nitruro de silicio. Otros materiales que servirán igualmente bien serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia.

Una característica adicional de las realizaciones preferidas de esta invención es el uso de aparatos fabricados con materiales transparentes. Esto permite al usuario observar el interior de la célula y los procesos de micro difusión y microelectroporación a través de un microscopio a medida que se producen.

Electroporación usada en terapia in vivo

Las técnicas de electroporación de la presente invención son útiles en relación con el tratamiento, análisis o diagnóstico de un organismo incluyendo mamíferos y seres humanos que necesitan tratamiento. En general, el tratamiento puede realizarse inyectando un material continuamente o en un bolo rápido en una zona del tejido a tratar. Los electrodos se colocan adyacentes al tejido y la corriente o voltaje se aplica y se mide continuamente para determinar cuando se obtiene el nivel deseado de electroporación haciendo posible por lo tanto transferir el material inyectado dentro de las células del tejido a tratar.

El compuesto farmacéuticamente activo que se inyecta puede ser un fármaco convencional normalmente denominado molécula pequeña o puede ser una proteína o una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. Además, la composición inyectada en el tejido puede administrarse antes, durante o incluso después de aplicar los impulsos eléctricos del dispositivo de electroporación. El objetivo global del proceso es proporcionar la abertura de poros mediante electroporación y por lo tanto introducir los compuestos en las células cuyos compuestos normalmente no penetrarían en la membrana celular. Por ejemplo, es posible introducir bleomicina o diversas construcciones de genes y/o plásmidos en las células del tejido a tratar. Esto se consigue generando potenciales y corrientes eléctricos a través de las células dentro del tejido a tratar en el que los potenciales eléctricos se generan como impulsos eléctricos. Para generar los impulsos, es preferible utilizar una pluralidad de electrodos a diferencia de un sólo electrodo.

Un ejemplo de un diseño de electrodo útil es uno que comprende dos tiras planas de acero de 10 mm de anchura y 0,6 mm de espesor. Los electrodos se separan entre sí a una distancia fija de aproximadamente 6 a 7 mm. Un segundo diseño de electrodo comprende de dos a, como mucho, ocho soportes planos de acero de 20 mm. Los electrodos están conectados a un electro impulsor PS 15. Los impulsos pueden suministrarse colocando los electrodos en la piel con el lado plano en la piel o colocando los electrodos alrededor de los tumores en la piel. El contacto con la piel puede conseguirse usando materiales convencionalmente usados en relación con electrocardiógrafos de rendimiento tal como geles o soluciones salinas electro conductoras. Para realizar el procedimiento un paciente puede recibir un impulso o una pluralidad de impulsos y preferiblemente recibe una pluralidad de impulsos. Pueden diseñarse diferentes configuraciones para realizar la electroporación del tejido dentro de un organismo tal como dentro del cuerpo de un ser humano, es decir sin aplicar electrodos fuera en la piel.

Dichas configuraciones pueden comprender matrices de agujas que comprenden una pluralidad de electrodos de aguja. Como un ejemplo los electrodos positivos y negativos pueden comprender cada uno seis o más agujas que tienen de 0,5 mm de diámetro y compuestas de acero inoxidable de 1 cm de longitud conectadas a un generador de impulsos BTX 820. Los electrodos pueden insertarse en paralelo en el tejido alrededor de las células afectadas por electroporación. Los electrodos pueden colocarse en círculos de diversos diámetros que varían de 5 mm a 1 cm. Puede usarse la proporción de electrodo voltaje en el intervalo de aproximadamente 1300 V/cm. Aunque puede suministrarse cualquier número de impulsos es preferible comenzar el proceso suministrando aproximadamente seis impulsos en intervalos de un segundo con una anchura de impulso de 100 microsegundos. La presente invención es particularmente deseable en relación con la electroporación de tejidos ya que el método puede determinar si se produce la electroporación sin usar colorantes ni marcadores para rastrear el material que se introduce dentro de la célula.

Como se muestra en las Fig. 6a y 6b la corriente eléctrica puede fluir alrededor de las células (Fig. 6a) o a través de las células (Fig. 6b) después de haberse producido la electroporación. El proceso de la invención hace posible determinar el punto en el que ocurre la transición entre lo que se muestra en la Fig. 6a y lo que ocurre en la Fig. 6b y adicionalmente hace posible impedir la ocurrencia de efectos irreversibles en las membranas celulares. Como se muestra en la Fig. 8a de la electroporación puede realizarse hasta el punto de dañar las membranas celulares dando como resultado por lo tanto a efectos irreversibles en las células. En general, esto no se desea. Sin embargo, modulando la cantidad de corriente eléctrica es posible obtener electroporación sin producir daños significativos en las membranas celulares obteniendo por lo tanto una situación reversible como se muestra en la Fig. 8b.

Como se muestra en las Fig. 6a y 6b la impedancia eléctrica creada en las células y la presente invención se refieren a determinar con precisión el grado de esta impedancia eléctrica y a ajustar la corriente para obtener los resultados deseados con respecto a la electroporación. Sin embargo, cuando una gran cantidad de células están implicadas tal como en un tejido puede ser deseable usar otros mecanismos para medir otros efectos de la corriente creando electroporación en una pluralidad de células en el tejido. La impedancia eléctrica es una medición de cómo la electricidad viaja a través de un material proporcionado. Cada material tiene una impedancia eléctrica diferente determinada por su composición eléctrica. Algunos materiales tienen elevada impedancia eléctrica y otros tienen una baja impedancia eléctrica. El tejido mamario que es maligno (canceroso) tiene una impedancia eléctrica mucho más baja (electricidad conducida mucho mejor) que la del tejido normal o un tumor benigno (no canceroso).

La impedancia es una medición del grado hasta el cual un circuito eléctrico resiste el flujo de corriente eléctrica cuando se aplica voltaje a través de sus terminales. La impedancia expresada en OHMS, es la proporción de voltaje aplicado a través de un par de terminales frente al flujo de corriente entre estas terminales. En circuitos de corriente continua (DC), la impedancia se corresponde con la resistencia. En circuitos de corriente alterna (AC), la impedancia es una función de resistencia, inductancia y capacitancia. Los inductores y condensadores acumulan voltajes que se oponen al flujo de corriente. Esta oposición se denomina reactancia, y debe combinarse con resistencia para definir la impedancia. La resistencia producida por la inductancia es proporcional a la frecuencia de la corriente alterna, mientras que la reactancia producida por capacitancia es inversamente proporcional a la frecuencia.

Los conceptos básicos descritos anteriormente se utilizan en los aspectos básicos de la presente invención y también son aplicables para describir la formación de imágenes por impedancia eléctrica denominada también tomografía de impedancia eléctrica (EIT). Debe observarse que puede usarse una diversidad de terminologías diferentes para describir la misma técnica y aquellas que incluyen la tomografía del potencial aplicado (APT). Estas tecnologías de formación de imágenes hacen posible producir imágenes basándose en la variación espacial de las propiedades eléctricas de los tejidos biológicos. Técnicas tales como APT e EIT podrían utilizarse para realizar la invención en relación a tejidos. La base física de la tomografía del potencial aplicado (APT) se basa en la medición de una distribución de potencial en una superficie de un material biológico, cuando se aplica una corriente eléctrica entre dos puntos de su superficie. Otros investigadores han utilizado la técnica y se han referido a ella como formación de imágenes de impedancia eléctrica, formación de imágenes por conductividad, tomografía de impedancia eléctrica, etc. En este documento, la tecnología se denomina generalmente EIT o tomografía de impedancia eléctrica. Por consiguiente, en el resto de la descripción la tecnología se denominará únicamente tecnología EIT y en el Ejemplo 3 más adelante se muestra un ejemplo de la misma.

Los expertos en la materia contemplarán diferentes medios de determinación de cambios en la corriente eléctrica después de leer esta descripción. Un método preferido para determinar dichos cambios cuando se realiza la invención en tejido es usar tecnología de formación de imágenes y específicamente tomografía de impedancia eléctrica (EIT) que controla y analiza diferencias en los atributos bio-eléctricos de la muestra que se va a controlar para producir una imagen. La tecnología EIT puede usarse en relación a la presente invención creando una imagen EIT y usando esta imagen para ajustar el flujo de corriente para obtener los resultados deseados. Específicamente, la imagen EIT se crea inyectando corrientes eléctricas en el tejido y midiendo los voltajes resultantes a través de una matriz de electrodo. Esto hace posible producir una imagen de impedancia a partir de entradas de corriente conocida y la medición de datos de voltaje de entrada usando un algoritmo de reconstrucción. El uso de tecnología EIT es particularmente deseado con respecto a la presente invención aplicada al tejido ya que esta formación de imágenes EIT proporciona un mapa de impedancias eléctricas. El mapa de impedancias eléctricas permite esencialmente al usuario visualizar cuándo está comenzando la electroporación. Cuando la electroporación comienza el usuario puede estabilizar la cantidad de corriente que se está aplicando y por lo tanto evitar la aplicación de demasiada corriente que produce un daño irreversible a las células como se muestra en la Fig. 8a. La tecnología EIT hace posible visualizar la zona de tejido que experimenta electroporación basándose en cambios de impedancia eléctrica equivalentes de las células dentro del tejido a controlar.

La Fig. 7 muestra una vista conceptual de un sistema EIT que se usa para realizar un proceso de la presente invención en tejido (71). Una fuente de corriente (72) se controla mediante un generador de señal (73) y se usa para dirigir una corriente eléctrica dentro de la muestra de tejido (71) a través de un par de multiplexores controlados por ordenador (74) y (75) que conducen a un amplificador diferencial (76) y a un desmodulador (77). Las señales medidas se comparan con las originales para registrar los datos de amplitud y fase para construir la imagen posterior. El ordenador de control (78) selecciona típicamente que par de electrodos inyectará corriente leyendo al mismo tiempo los voltajes del resto de electrodos. Existen varias configuraciones hardware diferentes que pueden utilizarse en relación con la presente invención.

Como se muestra en la Fig. 7 el sistema EIT se refiere generalmente a un sistema en serie debido a su fuente de corriente sencilla y amplificador de medición. Se han utilizado diversos grados de paralelismo (fuentes de corriente múltiple y amplificadores de medición de voltaje) en otros sistemas aumentando por lo tanto la flexibilidad y velocidad del sistema de inyección de corriente.

Los algoritmos de reconstrucción se usan para obtener el voltaje medido en una superficie externa de una región de interés en el cuerpo (los datos de la corriente inyectada) y la información relacionada con la geometría del electrodo y producir una imagen que representa la distribución del tejido de impedancia de tejido espacial dentro de la región del tejido (71). Existe una diversidad de métodos que pueden usarse para crear una imagen de impedancia. La formación de imágenes estática es la producción de una distribución de impedancia absoluta. Cook, R. D. et al. ACT3: a high speed, high precision electrical impedance tomography. IEEE, Trans. Biomed. Eng. 41, 713-22 (1994). Los métodos de formación de imagen diferenciales producen distribuciones basándose en diferencias entre dos conjuntos de datos. Barber, D. C. in Avances in Biomed Eng. (ed. En Benek in, W., Thevenin, V.) 165-173 (IOS Press, Amsterdam, 1995). Este tipo de técnica proporciona una imagen de cómo ha cambiado la distribución de impedancia a partir de una medición inicial. La formación imágenes de impedancia multi frecuencia se aprovecha de la dependencia de frecuencia de la impedancia del tejido. Grofhths, H. The importance of phase measurement in electrical impedance tomography. Physics in Medicine and Biololgy 32, 1435-1444 (1987). Usando la técnica diferencial anterior pueden producirse imágenes cuasi-estáticas con una imagen de baja frecuencia usada como medida inicial. Por consiguiente el sistema hace posible producir un tipo de formación de imágenes estáticas sin las dificultades de la formación de imágenes estáticas verdaderas.

Para proporcionar la reconstrucción y por tanto la imagen, se usó un modelo matemático de cómo se comporta la corriente en el tejido. En general mediante la ecuación de Poisson bien conocida se proporciona un modelo que gobierna el flujo de corriente en EIT. El tipo de análisis matemático que se necesita en la reconstrucción de imágenes EIT así como en muchas otras tecnologías médicas de formación de imágenes, pertenece a una clase general conocida como problemas de valores límite. Existen varios métodos diferentes para resolver problemas de valores límite. Sin embargo, todos estos problemas pueden clasificarse en técnicas iterativas analíticas o numéricas y los expertos en la materia pueden aplicar dichas técnicas para llevar a cabo la presente invención.

La inmensa mayoría de los algoritmos de reconstrucción actualmente en uso emplean soluciones numéricas iterativas frente a la ecuación de Poisson. La mayoría de las estrategias numéricas iterativas intentan resolver el problema de valor límite calculando una distribución de impedancia en el tejido y resolviendo reiteradamente el problema anterior (detectando el voltaje y densidades de corriente dada una distribución de impedancia) y ajustando la impedancia calculada correspondientemente hasta que el voltaje y las corrientes medidas se ajusten a las calculadas. El problema anterior debe resolverse numéricamente y se realiza habitualmente usando esquemas de elementos finitos o de diferencias finitas. El FEM (método de los elementos finitos) es un método popular y muy eficaz para solucionar los problemas anteriores y debido a esto, tiende a dominar soluciones de diseño a través de muchos campos interdisciplinarios.

En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de un aparato de microdifusión de acuerdo con esta invención para una sola célula biológica, para transportar materiales a través de la membrana sin la aplicación de un campo eléctrico. Los componentes de este aparato, desde abajo hacia arriba, son una base acrílica (11), una capa intermedia de silicio (12) (de 1 micrómetro de espesor) con una parte (13) esculpida para definir los límites laterales de la parte inferior de las dos cámaras de líquido, una capa de nitruro de silicio (14) que sirve como la barrera entre las dos cámaras, una arandela de silicio (15) que define los límites laterales de la cámara de líquido superior (16) y una placa de cubierta de vidrio (17). Un orificio (18) en la barrera de nitruro de silicio sirve como la abertura y una célula o masa de células contiguas tal como tejido (19) se muestra cubriendo el orificio. Los canales se extienden a través de la base acrílica para servir como canales de entrada y de salida para los líquidos que pasan a través de las cámaras superior e inferior como se muestra por las flechas en la Figura.

Cuando la presión en la cámara superior (16) es superior a la de la cámara inferior (13), la célula se mantendrá en posición sobre el orificio, sirviendo como un tapón para separar los líquidos en las dos cámaras entre sí. Cuando la composición de las soluciones en las dos cámaras difiere de la del interior de la célula, se produce la transferencia de masa a través de la membrana celular entre las cámaras y la célula. Cuando la composición de la solución en una cámara difiere de la de la otra, la transferencia de masa se produce a través de la célula de una cámara a la otra. Controlando con precisión las composiciones de las soluciones en las dos cámaras, puede controlarse con precisión la proporción y la dirección de la transferencia masa dentro de la célula. Como se conoce el diámetro de la abertura (18), puede determinarse con precisión la transferencia de masa que se produce a través de la abertura.

Las numerosas aplicaciones de este dispositivo de microdifusión serán fácilmente aparentes. Por ejemplo, el dispositivo puede usarse para infundir una célula con un crioconservante tal como glicerol, llenando la cámara superior (16) con solución salina fisiológica y la cámara inferior (13) con glicerol. Cuando se usa una célula (19) para la que se conoce el coeficiente de transferencia de masa del glicerol a través de la membrana, puede calcularse fácilmente la cantidad de glicerol que entrará en la célula y ajustar las concentraciones y tiempos de exposición para infundir la célula con la cantidad que se sabe que es necesaria para la crioconservación.

En la Figura 2 se muestra un ejemplo de un aparato de microelectroporación de acuerdo con esta invención para una sola célula biológica. El aparato es de construcción similar a la del aparato de microdifusión de la Figura 1. Sus componentes estructurales, de abajo hacia arriba, son una base acrílica (21), una capa de silicio inferior (22) con una parte esculpida para definir los límites laterales de la cama de líquido inferior (23), una capa de nitruro de silicio (24) (1 micrómetro de espesor) que sirve como la barrera entre las dos cámaras, una capa de silicio superior (25) que define los límites laterales de la cámara de líquido superior (26) y una cubierta constituida por una capa de n+ poli-silicio (5.000 \ring{A} de espesor) (27) y una capa de nitruro de silicio (1 micrómetro de espesor) (28). Un orificio (29) en la barrera de nitruro de silicio (24) sirve como la abertura, y una célula (30) (o masa de células) cubre el orificio. Los canales que se extienden a través de la base acrílica sirven como canales de entrada y salida para los líquidos que pasan a través de las cámaras superior e inferior, como muestran las flechas en la Figura. Una capa adicional de n+ poli-silicio
(5.000 \ring{A}) (31) se sitúa por encima de la base acrílica (21) y esta capa, junto con la capa de n+ poli-silicio (27) por encima de la cámara superior (26) sirve como los dos electrodos. Cada electrodo está unido por conducciones eléctricas a una placa de circuito impreso (32) que controla el voltaje aplicado entre los electrodos y mide la corriente que pasa entre ellos.

El aparato de microelectroporación mostrado en Fig. 2 puede fabricarse por técnicas de microfabricación convencionales, que implican típicamente la deposición química de vapor, enmascaramiento, grabado al aguafuerte y pulverización catódica. El funcionamiento del aparato será análogo al funcionamiento del aparato de microdifusión de la Fig. 1. El movimiento de las células biológicas a través del aparato se consigue suspendiendo las células en el líquido usado para llenar la cámara superior y las células se extraen de la abertura, de una en una, imponiendo un diferencial de presión entre las cámaras, que también sujeta una célula en su sitio una vez que la célula ha salido de la abertura. Un método conveniente de imposición de dicho diferencial de presión es mantener la presión atmosférica en la cámara superior mientras que se reduce la presión en la cámara inferior por debajo de la presión atmosférica uniendo una jeringa a la cámara inferior y empujando el émbolo de la jeringa. Se debe tener cuidado de limitar el diferencial de presión a uno que no dañe a la célula.

Las Figs. 3a y 3b ilustran un aparato y un método diferente dentro del ámbito de esta invención. Este aparato y método implica una suspensión de fluido de las células biológicas que fluyen a través de un conducto o canal de flujo, en el que las células pasan a través de una región entre un par de electrodos. La sección transversal longitudinal de Fig. 3a muestra las paredes (41) del canal y una célula biológica (42) pasando hacia abajo a través del lumen del canal (en la dirección de la flecha). La sección transversal de la Fig. 3b muestra que el canal es rectangular en sección transversal, aunque pueden usarse otras geometrías de sección transversal. Los electrodos (43, 44) están formados como recubrimientos en dos paredes opuestas del canal. Los electrodos están conectados a través de cables a una placa de circuito impreso (45) que mide la impedancia y controla el voltaje aplicado en los electrodos. La célula biológica (42) se muestra pasando a través de la región entre los dos electrodos.

El área de la sección transversal del canal es lo suficientemente grande para permitir que la célula lo atraviese esencialmente sin que las paredes de los canales lo obstaculicen pero a la vez lo suficientemente pequeño para que únicamente pueda pasar una célula a través de la región inter-electrodo. Además, cada electrodo (43, 44) mide aproximadamente lo mismo o ligeramente más que el diámetro de la célula biológica, de manera que la célula después de entrar en la región produce una disminución significativa o mensurable de la corriente que pasa a través de la región debido al voltaje aplicado a través de los electrodos. El espaciamiento de los electrodos, es decir, la distancia entre ellos, también está sometido a las mismas consideraciones. Las células biológicas se suspenden en una solución líquida de las especies a introducir en las células y la suspensión se hace pasar a través del canal. A medida que la suspensión fluye a través del canal se aplica un voltaje entre los electrodos y se controla la corriente entre los electrodos (o la impedancia). Una caída significativa de la corriente indica la presencia de una célula biológica en la región inter-electrodo. Una vez que la célula se detecta de esta manera, puede aplicarse un impulso de electroporación en los electrodos mientras la célula aún está en la región inter-electrodo y puede observarse la impedancia adicionalmente para detectar la aparición de electroporación. Las especies disueltas en la solución líquida entrarán en la célula como resultado de la electroporación.

Variaciones sobre estas estructuras y métodos serán fácilmente aparentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, las barreras descritas anteriormente pueden minimizarse o evitarse usando microelectrodos que tengan el mismo tamaño o menor que el de las células biológicas. Son ejemplos de dicho microelectrodos los microelectrodos de fibra de carbono (tales como ProCFE, Axon Instruments, Foster City, California, USA) usados junto con micromanipuladores de graduación elevada (tales como los disponibles de Narishige MWH-3, Tokyo, Japón). En lugar de los electrodos mostrados en la Fig. 2 o los mostrados en las Figs. 3a y 3b pueden usarse microelectrodos.

Ejemplos

Para proporcionar a los expertos en la materia una completa divulgación y descripción de cómo preparar y usar la presente invención, se incluyen los siguientes ejemplos y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni tampoco pretenden representar que los experimentos que se indican a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso mo-
lecular promedio en peso, la temperatura es en grados Centígrados y la presión es o se aproxima a la atmosférica.

Ejemplo 1

Se realizaron una serie de experimentos usando un sistema de microelectroporación constituido por un dispositivo de microelectroporación descrito anteriormente y mostrado en la Fig. 2, combinado con unidades de control de flujo y presión y manómetros para los líquidos que circulan a través de las cámaras superior e inferior, una fuente de alimentación de DC variable, un generador de impulsos y un amplificador de energía para imponer impulsos de voltaje a través del dispositivo, un osciloscopio digital para controlar los impulsos, un microscopio de fluorescencia, una cámara CCD (dispositivo de acoplamiento de carga) y un ordenador con software de procesamiento de imágenes y procesamiento de formación de ondas. Ambas cámaras del dispositivo se llenaron con solución salina fisiológica y en la cámara superior se introdujeron las células. El movimiento del líquido en las cámaras superior e inferior se controló mediante jeringas. La presión en la cámara superior era atmosférica mientras que la presión en la cámara inferior se redujo por debajo de la presión atmosférica tirando del émbolo de la jeringa conectado a esta cámara. Se aplicó el voltaje en impulsos métricos únicos variando de 0 a 120 V de magnitud y de 2 microsegundos a 100 milisegundos de duración. La distancia entre los electrodos en la cámara superior o inferior era de 900 micrómetros.

En este ejemplo los ensayos se realizaron usando células de adenocarcinoma prostáticas humanas ND-1 con un diámetro típico de 20 micrómetros. La abertura en el dispositivo de microelectroporación era de 5 micrómetros de diámetro. Se aplicó un impulso de voltaje rectangular con una duración de 60 milisegundos y se aplicó el impulsó a diversas amplitudes que variaban de 10 V a 60 V en incrementos de 5 voltios. A cada impulso, se midió la corriente eléctrica que pasaba a través de la abertura. Los experimentos se realizaron con las células y se repitieron tanto con la abertura cerrada con una perla de vidrio como sin obstruir toda la abertura. En cada caso los resultados se expresaron como microamperios de corriente frente a voltios de amplitud de impulso y se representaron en la Fig. 4, en la que la curva superior (puntos de datos representados por el eje x) representa la abertura no obstruida, la curva inferior (puntos de datos representados por asteriscos) representa los datos tomados con la perla de vidrio alojada en la abertura y las tres curvas del medio (cuadrados sin relleno, triángulos rectos sin relleno y triángulos invertidos sin relleno) representan los datos tomados con tres células ND-1 diferentes alojadas en la abertura.

La cámara superior muestra que la corriente aumenta de una manera sustancialmente continua a medida que aumenta el voltaje cuando no hay barrera para el paso de corriente a través de la abertura. La curva inferior también muestra un ascenso sustancialmente continuo a medida que aumenta el voltaje, aunque a un nivel mucho menor. Los valores de corriente mostrados en la curva inferior representan corrientes aisladas a través del dispositivo. Las curvas de los datos tomados con las células ND-1 a través de la abertura muestran que a voltajes bajos la corriente tiene un valor próximo al obtenido cuando la perla de vidrio cierra la abertura mientras a voltajes elevados la corriente asciende a los niveles obtenidos con una abertura no obstruida. La transición es un aumento brusco que es indicativo de la formación de poros en la membrana celular a través de la cual puede pasar la corriente eléctrica, es decir, el inicio de la electroporación. En las tres células, la transición se produjo a voltajes entre 30 V y 40 V. En dos de las tres células (cuadrados sin relleno y triángulos rectos sin relleno), el inicio de la electroporación se produjo esencialmente al mismo voltaje, mientras que en la tercera (triángulos invertidos), el inicio se produjo a un voltaje que era aproximadamente 5 V inferior al de las otras dos. Esto ilustra el valor del control del proceso para conseguir resultados óptimos con células individuales.

Después de generarse los datos mostrados en la Fig. 4, los impulsos se volvieron a aplicar en orden descendiente de valores de amplitud y las curvas resultantes mostraron histéresis, es decir, las curvas obtenidas con amplitudes descendientes eran de voltaje superior a las obtenidas con amplitudes ascendentes. Esto indica que la electroporación en estos experimentos era irreversible.

Ejemplo 2

Usando el mismo sistema de microelectroporación que el del Ejemplo 1, se realizó una serie de ensayos en hepatocitos de rata (ATCC #CRL-1439), cuyo diámetro típico era de 20 micrómetros, el aparato de microelectroporación tenía una abertura que tenía 4 micrómetros de diámetro. En este caso también se usaron impulsos de voltaje rectangular que tenían una duración de 60 milisegundos, variando en amplitud de 10 V a 37,5 V en incrementos de 5 V en el tramo de 10 V a 30 V y en incrementos de 2,5 V en el tramo de 30 V a 37,5 V. Los experimentos se realizaron en algunos casos únicamente aumentando las amplitudes y en otros aumentando primero, y después disminuyendo las amplitudes para evaluar la reversibilidad. Los resultados se representan en los gráficos mostrados en las Figs. 5a, 5b, 5c y 5d. En cada caso, la curva superior (puntos de datos representados por círculos) representa los datos tomados sin célula ni perla de vidrio alojada en la abertura, la curva inferior (puntos de datos representados por cuadrados) son los datos tomados con una perla de vidrio en la abertura y la curva del medio (puntos de datos representados por triángulos) son los datos tomados con un hepatocito en la abertura, usando hepatocitos diferentes para cada una de las cuatro Figuras.

En la Fig. 5a, la amplitud aumentó y no disminuyó, mostrando un voltaje de umbral de electroporación de entre 25 V y 30 V. En las Figs. 5b y 5c, la amplitud aumentó primero y después disminuyó para producir las dos curvas del medio. Aunque las curvas ascendentes y descendentes no se diferencian, son sustancialmente idénticas en cada Figura, se indica que la membrana celular en cada uno de estos dos casos se soltó después de cada impulso de voltaje y por tanto que la formación de poros era reversible. En el ensayo representado en la Fig. 5d, la célula se desintegró una vez que el voltaje superó los 37,5 V, aunque esto no se muestra en la Figura. Es significativo observar que a pesar del hecho de que se usaron los mismos tipos de células en cada una de las Figs. 5a, 5b, 5c y 5d, el voltaje del umbral de electroporación fue distinto entre las células individuales, aunque todas estaban incluidas en el intervalo de 20 V a 35. La adaptación del procedimiento para células individuales se consiguió fácilmente controlando la corriente de esta manera para observar cuando se producía el umbral de electroporación. Para conseguir el tratamiento deseado de la célula sin destruirla puede realizarse la selección óptima del tiempo de exposición, voltaje, cambios de composición en los líquidos circundantes y otros parámetros del sistema.

Los métodos descritos en este documento son herramientas útiles en el laboratorio para realizar investigaciones fundamentales sobre las propiedades de electroporación de las células biológicas y herramientas útiles en la industria para procesar grandes cantidades de células de una manera a través de flujo. Al permitir observar y registrar el flujo de corriente a través de las células individuales, se puede controlar la amplitud y duración del impulso de voltaje para conseguir resultados óptimos. Además, los dispositivos descritos y mostrados en este documento para usar en la práctica de la invención pueden construirse con partes transparentes y con un tamaño adecuado para montar sobre una pletina del microscopio. Esto permitirá correlacionar las mediciones de corriente eléctrica frente a observaciones visuales y mediciones de fluorescencia en el interior de la célula. El dispositivo puede usarse para detectar eléctricamente, a través de mediciones de corrientes, el momento en el que una célula se aloja en la abertura así como el momento en el que se consigue la formación de poros en la membrana celular. Para aplicaciones a mayor escala e industriales, pueden colocarse en paralelo gran cantidad de aparatos de microelectroporación del tipo descritos en este documento. Para cada célula, puede usarse la información eléctrica que indica el atrapamiento de una célula en la abertura (tal como una caída brusca de la corriente) para generar una señal que iniciará una secuencia de electroporación e información eléctrica adicional indicando la terminación de la electroporación (tal como un ascenso brusco de corriente) generará una señal que liberará la célula (por ejemplo eliminando o invirtiendo el diferencial de presión) y permitirá a la siguiente célula fluir a través de la abertura.

Además de usar el dispositivo y el sistema de la invención para transferir un material dentro o fuera de la célula el sistema y el dispositivo pueden usarse en un modo diagnóstico o analítico. Esto se realiza midiendo la impedancia eléctrica de una célula o células colocadas en un medio y usando la información de la impedancia eléctrica medida. Es posible deducir información relacionada con la integridad de las membranas celulares y por tanto permitir análisis. También es posible comparar la información con la información previamente obtenida en células normales o enfermas del mismo tipo y por lo tanto obtener información de diagnóstico. Por ejemplo, la impedancia eléctrica de una célula con una membrana intacta será mucho mayor que la impedancia de la misma célula con la membrana dañada. Por tanto, analíticamente el proceso puede proporcionar información con respecto a la integridad estructural de la membrana celular. Diagnósticamente el método puede proporcionar información con respecto a la integridad estructural relativa de las membranas celulares.

Ejemplo 3 Mapeo de la impedancia eléctrica de dominios electroporados

Para ilustrar la capacidad de EIT para controlar la electroporación en los tejidos se ha resuelto una simulación matemática del problema.

Para proporcionar los datos necesarios para la simulación de formación de imágenes de electroporación, se creó un tejido imaginario simulado usando primero un modelo FEM 2-D de red fina (\sim1600 nodos, \sim3100 elementos). El tejido imaginario, mostrado en la Fig. 9, consistía en un dominio de formación de imágenes circular (radio 20 mm, resistividad 500 ohm\cdotcm) para músculo con un número variable de electrodos de fuente de puntos espaciados equitativamente alrededor de la periferia. En el interior de esta región de formación de imagen, se definió una sola región electroporada conformada arbitrariamente con una resistividad diferente. Se usó un patrón de inyección de corriente de electrodo opuesto, proporcionando mediciones de voltaje independientes N(N-1)/2 en el que N es el número de electrodos. El modelo se resolvió usando los algoritmos de generación de redes adaptativas y de solución FEM disponibles en MATLAB's Partial Differential Equation Toolbox (The Mathworks Inc.).

En la Fig. 9 se muestra un ejemplo de red para la geometría proporcionada. La información del módulo imaginario permite reconstruir algoritmos que representan datos que podrían haber estado disponibles durante parte de la electroporación de un experimento, es decir corriente y voltaje en electrodos diferentes alrededor del tejido. A partir de estos datos se intentó reconstruir la imagen original del tejido que se introdujo en el modelo. (Debe observarse que se usó una corriente de inyección DC en lugar de la corriente típica AC para la EIT para simplificar el problema. La derivación e implementación de AC es una ampliación sencilla de la presentada en este documento). En la Fig. 10 se ilustra un ejemplo típico para la distribución de voltaje y corriente en el tejido imaginario durante una etapa de adquisición de datos simulada para un sistema EIT de 8 electrodos.

Los datos obtenidos del tejido imaginario se introdujeron en dos algoritmos de formación de imágenes EIT, uno usando el método del elemento finito y el segundo el método del elemento del límite para generar la imagen de impedancia. Los algoritmos usan una técnica Newton Raphson convencional para producir la imagen. La Fig. 11 compara la imagen de un dominio circular con dos impedancias eléctricas diferentes en comparación con la imagen del tejido imaginario original como se recrea con la técnica del elemento finito y con la técnica del elemento del límite.

La tomografía de impedancia eléctrica puede usarse para formar imágenes de la región electroporada en el tejido porque la EIT produce una imagen del tejido a partir de un mapa de la impedancia eléctrica del tejido y la electroporación produce cambios de la impedancia. Los electrodos para la formación de imágenes por electroporación de tejidos pueden ser diferentes a los usados para los procesos de electroporación en sí mismos o pueden ser los mismos.

Ejemplo 4 Detección eléctrica de cambios de la permeabilidad en la membrana

Como parte de la investigación sobre la electroporación celular se estudiaron las características eléctricas de las células durante la electroporación reversible e irreversible. En la electroporación reversible la célula no resultó dañada por el proceso de electroporación y la célula vuelve a sellar. En la electroporación irreversible la membrana celular resultó dañada y no vuelve a sellar. En una serie de experimentos en los que se usaron células ND-1 para medir corrientes a través de las células en las microplacas de microelectroporación se obtuvieron los resultados ilustrados en las Figs. 8a y 8b. Los resultados se obtuvieron exponiendo a las células a impulsos eléctricos con forma triangular (parte superior de la curva) en 8a y 8b. Las corrientes eléctricas que fluyen a través de las células se muestran en la curva inferior en 8a y 8b. La Fig. 8a representa una célula con electroporación irreversible y la Fig. 8b representa una célula con electroporación reversible. Puede observarse fácilmente que cuando se redujo el voltaje en la célula electroporada de manera reversible mantiene los mismos valores que durante la etapa de aumento de voltaje. Sin embargo, en el caso irreversible la corriente a través de la célula con la membrana dañada tenía una corriente superior a la de la célula intacta. Esto conduce a la conclusión de que las corrientes eléctricas que fluyen a través de las células pueden proporcionar indicaciones en los cambios de permeabilidad en la membrana en general y una medida de la integridad de la membrana celular en particular en una diversidad de situaciones y no únicamente durante la electroporación. Por ejemplo, a menudo la viabilidad celular se mide con azul tripán o con colorantes fluorescentes que penetran a través de las membranas dañadas. Estos resultados demuestran que un método alternativo para detectar células con membranas dañadas sería medir la proporción de corriente eléctrica frente a voltaje a través de la célula. De manera similar, existen compuestos, tales como ionóforos, que inducen la formación de poros en la membrana celular. La medición de la proporción corriente frente a voltaje (impedancia) a través de una membrana celular podría también detectar si estos productos químicos han dañado la membrana. Las mediciones eléctricas tendrían ventaja sobre los medios químicos para detectar el daño en la membrana celular porque producirían información inmediata. Un posible método para detectar cambios en la permeabilidad de la membrana celular y en particular en membranas celulares dañadas es usar la microplaca de electroporación como se describe para los procesos de electroporación. La medida del daño sería la diferencia entre una impedancia de la célula intacta y una impedancia de la célula dañada como se ilustra en las Figs. 8a y 8b. En los tejidos sería posible detectar células con membranas dañadas de manera similar a los métodos usados para detectar la electroporación descritos en este documento.

Claims (7)

1. Un método para realizar la electroporación de una célula biológica de una manera controlada, que comprende:

(a) colocar una célula biológica en un medio eléctricamente conductor y aplicar un voltaje a través del medio;

(b) detectar continuamente la proporción de la corriente eléctrica a través del medio frente al voltaje a través del medio; y

(c) ajustar la magnitud del voltaje aplicado de acuerdo con cambios en la proporción de corriente frente a voltaje detectados para conseguir un grado de electroporación controlado de la célula biológica;

en el que un aumento en la proporción de corriente frente a voltaje a través de una célula biológica se produce cuando la membrana celular se hace permeable debido a la formación de poros, daño celular u otros modos de formación de poros en la membrana.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la etapa (b) comprende detectar continuamente la proporción de corriente frente a voltaje como una indicación de la electroporación de la célula biológica y la etapa (c) comprende ajustar la duración del voltaje aplicado de acuerdo con la proporción de corriente frente a voltaje para conseguir una cantidad específica deseada de electroporación.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se coloca una pluralidad de células biológicas en el medio eléctricamente conductor y se establece el promedio de la proporción de corriente frente a voltaje sobre la pluralidad de las células biológicas, consiguiendo por lo tanto un grado promediado controlado de electroporación en la pluralidad de células biológicas.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se aplica voltaje entre dos microelectrodos y la célula biológica se coloca entre los microelectrodos.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en el que:

el voltaje se aplica entre dos electrodos en un canal a través de flujo, los electrodos se colocan para aplicar el voltaje en una dirección transversal para fluir a través del canal;

la etapa (a) comprende suspender la célula biológica en el medio y hacer pasar continuamente el medio a través del canal;

la etapa (b) comprende adicionalmente correlacionar la proporción de corriente frente a voltaje con la presencia de la célula biológica entre los electrodos; y

la etapa (c) comprende ajustar la magnitud del voltaje mientras la célula biológica está entre los electrodos.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende suspender una pluralidad de células biológicas en el medio eléctricamente conductor y hacer pasar continuamente el medio a través del canal de tal manera que a través de los electrodos pasa aproximadamente una célula a la vez.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la detección continuada en (b) proporciona una indicación del grado de electroporación en el tejido biológico y en el que adicionalmente el ajuste en (c) proporciona un grado de electroporación controlado en el tejido biológico.