ES2317844T3 - Procedimiento y dispositivo para controlar la electroporacion. - Google Patents

Abstract

enviar una corriente eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto por un medio eléctricamente conductor que comprende tejido; crear una imagen del tejido en el que la imagen se basa en la impedancia eléctrica del tejido; y ajustar un parámetro eléctrico basado en la imagen para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el tejido; en el que el parámetro eléctrico se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje y una combinación de corriente y voltaje.

Description

Procedimiento y dispositivo para controlar la electroporación.

Tomografía de impedancia eléctrica para controlar la electroporación.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general al campo de electroporación y transferencia de masa a través de membranas celulares y el transporte de iones a través de una membrana celular en particular.

Antecedentes de la invención

La electroporación es una técnica que se usa para introducir especies químicas en células biológicas y se realiza exponiendo las células a un potencial eléctrico que atraviesa la membrana celular. Aunque su mecanismo no se entiende completamente, se cree que la electroporación implica la degradación de la bicapa lipídica de la membrana celular conduciendo a la formación de poros transitorios o permanentes en la membrana que permiten que las especies químicas entren a la célula por difusión. El potencial eléctrico se aplica típicamente en impulsos y si la formación de poro es reversible o irreversible depende de parámetros tales como la amplitud, la longitud, la forma y la velocidad de repetición de los impulsos, además del tipo y etapa de desarrollo de la célula. Como un método para introducir especies químicas en las células, la electroporación ofrece numerosas ventajas: es sencilla de usar, se puede usar para tratar simultáneamente poblaciones enteras de células; se puede usar para introducir esencialmente cualquier macromolécula en una célula; se puede usar con una amplia diversidad de líneas celulares primarias o establecidas y es particularmente eficaz con ciertas líneas celulares y se puede usar tanto en células procariotas como eucariotas sin modificaciones o adaptaciones fundamentales al tipo y origen celular. Actualmente la electroporación se usa en células en suspensión o en cultivo, así como células en tejidos y órganos.

Actualmente la electroporación se realiza poniendo una o más células, en suspensión o en tejido, entre dos electrodos conectados a un generador que emite impulsos de un campo eléctrico de alto voltaje. La formación de poro, o permeabilización de la membrana ocurre en los polos celulares, que son los sitios de las membranas celulares que se dirigen directamente hacia los electrodos y por tanto, los sitios en los que el potencial transmembrana es más elevado. Desgraciadamente, el grado de permeabilidad que ocurre en la electroporación varía con el tipo de célula y también varía entre células en una población dada. Adicionalmente, como el procedimiento se realiza en poblaciones grandes de células cuyas propiedades varían entre las células individuales en la población, las condiciones de la electroporación sólo se pueden seleccionar para dirigirse a las cualidades promedio de la población celular; el procedimiento, como se practica actualmente, no se puede adaptar a las características específicas de células individuales. Es de particular interés que en ciertas condiciones, el potencial eléctrico es demasiado bajo para que una membrana celular se vuelva permeable, mientras que en otras condiciones la electroporación puede inducir formación de poro irreversible y muerte celular. Por ejemplo, un campo eléctrico elevado puede, por tanto, producir un aumento en la eficacia de transfección en una parte de una población celular mientras causa muerte celular en otra. Un problema adicional con los métodos conocidos de electroporación es que la eficacia de transfección por electroporación a veces puede ser baja. Por ejemplo, en el caso del ADN se necesita una gran cantidad de ADN en el medio circundante para conseguir una transformación eficaz de la célula.

Muchos de los problemas identificados anteriormente son una consecuencia del hecho de que el proceso de electroporación tanto en células individuales como en tejidos no se puede controlar en tiempo real. En el presente no existen los medios para determinar en tiempo real cuándo una célula entra en un estado de electroporación. Como resultado, el efecto de un protocolo de electroporación sólo se puede determinar por las consecuencias finales del proceso de transferencia de masa y su efecto en la célula. Esto ocurre mucho después de que ha tenido lugar la transferencia de masa por electroporación. Estas y otras deficiencias de los métodos actuales de electroporación se abordan en la presente invención.

Las técnicas actuales para el estudio y control de transferencia de masa a través de membranas celulares también son relevantes para la presente invención. El conocimiento de la transferencia de masa a través de las membranas celulares en la naturaleza, tanto en células que están funcionando normalmente como en células enfermas, es valioso en el estudio de ciertas enfermedades. Además, la capacidad de modificar y controlar la transferencia de masa a través de membranas celulares es una herramienta útil en la conducción de investigaciones y terapias en biotecnología y medicina moderna. La introducción o eliminación de especies químicas tales como ADN o proteínas de la célula para controlar la función, fisiología o comportamiento de la célula proporciona información valiosa en relación con procesos fisiológicos normales y anormales de la célula.

El método más común para lograr y estudiar la transferencia de masa a través de una membrana celular es poner la célula en contacto con una solución que contenga el compuesto que se pretende transportar a través de la membrana, con o sin electroporación. Este método de transferencia masiva no permite el control preciso o medición de la transferencia de masa a través de la membrana. La composición de la solución en sitios específicos no se conoce y es variable. Además, cuando está presente un campo eléctrico, la intensidad del campo local variará de un punto a otro. Adicionalmente, la superficie de la célula que está expuesta a la solución no está bien definida. Las áreas de superficie celular varían entre las células en una población dada y esto conduce a diferencias significativas entre las células en la cantidad de transferencia de masa. Por estas razones, la cantidad de transferencia de masa conseguida por procesos de transferencia masiva no es uniforme entre las células y la cantidad real transferida para cualquier célula particular no se puede determinar.

Los intentos realizados hasta ahora para superar las limitaciones de las técnicas de transferencia masiva incluyen técnicas para tratar células individuales que incluyen la inyección mecánica (microinyección) de compuestos químicos a través de la membrana celular o la electroporación con microelectrodos. En las técnicas de inyección, la membrana se penetra con una aguja para suministrar un agente químico, localizando la aplicación del agente químico en una pequeña región próxima al punto de inyección. Esto requiere la manipulación de la célula manualmente, una técnica que es difícil de realizar, que requiere mucho trabajo y no es fácilmente reproducible. La electroporación con microelectrodos experimenta estos problemas así como la carencia de cualquier medio para detectar el comienzo de la electroporación en una célula individual.

Schmukler, R. E.: "Impedance Spectroscopy of Biological Cells". Proceedings of the 16th Annual International Conference of the IEEE. Noviembre de 1994, Volumen 1, página A47 describe la realización de mediciones de impedancia complejas en células vivas impregnando las células en los poros de un filtro. Se usan electrodos porosos y se modifica una solución extracelular durante los experimentos de impedancia para proporcionar información adicional. Las membranas celulares se pueden someter a electroporación proporcionando un modo de estudiar la impedancia de las células vivas.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un método, que comprende las etapas de:

enviar una corriente eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto por un medio eléctricamente conductor que comprende tejido;

crear una imagen del tejido en el que la imagen se basa en la impedancia eléctrica del tejido; y

ajustar un parámetro eléctrico basado en la imagen para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el tejido;

en el que el parámetro eléctrico se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje y una combinación de corriente y voltaje.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un dispositivo, que comprende:

un medio para crear una corriente eléctrica a través de un medio eléctricamente conductor;

un medio para analizar la impedancia eléctrica del medio eléctricamente conductor para crear una imagen; y

un medio para ajustar un segundo parámetro eléctrico basado en la imagen para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el medio eléctricamente conductor;

en el que el segundo parámetro eléctrico se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje y una combinación de corriente y voltaje.

Más adelante en este documento se describen e ilustran dispositivos, sistemas y métodos que permiten supervisar con precisión el movimiento de materiales a través de una membrana celular. La información conseguida a partir de la supervisión del movimiento de materiales a través de una membrana celular se puede aplicar directamente para deducir información con respecto a la célula y/o su membrana. Alternativamente, la información obtenida de la supervisión se puede aplicar para controlar el movimiento de materiales a través de la membrana celular tal como controlando la aplicación de corriente eléctrica. Tales dispositivos y sistemas permiten mover moléculas cargadas y en particular especies iónicas, a través de una membrana celular y supervisar con precisión la aparición de las mismas. Cuando se realiza electroporación usando estos dispositivos, sistemas y métodos la información obtenida a partir de la supervisión del movimiento de las partículas cargadas a través de la membrana celular se usa para controlar el proceso de transferencia de masa a través de una membrana celular. Específicamente, el sistema se usa para obtener mediciones y cambios en la impedancia eléctrica a través de una membrana celular mientras que las propiedades de transferencia de masa de la célula cambian por la aplicación de corriente eléctrica. Por tanto, la información obtenida de los cambios de impedancia eléctrica producidos por la aplicación de corriente eléctrica se usa, en tiempo real, para controlar el movimiento de moléculas cargadas a través de una membrana celular.

Más adelante en este documento se describe un método que comprende la creación de un diferencial de carga eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto por un medio eléctricamente conductor que comprende una célula biológica. Después se mide un primer parámetro eléctrico entre el primer y segundo punto. Después se ajusta un segundo parámetro basado en la medición del primer parámetro eléctrico. El primer parámetro eléctrico puede ser cualquier parámetro tal como uno seleccionado del grupo que consiste en corriente, voltaje e impedancia eléctrica. El segundo parámetro eléctrico puede ser cualquier parámetro (igual o diferente al primer parámetro eléctrico) tal como uno seleccionado del grupo que consiste en corriente, voltaje o una combinación de corriente y voltaje.

En una realización preferida el método incluye además poner un material en el medio eléctricamente conductor y ajustar el segundo parámetro eléctrico para mover el material hacia dentro de la célula biológica. El material puesto dentro del medio eléctricamente conductor puede ser cualquier material tal como un compuesto farmacéuticamente activo o fármaco, una secuencia nucleotídica, un colorante fluorescente o un cristal que está diseñado específicamente para afectar la célula de una manera deseada. De acuerdo con el método se ajustan diversas condiciones para que el potencial eléctrico entre los dos puntos sea suficientemente elevado para causar la permeabilización de la célula. Sin embargo, las condiciones entre los dos puntos se ajustan adicionalmente para que la electroporación sea reversible y, como tal, no cause la muerte celular a menos que sea un resultado específicamente buscado.

La electroporación no se realiza con el propósito de mover material hacia dentro o hacia fuera de una célula sino para analizar la célula o grupo de células y proporcionar información o diagnóstico del tejido o individuo que contiene el tejido. En este método se crea un diferencial de carga eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto mediante un medio eléctricamente conductor que comprende una célula biológica. Después se mide un primer parámetro eléctrico entre el primer y segundo punto. Después se analiza la medición del primer parámetro eléctrico para determinar la naturaleza de la célula y, en particular, una característica de una membrana de la célula. El primer parámetro eléctrico puede ser cualquier parámetro y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje e impedancia eléctrica. Un segundo parámetro eléctrico se ajusta preferiblemente de una manera que afecte la membrana de la célula o células presentes en el medio y el segundo parámetro eléctrico es cualquier parámetro pero preferiblemente se selecciona de corriente, voltaje o una combinación de ambos.

Se describe un dispositivo que preferiblemente comprende un primer electrodo, un segundo electrodo, una fuente de electricidad que se puede conectar más adelante a los electrodos pero está presente opcionalmente cuando se comercializa el dispositivo. Además el dispositivo incluye un medio para impedir el flujo de corriente eléctrica entre el primer y segundo electrodo excepto el flujo continuo de corriente eléctrica por una vía definida. Además, el dispositivo incluye un medio para medir un parámetro eléctrico tal como corriente, voltaje o impedancia eléctrica por la vía definida y un medio para ajustar la fuente de electricidad basado en el parámetro eléctrico medido. Los medios para impedir el flujo de corriente eléctrica preferiblemente comprenden un material no conductor y una vía definida que comprende una o más aberturas, cada una con un diámetro menor que el de una célula biológica para que la célula pueda encajar en la vía definida y tener un flujo de corriente a través pero preferiblemente no alrededor de la célula.

El dispositivo y los sistemas se pueden usar en el método para mover un amplio intervalo de materiales hacia dentro o hacia fuera de la célula biológica para obtener un resultado deseado. El proceso se puede realizar en una célula individual, un grupo de células, células dentro de un cultivo celular o dentro de un organismo vivo, por ejemplo, células en invertebrados y vertebrados incluyendo mamíferos así como también en plantas. Cuando se realiza el proceso en una pluralidad de células (por ejemplo, en un tejido) se puede usar un proceso para formar imágenes del tejido y ajustar la corriente eléctrica en tiempo real basado en imágenes. Una tecnología de formación de imágenes que se puede aplicar es la tomografía de impedancia eléctrica (EIT). Esta tecnología depende de las diferencias de los atributos bioeléctricos dentro del cuerpo o de un organismo (por ejemplo, un ser humano) para producir una imagen. En el método se pueden usar imágenes de EIT de la misma manera que la etapa de medición se usa cuando el proceso se realiza en una única célula biológica. En esencia, la tecnología de EIT permite "ver" el efecto del flujo de corriente eléctrica aumentado que se produce como resultado de la electroporación proporcionando de ese modo información que se puede usar para ajustar con precisión el flujo de corriente eléctrica para que las membranas celulares se permeabilicen sin alterarse permanentemente.

El método de la invención comprende enviar una corriente eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto por un medio eléctricamente conductor que comprende tejido. Después de que se envía la corriente se crea una imagen del tejido donde la imagen se basa en un parámetro eléctrico tal como la impedancia eléctrica del tejido. Usando la imagen como una guía, se ajusta un parámetro eléctrico para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el tejido. La electroporación cambiará la impedancia eléctrica y ese cambio se puede visualizar en la imagen creada. El parámetro eléctrico ajustado se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje o una combinación de ambos. En una realización preferida se pone un material en el medio eléctricamente conductor tal como inyectándolo en el tejido y se realiza el ajuste de la corriente, basado en la imagen, de una manera que mueva el material hacia dentro de las células biológicas del tejido. La imagen creada es preferiblemente una imagen de impedancia creada a partir de entradas de corriente conocidas y voltaje de entrada medido usando un algoritmo de reconstrucción. La imagen de impedancia se puede crear a partir de una entrada de voltaje conocida, una entrada de corriente medida o la combinación de la entrada de voltaje conocida y la entrada de corriente medida.

Otro aspecto de la invención es un dispositivo para realizar este método cuyo dispositivo incluye un medio para crear una corriente eléctrica a través de un medio eléctricamente conductor. Además, el dispositivo incluye un medio para analizar la impedancia eléctrica del medio eléctricamente conductor para crear una imagen y un medio para ajustar un segundo parámetro eléctrico basado en la imagen para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el medio eléctricamente conductor. El segundo parámetro eléctrico se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje o una combinación de ambos. La corriente se crea preferiblemente mediante una pluralidad de electrodos colocados alrededor de un área de tejido sobre la que se realizará la electroporación.

La presente invención surge en parte de la observación de que el comienzo y el alcance de la electroporación en una célula biológica se puede relacionar con cambios en la impedancia eléctrica (cuya expresión se usa en este documento para referirse a la proporción de corriente a voltaje) de la célula biológica o de un medio conductor que incluye la célula biológica. Cuando la membrana celular se vuelve permeable debido a la formación de poro o por el daño celular u otros modos de formación de poros en la membrana celular, ocurre un aumento de la proporción de corriente a voltaje a través de una célula biológica. Análogamente, cuando el fluido atrae una célula biológica a la región entre los electrodos en una celda eléctrica de flujo continuo ocurre una disminución de la proporción de corriente a voltaje a través de un líquido conductor que está fluyendo. Por tanto, mediante la supervisión de la impedancia de la célula biológica o de una solución de electrolito en la que está suspendida la célula, se puede detectar el punto en el tiempo en el que ocurre la formación de poro en la membrana celular, así como el grado relativo de permeabilidad de la membrana celular debido a la formación de poro. Después se puede usar esta información para establecer que una célula dada ha, de hecho, experimentado electroporación o para controlar el proceso de electroporación dirigiendo la selección de los parámetros eléctricos del proceso, por ejemplo, la magnitud de voltaje. Esta observación también es útil en la electroporación simultánea de multitud de células en un cultivo celular o en vertebrados, invertebrados o plantas. Las realizaciones específicas aplican la invención a mamíferos incluyendo seres humanos. El proceso proporciona un indicio directo de la aparición real de electroporación y un indicio del grado de electroporación promedio de todas las células que se están sometiendo al proceso. Análogamente, la descripción es útil en la electroporación de tejido biológico (masas de células biológicas con membranas continuas) por las mismas razones.

Los beneficios de este proceso incluyen un nivel elevado de control sobre el comienzo y el grado de electroporación, junto con un conocimiento más detallado de la aparición y grado de permeabilidad creado en células individuales particulares o masas celulares. Cuando se aplica a células individuales o a una serie de células individuales, este proceso asegura que las células individuales se vuelvan de hecho permeables y se transformen de hecho mediante la introducción de especies químicas. El proceso también ofrece la capacidad de aumentar la eficacia de la electroporación evitando variaciones en el entorno eléctrico que destruirían algunas células mientras que tendrían un efecto insuficiente sobre otras.

La invención se puede entender describiendo una realización sencilla que implica el uso de un dispositivo o sistema eléctrico en el que se puede poner una célula biológica y que contiene una barrera que dirige el flujo de corriente eléctrica y, por lo tanto, el flujo de iones a través de una vía de flujo que pasa a través de la célula biológica mientras que no permite sustancialmente que la corriente eléctrica se desvíe de la célula biológica. En algunas de estas realizaciones, la invención implica el uso de un aparato que contiene dos cámaras de retención de líquido separadas por una barrera que es sustancialmente impermeable a una corriente eléctrica. La barrera contiene una abertura que es más pequeña que la célula biológica para que la célula biológica tapone o cierre la abertura una vez que se aloje en la abertura. Para conseguir la electroporación, la célula biológica se asegura en la abertura por medios mecánicos, químicos y/o bioquímicos, preferiblemente de una manera reversible para que la célula biológica se pueda retirar más tarde sin daño a la célula biológica. Una vez que la célula biológica se ha asegurado en la abertura, se aplica un voltaje entre las dos cámaras y a través de la célula biológica que reside en la abertura. De este modo, el paso de corriente entre las cámaras se limita a una vía que pasa a través de la abertura y, por lo tanto, a través de la célula biológica. Mediante la supervisión de la relación corriente-voltaje en la celda eléctrica, se detecta el comienzo de la electroporación y se controla el grado de formación de poro, tanto para asegurar que la electroporación esté sucediendo como para evitar la formación de poro excesiva y la muerte celular. Por tanto, se proporciona un conocimiento altamente preciso al usuario y control del estado de y el flujo a través de la membrana celular biológica.

En otra serie de realizaciones, esta invención es útil en el transporte difusivo de especies químicas hacia dentro o hacia fuera de una célula biológica. En estas realizaciones, la celda se divide de nuevo en dos cámaras separadas por una barrera y la célula biológica se introduce a través de una abertura en la barrera de tal manera que se evite sustancialmente el paso de líquido alrededor de la célula de una cámara a otra. Se pone una solución líquida de las especies que se tienen que introducir en la célula biológica en una o ambas cámaras. La concentración de las especies en la solución difiere de la de la célula (más elevada o más baja, dependiendo de si se busca introducir o retirar las especies de la célula) o la concentración en una cámara difiere de la de la otra cámara.

En métodos preferidos para aplicar esta invención al transporte difusivo, las soluciones en las dos cámaras tienen concentraciones diferentes para que la fuerza accionadora del transporte difusivo esté entre las dos cámaras en lugar de entre las cámaras y el interior de la célula biológica. El conocimiento y la supervisión controlada de las concentraciones en cada una de las dos cámaras de una forma periódica o continua a medida que transcurre la difusión, junto con el conocimiento preciso de las dimensiones de la abertura, permite al usuario observar y controlar con precisión la proporción y cantidad de las especies que entran a la célula. El tiempo de difusión se puede controlar aplicando cambios graduales en las concentraciones en cualquiera o ambas cámaras, aplicando o retirando de ese modo el diferencial de concentración. Una aplicación de interés particular es la combinación de este tipo de transporte difusivo de una especie química con electroporación controlada como se ha descrito en el anterior párrafo.

Además de ser útil en relación con la tecnología de electroporación la presente invención puede proporcionar información valiosa en relación a una célula o grupo de células o tejido que contiene un grupo de células supervisando la impedancia eléctrica y de ese modo proporcionando información con respecto a la integridad de una membrana celular. Específicamente, se realizan mediciones con respecto al movimiento de partículas cargadas a través de una membrana celular. Estas mediciones están relacionadas con la cantidad de corriente eléctrica requerida para realizar la difusión a través de una membrana celular. La información obtenida se puede analizar directamente o en comparación con mediciones previas de un mismo tejido o mediciones realizadas en tejido enfermo o normal proporcionando, de ese modo, un indicio de la cantidad de cambio que ha ocurrido en el tejido que se está midiendo (basado en mediciones anteriores de los mismos tejidos) o la cantidad de variación entre el tejido que se está midiendo y tejido con membranas celulares alteradas (por ejemplo, células enfermas) o una célula o tejido normal. El método se realiza de una manera similar a la que se usa para conducir la electroporación. Sin embargo, no se necesita añadir material al medio que rodea las células. El dispositivo es similar en que está dividido en dos partes con un electrodo positivo en un lado y un electrodo negativo en otro lado separados por una barrera, con las células colocadas a lo largo de aberturas en la barrera de una manera que deje pasar partículas cargadas a través de la célula y a través de la abertura en la barrera de un electrodo a otro. La barrera obstaculiza o elimina completamente el flujo de partículas cargadas excepto a través de las aberturas. La medición de la impedancia eléctrica entre los electrodos permite distinguir entre células con una membrana intacta y células con membranas alteradas. Realizando las mediciones con mayor precisión es posible hacer determinaciones con respecto a la integridad de una membrana celular normal en relación con una membrana celular alterada (por ejemplo, enferma).

Cada una de las diversas realizaciones de esta invención se puede usar con dos o más (es decir, una pluralidad de) células biológicas simultáneamente o masas celulares tales como en tejido que puede estar en un animal o planta durante el proceso. El aparato descrito anteriormente se puede adaptar para usarse con dos o más células biológicas disponiendo la barrera para limitar el transporte de corriente o difusivo, a una vía de flujo que pasa a través de todas las células mientras evita la desviación alrededor de las células. Una aplicación adicional de los conceptos de esta invención es la electroporación de células biológicas suspendidas en un líquido fluido. Los electrodos se ponen en posiciones fijas en el canal de flujo y se aplica un voltaje entre los electrodos mientras se supervisa el paso de corriente entre los electrodos. Las células biológicas que entran a la región entre los electrodos disminuirán la corriente, sirviendo la impedancia como un indicio de la presencia de una o más células en la región y, opcionalmente, también como una señal para iniciar la aplicación de un voltaje más elevado suficiente para conseguir la electroporación.

Una aplicación adicional del dispositivo, sistema y método de la invención es la electroporación de células biológicas presentes en un tejido cuyo tejido puede estar presente en un organismo vivo tal como un mamífero. Los electrodos se ponen en posiciones fijas en el tejido y se aplica voltaje entre los electrodos mientras se supervisa el paso de corriente entre los electrodos. Las células biológicas con membranas intactas en la región entre los electrodos aumentarán la impedancia eléctrica. En consecuencia, una medición de la impedancia eléctrica proporciona un indicio de la presencia de una o más células en la región. La electroporación disminuirá la cantidad de impedancia medida. Cuando el proceso se realiza en un tejido la medición de impedancia eléctrica es un promedio estadístico de las células presentes entre los electrodos.

La metodología de electroporación de la invención se puede realizar en tejido en un organismo vivo usando una tecnología de formación de imágenes que permita determinar cuándo (y preferiblemente hasta cierto alcance el grado) se transforman las membranas celulares para permitir el flujo de corriente eléctrica a través de sus membranas. La tecnología de formación de imágenes preferida es la tomografía de impedancia eléctrica (EIT) que proporciona una imagen cambiante creada a partir de información de las diferencias en los atributos bioeléctricos del tejido del que se forman las imágenes. Una imagen de EIT típica se obtiene inyectando corrientes eléctricas en el cuerpo y midiendo los voltajes resultantes a través de una serie de electrodos. Después se produce una imagen de impedancia a partir de las entradas de corriente conocidas y los datos de voltaje medidos usando un algoritmo de reconstrucción. La EIT es particularmente apropiada para la puesta en práctica de la invención en tejido porque realmente cartografía impedancias eléctricas. Por lo tanto, se formarán imágenes mediante EIT de la región de tejido que experimentará la electroporación y en donde, por consiguiente, cambiará la impedancia eléctrica equivalente de las células. La imagen se usa para ajustar los parámetros eléctricos (por ejemplo, flujo de corriente eléctrica) de una manera que permita que ocurra la electroporación sin dañar las membranas celulares.

Entre las ventajas que esta invención ofrece en relación con la técnica anterior están la capacidad de tratar células individualmente y adaptar las condiciones de tratamiento a las necesidades de células individuales. En las realizaciones en las que se aplica voltaje, la supervisión de la impedancia proporciona al usuario conocimiento de la presencia o ausencia de poros y muestra el desarrollo de la formación de poro y si ha ocurrido formación de poro irreversible que pueda conducir a muerte celular.

Una ventaja del aparato de barrera y abertura es la elevada sensibilidad de la proporción de señal a ruido debido a la limitación de la corriente a una vía de flujo de corriente que pasa a través de la abertura.

Todavía otra ventaja adicional es la capacidad del aparato y el método de integrarse en un sistema automático mediante el cual se supervisa el estado de cada célula por instrumentación y las células individuales se alojan en la abertura y después se retiran en momentos determinados por las condiciones supervisadas.

Un aspecto de la invención es un método para controlar la electroporación de células biológicas en tiempo real mediante el ajuste de un parámetro eléctrico (por ejemplo, voltaje y/o corriente) aplicado a un sistema basado en mediciones en tiempo real de los cambios detectados en la corriente.

Un elemento de la invención es que los conceptos generales se pueden aplicar para realizar electroporación en una célula, en múltiples células, en un tejido o áreas de tejidos en un animal vivo.

Una ventaja de la invención es que se puede obtener una cantidad precisa de electroporación y evitar el daño celular controlando cualquier parámetro eléctrico dado (por ejemplo, corriente y/o voltaje) aplicado basado en mediciones en tiempo real de los cambios en la corriente que se relaciona con la cantidad de electroporación que se obtiene.

Otra ventaja de la invención es que se puede usar para transfectar células con secuencias nucleotídicas sin la necesidad de empaquetar las secuencias en un vector viral para suministro, evitando de ese modo las especificaciones celulares de tales vectores.

Todavía otras ventajas son que los procesos se pueden realizar relativamente rápidamente con un grado relativamente bajo de conocimientos técnicos.

Aún otra ventaja es que el proceso se puede usar para transfectar células sin generar una respuesta inmune.

Todavía otra ventaja es que el proceso no está limitado por el tamaño del ADN (es decir, la longitud de las secuencias de ADN) y se puede controlar la cantidad de ADN que se introduce en una célula.

Otro elemento de la invención es que las tecnologías de formación de imágenes tales como EIT se pueden usar para detectar cambios en la impedancia en un volumen de células.

Otro elemento de la invención es que puede usar EIT para cartografiar la impedancia de un área de tejido y de ese modo detectar cambios en la impedancia celular en un volumen de células para ajustar cualquier parámetro eléctrico dado (por ejemplo, flujo de corriente y/o voltaje) para obtener la electroporación deseada.

Estos y otros elementos, ventajas y objetos de la invención se entenderán mejor a partir de la siguiente descripción.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una sección transversal de un dispositivo de microdifusión útil en la práctica de la presente invención para infundir una especie química a una célula biológica sin la ayuda de una corriente eléctrica para efectuar electroporación.

La Figura 2 es una sección transversal de un dispositivo de microelectroporación útil en la práctica de la presente invención para conseguir formación de poro en una célula biológica y opcionalmente, para infundir una especie química a la célula con la ayuda de electroporación.

La Figura 3a es una sección transversal longitudinal de un dispositivo de electroporación de acuerdo con esta invención, diseñado para una suspensión móvil de células biológicas. La Figura 3b es una sección transversal longitudinal del dispositivo mostrado en la Figura 3a.

La Figura 4 es una representación de corriente frente a voltaje en una serie de experimentos de electroporación conducidos usando un dispositivo de microelectroporación de estructura similar al de la Figura 2.

Las Figuras 5a, 5b, 5c y 5d son representaciones de corriente frente a voltaje en una serie de experimentos de electroporación adicionales conducidos usando un dispositivo de microelectroporación de estructura similar al de la Figura 2.

La Figura 6a muestra el flujo de corriente alrededor de las células antes de la electroporación y la Figura 6b muestra el flujo de corriente eléctrica a través de las células después de (durante) la electroporación.

La Figura 7 muestra un sistema típico de tomografía de impedancia eléctrica (EIT) para uso con la invención.

La Figura 8a es una imagen del flujo de corriente a través de células con electroporación irreversible y la Figura 8b es una imagen del flujo de corriente a través de células con electroporación reversible.

La Figura 9 es una vista esquemática gráfica de una malla de elementos finitos que muestra una región circular de tejido rodeada por electrodos (puntos oscuros) --- el dominio tiene dos impedancias diferentes.

La Figura 10 muestra esquemáticamente una configuración típica de electrodo, variables eléctricas medidas y líneas equipotenciales en un dominio circular que tiene una inclusión con una impedancia eléctrica diferente.

La Figura 11 muestra una imagen real en la parte superior izquierda mientras que la cartografía de impedancia se muestra en la parte inferior derecha que muestra cartografía de impedancia diferencial.

Descripción de la invención y realizaciones específicas

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que también se describe específicamente cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo, entre los límites superiores e inferiores de ese intervalo. La invención abarca cada intervalo más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o intermedio en el intervalo indicado. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir o excluir independientemente en el intervalo y la invención también abarca cada intervalo en el que se incluye alguno, ninguno o ambos límites en los intervalos más pequeños, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen alguno o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un especialista en la técnica a quien pertenece esta invención. Aunque se puede usar cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en este documento se incorporan en este documento como referencia para exponer y describir los métodos y/o materiales en relación con las citadas en las publicaciones.

Se tiene que indicar que como se usan en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "y" y "el" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula biológica" incluye una pluralidad de tales células biológicas y la referencia a "un electrodo" incluye la referencia a uno o más electrodos y equivalentes de los mismos conocidos por los especialistas en la técnica y así sucesivamente.

Las publicaciones que se abordan en este documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento se debe interpretar como un reconocimiento de que la presente invención no da derecho a antedatar tal publicación debido a una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden requerir independientemente su confirmación.

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Definiciones

El término "electrodo" tiene por objeto referirse a cualquier material conductor, preferiblemente un metal, lo más preferible es que sea un metal no corrosivo que se use para establecer el flujo de corriente eléctrica de ese electrodo a otro electrodo. "Eléctricamente conductor" significa para transmitir corriente eléctrica a la que se puede referir de cualquier manera, por ejemplo, corriente o voltaje. Los electrodos están hechos de una diversidad de materiales eléctricamente conductores diferentes y pueden ser aleaciones o metales puros tales como cobre, oro, platino, acero, plata, cloruro de plata y aleaciones de los mismos. Además, el electrodo puede comprender un no metal que sea eléctricamente conductor tal como un material basado en silicio usado en relación con microcircuitos. Los electrodos típicos usados en electroporación de tejido son preferiblemente estructuras en forma de barra, en forma de placa plana o en forma de aguja hueca. Los electrodos se pueden usar para suministrar continuamente corriente eléctrica o para suministrar impulsos. Los electrodos pueden ser de aplicación muy específica y estar comprendidos de placas de acero inoxidable paralelas, cables implantados, pares de agujas y series de agujas. Los especialistas en la técnica diseñarán electrodos específicos que sean particularmente útiles con respecto a los resultados deseados para obtener electroporación de acuerdo con la presente invención.

El término "tejido" significará una pluralidad de células. Las células pueden ser del mismo tipo o de varios tipos diferentes. Estas células se organizan preferiblemente para realizar una función específica. El tejido incluye tejido presente en un organismo vivo así como tejido retirado y se puede referir a situaciones in vivo o in vitro. Además, el tejido puede ser de cualquier organismo incluyendo plantas y animales o un tejido desarrollado usando ingeniería genética y por tanto ser de una fuente artificial. En una realización el tejido es una pluralidad de células presente en un área definida de un ser humano.

El término "dispositivo" y la expresión "dispositivo de electroporación" se usan de manera intercambiable para describir cualquier dispositivo como se expone y describe en todo este documento. El dispositivo preferiblemente incluye un primer electrodo y un segundo electrodo donde el primer y segundo electrodos están conectados a una fuente de electricidad de una manera para proporcionar a los electrodos cargas positiva y negativa respectivamente. El dispositivo también incluye preferiblemente un medio para obstaculizar el flujo de electricidad entre los dos electrodos excepto a través de una o más aberturas específicas. Por ejemplo, el medio para obstaculizar el flujo puede ser un material no conductor que tenga una o más aberturas en el mismo en el que las aberturas estén diseñadas para sostener específicamente una célula biológica o grupo de células biológicas. De ese modo, la corriente eléctrica tiene que fluir a través de la abertura y a través de las células hasta el otro electrodo. El dispositivo también incluye preferiblemente un medio para medir el flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. El medio de medición puede incluir un voltímetro, un amperímetro o cualquier dispositivo conocido por los especialistas en la técnica que sea capaz de medir el flujo de corriente eléctrica de cualquier manera. Además, el dispositivo incluye preferiblemente un medio para ajustar la cantidad de flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. De ese modo el voltaje, la corriente u otro parámetro deseado de flujo de corriente eléctrica se puede ajustar específicamente basado en el flujo medido para obtener una electroporación óptima de la célula o células colocadas entre los electrodos. Cuando se usa el término "electroporación" no significa necesariamente que el dispositivo se está usando para mover un compuesto tal como un fármaco o secuencia de ADN hacia una célula.

Las expresiones "fuente de alimentación", "fuente de electricidad" y similares, se usan de manera intercambiable en este documento para describir cualquier medio para proporcionar energía eléctrica, corriente o voltaje creando de ese modo un flujo de corriente eléctrica entre los electrodos. Preferiblemente el dispositivo es capaz de proporcionar un modo y amplitud controlado y puede proporcionar corriente DC o corriente AC constante y proporcionar voltaje por impulsos o voltaje continuo. Los dispositivos preferidos son capaces de provocar la caída exponencial del voltaje, del voltaje de rampa, de la corriente de rampa o cualquier otra combinación. Por ejemplo, se puede usar un suministro eléctrico en combinación con un chip del tipo usado en relación con microprocesadores y proporcionar amplificación de potencia de alta velocidad en relación con un circuito de pared convencional proporcionando corriente alterna a 110 voltios. La forma del impulso se puede generar mediante un dispositivo microprocesador tal como un ordenador portátil Toshiba funcionando con un programa Lab View suministrando la potencia de salida a un amplificador de potencia. Un amplio intervalo de suministros eléctricos disponibles en el mercado puede proporcionar la función deseada. El potencial eléctrico suministrado para la electroporación habitualmente se indica en términos de los gradientes de voltaje que se desarrollan en la región afectada que se define en unidades de v/cm desarrollado en el tejido. Los intervalos incluyen un intervalo de 10 v/cm hasta 100.000 v/cm o más preferiblemente de 100 v/cm a 10.000 v/cm. Sin embargo, el intervalo es específico para la amplificación y se puede prolongar fuera del intervalo para cualquier aplicación deseada. Los impulsos eléctricos varían en general de microsegundos a milisegundos. Sin embargo, se pueden utilizar otros intervalos de pulsación dependiendo de los resultados deseados.

Invención en general

Aunque esta invención abarca una diversidad de estructuras, métodos y aplicaciones, esta parte de la memoria descriptiva ilustrará ciertas estructuras y métodos específicos con detalle, a partir de los cuales se harán aparentes los conceptos de la invención en su totalidad.

Se puede usar un amplio intervalo de dispositivos y sistemas diferentes para realizar el método de la invención. El dispositivo tiene que comprender un primer electrodo que tenga un primer voltaje y un segundo electrodo que tenga un segundo voltaje. Además, el dispositivo comprenderá un medio para detectar el flujo de partículas cargadas entre los electrodos y un medio para variar la corriente eléctrica entre los electrodos en base a los datos obtenidos mediante la detección de cambios en el flujo de partículas cargadas entre los electrodos. El dispositivo comprende además los medios para analizar la impedancia eléctrica del medio eléctricamente conductor para crear una imagen. Preferiblemente el dispositivo comprende además un componente que evita o reduce sustancialmente el flujo de partículas cargadas entre los electrodos excepto el flujo que ocurre a través de una o más células biológicas colocadas entre el primer y segundo electrodo.

Se puede añadir cualquier material deseado al medio para mover ese material hacia una célula que esté presente en el medio. Además, la invención no incluye necesariamente una etapa de proceso de inclusión de un material en el medio que se tenga que traer hacia una célula. El proceso se puede realizar simplemente para determinar los cambios que ocurren en una membrana celular en base a la corriente eléctrica aplicada. Esa información puede ser valiosa para determinar características acerca de la célula o grupo de células presentes en el medio y, específicamente, se puede usar para comparar con información de células normales y enfermas o para determinar las diferencias entre las células ensayadas previamente y las que se están ensayando actualmente.

La primera estructura que se tratará es una celda de electroporación con un soporte interno para sostener una única célula biológica y una barrera interna que limite el flujo de corriente eléctrica en la celda eléctrica a una vía de flujo que pase a través de la célula biológica. Cuando no se aplica voltaje, la estructura se puede usar para transporte difusivo solamente, sin ayuda de formación de poro inducida por voltaje.

La configuración de la barrera y las dos cámaras en realizaciones que incluyen dos cámaras, no es crítica para la invención y puede variar ampliamente mientras continúa sirviendo a los propósitos y ventajas de la invención. Sin embargo, ya que las células biológicas son de tamaño microscópico el tipo de aparato preferido para la práctica de esta invención en cada una de sus diversas formas es uno en el que la estructura en su totalidad y/o sus cámaras sean del tamaño de chips electrónicos, fabricados mediante técnicas de microfabricación tales como las usadas en la fabricación de chips electrónicos. Además, se prefiere que las cámaras se construyan como cámaras de flujo continuo para permitir el paso de los líquidos en flujo continuo, flujo intermitente o flujo en la dirección del usuario y para permitir cambios en las concentraciones, presión y otras condiciones según sea necesario para conseguir control estricto sobre el paso de especies a través de la membrana celular biológica. Por consiguiente, una estructura y método preferido de fabricación del aparato son los que implican la formación del aparato en capas o plaquetas con aberturas apropiadas que forman conductos de flujo cuando las capas o plaquetas se unen entre sí.

Las cámaras de flujo continuo ofrecen la ventaja de permitir la entrada y eliminación de células individuales consecutivamente para que se pueda tratar un gran número de células en serie. Las cámaras de flujo continuo también permiten el abastecimiento de soluciones pobres en soluto para que los gradientes de concentración se puedan mantener continuamente cuando se desee. Una función adicional que las cámaras de flujo continuo pueden ofrecer es el aumento y disminución de la presión, una función que es útil para diversos propósitos como se describe más adelante.

El soporte de la célula biológica en esta estructura puede ser cualquier estructura que asegure la célula biológica en una posición fija y que permita el paso de corriente eléctrica. El soporte más conveniente es una abertura en la barrera. Asegurar una célula biológica sobre la abertura sirve para cerrar, sellar o taponar la abertura, dirigiendo de ese modo el paso de corriente eléctrica, el transporte difusivo o ambos, a través de la célula y eliminando o minimizando la filtración alrededor de la célula. Un medio mecánico conveniente para conseguir esto es aplicar un diferencial de presión a través de la abertura en una dirección que presionará a la célula contra la abertura. El diámetro de la abertura será menor que el de la célula y la célula pasará a una de las dos cámaras después de entrar en el aparato. Aumentando la presión en la cámara en la que reside la célula o disminuyendo la presión en la otra cámara, la célula será forzada contra la abertura, cerrándola. Una vez que se ha completado el procedimiento, la célula se libera fácilmente de la abertura igualando las presiones en las dos cámaras o revirtiendo el diferencial para que la presión más alta esté en la cámara distinta a la cámara en la que se introdujo la célula. Después el flujo de líquido en la cámara en la que se introdujo la célula retirará la célula de la abertura, dejando expuesta la abertura para otra célula.

Un método alternativo para sellar la abertura con la célula es mediante el uso de un recubrimiento en la superficie de la barrera o sobre el borde de la abertura, de una sustancia que se une a la membrana celular. Ya que las membranas celulares biológicas están cargadas negativamente, el recubrimiento puede ser una sustancia que porte una carga positiva, tal como polilisina, poliarginina o polihistidina. La célula biológica se puede dirigir hacia la abertura mediante un diferencial de presión a través de la abertura y sujetarse en el sitio por el recubrimiento. Una vez que se ha completado el procedimiento, se puede liberar la célula del recubrimiento aumentando momentáneamente el caudal del líquido en la cámara en el lado de la abertura en el que está la célula o aplicando un diferencial de presión inverso a través de la abertura para impulsar a la célula lejos de la abertura.

El tamaño de la abertura no es crítico para la invención con tal que la abertura exponga área de superficie suficiente en la membrana celular para conseguir el grado deseado de transferencia de masa, el paso de una corriente eléctrica o ambos, dentro de un período de tiempo controlable y económicamente razonable. Por tanto, el tamaño óptimo variará con las células particulares que se estén tratando o estudiando. En general, la abertura es preferiblemente circular o de forma aproximadamente circular y, dependiendo del tamaño de la célula, preferiblemente varía en diámetro de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 100 micrómetros, más preferiblemente de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 50 micrómetros y lo más preferiblemente de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 20 micrómetros. Preferiblemente la barrera en la que se forma el agujero y que separa las dos cámaras es de un material dieléctrico rígido que es impermeable tanto a agua como a solutos y que soportará un diferencial de presión suficiente para asegurar una célula contra la abertura. Para los dispositivos fabricados mediante técnicas de microfabricación, el nitruro de silicio es un material conveniente para la barrera. Otros materiales que servirán igualmente bien serán fácilmente aparentes para los especialistas en la técnica.

Un elemento adicional de realizaciones preferidas de esta invención es el uso de aparatos hechos con materiales transparentes. Esto permite al usuario observar el interior de las células y los procesos de microdifusión y microelectroporación a través de un microscopio a medida que ocurren.

Electroporación usada en terapia in vivo

Las técnicas de electroporación de la presente invención son útiles en relación con el tratamiento, análisis o diagnóstico de un organismo incluyendo mamíferos y seres humanos que necesitan tratamiento. En general, el tratamiento se puede realizar inyectando continuamente un material o en un bolo rápido en un área de tejido que se tiene que tratar. Los electrodos se ponen adyacentes al tejido y se aplica y mide continuamente la corriente o el voltaje para determinar cuándo se obtiene el nivel deseado de electroporación permitiendo de ese modo mover el material inyectado hacia las células del tejido que se está tratando.

El compuesto farmacéuticamente activo que se inyecta puede ser un fármaco convencional al que se refiere normalmente como una molécula pequeña o ser una proteína o secuencia nucleotídica que codifica una proteína. Además, la composición inyectada en el tejido se puede administrar antes, durante o incluso después de la aplicación de impulsos eléctricos a partir del dispositivo de electroporación. El objetivo global del proceso es proporcionar la apertura de poros a través de la electroporación y de ese modo introducir los compuestos en las células cuyas membranas celulares no penetrarían normalmente los compuestos. Por ejemplo, es posible introducir bleomicina o diversas construcciones de genes y/o plásmidos en células del tejido que se está tratando. Esto se consigue generando potenciales y corrientes eléctricas a través de las células en el tejido que se tiene que tratar donde los potenciales eléctricos se generan como impulsos eléctricos. Es preferible utilizar una pluralidad de electrodos a diferencia de un único electrodo para generar los impulsos.

Un ejemplo de un diseño de electrodo útil es uno que comprende dos tiras de acero planas de 10 mm de ancho y 0,6 mm de grosor. Los electrodos están separados a una distancia fija de aproximadamente 6 a 7 m el uno del otro. Un segundo diseño de electrodo comprende dos, hasta un máximo de 8, cuadrados de acero planos de 20 mm. Los electrodos se conectan a un electropulsador PS15. Los impulsos se pueden suministrar poniendo los electrodos sobre la piel con el lado plano en la piel o poniendo los electrodos alrededor de tumores de piel. El contacto con la piel se puede conseguir mediante el uso de materiales usados convencionalmente en relación con la realización de electrocardiogramas tales como geles o soluciones salinas electro conductoras. Para realizar el procedimiento un paciente puede recibir uno o una pluralidad de impulsos y preferiblemente recibe una pluralidad de impulsos. Se pueden diseñar configuraciones diferentes para realizar la electroporación de tejido dentro de un organismo tal como dentro de un cuerpo humano, es decir, sin aplicar electrodos fuera de la piel. Tales configuraciones pueden comprender series de agujas que comprenden una pluralidad de electrodos de aguja. Como ejemplo, los electrodos positivo y negativo pueden comprender cada uno seis o más agujas de 0,5 mm de diámetro y que comprenden acero inoxidable, 1 cm de longitud conectadas a un generador de impulsos BTX 820. Los electrodos se pueden insertar en paralelo en el tejido alrededor de las células que se van a influir por la electroporación. Los electrodos se pueden colocar en círculos de diversos diámetros que varían de 5 mm a 1 cm. Se puede usar una proporción de voltaje de electrodo en el intervalo de aproximadamente 1300 v/cm. Aunque se puede suministrar cualquier número de impulsos es preferible empezar el proceso suministrando aproximadamente seis impulsos en intervalos de un segundo con una anchura de impulso de 100 microsegundos. La presente invención es particularmente deseable en relación a la electroporación de tejido en que el método puede determinar si está ocurriendo la electroporación sin el uso de colorantes y marcas para rastrear el material que se está introduciendo en la célula.

Como se muestra en las Figuras 6a y 6b la corriente eléctrica puede fluir alrededor de las células (Figura 6a) o a través de las células (Figura 6b) después de que ha tenido lugar la electroporación. El proceso de la invención permite determinar el punto en el que ocurre la transición entre lo que se muestra en la Figura 6a y lo que ocurre en la Figura 6b y, además, permite evitar la aparición de efectos irreversibles en las membranas celulares. Como se muestra en la Figura 8a la electroporación se puede realizar hasta un alcance tan grande que se dañen las membranas celulares dando como resultado de ese modo efectos irreversibles en las células. En general, esto es indeseable. Sin embargo, es posible obtener electroporación sin daño significativo a las membranas celulares modulando la cantidad de corriente eléctrica, obteniendo de ese modo, una situación reversible como se muestra en la Figura 8b.

Como se muestra en las Figuras 6a y 6b las células crean impedancia eléctrica y la presente invención se refiere a determinar con precisión el grado de esa impedancia eléctrica y ajustar la corriente para obtener resultados deseados con respecto a la electroporación. Sin embargo, cuando se involucran grandes cantidades de células tal como en un tejido puede ser deseable usar otros mecanismos para medir otros efectos de la corriente en la creación de electroporación en una pluralidad de células en el tejido. La impedancia eléctrica es una medición de cómo la electricidad viaja a través de un material dado. Cada material tiene una impedancia eléctrica diferente determinada por su composición eléctrica. Algunos materiales tienen impedancia eléctrica alta y otros tienen impedancia eléctrica baja. El tejido mamario maligno (canceroso) tiene una impedancia eléctrica mucho más baja (conduce mucho mejor la electricidad) que el tejido normal o un tumor benigno (no canceroso).

La impedancia es una medición del grado al que un circuito eléctrico resiste el flujo de corriente eléctrica cuando se imprime voltaje a través de sus terminales. La impedancia expresada en OHMS, es la proporción del voltaje que se imprime a través de un par de terminales al flujo de corriente entre esos terminales. En circuitos de corriente continua (DC), la impedancia equivale a resistencia. En circuitos de corriente alterna (AC), la impedancia es una función de resistencia, inductancia y capacitancia. Los inductores y condensadores crean voltajes que se oponen al flujo de corriente. Esta oposición se denomina reactancia y se tiene que combinar con la resistencia para definir la impedancia. La resistencia producida por la inductancia es proporcional a la frecuencia de la corriente alterna, mientras que la reactancia producida por la capacitancia es inversamente proporcional a la frecuencia.

Los conceptos básicos descritos anteriormente se utilizan en los aspectos básicos de la presente invención y también son aplicables para describir la formación de imágenes de impedancia eléctrica también denominada tomografía de impedancia eléctrica (EIT). Se debe indicar que se pueden usar varias terminologías diferentes para describir la misma técnica y las mismas incluyen la tomografía potencial aplicada (APT). Estas tecnologías de formación de imágenes permiten producir imágenes basadas en la variación espacial de las propiedades eléctricas del tejido biológico. Se podrían utilizar técnicas tales como APT y EIT para realizar la invención en relación al tejido. La tomografía potencial aplicada (APT) depende para su base física de la medición de una distribución de potencial en una superficie de un material biológico, cuando se aplica una corriente eléctrica entre dos puntos de la superficie. Otros investigadores han utilizado la técnica y se refieren a la misma como formación de imágenes de impedancia eléctrica, formación de imágenes de conductividad, tomografía de impedancia eléctrica, etc. En este documento, generalmente la tecnología se denomina EIT o tomografía de impedancia eléctrica. Por consiguiente, en el resto de la descripción se denomina a la tecnología sólo tecnología de EIT y se muestra un ejemplo de la misma más adelante en el Ejemplo 3.

Los especialistas en la técnica considerarán diferentes medios para determinar cambios en la corriente eléctrica después de la lectura de esta descripción. Un método preferido para determinar tales cambios cuando se realiza la invención en tejido es usar tecnología de formación de imágenes y, específicamente, tomografía de impedancia eléctrica (EIT) que supervisa y analiza diferencias en los atributos bioeléctricos de la muestra que se está supervisando para producir una imagen. La tecnología de EIT se puede usar en relación con la presente invención creando una imagen EIT y usando esa imagen para ajustar el flujo de corriente para obtener los resultados deseados. Específicamente, la imagen de EIT se crea inyectando corrientes eléctricas en el tejido y midiendo los voltajes resultantes a través de una serie de electrodos. Esto permite producir una imagen de impedancia a partir de las entradas de corriente conocidas y los datos de voltaje de entrada medidos usando un algoritmo de reconstrucción. El uso de la tecnología de EIT es particularmente deseable en relación a la presente invención cuando se aplica a tejido en que la formación de imágenes por EIT proporciona un mapa de impedancias eléctricas. El mapa de impedancias eléctricas permite esencialmente que el usuario visualice el comienzo de la electroporación. Cuando la electroporación comienza el usuario puede estabilizar la cantidad de corriente que se está aplicando y de ese modo evitar aplicar tanta corriente que dé como resultado un daño irreversible de las células como se muestra en la Figura 8a. La tecnología de EIT permite visualizar la región de tejido que experimenta la electroporación basado en los cambios en la impedancia eléctrica equivalente de las células en el tejido que se está supervisando.

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La Figura 7 muestra una vista conceptual de un sistema de EIT usado para realizar un proceso de la presente invención en tejido (71). Una fuente de corriente (72) se controla mediante un generador de señal (73) y se usa para conducir una corriente eléctrica en la muestra de tejido (71) a través de un par de multiplexores controlados por ordenador (74) y (75) que llevan a un amplificador de diferencial (76) y un demodulador (77). Las señales medidas se comparan con la original para registrar los datos de amplitud y etapa para la construcción posterior de imágenes. El ordenador de control (78) típicamente escoge qué par de electrodos inyectará corriente mientras lee los voltajes de los electrodos restantes. Existen varias configuraciones de hardware diferentes que se pueden utilizar en relación con la presente
invención.

El sistema de EIT como se muestra en la Figura 7 generalmente se denomina un sistema en serie debido a su única fuente de corriente y amplificador de medición. En otros sistemas se ha utilizado la variación de los grados de paralelismo (múltiples fuentes de corriente y amplificadores de medición de voltaje) aumentando, de ese modo, la flexibilidad y velocidad del sistema de inyección de corriente.

Se usan algoritmos de reconstrucción para tomar el voltaje medido en una superficie exterior de una región de interés en el cuerpo (los datos de corriente inyectada) e información relacionada con la geometría del electrodo y producir una imagen que representa la distribución espacial tisular de la impedancia del tejido dentro de la región del tejido (71). Existen varios métodos que se pueden usar para crear una imagen de impedancia. La formación de imágenes estáticas es la producción de una distribución de impedancia absoluta. Cook, R. D. et al. ACT3: a high speed, high precision electrical impedance tomography. IEEE, Trans. Biomed. Eng. 41, 713-22 (1994). Los métodos de formación de imagen diferencial produjeron distribuciones basadas en las diferencias entre dos conjuntos de datos. Barber, D. C. en Advances in Biomed. Eng. (ed. Benek en, W., Thevenin, V.) 165-173 (IOS Press, Amsterdam, 1995). Este tipo de técnica proporciona una imagen de cómo ha cambiado la distribución de impedancia a partir de una medición inicial. La formación de imágenes de impedancia multifrecuencia se aprovecha de la dependencia que tiene la impedancia del tejido de la frecuencia. Groffiths, H. The importance of phase measurement in electrical impedance tomography. Physics in Medicine and Biology 32, 1435-44 (1987). Se pueden producir imágenes cuasi-estáticas usando la técnica diferencial anterior usando una imagen de baja frecuencia como la medida inicial. Por consiguiente, el sistema permite producir un tipo de formación de imágenes estáticas sin las dificultades de la formación de imágenes estáticas verdaderas.

Se usa un modelo matemático de cómo se comporta la corriente en el tejido para proporcionar la reconstrucción y, por tanto, la imagen. En general, se proporciona un modelo para dirigir el flujo de corriente en la EIT mediante la conocida ecuación de Poisson. El tipo de análisis matemático que se necesita en la reconstrucción de imágenes de EIT así como muchas otras tecnologías de formación de imágenes médicas, pertenece a una clase general conocida como problemas de valores de frontera. Existen varios métodos diferentes para resolver los problemas de valores de frontera. Sin embargo, todos estos problemas se pueden clasificar en técnicas iterativas analíticas o numéricas y los especialistas en la técnica pueden aplicarlas para realizar la presente invención.

La gran mayoría de los algoritmos de reconstrucción que están en uso actualmente emplean soluciones numéricas iterativas para la ecuación de Poisson. La mayoría de los procedimientos de estudio numéricos iterativos intentan resolver el problema de valor de frontera mediante la estimación de una distribución de impedancia en el tejido y resolviendo repetidamente el problema directo (encontrando las densidades de voltaje y corriente con una distribución de impedancia dada) y ajustando las estimaciones aproximadas de impedancia proporcionalmente, hasta que los voltajes y corrientes medidos se correspondan con los calculados. El problema directo se tiene que resolver numéricamente y habitualmente se hace usando esquemas de elementos finitos o de diferencias finitas. El Método de Elementos Finitos es un método muy poderoso y popular de solución de problema directo y, debido a esto, tiende a dominar las soluciones de ingeniería a través de muchos campos interdisciplinarios.

En la Figura 1 se muestra un ejemplo de un aparato de microdifusión de acuerdo con esta invención para una única célula biológica, para transportar materiales a través de la membrana celular sin la aplicación de un campo eléctrico. Estos componentes de este aparato, de abajo hacia arriba, son una base acrílica (11), una capa de silicio intermedia (12) (1 micrómetro de grosor) con una parte (13) tallada para definir los límites laterales de la más baja de las dos cámaras líquidas, una capa de nitruro de silicio (14) que sirve como la barrera entre las dos cámaras, una arandela de silicio (15) que define los límites laterales de la cámara líquida superior (16) y una cubierta de vidrio (17). Un agujero (18) en la barrera de nitruro de silicio sirve como la abertura y se muestra una célula o masa celular contiguas tal como tejido (19) cubriendo el agujero. A través de la base acrílica se prolongan canales para servir como canales de entrada y salida para los líquidos que pasan a través de las cámaras superior e inferior, como lo muestran las flechas en la Figura.

Cuando la presión en la cámara superior (16) es mayor que en la cámara inferior (13), la célula se mantendrá en posición sobre el agujero, sirviendo como un tapón que separa los líquidos de las dos cámaras el uno del otro. Cuando la composición de las soluciones en las dos cámaras difiere de la del interior celular, ocurre transferencia de masa a través de la membrana celular entre las cámaras y la célula. Cuando la composición de la solución en una cámara difiere de la de la otra, ocurre transferencia de masa a través de la célula de una cámara a la otra. Controlando con precisión las composiciones de las soluciones en las dos cámaras, se puede controlar con precisión la cantidad y dirección de la transferencia de masa dentro de la célula. Ya que se conoce el diámetro de la abertura (18), se puede determinar con precisión la transferencia de masa que ocurre a través de la abertura.

Las numerosas aplicaciones de este dispositivo de microdifusión serán fácilmente aparentes. Por ejemplo, el dispositivo se puede usar para infundir un crioconservante tal como glicerol a una célula llenando la cámara superior (16) con solución salina fisiológica y la cámara inferior (13) con glicerol. Cuando se usa una célula (19) para la cual se conoce el coeficiente de transferencia de masa del glicerol a través de la membrana celular, se puede calcular fácilmente la cantidad de glicerol que entrará a la célula y ajustar las concentraciones y tiempos de exposición para infundir a la célula una cantidad que se conoce que se requiere para la crioconservación.

En la Figura 2 se muestra un ejemplo de un aparato de microelectroporación de acuerdo con esta invención para una única célula biológica. El aparato es similar en construcción al aparato de microdifusión de la Figura 1. Sus componentes estructurales, de abajo hacia arriba, son una base acrílica (21), una capa de silicio inferior (22) con una parte tallada para definir los límites laterales de la cámara líquida inferior (23), una capa de nitruro de silicio (24) (1 micrómetro de grosor) que sirve como la barrera entre las dos cámaras, una capa de silicio superior (25) que define los límites laterales de la cámara líquida superior (26) y una cubierta que consiste en una capa de poli silicio n+ (5.000 \ring{A} de grosor) (27) y una capa de nitruro de silicio (1 micrómetro de grosor) (28). Un agujero (29) en la barrera de nitruro de silicio (24) sirve como la abertura y una célula (30) (o masa celular) cubre el agujero. A través de la base acrílica se prolongan canales para servir como entradas y salidas de los líquidos que pasan a través de las cámaras superior e inferior, como lo muestran las flechas en la Figura. Encima de la base acrílica (21) reside una capa adicional de poli silicio n+ (5.000 \ring{A}) (31) y esta capa, junto con la capa de poli silicio n+ (27) encima de la cámara superior (26) sirven como los dos electrodos. Cada electrodo se une mediante cables eléctricos a una placa de circuito impreso (32) que controla el voltaje aplicado entre los electrodos y mide la corriente que pasa entre los mismos.

El aparato de microelectroporación mostrado en la Figura 2 se puede fabricar por técnicas de microfabricación convencionales, implicando típicamente deposición química en fase de vapor, enmascaramiento, grabado y pulverización catódica. El funcionamiento del aparato será análogo al funcionamiento del aparato de microdifusión de la Figura 1. El movimiento de células biológicas a través del aparato se consigue suspendiendo las células en el líquido usado para llenar la cámara superior y las células se atraen hacia la abertura, una por una, aplicando un diferencial de presión entre las cámaras, que también mantiene a una célula en su lugar una vez que se ha atraído a la célula hacia la abertura. Un método conveniente para aplicar tal diferencial de presión es mantener la presión atmosférica en la cámara superior mientras se disminuye la presión en la cámara inferior por debajo de la atmosférica uniendo una jeringa a la cámara inferior y tirando del émbolo de la jeringa. Se debe tener cuidado de limitar el diferencial de presión para que no dañe la célula.

Las Figuras 3a y 3b ilustran un aparato y método diferente dentro del alcance de esta invención. Este aparato y método implican una suspensión fluida de células biológicas que fluye a través de un conducto o canal de flujo, en la que las células pasan a través de una región entre un par de electrodos. La sección transversal longitudinal de la Figura 3a muestra las paredes (41) del canal y una célula biológica (42) pasando hacia abajo a través del lumen del canal (en la dirección de la flecha). La sección transversal de la Figura 3b muestra que el canal es rectangular en la sección transversal, aunque se pueden usar otras geometrías de sección transversal. Los electrodos (43, 44) se forman como recubrimientos en dos paredes opuestas del canal. Los electrodos se conectan por cables a una placa de circuito impresa (45) que mide la impedancia y controla el voltaje aplicado a los electrodos. La célula biológica (42) se muestra pasando a través de la región entre los dos electrodos.

El área de la sección transversal del canal es suficientemente grande para permitir que la célula pase esencialmente sin impedimentos por las paredes del canal y, al mismo tiempo, suficientemente pequeña para que sólo pueda pasar una célula a la vez por la región inter-electrodo. Adicionalmente, cada electrodo (43, 44) es de longitud aproximadamente igual o ligeramente más grande que el diámetro de la célula biológica, para que después de entrar en la región la célula cause una disminución significativa o apreciable en la corriente que pasa por la región debido al voltaje aplicado a través de los electrodos. El espaciamiento de los electrodos, es decir, la distancia entre los mismos, se somete análogamente a las mismas consideraciones. Las células biológicas se suspenden en una solución líquida de la especie que se tiene que introducir en las células y la suspensión se hace pasar por el canal. Se aplica un voltaje entre los electrodos a medida que la suspensión fluye a través del canal y se supervisa la corriente entre los electrodos (o la impedancia). Una caída significativa en la corriente indica la presencia de una célula biológica en la región inter-electrodo. Una vez que se detecta la célula de esta manera, se puede aplicar un impulso de electroporación mientras la célula está todavía en la región inter-electrodo y además se puede observar la impedancia para detectar el comienzo de la electroporación. Las especies disueltas en la solución líquida entrarán en la célula como resultado de la electroporación.

Las variaciones en estas estructuras y métodos serán fácilmente aparentes para los especialistas en la técnica. Por ejemplo, las barreras descritas anteriormente se pueden minimizar o evitar usando microelectrodos que sean del mismo tamaño o más pequeños que las células biológicas. Los ejemplos de tales microelectrodos son los microelectrodos de fibra de carbono (tales como ProCFE, Axon Instruments, Foster City, California, USA) usados junto con micromanipuladores de alta graduación (tales como los disponibles en Narishige MWH-3, Tokyo, Japón). Los microelectrodos se pueden usar en lugar de los electrodos mostrados en la Figura 2 o en lugar de los mostrados en las Figuras 3a y 3b.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a los especialistas en la técnica una explicación y descripción completa de cómo preparar y usar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos siguientes son todos los experimentos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben suponer algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura es en grados Centígrados y la presión es igual o próxima a la atmosférica.

Ejemplo 1

Se realizaron una serie de experimentos usando un sistema de electroporación que consiste en el dispositivo de microelectroporación descrito anteriormente y mostrado en la Figura 2, combinado con unidades de control de flujo y presión e indicadores de presión para los líquidos que tienen que circular a través de las cámaras superior e inferior, una fuente de alimentación DC variable, un generador de impulsos y un amplificador de corriente para aplicar impulsos de voltaje a través del dispositivo, un osciloscopio digital para supervisar los impulsos, un microscopio de fluorescencia, una cámara CCD (dispositivo de acoplamiento de carga) y un ordenador con software de procesamiento de imágenes y procesamiento de forma de onda. Ambas cámaras del dispositivo se llenaron con solución salina fisiológica y las células se introdujeron en la cámara superior. El movimiento de líquido en las cámaras superior e inferior se controló mediante jeringas. La presión en la cámara superior fue atmosférica mientras que la presión en la cámara inferior se redujo por debajo de la atmosférica tirando del barril de la jeringa conectada a esa cámara. El voltaje se aplicó en impulsos cuadrados sencillos que variaban de cero a 120 v de magnitud y de 2 microsegundos a 100 milisegundos de duración. La distancia entre los electrodos en las cámaras superior e inferior fue 900 micrómetros.

Los ensayos en este ejemplo se realizaron usando células de adenocarcinoma prostático humano ND-1 con un diámetro típico de 20 micrómetros. La abertura en el dispositivo de microelectroporación tenía 5 micrómetros de diámetro. Se aplicó un impulso de voltaje rectangular con una duración de 60 milisegundos y el impulso se aplicó a diversas amplitudes que variaban de 10 v a 60 v con aumentos de 5 voltios. Con cada impulso, se midió la corriente eléctrica que pasaba a través de la abertura. Se realizaron experimentos con las células y se repitieron tanto con la abertura tapada con una micro esfera de vidrio como sin ninguna obstrucción en la abertura. En cada caso los resultados se expresaron como microamperios de corriente frente a voltios de amplitud de impulso y se representan en la Figura 4, en la que la curva superior (puntos de datos representados por x) representa la abertura sin obstrucción, la curva inferior (puntos de datos representados por asteriscos) representa los datos obtenidos con la micro esfera de vidrio residiendo en la abertura y las tres curvas intermedias (cuadrados abiertos, triángulos verticales abiertos y triángulos invertidos abiertos) representan los datos obtenidos con tres células ND-1 diferentes residiendo en la abertura.

La curva superior muestra que la corriente aumenta de una manera sustancialmente continua a medida que aumenta el voltaje cuando no hay barrera para el paso de corriente a través de la abertura. La curva inferior también muestra un aumento sustancialmente continuo a medida que aumenta el voltaje, aunque a un nivel mucho menor. Los valores de corriente mostrados en la curva inferior representan corrientes de fuga a través del dispositivo. Las curvas de datos obtenidos con las células ND-1 a través de la abertura muestran que a voltajes bajos la corriente tiene un valor próximo al obtenido cuando la abertura está cerrada por la micro esfera de vidrio mientras que a voltajes altos la corriente aumenta hasta los niveles obtenidos con un abertura despejada. La transición es un aumento brusco que es indicativo de la formación de poros en la membrana celular a través de los cuales puede pasar una corriente eléctrica, es decir, el comienzo de la electroporación. En las tres células, la transición ocurrió a voltajes entre 30 v y 40 v. En dos de las tres células (cuadrados abiertos y triángulos verticales abiertos), el comienzo de la electroporación ocurrió esencialmente al mismo voltaje, mientras que en la tercera (triángulos invertidos), el comienzo ocurrió a un voltaje que fue más bajo que los otros dos en aproximadamente 5 v. Esto ilustra el valor de controlar el proceso para que las células individuales consigan resultados óptimos.

Después de que se generaron los datos mostrados en la Figura 4, se reaplicaron los impulsos en orden descendente de valores de amplitud y las curvas resultantes presentaron histéresis, es decir, las curvas obtenidas con amplitudes descendentes fueron de voltaje más elevado que las obtenidas con amplitudes ascendentes. Esto indicó que la electroporación en estos experimentos fue irreversible.

Ejemplo 2

Usando el mismo sistema de electroporación usado en el Ejemplo 1, se realizaron una serie de ensayos en hepatocitos de ratas (Colección Americana de Cultivos Tipo Nº CRL-1439), cuyo diámetro celular típico era 20 micrómetros y el aparato de microelectroporación que tenía una abertura de 4 micrómetros de diámetro. Aquí también se usaron impulsos de voltaje rectangular que tenían una duración de 60 milisegundos, que variaban en amplitud de 10 v a 37,5 v con aumentos de 5V en la parte de 10 v a 30 v y con aumentos de 2,5 v en la parte de 30 v a 37,5 v. En algunos casos los experimentos se realizaron sólo aumentando las amplitudes y en otros aumentando primero y después disminuyendo las amplitudes para evaluar la reversibilidad. Los resultados se representan en los gráficos mostrados en las Figuras 5a, 5b, 5c y 5d. En cada caso, la curva superior (puntos de datos representados por círculos) son los datos obtenidos sin una célula ni una micro esfera de vidrio residiendo en la abertura, la curva inferior (puntos de datos representados por cuadrados) son los datos obtenidos con una micro esfera de vidrio en la abertura y la curva intermedia (puntos de datos representados por triángulos) son los datos obtenidos con un hepatocito en la abertura, usando hepatocitos diferentes para cada una de las cuatro Figuras.

En la Figura 5a, la amplitud se aumentó y no se disminuyó, presentando un voltaje de umbral de electroporación de entre 25 v y 30 v. En las Figuras 5b y 5c, primero se aumentó la amplitud y después se disminuyó para producir las dos curvas intermedias. Aunque las curvas ascendente y descendente no se diferencian, son sustancialmente idénticas en cada Figura, indicando que la membrana celular en cada uno de estos dos casos se volvió a cerrar después de cada impulso de voltaje y, por tanto, que la formación de poro fue reversible. En el ensayo representado por la Figura 5d, la célula se desintegró una vez que el voltaje aplicado excedió los 37,5 v, aunque esto no se muestra en la Figura. Es significativo señalar que a pesar del hecho de que se usaron los mismos tipos celulares en cada una de las Figuras 5a, 5b, 5c y 5d, el voltaje de umbral de electroporación fue diferente entre las células individuales, aunque todos estuvieron en el intervalo de 20 v a 35 v. La adaptación del procedimiento a células individuales se consigue fácilmente supervisando la corriente de esta manera para observar cuando ocurre el umbral de electroporación. Después se puede realizar la selección del tiempo de exposición, voltaje, cambios de composición en los líquidos del entorno óptimos y otros parámetros del sistema para conseguir el tratamiento deseado de la célula sin la destrucción de la célula.

Los métodos descritos en este documento son herramientas útiles en el laboratorio para conducir investigación fundamental en las propiedades de electroporación de células biológicas y herramientas útiles en la industria para procesar grandes cantidades de células de una manera de flujo continuo. Permitiendo la observación y el registro de la corriente que fluye a través de células individuales, se puede controlar la amplitud y duración del impulso de voltaje para conseguir resultados óptimos. Adicionalmente, los dispositivos descritos y mostrados en este documento para uso en la práctica de la invención se pueden construir con partes transparentes y de un tamaño adecuado para montarlos en una platina de microscopio. Esto permitirá establecer una correlación entre las mediciones de corriente eléctrica, las observaciones visuales y las mediciones de fluorescencia dentro de la célula. El dispositivo se puede usar para detectar eléctricamente, a través de la medición de corrientes, el punto en el tiempo en el que una célula se aloja en la abertura así como el punto en el tiempo en el que se consigue la formación de poro en la membrana celular. Para aplicaciones a mayor escala e industriales, se puede disponer paralelamente un gran número de dispositivos de microelectroporación del tipo que se ha descrito en este documento. Para cada célula, se puede usar información eléctrica que indique la inmovilización de una célula en la abertura (tal como una caída brusca en la corriente) para generar una señal que iniciará una secuencia de electroporación y la información eléctrica adicional que indique la finalización de la electroporación (tal como un aumento brusco en la corriente) generará una señal que liberará la célula (por ejemplo, eliminando o revertiendo el diferencial de presión) y permitirá que la próxima célula fluya hacia la
abertura.

Además de usar el dispositivo y sistema de la invención para mover material hacia dentro o hacia fuera de la célula el sistema y el dispositivo se pueden usar de un modo diagnóstico o analítico. Esto se realiza midiendo la impedancia eléctrica de una célula o células colocadas en un medio y usando la información de impedancia eléctrica medida. Es posible deducir información relacionada con la integridad de las membranas celulares y, de este modo, prever el análisis. También es posible comparar la información con información obtenida previamente de células normales o enfermas del mismo tipo y, de ese modo, obtener información diagnóstica. Por ejemplo, la impedancia eléctrica de una célula con una membrana intacta será mucho más alta que la impedancia de la misma célula con una membrana alterada. Por tanto, el proceso puede proporcionar analíticamente información con respecto a la integridad estructural de la membrana celular. Diagnósticamente el método puede proporcionar información con respecto a la integridad estructural relativa de las membranas celulares.

Ejemplo 3

Cartografía de impedancia eléctrica de dominios sometidos a electroporación

Para ilustrar la capacidad de la EIT para supervisar la electroporación en tejido se ha resuelto una simulación matemática del problema.

Para proporcionar los datos necesarios para la simulación de formación de imágenes de electroporación, se creó un sustituto de tejido simulado usando en primer lugar un modelo FEM de malla fina 2-D (\sim 1600 nodos, \sim3100 elementos). El sustituto, mostrado en la Figura 9, consistió en un dominio de formación de imágenes circular (radio de 20 mm, resistividad de 500 ohm\cdotcm para músculo con un número variable de electrodos de fuente puntual separados por la misma distancia alrededor de la periferia. Dentro de esta región de formación de imágenes, se definió una única región de electroporación a la que se dio forma arbitrariamente con una resistividad diferente. Se usó un patrón de inyección de corriente de electrodo opuesto, proporcionando mediciones de voltaje independientes N(N-1)/2, donde N es el número de electrodos. El modelo se resolvió usando la generación de malla adaptativa y algoritmos de solución FEM disponibles en MATLAB's Partial Differential Equation Toolbox (The Mathworks Inc.). En la Figura 9 se muestra un ejemplo de malla para la geometría dada. La información que el módulo del sustituto pone a la disposición de los algoritmos de reconstrucción representa los datos que habrían estado disponibles durante la parte de electroporación de un experimento, es decir, corriente y voltaje en los diferentes electrodos alrededor del tejido. A partir de estos datos se trató de reconstruir la imagen original del tejido que se introdujo en el modelo. (Se debe indicar que se usó una corriente de inyección DC en lugar de corriente AC típica en EIT para simplificar el problema. La derivación y ejecución AC es una extensión sencilla de la que se presenta en este documento). Un ejemplo típico de la distribución del voltaje y la corriente en el sustituto durante una etapa de adquisición de datos simulada para un sistema de EIT de 8 electrodos se ilustra en la Figura 10.

Los datos obtenidos del sustituto se aportaron a dos algoritmos de formación de imágenes de EIT, el primero usando el método de elementos finitos y el segundo el método de elementos de frontera para generar la imagen de impedancia. Los algoritmos usan una técnica convencional de Newton Raphson para producir la imagen. La Figura 11 compara la imagen de un dominio circular con dos impedancias eléctricas diferentes en comparación con la imagen del sustituto original como se ha recreado con la técnica de elementos finitos y con la técnica de elementos de frontera.

La tomografía de impedancia eléctrica se puede usar para formar imágenes de la región de electroporación en el tejido porque la EIT produce una imagen del tejido a partir de un mapa de la impedancia eléctrica del tejido y la electroporación produce cambios en la impedancia. Los electrodos para formación de imágenes de electroporación de tejido pueden ser diferentes a los usados para el proceso de electroporación mismo o pueden ser iguales.

Ejemplo 4

Detección eléctrica de cambios en la permeabilidad de la membrana

Como parte de la investigación sobre la electroporación celular se han estudiado las características eléctricas de las células durante la electroporación reversible e irreversible. En la electroporación reversible la célula no resulta dañada por el proceso de electroporación y la membrana se vuelve a cerrar. En la electroporación irreversible la membrana celular resulta dañada y no se vuelve a cerrar. En un conjunto de experimentos en los que se ha usado células ND-1 para medir las corrientes a través de las células en el chip de microelectroporación se han obtenido resultados ilustrados en las Figuras 8a y 8b. Los resultados se obtuvieron exponiendo las células a impulsos eléctricos de forma triangular (curva superior) en 8a y 8b. Las corrientes eléctricas que fluyen a través de las células se muestran en la curva inferior en 8a y 8b. La Figura 8a es de una célula que se ha sometido a electroporación irreversible y la Figura 8b de una célula que se ha sometido a electroporación reversible. Se puede observar fácilmente que cuando se redujo el voltaje en la célula que se sometió a electroporación reversible, ésta conservó los mismos valores que durante la etapa de aumento del voltaje. Sin embargo, en el caso irreversible la corriente a través de la célula con la membrana dañada tuvo una mayor corriente que en la célula intacta. Esto lleva a la conclusión de que las corrientes eléctricas que fluyen a través de las células pueden proporcionar indicios de cambios en la permeabilidad de la membrana en general y una medida de la integridad de la membrana celular en particular en una diversidad de situaciones y no sólo durante la electroporación. Por ejemplo, la viabilidad celular con frecuencia se mide con azul de tripano o colorantes fluorescentes que penetran a través de las membranas dañadas. Estos resultados muestran que un método alternativo para detectar células con membranas dañadas sería medir la relación de corriente eléctrica a voltaje a través de la célula. De forma similar, existen compuestos que inducen poros en la membrana celular, tales como ionóforos. La medición de corriente-voltaje (relación de impedancia a través de una membrana celular) también podría detectar si la membrana se ha alterado por estos químicos. Las mediciones eléctricas tendrían ventaja sobre los medios químicos para detectar el daño de la membrana celular porque estos producirían información inmediata. Un método posible para detectar cambios en la permeabilidad de la membrana celular y en particular membranas celulares dañadas es usar el chip de electroporación como se ha descrito para el proceso de electroporación. La medida del daño sería la diferencia entre la impedancia de una célula intacta y la impedancia de una célula dañada como se ilustra en las Figuras 8a y 8b. Sería posible detectar células con membranas celulares dañadas en tejido de una forma similar a los métodos de detección de electroporación descritos en este documento.

Claims (9)

1. Un método, que comprende la etapas de:

enviar una corriente eléctrica entre un primer punto y un segundo punto separado del primer punto por un medio eléctricamente conductor que comprende tejido;

crear una imagen del tejido en el que la imagen se basa en la impedancia eléctrica del tejido; y

ajustar un parámetro eléctrico basado en la imagen para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el tejido;

en el que el parámetro eléctrico se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje y una combinación de corriente y voltaje.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente:

poner un material en el medio eléctricamente conductor y ajustar la corriente eléctrica en base a la imagen, de una manera que mueva el material dentro de las células biológicas en el tejido.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la imagen se crea usando tomografía de impedancia eléctrica.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la imagen es una imagen de impedancia creada a partir de entradas de corriente conocidas y voltaje de entrada medido usando un algoritmo de reconstrucción.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la imagen es una imagen de impedancia creada a partir de un voltaje de entrada conocido.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la imagen es una imagen de impedancia creada a partir de una entrada de corriente medida.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la imagen es una imagen de impedancia creada a partir de una combinación de una entrada de voltaje conocida y una entrada de corriente medida.

8. Un dispositivo, que comprende:

un medio para crear una corriente eléctrica a través de un medio eléctricamente conductor;

un medio para analizar la impedancia eléctrica del medio eléctricamente conductor para crear una imagen; y

un medio para ajustar un segundo parámetro eléctrico basado en la imagen para obtener un grado deseado de electroporación de células biológicas en el medio eléctricamente conductor;

en el que el segundo parámetro eléctrico se selecciona del grupo que consiste en corriente, voltaje y una combinación de corriente y voltaje.

9. El dispositivo de la reivindicación 8, en el que el medio para crear corriente eléctrica comprende electrodos.