ES2339997T3

ES2339997T3 - Metodo para producir compuestos de fenilalanina opticamente activos a partir de derivados de acido cinamico que emplea una fenilalanina amoniaco liasa derivada de idiomarina loihiensis.

Info

Publication number: ES2339997T3
Application number: ES07818125T
Authority: ES
Inventors: Friso Bernard Jan Van Assema; Natascha Sereinig
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2006-09-12
Filing date: 2007-09-12
Publication date: 2010-05-27
Anticipated expiration: 2027-09-12
Also published as: EP2069518A1; CN101517089A; EA015803B1; EA200900430A1; EP2069518B1; WO2008031578A1; HK1219507A1; CN105238825A; ATE457035T1; CN105238825B; DE602007004678D1

Abstract

Proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido por reacción del ácido cinámico correspondiente con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con SEQ ID NO. 4.

Description

Método para producir compuestos de fenilalanina ópticamente activos a partir de derivados de ácido cinámico que emplea una fenilalanina amoniaco liasa derivada de Idiomarina loihiensis.

La invención se refiere a un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido en el cual el derivado de ácido cinámico correspondiente se hace reaccionar con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva.

Los compuestos de fenilalanina enantioméricamente enriquecidos son compuestos intermedios importantes para, por ejemplo, productos farmacéuticos, en particular en la preparación de inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina I (ACE), que se utilizan para el tratamiento de la presión sanguínea elevada (hipertensión). El ácido (S)-indolina-2-carboxílico ópticamente activo, que puede prepararse por cierre de anillo de (S)-2-clorofenilalanina, por ejemplo, puede utilizarse en la preparación de ácido [2S-[1[R*(R*)-2\alpha,3a\beta,7a\beta]]-1-[2-[[1-(etoxicarbonil)butil]amino]-1-oxopropil]octahidro-1H-indol-2-carboxílico, conocido también bajo el nombre comercial Perindopril, que es útil como antihipertensivo (inhibidor de la ACE) o ingrediente cardiotónico activo. Otras aplicaciones útiles son, por ejemplo, Pentopril e Indolapril.

Un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido es conocido por WO2006/069799 A1, en donde en un ejemplo específico se prepara ácido (S)-2-amino-3-(2-cloro-fenil)-propiónico por reacción de ácido 3-(2-cloro-fenil)acrílico con NH_{3} acuoso en presencia de fenilalanina-amoniaco-liasa (PAL) de R. glutinis. La secuencia de aminoácidos de PAL de Rhodotorula glutinis puede encontrarse en WO01/11071 A2 y en SEQ ID NO. 9 en esta memoria.

Una desventaja del proceso que se describe en WO2006/069799 A1 es que se produce inhibición de sustrato. Por esta razón, el proceso precisa ejecutarse a baja concentración. Para la producción de una cantidad aceptable de producto, se requieren por tanto grandes volúmenes o protocolos de alimentación complicados, lo que lo hace menos atractivo desde un punto de vista comercial.

Por esta razón, es el objeto de la presente invención proporcionar un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina en el cual se reduce la inhibición de sustrato.

Este objeto se ha conseguido por un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido por reacción del ácido cinámico correspondiente con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con SEQ ID NO. 4.

El proceso de la presente invención proporciona por tanto un proceso mejorado y/o comercialmente atractivo para la preparación de un compuesto de fenilalanina. La inhibición de sustrato, es decir - una disminución en la actividad inicial de la enzima por aumento en la concentración de sustrato -, se reduce por utilización de una PAL que tiene al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4. Adicionalmente, las fenilalanina-amoniaco-liasas (PALs) que tienen al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4 se sobre-expresan fácilmente en E. coli. Otra ventaja de las PALs que tienen al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4 en comparación con PAL de R. glutinis es que las mismas tienen mayor actividad.

El % de identidad como se define en esta memoria se determina en estudios de alineación de secuencias utilizan-
do

Clone Manager 6 (versión 6.00/Align Plus 4, versión 4.10 (Scientific & Educational Software) utilizando BLOSUM62 como matriz de registro.

Preferiblemente, en el proceso de la presente invención, la PAL utilizada tiene una identidad de secuencia de al menos 50%, más preferiblemente al menos 53%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 57%, aún más preferiblemente al menos 60%, todavía más preferiblemente al menos 62%, todavía más preferiblemente al menos 65%, todavía más preferiblemente al menos 70%, en particular al menos 75%, de modo más particular al menos 80%, de modo más particular al menos 85%, de modo más particular al menos 90%, de modo aún más particular al menos 95%, de modo aún más particular al menos 97%, de modo todavía más particular al menos 98%, de modo todavía más particular al menos 99%, y muy particularmente 100% con SEQ ID NO. 4.

Las secuencias de PAL que pueden utilizarse en el proceso de la presente invención pueden ser identificadas fácilmente por la persona experta en la técnica, utilizando por ejemplo búsquedas BLAST en una base de datos, por ejemplo en la base de datos NCBI. Las secuencias de ácido nucleico que codifican estas secuencias PAL pueden identificarse fácilmente, por ejemplo por utilización de los programas disponibles vía BLAST en el NCBI. Alternativamente, partiendo de la secuencia de aminoácidos, puede sintetizarse también una secuencia de ácido nucleico en el uso de codones preferido u optimizado para la célula hospedadora deseada, por ejemplo por compañías comerciales tales como GenScript o DNA 2.0. La secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una enzima PAL utilizada en el proceso de la presente invención, puede clonarse en un vector adecuado y, después de introducción en un hospedador adecuado, la secuencia puede (sobre)expresarse de acuerdo con técnicas estándar de clonación y expresión, que son conocidas por la persona experta en la técnica (v.g., como se describe en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) para producir una enzima PAL que tiene al menos 50% de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 4.

En el marco de la invención, PAL (fenilalanina-amoniaco-liasa) se define como una enzima con actividad de fenilalanina-amoniaco-liasa, es decir la capacidad para catalizar la aminación reversible no reductora de ácido cinámico a fenilalanina. HAL (histidina-amoniaco-liasa) se define como una enzima con actividad de histidina-amoniaco-liasa, es decir la capacidad para catalizar la aminación reversible no reductora de ácido urocanoico a histidi-
na.

Preferiblemente, el compuesto de fenilalanina producido en el proceso de la presente invención es un compuesto de fórmula (1) o una sal del mismo

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en donde Y representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo ariloxi sustituido o no sustituido, o un grupo amina o un residuo amina -NHR en donde R es un grupo alquilo, aralquilo, arilo, alcarilo que comprende 1-10 átomos C y opcionalmente uno o más heteroátomos, y en donde Z representa uno o más sustituyentes en un grupo aromático que se seleccionan de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos, con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo amina, un grupo nitro, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, una amida carboxílica, o un grupo nitrilo o trifluorometilo. La sustitución opcional en el caso en que Z es un grupo alifático cíclico o acíclico, un grupo alifático heterocíclico, un grupo (hetero)arilo o un grupo alcoxi y en el caso en que Y es un grupo alcoxi o ariloxi puede seleccionarse por ejemplo de un trihalogenuro, por ejemplo trifluorometilo, triclorometilo; un átomo de halógeno, por ejemplo fluoruro, cloruro o yoduro; un grupo amina, por ejemplo metilamina, dimetilamina, bencilamina, etilamina, propilamina, fenilamina, 4-fluorofenilamina; un grupo alcoxi o ariloxi, por ejemplo metoxi, etoxi, isopropoxi, benciloxi, fenoxi, 4-fluorofenoxi, 3-fluorofenoxi, 2-fluorofenoxi; un tioéter, por ejemplo metiltioéter, etiltioéter, benciltioéter; un trihaloalquiléter, por ejemplo trifluorometiléter; un arilo o heteroarilo, por ejemplo, fenilo, 4-fluorofenilo, 3-fluorofenilo, 2-fluorofenilo, 2-trifluorometilfenilo, 3-trifluorometilfenilo, 4-trifluorometilfenilo, tiofeno, furano, pirazol, pirrol, imidazol, o análogos. Se prefieren compuestos en los cuales Z es hidrógeno, un átomo de halógeno, trifluorometilo, hidroxi, metoxi o nitrilo e Y es hidroxilo.

De modo más preferible, el compuesto de fenilamina producido en el proceso de la presente invención es un compuesto de fórmula (2) o una sal del mismo:

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en donde Y es como se define arriba para la fórmula (1) y en donde Z es como se define arriba para la fórmula (1) y en donde X representa un grupo lábil, por ejemplo un grupo lábil seleccionado del grupo de fluoruro, bromuro, cloruro o yodo, un grupo mesilato, un grupo nosilato, un grupo tosilato, un grupo triflato, ácido borónico, un grupo nitro y análogos.

El término "grupo lábil" en el contexto de esta invención significa un grupo adecuado para actuar como grupo lábil en un proceso para la preparación de un ácido indolina-2-carboxílico enantioméricamente enriquecido y opcionalmente sustituido de acuerdo con la fórmula (3)

3

o una sal de la misma, en la cual Y y Z son como se define arriba

en donde un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido, quiral y sustituido con X en posición orto de acuerdo con la fórmula (2) se somete a ciclación a una temperatura inferior a aproximadamente 140ºC, con formación del compuesto de ácido indolina-2-carboxílico enantioméricamente enriquecido de acuerdo con la fórmula (3). Cualesquiera sustituyentes que pueden estar presentes en Y o Z en la fórmula (3) son como se define más adelante. Esta reacción de ciclación ha sido descrita en WO2006/069799 A1.

Ejemplos adecuados de sales de compuestos de acuerdo con las fórmulas (1), (2) y (3) son, por ejemplo, la sal HCl, sal HBr, sal de amonio, sal de ácido acético, sal de ácido metanosulfónico, sal de ácido bencenosulfónico, sal de ácido p-toluenosulfónico, sal de ácido maleico, sal de ácido tartárico, sal de ácido cítrico, o sal de ácido glucónico de los mismos.

Donde Z en la fórmula (1), (2) o (3) es un grupo alifático sustituido cíclico o acíclico con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo sustituido, un grupo alcoxi sustituido con 1-10 átomos de carbono, que contiene uno o más heteroátomos, estos heteroátomos se seleccionarán por lo general cada uno independientemente del grupo de P, N, O y S. Donde Y contiene uno o más heteroátomos, estos heteroátomos se seleccionarán también cada uno independientemente por lo general del grupo de P, N, O y S.

Preferiblemente, en la o las fórmulas anteriores, Y representa OH u OR^{1}, en donde R^{1} representa un alquilo, típicamente con 1-10 átomos C, con preferencia un alquilo con 1-6 átomos C, representando Y muy con preferencia OH. Preferiblemente, Z representa H o halógeno, por ejemplo fluoruro, cloruro, bromuro o yoduro, representando Z muy con preferencia H. Preferiblemente, X en la fórmula (2) representa fluoruro, bromuro, cloruro o yodo, muy con preferencia cloruro o bromuro. Debido a su bajo coste, y/o desde un punto de vista ambiental, es muy preferido el cloruro.

Ejemplos adecuados de compuestos de fenilalanina son por ejemplo 2-bromo-fenilalanina, 2-clorofenilalanina, 2-yodo-fenilalanina, 2-bromofenilalanina metiléster, 2-clorofenilalanina metiléster, 2-yodo-fenilalanina metiléster, 2-bromofenilalanina etiléster, 2-clorofenilalanina etiléster, 2-yodo-fenilalanina etiléster, 2-bromofenilalanina benciléster, 2-clorofenilalanina benciléster, 2-yodo-fenilalanina benciléster, 2-bromofenilalanina amida, 2-clorofenilalanina amida, 2-yodo-fenilalanina amida, o análogos. Se prefieren 2-bromofenilalanina, 2-clorofenilalanina, 2-bromofenilalanina benciléster y 2-clorofenilalanina benciléster. Son más preferidos 2-bromofenilalanina y 2-clorofenilalanina. Aún más preferidos son los enantiómeros (S) de los ejemplos respectivos de compuestos de fenilalanina. Son muy preferidos (S)-2-clorofenilalanina y (S)-bromofenilalanina.

"Enantioméricamente enriquecido" como se define en esta memoria, es equivalente al término "ópticamente activo" y significa que uno de los enantiómeros de un compuesto está presente en exceso comparado con el otro enantiómero. A este exceso se hará referencia en adelante como "exceso enantiomérico" o e.e. (como se determina por ejemplo por análisis GLC o HPLC quiral). El exceso enantiomérico e.e. es igual a la diferencia entre las cantidades de los enantiómeros dividida por la suma de las cantidades de los enantiómeros, cociente que puede expresarse como porcentaje después de multiplicación por 100.

En el proceso de la invención, la pureza óptica del compuesto de fenilalanina es con preferencia al menos aproximadamente 50%, de modo más preferible al menos aproximadamente 75%, de modo aún más preferible al menos aproximadamente 90%, en particular al menos aproximadamente 95%, y de modo muy particular al menos aproximadamente 98%.

Ejemplos adecuados de sales de un compuesto de fenilalanina de fórmula (1) o (2) son por ejemplo, la sal HCl, sal HBr, sal de ácido acético, sal de ácido metanosulfónico, sal de ácido bencenosulfónico, la sal de ácido p-toluenosulfónico, sal de ácido maleico, sal de ácido tartárico, sal de ácido cítrico, o sal de ácido glucónico del mismo.

Donantes de grupos amino adecuados incluyen por ejemplo NH_{3} o NH_{4}OH o B-NH_{2}, en donde B es un grupo -COR^{1} en el cual R^{1} puede seleccionarse de un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, y un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo sulfonilo opcionalmente sustituido o análogos. Se prefieren NH_{3} y NH_{4}OH. Por supuesto, es posible también utilizar una combinación de diversos donantes de grupos amino. Los sustituyentes opcionalmente presentes en R^{1} pueden seleccionarse de un grupo hidroxilo, un trihalogenuro, por ejemplo trifluorometilo, triclorometilo; un átomo de halógeno, por ejemplo fluoruro, cloruro o yoduro; un grupo amina, por ejemplo metilamina, dimetilamina, bencilamina, etilamina, propilamina, fenilamina, 4-fluorofenilamina; un grupo alcoxi o ariloxi, por ejemplo, metoxi, etoxi, isopropoxi, benciloxi, fenoxi, 4-fluorofenoxi, 3-fluorofenoxi, 2-fluorofenoxi; un tioéter, por ejemplo metiltioéter, etiltioéter, benciltioéter; un trihaloalquil-éter, por ejemplo trifluorometiléter; un arilo o heteroarilo, por ejemplo, fenilo, 4-fluorofenilo, 3-fluorofenilo, 2-fluorofenilo, 2-trifluorometilfenilo, 3-trifluorometilfenilo, 4-trifluorometilfenilo, tiofeno, furano, pirazol, pirrol, imidazol, o análogos.

Con "estereoselectividad" de PAL se entiende que PAL cataliza preferentemente la formación de uno de los enantiómeros del compuesto (2). La estereoselectividad de una enzima puede expresarse en términos de la relación E, la relación de las constantes de especificidad V_{max}/K_{m} de los dos enantiómeros como se describe en C-S. Chen, Y Fujimoto, G. Girdaukas, C. J. Sih., J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 7294-7299. En el marco de la invención, la relación E de una PAL se determina utilizando los valores V_{max} y K_{m} como se determinan en la desaminación no oxidante del compuesto de fenilalanina sustituido con X en orto (= compuesto (1)) utilizando PAL.

Preferiblemente PAL forma productos con un e.e. de >80%, más con preferencia, PAL forma productos con un e.e. de >90%, aún más preferiblemente PAL forma productos con un e.e. de >95%, y muy con preferencia, PAL forma productos con un e.e. de >99%. Preferiblemente, PAL cataliza de modo estereoselectivo la formación del enantiómero (S) del compuesto de fenilalanina, formándose más preferiblemente el compuesto de (S)-fenilalanina sustituido en orto con cloro.

La PAL como se utiliza en el proceso de la presente invención no sufre con preferencia inhibición de sustrato, es decir, con preferencia no sufre inhibición por ácido cinámico o derivados del mismo.

El proceso de la invención no está limitado en modo alguno por la forma en que se utiliza la PAL que tiene al menos 50% de identidad con SEQ ID NO. 4. La PAL puede estar presente por ejemplo en una forma seleccionada a partir de una solución bruta de enzima, una solución de enzima purificada, células (permeabilizadas y/o inmovilizadas) que poseen actividad PAL naturalmente o por modificación genética, en un lisado de células con dicha actividad, en forma inmovilizada, en forma químicamente modificada o formas ulteriores conocidas por una persona experta en la técnica, o en una combinación de dos o más de estas formas.

Estará claro para la persona experta en la técnica que puede hacerse uso también de mutantes de enzimas PAL existentes naturalmente (tipo salvaje). Por ejemplo, es posible producir mutantes con actividad PAL, es decir mutantes que exhiben una actividad mayor que PAL de tipo salvaje sobre al menos un sustrato, mutantes de expresión de PAL, es decir mutantes que se expresan mejor que PAL de tipo salvaje; y análogos. Mutantes con actividad PAL de enzimas de tipo salvaje pueden producirse por ejemplo por modificación del DNA que codifica las enzimas de tipo salvaje utilizando métodos de mutagénesis conocidos por las personas expertas en la técnica (mutagénesis aleatoria, mutagénesis orientada, evolución dirigida, desordenamiento de genes, etc.) de tal modo que el DNA codifica una enzima que difiere al menos en un aminoácido de la enzima de tipo salvaje y por expresión del DNA así modificado en una célula adecuada (hospedador).

Alternativamente, pueden prepararse mutantes de expresión de PAL por modificación del DNA que codifica enzimas PAL de tipo salvaje utilizando métodos de mutagénesis conocidos por una persona experta en la técnica, tales que si el DNA se expresa en una célula (hospedador), el nivel de expresión de PAL es mayor para el DNA mutado que para el DNA no mutado. La persona experta conoce del modo de seleccionar estos mutantes de expresión de PAL, por ejemplo por medición de la actividad relativa para al menos tres sustratos diferentes y por comparación de la relación de las actividades con la enzima de tipo salvaje. Los mutantes de expresión tienen una mayor actividad para todos los sustratos diferentes, mientras que la relación de las actividades entre los sustratos es igual a la de la enzima de tipo salvaje. Los mutantes de la enzima PAL pueden tener propiedades mejoradas con respecto a (estereo)selectividad y/o actividad y/o estabilidad y/o resistencia a los disolventes y/o perfil de pH y/o perfil de temperatura, y/o expresión y/o inhibición de producto y/o de sustrato, y dichos mutantes de PAL pueden seleccionarse específicamente basándose en la presencia de cualquiera de estas propiedades mejoradas sola o en combinación de dos o más de las
mismas.

Puede ser ventajoso añadir un agente reductor al proceso de la presente invención a fin de reducir efectos negativos de oxígeno sobre la vida de PAL. Ejemplos de tales agentes reductores incluyen sulfuro de hidrógeno, ácido tioglicólico, ácido tiosulfúrico, ácido nitroso, ácido sulfuroso, sales de amonio y sales metálicas de los anteriores, ditiotreitol, etilmercaptano, etilenomercaptano, metilmercaptano, 2-mercaptoetanol, hidrógeno, óxido nitroso, compuestos de hierro(II), compuestos de manganeso(II), azufre y cinc. Preferiblemente, para reducir los efectos del oxígeno sobre la vida de PAL, el proceso de la presente invención puede realizarse en condiciones anaerobias de manera conocida por las personas expertas en la técnica, por ejemplo, por realización del proceso de la presente invención en atmósfera de nitrógeno. La persona experta en la técnica puede realizar experimentos de rutina para seleccionar las condiciones óptimas de reacción con respecto a - entre otros - temperatura, pH, concentración y disolventes.

Preferiblemente, la temperatura del paso PAL se selecciona de tal modo que la actividad de la PAL seleccionada sea óptima. Por ejemplo, la temperatura de reacción preferida para la PAL de Idiomarina loihiensis está comprendida en el intervalo de 0 a 50ºC, en particular de 25 a 45ºC, y de modo más particular de 27 a 37ºC.

Preferiblemente, el pH del paso PAL y la concentración del donante del grupo amino (con preferencia NH_{3}) se seleccionan de tal manera que la actividad de la PAL seleccionada y la estabilidad del compuesto de fenilalanina formado, y los rendimientos con los cuales se obtienen estos compuestos sean óptimos. Por ejemplo, el pH para la PAL de Idiomarina loihiensis está comprendido con preferencia en el intervalo de pH 8 a pH 14, en particular en el intervalo de pH 10 a 12, y de modo más particular en un intervalo de pH 10,5 a 11,5.

Por ejemplo, la concentración de hidróxido de amonio (NH_{4}OH) en agua para la PAL de Idiomarina loihiensis se selecciona con preferencia entre aproximadamente 5 y aproximadamente 25% en peso, en particular desde aproximadamente 10 a 15% en peso, y de modo más particular desde aproximadamente 12 a 14% en peso.

El proceso de la presente invención puede realizarse por ejemplo en amoniaco acuoso, al que pueden añadirse opcionalmente un co-disolvente, un agente de solubilización o un aditivo a fin de mejorar la solubilización del compuesto de ácido cinámico correspondiente o mejorar la actividad o estabilidad de PAL. Ejemplos de co-disolventes incluyen dimetilformamida, tetrahidrofuran-acetonitrilo, aldehído glutárico, glicerol, tolueno, etanol, acetona, éter y dimetilsulfóxido (DMSO). Ejemplos de agentes de solubilización incluyen Triton X100 (fabricado por Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wis), Tween-80 (fabricado por Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, Wis), polietilenglicol (PEG). Ejemplos de aditivos incluyen ácido glutámico, isoleucina, etilenglicol y sorbitol.

El compuesto de fenilalanina que se obtiene en el proceso de la presente invención puede utilizarse directamente en un paso siguiente o puede modificarse primeramente. El compuesto de fenilalanina puede purificarse a partir de la mezcla de reacción obtenida en el proceso de la presente invención utilizando métodos convencionales conocidos por las personas expertas en la técnica. Por ejemplo, la mezcla de reacción obtenida que comprende el compuesto de fenilalanina puede filtrarse o centrifugarse (para eliminar las partículas no disueltas, tales como por ejemplo las células hospedadoras que expresan PAL). Adicionalmente, el donante de grupo amino puede por ejemplo evaporarse, después de lo cual en el compuesto de fenilalanina puede aislarse, con preferencia por precipitación.

El rendimiento obtenido con el proceso de la presente invención es con preferencia al menos 30%, más preferiblemente al menos 40%, todavía más preferiblemente al menos 50%, con preferencia en particular al menos 60%, con preferencia de modo más particular al menos 80%, y de modo muy particular al menos 90%.

En una realización preferida del proceso de la presente invención, se prepara un compuesto de (S)-fenilalanina sustituido con cloro en orto (fórmula (2) en la cual X representa Cl y Z representa H)por reacción del compuesto de ácido cinámico 2-clorosustituido correspondiente en una solución acuosa de hidróxido de amonio, siendo la concentración de hidróxido de amonio en agua desde aproximadamente 12 a 14% en peso en presencia de PAL de Shewanella oneidensis, Idiomarina loihiensis, Fibrobacter succinogenes o Vibrio vulnificus, cuyas secuencias de aminoácidos se dan respectivamente en SEQ ID NO. 2 (que tiene una identidad de secuencia de 60% con SEQ ID NO. 4), SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 (que tiene una identidad de secuencia de 53% con SEQ ID NO. 4), y SEQ ID NO. 8 (que tiene una identidad de secuencia de 63% con SEQ ID NO. 4). Sorprendentemente, aunque estas cuatro enzimas se anotaron como histidina-amoniaco-liasas en la base de datos de GenBank del NCBI, estas cuatro enzimas tienen actividad de fenilalanina-amoniaco-liasa. Preferiblemente, en esta realización, la temperatura se selecciona entre 25 y 45ºC, y el pH está comprendido entre pH 10,5 y 11,5.

La descripción se refiere también a un proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido de acuerdo con la invención en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereo-selectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, con preferencia 90%, muy con preferencia 95% con SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 8.

Como se describe en WO2006/069799 A1, el compuesto de fenilalanina formado en el proceso de la presente invención puede utilizarse para preparar ácido (S)-indolina-2-carboxílico ópticamente activo que, a su vez, es un compuesto intermedio en la producción de ácido [2S-[1[R*(R*)-2\alpha,3a\beta,7a\beta]]-1-[2-[[1-(etoxicarbonil)butil]-amino]-1-oxopropil]octahidro-1H-indol-2-carboxílico.

Por consiguiente, la invención se refiere también a un proceso que comprende el proceso de la presente invención, en donde el compuesto de fenilalanina producido se convierte ulteriormente en un ingrediente farmacéuticamente activo, en particular [2S-[1[R*(R*)-2\alpha,3a\beta,7a\beta]]-1-[2-[[1-(etoxicarbonil)butil]amino]-1-oxopropil]octahidro-1H-indol-2-carboxílico.

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Ejemplos

Los clones siguientes se utilizaron en tests para actividad de PAL.

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Los genes que tienen las secuencias de ácido nucleico dadas arriba se amplificaron por PCR y los productos PCR purificados se fusionaron con los sitios NcoI y Bg/II del vector pSE420 (Invitrogen Corp. CA., EE.UU.), utilizando el método de clonación Xi. Por utilización de este método, el sitio NcoI se destruye después de clonación de los genes. Los plásmidos formados se transformaron en células TOP 10 de E. coli (Invitrogen), y se comprobaron respecto a la inserción correcta por análisis de restricción y electroforesis en gel de agarosa para dar los clones con el número de clon dado anteriormente.

El gen PAL de R. glutinis fue sintetizado por Genscript Corporation, Scotch Plains, EE.UU. de acuerdo con la secuencia de proteínas de la PAL de Rhodosporidium toruloides ATCC 10788, secuencia que está incluida en la base de datos de proteínas del NCBI bajo el número CAA31209. Los codones del gen PAL sintético se optimizaron para expresión en E. coli. El gen sintetizado se ligó en el sitio SmaI de pUC57 por Genscript para dar el constructo pUC57_PAL. El plásmido liofilizado (5 \mug) (obtenido de Genscript) se disolvió en 50 \mul de agua MilliQ y se utilizó 1 \mul de esta solución para transformar una parte alícuota de células DH5\alpha de E. coli químicamente competentes (Invitrogen, Breda, Países Bajos) de acuerdo con el protocolo del suministrador.

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Preparación de células y extracto exento de células Cultivo de E. coli que contiene las PALs

Se inocularon E. coli que contenían los plásmidos correspondientes cada uno en 20 ml de medio 2xTY (16 g/l Triptona; 10 g/l extracto de levadura, 7 g/l NaCl) complementado con carbenicilina (100 \mug/ml) y se incubaron durante una noche a 28ºC. Estos cultivos se utilizaron para inocular volúmenes mayores de medio (250 \mul de pre-cultivo para 250 ml de medio). Las células se dejaron crecer a 37ºC hasta que la DO alcanzó \sim1). Los clones PAL de Shewanella oneidensis (clon no. 1), Idiomarina loihiensis (clon no. 2), Fibrobacter succinogenes (clon no. 3), Vibrio vulnificus (clon no. 4) se indujeron con IPTG (concentración final 0,5 mM). El clon PAL de Rhodotorula glutinis se indujo con IPTG (concentración final 1 mM). Después de inducción, los cultivos se sacudieron a 28ºC durante una noche.

Las células (\sim2 g/250 ml de medio) se cosecharon por centrifugación (8.000 RPM a 4ºC), y se suspendieron de nuevo en tampón Tris 0,1M/HCl de pH 8,8 (1 ml tampón/0,5 g células). Las suspensiones de células se dividieron en partes alícuotas de 0,2 ml y se centrifugaron. Se desechó el sobrenadante, y el sedimento de células (aproximadamente 0,1 gramos en cada caso) se guardó a -20ºC.

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Determinación de proteínas, SDS-PAGE, preparación de CFE

Se resuspendieron 0,1 g de células en 1 ml de tampón Tris/HCl 0,1M de pH 8,8 y se disgregaron las células por sonificación. Una parte de las células sonificadas se centrifugó y el Extracto Exento de Células (CFE) se decantó. La concentración de proteínas en las diferentes fracciones se determinó por el método descrito por Bradford.

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Para determinar el nivel de expresión, se aplicaron 25 \mug de proteína de los Extractos Exentos de Células y los extractos de células totales a un gel NuPAGE.

5

Este análisis demuestra que los genes PAL se expresan satisfactoriamente en E. coli. No se formaron cuerpos de inclusión. El clon 2 (Idiomarina loihiensis) demostró los niveles de expresión máximos en E. coli.

Actividades iniciales a pH 9,25

Se preparó una solución de reacción por ajuste de una solución de amoniaco al 10% en peso a pH 9,25 con ácido sulfúrico a 30ºC.

Se prepararon soluciones 10 mM de ácido trans-2-bromo-cinámico en la solución de amoniaco. Se calentaron 4,8 ml de la solución sustrato a 30ºC. Se suspendieron 100 mg de un pelet de células en 100 \mul de la solución de amoniaco correspondiente y se añadieron a la mezcla de reacción. La reacción se siguió a lo largo del tiempo. La (L)-2-bromo-fenilalanina formada se determinó por análisis HPLC.

Las actividades relativas iniciales (comparadas con la actividad de células de E. coli que contenían PAL de R. glutinis) se miden a lo largo de los primeros 30-60 minutos de la reacción.

TABLA 1 Actividades relativas iniciales de clones PAL individuales comparadas con la PAL de R. glutinis

6

Como puede verse por la Tabla 1, los genes clonados de S. oneidensis, I. loihiensis, F. succinogenes y V. vulnificus eran todos ellos mucho más activos que el gen clonado de R. glutinis en las condiciones del test.

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Determinación de la inhibición de sustrato

Para reacciones a pH 11: 4,8 ml de soluciones 100 mM, 50 mM, 20 mM y 10 mM de ácido trans-2-bromo-cinámico en amoniaco al 13% en peso (ajustado a pH 11 con ácido sulfúrico a 30ºC) se calentaron a 30ºC.

Para reacciones a pH 9,25: Se suspendió ácido trans-2-bromo-cinámico sólido en 4,8 ml de amoniaco al 8% en peso (ajustado a pH 9,25 con ácido sulfúrico a 30ºC) para dar una concentración final de 50 mM, 20 mM y 10 mM. Las mezclas de reacción se calentaron a 30ºC. Para iniciar la reacción, se añadió una suspensión de 100 mg de pelet de células en 100 \mul de la solución de amoniaco correspondiente. La reacción se siguió a lo largo del tiempo. La (L)-2-bromo-fenilalanina formada se determinó por análisis HPLC.

Actividades iniciales (con relación al clon PAL de R. glutinis) en NH3 al 13% de pH 11 a diferentes concentraciones de sustrato:

7

Actividades iniciales (con relación al clon PAL de R. glutinis) en NH_{3} al 8% de pH 9,27 a diferentes concentraciones de sustrato:

8

: * nd: la actividad no se determinó debido a la actividad muy baja en estas condiciones

: Nota: Las reacciones con amoniaco al 8% de pH 9,27 eran lodos para concentraciones superiores a 20 mM.

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Como puede verse por los resultados anteriores, todas las PALs exhibían menos inhibición de sustrato que la PAL de R. glutinis. La PAL clonada a partir de I. loihiensis exhibe una tolerancia excepcional a concentraciones altas de sustrato incluso a valores de pH altos, para los cuales la solubilidad del sustrato es alta.

<110> DSM IP Assets BV

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<120> PROCESO PARA LA PREPARACIÓN DE UN COMPUESTO DE FENILALANINA

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<130> 25385WO

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<150> EP06019071.7

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<151> 2006-09-12

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<160> 10

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<170> PatentIn versión 3.3

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<210> 1

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<211> 1566

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<212> DNA

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<213> Shewanella oneidensis

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<400> 1

10

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<210> 2

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<211> 521

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<212> PRT

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<213> Shewanella oneidensis

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<400> 2

11

12

13

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<210> 3

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<211> 1548

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<212> DNA

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<213> Idiomarina loihiensis

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<400> 3

14

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<210> 4

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<211> 515

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<212> PRT

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<213> Idiomarina loihiensis

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<400> 4

15

16

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<210> 5

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<211> 1527

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<212> DNA

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<213> Fibrobacter succinogenes

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<400> 5

18

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<210> 6

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<211> 508

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<212> PRT

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<213> Fibrobacter succinogenes

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<400> 6

19

20

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<210> 7

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<211> 1539

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<212> DNA

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<213> Vibrio vulnificus

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<400> 7

21

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<210> 8

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<211> 512

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<212> PRT

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<213> Vibrio vulnificus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

22

23

24

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<210> 9

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<211> 2151

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<212> DNA

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<213> Rhodotorula glutinis

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<400> 9

25

26

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<210> 10

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<211> 716

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<212> PRT

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<213> Rhodotorula glutinis

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<400> 10

27

28

29

Claims

1. Proceso para la preparación de un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido por reacción del ácido cinámico correspondiente con un donante de grupo amino en presencia de una fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva que tiene una identidad de secuencia de al menos 50% con SEQ ID NO. 4.

2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el compuesto de fenilalanina es un compuesto de fórmula (1) o una sal del mismo

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30

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en donde Y representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo ariloxi sustituido o no sustituido, o un residuo amina y en donde Z representa uno o más sustituyentes en un grupo aromático que se seleccionan de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo amina, un grupo nitro, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, una amida carboxílica, o un grupo nitrilo o trifluorometilo.

3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el compuesto de fenilalanina es un compuesto de fórmula (2) o una sal del mismo

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31

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en donde Z representa uno o más sustituyentes en un grupo aromático que se seleccionan de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alifático cíclico o acíclico opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo heterocíclico alifático opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo (hetero)arilo opcionalmente sustituido, un grupo alcoxi opcionalmente sustituido con 1-10 átomos de carbono, un átomo de halógeno, un grupo amina, un grupo nitro, un ácido carboxílico, un éster carboxílico, una amida carboxílica, un grupo nitrilo o trifluorometilo y en donde Y representa un grupo hidroxilo, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido con 1-10 átomos de carbono, un grupo ariloxi sustituido o no sustituido, o un residuo amina, y en donde X representa un grupo lábil, por ejemplo un grupo lábil seleccionado del grupo de halógeno, mesilato, nosilato, tosilato, triflato, ácido borónico, un grupo nitro y análogos.

4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde X representa cloruro o bromuro, Y representa hidroxilo y Z representa hidrógeno.

5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el compuesto de fórmula (1) es (S)-2-clorofenilalanina o (S)-2-bromofenilalanina.

6. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el donante de grupo amino es NH_{3} o NH_{4}OH.

7. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la fenilalanina-amoniaco-liasa estereoselectiva tiene la secuencia de aminoácidos que se presenta en SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 8.

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8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, que comprende adicionalmente el paso de, someter a ciclación un compuesto de fenilalanina enantioméricamente enriquecido, quiral y sustituido con X en orto, de acuerdo con la fórmula (2)

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o una sal del mismo, en la cual Y y Z son como se define arriba y X es un grupo lábil, a una temperatura inferior a aproximadamente 140ºC, con lo cual se forma un compuesto de ácido indolina-2-carboxílico enantioméricamente enriquecido de acuerdo con la fórmula (3)

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9. Proceso para la producción de un ingrediente farmacéutico activo, que comprende el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.