ES2339730A1 - Composiciones y metodos para inhibir la actividad de p300. - Google Patents
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Abstract
La invención se relaciona con variantes del dominio N-terminal de activación de transcripción de p300 que presentan mutaciones en los sitios de fosforilación dando lugar a mutantes no fosforilables y que carecen de actividad transcripcional o de mutantes que mimetizan restos residuos fosforilados dando lugar a variantes constitutivamente activas de p300. Las variantes de p300 se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedades autoinmunes, infecciones, etc.
Description
Composiciones y métodos para inhibir la
actividad de p300.
La invención se relaciona con composiciones
útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con una
activación o una inhibición indeseadas de factores de transcripción
que requieren de p300 como co-activador. En
particular, las composiciones de la invención son útiles para el
tratamiento de enfermedades tales como cáncer, enfermedades
autoinmunes, infecciones, etc.
Las proteínas p300 y CBP son importantes
reguladores de la transcripción inducible en células eucariotas.
Estas proteínas fueron identificadas originalmente como proteínas
que interaccionaban con el factor de transcripción CREM y con la
proteína adenoviral E1A. Los co-activadores actúan
de dos formas distintas. Por un lado, actúan como un puente
molecular conectando los factores de transcripción con la maquinaria
transcripcional, incluyendo TBP, TFIIIB, TFIID y la ARN polimerasa
II. Por otro lado, CBP y p300 son capaces de acevilar histonas en la
cromatina del promotor diana gracias a la actividad histona
acetiltransferasa (HAT) presente en su región
C-terminal, lo que provoca un cambio conformacional
en la cromatina adquiriendo una estructura abiertas CBP/p300
interaccionan con y aumentan la transactivación de una variedad de
factores de transcripción, incluyendo p53, factores de la familia
E2F, CREB, NF-AT, NF-\kappaB y
AP-1, coordinando la transcripción de los genes
dianas. Por tanto, CBP y p300 están implicados en la regulación de
múltiples procesos celulares, incluyendo proliferación,
diferenciación, supresión tumoral, transformación maligna y varias
alteraciones inmunológicas.
Por tanto, resulta de interés el disponer de
agentes que permiten modular la actividad de p300, tanto mediante su
estimulación como mediante su inhibición. Inhibidores de la
actividad transcripcional de p300 basados en la inhibición de la
actividad acetil transferasa han sido descritos en el estado de la
técnica. Así, WO03027279 describe una histona acetiltransferasa,
Zheng et al. (J. Am. Chem. Soc. 2005 Dec
14;127(49):17182-3) han descrito un inhibidor
de la actividad histona acetiltransferasa de p300 formado por un
análogo de coenzima A acoplado mediante un puente disulfuro a un
resto de oligoarginina que promueve el transporte a través de
membranas; Balasubramanyam, K. et al (J. Biol. Chem.
279:51163-71) han descrito la capacidad de la
curcumina de inhibir la actividad histona acetiltransferasa de p300;
Stimson et al (Mol. Cancer Ther., 2005,
10:1521-32) han descrito compuestos isotiazolónicos
que inhiben la actividad histona acetiltransferasa de p300 y la
solicitud de patente japonesa JP2000139464 describe oligonucleótidos
antisentido dirigidos contra p300 y CBP y su uso para el tratamiento
de la leucemia.
CBP/p300 contienen dos dominios que presentan
actividad transcripcional, uno de ellos localizado en el extremo
N-terminal y el otro en el extremo
C-terminal, que pueden actuar independientemente e
interaccionar simultáneamente con la maquinaria transcripcional y/o
con diferentes factores de transcripción para generar la actividad
transcripcional mediada por co-activadores. La
transactivación mediante por CBP y p300 se regula a través de
múltiples vías de señalización que resultan en distintos tipos de
modificaciones post-traduccionales de los dominios
de transactivación, incluyendo sumoilación, fosforilación,
metilación y auto-acetilación. Entre ellas, la
forsforilación parece ser una de las modificaciones de mayor
importancia dado que la actividad HAT de CBP y p300 se ve aumentada
por la quinasas MAP p42 y o44, CaMK IV, PKA, Akt y
IKK-alpha. Por otro lado, la actividad
transcripcional de CBP/p300 está controlada negativamente por el
complejo ciclina e/cdk-2 o por la fosforilación por
la proteína quinasa delta (PKC-\delta).
Por tanto, es posible regular la actividad de
p300 mediante la modificación del estado de fosforilación. Sin
embargo, a pesar de que se conoce la relación entre fosforilación y
actividad, los sitios exactos de fosforilación y las quinasas
responsables son desconocidos. Yuan et al (Biochim Biophys
Acta. 2002, 1592:205-11) han descrito la capacidad
de la proteína quinasa delta de fosforilar la serina en posición 89
de p300 provocando la inhibición de la actividad histona
acetiltransferasa.
Por tanto, existe una necesidad en la de técnica
de agentes capaces de modificar los patrones fisiológicos de
fosforilación de la proteína p300/CBP y que permitan regular a
voluntad la actividad de p300.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1 (amino
ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) o una variante de la
misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y que
carece de actividad trans-activadora de la
transcripción.
En otro aspecto la invención se relaciona con un
polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO:1
(amino ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) cuya actividad
trans-activadora de la transcripción se encuentra
constitutivamente activada.
En aspectos adicionales, la invención se
relaciona con construcciones génicas que comprenden los
polinucleótidos de la invención, con vectores que comprenden los
polinucleótido de la invención o las construcciones génicas de la
invención, con células que comprende los polipéptidos de la
invención, los polinucleótidos de la invención, los vectores de la
invención o las construcciones génicas de la invención y con
animales transgénicos no humano que comprende, integrado en su
genoma, los polinucleótidos de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polipéptido de la invención, con un polinucleótido de la
invención, con una construcción génica de la invención, con un
vector de la invención para su uso en medicina.
En un primer aspecto, la invención se relaciona
con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 o una
variante de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de
secuencia y que carece de actividad trans-activadora
de la transcripción para el tratamiento de enfermedades causados por
una activación indeseada de las proteínas p300,
NF-\kappaB, NFAT y/o c-jun.
En otro aspecto la invención se relaciona con un
polipéptido que comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO:1
cuya actividad trans-activadora de la transcripción
se encuentra constitutivamente activada para el tratamiento de
enfermedades causados por una inhibición indeseada de las proteínas
p300, NF-\kappaB, NFAT y/o
c-jun.
Figura 1. La proteína viral A238L inhibe la
interacción entre el extremo N-terminal TAD de p300
y PKC. Células Jurkat-pcDNA y
Jurkat-A238L se transfectaron con diferentes
mutantes GAL4-p300. A, GAL4-p300 FL;
B, GAL4-p300 1-1301; C,
GAL4-p300 192-703; y D,
GAL4-p300 1239-2414, como se ha
descrito en Materiales y Métodos. Veinticuatro horas después de la
transfección, las células se incubaron en ausencia o presencia de
PMA/Ion durante 4 h, y los extractos nucleares se inmunoprecipitaron
con 4 \mug de anticuerpo policlonal de conejo contra PKC, o con
IgG como control negativo. Los inmunopreipitados se analizaron por
Western Blot con el mismo anticuerpo (\alphaPKC) para determinar
los niveles de proteínas en el precipitado, y con
anti-GAL4 (\alphaGAL4) para detectar los niveles
de PKC asociada con la correspondiente forma mutante de p300. El
análisis densitométrico muestra la relación entre PKC
coinmunoprecipitada y p300 presente en el precipitado, de tres
experimentos independientes (mean \pm S.D). E, La
inmunoprecipitación de PKC se analizó por Western blot con un
anticuerpo anti-SV5 para detectar los niveles de
A238L-SV5 asosciada a PKC. El análisis
densitométrico muestra la relación entre A238L coinmunoprercipitada
y PKC presente en el precipitado, de tres experimentos
independientes (mean \pm S.D). F, En paralelo, la PKC
inmunoprecipitada se usó en un ensayo kinasa in vitro,
utilizando como sustrato MBP purificado. Las proteínas se separaron
mediante un gel de poliacrilamida SDS-PAGE al 12% y
se reveló mediante autoradiografía. El análisis densitométrico
muestra la relación entre MBP [^{32}P] fosforilado y PKC
inmunoprecipitada, de tres experimentos independientes (mean \pm
S.D).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 2. La fosforilación de la Serina 384 por
PKC-\theta, representa un paso esencial en la
activación transcripcional de p300. A, Células Jurkat
wild-type se cotransfectaron de forma transitoria
con el plásmido reportero GAL4-luc, y con las
siguientes construcciones de GAL4-p300:
GAL4-p300 (FL) wild type (WT) y Serina 384 mutante
Alanina (S384A), y GAL4-p300
(192-703) wild type (WT) y Serina 384 mutante
Alanina (S384A), como se ha descrito en Materiales y Métodos.
Veinticuatro horas después de la transfección las células se
incubaron en ausencia (control) o presencia de PMA/Ion, los
extractos celulares se procesaron y se midió la actividad
luciferasa. Los extractos se normalizaron a la actividad luciferasa
Renilla. Se muestran los valores de RLU/\mug de proteína de tres
experimentos independientes (mean \pm S.D.) B, Células Jurkat
wild-type se transfectaron transitoriamente con los
plásmidos de expresión GAL4-p300
(192-703) wild type (WT) y Serina 384 mutante
Alanina (S384A), como se ha descrito en Materiales y Métodos. Las
proteínas GAL4-p300 fueron inmunoprecipitadas con un
anticuerpo específico para GAL4. C, PKC-\theta se
inmunoprecipitó a partir de extractos celulares de Jurkat
wild-type. Los inmunoprecipitados
GAL4-p300 (192-703) wild type (WT) y
Serina 384 mutante Alanina (S384A) se usaron como sustrato para
PKC-\theta en ensayos kinasa in vitro. Las
proteínas se separaron en geles de poliacrilamida
SDS-PAGE al 8% y se revelaron por autoradiografía.
El análisis densitométrico muestra la relación entre p300-[^{32}P]
y PKC-\theta inmunoprecipitada, de tres
experimentos independientes (mean \pm S.D). D, Efecto de la
sobreexpresión de PKC-\theta en la activación
tyranscripcional de p300. Células Jurkat-pcDNA
(barras blancas) o Jurkat-A238L (barras grises) se
transfectaron transitoriamente con el plásmido vacío pEFneo y los
plásmidos de expresión
pEF-KC-\theta wild type (wt) o el
mutante constitutivamente activo PKC-\theta
(pEF-PKC-\theta A/E) (1
\mug/10^{6} cells), y con las construcciones
GAL4-p300 full length (FL) o amino terminal
(192-703), junto con el plásmido reportero
GAL4-luc (250 ng/10^{6} cells) como se describe en
Materiales y Métodos. Después de la transfección las células se
incubaron en ausencia (-) o presencia (+) de PMA/Ion, y se midió la
actividad luciferasa. Los extractos se normalizaron a la actividad
luciferasa Renilla. Se muestran los valores de RLU/\mug de
proteína de tres experimentos independientes (mean \pm S.D.) E,
Células Jurkat-pcDNA y Jurkat-A238L
se transfectaron de forma transitoria con GAL4-p300
(192-703) wild type (WT), como se describe en
Materiales y Métodos. Veinticuatro horas después de la transfección
las células se incubaron en ausencia (-) o presencia (+) de PMA/Ion
durante 2 h, los extractos celulares se inmunoprecipitaron con 4
\mug de anticuerpo policlonal de conejo contra
PKC-\theta, o con IgG como control negativo. Los
inmunoprecipitados se analizaron por Western blot con el mismo
anticuerpo (\alphaPKC-\theta) para determinar
los niveles de kinasa en el precipitado, y con anti GAL4
(\alphaGAL4) para detectar los niveles de PKC asociada con
GAL4-p300 (192-703). El análisis
densitométrico muestra la relación entre PKC coinmunoprecipitada y
p300 presente en el precipitado, de tres experimentos
independientes
(mean \pm S.D).
(mean \pm S.D).
\newpage
Figura 3. Células Jurkat
wild-type se transfectaron de forma transitoria con
los plásmidos de expresión GAL4-p300 full length
(FL) y amino terminal (192-703), wild type (WT) y
Serina 384 muíante Alanina (S384A), como se describe en Materiales y
Métodos. Los extractos nucleares de 10^{7} células Jurkat
transfectadas y tratadas (+) o no (-) con PMA/Ion durante 4 h fueron
inmunoprecipitados con 4 \mug de anticuerpo policlonal de conejo
contra GAL4, o con IgG como control negativo. Los inmunoprecipitados
se analizaron por Western blot con el mismo anticuerpo GAL4 para
determinar los niveles de estas proteínas en el precipitado, y con
un anticuerpo anti Usinas acetiladas (\alphaAc.Lys) para detectar
p300 acetiladas, como se describe en Materiales y Métodos. El
análisis densitométrico muestra las veces de inducción de las
proteínas GAL4-p300 estimuladas respecto las
condiciones basales, de tres experimentos independientes (mean \pm
S.D).
Los autores de la presente invención han puesto
de manifiesto que, sorprendentemente, la serina 384 del dominio CH1
de la proteína p300 es esencial para la actividad transcripcional de
p300 y que dicha serina es objeto de fosforilación por la isoforma
theta de PKC. Adicionalmente, los autores de la invención han
demostrado que la región de p300 en la que se encuentra la serina
384 interacciona con la proteína A238L del virus de la peste porcina
africana (VPPA) y que dicha interacción bloquea la capacidad de p300
de interaccionar con PKC\theta, siendo este bloqueo el responsable
de la capacidad de la proteína A238L de inhibir la actividad
transcripcional de p300. Estos hallazgos abren la puerta al diseño
de variantes de p300 que carecen de actividad activadora de la
transcripción así como de variantes de p300 que se encuentran
constitutivamente activadas.
Por "p300" se entiende, en el contexto de
la presente invención, la proteína humana p300 cuyo número de acceso
en UniProt viene dado por EP300_HUMAN o Q09472 cuya secuencia viene
dada por la secuencia indicada en SEQ ID NO:2.
Por "variante de p300" se entiende, en el
contexto de la presente invención, una proteína que comprende la
secuencia mínima de p300 capaz de promover la transcripción de un
gen cuando se encuentra en la proximidad de su región promotora.
Así, en un primer aspecto, la invención se
relaciona con un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1
(amino ácidos 192 a 703 de la proteína p300 humana) o una variante
de la misma que muestra al menos un 80% de identidad de secuencia y
que carece de actividad trans-activadora de la
transcripción.
Sin querer estar vinculado a ninguna teoría, se
piensa que la actividad bloqueadora de la activación transcripcional
mediada por las variantes de la invención radica en la capacidad de
estas variantes de secuestrar las dianas down-stream
de ésta proteína, es decir, la proteína quinasa theta impidiendo que
ésta active moléculas de p300 endógenas o los factores de
transcripción con los que habitualmente interacciona p300
(NF-\kappaB, c-jun,
NF-AT) impidiendo la unión de éstos a la proteína
p300 endógena nativa.
Un ensayo adecuado para determinar la actividad
trans-activador a de la transcripción de un
polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1 se ha descrito en
los ejemplos y consiste en poner en contacto una proteína de fusión
formada por el dominio de unión a ADN de la proteína GAL4 y la
variante cuya actividad activadora de la transcripción se desea
ensayar con una célula que comprende un gen reporter bajo el control
de un sitio de unión para el dominio de unión de ADN de la proteína
GAL4. De esta forma, la proteína de fusión sólo provocará expresión
del gen reportero si la variante que se encuentra unida al sitio de
unión de ADN de GAL4 es capaz de activar la transcripción (véase
ejemplo 2).
En una forma de realización, la inactivación de
p300 puede llevarse a cabo mediante modificación del amino ácido en
posición 193 en la proteína de SEQ ID NO:1 (correspondiente al amino
ácido en posición 384 en la proteína p300 de cadena completa) por un
amino ácido que no es fosforilable ni un análogo estructural de
fosfoamino ácido. Preferiblemente, el amino ácido en posición 193 en
la secuencia de SEQ ID NO:1 es Ala.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1 que se
encuentran constitutivamente activadas. Por variantes
"constitutivamente activadas" se entiende, en el contexto de la
presente invención, todas aquellas variantes de p300 que son capaces
de promover la transcripción de genes cuando la variante se localiza
en proximidad en la región reguladora de la expresión de dicho gen
sin requerir para ello la fosforilación de la serina en posición
384.
Sin querer estar vinculado a ninguna teoría, se
piensa que la actividad activadora de la transcripcional mediada por
las variantes de la invención radica en la capacidad de estas
variantes de mimetizar p300 fosforilada en posición 384, eliminando
por tanto la necesidad de fosforilar con PKCtheta y activando de
forma directa y constitutiva la transcripción mediada por los
factores de transcripción con los que habitualmente interacciona
p300 (NF-\kappaB, c-jun,
NF-AT).
Un ensayo adecuado para determinar la actividad
transcripcional de la variante de la invención se ha descrito
anteriormente para las variantes inactivas y se basa en la capacidad
de dicha variante de activar la transcripción de un gen reportero
cuando dicha variante se encuentra asociada a la región reguladora
de la expresión de dicho en mediante el uso del dominio de unión de
ADN de un factor de transcripción cualquiera (por ejemplo GAL4)
(véase ejemplo 2).
En una forma preferida de realización, la
variante comprende la secuencia identificada en SEQ ID NO:1 en la
que la serina en posición 193 ha sido reemplazada por un amino ácido
que es estructuralmente similar a fosfoserina. En otro aspecto, la
variante constitutivamente activa de p300 contiene un resto de
aspártico en posición 193.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un polinucleótido que codifica un polipéptido inactivo de acuerdo a
la invención o un polipéptido constitutivamente activo de acuerdo a
la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una construcción génica que comprende el polinucleótido la
invención. Preferiblemente, las construcciones génicas contienen el
polinucleótido de la invención junto con regiones adecuadas para
regular la expresión de dicho polinucleótido incluyendo promotores,
terminadores de la transcripción, regiones no traducidas 5' y 3',
señales de poliadenilación y similares.
En principio, cualquier promotor puede ser
utilizado a los vectores de clonaje en el contexto de la presente
invención siempre que dicho promotores sean compatibles con las
células en las que se desea expresar el polinucleótido. Así,
promotores adecuados para la realización de la presente invención
incluyen, sin estar necesariamente limitados, promotores
constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus
eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV,
virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del
gen de la metalotioneina, el promotor del gen de la timidina kinasa
del virus del herpes simplex, regiones LTR de los retrovirus, el
promotor del gen de la inmunoglobuina, el promotor del gen de la
actina, el promotor del gen EF-1alpha así como
promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende
de la adición de una molécula o de una señal exógena, tales como el
sistema tetraciclina, el sistema NF\kappaB/luz UV, el sistema
Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico, los promotores
regulables de la ARN polimerasa II descritos en WO/2006/135436 así
como promotores específicos de tejido tales como:
- -
- promotores específico de tejido gástrico tales como el promotor de la subunidad beta de la ATPasa H/K, el promotor K19, el promotor de metalotioneina. el promotor TFF1, el promotor TFF2 y el promotor FOXa/HNF2 gamma,
- -
- promotores específicos de pancreas tales como el promotor de la elastasa, el promoter Pdx-1, el promotor de la insulina o el promotor de la fosfoglicerato quinasa,
- -
- promotores específicos de pulmón tales como el promotor de la proteína secretora de células Clara o el promotor del surfactante C,
- -
- promotores específicos de tejido mamario tal como el promotor del virus del tumor mamario de ratón o el promotor de la proteína acídica del suero,
- -
- promotores específicos de piel como el promotor de queratina o el promotor K14,
- -
- promotores específicos de esófago como el promotor de la proteína L2 de EBV,
- -
- promotores específicos de hígado como el promotor de la proteína urinaria mayoritaria o el promotor de albúmina,
- -
- promotores específicos de colon como el promotor de la villina o el promotor de FABP-TS4,
- -
- promotores específicos de próstata como el promotor de la criptidina 2, el promotor del antígeno específico de próstata (PSA), el promotor de C(3)1 de la proteína secretora de próstata de 94 amino ácidos (PSP94) o el promotor de la probasina,
- -
- promotores específicos de riñon tales como el promoter de la uromodulina, el promoter de la proteína Tamm-Horsfall o el promotor de la gamma-glutamil transpeptidasa de tipo 1,
- -
- promotores específicos de vejiga tales como el promtoro de la uroplaquina o el promoter de la urohingina,
- -
- promotores específicos de útero como el promoter de la uteroglobina.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, la invención se relaciona con
vectores que comprenden el polinucleótido de la invención o las
construcciones génicas de la invención. Así, es posible el uso de
vectores derivados de vectores de expresión en procariotas tales
como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322,
pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, fagos y vectores "shuttle" tales como
pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levaduras tales como vectores
del tipo de plásmidos de 2 micras, plásmidos de integración,
vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de
expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie
pAC y de la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como
vectores de la serie pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB,
pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células
eucariotas superiores bien basados en vectores virales (adenovirus,
virus asociados a los adenovirus así como retrovirus y, en
particular, lentivirus) así como vectores no virales tales como
pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2,
pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl,
pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10,
pBPV-1, pML2d y pTDTl.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
células que comprenden en su interior al menos un polinucleótido de
la invención, una construcción génica de la invención o un vector de
acuerdo con la invención. Los huéspedes pueden contener una o más
copias de los vectores mencionados anteriormente son un objeto
adicional de la presente invención. Preferiblemente, los huéspedes
son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no están
limitadas a, células procedentes de mamífero, planta, insecto,
hongos o bacteria. Las células bacterianas incluyen, pero no están
limitadas a, células de bacterias Gram positivas tal como varias
especies de los géneros Bacillus, Steptomyces y
Staphylococcus o células de bacterias Gram negativas tal como
varias especies de los géneros Escherichia y
Pseudomonas. En el grupo de las células de hongos se utilizan
preferiblemente células de levadura. Se puede alcanzar la expresión
en levadura utilizando cepas de levadura tal como entre otras
Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y
Hansenula polymorpha. Además, se pueden utilizar células de
insecto tal como células de Drosophila y Sf9 como células huésped.
Además de eso, las células huésped pueden ser células vegetales tal
como entre otras células de plantas de cultivo tal como plantas de
silvicultura, o células de plantas que proporcionan alimento y
materias primas tal como plantas de cereales, o plantas medicinales,
o células de plantas ornamentales, o células de flores de bulbos de
cultivo. Las plantas o las células vegetales transformadas
(transgénicas) se producen mediante métodos conocidos, por ejemplo,
transferencia de genes mediada por Agrobacterium, transformación de
discos de hojas, transformación de protoplastos mediante
transferencia de ADN mediada por polietilenglicol, electroporación,
sonicación, microinyección o transferencia de genes balística.
Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un
sistema de baculovirus. Los sistemas de expresión que utilizan
células de mamífero tal como células de ovario de hámster chino
(CHO), células COS, células BHK, células HeLa, células CHO, células
Vero, células MDCK, células 293, células 3T3, células de melanoma de
Bowes y similares son preferidas en la presente invención. Las
células de mamífero proporcionan proteínas expresadas con las
modificaciones postraduccionales que son más similares a las
moléculas naturales procedentes de mamíferos. Puesto que la presente
invención se ocupa de moléculas que puede que se tengan que
administrar a seres humanos, un sistema de expresión completamente
humano sería particularmente preferido. Por lo tanto, aún más
preferiblemente, las células huésped son células humanas, tal como
células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 o PER.C6^{TM} (PER.C6 es una
marca registrada que pertenece a Crucell Holland B.V.) y células
derivadas de las mismas mediante modificación genética.
Las variantes inactivas de p300 de acuerdo a la
invención pueden ser utilizadas para el tratamiento de todos
aquellos trastornos causados por una activación indeseada de p300 o
de todos aquellos factores de transcripción que actúan aguas debajo
de p300, tales como NF-\kappaB,
NF-AT y c-jun.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con una variante inactiva de p300, un polinucleótido que codifica
dicha variante, una construcción génica que comprende dicho
polinucléotido o un vector que comprende dicho polinucleótido o
dicha construcción para uso en medicina.
En una forma preferida de realización, el
polipéptido, polinucleótido, construcción génica o vector se
utilizan en el tratamiento de trastornos causados por una activación
indeseada de las proteínas p300, NF-\kappaB, NFAT
y/o c-jun. Preferiblemente, los polipéptidos se usan
para el tratamiento de trastornos en los que se produce una
activación indeseada de NF-\kappaB.
Preferiblemente, dicha enfermedad asociada a una activación
indeseada de NF-\kappaB se selecciona del grupo de
una enfermedad inflamatoria y una enfermedad autoinmune.
Puesto que p300 actúa como mediador de la
actividad pro-tumorigénica de distintos factores de
transcripción y de algunas oncoproteínas virales, la activación
indeseada de p300 puede resultar en el desarrollo de trastornos
neoplásicos. Por tanto, las variantes inactivas de p300 de acuerdo a
la invención pueden ser usadas para el tratamiento de trastornos
neoplásicos debidos a una hiperactividad de ciertos oncogenes o
asociados a infecciones por virus que expresan oncoproteínas.
En otro aspecto, los compuestos de la invención
permiten el tratamiento de trastornos causados por una activación
indeseada de NF-\kappaB. Estos trastornos
incluyen, entre otros, enfermedades causadas por la producción
excesiva de mediadores inflamatorios y por la propagación viral, en
particular, enfermedades causadas por la hiperproliferación de
queratinocitos y/o de células T, en particular enfermedades
inflamatorias y enfermedades autoinmunes tales como enfermedad de
Addison, alopecia areata, espondilitis anquilosante, anemia
hemolítica, anemia perniciosa, aftas, estomatitis añosa, artritis,
arterioesclerosis, osteoartritis, artritis reumatoide,
aspermiogénesis, asma bronquial, asma autoinmune, hemolisis
autoimnmune, enfermedad de Bechet, enfermedad de Boeck, enfermedad
inflamatoria intestinal, linfoma de Burkitt, enfermedad de Crohn,
corioiditis, colitis ulcerosa, enfermedad celiaca, crioglobulinemia,
dermatitis herpetiformis, dermatomiositis, diabetes dependiente de
insulina, diabetes juvenil, enfermedades demielinantes autoinmunes,
contractura de Dupuytren, encefalomielitis, encefalkomieltis
alérgica, endoftalmia, enteiritis alérgica, síndrome enteropatía
autoimnue, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiomática,
síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, glomerulonefritos,
síndrome de Goodpasture, síndrome de Graves, enfermedad de
Harnman-Rich, enfermedad de Hashimoto, pérdida
repentina de audición, hepatitis crónica, enfermedad de Hodgkin,
hemoglobinuria paroximástica, hipogonadismo, ileitis regionales,
iritis, leucopenia, lupus eritematoso diseminado, lupus eritematoso
sistémico, lupus eritematoso cutáneo, linfogranuloma, mononucleosis
infecciosa, miastenia gravis, mielitis traversa, mixedema idiomático
primario, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa,
pancretitis, pénfigo vulgar, poliarteritis nodosa, poliartritis
crónica, polimiositis, poliradicultis aguda, psoriasis, purpura,
pioderma gangrenoso, síndrome de Reiter, sarcoidosis, esclerosis
atáxica, esclerosis sistémica progresiva, escleritis, esclerodermia,
esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, infertilidad debida a
anticuerpos anti-espertazoides, trombocitopenia,
timoma, uveitis anterior aguda, vitíligo, enfermedades asociadas al
SIDA, SCID y virus de Epstein Barr tales como el síndrome de
Sjorgren, el linfoma de células B asociado a SIDA o a virus de
Epstein-Barr, enfermedades parasitarias tales como
leishmaniosis y estados inmunosuprimidos tales como infecciones
virales tras transplantes, SIDA, cáncer, hepatitis activa crónica,
el rechazo de transplante a consecuencia del transpñante de un
tejido u órgano y la enfermedad de injerto contra huésped que puede
resultar del transplante de médula osea o de células troncales.
En otro aspecto, los compuestos de la invención
permiten el tratamiento de trastornos causados por una activación
indeseada de NF-AT. NF-AT es un
factor de transcripción que aparece en distintas células del sistema
inmune (células T, células B, células linfocítica natural o células
NK y monocitos), por lo que los trastornos incluyen, aquellos en los
que se produce una hiperactivación indeseada o actividad inapropiada
del sistema inmune e incluyen, sin limitación, enfermedades tales
como enfermedades inmunes agudas y crónicas y enfermedades
autoinmunes. Ejemplos de este tipo de enfermedades han sido citados
anteriormente con respecto a la activación indeseada de
NF-\kappaB.
En otro aspecto, los compuestos de la invención
permiten el tratamiento de trastornos causados por una activación
indeseada de c-jun. El oncogén celular
c-jun es una fosfoproteína nuclear de 39 kDa que
forma parte del factor de transcricpción heterodimérico
AP-1 junto con la proto-oncoproteína
c-fos. El complejo AP-1 es capaz de
activar la transcripción de múltiples genes que se encuentran bajo
el control de sitios de unión de AP-1 que conduce en
muchos casos a la transformación celular y a la carcinogénesis. Por
tanto, los compuestos de la invención son útiles para el tratamiento
de trastornos o enfermedades neoplásica se selecciona del grupo que
consiste en leucemias (por ejemplo, leucemia mieloide aguda,
leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica,
leucemia promielocítica aguda, síndrome mielodisplásico, leucemia
mielomonocítica juvenil, etc.), metástasis, neoplasias, tumores (por
ejemplo, neuroma acústico, adenocarcinoma, cáncer adrenocortical,
carcinoma anal, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma de células
basales, carcinoma de conductos biliares, carcinoma de vesícula,
cáncer de cerebro, cáncer de mama, carcinoma broncogénico, cáncer
del peritoneo, cáncer cervical, condrosarcoma, cordoma,
coriocarcinoma, carcinoma de colon, cáncer colorrectal,
craniofaringioma, cistadenocarcinoma, carcinoma embrionario,
carcinoma endometrial, endoteliosarcoma, epindimoma, carcinoma
epitelial, cáncer de esófago, tumor de Ewing, fibrosarcoma, cáncer
gastrointestinal, cáncer del aparato genitourinario, glioblastomas,
glioma, cáncer de cabeza, hemangioblastoma, hepatoma, enfermedad de
Hodgkin, cáncer de riñon, liomiosarcoma, liposarcoma, cáncer de
hígado, carcinoma de pulmón, linfangioendoteliosarcoma,
linfangiosarcoma, linfomas, hipercalcemia maligna, insulanoma
pancreático maligno, carcinoma medular, meduloblastoma, melanoma,
meningioma, mesotelioma, cáncer de cuello, neuroblastoma, linfoma no
de Hodgkin, carcinoma de no células pequeñas de pulmón,
oligodendroglioma, sarcoma osteogénico, cáncer de ovario, cáncer de
páncreas, adenocarcinomas papilares, carcinoma papilar, carcinoma de
pene, pinealoma, lesiones de la piel premalignas, tumores primarios
del cerebro, macroglobulinemia primaria, trombocitosis primaria,
cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales,
retinoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de las glándulas
salivares, sarcoma, carcinoma de las glándulas sebáceas, seminoma,
carcinoma de células pequeñas de pulmón, carcinoma de células
escamosas, cáncer de estómago, sinovioma, carcinoma de glándula
sudorípara, tumor testicular, cáncer de tiroides, carcinoma de
útero, cáncer de vulva, y tumor de Wilms), o cualquier enfermedad o
trastorno caracterizado por un crecimiento celular incontrolado.
Las variantes constitutivamente activas de p300
de acuerdo a la invención pueden ser utilizadas para el tratamiento
de todos aquellos trastornos causados por una activación indeseada
de p300 o de todos aquellos factores de transcripción que actúan
aguas debajo de p300, tales como NF-\kappaB,
NF-AT y c-jun.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona
con una variante constitutivamente activa de p300, un polinucleótido
que codifica dicha variante, una construcción génica que comprende
dicho polinucleótido o un vector que comprende dicho polinucleótido
o dicha construcción para uso en medicina.
En una forma preferida de realización, el
polipéptido, polinucleótido, construcción génica o vector se
utilizan en el tratamiento de trastornos causados por una inhibición
indeseada de las proteínas p300, NF-\kappaB,
NF-AT y/o c-jun. Preferiblemente,
los polipéptidos se usan para el tratamiento de trastornos en los
que se produce una inhibición indeseada de
NF-\kappaB, NF-AT o
c-jun. Preferiblemente, los compuestos de la
invención son útiles para el tratamiento de condiciones de
inmunodeficiencia innatas o adquiridas, enfermedades causadas por
una apoptosis prematura durante el desarrollo, para potenciar la
respuesta inmune del organismo frente a tumores y metástasis y
frente a agentes infecciosos.
En otro aspecto, los compuestos de la invención
permiten el tratamiento de trastornos causados por una inhibición
indeseada de NF-\kappaB, por ejemplo, en los casos
en los que existe un defecto en la ruta de señalización de
NF-\kappaB tales como:
- -
- Enfermedades en las que se produce apoptosis de forma prematura durante el desarrollo embrionario o cuando se produce apoptosis ectópica (por ejemplo, durante el desarrollo embrionario del ojo o del cerebro), como ocurre en pacientes con Incontinentia Pigmento.
- -
- Defectos neurológicos tales como microcefalia, o a condiciones epilépticas producidas a consecuencia de malformaciones del cerebro.
- -
- Enfermedades oftalmológicas tales como la retinopatía del prematuro o las vasculopatías proliferativas (cataratas, ojo pequeño o desprendimiento de retina).
- -
- Enfermedades en las que el organismo tienen una capacidad parcial o totalmente alterada de responder a infecciones de distinto tipo, tales como la Incontinentia Pigmenti, en donde existe una proliferación extrema de eosinofilos que se infiltran en la piel y que aumentan su concentración en sangre.
- -
- Enfermedades de los vasos sanguíneos en la retina, el cerebro o en la piel.
- -
- Enfermedades dentales
- -
- Osteopetrosis ocasionada por una resorción defectuosa del hueso inmaduro.
- -
- Enfermedades cutáneas tales como hipomelanosis.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto, los compuestos de la invención
permiten el tratamiento de trastornos causados por una inhibición
indeseada de NF-AT. Dichos trastornos se manifiestan
por una hipoactividad del sistema inmune tales como las que aparecen
en condiciones de inmunodefíciencia innatas o adquiridas, por lo que
las variantes constitutivamente activadas de p300 tienen utilidad en
métodos para estimular el sistema inmune en condiciones tales como
cirugía, heridas, infecciones u otro tipo de traumas. Los compuestos
de la invención son útiles para su administración en infecciones
bacterianas, virales, parasitarias del tipo de Así, la invención
contempla el uso de los polipéptidos y polinucleótidos para el
tratamiento de enfermedades causadas por bacterias tales como
menigitus, carbunco, apenditis, disenteria, bacteremia, peste,
lepra, borreliosis, botulismo, bronqutis, brucelosis, peste
bubónica, cerebritos, cervicitis, cólera, conjuntivitis, cistitis,
dermatitis, diarrea, encefalitis, endocarditis, fiebre entérica,
enteritis, enterocolitis, epididimitos, erisipela, tuberculosis,
forúnculos, gangrena, gastritis, gastroenteritis, otitis,
glomerulonefritis, impetigo, laringitis, tétano, mastitis,
meningitis, meningoencefalitis, listeriosis, nocardiosis,
oftalmitis, osteomielitis, otitis media, pancreatitis, parotiditis,
neumonía, listeremia, prostatis, sepsis puerperal, abscesos
cutáneos, pielonefritis, fiebre reumática, rinitis,
romboencefalitis, salmonelosis, escarlatina, sepsis, shigelosis,
sífilis, peritonitis, sinusitis, traqueobronquitis, fiebres de
Malta, tifus, fiebres tifoideas, ulcera y uretritis.
Asimismo, los compuestos de la invención pueden
usarse como agentes adyuvantes de vacunas inyectables cuando se
utilizan conjuntamente con vacunas para alguna de las enfermedades
citadas anteriormente.
Adicionalmente, los compuestos de la invención
que tienen utilidad para el tratamiento de tumores de mama, corazón,
pulmón, intestino delgado, colon, bazo, riñón, vejiga, cabeza,
cuello, ovario, próstata, cerebro, páncreas, piel, hueso, médula
ósea, sangre, timo, útero, testículos e hígado. En particular,
tumores que pueden ser tratados con los compuestos de la invención
incluyen adenoma, angiosarcoma, astrocitoma, carcinoma epitelial,
germinoma, glioblastoma, glioma, hemangioendotelioma,
hemangiosarcoma, hematoma, hepatoblastoma, leucemia, linfoma,
meduloblastoma, melanoma, neuroblastoma, osteosarcoma,
retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma y teratoma. En particular,
el tumor/cancer se selecciona del grupo de melanoma acral
lentiginoso, queratosis actínica adenocarcinoma, carcinoma adenoidal
cística, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, tumores
astrocíticos, carcinoma de la glándula de Bartolino, carcinoma de
células basales, carcinoma de glándulas branquiales, carcinoide
capilar, carcinoma, carcinosarcoma, colangiocarcinoma, cistadenoma,
tumor del seno endodermal, hiperplasia endometrial, sarcoma del
estroma endometrial, adenocarcinoma endometroide, sarcoma ependial,
sarcoma de Swing, hiperplasia nodular focal, gastrónoma, tumores de
la línea germinal, glioblastoma, glucagonoma, hemagioblastoma,
hemagioendotelioma, hemagioma, adenoma hepático, adenomastosis
hepática, carcinoma hepatocelular, insulinita, neoplasia
intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales,
carcinma de células escamosas invasivas, carcinoma de células
grandes, leiomiosarcoma, melanoma, melonoma maligno, tumor
mesotelial maligno, medulobastoma, meduloepitelioma, carcinoma
mucoepidermoide, neuroblastoma, adenocarcinoma neuroepitelial,
melanoma nodular, osteosacrcoma, adenocarcinoma seroso papilar,
tumores pituitarios, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar,
carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma,
sarcoma, carcinoma seroso, carcinoma de células pequeñas, carcinoma
de tejidos blandos, tumor secretor de somatostatina, carcinoa
escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma no diferenciado,
melanoma uveal, carcinoa verrugoso, vipoma, tumor de Wilm. Aún más
preferiblemente, el tumor/cáncer a ser tratado con los compuestos de
la invención incluye cáncer intracerebral, cáncer de cabeza y
cuello, cáncer rectal, astrocitoma, preferiblemente astrocitoma de
grado II, III o IV, glioblastoma, preferiblemente glioblastoma
multiforme, cáncer de células pequeñas, y cáncer de células no
pequeñas, preferiblemente cáncer de pulmón de células no pequeñas,
melanoma metastático, cáncer de próstata metastático independiente
de andrógenos, cáncer de próstata metastático dependiente de
andrógenos y cáncer de mama.
Para uso en medicina, los compuestos de la
invención pueden ser formulados conjuntamente con un excipiente que
es aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Excipientes
preferidos para su uso en la presente invención incluyen azúcares,
almidones, celulosas, gomas y proteínas. En una realización
particular, la composición farmacéutica de la invención se formulará
en una forma farmacéutica de administración sólida (p.ej.,
comprimidos, cápsulas, grageas, gránulos, supositorios, etc.) o
líquida (p.ej., soluciones, suspensiones, emulsiones, etc.). En otra
realización particular, las composiciones farmacéuticas de la
invención pueden ser administradas por cualquier ruta, incluyendo,
sin ser limitante, oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial,
intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica,
subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica,
sublingual o rectal. Una revisión de las distintas formas de
administración de principios activos, de los excipientes a utilizar
y de sus procedimientos de fabricación puede encontrarse en el
Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de
Ediciones, 1993.
Alternativamente, cuando el compuesto de la
invención comprende un polinucleótido, la composición farmacéutica
de la invención puede formularse en forma de una composición
destinada para su empleo en terapia génica; a modo ilustrativo, no
limitativo, en este caso, la composición farmacéutica de la
invención puede contener un vector, viral o no viral, que comprende
un polinucleótido de la invención o una construcción génica de la
invención. A modo ilustrativo, no limitativo, dichos vectores pueden
ser vectores virales, por ejemplo, basados en retrovirus,
adenovirus, etc., o no virales tales como los complejos
ADN-liposoma, ADN-polímero,
ADN-polímero-liposoma, etc. [véase
"Nonviral Vectors for Gene Therapy", editado por Huang, Hung y
Wagner, Academic Press (1999)]. Dichos vectores, que contienen un
polinucleótido o una construcción génica de la invención pueden ser
administrados directamente al cuerpo humano o animal por métodos
convencionales. Alternativamente, dichos vectores pueden ser
utilizados para transformar, transfectar o infectar células, por
ejemplo, células de mamíferos, incluido el hombre, ex vivo,
y, posteriormente implantarlas en el cuerpo humano o animal para
obtener el efecto terapéutico deseado. Para su administración al
cuerpo humano o animal dichas células se formularán en un medio
adecuado que no afecte adversamente a la viabilidad de dichas
células.
Las composiciones de la invención pueden
administrarse formando parte de liposomas, conjugadas a colesterol o
conjugados a compuestos capaces de promover la translocación a
través de membranas celulares tales como el péptido Tat derivado de
la proteína TAT de HIV-1, la tercera hélice del
homeodominio de la proteína Antennapedia de D. melanogaster,
la proteína VP22 del virus del herpes simplex, oligómeros de
arginina y péptidos tales como los descritos en WO07069090
(Lindgren, A. et al, 2000, Trends Pharmacol. Sci,
21:99-103, Schwarze, S.R. et al. , 2000,
Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M
et al., 2003, Mol. Therapy 8:143-150 y
Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res.
21:389-393). Alternativamente, en el caso que el
compuesto terapeútico sea ADN, éste puede administrarse formando
parte de un vector plasmídico o de un vector viral, preferiblemente
vectores basados en adenovirus, en virus adenoasociados o en
retrovirus, particularmente virus basados en el virus de la leucemia
murina (MLV) o en lentivirus (HIV, FIV, EIAV).
En otro aspecto, las composiciones farmacéuticas
de la invención comprende instrucciones para su uso. El experto en
la materia apreciará que el régimen de dosis y los pacientes
correspondientes a ser tratados se pueden determinar de acuerdo con
la presente invención. Las dosis recomendadas se indicarán en la
etiqueta del producto permitiendo al prescriptor anticipar los
ajustes de dosis dependiendo del grupo de pacientes considerado, con
información que evita prescribir la droga incorrecta a los pacientes
incorrectos a la dosis incorrecta.
El régimen de dosis se determinará por el médico
y otros factores clínicos; preferiblemente de acuerdo con cualquiera
de los métodos descritos anteriormente. Como es bien sabido en la
ciencia médica, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos
factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de la
superficie del cuerpo, edad, el compuesto particular que se le va a
administrar, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y
si se están administrando otras drogas al mismo tiempo. El progreso
se puede observar mediante valoración periódica.
Las composiciones de la invención pueden ser
administradas en dosis de menos de 10 mg por kilogramo de peso
corporal, preferiblemente menos de 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0,05, 0,01,
0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005 ó 0,00001 mg por cada kg de
peso corporal y menos de 200 nmol de agente ARN, es decir, en torno
a 4.4 x 1016 copias por kg de peso corporal o menos de 1500, 750,
300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15 ó 0,075 nmol por Kg de peso
corporal. La dosis unitaria se puede administrar por inyección, por
inhalación o por administración tópica. Las composiciones de la
invención pueden ser administradas directamente en el órgano en el
que se observe el defecto que se desea tratar en cuyo caso se
administran dosis de entre 0.00001 mg a 3 mg por órgano, o
preferiblemente entre 0.0001 y 0.001 mg por órgano, en torno a 0,03
y 3.0 mg por órgano, en torno a 0,1 y 3,0 mg por órgano o entre 0,3
y 3,0 mg por órgano.
La dosis depende de la severidad y respuesta de
la condición a tratar y puede variar entre varios días y varios
meses o hasta que se observe que la condición remite. La
dosificación óptima se puede determinar realizando mediciones
periódicas de las concentraciones de agente en el organismo del
paciente. La dosis óptima se puede determinar a partir de los
valores de EC50 obtenidos mediante ensayos previos in vitro o
in vivo en modelos animales. La dosis unitaria se puede
administrar una vez al día o menos de una vez al día,
preferiblemente, menos de una vez cada 2, 4, 8 o 30 días.
Alternativamente, es posible administrar una dosis inicial seguida
de una o varias dosis de mantenimiento, generalmente de menos
cantidad que la dosis inicial. El régimen de mantenimiento puede
implicar tratar al paciente con dosis que oscilan entre 0,01 \mug
y 1,4 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo 10, 1, 0,1, 0,01,
0,001, o 0,00001 mg por kg de peso corporal por día. Las dosis de
mantenimiento se administran, preferiblemente, como mucho una vez
cada 5, 10 ó 30 días. El tratamiento se debe continuar durante un
tiempo que variará según el tipo de alteración que sufra el
paciente, su severidad y el estado del paciente. Tras el
tratamiento, se debe monitorizar la evolución del paciente para
determinar si se debe incrementar la dosis en caso de que la
enfermedad no responda al tratamiento o se disminuye la dosis si se
observa una mejora de la enfermedad o si se observan efectos
secundarios indeseados.
La dosis diaria se puede administrar en una
única dosis o en dos o más dosis según las circunstancias
particulares. Si se desea una administración repetida o
administraciones frecuentes, es aconsejable la implantación de un
dispositivo de administración tal como una bomba, un catéter
semipermanente (intravenoso, intraperitoneal, intracisternal o
intracapsular) o un reservorio.
Los autores de la presente invención han puesto
de manifiesto que la capacidad de la proteína A238L de bloquear la
activación de NF-kappaB y NF-AT
radica en la capacidad de esta proteína de impedir la actividad
activadora de la transcripción de p300 al impedir la fosforilación
de p300 por la PKC-theta. Estos resultados permiten
el desarrollo de métodos para la identificación de compuestos
capaces de inhibir la actividad de p300 de forma similar a A238L.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para
la identificación de compuestos antitumorales que comprende las
etapas de:
- (i)
- poner en contacto una célula que comprende
- (a)
- un polipéptido de fusión que comprende un primer componte formado por la secuencia SEQ ID NO:1 o una variante de la misma cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada y un segundo componente formado por un dominio de unión a ADN y
- (b)
- un gen reportero acoplado operativamente a un promotor que comprende al menos una copia del sitio al que se une el dominio de unión de ADN presente en el polipéptido (i)
- con un compuesto cuya actividad antitumoral se desea ensayar y
- (ii)
- identificar aquellas células en las que se produzca una disminución de la expresión del gen reportero
en donde el compuesto es antitumoral si provoca
una disminución de la expresión del gen reportero.
\vskip1.000000\baselineskip
En una primera etapa, el método de
identificación de compuestos antitumorales o antiinflamatorios de la
invención implica poner en contacto una célula con un compuesto
candidato en cualquier grado de pureza. Por "célula" se
entiende, en el contexto de la presente invención, cualquier célula
que comprende
- (a)
- un polipéptido de fusión que comprende un primer componte formado por la secuencia SEQ ID NO:1 o una variante de la misma cuya actividad trans-activadora de la transcripción se encuentra constitutivamente activada y un segundo componente formado por un dominio de unión a ADN y
- (b)
- un gen reportero acoplado operativamente a un promotor que comprende al menos una copia del sitio al que se une el dominio de unión de ADN presente en el polipéptido (i).
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma preferida de realización, el
polipéptido (i) comprende una variante de la secuencia SEQ ID NO:1
cuya actividad trans-activadora de la transcripción
se encuentra constitutivamente activada. Preferiblemente, la
variante de la SEQ ID NO:12 se encuentra constitutivamente actividad
mediante la sustitución del amino ácido en posición 193 de SEQ ID
NO:1 por un análogo estructural de un fosfoamino ácido. En una forma
aún más preferida de realización, el análogo estructural de un
fosfoamino ácido es Asp.
En otra forma preferida de realización, el
polipéptido (i) comprende la secuencia SEQ ID NO:1. En este caso,
sólo es posible identificar compuestos que interfieran con la
activación de p300 si el polipéptido de SEQ ID NO:1 se activa
previamente por medio de la fosforilación en la posición 193
(correspondiente a la posición 384 en la proteína p300 completa).
Dicha activación puede ser llevada a cabo por medio de la proteína
PKC-theta que aparece de forma endógena en la célula
en la que se lleva a cabo el ensayo. Sin embargo, en caso de que la
células no disponga de actividad PKC-theta
suficiente para la activación del polipéptido de SEQ ID NO:1, la
invención contempla, en una forma preferida de realización, el uso
de una célula en la etapa (i) que comprende, adicionalmente, un gen
que codifica PKC-theta. En una forma preferida de
realización, el gen que codifica PKC-theta se
encuentra operativamente controlado por un promotor inducible.
Promotores adecuados para la regular la expresión de
PKC-theta incluyen los promotores anteriormente
mencionados. Preferiblemente, el promotor es un promotor inducible
que permite activar la expresión de PKC-theta a
voluntad mediante la puesta en contacto de la célula con un
determinado compuesto o en determinadas condiciones.
\newpage
Genes reporteros que se pueden usar formando
parte del componente (ii) invención incluyen luciferasa, proteína
verde fluorescente y variantes de la misma que emiten fluorescencia
a distintas longitudes de onda (por ejemplo, DS-Red
o proteína fluorescente roja), cloranfenicol acetiltransferasa,
\beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y
peroxidasa de rábano.
Células adecuadas para la realización del método
de la invención incluyen células de las líneas CHO, VERO, BHK, HeLa,
COS, MDCK 293, 3T3, WI38 y similares. En una forma preferida de
realización, la célula que se usa en el método de la invención es
una célula Jurkatt, correspondiente una línea de células T de origen
humano.
Una vez que se ha seleccionado la célula en la
que se va a expresar las proteínas de fusión y el gen reportero bajo
el control de un promotor, es necesario incorporar en dicha célula
las construcciones de ADN que codifican para el componente (i) y que
comprenden la construcción (ii). Las construcciones de ADN se
introducen en las células objeto de estudio usando cualquiera de los
métodos de transfección conocidos para el experto en la materia
(véase secciones 9.1 a 9.5 en Ausubel, F.M. et al., Current
Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ringbou
edition, 2003). En particular, las células se pueden transfectar
mediante co-precipitación de ADN con fosfato
cálcico, DEAE-dextrano, polibreon, electroporación,
microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección
por retrovirus y transfección biolística.
Las construcciones necesarias para la expresión
de ambas componente pueden incorporarse de forma transitoria o de
forma estable. Preferiblemente, las construcciones se incorporan de
forma estable. Para ello, es necesario incluir en la transfección un
gen que codifique para resistencia a un determinado antibiótico, de
forma que se puedan seleccionar aquellas líneas celulares que han
incorporado el ADN en el genoma de aquellas líneas celulares en las
que el ADN se encuentra en posición extracromosómica. El gen que
permite seleccionar las células se puede aportar formando parte del
mismo vector que contiene la construcción objeto de la invención o,
alternativamente, se puede aportar separadamente mediante
co-transfección con un segundo plásmido que contiene
dicho gen de resistencia. En este último caso, el plásmido que
contiene la construcción de ADN se aporta a la mezcla de
transfección en un exceso molar con respecto al gen de resistencia
de forma que por cada evento de integración del gen de resistencia
exista una alta probabilidad de integración del gen que contiene el
promotor objeto de estudio. Preferiblemente, el plásmido que
contiene la construcción de ADN se aporta en un exceso de al menos 5
veces con respecto al vector que contiene el reportero de
resistencia.
Marcadores de resistencia adecuados para
seleccionar líneas celulares que han integrado la construcción en el
genoma incluyen marcadores de selección positiva como por ejemplo el
gen de resistencia a la neomicina, que confiere resistencia al
aminoglucósido G418, el gen de la higromicina fosfotransferasa que
confiere resistencia a higromicina, el gen ODC, que confiere
resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa
(2-(difluorometil)-DL-ornitina
(DFMO), el gen de la dihidrofolato reductase que confiere
resistencia a metrotexato, el gen de la
puromicina-N-acetil transferasa, que
confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere
resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere
resistencia a
9-beta-D-xilofuranosil
adenina, el gen de la cítosina deaminasa, que permite a las células
crecer en presencia de
N-(fosfonacetil)-L-aspartato,
timidina kinasa, que permite a las células crecer en presencia de
aminopterina, el gen de Xantina-guanina
fosforibosiltransferasa, que permite a las células crecer en
presencia de xantina y ausencia de guanina, el gen trpB de E.
coli que permite a las células crecer en presencia de indol en
lugar de triptófano, el gen hisD de E. coli, que permite a
las células el usar histidinol en lugar de histidina. El gen de
selección se incorpora en un plásmido que puede incluir,
adicionalmente, un promotor adecuado para la expresión de dicho gen
en células eucariotas (por ejemplo, los promotores CMV o SV40), un
sitio optimizado de iniciación de la traducción (por ejemplo un
sitio que sigue las denominadas reglas de Kozak o un IRES), un sitio
de poliadenilación como, por ejemplo, el sitio de poliadenilación
del SV40 o de la fosfoglicerato quinasa, intrones como, por ejemplo,
el intrón del gen de la beta-globulina.
El proceso de selección de células que contienen
la construcción de ADN de interés integrada de forma estable en el
genoma se lleva a cabo mediante un proceso de selección convencional
(véase por ejemplo Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in
Molecular Biology (1997) 9.5.1-9.5.19). Para ello,
se transfectan las células con el vector o mezclas de vectores y,
tras un periodo de recuperación, se dejan crecer en un medio
selectivo (bien un medio que contiene al antibiótico frente al que
el reportero confiere resistencia o bien un medio mínimo que
contiene el antimetabolito frente al cual el reportero confiere
resistencia). Las colonias celulares que crecen en medio selectivo
se aíslan y se vuelven a dejar crecer en medio selectivo. Una vez
que se han obtenido células que son capaces de crecer durante
repetidos ciclos de proliferación en presencia del marcador de
selección, puede ser conveniente el eliminar dicho marcador de las
células, particularmente si las células van a ser transfectadas con
otro marcador de selección. Para ello, se pueden usar recombinasas,
en particular el sistema Cre/Lox. Alternativamente, es posible
amplificar el número de copias del marcador de selección, lo que
resulta en una amplificación simultánea del número de copias del gen
de interés con el consiguiente aumento de su expresión. Para ello,
las células se hacen crecer en presencia de concentraciones
progresivamente superiores de agente de selección, lo que resulta en
una selección de las células que han sufrido una amplificación de
los genes que confieren resistencia a tal agente y, normalmente, de
las regiones adyacentes o intermedias. Preferiblemente se usa DHFR
como marcador de selección y la selección de líneas celulares en las
que existe una amplificación de dicho gen se lleva a cabo en
presencia de metotrexato.
En el caso de que las células utilizadas en el
método de la invención hayan sufrido una amplificación de los genes
que confieren resistencia a tal agente, es necesaria la
incorporación sucesiva de dos construcciones. En este caso, es
posible incoporar la construcción que codifica la proteína de fusión
de forma estable usando los métodos ya descritos y la construcción
que contiene el gen reportero de forma transitoria.
Alternativamente, es posible incorporar ambas construcciones de
forma estable, en cuyo caso será necesario usar un marcador de
selección distinto con cada construcción y efectuar el proceso de
transfección/selección ya descrito dos veces. Normalmente, se
considera que una célula expresa un marcador de forma estable cuando
la expresión de dicho marcador no disminuye con sucesivos ciclos de
proliferación, independientemente de la presencia en el medio de
cultivo de agente de selección.
Una vez que se dispone de una línea celular que
ha integrado en su genoma de forma estable las construcciones de ADN
de acuerdo a la invención, la célula se pone en contacto con un
compuesto o preparación cuyo efecto sobre la transcripción del gen
reportero se desee estudiar. Por "poner en contacto" una célula
con el compuesto candidato se incluye, según la presente invención,
cualquier posible forma de llevar el compuesto candidato hasta el
interior de la célula que expresa la construcción de ADN.
Así, en caso de que el compuesto candidato sea
una molécula de bajo peso molecular, es suficiente con añadir dicha
molécula al medio de cultivo. En caso de que el compuesto candidato
sea una molécula de alto peso molecular (por ejemplo, polímeros
biológicos tales como un ácido nucleico o una proteína), es
necesario aportar los medios para que esa molécula pueda acceder al
interior celular. En caso de que la molécula candidata sea un ácido
nucleico, pueden usarse métodos convencionales para transfección,
según se ha descrito anteriormente para la introducción de la
construcción de ADN. En caso de que el compuesto candidato sea una
proteína, la célula puede ponerse en contacto tanto con la proteína
directamente como con el ácido nucleico que la codifica acoplado a
elementos que permitan su transcripción/traducción una vez que se
encuentren en el interior celular. Para ello, se pueden usar
cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para permitir su
entrada al interior celular. Alternativamente, es posible poner en
contacto la célula con una variante de la proteína que se desea
estudiar que ha sido modificada con un péptido que sea capaz de
promover la translocación de la proteína al interior celular, tales
como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de
HIV-1, la tercera hélice del homeodominio de la
proteína Antennapedia de D. melanogaster, la proteína VP22 del virus
del herpes simplex y oligómeros de arginina (Lindgren, A. et
al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103,
Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci.,
21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol.
Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F.,
2004, Pharm. Res. 21:389-393).
Preferiblemente, el compuesto a ensayar no se
encuentra aislado sino que se encuentra formando parte de una mezcla
más o menos compleja bien derivada de una fuente natural o bien
formando parte de una biblioteca de compuestos. Ejemplos de
bibliotecas de compuestos que pueden ser ensayadas según el método
de la presente invención incluyen, sin limitación, bibliotecas de
péptidos incluyendo tanto péptidos como análogos peptídicos que
comprenden D-amino ácidos o péptidos que comprenden
enlaces no peptídicos, bibliotecas de ácidos nucleicos incluyendo
ácidos nucleicos con enlaces no fosfodiester del tipo de
fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos, bibliotecas de
anticuerpos, de carbohidratos, de compuestos de bajo peso molecular,
preferiblemente moléculas orgánicas, de peptidomiméticos, y
similares. En el caso de que se use una biblioteca de compuestos
orgánicos de bajo peso molecular, la biblioteca puede haber sido
preseleccionada para que contengan compuestos que puedan acceder al
interior celular con mayor facilidad. Así, los compuestos de pueden
seleccionar en base a determinados parámetros tales como tamaño,
lipofilicidad, hidrofilicidad, capacidad de formar puentes de
hidrógeno.
Alternativamente, los compuestos a ensayar
pueden estar formando parte de un extracto obtenido de una fuente
natural. La fuente natural puede ser animal, vegetal obtenido de
cualquier entorno, incluyendo, sin limitación, extractos de
organismos terrestres, aéreos, marinos y similares.
En una segunda etapa, el método de la invención
incluye la determinación de la actividad de la proteína codificada
por el gen reportero. Preferiblemente, a la vez que se lleva a cabo
la determinación de la actividad del gen reportero en presencia de
los compuestos a ensayar, es necesario efectuar determinaciones en
paralelo de la actividad transcripcional basal en presencia de
únicamente el medio de cultivo y/o del vehículo en el que se
encuentra disuelto el compuesto a ensayar o en el que se han
preparado los extractos a ensayar. Generalmente, aquellos compuestos
o extractos con actividad promotora de la transcripción se
manifestarán porque darán valores superiores a 1 de la relación
entre actividad transcripcional en presencia del compuesto o del
extracto candidato y en presencia de vehículo. Preferiblemente, se
considerarán compuestos o extractos positivos aquellos en los que la
relación de actividad del gen reportero sea de al menos 1.1, 1.2,
1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 y 2.
En una forma de realización preferida, el método
de la invención se utiliza para identificar compuestos adecuados
para el tratamiento o la prevención de un proceso tumoral en donde
dicho proceso se caracteriza por una activación indesada de la
activada de los factores de transcripción
NF-\kappaB, NF-AT y/o
AP-1.
El método de detección de la expresión del gen
reportero implica la puesta en contacto de las células con un
compuesto que puede generar un producto coloreado o fluorescente en
presencia del producto codificado por el gen reportero. Así, si la
enzima es la fosfatasa alcalina, se pueden usar substratos
cromogénicos del tipo del p-nitrofenil fosfato
(p-NPP),
5-bromo-4cloro
3-indolil fosfato/tetrazolio nitroblue (BCIP/NPT),
Fast-Red/naftol-AS-TS
fosfato o substratos fluorogénicos del tipo de
4-metilumbeliferil fosfato (4-MUP),
2-(5'-cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona
(CPPCQ), 3,6-fluoresceína difosfato
(3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR o sales de
diazonio de Fast Red Violet LB.
Si el gen reportero codifica una peroxidasa, se
pueden usar substratos cromogénicos del tipo de
2,2-azinobis (ácido
3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)
(ABTS), o-fenilenediamina (OPT),
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB),
o-dianisidina, ácido 5-amino
salicílico, ácido 3-dimetilamino benzoico (DMAB) y
3-metil-2-benzotiazolinhidrazona
(MBTH),
3-amino-9-etilcarbazol
(AEC) y 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro
(DAB) o substratos fluorogénicos del tipo del ácido
4-hidroxi-3-metoxifenilacetico,
fenoxazines reducidas y benzotiazines reducidas, incluyendo los
reactivos Amplex® Red y Amplex UltraRed y los dihidroxantenos
reducidos.
Si el gen reportero codifica una glucosidasa, se
pueden usar substratos cromogénicos del tipo de
o-nitrofenil-\beta-D-galactosido
(o-NPG),
p-nitrofenil-\beta-D-galactosido
y
4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosido
(MUG) para la
\beta-D-galactosidasa y substratos
fluorogénicos del tipo de la resorufina
beta-D-galactopiranosido,
digalactosido de fluoresceína (FDG), diglucurónido de fluoresceína,
4-metilumbeliferil
beta-D-galactopiranosido,
carboxiumbeliferil
beta-D-galactopiranosido y
beta-D-galactopiranosido de
cumarina.
En una forma preferida de realización, el gen
reportero codifica para la luciferasa y la detección se efectúa
midiendo la luminiscencia emitida por dicha enzima en presencia de
ATP. La luminiscencia se determina usando kits comerciales, como por
ejemplo, el kit de enhanced luciferase assay (Analytical
Luminescence Laboratory, MI). Preferiblemente, el método de
identificación de compuestos de la invención se lleva a cabo usando
métodos de alta capacidad de procesamiento
(high-throughput screening o HTS), de forma que se
puedan ensayar un alto número de muestras simultáneamente. Los
ensayos HTS se llevan a cabo preferiblemente en placas mutipocillo,
preferiblemente, en placas de 96 pocillos, lo que facilita la
detección de la actividad luciferasa en cada muestra puesto que
existen luminómetros que pueden aceptar directamente placas de
cultivo de 96 pocillos.
En caso de que el compuesto candidato se
encuentre formando parte de una mezcla de mayor o menor complejidad,
la invención comprende adicionalmente una o varias etapas (iii) de
fraccionamiento de dicha mezcla y la repetición de las etapas (i),
(ii) y (iii) del método de la invención un número variable de veces
hasta que el compuesto de la mezcla responsable de la actividad
promotora de la transcripción se encuentre aislado. Métodos para el
fraccionamiento de compuestos presentes en una mezcla incluyen
cromatografía (en capa fina, de gases o de exclusión molecular en
gel, de afinidad), cristalización, destilación, filtración,
precipitación, sublimación, extracción, evaporación, centrifugación,
espectrometría de masas, adsorpción y similares.
La invención se describe a continuación mediante
los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y en ningún
caso limitativos de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Extractos nucleares y citosólicos de células
Jurkat wild-type (wt), Jurkat-pcDNA
y Jurkat-A238L estimuladas o no estimuladas con
PMA/Ion, se procesaron para el ensayo. Las células se centrifugaron,
se lavaron con PBS y se resuspendieron en 500 \mul de Buffer A (10
mM HEPES pH: 7.6; 10 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 0.1 mM EGTA, 0.75 mM
espermidina, 0.15 mM espermina, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 10 mM
Na_{2}MoO_{4} y 2 \mug/ml de cada uno de los inhibidores
leupeptina, aprotinina y pepstatina A). Después de 15 min a 4ºC, se
añadió 5 \mul de solución NP-40 al 10%. Las
muestras se agitaron mediante vortex durante 10 sec y se
centrifugaron 20 min a 3000 rpm y 4ºC. Los sobrenadantes se usaron
como extractos citosólicos. Los núcleos se lavaron dos veces con 200
\mul de buffer A para evitar la contaminación citosólica. Para la
extracción de proteínas nucleares, se añadió 50 \mul de Buffer C
(20 mM HEPES pH: 7.6; 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT,
0.5 mM PMSF, 10 mM Na_{2}MoO_{4} y 2 \mug/ml de cada uno de
los inhibidores leupeptin, aprotinin y pepstatin A) y los pellet de
núcleos se incubaron durante 30 min a 4ºC en agitación. Las muestras
se centrifugaron durante 10 min a 14000 rpm y 4ºC, y los
sobrenadantes se usaron como extractos nucleares. Los extractos
proteicos de células Jurkat wt se prepararon con buffer RIPA (radio
immunoprecipitation assay), formado por 50 mM
Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1%
NP-40 y 0.25% Na-deoxycholate, y
suplementado con inhibidores de proteasas (Roche). En cada caso, la
concentración de proteínas se determinó mediante el método
espectofotométrico del ácido bicincóninico (BCA) (Pierce). Los
lisados celulares se separaron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), se
transfirieron a membranas de Inmobilon (Amersham) y las proteínas
separadas reaccionaron con el anticuerpo primario específico. Los
anticuerpos usados fueron: NFATc2 (sc-7296, Santa
Cruz Biotechnology), NF\kappaB-p65
(sc-109, Santa Cruz Biotechnology),
c-Jun (sc-45, Santa Cruz
Biotechnology), c-Fos (sc-52, Santa
Cruz Biotechnology), p300 (sc-584, Santa Cruz
Biotechnology), Acetylated Lysine
(Ac-K-103, Cell Signaling), GAL4
(sc-577, Santa Cruz Biotechnology), PKC
(sc-10800, Santa Cruz Biotechnology),
PKC-\theta (sc-212, Santa Cruz
Biotechnology), V5-TAG (MCA1360, Serotec),
\beta-actin (AC-15, Sigma) y un
antisuero policlonal frente A238L. Las membranas fueron incubadas
con el correspondiente anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa
(Amersham Biosciences). Para la detección de las proteínas
específicas se utilizó el método de quimioluminiscencia ECL
(Amersham Biosciences). El análisis densitométrico se llevó a cabo
utilizando el software TINA 2.0.
Extractos celulares y nucleares de células
Jurkat, al 80-90% de confluencia, tratadas o no con
PMA/Ion durante 4 h, se procesaron, y se determinó la concentración
proteica. Los extractos se incubaron con los siguientes anticuerpos
específicos: NFATc2 (sc-7296, Santa Cruz
Biotechnology), NF\kappaB-p65
(sc-109, Santa CruzBiotechnology),
c-Jun (sc-45, Santa Cruz
Biotechnology), c-Fos (sc-52, Santa
Cruz Biotechnology), p300 (sc-584, Santa Cruz
Biotechnology), PKC (sc-10800, Santa Cruz
Biotechnology), PKC-\theta
(sc-212, Santa Cruz Biotechnology),
V5-TAG (MCA 1360, Serotec) y una IgG de conejo o
ratón como control negativo, a una concentración final de 4
\mug/ml. Las muestras se incubaron toda la noche a 4ºC. Al día
siguiente las muestras se incubaron durante 3 horas a 4ºC con bolas
de proteína A/G-sefarosa (Sigma). Las muestras se
centrifugaron y las bolas se lavaron tres veces con el buffer de
lavado correspondiente (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM
NaCl, 1 mM EDTA, y 0.5% Nonidet P-40). Los
inmunoprecipitados se mezclaron con buffer de carga SDS y se
separaron mediante un gel de poliacrilamida
(SDS-PAGE) en gradiente de 4-15%, y
se analizaron mediante Western blot.
El plásmido de expresión
pcDNA-A238L expression plasmid se generó clonando el
marco de lectura abierta del gen A238L procedente del aislado viral
Ba71V de VPPA (African swine fever virus), en el vector pcDNA3.1
(Invitrogen). El NFAT-luc, que contiene tres copias
en tándem del sitio de unión distal NFATc2/AP-1
(posición -286 a -257) del promotor de IL-2, fue
cedido por el Dr. Gerald Crabtree (Departamento de Patología y
Biología del Desarrollo, Howard Hughes Medical Institute, Stanford
University Medical School, Stanford, CA). El plásmido reportero
NF\kappaB-p65 (pNF3TKLuc) contiene un trímero del
motivo de unión de NF\kappaB-p65 del gen upstream
H-2K del promotor de la timidita kinasa y del gen
reportero de la luciferasa. El plásmido
AP-1-Luc presenta el elemento de
respuesta a AP-1 (-73 a +63 pb) del promotor humano
de la colagenasa fusionado al gen de la luciferasa. La construcción
pGAL4-hNFATc2 contiene los primeros 451 aminoácidos
del NFATc2 humano fusionado al dominio de unión a DNA (DBD) del
factor de transcripción de levaduras GAL4. La construcción
GAL4-p65 tiene el dominio de unión a DNA de GAL4
unido al dominio de transactivación carboxi terminal de p65. El
plásmido GAL4-c-Jun expresa los
primeros 166 aminoácidos de c-Jun humano fusionado
al DBD del factor de transcripción de levaduras GAL4.
GAL4-cFos y GAL4-Sp1 fueron cedidos
por el Dr. Manuel Fresno (Centro de Biología Molecular Severo Ochoa,
Madrid, Spain) y el Dr. Stefan Roberts (División de Gene Expression,
Department de Biochemistry, University of Dundee, Dundee, Scotland,
UK) respectivamente. La construcción GAL4-luciferasa
(pGAL4-Luc) contiene cinco sitios de unión a GAL4
derivados de la fusión del gen GAL4 y el gen reportero luciferasa.
La construcción GAL4-p300
full-length (FL) y los mutantes
(192-703), (1-1301) y
(1239-2414) fueron cedidos por Dr. Perkins. La
expresión del plásmido pCI-p300
wild-type y su mutante de delección histona acetil
transferasa (HAT), pCI-p300\DeltaHAT, fue cedido
por el Dr. Joan Boyes (Institute of Cáncer Research, London, UK) y
el plásmido pCDNA3-A238L-SV5 fue
cedido por la Dr. Linda K. Dixon (Institute for Animal Health,
Woking, Surrey, UK). Los plásmidos de expresión de
PKC-\theta wild-type y el mutante
constitutivamente activo
(pEF-PKC-\theta wt y
pEF-PKC-\theta
A/E,respectivamente) fueron cedidos por el Dr. Martín Villalba
(Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Centre National
de la Recherche Scientifique-Unité Mixte de
Recherche, Montpellier, France). El plásmido vacío pEFneo fue cedido
por el Dr. Manuel Fresno. GAL4-p300
(FL)Ser384Ala y
GAL4-p300(192-703)Ser384Ala
fueron generados utilizando el QuickChange
Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Los
oligonucleótidos utilizados para la mutagénesis fueron: p300S384A;
forward
(5'-CCACATGACACACTGCCAGGCAGGCAAGTCTGCCAAGTGGC-3')
y reverse
(5'-GCCACTTGGCAGACTTGCCTGCCTGGCAGTGTGTCATGAGG-3'). Los nucleótidos subrayados indican la sustitución de la Serina por Alanina. El plásmido pRL-tk-luc (Promega) se utilizó en todos los casos para evaluar la eficiencia de transfección.
(5'-GCCACTTGGCAGACTTGCCTGCCTGGCAGTGTGTCATGAGG-3'). Los nucleótidos subrayados indican la sustitución de la Serina por Alanina. El plásmido pRL-tk-luc (Promega) se utilizó en todos los casos para evaluar la eficiencia de transfección.
Se generaron células Jurkat que expresan de
manera estable la proteína A238L. Para la transfección transitoria,
las células se transfectaron con 250 ng de plásmidos reporteros o
con 1 \mug de plásmidos de expresión por 10^{6} células,
utilizando el sistema LipofectAMINE Plus Reagent
(Invitrogen), siguiendo las indicaciones del fabricante. En los
ensayos de co-transfección se añadió la misma dosis
de plásmido de expresión por 10^{6} células. Las células se
incubaron durante 4 horas a 37ºC, se lavaron e incubaron con medio
con suero durante 24 h y se estimularon o no con PMA/Ion. Como
control de la transfección para el ensayo luciferasa, se
co-transfectó en todos los casos el plásmido control
Renilla luciferasa pRL-TK-luc
(Promega). A los tiempos post-estimulación
indicados, las células se Usaron con 200 \mul de Cell Culture
Lysis Reagent (Promega) y se centrifugaron a velocidad máxima
durante 5 min a 4ºC, y 20 \mul de cada sobrenadante se utilizó
para determinar los valores de la actividad luciferasa de luciérnaga
y Renilla en un luminómetro Monolight 2010 (Analytical Luminescence
Laboratory) utilizando Dual Luciferase Assay System
(Promega). Las transfecciones se normalizaron a los valores de
luciferasa de Renilla, y los resultados se expresaron como unidades
de luminiscencia relativas ajustados a la concentración de proteínas
de cada muestra determinado por el método BCA. Los experimentos se
realizaron por triplicado, y los datos se representan como unidades
de luciferasa relativas (RLU) (mean \pm S.D).
Utilizamos 2 \mug de MBP (miosin binding
protein) (sc-4113, Santa Cruz Biotechnology) o los
inmunoprecipitados
GAL4-p300(192-703)wt y
GAL4-p300(192-703)S384A
como sustrato de la fosforilación in vitro, en los cuales se
inmunoprescipitó pan-PKC o
PKC-\theta de células Jurkat. Extractos celulares
de 10^{7} células Jurkat se cultivaron en ausencia o presencia de
PMA/Ion durante 30 minutos. Las células se lisaron en buffer RIPA
formado por 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl y 1%
NP-40, suplementado con inhibidores de fosfatasas (1
mM NaVO_{3}, 10 mM NaF, y 10 mM Na_{2}MoO_{4}) e inhibidores
de proteasa (0.5 mM fluoridro fenilmetilsulfonil)1 \mug de
pepstatina, 2 \mug de leupeptina, y 2 \mug de aprotinina por
ml).
Los extractos clarificados se incubaron toda la
noche con 4 \mug de anticuerpo contra PKC
(sc-10800, Santa Cruz Biotechnology) o contra
PKC-\theta (sc-212, Santa Cruz
Biotechnology) para inmunoprecipitarlos. Los precipitados fueron
resuspendidos en buffer kinasa constituido por 20 mM HEPES (pH 7.6),
20 mM MgCl_{2}, 20 mM \beta-glicerofosfato, 20
\muM ATP, y 1 \muCi de [\gamma^{32}P]ATP (actividad
específica, 3,000 Ci/mol) suplementado con inhibidores de fosfatasa
y mezclado con el sustrato correspondiente. Después de 30 min a
30ºC, la reacción kinasa se determine lavando con buffer TNT que
contiene 20 mM Trizma base (pH 7.5), 200 mM NaCl y 1% Tritón
X-100, y está suplementado con inhibidores de
proteasas (Roche). Las proteínas fosforiladas se separaron en un gel
de poliacrilamida SDS-PAGE al 12%, y se revelaron
por autoradiografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que la activación y represión
transcripcional de p300 se regula por la actividad de diferentes
quinasas, y para establecer el mecanismo funcional de A238L por el
cual controla simultáneamente la actividad transcripcional de NFkB,
NFAT y c-Jun, probablemente a través de la
regulación del dominio CH1/KIX de p300, hemos analizado los residuos
fosforilables presentes en dicho dominio usando el servidor
NetPhosK, encontrando una nueva serina en la posición 384 dentro del
dominio TAD potencialmente fosforilable por PKC. A partir de este
momento, nos planteamos, por un lado, caracterizar el isotipo de 1
PKC involucrada, y por otro, si A238L realiza su función por
desplazamiento de dicha PKC de dicho dominio de fosforilación. Para
ello preparamos extractos nucleares de células estables
Jurkat-PCDNA y Jurkat-A238L,
transfectadas con diferentes construcciones de p300,
GAL4-p300 (FL), GAL4-p300
(1-1301), GAL4-p300
(1239-2414), y GAL4-p300
(192-703), estimuladas o no con PMA/Ion que fueron
inmunoprecipitados con un anticuerpo frente a distintos miembros de
la familia de PKCs (panPKC). Nuestros resultados muestran que la
p300 completa se asocia a PKC después de la estimulación con
PMA/Ion, y que esta interacción es desplazada por la proteína A238L.
La proteína viral también desplazó PKC de las construcciones que
contienen la región amino-terminal de p300,
GAL4-p300(1-1301) (Fig. 1B),
o los dominios CH1/KIX, GAL4-p300
(192-703) (Fig. 1C), soportando por tanto la
hipótesis de que A238L específicamente inhibe la activación de la
región amino-terminal TAD de p300 mediada por PKC.
Cuando se ensayó la construcción GAL4-p300
(1239-2414), conteniendo el
C-terminal TAD, A238L no alteró la interacción con
PKC (Fig. 1D), indicando que la proteína viral no afecta la unión de
PKC a esta región de p-300. Además, la Fig. 1E
muestra que A238L no interacciona con PKCs, y por tanto no es esta
la explicación de su interferencia con la unión. Por último,
analizamos la actividad de la PKC en ensayos kinasa específicos, que
demostraron que la actividad quinasa de PKC no está alterada (Fig.
1F, lo cual indica fuertemente que la inhibición de la trans
activación de p-300 se lleva a cabo impidiendo la
interacción de la quinasa con el amino-terminal TAD
de p300, sin afectar a su actividad enzimática.
Para analizar la relevancia de la Ser 384 en la
modulación de la actividad de p300, se generaron mutantes que
sustituyen la Ser en posición 384 por Ala (S384A), sobre la proteína
p300 completa, GAL4-p300(FL) S384A, y sobre
la construcción que contiene la región
amino-terminal GAL4-p300
(192-703) S384A, las cuales fueron ensayadas para
actividad Gal4-luc. Nuestros resultados mostraron
que dicha mutación en la p300 completa es responsable de una
importante reducción de la transactivación de p300 y que la
sustitución de la Ser384 por alanina en GAL4-p300
(192-703) S384A eliminó completamente la actividad
transcripcional mediada por esta región. (Fig. 2A). Estos datos
claramente indican que la Ser384 es esencial en la
trans-activación mediada por el dominio
N-terminal de p300, y directamente señalan a este
residuo como fundamental en la regulación global de este
coactivador. Previamente ha sido demostrada la importancia de los
miembros \zeta, \varepsilon y \theta de la familia PKC en la
activación de NF-ATc2,
NF-kB-p65, y c-Jun
en células T. Teniendo en cuenta estos datos, la Ser384 parece ser
un sustrato potencial de PKC. Por lo tanto, y para caracterizar el
isotipo de PKC responsable de la fosforilación de la Ser384, se
sobre-expresaron separadamente los imitantes
GAL4-p300 (192-703), wt, y
GAL4-p300 (192-703) S384A en células
Jurkat. Después, se utilizaron extractos nucleares para
inmunoprecipitarlos con un anticuerpo específico para GAL4, y
posteriormente revelarlos con un anticuerpo frente a p300 para
asesorarnos de la expresión de los transfectantes transfected
constructs (Fig. 2B). Los extractos inmunoprecipitados fueron
entonces utilizados como sustratos de sucesivos ensayos quinasa
usando PKC-\zeta, \varepsilon y \theta,
previamente obtenidos de células Jurkat y Jurkat estimuladas con
PMA/Ion. Los resultados muestran que ni PKC-\zeta,
ni \varepsilon fueron capaces de fosforilar la construcción
GAL4-p300 (192-703) que comprende el
extremo N-terminal de p300, mientras que
PKC-\theta fosforiló esta proteína de fusión,
revelando la importancia de PKC-\theta en la
fosforilación de este dominio regulador p300. Además, se observó un
menor nivel de fosforilación cuando GAL4-p300
(192-703) se usó el mutante S384A como substrato
(Fig. 2C), confirmando la relevancia de la S384 como diana de la
PKC-\theta en células T. Para reconfirmar el papel
de A238L y de PKC-\theta en la inhibición de la
activación de p300, células Jurkat-pcDNA o
Jurkat-A238L fueron transfectadas con el vector
vacío pEFneo, pEF-PKC-\theta wt, o
con un vector que expresa un mutante constitutivamente activo de
PKC-\theta
(pEF-PKC-\theta A/E) y además con
GAL4-p300 de cadena completa
(full-length o FL) o la construcción
N-terminal (192-703), junto con el
plásmido reportero GAL4-luc, como se describe en el
ejemplo 1. La Fig. 2D muestra cómo la
sobre-expresión del mutante constitutivamente activo
PKC-\theta
(pEF-PKC-\thetaA/E), revierte
completamente la inhibición inducida por A238L, incrementando por
tanto la relevancia de PKC-\theta en el mecanismo
de inhibición llevado a cabo por la proteína viral. Los resultados
también indican que PKC-\theta debe estar activada
para ejercer su función, un punto que ya se había establecido
previamente por otros laboratorios. Para demostrar la relación entre
PKC-\theta y la inhibición inducida por A238L, se
inmunoprecipitó la quinasa de Jurkat-pcDNA y
Jurkat-A238L, previamente transfectadas con
GAL4-p300 (192-703) wt. La Fig. 2E
muestra la presencia de GAL4-p300
(192-703 en los inmunoprecipitados de células
Jurkat-pcDNA estimuladas, pero no en las
Jurkat-A238L.
En su conjunto, estos datos demuestran que la
expresión de la proteína viral interfiere con la asociación de
PKC-\theta con la región
N-terminal de p300, controlando simultáneamente la
transactivación de NF-\kappaB-p65,
NF-ATc2, y c-Jun y representando un
nuevo y sofisticado mecanismo viral de bloqueo de la respuesta
inflamatoria. Finalmente y para corroborar aún mas la relevancia de
la S384 en la actividad de p300, usamos células Jurkat transfectadas
con GAL4-p300 (FL) o con GAL4-p300
(192-703), para inmunoprecipitar las construcciones
con un anti-Gal4 Ab o IgG control. Los
immunoprecipitados fueron analizados en Western blot usando un
anticuerpo especifico frente a acetilisina, para investigar el nivel
de acetilación de los mutantes S384A comparados con los wt. Los
resultados mostraron (Fig. 3) que la mutación de Ser384 por alanina
decrece fuertemente el nivel de acetilación, tanto de las
construcciones que expresan la p300 completo, como las del dominio
terminal TAD, indicando que este residuo mes probablemente
responsable de la completa activación del
co-activador p300.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generan líneas celulares derivadas de células
Jurkat que expresan p300 y que comprenden un plásmido que comprende
el gen reportero luciferasa bajo el control transcripcional de
varios motivos \kappaB de unión de NF-\kappaB
(p\kappaB-Luc), líneas celulares que expresan el
mutante S384A de p300 y que contienen el plásmido
p\kappaB-Luc, células que expresan el fragmento
formado por los amino ácidos 192-703 de p300 de
origen humano y que contienen el plásmido
p\kappaB-Luc y líneas celulares que expresan el
fragmento formado por los amino ácidos 192-703 de
p300 de origen humano con la mutación S193A (correspondiente al
amino ácido 384 en la secuencia completa de p300) y que contienen el
plásmido p\kappaB-Luc. Tras la selección de
aquellas líneas celulares que contienen ambos plásmidos, se
determina la actividad luciferasa en las distintas líneas
celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas celulares generadas que expresan
p300-S384D y que comprenden el gen
p\kappacB-Luc según el ejemplo 5 se hacen crecer
sobre placas multipocillo. En cada uno de los pocillos de dichas
placas se añade un compuesto seleccionado de una librería
combinatoria de compuestos y se determina la variación en la
actividad luciferasa usando métodos de alta capacidad de
procesamiento. Se identifican aquellos compuestos que provoquen una
disminución de la actividad del gen reportero en comparación con el
control.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectan de forma estable células Jurkat
con un primer plásmido que codifica p300 o el mutante S384D de p300
y con p\kappaB-Luc. Una vez seleccionadas líneas
celulares que contienen las dos combinaciones de plásmidos, se
determina la actividad luciferasa en ambas líneas celulares y se
comparan los valores obtenidos con las células que expresan la forma
nativa de p300 con las células que expresan el mutante de p300.
Se transfectan de forma estable células Jurkat
con un primer plásmido que codifica la proteína
GAL4-p300 (192-703) o con un
plásmido que codifica la proteína GAL4-p300
(192-703) S384D y con un segundo plásmido que
comprende el gen reportero luciferasa bajo el control
transcripcional de varios sitios de unión GAL4. Tras la selección de
aquellas líneas celulares que contienen ambos plásmidos, se
determina la actividad luciferasa en las distintas líneas
celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generan líneas celulares estables que
comprenden un vector que permite la expresión de
GAL4-p300 (192-703) o
GAL4-p300 (192-703) S384A, un
segundo vector que permite la expresión de
pEF-PKC-\theta wt o de un mutante
constitutivamente activo de PKC-\theta
(pEF-PKC-\theta A/E) y un tercer
vector que comprende un gen reportero bajo el control de varios
elementos de unión de NF-\kappaB. Se determinará
la actividad del gen reportero en las distintas líneas celulares con
el fin de determinar si la fosforilación de S384 en p300 mediada por
PKC-\theta es capaz de estimular la activación
transcripcional mediada por NF-\kappaB.
<110> CSIC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA MODULAR
LA ACTIVIDAD DE p300
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P3657ES00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2414
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 512
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
Claims (13)
1. Un polipéptido que comprende la secuencia SEQ
ID NO:1 o una variante de la misma que muestra al menos un 80% de
identidad de secuencia y que carece de actividad
trans-activadora de la transcripción.
2. Un polipéptido según la reivindicación 1 en
el que el amino ácido en posición 193 de SEQ ID NO:1 no es un amino
ácido fosforilable ni un análogo estructural de un
fosfoaminoácido.
3. Un polipéptido según la reivindicación 2 en
donde el amino ácido en posición 193 en la secuencia de SEQ ID NO:1
es Ala.
4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido
tal que definido en las reivindicaciones 1 a 3.
5. Una construcción génica que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 4.
6. Un vector que comprende un polinucleótido
según la reivindicación 4 o una construcción génica según la
reivindicación 5.
7. Una célula que comprende un polipéptido según
la reivindicación 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación
4, una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector
según la reivindicación 6.
8. Un animal transgénico no humano que
comprende, integrado en su genoma, un ácido nucleico según la
reivindicación 4.
9. Un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4,
una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según
la reivindicación 6 para su uso en medicina.
10. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un
polinucleótido según la reivindicación 4, una construcción génica
según la reivindicación 5 o un vector según la reivindicación 6
junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. Un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, un polinucleótido según la reivindicación 4,
una construcción génica según la reivindicación 5 o un vector según
la reivindicación 6 para el tratamiento de trastornos causados por
una activación indeseada de las proteínas p300,
NF-\kappaB, NFAT y/o c-jun.
12. Un polipéptido, polinucleótido, construcción
génica o vector según la reivindicación 11 en donde la enfermedad
está causada por una activación indeseada de
NF-\kappaB.
13. Un polipéptido, polinucleótido, construcción
génica o vector según la reivindicación 12 en donde la enfermedad
causada por una activación indeseada de NF-\kappaB
se selecciona del grupo de una enfermedad inflamatoria y una
enfermedad autoinmune.
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WO1995028499A1 (en) * | 1994-04-14 | 1995-10-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Nucleic acid encoding transcription factor p300 and uses of p300 |
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2009
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO1995028499A1 (en) * | 1994-04-14 | 1995-10-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Nucleic acid encoding transcription factor p300 and uses of p300 |
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Title |
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SNOWDEN, A.W. et al. "{}A novel transcriptional repression domain mediates p21WAF1/CIP1 induction of p300 transactivation"{}. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY. 01.04.2000. Vol. 20, N$^{o}$. 8, páginas 2676-2686; todo el documento, especialmente Fig. 3. * |
SNOWDEN, A.W. et al. "A novel transcriptional repression domain mediates p21WAF1/CIP1 induction of p300 transactivation". MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY. 01.04.2000. Vol. 20, Nº. 8, páginas 2676-2686; todo el documento, especialmente Fig. 3. * |
Also Published As
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