ES2334974T3 - Almacenamiento y administracion de microorganismos. - Google Patents

Abstract

Un método para administrar un microorganismo a una corriente de pienso para ingestión subsecuente por un animal, comprendiendo el método: (a) Proveer una formulación que comprende un microorganismo suspendido en o sobre una matriz; (b) Proporcionar una corriente de pienso al animal; (c) Proporcionar un flujo de agua u otro líquido para la formulación, donde la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido pueden estar en la misma corriente, o el flujo de agua u otro líquido pueden posicionarse a una distancia de la corriente de pienso; (d) Desprender los microorganismos de la matriz, y arrastrar los microorganismos desprendidos hacia el flujo de agua u otro líquido; y (e) Permitir que un animal ingiera la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido.

Description

Almacenamiento y administración de microorganismos.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con un método y un aparato para administrar microorganismos animales, particularmente probióticos en alimentación animal y/o en un sistema de agua para beber.

Antecendentes de la invención

Ha sido conocido por muchos años que ciertas cepas de microorganismos imparten efectos benéficos a través del tracto digestivo tanto de animales como de humanos. Tales microorganismos son conocidos como probióticos. Los beneficios del empleo de los probióticos microbianos y las bases científicas de los mismos han sido revisados por Ried (1999. Appl. Env. Microbiol 65, 3763-3766).

Mucha de la investigación hecha acerca del uso y beneficio de los probióticos microbianos han sido llevada a cabo con cepas de Lactobacillus. Los efectos benéficos surgen de una concentración incrementada de las cepas de Lactobacillus en el tracto digestivo. Los beneficios incluyen diarreas reducidas en terneros (Chaves et al, 1999, Braz. J. Animal Sci. 28,1093-1101), colonización reducida por Salmonella en pollos (Singh et al, 1999. Appl Env. Microbiol 65, 4981-4986), mortalidad general reducida en pollos (Singh et al, 1999. Ind. J. Animal Sci., 69, 830-831) y asimilación reducida de colesterol en piensos para gallos en dietas altas en colesterol (Endo et al, 1999. Biosci. Biotech. Biochem. 63. 1569-1575). Parece que muchos de los efectos benéficos observados con las cepas probióticas de Lactobacillus resultan a partir de la colonización del tracto digestivo por esas cepas, evitando por lo tanto la colonización por otros microorganismos más nocivos. Se ha encontrado que, para que estos efectos benéficos persistan, las cepas probióticas deben ser suministradas al huésped en una base continua para asegurar una persistencia en el tracto digestivo.

Además de las cepas de Lactobacillus, otros microorganismos, más notablemente los que incluyen los Enterococci, han mostrado exhibir una actividad probiótica. En el caso de los Enterococci, los efectos benéficos parecen estar ligados no solamente a la colonización preferencial sino también a su capacidad, en ciertos casos, para producir bacteriocinas. Se ha informado, por ejemplo, que algunas cepas producen bacteriocinas que exhiben efectos antilisteria (Laukova et al., 1998, Letts. Appl. Microbiol. 27, 178-182).

Los efectos benéficos de estos microorganismos pueden ser controlados o potenciados incrementado su presencia o concentración en el tracto digestivo (Reid, 1999, Appl. Env. Microbiol. 65; 3763-3766). Esto puede ser logrado modificando la preparación de la materia prima para pienso animal con el fin de maximizar una concentración de microorganismos benéficos endógenos, por ejemplo, por ensilación. En la ensilación, las condiciones son manipuladas para asegurar un rápido descenso en el pH, potenciando por lo tanto la persistencia de cepas bacterianas de ácido láctico benéficas (LAB) y previniendo el crecimiento de microorganismos anaerobios nocivos tales como Clostridia (Lindgren et al., 1986; Swed. J. Agric. Res., 15: 9-18).

Alternativamente, los microorganismos probióticos pueden ser administrados al animal añadiendo la cepa microbiana relevante a la alimentación animal. Típicamente, el microorganismo se añade en forma seca al pienso, y luego es consumido junto con el alimento durante la alimentación. Alternativamente, pueden añadirse microorganismos al agua de beber para los animales. Una cantidad de los microorganismos probióticos, que puede estar en la forma de una torta, es pesada y mezclada con el pienso o el agua para beber. Sin embargo, es frecuentemente difícil asegurar que se ha añadido la cantidad correcta de probiótico cada vez que el probiótico no haya sido distribuido exhaustivamente en el pienso o en el agua para beber y se presentan problemas.

Hay por lo tanto una necesidad para un sistema que administre microorganismos probióticos a los animales que supere los problemas asociados con los métodos tradicionales.

Resumen de la invención

Hemos encontrado ahora que es posible inmovilizar los microorganismos en una matriz de manera que permanezcan viables durante almacenamiento por períodos extendidos de tiempo. Subsecuentemente, los microorganismos pueden ser separados de la matriz y mezclados en una corriente de alimento para el animal. Los microorganismos pueden entonces ser ingeridos por el animal cuando éste se alimenta de la corriente de alimento. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, proporcionamos un método para administrar microorganismo a un animal de acuerdo con la reivindicación 1.

Preferiblemente los microorganismos son separados y transportados a la corriente de pienso para ser arrastrados con la misma. Alternativamente, los microorganismos pueden ser separados y arrastrados por contacto de la formulación con la corriente de pienso. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, proveemos un aparato para administrar un microorganismo a un animal de acuerdo con la reivindicación 2.

El aparato puede comprender adicionalmente medios para transportar microorganismos separados a la corriente de pienso. Alternativamente, el aparato puede permitir un contacto directo entre la formulación y la corriente de pienso, de manera que el movimiento relativo entre la corriente de pienso y la formulación hacen que los microorganismos sean separados y arrastrados en la corriente de pienso. El aparato puede comprender adicionalmente medios para administrar los microorganismos a la corriente de pienso en un lote, por pulsos o de manera de flujo continuo, o en cualquier combinación de éstas. Preferiblemente, la formulación es tal que los microorganismos son capaces de ser separados de la formulación de una manera sustancialmente continua.

La formulación comprende una fuente de microorganismos probióticos suspendidos en una matriz, siendo capaz la formulación preferiblemente de permitir que los microorganismos sean separados de la misma en una forma sustancialmente continua o semicontinua.

Los microorganismos suspendidos actúan como una fuente inoculadora del microorganismo para el pienso animal o el agua para beber. Cuando se hace referencia a microorganismos que están siendo desprendidos de la matriz, se entiende liberación, separación o desprendimiento de los microorganismos de la matriz. Los microorganismos separados pueden incluir descendientes de los microorganismos originalmente suspendidos. Así, los microorganismos suspendidos (y/o descendientes de los mismos) pueden ser liberados físicamente de la matriz. Alternativamente, las células hijas de microorganismos suspendidos originalmente son separadas de la superficie de la matriz.

Los microorganismos pueden ser separados por acción mecánica sobre la formulación, por ejemplo por desprendimiento. Alternativamente o conjuntamente, los microorganismos pueden ser separados disolviendo las moléculas que forman la matriz en el ambiente. La formulación también puede ser añadida directamente a la corriente de pienso y consumida por el animal con el pienso o el agua.

Preferiblemente, el microorganismo es un organismo probiótico. El término "probiótico" es conocido en la técnica, y se refiere a un suplemento microbiano de alimentación vivo que afecta beneficiosamente al animal o huésped mejorando su balance microbiano intestinal. Ejemplos de microorganismos probióticos son Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus y Enterococcus.

Microorganismos probióticos preferidos son Lactobacillus o Enterococcus spp. Más preferiblemente, el microorganismo probiótico es seleccionado de Lactobacillus acidophilus LA-107 (ATCC No. 53545), Lactobacillus acidophilus LA-101 (ATCC No. 4356) y Enterococcus faecium EF-101(ATCC No. 19434).

La formulación puede comprender microorganismos todos los cuales comprenden la misma cepa o especie. Alternativamente y preferiblemente, la formulación comprende microorganismos de dos o más cepas o especies. Las formas recombinantes de cualquiera de los microorganismos puede ser utilizada, bien sea solos o en combinación con formas no recombinantes o silvestres.

La formulación puede comprender perlas que inmovilizan el microorganismo. La formulación puede comprender un cartucho que contiene una pluralidad de perlas. Las perlas pueden ser microperlas o microesferas. Preferiblemente, las perlas tienen un diámetro entre aproximadamente 2 y 3 milímetros.

La matriz comprende preferiblemente un material poroso al agua, preferiblemente un gel. Preferiblemente, los microorganismos son inmovilizados en la matriz. La matriz puede comprender agar, agarosa, almidón, carragenato, gomo de algarrobo, geles o críogeles basados en poli (vinil) alcohol (Gough et al. (1998) Bioprocess Eng. 19 87-90), alimentos de fósiles silíceos (por ejemplo kieselguhr, tripolita y diatomita) o cenizas volcánicas tales como kissiris (Love et al. (1998) Bioprocess Eng. 18, 187-189). La matriz puede comprender cualquier soporte adecuado, y puede estar hecha, por ejemplo de, plásticos, incluyendo plásticos biodegradables.

La matriz puede comprender adicionalmente poliláctidos (Huang et al., 1999, Int. J. Pharm., 182, 93-100), polímeros que comprenden subunidades de ácido láctico, poliglicólidos, poliláctido-poliglicólido, poli (D,L láctido co glicólido) (Seifert et al., 1997, Biomaterials, 18, 1495-502), o copolimeros de bloque o copolimeros de hidrogel por ejemplo que comprenden subunidades repetidas de 2-hidroxietilmetacrilato y etilendimetacrilato (Wheeler et al., 1996, J. Long Term Eff Med Implants, 6, 207-217). En efecto cualquier material derivado de un material vegetal o animal o artificial, materiales sintéticos tales como plástico, papel etc. pueden ser usados.

Preferiblemente la matriz comprende un alginato. El término "alginato" se refiere a un copolimero del ácido beta-D-manurónico y ácido alfa-L-gulurónico (GuIA), enlazados entre sí por uniones 1-4. Los alginatos, junto con sus ésteres y sales metálicas, comprenden el componente carbohidrato principal de las algas marrón Ascophyllum, Laminaria y Macrosystis. Preferiblemente, el alginato es un alginato de un metal alcalinotérreo, y más preferiblemente el alginato es un alginato de calcio o bario.

La formulación también puede comprender nutrientes, aditivos o suplementos para ayudar al crecimiento de los animales que están siendo alimentados, tales como potenciadores naturales o sintéticos del crecimiento, hormonas de crecimiento, productos recombinantes, vitaminas, micronutrientes, antibióticos, etc. Otros ejemplos de tales nutrientes etc. son conocidos en la técnica. La formulación puede, en vez de o además de los nutrientes, aditivos o suplementos, incluir microorganismos capaces de producir estos nutrientes etc.

Por "corriente de pienso", se entiende un tren, línea o corriente continua de alimentación, materias primas de alimentación, material de pienso, agua u otros nutrientes sólidos, semisólidos o líquidos que se transportan desde una fuente. La corriente de alimentación puede comprender cualquier producto de origen vegetal o animal, sustancias orgánicas o inorgánicas y puede estar en su estado natural, fresco o preservado, procesado industrialmente, mezclas de estos etc. La corriente de pienso se transporta preferiblemente a un punto de alimentación para el animal. La corriente de pienso es preferiblemente una corriente de pienso móvil, que puede ser administrada en forma continua o semicontinua. La corriente de pienso puede ser provista sobre una cinta o tubería de transporte, y esto es adecuado cuando los alimentos o nutrientes están en forma sólida. Los alimentos u otros nutrientes pueden ser transportados en contenedores, por ejemplo cubos dispuestos sobre una cinta transportadora. Cuando la corriente de pienso transporta agua, alimentos líquidos o alimentos semilíquidos, la corriente de pienso es provista preferiblemente en una tubería, canaleta u otro conducto. Preferiblemente, la corriente de alimentación comprende agua para beber para el animal.

Preferiblemente, la formulación se provee en una forma que es sustancialmente libre de agua. La formulación puede ser secada por congelación, liofilizada o secada por aspersión, o secada de alguna otra manera por métodos conocidos en la técnica. De acuerdo con lo anterior, la formulación comprende preferiblemente un preservativo capaz de mantener la viabilidad de los microorganismos probióticos, de manera que una proporción sustancial de los microorganismos este viva cuando la formulación es mantenida durante periodos extendidos de tiempo. Preferiblemente, el preservativo es un criopreservativo. Preferiblemente el preservativo comprende trehalosa o lactosa.

Aunque se ha informado que la trehalosa es muy eficiente para proteger el material biológico de la deshidratación, hemos encontrado que la lactosa es tan eficiente como la trehalosa en la preservación de los microorganismos. De acuerdo con lo anterior, y lo más preferiblemente, el preservativo o criopreservativo es la lactosa. El microorganismo puede ser manipulado mediante ingeniería genética para expresar una enzima de biosíntesis de la trehalosa o una enzima de biosíntesis de la lactosa, por ejemplo mediante la introducción de genes otsA y otsB de Escherichia coli. Así, la formulación puede ser mantenida o almacenada durante períodos extendidos de tiempo en un estado seco, semiseco o húmedo sin comprometer la viabilidad de los microorganismos. Esto es ventajoso puesto que permite que la formulación sea fácilmente almacenada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra los resultados de un experimento para determinar la capacidad inoculadora de células inmovilizadas de Lactobacillus acidophilus LA- 107que han sido almacenadas a temperatura ambiente durante una semana. Se toman muestras de caldo y se mide la absorbancia a 660 nm y se representan en una gráfica contra el tiempo.

La Figura 1B muestra los resultados de un experimento similar llevado a cabo con células inmovilizadas de Enterococcus faecium EF-101. El ciclo 1 indica que la realimentación se lleva a cabo a las 7 horas, el ciclo 2 indica que la realimentación se lleva a cabo a las 19 horas, el ciclo 3 indica que la realimentación se lleva a cabo a las 26 horas, mientras que el ciclo 4 indica que la realimentación se lleva a cabo a las 32 horas.

La Figura 2 muestra la capacidad de inoculación de formulaciónes inmovilizadas preparadas primero haciendo crecer el microorganismo en un medio junto con alginato de sodio y la adición subsecuente de una mezcla fermentada directamente al cloruro de calcio. El medio fresco se añade a las perlas a T = 0. El medio gastado es reemplazado con medio fresco a 37, 54 y 122 horas. El eje x denota el tiempo medido en horas y el eje y denota la densidad óptica (absorbancia) a 660 nm.

La Figura 3 muestra la producción continua de probióticos a partir de un sistema de reactor de lecho fijo que contiene kelp como medio de inmovilización. El eje x denota el tiempo medido en horas y el eje y denota el conteo viable por 10^{6}/ml en efluentes del reactor.

La Figura 4 muestra los resultados de un experimento para demostrar la capacidad inoculadora de células de Lactobacillus acidophilus LA-107 que han sido inmovilizadas en la presencia de diversos preservativos y/o criopreservativos. La absorbancia a 660 nm es representada gráficamente contra el tiempo. "FD" indica que las células han sido secadas por congelación.

La Figura 5 muestra la capacidad de inoculación de productos con coinmovilizados. La gráfica muestra los resultados de experimentos en los cuales se inmovilizan dos cepas microbianas diferentes en una matriz de algina. La gráfica representa la densidad celular (medida por absorbancia del medio de cultivo) contra el tiempo.

La Figura 6 muestra la capacidad de inoculación de perlas en la cual la cepa probiótica del microorganismo Lactobacillus acidophilus 107 es coinmovilizada junto con inulina, celulosa, almidón resistente y xilano de avena espelta (prebióticos). El control consiste de un microorganismo inmovilizado sólo en alginato (círculos rellenos). Las perlas son alimentadas con medio fresco en T = 0 y el medio ha sido retirado reemplazado con medio fresco a 29, 57 y 121 horas. El eje x denota el tiempo medido en horas y el eje y denota la densidad óptica (absorbancia) a 660 nm.

La Figura 7A muestra la producción continua de un microorganismo probiótico a partir de un reactor de lecho fijo. Los recuentos por 10^{6} producidos por dos lecturas separadas (triángulos rellenos y cuadrados rellenos) se determinan por conteo directo. La Figura 7B muestra una comparación de microorganismos viables a partir del reactor operado en un lecho fijo (triángulos rellenos invertidos y cuadrados rellenos) y lecho fluidizado (triángulos rellenos) como configuración. En ambos casos el eje x denota el tiempo medido en días y el eje y denota los conteos por 10^{6}/ml viables en efluyentes del reactor relevante.

La Figura 8 es un diagrama esquemático de un aparato para administrar un microorganismo probiótico a un animal.

Descripción detallada de la invención

Nuestra invención permite que una fuente de microorganismos probióticos sea administrada continuamente en la cadena alimenticia de un animal. Los microorganismos probióticos son provistos como una formulación que comprende células suspendidas o inmovilizadas en una matriz.

El microorganismo probiótico puede comprender cualquier especie o cepa que sea conocida por tener efectos beneficiosos en el animal. El microorganismo probiótico puedes ser un Enterococcus por ejemplo Enterococcus faecium, Enterococcus faecium PR88, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalis V24, Enterococcus avium o Enterococcus durans. Los microorganismos prebióticos también pueden ser un Lactobacillus por ejemplo, Lactobacillus animalis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus animalis subsp cellobiosus, Lactobacillus acidophilus cepas LT516 (Chaves et al. 1999, Brazilian Journal of Animal Science, 28, 1075-1085) y LT 158A (Chaves et al. 1999, Brazilian Journal of Animal Science, 28, 1093-1101), Lactobacillus salivarius CTC2197 (Pascual et al, 1999, Applied and Environmental Microbiology, 65, 4981-4986), Lactobacillus sporogenes (Singh et al, 1999, Indian Journal of Animal Sciences, 69, 830-831), Lactobacillus bifidus, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus CNRZ-303, Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus-12, Lactobacillus helveticus INF-II, Lactobacillus plantarum INF-9a, Lactobacillus casei subes casei INF-15d, Lactobacillus casei subsp pseudocasei INF-13i, o Lactobacillus fermentum. El microorganismo probiótico también puede ser un Bífidobacterium, por ejemplo Bifidobacterium bifidum.

Será evidente que las formas recombinantes de cualquiera de los microorganismos anteriores pueden ser utilizadas. En efecto, con referencia un "microorganismo" en este documento, tal referencia debe entenderse como que abarca las variantes recombinantes del microorganismo. Tales formas recombinantes pueden comprender formas manipuladas por ingeniería genética para obtener características alteradas, expresión de productos útiles, mejor supervivencia, etc.

Los microorganismos probióticos preferidos son aquellos que han sido aprobados por las autoridades reguladoras correspondientes para su uso. Tales microorganismos incluyen los que están anexo, por ejemplo, en la European Council Directive 70/524/EEC of 23 November 1970 que se refiere a los aditivos en las materias primas alimenticias (Official Journal 270, 14/12/1970 p. 0001-0017), o como ha sido modificado por la legislación subsecuente (véase http://europa.eu.int/eurlex/en/lif/dat/1970/en 370L0524.html). En el anexo I de este documento se proporciona una lista de tales microorganismos.

La matriz puede ser cualquier matriz capaz de preservar la viabilidad sustancial de los microorganismos, de manera que un número sustancial de microorganismos estén vivos cuando la formulación se mantiene durante periodos extendidos de tiempo. Preferiblemente, la matriz es escogida de manera que la viabilidad de los microorganismos suspendidos es comparable a, o mejor que, las células libres (en otras palabras, células que no han sido inmovilizadas).

Se han divulgado un cierto número de matrices capaces de preservar las células. Por ejemplo, se han suspendido las células en agar, agarosa, o en una mezcla agar-agarosa, fundiendo el agar o la agarosa o la mezcla. Las células son adicionadas al líquido fundido y se mezclan para formar una suspensión uniforme. El fundido de agar/agarosa/mezcla es enfriado entonces por debajo del punto de fusión relevante.

Alternativamente, como una realización preferida, las células probióticas se hacen crecer en un medio de cultivo apropiado tal como es conocido en la técnica. Las células son recolectadas preferiblemente, por ejemplo, mediante centrifugación y son lavadas. Las células son suspendidas entonces en una solución de una sal de alginato soluble. Se sabe que los alginatos de los metales alcalinos son solubles: las sales de alginatos preferidas incluyen por lo tanto alginatos de metales alcalinos tales colmo litio, sodio, potasio, rubidio etc. También puede utilizarse alginato de amonio. Preferiblemente, se utiliza alginato de sodio, en una concentración preferida de 4% peso/volumen. La suspensión se añade entonces a una solución que contiene iones calcio para producir la formación de un gel. Alternativamente, las células pueden ser suspendidas en la solución que contiene calcio y añadidas a una solución de alginato soluble. El gel comprende alginato de calcio, y contiene células probióticas inmovilizadas suspendidas en el alginato. Si la suspensión del microorganismo se añade gota a gota, entonces el gel se forma como perlas que pueden ser recogidas. El alginato gelificado puede si es necesario ser moldeado en un bloque, o conformado en capas sobre un soporte sólido.

Un método de inmovilización de células en cápsulas de alginato de calcio se describe en la patente de los Estado Unidos No. 5, 766, 907. Otros alginatos insolubles que pueden ser utilizados para encapsular o inmovilizar las células probióticas incluyen sales de alginato de metales alcalinotérreos, tales como magnesio, calcio, estroncio, bario, etc, en forma de sales de alginato. Los alginatos de otros cationes divalentes también pueden ser empleados. Las matrices o geles que comprenden tales alginatos pueden fabricarse por los métodos descritos aquí.

La realización preferida descrita más arriba emplea células recolectadas suspendidas en una solución de una sal de alginato soluble. Esta etapa de separación, aunque preferida, no es estrictamente necesaria. Hemos encontrado que es posible complementar el medio de crecimiento con alginato soluble y que los microorganismos permanecen capaces de crecer en el medio que contiene alginato. Las perlas que comprenden microorganismos inmovilizados o encapsulados pueden formarse añadiendo el medio (que contiene células y alginatos) en una solución de calcio u otro como se describió más arriba. Adicionalmente, los microorganismos pueden hacerse crecer en un medio que comprende un agente gelificante tales como iones de calcio (u otros iones metálicos alcalinotérreos o divalentes, etc) y se añaden en una solución que contiene alginato soluble para formar los geles o perlas que comprenden microorganismos encapsulados.

Las células de los microorganismos probióticos también pueden ser encapsuladas en microesferas o microcápsulas, mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se divulgan en la patente de los Estados unidos No. 4, 803,168. Las microcápsulas que contienen los microorganismos también pueden ser formadas por gelificación interna de una solución de alginato emulsificada con un aceite, por ejemplo, como se describe en Esquisabel et al. (1997), Journal of Microencapsulation, 14, 627-638. Alternativamente, pueden utilizarse geles de carragenato-quitosan para inmovilizar los microorganismos (Wang and Qian, 1999, Chemosphere 38, 3109-3117). También se han utilizado cápsulas biocompatibles que consisten de un núcleo de almidón líquido con membranas de alginato de calcio para encapsular bacterias del ácido láctico (Jankowski et al, 1997. Biotechnology Techniques, 11, 31-34). Las cápsulas de alginato de bario también pueden ser utilizadas en lugar de calcio (Yoo et al, 1996, Enzyme and Microbial Technology, 19, 428-433).

También son posibles otras formas alternativas de la matriz para encapsular microorganismos (además de las perlas). Por ejemplo, pueden emplearse criogeles que comprenden poli (vinil alcohol). Tales criogeles se hacen proveyendo una solución de un alcohol polivinilico que contiene el microorganismo de interés. La solución se añade entonces (por ejemplo, gota a gota) a un solvente no miscible tal como hexano (o el hexano se añade a la solución que contiene el microorganismo). Se forman perlas congeladas y estas, cuando se descongelan muy lentamente (por ejemplo, durante la noche en una nevera) forman perlas insolubles con microorganismos viables. Tal método puede ser empleado con cualquier polímero soluble, por ejemplo alginato soluble, carboximetil celulosa, poliacrilamida, etc. Se hace referencia a Gough et al, 1998, Bioprocess Eng., 87-90

También pueden utilizarse diversas formas de matriz, permitiendo configuraciones alternativas de los reactores. Así, además de perlas, la matriz puede tomar la forma de discos, bloques, fibras o fibrilas extrudidas, tubos. Además, la matriz o formulación puede ser recubierta sobre placas, recubrir mallas de alambre, o en efecto recubrir cualquier otro soporte sólido.

Por ejemplo, la matriz puede formarse como perlas u otras partículas conformadas, las cuales pueden ser retenidas sobre un soporte. Un soporte preferido comprende una malla o red, la cual puede ser hecha de metal, alambre u otro material adecuado. Las perlas o partículas pueden conformarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo por aspersión o pulverización desde una boquilla sobre la malla, de una manera análoga a la liofilización. La matriz que comprende los microorganismos puede ser aplicada al soporte por ejemplo sumergiendo el soporte (tal como una malla de alambre) en CaCl_{2} (o soluciones que contengan otros iones divalentes o alcalinotérreos como se describió en algún lugar en este documento) y sumergiendo subsecuentemente la malla en suspensiones probióticas que contienen alginato. Lo inverso también es posible, cuando la malla es sumergida en la suspensión probiótica y luego con solución de calcio etc. Medios alternativos de recubrimiento son evidentes para una persona experimentada. Las placas pueden ser entonces alineadas lado a lado en un recipiente de soporte con el cual puede ser suministrado el medio. El efluente del sistema contendría un depósito de probióticos. Además, la matriz puede ser conformada como una superficie sustancialmente extendida, tal como una superficie sustancialmente plana, y soportada opcionalmente mediante un elemento de soporte. Así, la matriz puede ser utilizada para recubrir en forma de una película sobre una placa de material adecuado, por ejemplo, un material inerte tal como metal o plástico. El soporte es preferiblemente resiliente. El soporte puede comprender agar o agarosa, que comprende preferiblemente un alto contenido adecuado de agente de gelificación para resiliencia. Una concentración preferida es 1%, 2%, 3% o más de agarosa o de otro agente gelificante. Una ventaja de tal configuración es la superficie incrementada disponible para que se desprendan los microorganismos. Así, se entenderá que la superficie puede comprender indentaciones, surcos, o tener una forma curvada, sinusoidal u ondeada o cualquier otro perfil transversal para incrementar el área superficial.

Alternativamente, los probióticos inmovilizados podrían ser colocados en forma de placa sobre las paletas de un dispositivo impulsor que puede ser rotado a través de un medio a una velocidad particular (por ejemplo a una velocidad baja). Los probióticos serian entonces depositados sobre el medio. Tales paletas pueden comprender las configuraciones planas descritas más arriba.

La ventaja de tales configuraciones es especialmente evidente en configuraciones donde se usan placas múltiples (preferiblemente dispuestas en forma sustancialmente paralelas).

Mientras que se ha hecho referencia a la inmovilización del microorganismo en una matriz, será evidente que cualquier forma de inmovilización en conjunción con cualquier material de soporte adecuado pueden ser utilizadas, en tanto los microorganismos retengan una viabilidad sustancial y puedan ser depositados desde el soporte o matriz. Así, cuando nos referimos a inmovilización "dentro de" o "en" una matriz, debe tomarse como referencia a cualquier tipo de inmovilización de microorganismo soportados por una matriz. Se incluye la inmovilización en, alrededor de, cerca de, dentro de, sobre la superficie de, unido a, o de otra manera asociado con una matriz.

Por ejemplo, la matriz puede comprender un soporte sólido o semisólido, sobre el cual se soporta el microorganismo. Tal soporte puede ser cualquier soporte, preferiblemente un soporte inerte tal como es conocido en la técnica. Por ejemplo, el soporte puede comprender una perla, sobre la cual se une el microorganismo. Son posibles diferentes formas, por ejemplo, elongada, tubular, esférica, cúbica, etc. El material de soporte puede comprender agar, agarosa, carragenato, etc, tal como se describió más arriba. Preferiblemente, sin embargo, el microorganismo esta embebido con la matriz, tal como una porción sustancial de matriz que rodea el microorganismo. Realizaciones en las cuales la matriz actúa como un sustrato incluye las descritas en el ejemplo 3, donde se utiliza como soporte el kelp.

La matriz que contiene los microorganismos puede ser secada por congelación. Los métodos para secar por congelación sustancias son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, la matriz puede ser liofilizad mediante, por ejemplo, la exposición a vacio, o secada por aspersión. En la técnica se conocen diversos métodos de liofilización y secado por aspersión. La matriz que contiene los microorganismos puede ser reconstituida añadiendo agua o un medio (por ejemplo, caldo o nutrientes) a la matriz seca.

La matriz que contiene los microorganismos también puede contener un preservativo que mejora la viabilidad de los microorganismos. Cuando los microorganismos son secados por congelación su reconstitución por adición de medio o agua es potenciada mediante la adición de criopreservativos (crioprotectores) antes de la congelación. Preferiblemente, el preservativo es alguno que proteja los microorganismos de la deshidratación o del frío o de ambos. Los anteriores incluyen agentes que permiten una supervivencia o viabilidad sustancial de los microorganismos, de los cuales se ha retirado el agua de su ambiente natural, protegiéndolos preferiblemente contra la deshidratación completa.

Tales preservativos y/o criopreservativos son caracterizados normalmente por la presencia de numerosos grupos hidroxilo en su estructura y se cree que estos grupos estabilizan la microestructura a un nivel molecular en los sistemas biológicos secados por congelación reemplazando los grupos hidroxilo del agua retirados durante el procedimiento de congelación. Los agentes tales como glicerol, sacarosa, glucosas y más recientemente, trehalosa han mostrado potencial para la rehidratación de los productos biológicos. La trehalosa es muy eficiente en este aspecto y ha sido explotada en las preparaciones secadas por congelación de productos biológicos (Sánchez et al, 1999, Intl. J. Pharm. 185, 255-266; Esquisabel et al., 1997, J. Microencapsulation, 14, 627-638). En algunos casos las preparaciones crudas de preservativos se han empleado para estabilizar preparaciones secadas por congelación de microorganismos y se ha encontrado que los sólidos de la leche desengrasada estabiliza las preparaciones inmovilizadas en alginato de cepas de Lactobacillus (excluyendo al Lactobacillus acidophilus) (Selmer-Olsen et al. 1999, J. Appl. Microbiol. 87, 427-439). Así, por ejemplo, el preservativo puede comprender suero o permeado de suero, o combinaciones de estos. Es bien conocido que la leche puede ser separada en suero y cuajada; las proteínas tales como la caseína residual son retiradas del suero para producir permeado de suero. Además, puede utilizarse cualquier sacárido o polialcohol como preservante potencial.

El preservativo o criopreservativo puede ser glicerol, sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol, adonitol, betaina (N,N,N-trimetilglicina), lactosa o trehalosa. Con el fin de incorporar el criopreservativo en la matriz, el preservativo o criopreservativo apropiado (por ejemplo, trehalosa o lactosa) se disuelve en el medio apropiado, preferiblemente como lactosa al 2% p/v hasta 10% p/v más preferiblemente 2%, 3%, 4% o 5%. El alginato gelificado se expone entonces a la solución de preservativo o criopreservativo durante una cantidad adecuada de tiempo para permitir que el preservativo o el criopreservativo entren en la matriz. Alternativamente, las perlas se forman comprendiendo ya el preservativo o criopreservativo. Así, el preservativo o criopreservativo pueden ser añadidos al medio de crecimiento que contiene el microorganismo y el alginato, antes de ser gelificado por exposición a calcio, etc. Son posibles otras combinaciones, y serán evidentes para el lector.

Se apreciará que pueden utilizarse combinaciones de preservativos. Así, la matriz puede comprender lactosa y trehalosa, o puede comprender suero o permeado de suero, junto con lactosa y/o trehalosa, etc.

Los microorganismos que son suspendidos en la matriz pueden comprender una cepa o especie individual. Alternativa y preferiblemente, la matriz comprende más de una cepa o especie. Por ejemplo, la matriz puede comprender Lactobacillus acidophilus LA-107 y Enterococcus faecium EF-101.

La formulación sirve como una fuente inoculadora del probiótico. Los microorganismos pueden ser desprendidos de la formulación por acción mecánica, por ejemplo, poniendo en contacto directamente la formulación con la corriente de pienso. Las células pueden ser desprendidas por raspado, y son transportadas por la corriente de pienso al punto de alimentación del animal. Los microorganismos desprendidos son adecuadamente células hijas que surgen de la división celular de los microorganismos suspendidos. El paso de las partículas de alimento en la corriente de alimentación también pueden desgastar el alginato y liberar los microorganismos atrapados. Por ejemplo, las partículas de la matriz pueden ser disueltas en la corriente de pienso cuando la corriente de pienso es una corriente de pienso líquida.

La formulación puede ser colocada dentro de un dispositivo de administración tal como un cartucho. Encerrar la formulación en un cartucho es ventajoso cuando la formulación está en la forma de perlas de alginato. Así, el alginato sirve como una columna para mantener las perlas. Las perlas pueden ser empacadas en un cartucho para almacenamiento, y el cartucho puede ser retirado para su uso. El cartucho tiene aberturas para permitir el paso de agua a través de las perlas. Preferiblemente, las aberturas son formadas como una malla que tiene un tamaño de malla que es lo suficientemente pequeño para retener las perlas en el cartucho, pero lo suficientemente grande para permitir que las células desprendidas sean transportadas.

La formulación probiótica inmovilizada puede ser encerrada en una columna como se describió más arriba. Esto es ventajoso y permite un sistema de flujo continuo o semicontinuo establecido, donde la corriente de pienso pasa a través de la columna en una forma continua o semicontinua para permitir una descarga regular de los microorganismos. Tal sistema de flujo continuo se describe en detalle en el ejemplo 10. Sin embargo, será evidente que un sistema de flujo por lotes o pulsos puede ser usado también.

Las configuraciones alternativas también son compatibles con la operación en flujo continuo o semicontinuo. Esto se incluye en el uso de tecnología de elevación por aire, en la cual la preparación probiótica inmovilizada es encerrada dentro de un recipiente, y se bombea aire (u otro gas, preferiblemente un gas inerte) a través de la base del sistema con el fin de facilitar la agitación. Puede introducirse un medio a través del fondo del sistema y el medio utilizado que contiene los probióticos retirados de la parte superior del sistema. El recipiente también puede ser equipado ventajosamente con una ventilación de gas, por ejemplo en la parte superior en cualquier otra localización adecuada.

Alternativamente, puede emplearse un sistema de tanque agitado, en el cual el sistema inmovilizado es encerrado en un recipiente y se obtiene agitación utilizando un impulsor. De nuevo puede introducirse en medio fresco al sistema y el medio utilizado que contiene los probióticos puede ser recolectado desde el sistema.

Además, las células inmovilizadas pueden ser colocadas en un reactor de fibra hueca y barra o en el espacio excluido de la fibra. El espacio interno de las fibras puede ser empleado para suministrar al sistema nutrientes y para eliminar productos residuales y el espacio excluido puede contener las células inmovilizadas. Las células pueden entonces ser enjuagadas con un medio sobre una base continua para recolectar las células depositadas desde el sistema inmovilizado.

También son posibles configuraciones en estado semisólido de flujo continuo. Así, las perlas, la matriz u otra formulación que comprenda los probióticos pueden ser colocadas en una plataforma hecha de cualquier material adecuado (por ejemplo, una rejilla metálica o plástica), sobre la cual se suministran humedad y nutrientes en forma de aspersión.

Los microbios depositados desde la matriz de inmovilización pueden entonces ser recolectados como gotas de humedad desde la rejilla y recolectados en un recipiente colocado por debajo de la rejilla. Este sistema tiene la ventaja de minimizar la cantidad de agua líquida en el sistema y proporcionar una concentración extremadamente alta de los microorganismos probióticos.

Como puede verse a partir de lo anterior donde las perlas, etc., que comprenden los microorganismos que están empacados, en la forma de una columna, es ventajoso proveer alguna forma de medios de agitación con el fin de promover la deposición de los microorganismos desde la matriz. Cualquier forma de agitación mecánica, electrónica, magnética o física puede ser utilizada aquí. Tal agitación puede ser provista mediante el uso de un lecho fluidizado, como se describe en el ejemplo 10 más abajo. Cualquier fluido adecuado tal como aire, agua, medio, etc. puede ser bombeado sobre las perlas empacadas, etc., que comprenden los microorganismos. El fluido puede hacerse pasar a través de las perlas, de manera continua, o preferiblemente continua. Esto permite que la acción mecánica desprenda los microorganismos. La matriz puede ser puesta en movimiento (por ejemplo agitadas) por medio del fluido de agitación; alternativamente, la matriz puede ser sustancialmente inmóvil, y el desprendimiento de los microorganismos se puede efectuar mediante el paso del fluido de agitación sobre la matriz fija.

La formulación puede ser colocada ventajosamente de forma directa en una corriente de pienso líquido por ejemplo, un suministro de agua para bebida para el animal. Alternativa y preferiblemente, la formulación puede ser posicionada a una distancia de la corriente de pienso. En este caso, las células son desprendidas mediante un mecanismo separado o transportadas (por ejemplo, mediante una tubería) a la corriente de pienso después de ser desprendida. El mecanismo de desprendimiento puede comprender un flujo de agua u otro líquido que pasa por la formulación, el cual desprende los microorganismos de la matriz y los lleva hacia la corriente de pienso. El flujo de líquido puede ser mediado por la gravedad. Preferiblemente o además, el flujo puede ser mediado o asistido mediante una bomba.

Preferible y ventajosamente, el agua o el líquido que alimenta el dispositivo de administración comprende un caldo o medio nutritivo apropiado para el microorganismo. El caldo o medio nutritivo puede ser suministrado desde un depósito, y el flujo de caldo o medio sobre las perlas puede ser regulado para alcanzar una dosis apropiada de microorganismos en la corriente de pienso. Así, cuando las perlas son bañadas en un flujo de caldo o medio nutritivo, las células inmovilizadas son nutridas y sufren crecimiento y división celular, proveyendo un suministro de células desprendidas que puede ser transportado hacia la corriente de pienso. En contraste, cuando el suministro de caldo de nutrientes es cortado, el crecimiento de la población de microorganismos se detiene.

La rata de desprendimiento del microorganismo puede ser ajustada de manera que sea sustancialmente continua y uniforme para superar los problemas de dosificación y mezclado asociado con los métodos anteriores como se describieron más arriba. Sin embargo, puede ser preferido en alguna circunstancias tener un flujo pulsado, por lotes o semicontinuo, y el aparato se adapta para suministrar tal flujo por métodos conocidos en la técnica.

La invención se describe adicionalmente, para propósitos de ilustración solamente, mediante los ejemplos siguientes.

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Ejemplos Ejemplo 1 Inmovilización de cepas probióticas y su uso como fuente continua de probióticos viables

El objetivo de este ejemplo es demostrar (1) que las cepas probióticas microbianas escogidas pueden ser inmovilizadas sin efectos nocivos a la viabilidad (2) que estas formulaciones pueden ser utilizadas como una fuente continua de probiótico viable como resultado de la deposición desde la matriz de inmovilización.

Cultivos de 100 ml de Lactobacillus acidophilus LA-107 (ATCC cepa No. 53545 y Enterococcus faecium EF-101(ATCC cepa No. 19434) se hacen crecer en fase estacionaria en caldo MRS (deMan, Rogosa, Sharpe) y caldo nutritivo (Oxoid) respectivamente a 37ºC. Se alcanza la fase estacionaria a las 8 horas utilizando EF-101 mientras que la cepa de LA alcanza la fase estacionaria a las 26 horas. Las células son lavadas en medio, recuperadas por centrifugación y suspendidas en 4 ml (LA-07) y 2 ml (EF-101) de alginato de sodio al 4% (p/v). Estas suspensiones son añadidas gota a gota a 100 ml de CaCl_{2} 50 mM.

Las perlas resultantes de los cultivos inmovilizados (diámetro aproximado = 2-3 mm) son retenidas a 4ºC durante 1 hora en el CaCl_{2} y se almacenan bien en caldo o simplemente como perlas humidificadas a temperatura ambiente durante una semana. Con el fin de determinar si el microorganismo en la matriz permanece o no viable y capaz de ser desprendido desde la perla, una perla individual se coloca en 50 ml del caldo relevante que contiene CaCl_{2} 50 milimolar, se incuba a 37ºC y se toman muestras de caldo en los tiempos indicados en la Figura 1A y Figura 1B. Si el microorganismo viable está presente, entonces el desprendimiento desde la superficie de la perla contribuirá a la turbidez en el medio circundante.

La turbidez de estas muestras se determina midiendo la absorbancia a 660 nm utilizando un espectrofotómetro. Los perfiles de crecimiento obtenidos para las perlas que contienen LA-107 se muestran en la Figura 1A. El medio se reemplaza a las 30 horas, 50 horas y 170 horas. La muestra de control consiste de células libres que son realimentadas en los tiempos indicados por la adición de caldo fresco. Los resultados demuestran que las células en perlas almacenadas en el medio durante una semana se recuperan alrededor de 10 horas después y el perfil de crecimiento es similar al de la población de células de control no inmovilizadas. Además, cuando se realimentan las perlas a 30, 50 y 170 horas, el crecimiento se recupera de nuevo por desprendimiento desde las perlas. Aunque las perlas almacenadas durante una semana en la ausencia de medio fallan en recuperar el primer ciclo hasta las 30 horas, la recuperación es evidente en ciclos de realimentación subsecuentes.

Los perfiles de crecimiento obtenidos siguiendo un estudio similar con la cepa EF-101 inmovilizadas se muestran en la Figura 1B. La realimentación se lleva a cabo a las 7, 19, 26 y 32 horas. Los resultados demuestran que la recuperación de las perlas es similar a los perfiles de crecimiento exhibidos usando las células libres. Además, se encuentra que cuando la perla es realimentada a las 200 horas se obtiene un perfil de recuperación similar.

Estos resultados demuestran que tanto los microorganismos probióticos listados arriba pueden ser inmovilizados en matrices de alginato como que los microorganismos retienen la viabilidad. Además, las formulaciones probióticas retienen su capacidad inoculadora durante un periodo considerable de tiempo y la inoculación de las formulaciones exhibe perfiles de crecimiento similares a los exhibidos por los microorganismos libres.

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Ejemplo 2 Inmovilización de cepas probióticas mediante crecimiento en un medio que contiene alginato soluble y adición de calcio

Los ejemplos anteriores describen la inmovilización de microorganismos probióticos en matrices, primero recolectando el microorganismo probiótico después de un crecimiento convencional sobre medios, suspensión en alginato, y adición gota a gota a soluciones de CaCl_{2}.

Este ejemplo muestra que lo inverso también puede ser utilizado para inmovilizar los microorganismos, esto es, el crecimiento de los microorganismos en un medio que comprende alginato soluble, y adición a soluciones que contienen calcio. Los microorganismos (LA-107) se hacen crecer primero en medio MRS que contiene alginato de sodio al 4%. Estas mezclas son añadidas entonces gota a gota a CaCl_{2} 50 mM y las perlas que se forman son examinadas en cuanto a su capacidad para depositar microorganismos probióticos en el medio.

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Ejemplo 2 Resultados

Cuando las perlas son preparadas en la forma alternativa anterior, se colocan en medio MRS fresco y la capacidad de la perla para depositar microorganismos se determina midiendo la absorbancia a 660 nm. Con el fin de demostrar adicionalmente que la deposición de microorganismos puede ser llevada a cabo durante un cierto número de ciclos, se añade medio fresco a 37, 54 y 122 horas. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2 y demuestran que estas formulaciones, preparadas de la forma alternativa descrita más arriba, pueden ser empleadas para producir de manera continua microorganismos probióticos.

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Ejemplo 3 Inmovilización de cepas probióticas sobre la superficie de un material (Kelp)

Los ejemplos anteriores muestran la inmovilización de microorganismos dentro de una matriz. Este ejemplo demuestra que los microorganismos probióticos pueden ser inmovilizados por unión a un material sólido o semisólido (sustratos). Así, de la misma forma que la inmovilización dentro de una matriz, el microorganismo puede ser inmovilizado sobre un material, el cual puede ser por sí mismo una matriz.

El microorganismo se hace crecer sobre bloques de kelp, el cual se obtiene fresco del litoral marítimo (Dunseverick, Co, Antrim, Northern Ireland). La pulpa interna del tallo es cortada en cubos que miden aproximadamente 125 mm^{3} y se lavan exhaustivamente. Se añaden entonces a matraces que contienen medio MRS, se someten a autoclave y después de la inoculación con LA-107, los matraces son colocados en una incubadora orbital a 37ºC.

Los cubos de kelp se encuentran recubiertos ya de una capa de microorganismos, indicando que el microorganismo ha sido inmovilizado sobre la matriz. El líquido es decantado y los bloques de kelp junto con los microorganismos adheridos son empacados en una columna. Una configuración similar como la descrita en el ejemplo 10 (véase más abajo) fue empleada excepto que la rata de flujo se determina a 85 ml/hr, se introduce medio en la parte superior de la columna y el flujo es facilitado por gravedad. El medio MRS es bombeado a través del lecho empacado de la columna y los microorganismos viables son determinados por un conteo directo sobre placas de agar (agar MRS).

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Ejemplo 3 Resultados

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3 y demuestran que la formulación, con base en la inmovilización de microorganismos probióticos sobre una matriz también es capaz de servir como fuente continua de probióticos. Como en el caso con los resultados mostrados en la Figura 7A (véase ejemplo 10 más abajo), la producción de microorganismos a partir de la columna es errática y esto puede ser contrarrestado por agitación del lecho como se describe para el ejemplo 10. No obstante estos resultados demuestran que puede emplearse una matriz alternativa en una configuración de columna para la inoculación continua bien en agua para bebida o corrientes de piensos para los animales con el fin de facilitar la inoculación del tracto digestivo de los animales receptores.

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Ejemplo 4 Almacenamiento a largo plazo de una formulación prebiótica que consiste de Enterococcus faecium EF-101 inmovilizado en alginato

Con el fin de determinar si la inmovilización puede proveer o no ventajas con respecto al almacenamiento, se escogió E. faecium (EF-101) como microorganismo probiótico candidato y se inmovilizó como se describe en el ejemplo 1. Las perlas y las células libres son almacenadas entonces a 4ºC en un caldo nutritivo que contiene CaCl_{2} 5 mM para los tiempos indicados en la tabla 1 y el medio es reemplazado sobre una base semanal.

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TABLA 1 Estabilidad de E. faecium EF-101 en la formulación de alginato probiótica

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Con el fin de determinar la viabilidad de los microorganismos en la matriz de inmovilización, se toma una perla individual en los tiempos indicados y se disuelven en 50 ml de caldo nutritivo que contiene NaCl 50 mM y citrato de sodio 10 mM. Los recuentos de células viables son determinadas después del crecimiento durante la noche por inoculación sobre placas de agar nutritivo. Los resultados en la Tabla 1 demuestran que los microorganismos viables son retenidos en las perlas por periodos hasta de 3 meses y los recuentos viables son más altos que los retenidos en preparaciones de células libres.

Los resultados demuestran una estabilidad incrementada en los microorganismos probióticos inmovilizados durante periodos prolongados de tiempo.

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Ejemplo 5 Inclusión de lactosa en la formulación de probióticos inmovilizados potencia la recuperación de microorganismos probióticos viables después de la reconstitución de las preparaciones secadas por congelación

Este ejemplo determina si las cepas de probiótico relevantes pueden ser inmovilizadas en alginato, almacenadas como una preparación secada por congelación (para una manipulación potenciada en estante/almacenamiento) y reconstituidas para producir microorganismos viables. También queríamos determinar si la adición de lactosa a las perlas antes de la reconstitución potenciada por secado por congelación de la preparación inmovilizada en términos de la capacidad de inoculación. En particular, queríamos determinar si la lactosa es tan eficiente como la trehalosa en la potenciación de tal reconstitución.

En estos estudios, se escogió LA-107 como microorganismo probiótico representativo y se inmovilizó como se describió en el ejemplo 1. Se suspende una preparación de 50 perlas en 10 ml de lactosa al 2% (p/v) o trehalosa al 2% (p/v) durante una hora a temperatura ambiente antes del secado por congelación. Después del secado por congelación las perlas son almacenadas a temperatura ambiente durante una semana. Las muestras de control consisten de microorganismos secados por congelación no inmovilizados que han sido almacenados en medio durante una hora antes del secado por congelación. Después de una semana a temperatura ambiente se rehidratan las perlas individuales en 50 ml de medio de RMS que contiene CaCl_{2} 50 milimolar y la capacidad de inoculación de estas preparaciones se examina como se describió en el ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la Figura 4. La capacidad de inoculación de cada preparación inmovilizada se compara con la capacidad de inoculación de células libres no secas. La eficiencia relativa de la capacidad de inoculación se indica por el tiempo tomado por el medio para alcanzar la absorbancia de 0,5 a 660 nm (A660) y es un reflejo de la cantidad de crecimiento microbiano. Se encuentra que la inoculación por células libres exhibe un perfil convencional y el A660 alcanza 0.5 al cabo de 16 h. El perfil exhibido por las células libres secadas por congelación muestra que un A660 de 0.5 se alcanza al cabo de 19 h. Las preparaciones con lactosa y trehalosa estabilizadas e inmovilizadas y secadas por congelación alcanzan un A660 de 0.5 dentro de 21 horas y los perfiles exhibidos por ambas son muy similares. Los probióticos inmovilizados no estabilizados secados por congelación son más bajos, y alcanzan un A660 de 0.5 a las 34 horas.

Estos resultados muestran claramente la ventaja de añadir lactosa o trehalosa a la formulación inmovilizada antes del secado por congelación. Puesto que ambos perfiles de inoculación son similares los resultados sugieren que la lactosa, más que la trehalosa, es un aditivo preferido sobre la base del coste de la formulación. Los resultados también demuestran claramente que la formulación probiótica sugerida que incluye lactosa y/o trehalosa puede ser almacenada como un producto seco durante periodos prolongados de tiempo.

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Ejemplo 6 Efecto de lactosa y trehalosa sobre la recuperación a largo término de la viabilidad (estudio a 6 meses)

El ejemplo anterior muestra que inmovilizar el microorganismo probiotico en alginato junto con trehalosa o lactosa proporciona un grado de protección cuando las preparaciones son almacenadas durante una semana después del secado por congelación. Con el fin de extender el estudio decidimos inmovilizar el mismo microorganismo (LA-107) como se describió anteriormente y continuar su estudio hasta el mes 6.

En este caso las preparaciones también consisten de microorganismos almacenados sólo en alginato, alginato más 2% de lactosa y alginato más 2% de trehalosa. Además también se almacenan microorganismos inmovilizados en lactosa al 4%. Las muestras de control consisten de microorganismos libres. Cada preparación es almacenada hasta 6 meses y las muestras son reconstituidas periódicamente. Las preparaciones de microorganismos reconstituidos son examinadas en cuanto a su habilidad para depositar los microorganismos probióticos en el medio circundante durante un periodo de 48 horas, y se determina la absorbancia a 660 nm utilizando un espectrofotómetro. Un incremento en la absorbancia es indicativo del desprendimiento de probióticos desde la superficie de la perla. Si no hay incremento en la absorbancia se indica una viabilidad negativa.

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Ejemplo 6 Resultados

Los resultados obtenidos se muestran en las Tablas 2A y 2B más abajo.

TABLA 2A Deposición de probióticos en el medio después de almacenamiento de preparaciones inmovilizadas por secado por congelación

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TABLA 2B Deposición de probióticos en el medio después de almacenamiento de preparaciones inmovilizadas por secado por congelación

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Como puede verse a partir de las Tablas 2A y 2B, en la ausencia de cualquier aditivo de azúcar, la viabilidad del microorganismo probiótico en alginato no es preservada con un mes de almacenamiento más. Cuando se emplea trehalosa como estabilizador en las preparaciones inmovilizadas la viabilidad se preserva para un almacenamiento de hasta 6 meses de preparaciones secadas por congelación. Sin embargo, cuando se emplea lactosa como estabilizador en una concentración de 2% (p/v) en las preparaciones inmovilizadas, la viabilidad del probiótico se preserva hasta por un mes. Sin embargo con tiempos de almacenamiento más largos, la viabilidad del probiótico en estas soluciones que contienen lactosa no podría ser recuperada (Tablas 2A y 2B).

Sin embargo hemos decidido determinar si incrementado o no la concentración de la lactosa se puede asegurar la supervivencia del probiótico en formulaciones inmovilizadas. Por lo tanto se llevó a cabo un experimento similar en el cual la viabilidad del probiótico se examina en formulaciones inmovilizadas que contienen 4% (p/v) de lactosa y que se reconstituyen después del almacenamiento durante 3 y 6 meses. Los resultados se muestran en la Tabla 2B y demuestran que un 4% de lactosa preserva la viabilidad de los probióticos en formulaciones inmovilizadas secadas por congelación para periodos de hasta 6 meses.

La lactosa puede por lo tanto servir para estabilizar los microorganismos como una alternativa a la trehalosa.

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Ejemplo 7 Una formulación probiótica microbiana que consiste de dos entidades microbianas coinmovilizadas y en una matriz de alginato

En los ejemplos anteriores empleamos cepas microbianas tanto de Lactobacillus como de Enterococcus probióticas inmovilizadas separadamente en formulaciones de matriz de alginato. El objetivo de este estudio es determinar si las cepas de Lactobacillus y Enterococcus pueden ser coinmovilizadas en la misma matriz produciendo una formulación sencilla con capacidad inoculadora para ambos microorganismos probióticos.

En este estudio la LA101 y la LA107 son coinmovilizadas juntas con EF-101 para producir dos formulaciones separadas, a saber LA-101/EF-101 y LA-107/EF-101. La inmovilización se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 1, excepto que la mezcla apropiada de microorganismo se emplea en vez de la cepa individual. En la mezcla LA-101/EF-101 la proporción es 1:1 con respecto al conteo celular. En caso de LA-107/EF 101 la proporción de mezcla es 1:10. Después de la inmovilización, las formulaciones se almacenan por 4 días en un medio. Las poblaciones de control consisten de mezclas apropiadas de los microorganismos en proporciones similares. Después de 4 días de almacenamiento se coloca una perla de cada mezcla en caldo MRS según se describió para los ejemplos anteriores y se determinó la capacidad de inoculación examinando el crecimiento de la deposición de microorganismos en el medio.

Los resultados se muestran en la Figura 5 y demuestran que los microorganismos son liberados de ambas preparaciones coinmovilizadas. Aunque estos resultados demuestran que las preparaciones coinmovilizadas son capaces de depositar microorganismos en el medio circundante, es necesario examinar si los microorganismos asociados están siendo liberados desde la matriz. Para este propósito se recolectaron muestras de caldo de los sistemas coinmovilizados y se inocularon sobre placas de agar MRS (Oxoid) en una dilución de 1 en 10^{6}. Las colonias son distinguidas sobre la base de la morfología de las colonias y la proporción relativa de Lactobacillus y Enterococcus se determina por conteo directo. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3 abajo.

Además, cada sistema es realimentado a las 38 horas con medio fresco y se deja crecer durante otro ciclo hasta la fase estacionaria. De nuevo, se analizan muestras de caldo como se describió más arriba con el fin de determinar las proporciones relativas de cada microorganismo asociado depositado desde la matriz de inmovilización. Los resultados obtenidos se muestran también en la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3 Identificación de cepas microbianas liberadas desde las formulaciones coinmovilizadas

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Los recuentos determinados inoculando 1 en diluciones 10^{6} del cultivo sobre placas de agar MRS y colonias distinguidas sobre la base de la morfología. * La ausencia de colonias significa que en esta dilución no se pudo detectar EF lo cual no necesariamente significa una ausencia de EF en el medio.

Los resultados demuestran que al final del primer ciclo de crecimiento la cepa EF-101 es la cepa predomínate liberada desde la matriz en el medio. Sin embargo, los resultados también demuestran la presencia de LA-101 y LA-107 liberados desde la preparación inmovilizada relevante. Esto debe esperarse puesto que el crecimiento de la cepa EF-101 es mucho más rápido que el de las cepas LA, como se describió antes en el ejemplo 1. Había alguna preocupación en cuanto que la cepa EF podría competir con las cepas LA en la preparación coinmovilizada, resultando en una desaparición eventual de esta última en términos de capacidad de inoculación. Sin embargo, cuando las formulaciones mezcladas son realimentadas y analizadas de nuevo en cuanto a las cantidades relevantes de EF y LA se encontró sorprendentemente que esta última se convierte en el microorganismo predominante depositado en el medio (véase Tabla 3).

Los resultados demuestran que ambas cepas microbianas probióticas pueden ser coinmovilizadas en alginatos para producir una formulación probiótica novedosa y que la formulación puede ser empleada para facilitar la inoculación de ambas cepas asociadas de los microorganismos en el medio relevante. Además, los resultados demuestran que es posible alcanzar una producción selectiva de las perlas manipulando las proporciones relativas de cada asociado durante la formulación. Esto proporcionaría ventajas en sistemas donde se desea suministrar preferiblemente uno de una pareja de microorganismos a un huésped antes de suministrar otro microorganismo de la pareja.

Perlas separadas

Los resultados demuestran que es posible obtener cultivos mixtos de los probióticos a partir de las formulaciones inmovilizadas cuando se coinmovilizan dos microorganismos probióticos en una perla individual de la matriz. Una alternativa para tal sistema involucra la mezcla de dos perlas separadas que contienen cada microorganismo. Con este fin se preparan perlas que contienen bien sea LA 107 o EF como se describió en el ejemplo 1 más arriba. Las perlas son lavadas entonces y recolectadas y luego se colocan dos perlas, una que contiene LA 107 y la otra que contiene EF, en medio MRS. Los recuentos viables son determinados en la fase de medio logaritmo y el medio se reemplaza subsecuentemente con medio fresco de manera que se examinan 3 ciclos de deposición.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Combinación de perlas 1x LA 107 y 1 x EF 101. TMTC = Demasiado para contar

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Los resultados mostrados en la Tabla 4 demuestran que ambos microorganismos son depositados en el medio (deposición 2). Los resultados también confirman los obtenidos con ambos microorganismos en una perla individual (más arriba) cuando la cepa de Lactobacillus se hace eventualmente predominante en el medio en la tercera deposición. Estos resultados confirman que más de un microorganismo probiótico puede ser empleado en formulaciones y que estas pueden ser coinmovilizadas en la matriz y/o inmovilizadas en perlas separadas.

Ejemplo 8 Prebióticos

Se ha mostrado en los ejemplos anteriores que los microorganismos probióticos pueden ser incorporados en matrices y que estas formulaciones producen microorganismos probióticos viables que pueden ser administrados bien directamente al animal o introducidos bien sea en el agua para beber o en corrientes de pienso. Con el fin de ilustrar adicionalmente las ventajas asociadas con estas formulaciones, determinamos si otros materiales podrían ser coinmovilizados junto con los microorganismos probióticos.

Se ha conocido durante algún tiempo que ciertos oligosacáridos no digeribles pueden proporcionar ventajas para los probióticos bien estimulando su crecimiento o la función de los cultivos probióticos en el tracto digestivo y estos oligosacáridos son denominados comúnmente como prebióticos (Crittenden et al., 2000, J. Appl. Microbiol., 90, 268-278). Se pensó que si estos pudieran ser inmovilizados correctamente con el probiótico en la matriz inmovilizante podrían ser coadministrados al animal receptor proporcionando por lo tanto una función prebiótica y probiótica en una dosis individual. Decidimos por lo tanto escoger una serie de entidades de carbohidrato no digerible y coinmovilizarlas junto con el microorganismo probiótico LA 107.

Con este fin el microorganismo se hace crecer en medio MRS y se recolecta. Luego se añade a alginato al 4% (p/v) que contiene prebióticos al 2% (p/v) y los candidatos escogidos son inulina, celulosa, almidón resistente y xilano de avena espelta. Las perlas se forman como se describió en el ejemplo 1 uno más arriba y se colocan en un medio. Se examina la capacidad del microorganismo para depositarse en el medio circundante. El medio es reemplazado a las 29, 50 y 121 horas con el fin de demostrara una deposición prolongada.

Además, las preparaciones también son almacenadas como preparaciones húmedas durante un periodo de 1 mes a temperatura ambiente, 4ºC y a -20ºC, y se examina la capacidad de recuperar el microorganismo viable después de colocarlo en un medio al final de este periodo. En estos estudios particulares el microorganismo se hace crecer en un prebiótico más medio y luego se inmoviliza en alginato, o el microorganismo se hace crecer en un medio y luego se inmoviliza en alginato que contiene la entidad prebiótica. Las preparaciones de control usadas a través de los estudios descritos en este ejemplo consisten de microorganismos probióticos inmovilizados en alginato solamente.

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Ejemplo 8 Resultados

Con el fin de determinar si el microorganismo probiótico puede depositarse desde las formulaciones que contienen el prebiótico, se colocan las perlas en un medio y se determina la absorbancia a 660 nm. Los ciclos de deposición son examinados después de la transferencia de las perlas a un medio a las 0, 29, 50 y 121 horas. Los resultados se muestran en la Figura 6 y demuestran que el microorganismo es depositado desde todas las formulaciones examinadas. Estos resultados demostraron que aditivos tales como los prebióticos que proporcionan beneficios pueden ser incorporados en la matriz de inmovilización sin afectar adversamente la capacidad de estas formulaciones para proveer microorganismos probióticos.

Además de los anteriores resultados, también decidimos determinar si la incorporación del prebiótico en la formulación proveería beneficios en términos de almacenamiento. Con este fin se prepararon microorganismos haciéndolos crecer en presencia o ausencia de prebióticos y luego inmovilizándolos en alginato. En este último caso, el prebiótico es adicionado al alginato después de la inmovilización.

En este caso los prebióticos escogidos también son inulina, celulosa, almidón resistente o xilano de avena espelta. Se forman las perlas y se almacenan como se indica en la Tabla 5 más abajo. Después del almacenamiento durante 1 mes las perlas son añadidas en medio MRS y se determina el recuento de células viables en una fase estacionaria tardía. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5 Resultados de almacenamiento durante un mes de LA- 107 con diversos prebióticos

6

La Tabla 5 muestra que después de un almacenamiento de un mes bajo todas las condiciones no se recuperaron recuentos viables a partir de la formulación que consistió de alginato y probióticos únicamente.

En el caso de almidón resistente y xilano de avena espelta los recuentos son recuperados incluso cuando las formulaciones se almacenan a temperatura ambiente. Aunque no se recuperaron recuentos a partir de formulaciones que contenían inulina después del almacenamiento a temperatura ambiente, los recuentos se recuperan a partir de formulaciones almacenadas durante un mes bien a 4ºC y a -20ºC. En el caso de formulaciones que contenían celulosa surgió un patrón similar aunque en este caso y dependiendo de cómo el microorganismo fue preparado, encontramos que los recuentos podrían ser recuperados a partir de formulaciones almacenadas a temperatura ambiente. Estos resultados demuestran que la adición de prebióticos a las formulaciones inmovilizadas proporciona ventajas en términos de almacenamiento. Cuando el prebiótico se suministra también a un animal (por ejemplo, como un suplemento en el pienso), esto puede servir para mejorar la estabilidad del microorganismo en los intestinos del animal.

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Ejemplo 9 La inmovilización de microorganismos incrementa la capacidad de adhesión

Está bien documentado que los microorganismos probióticos se adhieren al recubrimiento del tracto digestivo. Además, se ha sugerido que esta propiedad es importante para mediar en los efectos beneficiosos de estos probióticos (Tuomola et al., 2001, Am, J. Clin. Nutr. 73. 393S-3985; Kankaanpaa et al., 2001. FEMS Microbiol. Lett, 194, 149-153). En algunos casos se ha sugerido que esta propiedad es funcional en la retención del microorganismo del tracto digestivo a la vez que ejerce sus efectos benéficos. En otros casos se ha sugerido que otras cepas probióticas compiten con los microorganismos enterotoxigénicos por los sitios de adhesión, compitiendo por la tanto con los últimos (Jin et al. 2000. Appl. Environ. Microbio., 66, 4200-4204).

Puesto que este fenómeno parece tener influencia sobre la efectividad de cualquier probiótico, y, en particular, se refiere al grado en el cual el tracto digestivo de un receptor podría ser colonizado por el probiótico, quisimos determinar si las formulaciones aquí descritas podrían tener cualquier efecto benéfico en términos de características de adhesión potenciadas.

Recolectamos preparaciones del microorganismo libre, así como de microorganismos derivados de una formulación probiótica inmovilizada recién preparada (ejemplo 1 más arriba), microorganismos derivados de una formulación probiótica inmovilizada que había sido secada por congelación (ejemplo 5 más arriba) y microorganismos derivados de una columna según se describe en el ejemplo 10 más abajo. Estas preparaciones de microorganismos son colocadas entonces en contacto con células de mamífero objetivo y se determina el grado en el cual ellas se adhieren a las
células.

Esencialmente el método involucra el uso de células HeLa en un ensayo de adhesión. La línea celular (ECACC No. 93021013) se obtiene a partir de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales. Las células se cultivan en un mínimo de medio esencial Eagle's (MEM) (Life Technologies, Paisley, Scotland), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Life Technologies) y aminoácidos no esenciales al 1% (Life Technologies). Las células se cultivan en una atmósfera humidificada de CO_{2} al 5% a 37ºC. Se utiliza una placa de cámaras de cuatro pozos (Life Technologies) en cada ensayo de adhesión. Las células son preparadas en monocapas en la placa de cámaras a una concentración de 1x10^{5} células por pozo (1.7 cm^{2} de área de cultivo por pozo) durante 24 horas antes de llevar a cabo la prueba de adhesión. Antes de la prueba de adhesión, el cultivo bacteriano de LA 107 se recolecta por centrifugación a 3.000 g durante 20 minutos. La pella bacteriana es suspendida en MEM sin FBS ni aminoácidos esenciales. Se determina la formación de unidades de colonia por ml (CFU/ml) colocando en placa diluciones seriadas a 10 veces de suspensiones de bacterias sobre agar RMS antes de la prueba de adhesión. La suspensión bacteriana de LA 107 en MEM es diluida serialmente 10 veces en MEM hasta una concentración de 10^{-3}. La prueba de adhesión se lleva a cabo retirando primero el medio de las células HeLa y enjuagando una vez con MEM. Se añaden alícuotas de 1 ml de suspensión bacteriana en MEM a una concentración 10-3 a cada uno de los 3 pozos. El cuarto pozo se utiliza como control e involucra la adición de medios solamente. La placa de cámaras se incuba entonces a 37ºC durante un máximo de 2 horas. Las monocapas son lavadas entonces 2 veces con PBS estéril, se fijan y se someten a tinción utilizando el Diff-Quik Stain Set (Gamidor Limited, Oxfordshire, Inglaterra) y luego se examinan microscópicamente. Un método de recuento visual se utiliza para determinar el número de células bacterianas adheridas a 100 células HeLa objetivo a través de un análisis aleatorio de 100 células por cámara. Se establece un promedio de tres líneas de cámara y el experimento se lleva a cabo en duplicado. Se determina un valor promedio y se multiplica por el factor de dilución de las células bacterianas utilizadas. En todas las condiciones de almacenamiento probadas de LA 107, se encontró que un factor de dilución 10^{-3} es la cantidad más alta posible para contar manualmente con precisión las bacterias. En todos los casos se toman recuentos viables después de la prueba de adhesión y se comparan contra los resultados de adhesión.

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Ejemplo 9 Resultados

Los resultados se muestran en la Tabla 6 a continuación.

TABLA 6 Propiedades de adhesión de diversas preparaciones

7

En todos los casos los números de células adheridas son representativos de las que se unen a las células objetivo por cada 10^{6} células probióticas microbianas añadidas a la prueba. Estos resultados demuestran que todas las preparaciones inmovilizadas de microorganismos probióticos exhibieron un grado más alto de adhesión que los exhibidos por los probióticos libres. De los microorganismos derivados a partir de las formulaciones inmovilizadas, los probióticos derivados a partir de la columna exhibieron el grado más alto de adhesión. Este resultado sugiere que las formulaciones probióticas inmovilizadas proporcionan ventajas en términos de producir probióticos con características de adhesión superiores.

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Ejemplo 10 Un sistema reactor de flujo continuo como fuente de microorganismos probióticos

Un uso ventajoso de las formulaciones probióticas inmovilizadas descritas en este documento es facilitar la aplicación continua de microorganismos probióticos viables a un sistema de agua para beber. Por lo tanto decidimos colocar la formulación en un sistema de reactor de flujo continuo y determinar si el sistema era capaz o no de servir como una fuente continúa de probióticos viables.

Con este fin se decidió inmovilizar el microorganismo probiótico LA 107 como microorganismo candidato según se describe en el ejemplo 1 anterior y empacar las perlas en una columna de vidrio recubierta con una camisa de agua (volumen interno = 3 cm x 30 cm y el volumen del lecho de perlas era aproximadamente 106 cm^{3}). Las perlas empacadas en la columna son retenidas utilizando una valla de alambre en la parte superior con el fin de asegurar que el sistema se opera bajo condiciones de lecho empacado. La columna se mantiene a 37ºC utilizando la camisa de agua y se le suministra medio MRS a través de la parte inferior de la columna. El medio utilizado que contiene microorganismos es retirado de la parte superior de la columna y se recolecta diversas veces con el fin de determinar el conteo de células viables. Además, la columna es provista con una ventilación de gas filtrada con el fin de asegurar una presión igualada. El flujo de medio se mantiene aproximadamente a 150 ml/hr utilizando bombas peristálticas.

En una configuración alternativa, se conecta una bomba circulante a un circuito de circulación cerrado sobre la columna de tal manera que la columna se opera en un modo de lecho fludizado. Aquí, las perlas son libres de moverse. De nuevo, esta columna es operada a una rata de flujo de 150 ml/hr.

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Ejemplo 10 Resultados

Los resultados obtenidos a partir de estos experimentos se muestran en las Figuras 7A y 7B. Los resultados mostrados en la Figura 7A representan los obtenidos a partir de la corrida de la columna en un modo de operación de lecho empacado.

Cuando se determinan los recuentos de células viables durante la operación de la columna durante un período prolongado de tiempo (hasta 30 días), se encuentra que la producción desde la columna es un poco errática. También notamos que cuando la matriz de la columna (perlas) se examina en la columna, los microorganismos se ven acumulados a tal grado que eran visualmente obvios como una formación dentro de la columna. Los puntos altos mostrados en la Figura 7A resultan de partes de esta construcción que se separa periódicamente de las perlas y que es enjuagada hacia afuera de la columna.

Aunque la producción de la columna es errática estos experimentos demuestran que la columna que contiene el probiótico inmovilizado sirve como una fuente continua de probiótico. Además, demostramos que el sistema puede ser operado durante periodos prolongados de tiempo. Así, este sistema es capaz de servir como una fuente de probióticos para inoculación en un sistema de agua para beber y/o inoculación de probióticos sobre o dentro de preparaciones de pienso sólidas.

Con el fin de determinar si la producción errática de los microorganismos probióticos del sistema puede ser ajustada o no con el fin de facilitar una producción más predecible, decidimos hacer una corrida de la columna bajo condiciones de lecho fluidizado. Esto fue facilitado conectando a un sistema de circulación de circuito cerrado a la configuración de columna existente, de tal manera que el lecho de perlas se hizo fluidizado. Cuando se examinó la producción probiótica de este sistema encontramos que se facilitaba una producción pareja (Figura 7B). Esto demuestra que cualquier combinación de configuraciones puede ser empleada para facilitar cualquier producción deseada desde la columna y de nuevo demuestra que el sistema puede servir como una fuente continua de probióticos para inoculación en agua para beber y/o preparaciones alimenticias.

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Ejemplo 11 Una configuración de agua para beber con base en el uso de formulaciones de probióticos microbianos inmovilizados

Los microorganismos que son inmovilizados pueden ser suministrados a la corriente de pienso, por ejemplo, utilizando un aparato como se describe más abajo con referencia a la Figura 8.

El aparato consiste de una línea de alimentación de agua principal (4) que sale de una fuente de agua primaria (bien sea una línea principal o un tanque de almacenamiento, 1). La línea de alimentación de agua principal termina en salidas para beber (5) de las cuales los animales reciben el agua. El agua en este sistema puede ser mantenida a la temperatura ambiente del habitáculo en las instalaciones de alojamiento de los animales. Se conecta a un cartucho que contiene la formulación inmovilizada (3) a la línea de alimentación principal (4) entre la fuente de agua y las salidas para beber (5). El suministro de probiótico microbiano a partir de este sistema puede ser mediado por la gravedad y/o mediante bombas (6). La construcción del cartucho incluye un sistema de malla de tal manera que el probiótico microbiano inmovilizado es mantenido dentro del sistema pero el probiótico microbiano libre podrá salir del sistema hacia la línea de alimentación de agua para beber. El cartucho también incorpora alguna forma de instalación para control de temperatura.

Puede ser necesaria una bomba (6) donde la inoculación semicontinua de probióticos microbianos en el sistema de agua para beber es requerida, y es ventajoso cuando se necesita un control más preciso de la cantidad de probiótico microbiano en el agua para beber. Sin embargo, como se mencionó más arriba, el probiótico microbiano libre puede ser alimentado en la línea de alimentación principal mediante flujo por gravedad.

También puede proveerse un cartucho adicional de nutriente para realimentación (2) que contiene nutrientes requeridos para facilitar una viabilidad máxima dentro del cartucho de los probióticos (3). La configuración global se diseña para administrar la dosis de probióticos óptima al animal receptor.

En una realización alternativa, el cartucho puede estar "en línea" con el flujo de agua desde la fuente de agua principal hacia la salida para beber. Así, el cartucho puede tener una entrada que permite el flujo de agua desde la fuente de agua, y una salida que permite la salida de los microorganismos, portados por la corriente de agua. Esta alternativa se muestra como (4A) en la Figura 8. Puede utilizarse una fuente de agua separada en esta realización, como se describe más abajo. Será evidente que la fuente de agua principal o las fuentes de agua pueden contener componentes que puedan ser tóxicos para los microorganismos, o que inhiba su crecimiento (por ejemplo, agua clorada o fluorada). Por lo tanto, en una realización adicional, una fuente de agua separada (de agua purificada o agua que sea biológicamente más compatible con los microorganismos) pueda alimentar el cartucho probiótico (3) - bien sea en línea o no - para arrastrar los microorganismos.

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Ejemplo 12 Evaluación de un probiótico administrado a través del sistema para beber en pollos de engorde jóvenes

Este ejemplo describe un protocolo que cumple con el estándar GCP(V) para probar el efecto de un probiótico administrado a través del agua para beber en la microflora intestinal y en el rendimiento de las aves de pollos de engorde jóvenes en crecimiento. Este ejemplo particular se refiere a la prueba de la especie G, pero puede ser adaptado según sea necesario para cualquier microorganismo probiótico.

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Se usan dos tratamientos, el primero como un control con 0% de dosificación de probióticos, y el segundo con un suplemento de 2.5% de probióticos.

El probiótico inmovilizado es suministrado como perlas de aproximadamente 1-4 mm de tamaño. Antes de la adición al agua para beber, se incuba una perla durante la noche a 48 horas a 37ºC en alícuotas de 100 ml de caldo MRS. 25 ml de este se llevan a 1 litro con agua para beber.

Se utiliza solamente agua deionizada o agua filtrada. La sustancia de prueba es suministrada a los animales en agua para beber limpia en botellas de 1 litro de volumen, las cuales se cambian en intervalos de 24 horas.

Se registran los detalles de números, de lote, fechas de expiración y volumen/masa de las sustancias de prueba recibidas y usadas.

Se utilizan pollos hembra de engorde en crecimiento típicos del Reino Unido (n = 60) como animales de prueba, por ejemplo pollos de engorde Cobb 500 o Ross 308 dependiendo de la disponibilidad. La cepa usada y la fuente de los pollos son documentados en los datos básicos para el estudio, tales como los planes de vacunación de los pollos que se dan mientras están en el criadero.

La prueba se lleva a cabo en un estudio con dos tratamientos no ciego donde los pollos son almacenados en grupos de tres en jaulas desde 1 día de edad hasta 28 días de edad. Se utilizan diez jaulas como grupo de tratamiento, dando un total de 30 pollos por tratamiento y 60 pollos para la prueba en total. Este diseño experimental significa que cada jaula es el replicado para el propósito de análisis y tiene la ventaja sobre el alojamiento de un pollo individual de que si ocurre mortalidad en un replicado entonces el replicado total no se pierde. Así la prueba permanece balanceada y permite un análisis estadístico robusto de los datos.

Se utiliza un diseño de bloque aleatorio donde los pollos son asignados aleatoriamente a las jaulas, y las jaulas son asignadas aleatoriamente al grupo de tratamiento. Los datos, cuando es apropiado, se analizan utilizando análisis de varianza con transformaciones adecuadas cuando sea necesario (Minitab Release 7.2).

Administración/Ambiente

Los actuales Codes of Recommendations for the Welfare of Livestock-Turkeys/broilers/layers son respetados, para cubrir los aspectos del ambiente tales como niveles de dióxido de carbono y amoniaco, humedad, temperatura, etc. Estos códigos están disponibles en la Animal Welfare Division, The Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Government Buildings (Toby Jug Site), Hook Rise South, Tolworth, Surbiton, Surrey KT6 7NF. Se hace referencia en particular a las publicaciones PB0077, (1987,1993 reprint), PB0076 (1987), PB1315 (1994), PB1739 (1994), las cuales también están disponibles en

http://wwv.maff.gov.uk/animalh/welfare/publications/booklest/pb0076 fowlcode.htm

http://www.maff.gov.uk/animalh/welfare/publications/layhen-pub.htm

http://www.maff.gov.uk/animalh/welfare/publications/booklets/pb0077/turkcode.htm

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Colocación de las aves: los pollos tienen un día de edad al comienzo del estudio y son incubados en incubadoras de gas, siendo ajustadas las incubadoras para proveer una temperatura de 32ºC. Las temperaturas de las incubadoras se disminuyen en 0.5ºC hasta que se alcanza una temperatura de 21ºC a los 31 días de edad.

Espacio de alimentador: Cada jaula tiene un alimentador en el frente donde los pollos tienen acceso a su pienso.

Espacio para beber: una botella para beber individualmente marcada (volumen 1 L) se posiciona en el frente de cada jaula.

Iluminación: la iluminación desde 1 día de edad hasta 28 días de edad es de 23 horas de luz y una hora de oscuridad.

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Dieta y nutrición

Dieta: las aves son alimentadas con dietas normales de pienso para pollos en crecimiento, formuladas para que sean adecuadas con respecto a la energía y nutrientes para los pollos de engorde dependiendo del sexo, edad y raza utilizada en el estudio. Las aves son alimentadas libremente utilizando un programa de dieta de alimentación que sigue las recomendaciones de la compañía de crianza específica para la raza de pollo de crecimiento que se utiliza en la prueba. Esto comprende una ración que crece, en forma de masa, que se alimenta desde los 0 hasta los 28 días de edad. La composición estimada de los nutrientes de la dieta es registrada y se incluye como parte de los datos básicos del estudio.

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Las dietas comerciales típicas para los pollos de engorde incluyen un fármaco anticoccidiosis, un antibiótico profiláctico, y una enzima de alimentación que se incluye frecuentemente. Para los propósitos de este estudio, no se incluye el antibiótico, la enzima de alimentación ni el coccidiostático en la dieta.

Requerimientos de pienso: Cada pollo de engorde consume 2.29 kg por cada 28 días de edad. Se requieren entonces 140 kg de pienso para el estudio completo.

Muestreo del pienso: Se toman muestras de pienso de la dieta en triplicado y se retienen para un análisis subsecuente post hoc, si se requiere. Las muestras de alimentación se mantienen en un congelador (-18 \pm 2ºC) durante seis meses después de la aceptación del reporte final, punto en el cual son descartadas.

Mantenimiento de registros

Registro de datos: todos los datos son registrados en forma de captura de datos ASRC estándar.

Peso del cuerpo: Cada ave es pesada al inicio del experimento (día 0) y de nuevo a los 7, 14, 21 y 28 días de edad. Las aves son pesadas individualmente hasta el 1.0 g más próximo.

Alimentación: se registra la administración diaria de pienso y se pesa el peso restante de pienso a los 7, 14, 21 y 28 días de edad. La diferencia entre las administraciones de pienso diariamente acumulativas y los pesos restantes de pienso durante ese periodo, por ejemplo 0-7 días, se toman como consumo de alimento durante ese periodo.

Consumo de agua: se registra consumo diario de agua (por peso), y se suma para cada periodo semanal.

Temperatura y humedad relativa: Todos los termómetros de máxima/mínima son leídos y registrados diariamente. También se calcula y registra diariamente la humedad relativa.

Mortalidad; todas las muertes son registradas y cuando sea posible se asigna una causa con base en la inspección externa.

Solo se llevaran a cabo análisis post mortems en el evento de un escenario de muerte sospechosa si la causa es desconocida.

Muestras fecales: Se toman muestras fecales de cada jaula (reuniéndolas por lo tanto para todos los pollos dentro de una jaula) en una base semanal. Las muestras fecales son analizadas cuando están frescas en busca de Lactobacillus en un laboratorio de microbiología. Frotis de cloaca: Se toman frotis de cloaca de un ave de cada jaula cada semana. Se analizan cuando están frescas en busca de Lactobacillus en un laboratorio de microbiología.

Análisis microbiológico de muestras fecales y de cloaca: Todas las muestras fecales y de cloaca son analizadas en el sitio para un recuento total de Lactobacillus sobre medo RMS suplementado con los siguientes antibióticos selectivos: 5 \mug/ml de Kanamicina, 500 \mug/ml de ácido nalidíxico y 75 \mug/ml de laxicina.

Muestras de tejido: Al final de la prueba, todos los pollos son sacrificados de manera humanitaria mediante la administración de una sobredosis de anestésico y se recogen muestras de todo el tracto gastrointestinal y se almacenan congeladas para análisis.

Se llevan a cabo análisis posteriores mediante los siguientes protocolos.

Confirmación de LA 107 a partir de muestras de tracto gastrointestinal por fragmentos de ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD).

Los análisis RAPD utilizan un cebador individual décimo para obtener un perfil de huella digital reproducible y única para la cepa bacteriana. La amplificación por PCR se lleva a cabo utilizando el cebador individual de la secuencia de nucleótido arbitraria: 5'AGCAGCGT-GG 3', de acuerdo con un protocolo de Cocconcelli et al (1995) Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and enterococci. Letters Appl. Microbiol. 21. 376-379. Antes del análisis de las muestras del tracto gastrointestinal se genera un perfil RAPD del LA 107.

Identificación de Lactobacillus utilizando bandas API 50 CH y medio API 50 CHL.

Las bandas API 50 CH permiten el estudio del metabolismo de los carbohidratos por parte de los microorganismos. El medio API 50 CHL, que se usa para inocular las bandas está previsto para la identificación del género Lactobacillus y organismos relacionados. Este medio permite que se estudie la fermentación de 49 carbohidratos sobre la banda API 50 CH (bioMerieux, Lyon, Francia).

Llevando a cabo el estudio anterior, encontramos que los microorganismos que están suspendidos en las perlas son administrados de manera efectiva a los animales. También encontramos que los microorganismos administrados colonizan el intestino de los animales.

Cada una de las aplicaciones y patentes mencionadas anteriormente y cada documento citado o referenciado en cada una de las aplicaciones y patentes anteriores, incluyendo aquellas durante el trámite de cada una de las solicitudes y patentes anteriores ("documentos de solicitud citados") y cualquier instrucción de fabricante o catálogos para cualquier producto citado o mencionado en cada una de las solicitudes y patentes anteriores y en cualquiera de los documentos citados de solicitud, se incorporan aquí como referencia. Además, todos los documentos citados en este texto, y todos los documentos citados o referenciados en los documentos citados en este texto y cualquier instrucción o catalogo de fabricantes para cualquier producto citado o mencionado en este texto, se incorporan aquí como referencia.

Diversas modificaciones y variaciones de los métodos descritos y sistemas de la invención serán evidentes para los experimentados en la técnica sin apartarse del alcance de la invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con realizaciones específicas preferidas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debería ser limitada indebidamente a tales realizaciones específicas. En efecto, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para las personas experimentadas en biología molecular o en campos relacionados están previstas para ser incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Anexo 1

Lista de microorganismos (de la directiva del consejo 70/524/etc)

8

Claims (28)

1. Un método para administrar un microorganismo a una corriente de pienso para ingestión subsecuente por un animal, comprendiendo el método:

(a)

Proveer una formulación que comprende un microorganismo suspendido en o sobre una matriz;

(b)

Proporcionar una corriente de pienso al animal;

(c)

Proporcionar un flujo de agua u otro líquido para la formulación, donde la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido pueden estar en la misma corriente, o el flujo de agua u otro líquido pueden posicionarse a una distancia de la corriente de pienso;

(d)

Desprender los microorganismos de la matriz, y arrastrar los microorganismos desprendidos hacia el flujo de agua u otro líquido; y

(e)

Permitir que un animal ingiera la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido.

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2. Un aparato para administrar un microorganismo o una corriente de pienso para ingestión subsecuente para un animal, comprendiendo el aparato:

(a)

Una formulación que comprende un microorganismo suspendido en o sobre una matriz;

(b)

Medios para proveer una corriente de pienso al animal;

(c)

Medios para proveer un flujo de agua u otro líquido de la formulación, donde la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido pueden ser la misma corriente, o el flujo de agua u otro líquido pueden estar posicionados a una distancia de la corriente de pienso;

(d)

Medios para desprender microorganismos de la matriz; y medios para arrastrar los microorganismos desprendidos hacia el flujo de agua u otro líquido; y

(e)

Medios para permitir que un animal ingiera la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido.

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3. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el cual el flujo de agua u otro líquido está posicionado a una distancia de la corriente de pienso, y comprende adicionalmente medios de transporte para transportar los microorganismos desprendidos hacia la corriente de pienso.

4. Un aparato de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, que comprende además medios para ajustar el flujo de agua u otro líquido después de la formulación.

5. Un aparato de acuerdo con las reivindicaciones 2-4, donde el flujo de agua u otro líquido comprende un caldo nutritivo.

6. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones presentes, en el cual los microorganismos son desprendidos de la formulación mediante el flujo de agua u otro líquido después de la formulación.

7. Un método o aparato de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el cual los microorganismos son desprendidos poniendo en contacto la formulación con la corriente de pienso.

8. Un método o aparato de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2, o 7, en el cual la corriente de pienso es una corriente de pienso líquida.

9. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual los microorganismos son desprendidos de la matriz en una manera pulsada o sustancialmente continua.

10. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la corriente de pienso comprende agua para beber para el animal.

11. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la corriente de pienso y/o el flujo de agua u otro líquido es administrado de manera continua o semicontinua.

12. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el microorganismo es un organismo probiótico que incluye un microorganismo probiótico recombinante.

13. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la formulación comprende adicionalmente un prebiótico.

14. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 13 en el cual el prebiótico es seleccionado del grupo consistente de: oligosacáridos no digeribles, inulina, celulosa, almidón resistente y xilano de avena espelta.

15. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en el cual el prebiótico esta presente en una concentración de aproximadamente 2% (p/v).

16. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el microorganismo es un Lactobacillus o un Enterococcus.

17. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el microorganismo es seleccionado de L. acidophilus LA-107 (ATCC No. 53545), L. acidophilus LA-101 (ATCGNo. 4356), y E. faecium EF-101 (ATCC No. 19434).

18. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la formulación comprende más de una cepa o especie de microorganismo.

19. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz comprende un material poroso al agua.

20. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz comprende alginato, preferiblemente alginato de calcio o alginato de bario.

21. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la formulación es sustancialmente libre de agua.

22. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz ha sido sometida a un secado por congelación, secado por aspersión o liofilización.

23. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz comprende un preservativo o criopreservativo para mantener la viabilidad de los microorganismos.

24. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 23, en el cual el preservativo o el criopreservativo comprende trehalosa o lactosa, o una combinación de trehalosa y lactosa.

25. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 23 o 24, en el cual el preservativo o criopreservativo, comprende lactosa.

26. Un método o aparato de acuerdo con una reivindicación precedente, en el cual la formulación es provista en un dispositivo de administración.

27. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 26, en el cual el dispositivo de administración es un cartucho.

28. Un método o aparato de acuerdo con la reivindicación 27, en el cual el cartucho comprende una malla para retener la formulación en la forma de perlas dentro del cartucho, pero permitiendo sustancialmente que los microorganismos desprendidos sean transportados con la corriente de pienso.