ES2334974T3 - Almacenamiento y administracion de microorganismos. - Google Patents
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Abstract
Un método para administrar un microorganismo a una corriente de pienso para ingestión subsecuente por un animal, comprendiendo el método: (a) Proveer una formulación que comprende un microorganismo suspendido en o sobre una matriz; (b) Proporcionar una corriente de pienso al animal; (c) Proporcionar un flujo de agua u otro líquido para la formulación, donde la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido pueden estar en la misma corriente, o el flujo de agua u otro líquido pueden posicionarse a una distancia de la corriente de pienso; (d) Desprender los microorganismos de la matriz, y arrastrar los microorganismos desprendidos hacia el flujo de agua u otro líquido; y (e) Permitir que un animal ingiera la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido.
Description
Almacenamiento y administración de
microorganismos.
Esta invención se relaciona con un método y un
aparato para administrar microorganismos animales, particularmente
probióticos en alimentación animal y/o en un sistema de agua para
beber.
Ha sido conocido por muchos años que ciertas
cepas de microorganismos imparten efectos benéficos a través del
tracto digestivo tanto de animales como de humanos. Tales
microorganismos son conocidos como probióticos. Los beneficios del
empleo de los probióticos microbianos y las bases científicas de los
mismos han sido revisados por Ried (1999. Appl. Env. Microbiol 65,
3763-3766).
Mucha de la investigación hecha acerca del uso y
beneficio de los probióticos microbianos han sido llevada a cabo
con cepas de Lactobacillus. Los efectos benéficos surgen de
una concentración incrementada de las cepas de Lactobacillus
en el tracto digestivo. Los beneficios incluyen diarreas reducidas
en terneros (Chaves et al, 1999, Braz. J. Animal Sci.
28,1093-1101), colonización reducida por
Salmonella en pollos (Singh et al, 1999. Appl Env.
Microbiol 65, 4981-4986), mortalidad general
reducida en pollos (Singh et al, 1999. Ind. J. Animal Sci.,
69, 830-831) y asimilación reducida de colesterol en
piensos para gallos en dietas altas en colesterol (Endo et
al, 1999. Biosci. Biotech. Biochem. 63.
1569-1575). Parece que muchos de los efectos
benéficos observados con las cepas probióticas de
Lactobacillus resultan a partir de la colonización del tracto
digestivo por esas cepas, evitando por lo tanto la colonización por
otros microorganismos más nocivos. Se ha encontrado que, para que
estos efectos benéficos persistan, las cepas probióticas deben ser
suministradas al huésped en una base continua para asegurar una
persistencia en el tracto digestivo.
Además de las cepas de Lactobacillus,
otros microorganismos, más notablemente los que incluyen los
Enterococci, han mostrado exhibir una actividad probiótica.
En el caso de los Enterococci, los efectos benéficos parecen
estar ligados no solamente a la colonización preferencial sino
también a su capacidad, en ciertos casos, para producir
bacteriocinas. Se ha informado, por ejemplo, que algunas cepas
producen bacteriocinas que exhiben efectos antilisteria (Laukova
et al., 1998, Letts. Appl. Microbiol. 27,
178-182).
Los efectos benéficos de estos microorganismos
pueden ser controlados o potenciados incrementado su presencia o
concentración en el tracto digestivo (Reid, 1999, Appl. Env.
Microbiol. 65; 3763-3766). Esto puede ser logrado
modificando la preparación de la materia prima para pienso animal
con el fin de maximizar una concentración de microorganismos
benéficos endógenos, por ejemplo, por ensilación. En la ensilación,
las condiciones son manipuladas para asegurar un rápido descenso en
el pH, potenciando por lo tanto la persistencia de cepas bacterianas
de ácido láctico benéficas (LAB) y previniendo el crecimiento de
microorganismos anaerobios nocivos tales como Clostridia
(Lindgren et al., 1986; Swed. J. Agric. Res., 15:
9-18).
Alternativamente, los microorganismos
probióticos pueden ser administrados al animal añadiendo la cepa
microbiana relevante a la alimentación animal. Típicamente, el
microorganismo se añade en forma seca al pienso, y luego es
consumido junto con el alimento durante la alimentación.
Alternativamente, pueden añadirse microorganismos al agua de beber
para los animales. Una cantidad de los microorganismos probióticos,
que puede estar en la forma de una torta, es pesada y mezclada con
el pienso o el agua para beber. Sin embargo, es frecuentemente
difícil asegurar que se ha añadido la cantidad correcta de
probiótico cada vez que el probiótico no haya sido distribuido
exhaustivamente en el pienso o en el agua para beber y se presentan
problemas.
Hay por lo tanto una necesidad para un sistema
que administre microorganismos probióticos a los animales que
supere los problemas asociados con los métodos tradicionales.
Hemos encontrado ahora que es posible
inmovilizar los microorganismos en una matriz de manera que
permanezcan viables durante almacenamiento por períodos extendidos
de tiempo. Subsecuentemente, los microorganismos pueden ser
separados de la matriz y mezclados en una corriente de alimento para
el animal. Los microorganismos pueden entonces ser ingeridos por el
animal cuando éste se alimenta de la corriente de alimento. De
acuerdo con un primer aspecto de la invención, proporcionamos un
método para administrar microorganismo a un animal de acuerdo con
la reivindicación 1.
Preferiblemente los microorganismos son
separados y transportados a la corriente de pienso para ser
arrastrados con la misma. Alternativamente, los microorganismos
pueden ser separados y arrastrados por contacto de la formulación
con la corriente de pienso. De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, proveemos un aparato para administrar un microorganismo
a un animal de acuerdo con la reivindicación 2.
El aparato puede comprender adicionalmente
medios para transportar microorganismos separados a la corriente de
pienso. Alternativamente, el aparato puede permitir un contacto
directo entre la formulación y la corriente de pienso, de manera
que el movimiento relativo entre la corriente de pienso y la
formulación hacen que los microorganismos sean separados y
arrastrados en la corriente de pienso. El aparato puede comprender
adicionalmente medios para administrar los microorganismos a la
corriente de pienso en un lote, por pulsos o de manera de flujo
continuo, o en cualquier combinación de éstas. Preferiblemente, la
formulación es tal que los microorganismos son capaces de ser
separados de la formulación de una manera sustancialmente
continua.
La formulación comprende una fuente de
microorganismos probióticos suspendidos en una matriz, siendo capaz
la formulación preferiblemente de permitir que los microorganismos
sean separados de la misma en una forma sustancialmente continua o
semicontinua.
Los microorganismos suspendidos actúan como una
fuente inoculadora del microorganismo para el pienso animal o el
agua para beber. Cuando se hace referencia a microorganismos que
están siendo desprendidos de la matriz, se entiende liberación,
separación o desprendimiento de los microorganismos de la matriz.
Los microorganismos separados pueden incluir descendientes de los
microorganismos originalmente suspendidos. Así, los microorganismos
suspendidos (y/o descendientes de los mismos) pueden ser liberados
físicamente de la matriz. Alternativamente, las células hijas de
microorganismos suspendidos originalmente son separadas de la
superficie de la matriz.
Los microorganismos pueden ser separados por
acción mecánica sobre la formulación, por ejemplo por
desprendimiento. Alternativamente o conjuntamente, los
microorganismos pueden ser separados disolviendo las moléculas que
forman la matriz en el ambiente. La formulación también puede ser
añadida directamente a la corriente de pienso y consumida por el
animal con el pienso o el agua.
Preferiblemente, el microorganismo es un
organismo probiótico. El término "probiótico" es conocido en la
técnica, y se refiere a un suplemento microbiano de alimentación
vivo que afecta beneficiosamente al animal o huésped mejorando su
balance microbiano intestinal. Ejemplos de microorganismos
probióticos son Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus
y Enterococcus.
Microorganismos probióticos preferidos son
Lactobacillus o Enterococcus spp. Más preferiblemente,
el microorganismo probiótico es seleccionado de Lactobacillus
acidophilus LA-107 (ATCC No. 53545),
Lactobacillus acidophilus LA-101 (ATCC No.
4356) y Enterococcus faecium
EF-101(ATCC No. 19434).
La formulación puede comprender microorganismos
todos los cuales comprenden la misma cepa o especie.
Alternativamente y preferiblemente, la formulación comprende
microorganismos de dos o más cepas o especies. Las formas
recombinantes de cualquiera de los microorganismos puede ser
utilizada, bien sea solos o en combinación con formas no
recombinantes o silvestres.
La formulación puede comprender perlas que
inmovilizan el microorganismo. La formulación puede comprender un
cartucho que contiene una pluralidad de perlas. Las perlas pueden
ser microperlas o microesferas. Preferiblemente, las perlas tienen
un diámetro entre aproximadamente 2 y 3 milímetros.
La matriz comprende preferiblemente un material
poroso al agua, preferiblemente un gel. Preferiblemente, los
microorganismos son inmovilizados en la matriz. La matriz puede
comprender agar, agarosa, almidón, carragenato, gomo de algarrobo,
geles o críogeles basados en poli (vinil) alcohol (Gough et
al. (1998) Bioprocess Eng. 19 87-90), alimentos
de fósiles silíceos (por ejemplo kieselguhr, tripolita y diatomita)
o cenizas volcánicas tales como kissiris (Love et al. (1998)
Bioprocess Eng. 18, 187-189). La matriz puede
comprender cualquier soporte adecuado, y puede estar hecha, por
ejemplo de, plásticos, incluyendo plásticos biodegradables.
La matriz puede comprender adicionalmente
poliláctidos (Huang et al., 1999, Int. J. Pharm., 182,
93-100), polímeros que comprenden subunidades de
ácido láctico, poliglicólidos,
poliláctido-poliglicólido, poli (D,L láctido co
glicólido) (Seifert et al., 1997, Biomaterials, 18,
1495-502), o copolimeros de bloque o copolimeros de
hidrogel por ejemplo que comprenden subunidades repetidas de
2-hidroxietilmetacrilato y etilendimetacrilato
(Wheeler et al., 1996, J. Long Term Eff Med Implants, 6,
207-217). En efecto cualquier material derivado de
un material vegetal o animal o artificial, materiales sintéticos
tales como plástico, papel etc. pueden ser usados.
Preferiblemente la matriz comprende un alginato.
El término "alginato" se refiere a un copolimero del ácido
beta-D-manurónico y ácido
alfa-L-gulurónico (GuIA), enlazados
entre sí por uniones 1-4. Los alginatos, junto con
sus ésteres y sales metálicas, comprenden el componente carbohidrato
principal de las algas marrón Ascophyllum, Laminaria y
Macrosystis. Preferiblemente, el alginato es un alginato de
un metal alcalinotérreo, y más preferiblemente el alginato es un
alginato de calcio o bario.
La formulación también puede comprender
nutrientes, aditivos o suplementos para ayudar al crecimiento de los
animales que están siendo alimentados, tales como potenciadores
naturales o sintéticos del crecimiento, hormonas de crecimiento,
productos recombinantes, vitaminas, micronutrientes, antibióticos,
etc. Otros ejemplos de tales nutrientes etc. son conocidos en la
técnica. La formulación puede, en vez de o además de los nutrientes,
aditivos o suplementos, incluir microorganismos capaces de producir
estos nutrientes etc.
Por "corriente de pienso", se entiende un
tren, línea o corriente continua de alimentación, materias primas
de alimentación, material de pienso, agua u otros nutrientes
sólidos, semisólidos o líquidos que se transportan desde una
fuente. La corriente de alimentación puede comprender cualquier
producto de origen vegetal o animal, sustancias orgánicas o
inorgánicas y puede estar en su estado natural, fresco o preservado,
procesado industrialmente, mezclas de estos etc. La corriente de
pienso se transporta preferiblemente a un punto de alimentación para
el animal. La corriente de pienso es preferiblemente una corriente
de pienso móvil, que puede ser administrada en forma continua o
semicontinua. La corriente de pienso puede ser provista sobre una
cinta o tubería de transporte, y esto es adecuado cuando los
alimentos o nutrientes están en forma sólida. Los alimentos u otros
nutrientes pueden ser transportados en contenedores, por ejemplo
cubos dispuestos sobre una cinta transportadora. Cuando la
corriente de pienso transporta agua, alimentos líquidos o alimentos
semilíquidos, la corriente de pienso es provista preferiblemente en
una tubería, canaleta u otro conducto. Preferiblemente, la corriente
de alimentación comprende agua para beber para el animal.
Preferiblemente, la formulación se provee en una
forma que es sustancialmente libre de agua. La formulación puede
ser secada por congelación, liofilizada o secada por aspersión, o
secada de alguna otra manera por métodos conocidos en la técnica.
De acuerdo con lo anterior, la formulación comprende preferiblemente
un preservativo capaz de mantener la viabilidad de los
microorganismos probióticos, de manera que una proporción sustancial
de los microorganismos este viva cuando la formulación es mantenida
durante periodos extendidos de tiempo. Preferiblemente, el
preservativo es un criopreservativo. Preferiblemente el preservativo
comprende trehalosa o lactosa.
Aunque se ha informado que la trehalosa es muy
eficiente para proteger el material biológico de la deshidratación,
hemos encontrado que la lactosa es tan eficiente como la trehalosa
en la preservación de los microorganismos. De acuerdo con lo
anterior, y lo más preferiblemente, el preservativo o
criopreservativo es la lactosa. El microorganismo puede ser
manipulado mediante ingeniería genética para expresar una enzima de
biosíntesis de la trehalosa o una enzima de biosíntesis de la
lactosa, por ejemplo mediante la introducción de genes otsA y otsB
de Escherichia coli. Así, la formulación puede ser mantenida
o almacenada durante períodos extendidos de tiempo en un estado
seco, semiseco o húmedo sin comprometer la viabilidad de los
microorganismos. Esto es ventajoso puesto que permite que la
formulación sea fácilmente almacenada.
La Figura 1A muestra los resultados de un
experimento para determinar la capacidad inoculadora de células
inmovilizadas de Lactobacillus acidophilus LA- 107que han
sido almacenadas a temperatura ambiente durante una semana. Se
toman muestras de caldo y se mide la absorbancia a 660 nm y se
representan en una gráfica contra el tiempo.
La Figura 1B muestra los resultados de un
experimento similar llevado a cabo con células inmovilizadas de
Enterococcus faecium EF-101. El ciclo 1
indica que la realimentación se lleva a cabo a las 7 horas, el ciclo
2 indica que la realimentación se lleva a cabo a las 19 horas, el
ciclo 3 indica que la realimentación se lleva a cabo a las 26
horas, mientras que el ciclo 4 indica que la realimentación se lleva
a cabo a las 32 horas.
La Figura 2 muestra la capacidad de inoculación
de formulaciónes inmovilizadas preparadas primero haciendo crecer
el microorganismo en un medio junto con alginato de sodio y la
adición subsecuente de una mezcla fermentada directamente al
cloruro de calcio. El medio fresco se añade a las perlas a T = 0. El
medio gastado es reemplazado con medio fresco a 37, 54 y 122 horas.
El eje x denota el tiempo medido en horas y el eje y denota la
densidad óptica (absorbancia) a 660 nm.
La Figura 3 muestra la producción continua de
probióticos a partir de un sistema de reactor de lecho fijo que
contiene kelp como medio de inmovilización. El eje x denota el
tiempo medido en horas y el eje y denota el conteo viable por
10^{6}/ml en efluentes del reactor.
La Figura 4 muestra los resultados de un
experimento para demostrar la capacidad inoculadora de células de
Lactobacillus acidophilus LA-107 que han sido
inmovilizadas en la presencia de diversos preservativos y/o
criopreservativos. La absorbancia a 660 nm es representada
gráficamente contra el tiempo. "FD" indica que las células han
sido secadas por congelación.
La Figura 5 muestra la capacidad de inoculación
de productos con coinmovilizados. La gráfica muestra los resultados
de experimentos en los cuales se inmovilizan dos cepas microbianas
diferentes en una matriz de algina. La gráfica representa la
densidad celular (medida por absorbancia del medio de cultivo)
contra el tiempo.
La Figura 6 muestra la capacidad de inoculación
de perlas en la cual la cepa probiótica del microorganismo
Lactobacillus acidophilus 107 es coinmovilizada junto con
inulina, celulosa, almidón resistente y xilano de avena espelta
(prebióticos). El control consiste de un microorganismo inmovilizado
sólo en alginato (círculos rellenos). Las perlas son alimentadas
con medio fresco en T = 0 y el medio ha sido retirado reemplazado
con medio fresco a 29, 57 y 121 horas. El eje x denota el tiempo
medido en horas y el eje y denota la densidad óptica (absorbancia)
a 660 nm.
La Figura 7A muestra la producción continua de
un microorganismo probiótico a partir de un reactor de lecho fijo.
Los recuentos por 10^{6} producidos por dos lecturas separadas
(triángulos rellenos y cuadrados rellenos) se determinan por conteo
directo. La Figura 7B muestra una comparación de microorganismos
viables a partir del reactor operado en un lecho fijo (triángulos
rellenos invertidos y cuadrados rellenos) y lecho fluidizado
(triángulos rellenos) como configuración. En ambos casos el eje x
denota el tiempo medido en días y el eje y denota los conteos por
10^{6}/ml viables en efluyentes del reactor relevante.
La Figura 8 es un diagrama esquemático de un
aparato para administrar un microorganismo probiótico a un
animal.
Nuestra invención permite que una fuente de
microorganismos probióticos sea administrada continuamente en la
cadena alimenticia de un animal. Los microorganismos probióticos son
provistos como una formulación que comprende células suspendidas o
inmovilizadas en una matriz.
El microorganismo probiótico puede comprender
cualquier especie o cepa que sea conocida por tener efectos
beneficiosos en el animal. El microorganismo probiótico puedes ser
un Enterococcus por ejemplo Enterococcus faecium, Enterococcus
faecium PR88, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus
faecalis, Enterococcus faecalis V24, Enterococcus avium
o Enterococcus durans. Los microorganismos prebióticos
también pueden ser un Lactobacillus por ejemplo,
Lactobacillus animalis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus
animalis subsp cellobiosus, Lactobacillus acidophilus cepas
LT516 (Chaves et al. 1999, Brazilian Journal of Animal
Science, 28, 1075-1085) y LT 158A (Chaves et
al. 1999, Brazilian Journal of Animal Science, 28,
1093-1101), Lactobacillus salivarius CTC2197
(Pascual et al, 1999, Applied and Environmental Microbiology,
65, 4981-4986), Lactobacillus sporogenes
(Singh et al, 1999, Indian Journal of Animal Sciences, 69,
830-831), Lactobacillus bifidus, Lactobacillus
leichmannii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,
Lactobacillus helveticus CNRZ-303,
Lactobacillus delbruckii subsp bulgaricus-12,
Lactobacillus helveticus INF-II,
Lactobacillus plantarum INF-9a,
Lactobacillus casei subes casei
INF-15d, Lactobacillus casei subsp
pseudocasei INF-13i, o Lactobacillus
fermentum. El microorganismo probiótico también puede ser un
Bífidobacterium, por ejemplo Bifidobacterium
bifidum.
Será evidente que las formas recombinantes de
cualquiera de los microorganismos anteriores pueden ser utilizadas.
En efecto, con referencia un "microorganismo" en este
documento, tal referencia debe entenderse como que abarca las
variantes recombinantes del microorganismo. Tales formas
recombinantes pueden comprender formas manipuladas por ingeniería
genética para obtener características alteradas, expresión de
productos útiles, mejor supervivencia, etc.
Los microorganismos probióticos preferidos son
aquellos que han sido aprobados por las autoridades reguladoras
correspondientes para su uso. Tales microorganismos incluyen los que
están anexo, por ejemplo, en la European Council Directive
70/524/EEC of 23 November 1970 que se refiere a los aditivos en las
materias primas alimenticias (Official Journal 270, 14/12/1970 p.
0001-0017), o como ha sido modificado por la
legislación subsecuente (véase
http://europa.eu.int/eurlex/en/lif/dat/1970/en
370L0524.html). En el anexo I de este documento se proporciona
una lista de tales microorganismos.
La matriz puede ser cualquier matriz capaz de
preservar la viabilidad sustancial de los microorganismos, de
manera que un número sustancial de microorganismos estén vivos
cuando la formulación se mantiene durante periodos extendidos de
tiempo. Preferiblemente, la matriz es escogida de manera que la
viabilidad de los microorganismos suspendidos es comparable a, o
mejor que, las células libres (en otras palabras, células que no han
sido inmovilizadas).
Se han divulgado un cierto número de matrices
capaces de preservar las células. Por ejemplo, se han suspendido
las células en agar, agarosa, o en una mezcla
agar-agarosa, fundiendo el agar o la agarosa o la
mezcla. Las células son adicionadas al líquido fundido y se mezclan
para formar una suspensión uniforme. El fundido de
agar/agarosa/mezcla es enfriado entonces por debajo del punto de
fusión relevante.
Alternativamente, como una realización
preferida, las células probióticas se hacen crecer en un medio de
cultivo apropiado tal como es conocido en la técnica. Las células
son recolectadas preferiblemente, por ejemplo, mediante
centrifugación y son lavadas. Las células son suspendidas entonces
en una solución de una sal de alginato soluble. Se sabe que los
alginatos de los metales alcalinos son solubles: las sales de
alginatos preferidas incluyen por lo tanto alginatos de metales
alcalinos tales colmo litio, sodio, potasio, rubidio etc. También
puede utilizarse alginato de amonio. Preferiblemente, se utiliza
alginato de sodio, en una concentración preferida de 4%
peso/volumen. La suspensión se añade entonces a una solución que
contiene iones calcio para producir la formación de un gel.
Alternativamente, las células pueden ser suspendidas en la solución
que contiene calcio y añadidas a una solución de alginato soluble.
El gel comprende alginato de calcio, y contiene células probióticas
inmovilizadas suspendidas en el alginato. Si la suspensión del
microorganismo se añade gota a gota, entonces el gel se forma como
perlas que pueden ser recogidas. El alginato gelificado puede si es
necesario ser moldeado en un bloque, o conformado en capas sobre un
soporte sólido.
Un método de inmovilización de células en
cápsulas de alginato de calcio se describe en la patente de los
Estado Unidos No. 5, 766, 907. Otros alginatos insolubles que pueden
ser utilizados para encapsular o inmovilizar las células
probióticas incluyen sales de alginato de metales alcalinotérreos,
tales como magnesio, calcio, estroncio, bario, etc, en forma de
sales de alginato. Los alginatos de otros cationes divalentes
también pueden ser empleados. Las matrices o geles que comprenden
tales alginatos pueden fabricarse por los métodos descritos
aquí.
La realización preferida descrita más arriba
emplea células recolectadas suspendidas en una solución de una sal
de alginato soluble. Esta etapa de separación, aunque preferida, no
es estrictamente necesaria. Hemos encontrado que es posible
complementar el medio de crecimiento con alginato soluble y que los
microorganismos permanecen capaces de crecer en el medio que
contiene alginato. Las perlas que comprenden microorganismos
inmovilizados o encapsulados pueden formarse añadiendo el medio (que
contiene células y alginatos) en una solución de calcio u otro como
se describió más arriba. Adicionalmente, los microorganismos pueden
hacerse crecer en un medio que comprende un agente gelificante
tales como iones de calcio (u otros iones metálicos alcalinotérreos
o divalentes, etc) y se añaden en una solución que contiene alginato
soluble para formar los geles o perlas que comprenden
microorganismos encapsulados.
Las células de los microorganismos probióticos
también pueden ser encapsuladas en microesferas o microcápsulas,
mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo como se
divulgan en la patente de los Estados unidos No. 4, 803,168. Las
microcápsulas que contienen los microorganismos también pueden ser
formadas por gelificación interna de una solución de alginato
emulsificada con un aceite, por ejemplo, como se describe en
Esquisabel et al. (1997), Journal of Microencapsulation, 14,
627-638. Alternativamente, pueden utilizarse geles
de carragenato-quitosan para inmovilizar los
microorganismos (Wang and Qian, 1999, Chemosphere 38,
3109-3117). También se han utilizado cápsulas
biocompatibles que consisten de un núcleo de almidón líquido con
membranas de alginato de calcio para encapsular bacterias del ácido
láctico (Jankowski et al, 1997. Biotechnology Techniques, 11,
31-34). Las cápsulas de alginato de bario también
pueden ser utilizadas en lugar de calcio (Yoo et al, 1996,
Enzyme and Microbial Technology, 19, 428-433).
También son posibles otras formas alternativas
de la matriz para encapsular microorganismos (además de las
perlas). Por ejemplo, pueden emplearse criogeles que comprenden poli
(vinil alcohol). Tales criogeles se hacen proveyendo una solución
de un alcohol polivinilico que contiene el microorganismo de
interés. La solución se añade entonces (por ejemplo, gota a gota) a
un solvente no miscible tal como hexano (o el hexano se añade a la
solución que contiene el microorganismo). Se forman perlas
congeladas y estas, cuando se descongelan muy lentamente (por
ejemplo, durante la noche en una nevera) forman perlas insolubles
con microorganismos viables. Tal método puede ser empleado con
cualquier polímero soluble, por ejemplo alginato soluble,
carboximetil celulosa, poliacrilamida, etc. Se hace referencia a
Gough et al, 1998, Bioprocess Eng., 87-90
También pueden utilizarse diversas formas de
matriz, permitiendo configuraciones alternativas de los reactores.
Así, además de perlas, la matriz puede tomar la forma de discos,
bloques, fibras o fibrilas extrudidas, tubos. Además, la matriz o
formulación puede ser recubierta sobre placas, recubrir mallas de
alambre, o en efecto recubrir cualquier otro soporte sólido.
Por ejemplo, la matriz puede formarse como
perlas u otras partículas conformadas, las cuales pueden ser
retenidas sobre un soporte. Un soporte preferido comprende una
malla o red, la cual puede ser hecha de metal, alambre u otro
material adecuado. Las perlas o partículas pueden conformarse por
cualquier medio adecuado, por ejemplo por aspersión o pulverización
desde una boquilla sobre la malla, de una manera análoga a la
liofilización. La matriz que comprende los microorganismos puede
ser aplicada al soporte por ejemplo sumergiendo el soporte (tal
como una malla de alambre) en CaCl_{2} (o soluciones que contengan
otros iones divalentes o alcalinotérreos como se describió en algún
lugar en este documento) y sumergiendo subsecuentemente la malla en
suspensiones probióticas que contienen alginato. Lo inverso también
es posible, cuando la malla es sumergida en la suspensión
probiótica y luego con solución de calcio etc. Medios alternativos
de recubrimiento son evidentes para una persona experimentada. Las
placas pueden ser entonces alineadas lado a lado en un recipiente de
soporte con el cual puede ser suministrado el medio. El efluente
del sistema contendría un depósito de probióticos. Además, la
matriz puede ser conformada como una superficie sustancialmente
extendida, tal como una superficie sustancialmente plana, y
soportada opcionalmente mediante un elemento de soporte. Así, la
matriz puede ser utilizada para recubrir en forma de una película
sobre una placa de material adecuado, por ejemplo, un material
inerte tal como metal o plástico. El soporte es preferiblemente
resiliente. El soporte puede comprender agar o agarosa, que
comprende preferiblemente un alto contenido adecuado de agente de
gelificación para resiliencia. Una concentración preferida es 1%,
2%, 3% o más de agarosa o de otro agente gelificante. Una ventaja de
tal configuración es la superficie incrementada disponible para que
se desprendan los microorganismos. Así, se entenderá que la
superficie puede comprender indentaciones, surcos, o tener una forma
curvada, sinusoidal u ondeada o cualquier otro perfil transversal
para incrementar el área superficial.
Alternativamente, los probióticos inmovilizados
podrían ser colocados en forma de placa sobre las paletas de un
dispositivo impulsor que puede ser rotado a través de un medio a una
velocidad particular (por ejemplo a una velocidad baja). Los
probióticos serian entonces depositados sobre el medio. Tales
paletas pueden comprender las configuraciones planas descritas más
arriba.
La ventaja de tales configuraciones es
especialmente evidente en configuraciones donde se usan placas
múltiples (preferiblemente dispuestas en forma sustancialmente
paralelas).
Mientras que se ha hecho referencia a la
inmovilización del microorganismo en una matriz, será evidente que
cualquier forma de inmovilización en conjunción con cualquier
material de soporte adecuado pueden ser utilizadas, en tanto los
microorganismos retengan una viabilidad sustancial y puedan ser
depositados desde el soporte o matriz. Así, cuando nos referimos a
inmovilización "dentro de" o "en" una matriz, debe tomarse
como referencia a cualquier tipo de inmovilización de
microorganismo soportados por una matriz. Se incluye la
inmovilización en, alrededor de, cerca de, dentro de, sobre la
superficie de, unido a, o de otra manera asociado con una
matriz.
Por ejemplo, la matriz puede comprender un
soporte sólido o semisólido, sobre el cual se soporta el
microorganismo. Tal soporte puede ser cualquier soporte,
preferiblemente un soporte inerte tal como es conocido en la
técnica. Por ejemplo, el soporte puede comprender una perla, sobre
la cual se une el microorganismo. Son posibles diferentes formas,
por ejemplo, elongada, tubular, esférica, cúbica, etc. El material
de soporte puede comprender agar, agarosa, carragenato, etc, tal
como se describió más arriba. Preferiblemente, sin embargo, el
microorganismo esta embebido con la matriz, tal como una porción
sustancial de matriz que rodea el microorganismo. Realizaciones en
las cuales la matriz actúa como un sustrato incluye las descritas en
el ejemplo 3, donde se utiliza como soporte el kelp.
La matriz que contiene los microorganismos puede
ser secada por congelación. Los métodos para secar por congelación
sustancias son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, la
matriz puede ser liofilizad mediante, por ejemplo, la exposición a
vacio, o secada por aspersión. En la técnica se conocen diversos
métodos de liofilización y secado por aspersión. La matriz que
contiene los microorganismos puede ser reconstituida añadiendo agua
o un medio (por ejemplo, caldo o nutrientes) a la matriz seca.
La matriz que contiene los microorganismos
también puede contener un preservativo que mejora la viabilidad de
los microorganismos. Cuando los microorganismos son secados por
congelación su reconstitución por adición de medio o agua es
potenciada mediante la adición de criopreservativos
(crioprotectores) antes de la congelación. Preferiblemente, el
preservativo es alguno que proteja los microorganismos de la
deshidratación o del frío o de ambos. Los anteriores incluyen
agentes que permiten una supervivencia o viabilidad sustancial de
los microorganismos, de los cuales se ha retirado el agua de su
ambiente natural, protegiéndolos preferiblemente contra la
deshidratación completa.
Tales preservativos y/o criopreservativos son
caracterizados normalmente por la presencia de numerosos grupos
hidroxilo en su estructura y se cree que estos grupos estabilizan la
microestructura a un nivel molecular en los sistemas biológicos
secados por congelación reemplazando los grupos hidroxilo del agua
retirados durante el procedimiento de congelación. Los agentes
tales como glicerol, sacarosa, glucosas y más recientemente,
trehalosa han mostrado potencial para la rehidratación de los
productos biológicos. La trehalosa es muy eficiente en este aspecto
y ha sido explotada en las preparaciones secadas por congelación de
productos biológicos (Sánchez et al, 1999, Intl. J. Pharm.
185, 255-266; Esquisabel et al., 1997, J.
Microencapsulation, 14, 627-638). En algunos casos
las preparaciones crudas de preservativos se han empleado para
estabilizar preparaciones secadas por congelación de
microorganismos y se ha encontrado que los sólidos de la leche
desengrasada estabiliza las preparaciones inmovilizadas en alginato
de cepas de Lactobacillus (excluyendo al Lactobacillus
acidophilus) (Selmer-Olsen et al. 1999,
J. Appl. Microbiol. 87, 427-439). Así, por ejemplo,
el preservativo puede comprender suero o permeado de suero, o
combinaciones de estos. Es bien conocido que la leche puede ser
separada en suero y cuajada; las proteínas tales como la caseína
residual son retiradas del suero para producir permeado de suero.
Además, puede utilizarse cualquier sacárido o polialcohol como
preservante potencial.
El preservativo o criopreservativo puede ser
glicerol, sacarosa, glucosa, manitol, sorbitol, adonitol, betaina
(N,N,N-trimetilglicina), lactosa o trehalosa. Con el
fin de incorporar el criopreservativo en la matriz, el preservativo
o criopreservativo apropiado (por ejemplo, trehalosa o lactosa) se
disuelve en el medio apropiado, preferiblemente como lactosa al 2%
p/v hasta 10% p/v más preferiblemente 2%, 3%, 4% o 5%. El alginato
gelificado se expone entonces a la solución de preservativo o
criopreservativo durante una cantidad adecuada de tiempo para
permitir que el preservativo o el criopreservativo entren en la
matriz. Alternativamente, las perlas se forman comprendiendo ya el
preservativo o criopreservativo. Así, el preservativo o
criopreservativo pueden ser añadidos al medio de crecimiento que
contiene el microorganismo y el alginato, antes de ser gelificado
por exposición a calcio, etc. Son posibles otras combinaciones, y
serán evidentes para el lector.
Se apreciará que pueden utilizarse combinaciones
de preservativos. Así, la matriz puede comprender lactosa y
trehalosa, o puede comprender suero o permeado de suero, junto con
lactosa y/o trehalosa, etc.
Los microorganismos que son suspendidos en la
matriz pueden comprender una cepa o especie individual. Alternativa
y preferiblemente, la matriz comprende más de una cepa o especie.
Por ejemplo, la matriz puede comprender Lactobacillus
acidophilus LA-107 y Enterococcus faecium
EF-101.
La formulación sirve como una fuente inoculadora
del probiótico. Los microorganismos pueden ser desprendidos de la
formulación por acción mecánica, por ejemplo, poniendo en contacto
directamente la formulación con la corriente de pienso. Las células
pueden ser desprendidas por raspado, y son transportadas por la
corriente de pienso al punto de alimentación del animal. Los
microorganismos desprendidos son adecuadamente células hijas que
surgen de la división celular de los microorganismos suspendidos. El
paso de las partículas de alimento en la corriente de alimentación
también pueden desgastar el alginato y liberar los microorganismos
atrapados. Por ejemplo, las partículas de la matriz pueden ser
disueltas en la corriente de pienso cuando la corriente de pienso
es una corriente de pienso líquida.
La formulación puede ser colocada dentro de un
dispositivo de administración tal como un cartucho. Encerrar la
formulación en un cartucho es ventajoso cuando la formulación está
en la forma de perlas de alginato. Así, el alginato sirve como una
columna para mantener las perlas. Las perlas pueden ser empacadas en
un cartucho para almacenamiento, y el cartucho puede ser retirado
para su uso. El cartucho tiene aberturas para permitir el paso de
agua a través de las perlas. Preferiblemente, las aberturas son
formadas como una malla que tiene un tamaño de malla que es lo
suficientemente pequeño para retener las perlas en el cartucho, pero
lo suficientemente grande para permitir que las células
desprendidas sean transportadas.
La formulación probiótica inmovilizada puede ser
encerrada en una columna como se describió más arriba. Esto es
ventajoso y permite un sistema de flujo continuo o semicontinuo
establecido, donde la corriente de pienso pasa a través de la
columna en una forma continua o semicontinua para permitir una
descarga regular de los microorganismos. Tal sistema de flujo
continuo se describe en detalle en el ejemplo 10. Sin embargo, será
evidente que un sistema de flujo por lotes o pulsos puede ser usado
también.
Las configuraciones alternativas también son
compatibles con la operación en flujo continuo o semicontinuo. Esto
se incluye en el uso de tecnología de elevación por aire, en la cual
la preparación probiótica inmovilizada es encerrada dentro de un
recipiente, y se bombea aire (u otro gas, preferiblemente un gas
inerte) a través de la base del sistema con el fin de facilitar la
agitación. Puede introducirse un medio a través del fondo del
sistema y el medio utilizado que contiene los probióticos retirados
de la parte superior del sistema. El recipiente también puede ser
equipado ventajosamente con una ventilación de gas, por ejemplo en
la parte superior en cualquier otra localización adecuada.
Alternativamente, puede emplearse un sistema de
tanque agitado, en el cual el sistema inmovilizado es encerrado en
un recipiente y se obtiene agitación utilizando un impulsor. De
nuevo puede introducirse en medio fresco al sistema y el medio
utilizado que contiene los probióticos puede ser recolectado desde
el sistema.
Además, las células inmovilizadas pueden ser
colocadas en un reactor de fibra hueca y barra o en el espacio
excluido de la fibra. El espacio interno de las fibras puede ser
empleado para suministrar al sistema nutrientes y para eliminar
productos residuales y el espacio excluido puede contener las
células inmovilizadas. Las células pueden entonces ser enjuagadas
con un medio sobre una base continua para recolectar las células
depositadas desde el sistema inmovilizado.
También son posibles configuraciones en estado
semisólido de flujo continuo. Así, las perlas, la matriz u otra
formulación que comprenda los probióticos pueden ser colocadas en
una plataforma hecha de cualquier material adecuado (por ejemplo,
una rejilla metálica o plástica), sobre la cual se suministran
humedad y nutrientes en forma de aspersión.
Los microbios depositados desde la matriz de
inmovilización pueden entonces ser recolectados como gotas de
humedad desde la rejilla y recolectados en un recipiente colocado
por debajo de la rejilla. Este sistema tiene la ventaja de
minimizar la cantidad de agua líquida en el sistema y proporcionar
una concentración extremadamente alta de los microorganismos
probióticos.
Como puede verse a partir de lo anterior donde
las perlas, etc., que comprenden los microorganismos que están
empacados, en la forma de una columna, es ventajoso proveer alguna
forma de medios de agitación con el fin de promover la deposición
de los microorganismos desde la matriz. Cualquier forma de agitación
mecánica, electrónica, magnética o física puede ser utilizada aquí.
Tal agitación puede ser provista mediante el uso de un lecho
fluidizado, como se describe en el ejemplo 10 más abajo. Cualquier
fluido adecuado tal como aire, agua, medio, etc. puede ser bombeado
sobre las perlas empacadas, etc., que comprenden los
microorganismos. El fluido puede hacerse pasar a través de las
perlas, de manera continua, o preferiblemente continua. Esto permite
que la acción mecánica desprenda los microorganismos. La matriz
puede ser puesta en movimiento (por ejemplo agitadas) por medio del
fluido de agitación; alternativamente, la matriz puede ser
sustancialmente inmóvil, y el desprendimiento de los
microorganismos se puede efectuar mediante el paso del fluido de
agitación sobre la matriz fija.
La formulación puede ser colocada ventajosamente
de forma directa en una corriente de pienso líquido por ejemplo, un
suministro de agua para bebida para el animal. Alternativa y
preferiblemente, la formulación puede ser posicionada a una
distancia de la corriente de pienso. En este caso, las células son
desprendidas mediante un mecanismo separado o transportadas (por
ejemplo, mediante una tubería) a la corriente de pienso después de
ser desprendida. El mecanismo de desprendimiento puede comprender un
flujo de agua u otro líquido que pasa por la formulación, el cual
desprende los microorganismos de la matriz y los lleva hacia la
corriente de pienso. El flujo de líquido puede ser mediado por la
gravedad. Preferiblemente o además, el flujo puede ser mediado o
asistido mediante una bomba.
Preferible y ventajosamente, el agua o el
líquido que alimenta el dispositivo de administración comprende un
caldo o medio nutritivo apropiado para el microorganismo. El caldo o
medio nutritivo puede ser suministrado desde un depósito, y el
flujo de caldo o medio sobre las perlas puede ser regulado para
alcanzar una dosis apropiada de microorganismos en la corriente de
pienso. Así, cuando las perlas son bañadas en un flujo de caldo o
medio nutritivo, las células inmovilizadas son nutridas y sufren
crecimiento y división celular, proveyendo un suministro de células
desprendidas que puede ser transportado hacia la corriente de
pienso. En contraste, cuando el suministro de caldo de nutrientes
es cortado, el crecimiento de la población de microorganismos se
detiene.
La rata de desprendimiento del microorganismo
puede ser ajustada de manera que sea sustancialmente continua y
uniforme para superar los problemas de dosificación y mezclado
asociado con los métodos anteriores como se describieron más
arriba. Sin embargo, puede ser preferido en alguna circunstancias
tener un flujo pulsado, por lotes o semicontinuo, y el aparato se
adapta para suministrar tal flujo por métodos conocidos en la
técnica.
La invención se describe adicionalmente, para
propósitos de ilustración solamente, mediante los ejemplos
siguientes.
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El objetivo de este ejemplo es demostrar (1) que
las cepas probióticas microbianas escogidas pueden ser inmovilizadas
sin efectos nocivos a la viabilidad (2) que estas formulaciones
pueden ser utilizadas como una fuente continua de probiótico viable
como resultado de la deposición desde la matriz de
inmovilización.
Cultivos de 100 ml de Lactobacillus
acidophilus LA-107 (ATCC cepa No. 53545 y
Enterococcus faecium EF-101(ATCC cepa
No. 19434) se hacen crecer en fase estacionaria en caldo MRS (deMan,
Rogosa, Sharpe) y caldo nutritivo (Oxoid) respectivamente a 37ºC.
Se alcanza la fase estacionaria a las 8 horas utilizando
EF-101 mientras que la cepa de LA alcanza la fase
estacionaria a las 26 horas. Las células son lavadas en medio,
recuperadas por centrifugación y suspendidas en 4 ml
(LA-07) y 2 ml (EF-101) de alginato
de sodio al 4% (p/v). Estas suspensiones son añadidas gota a gota a
100 ml de CaCl_{2} 50 mM.
Las perlas resultantes de los cultivos
inmovilizados (diámetro aproximado = 2-3 mm) son
retenidas a 4ºC durante 1 hora en el CaCl_{2} y se almacenan bien
en caldo o simplemente como perlas humidificadas a temperatura
ambiente durante una semana. Con el fin de determinar si el
microorganismo en la matriz permanece o no viable y capaz de ser
desprendido desde la perla, una perla individual se coloca en 50 ml
del caldo relevante que contiene CaCl_{2} 50 milimolar, se incuba
a 37ºC y se toman muestras de caldo en los tiempos indicados en la
Figura 1A y Figura 1B. Si el microorganismo viable está presente,
entonces el desprendimiento desde la superficie de la perla
contribuirá a la turbidez en el medio circundante.
La turbidez de estas muestras se determina
midiendo la absorbancia a 660 nm utilizando un espectrofotómetro.
Los perfiles de crecimiento obtenidos para las perlas que contienen
LA-107 se muestran en la Figura 1A. El medio se
reemplaza a las 30 horas, 50 horas y 170 horas. La muestra de
control consiste de células libres que son realimentadas en los
tiempos indicados por la adición de caldo fresco. Los resultados
demuestran que las células en perlas almacenadas en el medio
durante una semana se recuperan alrededor de 10 horas después y el
perfil de crecimiento es similar al de la población de células de
control no inmovilizadas. Además, cuando se realimentan las perlas
a 30, 50 y 170 horas, el crecimiento se recupera de nuevo por
desprendimiento desde las perlas. Aunque las perlas almacenadas
durante una semana en la ausencia de medio fallan en recuperar el
primer ciclo hasta las 30 horas, la recuperación es evidente en
ciclos de realimentación subsecuentes.
Los perfiles de crecimiento obtenidos siguiendo
un estudio similar con la cepa EF-101 inmovilizadas
se muestran en la Figura 1B. La realimentación se lleva a cabo a
las 7, 19, 26 y 32 horas. Los resultados demuestran que la
recuperación de las perlas es similar a los perfiles de crecimiento
exhibidos usando las células libres. Además, se encuentra que
cuando la perla es realimentada a las 200 horas se obtiene un perfil
de recuperación similar.
Estos resultados demuestran que tanto los
microorganismos probióticos listados arriba pueden ser inmovilizados
en matrices de alginato como que los microorganismos retienen la
viabilidad. Además, las formulaciones probióticas retienen su
capacidad inoculadora durante un periodo considerable de tiempo y la
inoculación de las formulaciones exhibe perfiles de crecimiento
similares a los exhibidos por los microorganismos libres.
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Los ejemplos anteriores describen la
inmovilización de microorganismos probióticos en matrices, primero
recolectando el microorganismo probiótico después de un crecimiento
convencional sobre medios, suspensión en alginato, y adición gota a
gota a soluciones de CaCl_{2}.
Este ejemplo muestra que lo inverso también
puede ser utilizado para inmovilizar los microorganismos, esto es,
el crecimiento de los microorganismos en un medio que comprende
alginato soluble, y adición a soluciones que contienen calcio. Los
microorganismos (LA-107) se hacen crecer primero en
medio MRS que contiene alginato de sodio al 4%. Estas mezclas son
añadidas entonces gota a gota a CaCl_{2} 50 mM y las perlas que se
forman son examinadas en cuanto a su capacidad para depositar
microorganismos probióticos en el medio.
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Cuando las perlas son preparadas en la forma
alternativa anterior, se colocan en medio MRS fresco y la capacidad
de la perla para depositar microorganismos se determina midiendo la
absorbancia a 660 nm. Con el fin de demostrar adicionalmente que la
deposición de microorganismos puede ser llevada a cabo durante un
cierto número de ciclos, se añade medio fresco a 37, 54 y 122
horas. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2 y
demuestran que estas formulaciones, preparadas de la forma
alternativa descrita más arriba, pueden ser empleadas para producir
de manera continua microorganismos probióticos.
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Los ejemplos anteriores muestran la
inmovilización de microorganismos dentro de una matriz. Este ejemplo
demuestra que los microorganismos probióticos pueden ser
inmovilizados por unión a un material sólido o semisólido
(sustratos). Así, de la misma forma que la inmovilización dentro de
una matriz, el microorganismo puede ser inmovilizado sobre un
material, el cual puede ser por sí mismo una matriz.
El microorganismo se hace crecer sobre bloques
de kelp, el cual se obtiene fresco del litoral marítimo
(Dunseverick, Co, Antrim, Northern Ireland). La pulpa interna del
tallo es cortada en cubos que miden aproximadamente 125 mm^{3} y
se lavan exhaustivamente. Se añaden entonces a matraces que
contienen medio MRS, se someten a autoclave y después de la
inoculación con LA-107, los matraces son colocados
en una incubadora orbital a 37ºC.
Los cubos de kelp se encuentran recubiertos ya
de una capa de microorganismos, indicando que el microorganismo ha
sido inmovilizado sobre la matriz. El líquido es decantado y los
bloques de kelp junto con los microorganismos adheridos son
empacados en una columna. Una configuración similar como la descrita
en el ejemplo 10 (véase más abajo) fue empleada excepto que la rata
de flujo se determina a 85 ml/hr, se introduce medio en la parte
superior de la columna y el flujo es facilitado por gravedad. El
medio MRS es bombeado a través del lecho empacado de la columna y
los microorganismos viables son determinados por un conteo directo
sobre placas de agar (agar MRS).
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 3 y demuestran que la formulación, con base en la
inmovilización de microorganismos probióticos sobre una matriz
también es capaz de servir como fuente continua de probióticos.
Como en el caso con los resultados mostrados en la Figura 7A (véase
ejemplo 10 más abajo), la producción de microorganismos a partir de
la columna es errática y esto puede ser contrarrestado por agitación
del lecho como se describe para el ejemplo 10. No obstante estos
resultados demuestran que puede emplearse una matriz alternativa en
una configuración de columna para la inoculación continua bien en
agua para bebida o corrientes de piensos para los animales con el
fin de facilitar la inoculación del tracto digestivo de los animales
receptores.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar si la inmovilización
puede proveer o no ventajas con respecto al almacenamiento, se
escogió E. faecium (EF-101) como
microorganismo probiótico candidato y se inmovilizó como se describe
en el ejemplo 1. Las perlas y las células libres son almacenadas
entonces a 4ºC en un caldo nutritivo que contiene CaCl_{2} 5 mM
para los tiempos indicados en la tabla 1 y el medio es reemplazado
sobre una base semanal.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de determinar la viabilidad de los
microorganismos en la matriz de inmovilización, se toma una perla
individual en los tiempos indicados y se disuelven en 50 ml de caldo
nutritivo que contiene NaCl 50 mM y citrato de sodio 10 mM. Los
recuentos de células viables son determinadas después del
crecimiento durante la noche por inoculación sobre placas de agar
nutritivo. Los resultados en la Tabla 1 demuestran que los
microorganismos viables son retenidos en las perlas por periodos
hasta de 3 meses y los recuentos viables son más altos que los
retenidos en preparaciones de células libres.
Los resultados demuestran una estabilidad
incrementada en los microorganismos probióticos inmovilizados
durante periodos prolongados de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo determina si las cepas de
probiótico relevantes pueden ser inmovilizadas en alginato,
almacenadas como una preparación secada por congelación (para una
manipulación potenciada en estante/almacenamiento) y reconstituidas
para producir microorganismos viables. También queríamos determinar
si la adición de lactosa a las perlas antes de la reconstitución
potenciada por secado por congelación de la preparación inmovilizada
en términos de la capacidad de inoculación. En particular,
queríamos determinar si la lactosa es tan eficiente como la
trehalosa en la potenciación de tal reconstitución.
En estos estudios, se escogió
LA-107 como microorganismo probiótico representativo
y se inmovilizó como se describió en el ejemplo 1. Se suspende una
preparación de 50 perlas en 10 ml de lactosa al 2% (p/v) o trehalosa
al 2% (p/v) durante una hora a temperatura ambiente antes del
secado por congelación. Después del secado por congelación las
perlas son almacenadas a temperatura ambiente durante una semana.
Las muestras de control consisten de microorganismos secados por
congelación no inmovilizados que han sido almacenados en medio
durante una hora antes del secado por congelación. Después de una
semana a temperatura ambiente se rehidratan las perlas individuales
en 50 ml de medio de RMS que contiene CaCl_{2} 50 milimolar y la
capacidad de inoculación de estas preparaciones se examina como se
describió en el ejemplo 1.
Los resultados se muestran en la Figura 4. La
capacidad de inoculación de cada preparación inmovilizada se
compara con la capacidad de inoculación de células libres no secas.
La eficiencia relativa de la capacidad de inoculación se indica por
el tiempo tomado por el medio para alcanzar la absorbancia de 0,5 a
660 nm (A660) y es un reflejo de la cantidad de crecimiento
microbiano. Se encuentra que la inoculación por células libres
exhibe un perfil convencional y el A660 alcanza 0.5 al cabo de 16 h.
El perfil exhibido por las células libres secadas por congelación
muestra que un A660 de 0.5 se alcanza al cabo de 19 h. Las
preparaciones con lactosa y trehalosa estabilizadas e inmovilizadas
y secadas por congelación alcanzan un A660 de 0.5 dentro de 21 horas
y los perfiles exhibidos por ambas son muy similares. Los
probióticos inmovilizados no estabilizados secados por congelación
son más bajos, y alcanzan un A660 de 0.5 a las 34 horas.
Estos resultados muestran claramente la ventaja
de añadir lactosa o trehalosa a la formulación inmovilizada antes
del secado por congelación. Puesto que ambos perfiles de inoculación
son similares los resultados sugieren que la lactosa, más que la
trehalosa, es un aditivo preferido sobre la base del coste de la
formulación. Los resultados también demuestran claramente que la
formulación probiótica sugerida que incluye lactosa y/o trehalosa
puede ser almacenada como un producto seco durante periodos
prolongados de tiempo.
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El ejemplo anterior muestra que inmovilizar el
microorganismo probiotico en alginato junto con trehalosa o lactosa
proporciona un grado de protección cuando las preparaciones son
almacenadas durante una semana después del secado por congelación.
Con el fin de extender el estudio decidimos inmovilizar el mismo
microorganismo (LA-107) como se describió
anteriormente y continuar su estudio hasta el mes 6.
En este caso las preparaciones también consisten
de microorganismos almacenados sólo en alginato, alginato más 2% de
lactosa y alginato más 2% de trehalosa. Además también se almacenan
microorganismos inmovilizados en lactosa al 4%. Las muestras de
control consisten de microorganismos libres. Cada preparación es
almacenada hasta 6 meses y las muestras son reconstituidas
periódicamente. Las preparaciones de microorganismos reconstituidos
son examinadas en cuanto a su habilidad para depositar los
microorganismos probióticos en el medio circundante durante un
periodo de 48 horas, y se determina la absorbancia a 660 nm
utilizando un espectrofotómetro. Un incremento en la absorbancia es
indicativo del desprendimiento de probióticos desde la superficie de
la perla. Si no hay incremento en la absorbancia se indica una
viabilidad negativa.
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Los resultados obtenidos se muestran en las
Tablas 2A y 2B más abajo.
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Como puede verse a partir de las Tablas 2A y 2B,
en la ausencia de cualquier aditivo de azúcar, la viabilidad del
microorganismo probiótico en alginato no es preservada con un mes de
almacenamiento más. Cuando se emplea trehalosa como estabilizador
en las preparaciones inmovilizadas la viabilidad se preserva para un
almacenamiento de hasta 6 meses de preparaciones secadas por
congelación. Sin embargo, cuando se emplea lactosa como
estabilizador en una concentración de 2% (p/v) en las preparaciones
inmovilizadas, la viabilidad del probiótico se preserva hasta por
un mes. Sin embargo con tiempos de almacenamiento más largos, la
viabilidad del probiótico en estas soluciones que contienen lactosa
no podría ser recuperada (Tablas 2A y 2B).
Sin embargo hemos decidido determinar si
incrementado o no la concentración de la lactosa se puede asegurar
la supervivencia del probiótico en formulaciones inmovilizadas. Por
lo tanto se llevó a cabo un experimento similar en el cual la
viabilidad del probiótico se examina en formulaciones inmovilizadas
que contienen 4% (p/v) de lactosa y que se reconstituyen después
del almacenamiento durante 3 y 6 meses. Los resultados se muestran
en la Tabla 2B y demuestran que un 4% de lactosa preserva la
viabilidad de los probióticos en formulaciones inmovilizadas
secadas por congelación para periodos de hasta 6 meses.
La lactosa puede por lo tanto servir para
estabilizar los microorganismos como una alternativa a la
trehalosa.
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En los ejemplos anteriores empleamos cepas
microbianas tanto de Lactobacillus como de
Enterococcus probióticas inmovilizadas separadamente en
formulaciones de matriz de alginato. El objetivo de este estudio es
determinar si las cepas de Lactobacillus y
Enterococcus pueden ser coinmovilizadas en la misma matriz
produciendo una formulación sencilla con capacidad inoculadora para
ambos microorganismos probióticos.
En este estudio la LA101 y la LA107 son
coinmovilizadas juntas con EF-101 para producir dos
formulaciones separadas, a saber
LA-101/EF-101 y
LA-107/EF-101. La inmovilización se
llevó a cabo como se describió en el ejemplo 1, excepto que la
mezcla apropiada de microorganismo se emplea en vez de la cepa
individual. En la mezcla
LA-101/EF-101 la proporción es 1:1
con respecto al conteo celular. En caso de LA-107/EF
101 la proporción de mezcla es 1:10. Después de la inmovilización,
las formulaciones se almacenan por 4 días en un medio. Las
poblaciones de control consisten de mezclas apropiadas de los
microorganismos en proporciones similares. Después de 4 días de
almacenamiento se coloca una perla de cada mezcla en caldo MRS según
se describió para los ejemplos anteriores y se determinó la
capacidad de inoculación examinando el crecimiento de la deposición
de microorganismos en el medio.
Los resultados se muestran en la Figura 5 y
demuestran que los microorganismos son liberados de ambas
preparaciones coinmovilizadas. Aunque estos resultados demuestran
que las preparaciones coinmovilizadas son capaces de depositar
microorganismos en el medio circundante, es necesario examinar si
los microorganismos asociados están siendo liberados desde la
matriz. Para este propósito se recolectaron muestras de caldo de los
sistemas coinmovilizados y se inocularon sobre placas de agar MRS
(Oxoid) en una dilución de 1 en 10^{6}. Las colonias son
distinguidas sobre la base de la morfología de las colonias y la
proporción relativa de Lactobacillus y Enterococcus se
determina por conteo directo. Los resultados obtenidos se muestran
en la Tabla 3 abajo.
Además, cada sistema es realimentado a las 38
horas con medio fresco y se deja crecer durante otro ciclo hasta la
fase estacionaria. De nuevo, se analizan muestras de caldo como se
describió más arriba con el fin de determinar las proporciones
relativas de cada microorganismo asociado depositado desde la matriz
de inmovilización. Los resultados obtenidos se muestran también en
la Tabla 3 a continuación.
Los recuentos determinados inoculando 1 en
diluciones 10^{6} del cultivo sobre placas de agar MRS y colonias
distinguidas sobre la base de la morfología. * La ausencia de
colonias significa que en esta dilución no se pudo detectar EF lo
cual no necesariamente significa una ausencia de EF en el medio.
Los resultados demuestran que al final del
primer ciclo de crecimiento la cepa EF-101 es la
cepa predomínate liberada desde la matriz en el medio. Sin embargo,
los resultados también demuestran la presencia de
LA-101 y LA-107 liberados desde la
preparación inmovilizada relevante. Esto debe esperarse puesto que
el crecimiento de la cepa EF-101 es mucho más
rápido que el de las cepas LA, como se describió antes en el ejemplo
1. Había alguna preocupación en cuanto que la cepa EF podría
competir con las cepas LA en la preparación coinmovilizada,
resultando en una desaparición eventual de esta última en términos
de capacidad de inoculación. Sin embargo, cuando las formulaciones
mezcladas son realimentadas y analizadas de nuevo en cuanto a las
cantidades relevantes de EF y LA se encontró sorprendentemente que
esta última se convierte en el microorganismo predominante
depositado en el medio (véase Tabla 3).
Los resultados demuestran que ambas cepas
microbianas probióticas pueden ser coinmovilizadas en alginatos
para producir una formulación probiótica novedosa y que la
formulación puede ser empleada para facilitar la inoculación de
ambas cepas asociadas de los microorganismos en el medio relevante.
Además, los resultados demuestran que es posible alcanzar una
producción selectiva de las perlas manipulando las proporciones
relativas de cada asociado durante la formulación. Esto
proporcionaría ventajas en sistemas donde se desea suministrar
preferiblemente uno de una pareja de microorganismos a un huésped
antes de suministrar otro microorganismo de la pareja.
Los resultados demuestran que es posible obtener
cultivos mixtos de los probióticos a partir de las formulaciones
inmovilizadas cuando se coinmovilizan dos microorganismos
probióticos en una perla individual de la matriz. Una alternativa
para tal sistema involucra la mezcla de dos perlas separadas que
contienen cada microorganismo. Con este fin se preparan perlas que
contienen bien sea LA 107 o EF como se describió en el ejemplo 1 más
arriba. Las perlas son lavadas entonces y recolectadas y luego se
colocan dos perlas, una que contiene LA 107 y la otra que contiene
EF, en medio MRS. Los recuentos viables son determinados en la fase
de medio logaritmo y el medio se reemplaza subsecuentemente con
medio fresco de manera que se examinan 3 ciclos de deposición.
Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla
4.
Los resultados mostrados en la Tabla 4
demuestran que ambos microorganismos son depositados en el medio
(deposición 2). Los resultados también confirman los obtenidos con
ambos microorganismos en una perla individual (más arriba) cuando
la cepa de Lactobacillus se hace eventualmente predominante
en el medio en la tercera deposición. Estos resultados confirman
que más de un microorganismo probiótico puede ser empleado en
formulaciones y que estas pueden ser coinmovilizadas en la matriz
y/o inmovilizadas en perlas separadas.
Se ha mostrado en los ejemplos anteriores que
los microorganismos probióticos pueden ser incorporados en matrices
y que estas formulaciones producen microorganismos probióticos
viables que pueden ser administrados bien directamente al animal o
introducidos bien sea en el agua para beber o en corrientes de
pienso. Con el fin de ilustrar adicionalmente las ventajas
asociadas con estas formulaciones, determinamos si otros materiales
podrían ser coinmovilizados junto con los microorganismos
probióticos.
Se ha conocido durante algún tiempo que ciertos
oligosacáridos no digeribles pueden proporcionar ventajas para los
probióticos bien estimulando su crecimiento o la función de los
cultivos probióticos en el tracto digestivo y estos oligosacáridos
son denominados comúnmente como prebióticos (Crittenden et
al., 2000, J. Appl. Microbiol., 90, 268-278).
Se pensó que si estos pudieran ser inmovilizados correctamente con
el probiótico en la matriz inmovilizante podrían ser
coadministrados al animal receptor proporcionando por lo tanto una
función prebiótica y probiótica en una dosis individual. Decidimos
por lo tanto escoger una serie de entidades de carbohidrato no
digerible y coinmovilizarlas junto con el microorganismo probiótico
LA 107.
Con este fin el microorganismo se hace crecer en
medio MRS y se recolecta. Luego se añade a alginato al 4% (p/v) que
contiene prebióticos al 2% (p/v) y los candidatos escogidos son
inulina, celulosa, almidón resistente y xilano de avena espelta.
Las perlas se forman como se describió en el ejemplo 1 uno más
arriba y se colocan en un medio. Se examina la capacidad del
microorganismo para depositarse en el medio circundante. El medio
es reemplazado a las 29, 50 y 121 horas con el fin de demostrara una
deposición prolongada.
Además, las preparaciones también son
almacenadas como preparaciones húmedas durante un periodo de 1 mes a
temperatura ambiente, 4ºC y a -20ºC, y se examina la capacidad de
recuperar el microorganismo viable después de colocarlo en un medio
al final de este periodo. En estos estudios particulares el
microorganismo se hace crecer en un prebiótico más medio y luego se
inmoviliza en alginato, o el microorganismo se hace crecer en un
medio y luego se inmoviliza en alginato que contiene la entidad
prebiótica. Las preparaciones de control usadas a través de los
estudios descritos en este ejemplo consisten de microorganismos
probióticos inmovilizados en alginato solamente.
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Con el fin de determinar si el microorganismo
probiótico puede depositarse desde las formulaciones que contienen
el prebiótico, se colocan las perlas en un medio y se determina la
absorbancia a 660 nm. Los ciclos de deposición son examinados
después de la transferencia de las perlas a un medio a las 0, 29, 50
y 121 horas. Los resultados se muestran en la Figura 6 y demuestran
que el microorganismo es depositado desde todas las formulaciones
examinadas. Estos resultados demostraron que aditivos tales como los
prebióticos que proporcionan beneficios pueden ser incorporados en
la matriz de inmovilización sin afectar adversamente la capacidad de
estas formulaciones para proveer microorganismos probióticos.
Además de los anteriores resultados, también
decidimos determinar si la incorporación del prebiótico en la
formulación proveería beneficios en términos de almacenamiento. Con
este fin se prepararon microorganismos haciéndolos crecer en
presencia o ausencia de prebióticos y luego inmovilizándolos en
alginato. En este último caso, el prebiótico es adicionado al
alginato después de la inmovilización.
En este caso los prebióticos escogidos también
son inulina, celulosa, almidón resistente o xilano de avena
espelta. Se forman las perlas y se almacenan como se indica en la
Tabla 5 más abajo. Después del almacenamiento durante 1 mes las
perlas son añadidas en medio MRS y se determina el recuento de
células viables en una fase estacionaria tardía. Los resultados se
muestran en la Tabla 5.
La Tabla 5 muestra que después de un
almacenamiento de un mes bajo todas las condiciones no se
recuperaron recuentos viables a partir de la formulación que
consistió de alginato y probióticos únicamente.
En el caso de almidón resistente y xilano de
avena espelta los recuentos son recuperados incluso cuando las
formulaciones se almacenan a temperatura ambiente. Aunque no se
recuperaron recuentos a partir de formulaciones que contenían
inulina después del almacenamiento a temperatura ambiente, los
recuentos se recuperan a partir de formulaciones almacenadas
durante un mes bien a 4ºC y a -20ºC. En el caso de formulaciones que
contenían celulosa surgió un patrón similar aunque en este caso y
dependiendo de cómo el microorganismo fue preparado, encontramos
que los recuentos podrían ser recuperados a partir de formulaciones
almacenadas a temperatura ambiente. Estos resultados demuestran que
la adición de prebióticos a las formulaciones inmovilizadas
proporciona ventajas en términos de almacenamiento. Cuando el
prebiótico se suministra también a un animal (por ejemplo, como un
suplemento en el pienso), esto puede servir para mejorar la
estabilidad del microorganismo en los intestinos del animal.
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Está bien documentado que los microorganismos
probióticos se adhieren al recubrimiento del tracto digestivo.
Además, se ha sugerido que esta propiedad es importante para mediar
en los efectos beneficiosos de estos probióticos (Tuomola et
al., 2001, Am, J. Clin. Nutr. 73. 393S-3985;
Kankaanpaa et al., 2001. FEMS Microbiol. Lett, 194,
149-153). En algunos casos se ha sugerido que esta
propiedad es funcional en la retención del microorganismo del
tracto digestivo a la vez que ejerce sus efectos benéficos. En otros
casos se ha sugerido que otras cepas probióticas compiten con los
microorganismos enterotoxigénicos por los sitios de adhesión,
compitiendo por la tanto con los últimos (Jin et al. 2000.
Appl. Environ. Microbio., 66, 4200-4204).
Puesto que este fenómeno parece tener influencia
sobre la efectividad de cualquier probiótico, y, en particular, se
refiere al grado en el cual el tracto digestivo de un receptor
podría ser colonizado por el probiótico, quisimos determinar si las
formulaciones aquí descritas podrían tener cualquier efecto benéfico
en términos de características de adhesión potenciadas.
Recolectamos preparaciones del microorganismo
libre, así como de microorganismos derivados de una formulación
probiótica inmovilizada recién preparada (ejemplo 1 más arriba),
microorganismos derivados de una formulación probiótica
inmovilizada que había sido secada por congelación (ejemplo 5 más
arriba) y microorganismos derivados de una columna según se
describe en el ejemplo 10 más abajo. Estas preparaciones de
microorganismos son colocadas entonces en contacto con células de
mamífero objetivo y se determina el grado en el cual ellas se
adhieren a las
células.
células.
Esencialmente el método involucra el uso de
células HeLa en un ensayo de adhesión. La línea celular (ECACC No.
93021013) se obtiene a partir de la Colección Europea de Cultivos de
Células Animales. Las células se cultivan en un mínimo de medio
esencial Eagle's (MEM) (Life Technologies, Paisley, Scotland),
complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Life
Technologies) y aminoácidos no esenciales al 1% (Life Technologies).
Las células se cultivan en una atmósfera humidificada de CO_{2}
al 5% a 37ºC. Se utiliza una placa de cámaras de cuatro pozos (Life
Technologies) en cada ensayo de adhesión. Las células son preparadas
en monocapas en la placa de cámaras a una concentración de
1x10^{5} células por pozo (1.7 cm^{2} de área de cultivo por
pozo) durante 24 horas antes de llevar a cabo la prueba de adhesión.
Antes de la prueba de adhesión, el cultivo bacteriano de LA 107 se
recolecta por centrifugación a 3.000 g durante 20 minutos. La pella
bacteriana es suspendida en MEM sin FBS ni aminoácidos esenciales.
Se determina la formación de unidades de colonia por ml (CFU/ml)
colocando en placa diluciones seriadas a 10 veces de suspensiones de
bacterias sobre agar RMS antes de la prueba de adhesión. La
suspensión bacteriana de LA 107 en MEM es diluida serialmente 10
veces en MEM hasta una concentración de 10^{-3}. La prueba de
adhesión se lleva a cabo retirando primero el medio de las células
HeLa y enjuagando una vez con MEM. Se añaden alícuotas de 1 ml de
suspensión bacteriana en MEM a una concentración
10-3 a cada uno de los 3 pozos. El cuarto pozo se
utiliza como control e involucra la adición de medios solamente. La
placa de cámaras se incuba entonces a 37ºC durante un máximo de 2
horas. Las monocapas son lavadas entonces 2 veces con PBS estéril,
se fijan y se someten a tinción utilizando el
Diff-Quik Stain Set (Gamidor Limited, Oxfordshire,
Inglaterra) y luego se examinan microscópicamente. Un método de
recuento visual se utiliza para determinar el número de células
bacterianas adheridas a 100 células HeLa objetivo a través de un
análisis aleatorio de 100 células por cámara. Se establece un
promedio de tres líneas de cámara y el experimento se lleva a cabo
en duplicado. Se determina un valor promedio y se multiplica por el
factor de dilución de las células bacterianas utilizadas. En todas
las condiciones de almacenamiento probadas de LA 107, se encontró
que un factor de dilución 10^{-3} es la cantidad más alta posible
para contar manualmente con precisión las bacterias. En todos los
casos se toman recuentos viables después de la prueba de adhesión y
se comparan contra los resultados de adhesión.
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Los resultados se muestran en la Tabla 6 a
continuación.
En todos los casos los números de células
adheridas son representativos de las que se unen a las células
objetivo por cada 10^{6} células probióticas microbianas añadidas
a la prueba. Estos resultados demuestran que todas las
preparaciones inmovilizadas de microorganismos probióticos
exhibieron un grado más alto de adhesión que los exhibidos por los
probióticos libres. De los microorganismos derivados a partir de las
formulaciones inmovilizadas, los probióticos derivados a partir de
la columna exhibieron el grado más alto de adhesión. Este resultado
sugiere que las formulaciones probióticas inmovilizadas proporcionan
ventajas en términos de producir probióticos con características de
adhesión superiores.
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Un uso ventajoso de las formulaciones
probióticas inmovilizadas descritas en este documento es facilitar
la aplicación continua de microorganismos probióticos viables a un
sistema de agua para beber. Por lo tanto decidimos colocar la
formulación en un sistema de reactor de flujo continuo y determinar
si el sistema era capaz o no de servir como una fuente continúa de
probióticos viables.
Con este fin se decidió inmovilizar el
microorganismo probiótico LA 107 como microorganismo candidato según
se describe en el ejemplo 1 anterior y empacar las perlas en una
columna de vidrio recubierta con una camisa de agua (volumen
interno = 3 cm x 30 cm y el volumen del lecho de perlas era
aproximadamente 106 cm^{3}). Las perlas empacadas en la columna
son retenidas utilizando una valla de alambre en la parte superior
con el fin de asegurar que el sistema se opera bajo condiciones de
lecho empacado. La columna se mantiene a 37ºC utilizando la camisa
de agua y se le suministra medio MRS a través de la parte inferior
de la columna. El medio utilizado que contiene microorganismos es
retirado de la parte superior de la columna y se recolecta diversas
veces con el fin de determinar el conteo de células viables.
Además, la columna es provista con una ventilación de gas filtrada
con el fin de asegurar una presión igualada. El flujo de medio se
mantiene aproximadamente a 150 ml/hr utilizando bombas
peristálticas.
En una configuración alternativa, se conecta una
bomba circulante a un circuito de circulación cerrado sobre la
columna de tal manera que la columna se opera en un modo de lecho
fludizado. Aquí, las perlas son libres de moverse. De nuevo, esta
columna es operada a una rata de flujo de 150 ml/hr.
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Los resultados obtenidos a partir de estos
experimentos se muestran en las Figuras 7A y 7B. Los resultados
mostrados en la Figura 7A representan los obtenidos a partir de la
corrida de la columna en un modo de operación de lecho
empacado.
Cuando se determinan los recuentos de células
viables durante la operación de la columna durante un período
prolongado de tiempo (hasta 30 días), se encuentra que la producción
desde la columna es un poco errática. También notamos que cuando la
matriz de la columna (perlas) se examina en la columna, los
microorganismos se ven acumulados a tal grado que eran visualmente
obvios como una formación dentro de la columna. Los puntos altos
mostrados en la Figura 7A resultan de partes de esta construcción
que se separa periódicamente de las perlas y que es enjuagada hacia
afuera de la columna.
Aunque la producción de la columna es errática
estos experimentos demuestran que la columna que contiene el
probiótico inmovilizado sirve como una fuente continua de
probiótico. Además, demostramos que el sistema puede ser operado
durante periodos prolongados de tiempo. Así, este sistema es capaz
de servir como una fuente de probióticos para inoculación en un
sistema de agua para beber y/o inoculación de probióticos sobre o
dentro de preparaciones de pienso sólidas.
Con el fin de determinar si la producción
errática de los microorganismos probióticos del sistema puede ser
ajustada o no con el fin de facilitar una producción más predecible,
decidimos hacer una corrida de la columna bajo condiciones de lecho
fluidizado. Esto fue facilitado conectando a un sistema de
circulación de circuito cerrado a la configuración de columna
existente, de tal manera que el lecho de perlas se hizo fluidizado.
Cuando se examinó la producción probiótica de este sistema
encontramos que se facilitaba una producción pareja (Figura 7B).
Esto demuestra que cualquier combinación de configuraciones puede
ser empleada para facilitar cualquier producción deseada desde la
columna y de nuevo demuestra que el sistema puede servir como una
fuente continua de probióticos para inoculación en agua para beber
y/o preparaciones alimenticias.
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Los microorganismos que son inmovilizados pueden
ser suministrados a la corriente de pienso, por ejemplo, utilizando
un aparato como se describe más abajo con referencia a la Figura
8.
El aparato consiste de una línea de alimentación
de agua principal (4) que sale de una fuente de agua primaria (bien
sea una línea principal o un tanque de almacenamiento, 1). La línea
de alimentación de agua principal termina en salidas para beber (5)
de las cuales los animales reciben el agua. El agua en este sistema
puede ser mantenida a la temperatura ambiente del habitáculo en las
instalaciones de alojamiento de los animales. Se conecta a un
cartucho que contiene la formulación inmovilizada (3) a la línea de
alimentación principal (4) entre la fuente de agua y las salidas
para beber (5). El suministro de probiótico microbiano a partir de
este sistema puede ser mediado por la gravedad y/o mediante bombas
(6). La construcción del cartucho incluye un sistema de malla de
tal manera que el probiótico microbiano inmovilizado es mantenido
dentro del sistema pero el probiótico microbiano libre podrá salir
del sistema hacia la línea de alimentación de agua para beber. El
cartucho también incorpora alguna forma de instalación para control
de temperatura.
Puede ser necesaria una bomba (6) donde la
inoculación semicontinua de probióticos microbianos en el sistema
de agua para beber es requerida, y es ventajoso cuando se necesita
un control más preciso de la cantidad de probiótico microbiano en
el agua para beber. Sin embargo, como se mencionó más arriba, el
probiótico microbiano libre puede ser alimentado en la línea de
alimentación principal mediante flujo por gravedad.
También puede proveerse un cartucho adicional de
nutriente para realimentación (2) que contiene nutrientes
requeridos para facilitar una viabilidad máxima dentro del cartucho
de los probióticos (3). La configuración global se diseña para
administrar la dosis de probióticos óptima al animal receptor.
En una realización alternativa, el cartucho
puede estar "en línea" con el flujo de agua desde la fuente de
agua principal hacia la salida para beber. Así, el cartucho puede
tener una entrada que permite el flujo de agua desde la fuente de
agua, y una salida que permite la salida de los microorganismos,
portados por la corriente de agua. Esta alternativa se muestra como
(4A) en la Figura 8. Puede utilizarse una fuente de agua separada
en esta realización, como se describe más abajo. Será evidente que
la fuente de agua principal o las fuentes de agua pueden contener
componentes que puedan ser tóxicos para los microorganismos, o que
inhiba su crecimiento (por ejemplo, agua clorada o fluorada). Por
lo tanto, en una realización adicional, una fuente de agua separada
(de agua purificada o agua que sea biológicamente más compatible con
los microorganismos) pueda alimentar el cartucho probiótico (3) -
bien sea en línea o no - para arrastrar los microorganismos.
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Este ejemplo describe un protocolo que cumple
con el estándar GCP(V) para probar el efecto de un probiótico
administrado a través del agua para beber en la microflora
intestinal y en el rendimiento de las aves de pollos de engorde
jóvenes en crecimiento. Este ejemplo particular se refiere a la
prueba de la especie G, pero puede ser adaptado según sea
necesario para cualquier microorganismo probiótico.
\newpage
Se usan dos tratamientos, el primero como un
control con 0% de dosificación de probióticos, y el segundo con un
suplemento de 2.5% de probióticos.
El probiótico inmovilizado es suministrado como
perlas de aproximadamente 1-4 mm de tamaño. Antes de
la adición al agua para beber, se incuba una perla durante la noche
a 48 horas a 37ºC en alícuotas de 100 ml de caldo MRS. 25 ml de
este se llevan a 1 litro con agua para beber.
Se utiliza solamente agua deionizada o agua
filtrada. La sustancia de prueba es suministrada a los animales en
agua para beber limpia en botellas de 1 litro de volumen, las cuales
se cambian en intervalos de 24 horas.
Se registran los detalles de números, de lote,
fechas de expiración y volumen/masa de las sustancias de prueba
recibidas y usadas.
Se utilizan pollos hembra de engorde en
crecimiento típicos del Reino Unido (n = 60) como animales de
prueba, por ejemplo pollos de engorde Cobb 500 o Ross 308
dependiendo de la disponibilidad. La cepa usada y la fuente de los
pollos son documentados en los datos básicos para el estudio, tales
como los planes de vacunación de los pollos que se dan mientras
están en el criadero.
La prueba se lleva a cabo en un estudio con dos
tratamientos no ciego donde los pollos son almacenados en grupos de
tres en jaulas desde 1 día de edad hasta 28 días de edad. Se
utilizan diez jaulas como grupo de tratamiento, dando un total de
30 pollos por tratamiento y 60 pollos para la prueba en total. Este
diseño experimental significa que cada jaula es el replicado para
el propósito de análisis y tiene la ventaja sobre el alojamiento de
un pollo individual de que si ocurre mortalidad en un replicado
entonces el replicado total no se pierde. Así la prueba permanece
balanceada y permite un análisis estadístico robusto de los
datos.
Se utiliza un diseño de bloque aleatorio donde
los pollos son asignados aleatoriamente a las jaulas, y las jaulas
son asignadas aleatoriamente al grupo de tratamiento. Los datos,
cuando es apropiado, se analizan utilizando análisis de varianza
con transformaciones adecuadas cuando sea necesario (Minitab Release
7.2).
Los actuales Codes of Recommendations for
the Welfare of Livestock-Turkeys/broilers/layers
son respetados, para cubrir los aspectos del ambiente tales como
niveles de dióxido de carbono y amoniaco, humedad, temperatura,
etc. Estos códigos están disponibles en la Animal Welfare Division,
The Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Government
Buildings (Toby Jug Site), Hook Rise South, Tolworth, Surbiton,
Surrey KT6 7NF. Se hace referencia en particular a las
publicaciones PB0077, (1987,1993 reprint), PB0076 (1987), PB1315
(1994), PB1739 (1994), las cuales también están disponibles en
http://wwv.maff.gov.uk/animalh/welfare/publications/booklest/pb0076
fowlcode.htm
http://www.maff.gov.uk/animalh/welfare/publications/layhen-pub.htm
http://www.maff.gov.uk/animalh/welfare/publications/booklets/pb0077/turkcode.htm
\vskip1.000000\baselineskip
Colocación de las aves: los pollos tienen un día
de edad al comienzo del estudio y son incubados en incubadoras de
gas, siendo ajustadas las incubadoras para proveer una temperatura
de 32ºC. Las temperaturas de las incubadoras se disminuyen en 0.5ºC
hasta que se alcanza una temperatura de 21ºC a los 31 días de
edad.
Espacio de alimentador: Cada jaula tiene un
alimentador en el frente donde los pollos tienen acceso a su
pienso.
Espacio para beber: una botella para beber
individualmente marcada (volumen 1 L) se posiciona en el frente de
cada jaula.
Iluminación: la iluminación desde 1 día de edad
hasta 28 días de edad es de 23 horas de luz y una hora de
oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
Dieta: las aves son alimentadas con dietas
normales de pienso para pollos en crecimiento, formuladas para que
sean adecuadas con respecto a la energía y nutrientes para los
pollos de engorde dependiendo del sexo, edad y raza utilizada en el
estudio. Las aves son alimentadas libremente utilizando un programa
de dieta de alimentación que sigue las recomendaciones de la
compañía de crianza específica para la raza de pollo de crecimiento
que se utiliza en la prueba. Esto comprende una ración que crece, en
forma de masa, que se alimenta desde los 0 hasta los 28 días de
edad. La composición estimada de los nutrientes de la dieta es
registrada y se incluye como parte de los datos básicos del
estudio.
\newpage
Las dietas comerciales típicas para los pollos
de engorde incluyen un fármaco anticoccidiosis, un antibiótico
profiláctico, y una enzima de alimentación que se incluye
frecuentemente. Para los propósitos de este estudio, no se incluye
el antibiótico, la enzima de alimentación ni el coccidiostático en
la dieta.
Requerimientos de pienso: Cada pollo de engorde
consume 2.29 kg por cada 28 días de edad. Se requieren entonces 140
kg de pienso para el estudio completo.
Muestreo del pienso: Se toman muestras de pienso
de la dieta en triplicado y se retienen para un análisis
subsecuente post hoc, si se requiere. Las muestras de
alimentación se mantienen en un congelador (-18 \pm 2ºC) durante
seis meses después de la aceptación del reporte final, punto en el
cual son descartadas.
Registro de datos: todos los datos son
registrados en forma de captura de datos ASRC estándar.
Peso del cuerpo: Cada ave es pesada al inicio
del experimento (día 0) y de nuevo a los 7, 14, 21 y 28 días de
edad. Las aves son pesadas individualmente hasta el 1.0 g más
próximo.
Alimentación: se registra la administración
diaria de pienso y se pesa el peso restante de pienso a los 7, 14,
21 y 28 días de edad. La diferencia entre las administraciones de
pienso diariamente acumulativas y los pesos restantes de pienso
durante ese periodo, por ejemplo 0-7 días, se toman
como consumo de alimento durante ese periodo.
Consumo de agua: se registra consumo diario de
agua (por peso), y se suma para cada periodo semanal.
Temperatura y humedad relativa: Todos los
termómetros de máxima/mínima son leídos y registrados diariamente.
También se calcula y registra diariamente la humedad relativa.
Mortalidad; todas las muertes son registradas y
cuando sea posible se asigna una causa con base en la inspección
externa.
Solo se llevaran a cabo análisis post
mortems en el evento de un escenario de muerte sospechosa si la
causa es desconocida.
Muestras fecales: Se toman muestras fecales de
cada jaula (reuniéndolas por lo tanto para todos los pollos dentro
de una jaula) en una base semanal. Las muestras fecales son
analizadas cuando están frescas en busca de Lactobacillus en
un laboratorio de microbiología. Frotis de cloaca: Se toman frotis
de cloaca de un ave de cada jaula cada semana. Se analizan cuando
están frescas en busca de Lactobacillus en un laboratorio de
microbiología.
Análisis microbiológico de muestras fecales y de
cloaca: Todas las muestras fecales y de cloaca son analizadas en el
sitio para un recuento total de Lactobacillus sobre medo RMS
suplementado con los siguientes antibióticos selectivos: 5
\mug/ml de Kanamicina, 500 \mug/ml de ácido nalidíxico y 75
\mug/ml de laxicina.
Muestras de tejido: Al final de la prueba, todos
los pollos son sacrificados de manera humanitaria mediante la
administración de una sobredosis de anestésico y se recogen muestras
de todo el tracto gastrointestinal y se almacenan congeladas para
análisis.
Se llevan a cabo análisis posteriores mediante
los siguientes protocolos.
Confirmación de LA 107 a partir de muestras de
tracto gastrointestinal por fragmentos de ADN polimórfico
amplificado aleatoriamente (RAPD).
Los análisis RAPD utilizan un cebador individual
décimo para obtener un perfil de huella digital reproducible y
única para la cepa bacteriana. La amplificación por PCR se lleva a
cabo utilizando el cebador individual de la secuencia de nucleótido
arbitraria: 5'AGCAGCGT-GG 3', de acuerdo con un
protocolo de Cocconcelli et al (1995) Development of RAPD
protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and
enterococci. Letters Appl. Microbiol. 21. 376-379.
Antes del análisis de las muestras del tracto gastrointestinal se
genera un perfil RAPD del LA 107.
Identificación de Lactobacillus
utilizando bandas API 50 CH y medio API 50 CHL.
Las bandas API 50 CH permiten el estudio del
metabolismo de los carbohidratos por parte de los microorganismos.
El medio API 50 CHL, que se usa para inocular las bandas está
previsto para la identificación del género Lactobacillus y
organismos relacionados. Este medio permite que se estudie la
fermentación de 49 carbohidratos sobre la banda API 50 CH
(bioMerieux, Lyon, Francia).
Llevando a cabo el estudio anterior, encontramos
que los microorganismos que están suspendidos en las perlas son
administrados de manera efectiva a los animales. También encontramos
que los microorganismos administrados colonizan el intestino de los
animales.
Cada una de las aplicaciones y patentes
mencionadas anteriormente y cada documento citado o referenciado en
cada una de las aplicaciones y patentes anteriores, incluyendo
aquellas durante el trámite de cada una de las solicitudes y
patentes anteriores ("documentos de solicitud citados") y
cualquier instrucción de fabricante o catálogos para cualquier
producto citado o mencionado en cada una de las solicitudes y
patentes anteriores y en cualquiera de los documentos citados de
solicitud, se incorporan aquí como referencia. Además, todos los
documentos citados en este texto, y todos los documentos citados o
referenciados en los documentos citados en este texto y cualquier
instrucción o catalogo de fabricantes para cualquier producto citado
o mencionado en este texto, se incorporan aquí como referencia.
Diversas modificaciones y variaciones de los
métodos descritos y sistemas de la invención serán evidentes para
los experimentados en la técnica sin apartarse del alcance de la
invención. Aunque la invención ha sido descrita en conexión con
realizaciones específicas preferidas, debe entenderse que la
invención tal como se reivindica no debería ser limitada
indebidamente a tales realizaciones específicas. En efecto, diversas
modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la
invención que son obvias para las personas experimentadas en
biología molecular o en campos relacionados están previstas para ser
incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Anexo
1
Claims (28)
1. Un método para administrar un microorganismo
a una corriente de pienso para ingestión subsecuente por un animal,
comprendiendo el método:
- (a)
- Proveer una formulación que comprende un microorganismo suspendido en o sobre una matriz;
- (b)
- Proporcionar una corriente de pienso al animal;
- (c)
- Proporcionar un flujo de agua u otro líquido para la formulación, donde la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido pueden estar en la misma corriente, o el flujo de agua u otro líquido pueden posicionarse a una distancia de la corriente de pienso;
- (d)
- Desprender los microorganismos de la matriz, y arrastrar los microorganismos desprendidos hacia el flujo de agua u otro líquido; y
- (e)
- Permitir que un animal ingiera la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un aparato para administrar un microorganismo
o una corriente de pienso para ingestión subsecuente para un
animal, comprendiendo el aparato:
- (a)
- Una formulación que comprende un microorganismo suspendido en o sobre una matriz;
- (b)
- Medios para proveer una corriente de pienso al animal;
- (c)
- Medios para proveer un flujo de agua u otro líquido de la formulación, donde la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido pueden ser la misma corriente, o el flujo de agua u otro líquido pueden estar posicionados a una distancia de la corriente de pienso;
- (d)
- Medios para desprender microorganismos de la matriz; y medios para arrastrar los microorganismos desprendidos hacia el flujo de agua u otro líquido; y
- (e)
- Medios para permitir que un animal ingiera la corriente de pienso y el flujo de agua u otro líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 1 o 2, en el cual el flujo de agua u otro líquido
está posicionado a una distancia de la corriente de pienso, y
comprende adicionalmente medios de transporte para transportar los
microorganismos desprendidos hacia la corriente de pienso.
4. Un aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 2 o 3, que comprende además medios para ajustar el
flujo de agua u otro líquido después de la formulación.
5. Un aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 2-4, donde el flujo de agua u otro
líquido comprende un caldo nutritivo.
6. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones presentes, en el cual los microorganismos
son desprendidos de la formulación mediante el flujo de agua u otro
líquido después de la formulación.
7. Un método o aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 1 o 2, en el cual los microorganismos son
desprendidos poniendo en contacto la formulación con la corriente
de pienso.
8. Un método o aparato de acuerdo con las
reivindicaciones 1, 2, o 7, en el cual la corriente de pienso es
una corriente de pienso líquida.
9. Un método o aparato de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en el cual los microorganismos
son desprendidos de la matriz en una manera pulsada o
sustancialmente continua.
10. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la
corriente de pienso comprende agua para beber para el animal.
11. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la
corriente de pienso y/o el flujo de agua u otro líquido es
administrado de manera continua o semicontinua.
12. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el
microorganismo es un organismo probiótico que incluye un
microorganismo probiótico recombinante.
13. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la
formulación comprende adicionalmente un prebiótico.
14. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 13 en el cual el prebiótico es seleccionado del grupo
consistente de: oligosacáridos no digeribles, inulina, celulosa,
almidón resistente y xilano de avena espelta.
15. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 13 o 14, en el cual el prebiótico esta presente en
una concentración de aproximadamente 2% (p/v).
16. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el
microorganismo es un Lactobacillus o un Enterococcus.
17. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual el
microorganismo es seleccionado de L. acidophilus
LA-107 (ATCC No. 53545), L. acidophilus
LA-101 (ATCGNo. 4356), y E. faecium
EF-101 (ATCC No. 19434).
18. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la
formulación comprende más de una cepa o especie de
microorganismo.
19. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz
comprende un material poroso al agua.
20. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz
comprende alginato, preferiblemente alginato de calcio o alginato
de bario.
21. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la
formulación es sustancialmente libre de agua.
22. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz
ha sido sometida a un secado por congelación, secado por aspersión
o liofilización.
23. Un método o aparato de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el cual la matriz
comprende un preservativo o criopreservativo para mantener la
viabilidad de los microorganismos.
24. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 23, en el cual el preservativo o el criopreservativo
comprende trehalosa o lactosa, o una combinación de trehalosa y
lactosa.
25. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 23 o 24, en el cual el preservativo o
criopreservativo, comprende lactosa.
26. Un método o aparato de acuerdo con una
reivindicación precedente, en el cual la formulación es provista en
un dispositivo de administración.
27. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 26, en el cual el dispositivo de administración es
un cartucho.
28. Un método o aparato de acuerdo con la
reivindicación 27, en el cual el cartucho comprende una malla para
retener la formulación en la forma de perlas dentro del cartucho,
pero permitiendo sustancialmente que los microorganismos
desprendidos sean transportados con la corriente de pienso.
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