CN102171329A - 具有高的草酸分解能力的乳酸菌 - Google Patents

具有高的草酸分解能力的乳酸菌 Download PDF

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Abstract

本发明提供具有比以往已知的具有草酸分解活性的乳酸菌高数倍的草酸分解活性的乳酸菌及其用途。由从成人的粪便和胃液单独分离的乳杆菌属乳酸菌132菌株中筛选出可大量分解草酸的乳酸菌。其结果，发现了具有下述特征的乳酸菌：在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上。

Description

具有高的草酸分解能力的乳酸菌
技术领域
本发明涉及具有高的草酸分解能力的乳酸菌及其用途。
背景技术
尿路结石多伴有腹部的剧烈疼痛，该疼痛是因结石通过尿路时的刺激等而突然发生的。肾结石多数情况下并无症状，但若放任无症状的结石，则有时也会发生肾积水所引起的肾功能降低或细菌感染等。
近年来，由于ESWL(体外冲击波碎石术)的开发，尿路结石的治疗得到惊人发展，治疗效果也显著地提高。但是，日本的尿路结石在2005年的患病率(相对于10万人口)为134，呈年年增加趋势，且复发率高(非专利文献1)。因此，今后不仅仅需要进行自然排石或碎石的治疗，致力于结石的预防也是非常重要的(非专利文献2)。
但是，除了摄入水分、改善饮食习惯或药物疗法以外，并没有有效的预防结石的手段，例如对于改善饮食习惯，可列举出限制摄入过量的动物性蛋白、摄入规定量的钙(600～800mg/天)、盐分、限制摄入过量的脂肪、摄入柠檬酸等。另外，通过控制草酸的摄入还能够防止产生草酸钙结石(非专利文献3)。
在日本，肾尿路结石症中，含有钙的结石占85％以上，且含有钙的结石中的75％为草酸钙结石(非专利文献4)。作为草酸钙结石的成因，有高钙尿症和高草酸尿症等(非专利文献5)。
目前，作为尿路结石的主要治疗方法，多使用茯汤(chorei to)等促进排石的药物，但尚没有确立可用来阻止结石形成的药剂。
作为使用微生物的预防方法，报告了被称为产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)的肠道内存在的细菌具有减小肾结石的复发风险的可能性(非专利文献6)，通过使用具有草酸分解能力的肠内细菌很可能能够预防肾结石。据报告乳酸菌具有调节肠道的作用、抗过敏作用等多种生理效果，并报告了有关草酸分解能力的几个菌种(专利文献1)。另外，已知通过草酸分解能力提高了的突变株、或为了提高草酸分解能力而在预先含有草酸的培养液中进行传代培养来诱导草酸分解能力的状态下，能够某种程度地提高草酸分解能力(专利文献2、非专利文献7)。
其中，本发明相关的现有技术文献情报如下所示。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利公表2003-500451
专利文献2：日本专利公表2008-517628
非专利文献
非专利文献1：Prevalence and epidemiological characteristics ofurolithiasis in Japan：national trends between 1965 and 2005.Urology 71：209-213，2008
非专利文献2：日本泌尿器科学会雑誌87卷6号p900～908
非专利文献3：「再発予防ガイドライン」『尿路結石症診療ガイドライン改訂版(2004年版)』
非专利文献4：腎よ透析1987臨時増刊号
非专利文献5：結石に関する代謝系の検查法.臨床泌尿器科：小川由英45；47，1991
非专利文献6：Duncan，et al，Appl Environ Microbiol.2002 Aug；68(8)：3841-7
非专利文献7：Transcriptional and Functional Analysis ofOxalyl-Coenzyme A(CoA)Decarboxylase and Formyl-CoA TransferaseGenes from Lactobacillus acidophilus.Applied and EnvironmentalMicrobiology.2006 Mar；72(3)：1891-1899
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴手这样的情况而完成的发明，本发明所要解决的课题是提供具有高的草酸分解能力的乳酸菌、该乳酸菌的处理物、用来分解草酸或草酸化合物的方法、草酸或草酸化合物降低了的组合物的制造方法。此外，本发明的课题还在于提供含有所述乳酸菌或所述处理物的组合物或者草酸或草酸化合物的分解剂。
用于解决课题的手段
本发明人等为了解决上述课题进行了锐意研究，结果分离出具有比以往已知的具有草酸分解活性的乳酸菌高数倍的草酸分解活性的乳酸菌，从而完成了本发明。具体而言，本发明为了获得可大量分解草酸的乳酸菌而进行了锐意的筛选工作。由从成人的粪便和胃液单独分离出来的乳杆菌(Lactobacillus)属乳酸菌132菌株中筛选可大量分解草酸的乳酸菌。其结果，发现了具有下述特征的乳酸菌：在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上，由此完成了本发明。
即，本发明更具体地提供以下的〔1〕～〔22-2〕。
〔1〕一种乳酸菌，其为属于乳杆菌属的乳酸菌，其特征在于，在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上。
〔2〕根据〔1〕所述的乳酸菌，其中，属于乳杆菌属的乳酸菌为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)菌种或嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)菌种。
〔3〕一种乳酸菌，其选自以下的(a)～(d)：
(a)乳酸菌格氏乳杆菌OLL203195株，其以保藏号：FERM BP-11005进行了保藏；
(b)乳酸菌嗜淀粉乳杆菌OLL2741株，其以保藏号：FERM BP-11007进行了保藏；
(c)乳酸菌嗜淀粉乳杆菌OLL2880株，其以保藏号：FERM BP-11006进行了保藏；和
(d)乳酸菌格氏乳杆菌OLL2727株，其以保藏号：FERM BP-11004进行了保藏。
〔4〕〔1〕～〔3〕中的任一项所述的乳酸菌的处理物。
〔5〕一种组合物，其含有〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物。
〔6〕根据〔5〕所述的组合物，其用于治疗和/或预防肾/尿路结石。
〔7〕根据〔5〕所述的组合物，其用于治疗和/或预防贫血。
〔8〕根据〔5〕所述的组合物，其用于治疗和/或预防骨质疏松症。
〔9〕根据〔5〕～〔8〕中任一项所述的组合物，其为医药组合物。
〔10〕根据〔5〕～〔8〕中任一项所述的组合物，其为食品组合物。
〔11〕一种草酸或草酸化合物的分解剂，其含有〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物。
〔12〕一种用来分解草酸或草酸化合物的方法，其包含使草酸或草酸化合物与〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物接触的工序。
〔13〕一种草酸或草酸化合物降低了的组合物的制造方法，其包含使含有草酸或草酸化合物的组合物与〔1〕、〔2〕或(3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物接触的工序。
〔14-1〕一种治疗和/或预防肾/尿路结石的方法，其包括将〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物给予对象的工序。
〔14-2〕一种治疗和/或预防肾/尿路结石的方法，其包含将〔5〕所述的组合物给予对象的工序。
〔15-1〕一种治疗和/或预防贫血的方法，其包含将〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物给予对象的工序。
〔15-2〕一种治疗和/或预防贫血的方法，其包含将〔5〕所述的组合物给予对象的工序。
〔16-1〕一种治疗和/或预防骨质疏松症的方法，其包含将〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物给予对象的工序。
〔16-2〕一种治疗和/或预防骨质疏松症的方法，其包含将〔5〕所述的组合物给予对象的工序。
〔17〕〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物在制造用于治疗和/或预防肾/尿路结石的医药组合物中的用途。
〔18〕〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物在制造用于治疗和/或预防贫血的医药组合物中的用途。
〔19〕〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物在制造用于治疗和/或预防骨质疏松症的医药组合物中的用途。
〔20-1〕在用于治疗和/或预防肾/尿路结石的方法中使用的〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物。
〔20-2〕在用于治疗和/或预防肾/尿路结石的方法中使用的〔5〕所述的组合物。
〔21-1〕在用于治疗和/或预防贫血的方法中使用的〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物。
〔21-2〕在用于治疗和/或预防贫血的方法中使用的〔5〕所述的组合物。
〔22-1〕在用于治疗和/或预防骨质疏松症的方法中使用的〔1〕、〔2〕或〔3〕所述的乳酸菌、或〔4〕所述的处理物。
〔22-2〕在用于治疗和/或预防骨质疏松症的方法中使用的〔5〕所述的组合物。
附图说明
图1为表示将草酸分解能力高的乳酸菌(乳杆菌属)经口给予饮食性高草酸尿症动物模型后对尿中草酸值进行测定所得到的结果的图。可见L.amylovorus OLL2880株给予组(第4组)在给予开始后第3天、第5天和第7天的尿中草酸值的上升得到显著性抑制(图中的*)。另外，在L.gasseriOLL2727株给予组(第3组)也可见尿中草酸值的上升得到显著性抑制。
具体实施方式
本发明涉及一种乳酸菌(以下称为“本发明的乳酸菌”)，其为属于乳杆菌属的乳酸菌，其特征在于，在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上。
乳杆菌属为乳酸菌的代表性菌属之一，包括80种以上的菌种。作为乳杆菌属中包含的菌种的例子，可列举出德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、嗜淀粉乳杆菌(下文也称为L.amylovorus。)、鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、格氏乳杆菌(下文也称为L.gasseri。)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。本发明的乳杆菌属乳酸菌只要是具有下述特征的乳酸菌，则可以是任一菌种：在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上；优选为格氏乳杆菌菌种或嗜淀粉乳杆菌菌种，例如由本发明人分离的格氏乳杆菌OLL203195株、嗜淀粉乳杆菌OLL2741株、嗜淀粉乳杆菌OLL2880株和格氏乳杆菌OLL2727株。
本发明的乳酸菌是具有下述特征的乳酸菌：在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上。本发明人测定了大量的乳酸菌的草酸分解活性，具体地发现了被命名为格氏乳杆菌OLL203195株、嗜淀粉乳杆菌OLL2741株、嗜淀粉乳杆菌OLL2880株、或格氏乳杆菌OLL2727株的乳酸菌在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上。
草酸是二羧酸中的一种，其分子量为90.03g/mol、CAS登记号为144-62-7。在蔬菜(菠菜、竹笋)等各种食品中含有，也是涩味的原因之一。另外，草酸易于与矿物质形成盐，在血中的草酸浓度上升的情况下，会形成不溶性的钙盐，从而与尿路结石等疾病相关。
“在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上”也可以换言之为“在含有5mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为4的条件下培养4小时时的每单位活菌数的草酸分解量为3.0×10-9μmol/cfu以上”、“在含有5mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为4的条件下培养4小时时具有比L.amylovorus JCM1126T高17倍以上的草酸分解活性”、或者“在含有5mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为4的条件下培养4小时时的草酸分解率为28％以上。“草酸分解率”可按照下文实施例1等中的所述式算出。
本发明的乳酸菌可以通过公知的方法分离。例如可以通过如下方法来分离：对来自人等哺乳类的粪便的菌进行培养，根据培养的菌的形状、生理学特征等将乳杆菌属乳酸菌分离，测定草酸分解活性，分选出在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上的乳杆菌属乳酸菌。草酸分解活性的测定可以利用公知的方法，作为示例，可利用本实施例的方法。
对于本发明的乳酸菌的培养，只要是通常适于乳酸杆菌的培养的培养基即可，可使用含有葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、海藻糖、蔗糖、甘露糖、纤维二糖等碳源，肉汁、蛋白胨、酵母膏、酵母膏提取物、酪蛋白、乳清蛋白等氮源、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰等无机营养素的培养基。作为优选的例子之一，可列举出乳酸菌MRS肉汤(Lactobacilli MRS Broth)(Difco，下文也称为“MRS培养基”。)。培养条件只要是肠内乳酸菌能够生长的条件，则没有特别限制，作为优选的条件，例如为pH5.0～pH8.0、温度为20℃～45℃，作为更优选的条件，为厌氧性、pH5.0～pH7.0、温度为30℃～40℃。
本发明的“格氏乳杆菌OLL203195株”和“格氏乳杆菌OLL2727株”由本发明人保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。以下记载了特定保藏的内容。
(1)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
(2)联系地址：日本国茨城県つくば巿東1丁目1番地1中央第6
邮政编码305-8566
电话号码029-861-6029，6079
(3)用于识别的表示：格氏乳杆菌OLL203195(保藏号：FERMBP-11005，原保藏日：平成20年9月2日)
用于识别的表示：格氏乳杆菌OLL2727(保藏号：FERM BP-11004，原保藏日：平成20年9月2日)
格氏乳杆菌OLL203195株(保藏号：FERM BP-11005)和OLL2727株(保藏号：FERM BP-11004)为革兰氏阳性杆菌，乳酸菌MRS琼脂(Lactobacilli MRS Agar)、Difco上的菌落形态为圆形、淡黄色、扁平状。作为生理学特征，有以同型乳酸发酵形式将葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、海藻糖发酵的发酵性、在45℃下的生长性。菌体增殖中，培养中的培养基的pH优选维持在5.0～7.0。
作为培养基，使用乳酸菌的培养基中通常使用的培养基。即，只要是除主碳源之外还适当含有氮源、无机物、其他营养素的培养基，则任何培养基均可使用。作为碳源，可根据所用菌的同化性，使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等。作为氮源，可使用酪蛋白的水解物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白水解物等有机氮含有物。此外，作为增殖促进剂，还可使用肉汁、鱼肉汁、酵母膏等。
培养优选在厌氧条件下进行，可以在通常使用的液体静置培养等的微需氧条件下。对于厌氧培养，可以使用在二氧化碳气层下进行培养的方法等公知的方法，但其他方法也可以使用。培养温度一般优选为30～40℃，但只要是菌能够生长的温度，则其他温度条件也可以。培养中的培养基的pH优选维持在5.0～7.0，但只要是菌能够生长的pH，则其他pH条件也可以。另外，也可以在分批培养条件下进行培养。培养时间通常优选为10～24小时，但只要是菌能够生长的时间，则其他培养时间也可以。
本发明的“嗜淀粉乳杆菌OLL2741株”和“嗜淀粉乳杆菌OLL2880株”由本发明的发明人保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。以下记载了特定保藏的内容。
(1)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心
(2)联系地址：日本国茨城県つくば巿東1丁目1番地1中央第6
邮政编码305-8566
电话号码029-861-6029，6079
(3)用于识别的表示：嗜淀粉乳杆菌OLL2741(保藏号：FERMBP-11007、原保藏日：平成20年9月2日)
用于识别的表示：嗜淀粉乳杆菌OLL2880(保藏号：FERM BP-11006、原保藏日：平成20年9月2日)
嗜淀粉乳杆菌OLL2741株(保藏号：FERM BP-11007)和OLL2880株(保藏号：FERM BP-11006)为革兰氏阳性杆菌，在乳酸菌MRS琼脂、Difco上的菌落形态为圆形、淡黄色、扁平状。作为生理学特征，有以同型乳酸发酵形式将葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖发酵的发酵性、在45℃下的生长性。在菌体增殖中，培养中的培养基的pH优选维持到5.0～7.0。
作为培养基，可以使用乳酸菌的培养基中通常使用的培养基。即，只要是在主碳源之外适当地含有氮源、无机物、其他营养素的培养基，则任何培养基均可使用。作为碳源，可以根据所用菌的同化性使用葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉水解物、糖蜜等。作为氮源，可以使用酪蛋白的水解物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白水解物等有机氮含有物。此外，作为增殖促进剂，还可使用肉汁、鱼肉汁、酵母膏等。
培养优选在厌氧条件下进行，可以在通常使用的液体静置培养等的微需氧条件下。对于厌氧培养，可以使用在二氧化碳气层下进行培养的方法等公知的方法，但其他方法也可以使用。培养温度一般优选为30～40℃，但只要是菌能够生长的温度，则其他温度条件也可以。培养中的培养基的pH优选维持在5.0～7.0，但只要是菌能够生长的pH，则其他pH条件也可以。另外，也可以在分批培养条件下进行培养。培养时间通常优选为10～24小时，但只要是菌能够生长的时间，则其他培养时间也可以。
另外，本发明还涉及本发明的乳酸菌的处理物(以下称为“本发明的处理物”)。
作为处理物，可列举出例如培养物、浓缩物、糊化物、喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、滚菌干燥物、液态物、稀释物、破碎物等，但并不限定于这些。
本发明的处理物可以通过公知的方法获得。例如当为培养物或浓缩物时，可以直接使用本发明的乳酸菌培养结束后的培养上清液或培养基成分，或者通过将培养基浓缩等来获得。另外，当为破碎物时，可以通过用公知的适当装置将本发明的乳酸菌或乳酸菌含有物破碎来获得。
本发明的乳酸菌和处理物可用于分解草酸或草酸化合物，或者用于治疗或预防与草酸相关的疾病、例如肾/尿路结石、贫血、骨质疏松症等。
另外，通过利用本发明的乳酸菌和处理物的草酸分解活性，能够抑制给予了本发明的乳酸菌和处理物的对象的体内对食品中所含的草酸的吸收。
本发明中，“对象”可列举出患有草酸相关的疾病的生物体或有其患病可能的生物体等。给予了本发明的乳酸菌和处理物的生物体没有特别限定，包括动物(例如人、家畜动物、野生动物、宠物等)。
另外，本发明还涉及含有本发明的乳酸菌或处理物的组合物(以下称为“本发明的组合物”)。
本发明的组合物也可以含有例如培养基成分、适于经口或经管(tubalfeeding)摄入的添加物和水等溶剂等。其他，还可以含有后文所述的医药上可容许的载体、糖质、蛋白质、脂质、维生素类、机体必需微量金属、香料等。
本发明的组合物能够用于分解草酸或草酸化合物，或者用于治疗或预防与草酸相关的疾病，例如肾/尿路结石、贫血、骨质疏松症等。
作为本发明的组合物，可列举出例如医药组合物(以下称为“本发明的医药组合物”)。
本发明的医药组合物除了本发明的乳酸菌和处理物以外，还可以含有医药上可容许的载体，可以经口或非经口地给予，但优选的给予方法为经口给予。作为载体，可列举出表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等渗剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、矫味剂等来作为医药上可容许的载体，但也可以适当使用其他常用的载体。具体而言，可列举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯固化蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。
作为经口给予制剂，可制成公知的各种剂型，例如可制成颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、液体剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、锭片(troche)等剂型。另外，通过采用本领域技术人员公知的方法制成肠溶性制剂，还能不受胃酸影响地将本发明的乳酸菌和处理物更高效地运送到肠。
使用本发明的乳酸菌和处理物制造的医药组合物通过医药组合物中的该乳酸菌的作用可期待发挥预防和/或治疗与草酸分解活性或草酸相关的疾病的效果。此外，还可期待上述医药组合物在被给予的对象体内发挥抑制食品中所含的草酸的吸收的效果。
另外，作为本发明的组合物，可列举出例如食品组合物(以下称为“本发明的食品组合物”)。
本发明的食品组合物除了本发明的乳酸菌和处理物以外，只要不妨碍乳酸菌的生长，则还可以含有糖质、蛋白质、脂质、维生素类、机体必需微量金属(硫酸锰、硫酸锌、氯化镁、碳酸钾等)、香料或其他的配合物。
作为糖质，可列举出糖类、加工淀粉(除了糊精外，可溶性淀粉、britishstarch、氧化淀粉、淀粉酯、淀粉醚等)、食物纤维等。
作为蛋白质，可列举出例如全脂奶粉、脱脂奶粉、部分脱脂奶粉、酪蛋白、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清蛋白分离物、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、乳铁蛋白、大豆蛋白、鸡蛋蛋白、肉蛋白等动植物性蛋白质、它们的水解物；黄油、乳性矿物质(wheymineral)、奶油、乳清、非蛋白态氮、唾液酸、磷脂、乳糖等各种乳来源的成分等。
作为脂质，可列举出例如猪油、鱼油等，它们的分离油、氢化油、酯交换油等动物性油脂；棕榈油、红花油、玉米油、菜籽油、椰子油，它们的分离油、氢化油、酯交换油等植物性油脂等。
作为维生素类，可列举出例如维生素A、胡萝卜素类、维生素B族、维生素C、维生素D族、维生素E、维生素K族、维生素P、维生素Q、烟酸、尼克酸、泛酸、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等；作为矿物质类，可列举出例如钙、钾、镁、钠、铜、铁、锰、锌、硒等。
本发明的食品组合物的种类或类型没有限制，可以是功能性食品、特定保健用食品、特定用途食品、营养功能食品、健康食品、护理用食品，另外也可以是糕点、乳酸菌饮料、乳酪或酸奶等乳制品、调味料等。对饮食品的形态没有限制，可以是固态、液态、流食状、果冻状、片剂状、颗粒状、胶囊状等通常可流通的所谓饮食品形态，也可以添加到各种食品(牛奶、清凉饮料、发酵乳、酸奶、乳酪、面包、饼干、脆饼、比萨饼、配方奶粉、流食、患者用食品、营养食品、冷冻食品、加工食品、其他的市售食品等)中。上述饮食品的制造可以采用本领域技术人员常用的方法来进行。
本发明的乳酸菌和处理物除了可以加工成如上所述的含有乳制品、发酵乳的一般饮食品外，还可以用作制造酸奶或奶酪等乳制品、发酵乳用的引子(starters)。作为引子时，只要不妨碍本发明的乳酸菌的生长、繁殖，并且不妨碍乳制品的制造，则也可以混合其他微生物。例如，可以与作为酸奶用乳酸菌的主要菌种的德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、嗜酸乳杆菌等混合，另外，也可以和通常用作酸奶用或奶酪用的菌种混合作为引子使用。利用上述引子的乳制品、发酵乳的制造可以按照常规方法来进行。例如，在加温、混合、均质化、杀菌处理后冷却的乳或乳制品中混入上述引子，经过发酵、冷却制成纯酸奶。
此外，本发明还涉及本发明的乳酸菌和处理物的用途。
作为用途，可列举出例如含有本发明的乳酸菌或处理物的草酸或草酸化合物的分解剂。该分解剂分解草酸或草酸化合物。
所述分解剂除了本发明的乳酸菌或处理物以外还可以含有上述的医药上可容许的载体、上述糖质、蛋白质、脂质、维生素类、机体必需微量金属(硫酸锰、硫酸锌、氯化镁、碳酸钾等)、香料或其他的配合物。另外，作为所述草酸分解剂的剂型，可列举出例如上文所述的剂型。
另外，所述分解剂也可以表述为“一种用来分解草酸或草酸化合物的方法，其包含使草酸或草酸化合物与本发明的乳酸菌或本发明的处理物接触的工序”。
通过上述工序，能够将草酸或草酸化合物有效地分解。上述工序优选在本发明的乳酸菌能够生存、或利用本发明的乳酸菌能够发酵的条件下进行。
另外，作为用途，可列举出例如用来治疗和/或预防肾/尿路结石·贫血·骨质疏松症的方法，其包含将本发明的乳酸菌或处理物给予对象的工序。
上述“对象”是指将给予本发明的乳酸菌或处理物的生物体、该生物体的体内的一部分、或者从生物体摘出或排出的一部分。生物体没有特别限定，包括动物(例如人、家畜动物、野生动物)。
本发明中，“给予”包括经口或非经口给予。例如可例示出经口给予、经管给予、经肠给予。
作为经口给予，可列举出以经口制剂的形式给予，作为经口制剂，可选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶剂、乳剂或悬浮剂等剂型。
作为非经口给予，可列举出以注射剂的形式给予。另外，也可以将本发明的乳酸菌或处理物局部地给予欲施予处置的区域。例如可通过手术中局部注入或使用导管来进行给予。
此外，利用本发明的乳酸菌和处理物的草酸分解活性，还可以制造草酸或草酸化合物降低了的组合物。本发明的草酸或草酸化合物降低了的组合物的制造方法包括使含有草酸或草酸化合物的组合物与本发明的乳酸菌或处理物接触的工序。通过该工序，能够有效地降低该组合物中所含的草酸或草酸化合物的量。这里，“草酸或草酸化合物降低了”是指上述含有草酸或草酸化合物的组合物中的草酸或草酸化合物的量在经过上述工序后比进行上述工序之前少。例如，经过上述工序后的草酸或草酸化合物的量与进行上述工序之前的草酸或草酸化合物的量相比减少10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上，此时可称为草酸或草酸化合物降低了。另外，经过上述工序后的组合物中完全不含有草酸或草酸化合物的情况也可称为草酸或草酸化合物降低了。
作为上述“草酸化合物”，可列举出例如草酸金属盐、草酸铵盐和草酸的胺盐等草酸化合物、或者蔬菜等植物中所含的草酸盐等。更具体而言，可列举出例如草酸盐的有机盐或无机盐(钙盐、镁盐、钠盐、草酸氢钠、钾盐)、草酸铁、和草酸水合物等。另外，“草酸化合物”也可以表述为“草酸源”或“溶解到水中生成草酸离子的化合物”。
需要说明的是，本说明书中引用的全部的现有技术文献作为参考引入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行进一步的具体说明，但本发明并不限于这些实施例。
<标准株>
L.gasseri JCM1131T
L.amylovorus JCM1126T
[实施例1]
作为下面所用的受试乳酸菌，使用明治乳业株式会社拥有的乳酸菌株、从理化学研究所微生物系统保存机构(JCM)获得的乳酸菌株。菌株名中记有OLL的菌株表示是明治乳业株式会社拥有的菌株。菌株名中记有JCM的菌株表示是理化学研究所微生物系统保存机构(JCM)拥有的菌株。
将各受试乳酸菌的菌体分散到经灭菌的10％(w/v)脱脂乳培养基(明治乳业株式会社)中，在深冷器中在-80℃下保存直到使用。
通过下述方法实施对草酸具有分解活性的菌的1次筛选。
对本公司拥有的27个菌种中的乳酸菌以每种数株地共计使用41种菌株。
为了进行厌氧培养，将各菌株与氧气吸收·二氧化碳气体产生剂(“AnaeroPack-Kenki”(三菱GAS化学株式会社制))一起放入密闭容器中，在MRS培养基(Difco、Detroit、MI、USA)中进行厌氧培养(37℃、16小时)。然后，测定得到的培养液的OD600，并进行调节以使OD600＝1。之后，将调节了OD600的培养液5μL添加到将MRS培养基(Difco、Detroit、MI、USA)与20mM草酸铵溶液等量混合得到的培养基5mL(pH6.5、含有50μmol的草酸)中，将得到的菌体悬浮液与“AnaeroPack-Kenki”一起放入密闭容器中，在37℃下静置培养72小时。
将得到的培养液稀释10倍，用吸光度计测定OD600。
将得到的培养液1mL在15000转/分钟、4℃下离心分离1分钟，在上清液500μL中添加作为内部标准液的30mM巴豆酸溶液50μL，之后用carrez试剂(carrezI溶液(100mL的蒸馏水中加入53.5g的ZnSO4·7H2O)、carrezII溶液(100mL的蒸馏水中加入17.2g的K4[Fe(CN)6]·3H2O))进行除蛋白，在10000转/分钟、4℃下离心分离3分钟。用0.22μm过滤器收集上清液。之后，将该液用于HPLC。需要说明的是，下述溶液中的草酸测定均使用上述记载的方法，HPLC在所有实验中均以下述条件实施。
<分析仪器>
高效液相色谱法：SCL-10A(岛津制作所制)
<分析条件>
柱：有机酸分析用聚合物柱东京化成工业株式会社/TRANSGENOMIC公司
ICSep ICE-ORH-801 6.5mmI.D×300mm
Guard Kit：有机酸分析用的保护柱盒(Guard column cartridge)
ICSep ICE-ORH-801 4.0mmI.D×20mm
检测器：电导度检测器(岛津CDD-10A)
流动相：5mM对甲苯磺酸水溶液
反应液：5mM对甲苯磺酸·100μM EDTA(2Na)/20mM Bis-Tris水溶液
温箱温度：50℃
流量：0.5mL/min(流动相·反应液一起)
样品量：10μL
根据HPLC保留时间确定草酸和巴豆酸。另外，基于HPLC图的峰面积值进行这些各化合物的定量。此外，按照下式算出草酸的分解率。
分解率(％)＝{(a-X)/a}×100
a：反应前的培养基中的草酸的浓度
X：反应后的培养上清液中的草酸的浓度
表1
Figure BDA0000053001730000151
本试验按照与日本专利公表2003-500451的实施例1大致同样的方法实施。其结果，与日本专利公表2003-500451的实施例1中分解率的最高值11.79％相比，本试验中L.gasseri、L.amylovorus和青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)菌种中存在分解率非常高的菌株。另外，上述4个菌株的分解率为56％以上。即可知，本发明中发现的表1的4个菌株与日本专利公表2003-500451中发现的菌株相比，具有约5倍(4.86倍)以上的高的草酸分解活性。
[实施例2]
使用实施例1中活性高的L.gasseri OLL2727株，进行下述研究。
为了进行厌氧培养，将菌株与氧气吸收·二氧化碳气体产生剂(“AnaeroPack-Kenki”(三菱GAS化学株式会社制))一起放入密闭容器中，在MRS培养基(Difco、Detroit、MI、USA)中进行厌氧培养(37℃、16小时)。然后，测定得到的培养液的OD600，并进行调节以使OD600＝5。之后，将调节至OD600＝5的培养液5mL在3000转/分钟、室温下离心分离10分钟，进行集菌。将得到的菌用0.8％生理盐水洗涤，再次在3000转/分钟、室温下离心分离10分钟，进行集菌。
在2-(N-吗啉基)乙磺酸(nacalaitesqe)42.65g、葡萄糖(wako)5g、NaCl(wako)0.9g、KH2PO4(wako)0.4g、(NH4)2SO4(wako)0.45g、MgSO4·7H2O(wako)0.09g、CaCl2(关东化学)0.05g、K2HPO4(wako)0.4g和L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(wako)0.5g中加入水至1L，将其作为培养基B。分别等量添加该培养基B与10mM草酸铵溶液，用微量的盐酸或氢氧化钠将pH调节至4和6，用0.45μm的过滤器进行灭菌，将其作为培养基A。
在得到的菌中添加培养基A(pH＝4和6)5mL，将得到的菌体悬浮液与“AnaeroPack-Kenki”一起加入密闭容器中，在37℃下静置培养6小时。
按照实施例1记载的方法测定和算出得到的培养液中的草酸量和分解率。
表2
Figure BDA0000053001730000161
其结果可知，与pH为6.0相比，pH为4.0下的活性更高。该结果表示，即使在低pH的胃内，菌株也能够存活并发挥草酸分解活性。即可以说，其是在胃内具有草酸分解活性的菌株。在pH为6时虽然与pH为4相比活性低，但菌株存活并具有草酸分解活性。肠内的pH通常为6.5左右，因此表明即使在肠内菌株也能够存活并发挥草酸分解活性。另外，由于肠内的乳酸菌所产生的乳酸会使肠内局部成为低pH环境，因此期待不仅在低pH的胃内、而且在肠内也能够进行草酸分解。
[实施例3]
另外，使用属于L.gasseri、L.amylovorus的本公司拥有的人来源的L.acidophilus群132株进行以下的实验。
通过下述方法测定、评价本发明微生物对草酸的分解活性。
为了进行厌氧培养，将各菌株与氧吸附剂(”AnaeroPack-Kenki”(三菱GAS株式会社制))一起放入密闭容器中，在MRS培养基(Difco、Detroit、MI、USA)中进行厌氧培养(37℃、16小时)。然后，测定得到的培养液的OD600，并进行调节以使OD600＝5。之后，将调节至OD600＝5的培养液5mL在3000转/分钟、室温下离心分离10分钟，进行集菌。将得到的菌用0.8％生理盐水洗涤，再次在3000转/分钟、室温下离心分离10分钟，进行集菌。
向得到的菌中添加实施例2中使用的培养基A 5mL(pH为4、含有25μmol的草酸)，将得到的菌体悬浮液与“AnaeroPack-Kenki”一起放入密闭容器中，在37℃、pH为4下静置培养4小时。然后，按照实施例1记载的方法测定和算出得到的培养液中的草酸量和分解率。
表3
能够得到每单位活菌数的草酸分解量为各菌种的标准株的每单位活菌数的草酸分解量的10～20倍以上的草酸分解活性高的株。
在实施了本次筛选的132株中，草酸分解活性为0的菌株为42株、为0.1mM以下的菌株为34株、为1mM以下的菌株为49株、为1mM以上的菌株为7株，草酸分解活性高的菌株非常少。当期待在动物体内具有草酸分解效果时，短时间内草酸分解活性高是有利的。
由于本次实验使用人来源的菌株，因此也确认该人来源的株能够以存活状态从人消化道内通过，从而能够用作益生菌。由于是在pH为4下在4小时的短时间内分解量大的菌，因此当其在胃内大量分解草酸时，流入小肠下游的草酸量将减少，从而能够利用在肠内分解草酸的菌来有效地减少尿中的草酸量。另外，尽管肠内的pH通常为6.5左石，但由于肠内的乳酸菌所产生的乳酸的作用，肠内局部也可成为低pH，因此不仅在低pH的胃内、而且在肠内也能够进行草酸分解。
由此可知，格氏乳杆菌OLL203195株、嗜淀粉乳杆菌OLL2741株、嗜淀粉乳杆菌OLL2880株和格氏乳杆菌OLL2727株这4种菌株与日本专利公表2003-500451中发现的菌株相比，具有约5倍(4.86倍)以上的高的草酸分解活性。
[实施例4]
关于乳酸菌的尿中草酸降低作用的体内的实验方法
制作饮食性高草酸尿症动物模型，研究微生物(乳酸菌)对该动物的尿中草酸值的影响。上述方法具体而言为下述方法：制备以0.075重量％含有草酸2水合物的混合液，使大鼠摄入，然后将摄入后的尿中草酸值与阴性组和对照组进行比较。
〔材料和实验过程〕
〔微生物〕
使用在体外试验中判断为草酸分解能力高的格氏乳杆菌2727株(以下根据具体情况将“乳杆菌(Lactobacillus)”简记为“L.”)、L.amylovorus2880株这2株。利用各菌种的乳酸菌，与体外试验同样地制备菌体悬浮液。将菌体悬浮液以1×1010CFU/10mL/kg经口给予大鼠。菌体悬浮液使用在葡萄糖(wako)2.5g、NaCl(wako)0.45g、KH2PO4(wako)0.2g、(NH4)2SO4(wako)0.2g、MgSO4·7H2O(wako)0.045g、CaCl2(关东化学)0.025g、K2HPO4(wako)0.2g、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物(wako)0.25g中加水至1L得到的溶液。(以下将该溶液记为溶液X)
〔实验动物〕
使用大鼠(Wister SPF、雄性、7周龄)。饲养(包括驯化与试验)使用大鼠用塑料笼，每个笼子收纳1只大鼠。明暗循环中将上午7点～下午7点(12小时)作为明期。
〔预备饲养(驯化)与分组〕
实验动物在搬入后进行1周的预备饲养(驯化)。驯化中，使其自由摄入饵(饲料)即钙量调节至50mg/100g的AIN-93G(Oriental酵母工业株式会社)(以下将该饲料记作特殊AIN-93G)、饮水即注射用水(大塚)。将经预备饲养的大鼠(买入7天后、8周龄、第0天)用代谢笼收集24小时的尿(从买入第6天上午～第7天上午)。用2N盐酸将该尿的pH调节至5，为了避免草酸钙沉淀，每1L中加入0.5g的EDTA。按照实施例1中记载的方法用HPLC测定得到的尿中的草酸值。另外，使用肌酐测定试剂盒(LABOASSAY肌酐(Jaffe法)(和光纯药))测定尿中肌酐。该方法按照说明书的指示通过微板法来实施。
分组按照使各组的尿中草酸量等同的方式进行。试验使用每组7只大鼠(仅阴性组为3只)，并设定阴性组(第1组)、对照组(第2组)、菌体给予组(第3、4组)共计4组。组名、饵、水、给予物(给予用量)、只数等如下所示。
·阴性组(第1组)：饵为“特殊AIN-93G”、水为“注射用水”、不给予、3只
·对照组(第2组)：饵为“特殊AIN-93G”、水为“以0.075重量％含有草酸2水合物的注射用水”、给予“溶液X”(10mL/kg)、7只
·菌体给予组(第3、4组)的每组均为：饵为“特殊AIN-93G”、水为“以0.075重量％含有草酸2水合物的注射用水”、7只。各组的给予菌体和给予量如下：
第3组：给予“L.gasseri 2727株的溶液X的悬浮液(1×109CFU/mL)”(10mL/kg)、
第4组：给予“L.amylovorus 2880株的溶液X的悬浮液(1×109CFU/mL)”(10mL/kg)。
〔正式饲养(试验)〕
将分组后的第二天开始作为试验期间，分别利用给水器使大鼠自由摄入“注射用水”饮用水(阴性组)和“以0.075重量％含有草酸2水合物的注射用水”饮用水(对照组、菌体给予组)7天。将该饮用水的给水开始日作为第1天、以后按照日期计算天数。菌体给予组的实验动物以1×1010CFU/10mL/kg强制经口给予上述菌体悬浮液。对照组以10mL/kg强制经口给予非菌体悬浮液的溶液X。
〔测定和检查等〕
·一般状态的观察和体重的测定
对于全部大鼠(全部组)从第1天至第8天每日连续观察给予时的一般状态，在第0天、第3天、第5天、第7天的上午9～10点定时测定体重。
·摄饵量和摄水量的测定
对于全部大鼠(全部组)在第3天(设定值)、第5天(残余值、设定值)、第7天(残余值)的上午9～10点定时测定摄饵量和摄水量。
·采集尿液和生化学检查
对于全部大鼠(全部组)在第0天、第3天、第5天、第7天采集24小时尿液。用2N盐酸将采集的尿的pH调节至5，为了避免草酸钙沉淀，每1L中加入0.5g的EDTA。按照实施例1中记载的方法通过HPLC测定得到的尿中的草酸值。另外，使用肌酐测定试剂盒(LABOASSAY肌酐(Jaffe法)(和光纯药))测定尿中肌酐。该方法按照说明书的指示通过微板法实施。
〔统计处理〕
结果用平均值±标准偏差表示，将对照组和菌体给予各组进行比较。对数值化了的检查值的分散比进行F检验，在等分散的情况下，进行Student′st-检验、在不等分散的情况下进行Aspin-Welch t-检验。统计处理使用excel统计2004的统计分析，将最低显著水平设为双侧5％。
〔结果〕
一般状态的结果示于表4，尿中草酸值/g(肌酐值)的变化情况示于图1。
关于给予乳酸菌所引起的尿中的草酸值的降低，如图1所示，在用溶液X悬浮的L.amylovorus OLL 2880给予组和L.gasseri OLL 2727给予组中可见显著性差异。关于一般状态，在对照组(第2组)和菌体给予组(第3组、第4组)之间可见显著性差异。
表4
  第1组   第2组   第3组   第4组
  试验期间中的体重增加量(g)   23.6±7.6   14.0±5.4   13.9±5.0   17.3±5.1
  试验期间中的摄饵量(g)   98.6±17.8   92.2±7.0   91.6±7.3   96.1±5.2
  试验期间中的摄水量(g)   124.3±20.3   96.8±9.3   98.4±11.4   103.3±5.8
产业上的可利用性
通过本发明，能够提供具有比以往已知的具有草酸分解活性的乳酸菌高数倍的草酸分解活性的乳酸菌。该乳酸菌、该乳酸菌的处理物以及含有该乳酸菌或该处理物的组合物能够用于治疗或预防与草酸相关的疾病，例如肾/尿路结石、贫血、骨质疏松症等，并能够用于制造草酸或草酸化合物降低了的组合物、草酸或草酸化合物的分解剂、以及用于用来分解草酸或草酸化合物的方法。另外，乳酸菌由于具有长期的食用经验，因此无论给予多长时间和给予多少量均能安全地摄入。

Claims (13)

1.一种乳酸菌，其为属于乳杆菌属的乳酸菌，其特征在于，在含有10mM草酸的培养液中、37℃、培养开始时的pH为6.5的条件下培养72小时时的草酸分解率为50％以上。
2.根据权利要求1所述的乳酸菌，其中，属于乳杆菌属的乳酸菌为格氏乳杆菌菌种或嗜淀粉乳杆菌菌种。
3.一种乳酸菌，其选自以下的(a)～(d)：
(a)乳酸菌格氏乳杆菌OLL203195株，其以保藏号：FERM BP-11005进行了保藏；
(b)乳酸菌嗜淀粉乳杆菌OLL2741株，其以保藏号：FERM BP-11007进行了保藏；
(c)乳酸菌嗜淀粉乳杆菌OLL2880株，其以保藏号：FERM BP-11006进行了保藏；和
(d)乳酸菌格氏乳杆菌OLL2727株，其以保藏号：FERM BP-11004进行了保藏。
4.权利要求1～3中的任一项所述的乳酸菌的处理物。
5.一种组合物，其含有权利要求1、2或3所述的乳酸菌、或权利要求4所述的处理物。
6.根据权利要求5所述的组合物，其用于治疗和/或预防肾/尿路结石。
7.根据权利要求5所述的组合物，其用于治疗和/或预防贫血。
8.根据权利要求5所述的组合物，其用于治疗和/或预防骨质疏松症。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的组合物，其为医药组合物。
10.根据权利要求5～8中任一项所述的组合物，其为食品组合物。
11.一种草酸或草酸化合物的分解剂，其含有权利要求1、2或3所述的乳酸菌、或权利要求4所述的处理物。
12.一种用来分解草酸或草酸化合物的方法，其包含使草酸或草酸化合物与权利要求1、2或3所述的乳酸菌、或权利要求4所述的处理物接触的工序。
13.一种草酸或草酸化合物降低了的组合物的制造方法，其包含使含有草酸或草酸化合物的组合物与权利要求1、2或3所述的乳酸菌、或权利要求4所述的处理物接触的工序。
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