ES2334608A1

ES2334608A1 - Metodo para la identificacion de compuestos potencialmente utiles en el tratamiento o la prevencion de enfermedades neurodegenerativas.

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Publication number: ES2334608A1
Application number: ES200702997A
Authority: ES
Inventors: Fernando Valdivieso Amate; Maria Jesus Bullido Gomez-Heras; Ana Martinez Garcia
Original assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2010-03-12
Anticipated expiration: 2027-11-13
Also published as: EP2221379A4; ES2334608B1; WO2009063110A1; EP2221379A1; US20100304384A1

Abstract

Método para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés de retículo endoplasmático o estrés oxidativo. La presente invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos productores o inhibidores de estrés de retículo endoplasmático o de estrés oxidativo. Dicho método se basa en la transformación de células de manera estable con un vector que exprese un gen reportero bajo el control del gen DDIT3 (también denominado CHOP). Este promotor comprende los nucleótidos del -1626 al +60 de dicho gen, habiendo dos variantes del mismo: -1507 C/G. Mientras que la variante-1507 C no se activa en condiciones de estrés oxidativo, la -1507 G responde a este estímulo de manera acusada. Por otro lado, ambos promotores se activan en situación de estrés de retículo endoplasmático, o en situación combinada de ambas condiciones.

Description

Método para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés de retículo endoplasmático o estrés oxidativo.

La presente invención se relaciona, en general, con un método para la identificación de compuestos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Dicho método se basa en un modelo celular de neurodegeneración útil para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades neurodegenerativas son procesos crónicos y progresivos que están caracterizados por pérdidas selectivas y simétricas de neuronas en los sistemas motor, sensorial y cognitivo. Estas enfermedades están creciendo alarmantemente en los países desarrollados debido a diversos factores, entre ellos, el paulatino envejecimiento de la población y los cambios en el estilo de vida. No existe todavía ningún tratamiento adecuado para dichas
enfermedades.

Estrés Oxidativo (EO)

Las especies reactivas de oxígeno (ROS, "reactive oxygen species"), tales como el radical de oxígeno superóxido (O^{2-}) o peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}), se producen durante los procesos metabólicos normales y realizan varias funciones útiles. Las células están dotadas con varios mecanismos para controlar los niveles de estos agentes oxidativos, por ejemplo, superóxido dismutasa (SOD), glutatión o vitamina E. En condiciones fisiológicas normales, existe un equilibrio entre ROS y estos mecanismos antioxidativos. Una producción excesiva de ROS y una pérdida de eficacia de las defensas antioxidativas pueden conducir a estrés oxidativo celular y por tanto, a estados patológicos en las células y provocar daño tisular. Este acontecimiento parece producirse de manera más espectacular en las neuronas, por su alta tasa de actividad metabólica, y por tanto, parece estar relacionado con una serie de procesos, enfermedades y síndromes degenerativos, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y esquizofrenia. Los tratamientos que conducen a una potenciación de los mecanismos antioxidativos pueden ralentizar la progresión de algunas de las enfermedades mencionadas.

Se sabe que durante el envejecimiento normal el cerebro sufre alteraciones morfológicas y funcionales que afectan a los árboles dendríticos, sinapsis, neurotransmisión, circulación y metabolismo, y estos cambios se ven reflejados en los sistemas motor y sensorial, en el sueño, memoria y aprendizaje. Entre los cambios neuronales producidos por la edad se incluyen la disminución de la homeostasis del Ca^{2+} y de la sensibilidad de los sistemas, dopaminérgico, colinérgico, opiáceo y de catecolaminas. Cada vez más, parece que en estas alteraciones tiene que ver una mayor susceptibilidad a los efectos a largo plazo del EO, disfunción mitocondrial (que aumenta con la edad) y daño por inflamación.

Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE)

El retículo endoplásmico (RE) es el lugar para la síntesis de proteínas y cambios postraduccionales para el correcto plegamiento de las proteínas, es la ruta de transporte común para suministrar proteínas a su destino apropiado dentro de la célula y es también un depósito de Ca^{2+}. La alta concentración de Ca^{2+} que hay en el lumen del RE respecto a la concentración en el citoplasma celular es importante tanto para señalización celular como para el correcto procesamiento de las proteínas de nueva síntesis. El RE ejerce el control de calidad sobre las proteínas, asegurando un procesamiento correcto del producto final que es crucial para el funcionamiento normal de la célula. Sólo las proteínas que por las modificaciones post-traduccionales se pliegan correctamente pasan al aparato de Golgi, mientras que aquéllas que no han terminado su plegamiento o están plegadas incorrectamente quedan retenidas en el RE para terminar el proceso o se señalizan para su degradación. Además de esta función de plegamiento de proteínas, el RE es el lugar de síntesis de esteroles y lípidos. Cualquier alteración en alguno de estos procesos es causa de ERE.

Distintas situaciones fisiológicas o patológicas que afecten al plegamiento proteico y/o a la homeostasis del Ca^{2+}, como privación de glucosa, infecciones virales o la expresión de proteínas mutantes incapaces de plegarse, pueden ser causa de ERE por acumulación de proteínas mal plegadas, y entonces se produce en las células una respuesta a este estrés, activándose la respuesta a proteínas no-plegadas (Unfolded Protein Response, UPR). El plegamiento de proteínas in vivo requiere una maquinaria de plegamiento en el RE que se puede sobrecargar, resultando en una acumulación de proteínas mal plegadas y entonces se activa la respuesta UPR para tratar de restablecer el estado normal en el RE.

En estos casos, se puede aumentar la capacidad de plegamiento del RE aumentando la expresión de su maquinaria de plegamiento y de chaperonas como BiP/GRP78 y GRP94 y aumentando el tamaño del RE y, por otro lado, disminuyendo la carga de proteínas mediante un silenciamiento de la traducción y transcripción y eliminando las proteínas mal plegadas y señalizadas como tal. Cuando estos mecanismos no son capaces de remediar la situación de estrés, el RE inicia una señal de alarma al sistema inmune vía NF-\kappaB, y un ERE excesivo y/o prolongado conduce al "suicidio celular", normalmente por un proceso apoptótico.

Un signo común de las enfermedades neurodegenerativas es la acumulación y los depósitos de proteínas con plegamiento erróneo que afectan a varias rutas de señalización que conducen finalmente a la muerte neuronal. Algunos autores consideran que el estrés del RE está relacionado con varias enfermedades neurodegenerativas tales como EA, EP, ELA, Huntington y encefalopatías espongiformes transmisibles (EET).

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos procedimientos para la identificación de compuestos terapéuticos para el tratamiento enfermedades neurodegenerativas, en particular, de enfermedades neurodegenerativas que cursan con estrés oxidativo y/o estrés de retículo endoplásmico y que conducen a la muerte neuronal.

Respuesta Integrada a Estrés (RIE)

Las células eucariotas responden a las proteínas mal plegadas en el RE, privación de aminoácidos o a condiciones oxidantes fosforilando de forma reversible al factor eIF2\alpha. Esta fosforilación inhibe la síntesis general de proteínas promoviendo la expresión de la isoforma 4 del factor activador de la transcripción (ATF4), y activando así la expresión de dianas implicadas en UPR, como Chop. Se trata de una Respuesta Integrada a Estrés (RIE) que regula el metabolismo de aminoácidos y la resistencia al estrés oxidativo; además de adaptar a las células a ERE. De esta manera, ante situaciones de estrés prolongado, la célula puede derivar hacia procesos apoptóticos y/o autofágicos.

Gen DDIT3 (DNA-Damage-Inducible Transcript 3)

El gen DDIT3, ( DNA-Damage-Inducible Transcript 3), también conocido como CHOP-10 (CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP) Homologous Protein -10), CHOP, CEBPZ (CEBP\zeta), GADD153 ( Growth Arrest and DNA-Damage inducible gene 153) o MGC4154 codifica para una proteína que se conoce habitualmente como Chop.

Chop es un factor de transcripción bZip que se activa en respuesta a agentes que alteren de algún modo la maquinaria de plegamiento del RE. Puede formar horno o heterodímeros con otros miembros de la familia C/EBP, pero los heterodímeros no se unen a los sitios clásicos de unión C/EBP, de tal forma que, desde el punto de vista de estos sitios diana, Chop es inhibidor de estos factores de transcripción. Sin embargo, los homodímeros de Chop sí son capaces de unirse a otras secuencias específicas diferentes de las clásicas C/EBP. Así, Chop tiene un papel dual inhibiendo la función de C/EBPs y activando otros genes diana diferentes. Se ha visto que la sobreexpresión de CHOP y la microinyección de la proteína Chop conduce a parada del ciclo celular y/o a apoptosis, mientras que ratones deficientes en este gen muestran apoptosis reducida en respuesta a ERE, y deficiencias en su expresión pueden proteger a las células de la apoptosis producida por ERE.

En las enfermedades neurodegenerativas se observa una acumulación de proteínas mal plegadas. En el caso de la EA, se ha observado que mutaciones en el gen PSEN1 aumentan los niveles de proteína Chop. De hecho, se ha observado que se da una respuesta al estrés exagerada en células con mutaciones en PSEN1, si bien este nivel de respuesta tan elevado se debía a una mayor traducción del mensajero Chop, más que a un mayor nivel de transcripción.

Compendio de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con un método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las etapas de:

a): poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa una construcción de ADN que comprende:

i): la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora; y

b): detectar la expresión del gen reportero;

en donde el compuesto ensayado es identificado como adecuado para el tratamiento o prevención de dicha enfermedad neurodegenerativa si provoca una variación en la expresión del gen reportero en sentido contrario a la alteración existente de los niveles de DDIT3 en la enfermedad neurodegenerativa en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto o si provoca una alteración en la expresión del gen reportero en el mismo sentido que la alteración que se desea conseguir en los niveles de DDIT3.

En otros aspectos adicionales, la presente invención se refiere a métodos para la identificación de compuestos que inducen o inhiben estrés de retículo endoplásmico y/o estrés oxidativo en una célula.

La presente invención se refiere además a un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer una enfermedad neurodegenerativa, o para determinar el estadio o severidad de la enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha enfermedad, que comprende determinar la presencia o ausencia del polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 de DDIT3 en una muestra biológica de dicho sujeto.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende introducir en una célula una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Por otro lado, la presente invención se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma así como con un vector de expresión, con una célula y con un animal no-humano que comprenden dicha construcción.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la actividad transcripcional del promotor de DDIT3 en células SK-N-MC transfectadas transitoriamente con las dos construcciones pXP2 DDIT3(-1507C) - Luciferasa (panel A) y DDIT3(-1507G) - Luciferasa (panel B). Se muestra en cuentas (x10^{-3}) por mU de \beta-galactosidasa en distintas condiciones de cultivo: basales (aspa), EO (triángulo), ERE (cuadrado) y RIE (círculo). Los datos mostrados se obtienen de la media y errores estándares de 7 experimentos de cinética por triplicado.

La Figura 2 muestra la actividad transcripcional del promotor de DDIT3 en células SK-N-MC transfectadas establemente con las dos construcciones pXP2 DDIT3(-1507C) - Luciferasa (panel A) y DDIT3(-1507G) - Luciferasa (panel B). Se muestra en cuentas (x10^{-3}) normalizado por el número de células en distintas condiciones de cultivo: basales (aspa), EO (triángulo), ERE (cuadrado) y RIE (círculo). Los datos mostrados se obtienen de la media y errores estándares de 7 experimentos de cinética por triplicado.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han puesto de manifiesto que cuando se transfecta de forma estable una línea celular con una construcción de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos del promotor del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 acoplada operativamente a un gen reportero, dicha línea celular puede ser particularmente útil para su uso en métodos de screening para la identificación de compuestos que activan o que inhiben la expresión del gen diana y por tanto, para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa asociada a una expresión deficiente de DDIT3.

Tal como aquí se utiliza, el término "enfermedad neurodegenerativa" se refiere a una enfermedad asociada con una pérdida progresiva y específica de neuronas (muerte neuronal), por ejemplo, la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme (BSE), síndrome de cocaína, degeneración Corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades por priones, la enfermedad de Refsum's, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, Tabes dorsalis, la enfermedad inflamatoria cerebral, etc.

Asimismo, los inventores han observado que, sorprendentemente, se produce una capacidad de respuesta a estímulos diferente en función de la variante alélica del promotor del gen DDIT3 presente. Así, los inventores han observado que en el caso de que dicha secuencia presente el polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 (variante -1507G) se produce una respuesta significativa a estrés oxidativo, mientras que dicha respuesta a estrés oxidativo no se observa cuando la secuencia del promotor comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 (variante -1507C). Por otro lado, los inventores han observado una mayor respuesta a estrés de retículo endoplásmico en el caso de que la variante alélica del promotor es la variante -1507C.

El término "estrés oxidativo" (EO), tal como aquí se emplea, se refiere a una alteración celular caracterizada por una producción excesiva de ROS y una pérdida de eficacia de las defensas antioxidativas que conduce a estados patológicos en las células y provoca daño tisular.

El término "estrés de retículo endoplásmico" (ERE), tal como aquí se emplea, se refiere a una alteración en la función del RE que conduce a la acumulación de proteínas no plegadas dentro del mismo, induciendo un estado denominado generalmente como estrés del RE (ERE).

Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para la identificación de compuestos potencialmente útiles para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que comprende las etapas de:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

y

b): detectar la expresión del gen reportero;

Así, el método de la invención comprende la etapa de detectar la expresión de un gen. El experto en la materia advertirá que existen técnicas convencionales para determinar los niveles de expresión de un gen determinado en una determinada célula o muestra biológica tales como las RT-PCR, Northern blot y similares para determinar la expresión del ARNm o distintos tipos de inmunoensayos (Western blot, ELISA, RIA, inmunoprecipitación y similares) para determinar la expresión de la proteína.

En una forma preferida de realización, la alteración existente de los niveles de DDIT3 en la enfermedad neurodegenerativa, y por tanto, la alteración en la expresión del gen reportero de DDIT3, es un aumento y, consiguientemente, el cambio de expresión en el gen reportero que es indicativa de que el compuesto candidato puede ser usado para el tratamiento o prevención de dicha enfermedad es una disminución de expresión.

En una primera etapa, el método de la invención implica poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza. Por "célula" se entiende, en el contexto de la presente invención, cualquier célula en donde el promotor del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma puede promover la expresión de un gen operativamente acoplado a dicho promotor. En general, la expresión de un gen a través de un promotor requiere la presencia de factores de transcripción capaces de reconocer secuencias de unión en dicho promotor. Así, las células que pueden ser objeto de la presente invención incluyen todas aquellas células que expresen los factores de transcripción necesarios para la activación transcripcional del promotor objeto de estudio. Aunque es posible reconstituir la expresión de dichos reporteros en células de muy distinto origen, es preferible el uso de células que expresan dichos factores de transcripción de forma endógena y constitutiva. Así, en una forma preferida de realización, las células objeto de estudio incluyen células eucariotas superiores, preferentemente células de mamíferos. La invención contempla el uso de cualquier tipo de célula en la que se pueda introducir un vector de expresión. Así, es posible la utilización de células embrionarias (oocitos, células de esperma. células troncales embrionarias), células adultas, células no diferenciadas (células fetales, células tumorales), células diferenciadas, células en división, células senescentes, células en cultivo y similares. En una forma preferida de realización, la célula que se usa en el método de la invención es una célula SK-N-MC, correspondiente a una línea celular de neuroblastoma humano.

Una vez que se ha seleccionado la célula en la que se va a expresar la construcción de ADN, es necesario incorporar de forma estable en dicha célula la construcción de ADN que comprende el promotor del gen objeto de estudio operativamente acoplado a un gen reportero. Por "promotor" se entiende, en el contexto de la presente invención, una región de ADN a la que se une la ARN polimerasa y que, por tanto, permite la transcripción de genes que se encuentran asociadas operativamente al mismo. La presente invención contempla el uso de la secuencia de nucleótidos del promotor del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 así como de una variante funcionalmente equivalente de la misma. Los inventores han observado que dicha secuencia promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 es capaz de inducirse ante estrés de retículo endoplásmico. Así, por "variante funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 1" se entiende todas aquellas secuencias derivadas de la secuencia de SEQ ID NO: 1 mediante modificación, inserción y/o deleción de uno o más nucleótidos, siempre y cuando se mantenga sustancialmente la capacidad de inducir la expresión del gen que se encuentra operativamente acoplado a dicha secuencia ante una situación de estrés celular, en particular de tipo estrés de retículo endoplásmico. Por mantener "sustancialmente" dicha capacidad de inducir la expresión de dicho gen se entiende que dicha variante mantiene una actividad promotora de, al menos, 1,5 veces la expresión basal respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización particular, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

El polimorfismo rs3847699, identificado en la SEQ ID NO: 2, es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen DDIT3 que comprende una transversión de Citosina (C) a Guanina (G) en el nucleótido 120 de la secuencia SEQ ID NO: 1. Los inventores han observado que un promotor que comprende la secuencia de nucleótidos identificado en la SEQ ID NO: 2, es capaz de inducirse tanto por estrés de retículo endoplásmico como por estrés oxidativo. Así, por "variante funcionalmente equivalente de la SEQ ID NO: 2" se entiende todas aquellas secuencias derivadas de la secuencia de SEQ ID NO: 2 mediante modificación, inserción y/o deleción de uno o más nucleótidos, siempre y cuando mantenga el polimorfismo identificado anteriormente y siempre y cuando se mantenga sustancialmente la capacidad de inducir la expresión del gen que se encuentra operativamente acoplado a dicha secuencia ante una situación de estrés celular, en particular de tipo estrés oxidativo. En una forma preferida de realización, dicha variante funcionalmente equivalente es una variante que responde ante estrés de retículo endoplásmico y estrés oxidativo. Por mantener "sustancialmente" dicha capacidad de inducir la expresión dicho gen se entiende que dicha variante mantiene una actividad promotora de, al menos, 1,5 veces la expresión basal respecto a la secuencia SEQ ID NO: 2.

El experto en la materia advertirá que secuencias funcionalmente equivalentes a las regiones promotoras anteriormente indicadas se pueden obtener siempre y cuando las regiones esenciales dentro de dichas secuencias responsables de la unión de los factores de transcripción se mantengan intactas. El experto en la materia apreciará que los sitios de unión en la regiones promotoras objeto de la invención incluyen aquellos que pueden determinarse mediante comparación con bases de sitios de unión de factores de transcripción tales como TFSEARCH (Heinemeyer, T. et al., 1998, Nucleic Acid Res., 26:364-370).

La secuencia de nucleótidos del promotor de DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 o la variante funcionalmente equivalente de la misma se encuentra acoplado de forma operativa a un gen reportero cuya expresión se pueda detectar con facilidad. Genes reporteros que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen luciferasa, proteína verde fluorescente (GFP) y variantes de la misma que emiten fluorescencia a distintas longitudes de onda (por ejemplo, DS-Red o proteína fluorescente roja), cloranfenicol acetiltransferasa, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano. En una realización particular, dicho gen reportero es el gen que codifica para la luciferasa.

Una vez construido el gen quimérico que comprende el promotor de DDIT3 y el gen reportero, éste debe introducirse en una célula hospedadora. La construcción de ADN se introduce en las células objeto de estudio usando cualquiera de los métodos de transfección conocidos para el experto en la materia (véase secciones 9.1 a 9.5 en Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ringbou edition, 2003). En particular, las células se pueden transfectar mediante co-precipitación de ADN con fosfato cálcico, DEAE-dextrano, polibreon, electroporación, microinyección,

\hbox{fusión mediada por liposomas,
lipofección, infección por retrovirus y  transfección
biolística.}

En una realización particular de la invención, dicha célula hospedadora expresa de forma transitoria dicha construcción de ADN. En otra realización particular, dicha célula expresa de forma estable dicha construcción de ADN. Así, con el fin de obtener expresión estable de la construcción de ADN objeto de la invención, es necesario incluir en la transfección un gen que codifique para resistencia a un determinado antibiótico, de forma que se puedan seleccionar aquellas líneas celulares que han incorporado el ADN en el genoma de aquellas líneas celulares en las que el ADN se encuentra en posición extracromosómica. El gen que permite seleccionar las células se puede aportar formando parte del mismo vector que contiene la construcción objeto de la invención o, alternativamente, se puede aportar separadamente mediante co-transfección con un segundo plásmido que contiene dicho gen de resistencia. En este último caso, el plásmido que contiene la construcción de ADN se aporta a la mezcla de transfección en un exceso molar con respecto al gen de resistencia de forma que por cada evento de integración del gen de resistencia exista una alta probabilidad de integración del gen que contiene el promotor objeto de estudio. Preferiblemente, el plásmido que contiene la construcción de ADN se aporta en un exceso de al menos 5 veces con respecto al vector que contiene el reportero de resistencia.

Marcadores de resistencia adecuados para seleccionar líneas celulares que han integrado la construcción en el genoma incluyen marcadores de selección positiva como por ejemplo el gen de resistencia a geneticina, el gen de resistencia a la neomicina, que confiere resistencia al aminoglucósido G418, el gen de la higromicina fosfotransferasa que confiere resistencia a higromicina, el gen ODC, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa (2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO), el gen de la dihidrofolato reductasa que confiere resistencia a metrotexato, el gen de la puromicina-N-acetil transferasa, que confiere resistencia a puromicina, el gen ble que confiere resistencia a zeocina, el gen de la adenosina deaminasa que confiere resistencia a 9-beta-D-xilofuranosil adenina, el gen de la citosina deaminasa, que permite a las células crecer en presencia de N-(fosfonacetil)-L-aspartato, timidina kinasa, que permite a las células crecer en presencia de aminopterina, el gen de Xantina-guanina fosforibosiltransferasa, que permite a las células crecer en presencia de xantina y ausencia de guanina, el gen trpB de E. coli que permite a las células crecer en presencia de indol en lugar de triptófano, el gen hisD de E. coli, que permite a las células el usar histidinol en lugar de histidina. El gen de selección se incorpora en un plásmido que puede incluir, adicionalmente, un promotor adecuado para la expresión de dicho gen en células eucariotas (por ejemplo, los promotores CMV o SV40), un sitio optimizado de iniciación de la traducción (por ejemplo un sitio que sigue las denominadas reglas de Kozak o un IRES), un sitio de poliadenilación como, por ejemplo, el sitio de poliadenilación del SV40 o de la fosfoglicerato quinasa, intrones como, por ejemplo, el intrón del gen de la beta-globulina.

El proceso de selección de células que contienen la construcción de ADN de interés integrada de forma estable en el genoma se lleva a cabo mediante un proceso de selección convencional (véase por ejemplo Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology (1997) 9.5.1-9.5.19). Para ello, se transfectan las células con el vector o mezclas de vectores y, tras un periodo de recuperación, se dejan crecer en un medio selectivo (bien un medio que contiene al antibiótico frente al que el reportero confiere resistencia o bien un medio mínimo que contiene el antimetabolito frente al cual el reportero confiere resistencia). Las colonias celulares que crecen en medio selectivo se aíslan y se vuelven a dejar crecer en medio selectivo. Una vez que se han obtenido células que son capaces de crecer durante repetidos ciclos de proliferación en presencia del marcador de selección, puede ser conveniente el eliminar dicho marcador de las células, particularmente si las células van a ser transfectadas con otro marcador de selección. Para ello, se pueden usar recombinasas, en particular el sistema Cre/Lox. Alternativamente, es posible amplificar el número de copias del marcador de selección, lo que resulta en una amplificación simultánea del número de copias del gen de interés con el consiguiente aumento de su expresión. Para ello, las células se hacen crecer en presencia de concentraciones progresivamente superiores de agente de selección, lo que resulta en una selección de las células que han sufrido una amplificación de los genes que confieren resistencia a tal agente y, normalmente, de las regiones adyacentes o intermedias. Preferiblemente se usa DHFR como marcador de selección y la selección de líneas celulares en las que existe una amplificación de dicho gen se lleva a cabo en presencia de geneticina.

Normalmente, se considera que una célula expresa un marcador de forma estable cuando la expresión de dicho marcador no disminuye con sucesivos ciclos de proliferación, independientemente de la presencia en el medio de cultivo de agente de selección.

Una vez que se dispone de una línea celular que ha integrado en su genoma de forma estable la construcción de ADN de acuerdo a la invención, la célula se pone en contacto con un compuesto o preparación cuyo efecto sobre la transcripción del gen reportero se desee estudiar. Por "poner en contacto" una célula con el compuesto candidato se incluye, según la presente invención, cualquier posible forma de llevar el compuesto candidato hasta el interior de la célula que expresa la construcción de ADN. Así, en caso de que el compuesto candidato sea una molécula de bajo peso molecular, es suficiente con añadir dicha molécula al medio de cultivo. En caso de que el compuesto candidato sea una molécula de alto peso molecular (por ejemplo, polímeros biológicos tales como un ácido nucleico o una proteína), es necesario aportar los medios para que esa molécula pueda acceder al interior celular. En caso de que la molécula candidata sea un ácido nucleico, pueden usarse métodos convencionales para transfección, según se ha descrito anteriormente para la introducción de la construcción de ADN. En caso de que el compuesto candidato sea una proteína, la célula puede ponerse en contacto tanto con la proteína directamente como con el ácido nucleico que la codifica acoplado a elementos que permitan su transcripción/traducción una vez que se encuentren en el interior celular. Para ello, se pueden usar cualquiera de los métodos mencionados anteriormente para permitir su entrada al interior celular. Alternativamente, es posible poner en contacto la célula con una variante de la proteína que se desea estudiar que ha sido modificada con un péptido que sea capaz de promover la translocación de la proteína al interior celular, tales como el péptido Tat derivado de la proteína TAT de HIV-1, la tercera hélice del homeodominio de la proteína Antennapedia de D. melanogaster, la proteína VP22 del virus del herpes simplex y oligómeros de arginina (Lindgren, A. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci, 21:99-103, Schwarze, S.R. et al., 2000, Trends Pharmacol. Sci., 21:45-48, Lundberg, M et al., 2003, Mol. Therapy 8:143-150 y Snyder, E.L. y Dowdy, S.F., 2004, Pharm. Res. 21:389-393).

En un caso particular, el compuesto a ensayar no se encuentra aislado sino que se encuentra formando parte de una mezcla más o menos compleja bien derivada de una fuente natural o bien formando parte de una biblioteca de compuestos. Ejemplos de bibliotecas de compuestos que pueden ser ensayadas según el método de la presente invención incluyen, sin limitación, bibliotecas de péptidos incluyendo tanto péptidos como análogos peptídicos que comprenden D-amino ácidos o péptidos que comprenden enlaces no peptídicos, bibliotecas de ácidos nucleicos incluyendo ácidos nucleicos con enlaces no fosfodiester del tipo de fosforotioato o ácidos nucleicos peptídicos, bibliotecas de anticuerpos, de carbohidratos, de compuestos de bajo peso molecular, preferiblemente moléculas orgánicas, de peptidomiméticos, y similares. En el caso de que se use una biblioteca de compuestos orgánicos de bajo peso molecular, la biblioteca puede haber sido preseleccionada para que contengan compuestos que puedan acceder al interior celular con mayor facilidad. Así, los compuestos de pueden seleccionar en base a determinados parámetros tales como tamaño, lipofilicidad, hidrofilicidad, capacidad de formar puentes de hidrógeno.

En caso de que el compuesto candidato se encuentre formando parte de una mezcla de mayor o menor complejidad, el método de la invención comprende adicionalmente una o varias etapas (c) de fraccionamiento de la mezcla ensayada y la repetición de los pasos (a), (b) y (c) con cada una de las fracciones obtenidas hasta que se aísla el compuesto en la mezcla que es adecuado para el tratamiento o la prevención de la enfermedad neurodegenerativa. Métodos para el fraccionamiento de compuestos presentes en una mezcla incluyen cromatografia (en capa fina, de gases o de exclusión molecular en gel, de afinidad), cristalización, destilación, filtración, precipitación, sublimación, extracción, evaporación, centrifugación, espectrometría de masas, adsorción y similares. Alternativamente, los compuestos a ensayar pueden estar formando parte de un extracto obtenido de una fuente natural. La fuente natural puede ser animal, vegetal obtenido de cualquier entorno, incluyendo, sin limitación, extractos de organismos terrestres, aéreos, marinos y similares.

En una segunda etapa, el método de la invención incluye la determinación de la actividad de la proteína codificada por el gen reportero. Preferiblemente, a la vez que se lleva a cabo la determinación de la actividad del gen reportero en presencia de los compuestos a ensayar, es necesario efectuar determinaciones en paralelo de la actividad transcripcional basal en presencia de únicamente el medio de cultivo y/o del vehículo en el que se encuentra disuelto el compuesto a ensayar o en el que se han preparado los extractos a ensayar. Generalmente, aquellos compuestos o extractos con actividad promotora de la transcripción se manifestarán porque darán valores superiores a 1 de la relación entre actividad transcripcional en presencia del compuesto o del extracto candidato y en presencia de vehículo. Preferiblemente, se considerarán compuestos o extractos positivos aquellos en los que la relación de actividad del gen reportero sea de al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 y hasta 100.

El método de detección de la expresión del gen reportero implica la puesta en contacto de las células con un compuesto que puede generar un producto coloreado o fluorescente en presencia del producto codificado por el gen reportero. Así, si la enzima es la fosfatasa alcalina, se pueden usar substratos cromogénicos del tipo del p-nitrofenil fosfato (p-NPP), 5-bromo-4cloro 3-indolil fosfato/tetrazolio nitroblue (BCIP/NPT), Fast-Red/naftol-AS-TS fosfato o substratos fluorogénicos del tipo de 4-metilumbeliferil fosfato (4-MUP), 2-(5'-cloro-2'-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), 3,6-fluoresceína difosfato (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR o sales de diazonio de Fast Red Violet LB.

Si el gen reportero codifica una peroxidasa, se pueden usar substratos cromogénicos del tipo de 2,2-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), o-fenilenediamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-amino salicílico, ácido 3-dimetilamino benzoico (DMAB) y 3-metil-2-benzotiazolinhidrazona (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) y 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) o substratos fluorogénicos del tipo del ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacetico, fenoxazines reducidas y benzotiazines reducidas, incluyendo los reactivos Amplex® Red y Arnplex U1traRed y los dihidroxantenos reducidos.

Si el gen reportero codifica una glucosidasa, se pueden usar substratos cromogénicos del tipo de o-nitrofenil-\beta-D-galactosido (o-NPG), p-nitrofenil-\beta-D-galactosido y 4-metilumbeliferil-\beta-D-galactosido (MUG) para la \beta-D-galactosidasa y substratos fluorogénicos del tipo de la resorufina beta-D-galactopiranosido, digalactosido de fluoresceína (FDG), diglucurónido de fluoresceína, 4-metilumbeliferil beta-D-galactopiranosido, carboxiumbeliferil beta-D-galactopiranosido y beta-D-galactopiranosido de cumarina. En una forma preferida de realización, el gen reportero codifica para la luciferasa y la detección se efectúa midiendo la luminiscencia emitida por dicha enzima en presencia de ATP. La luminiscencia se determina usando kits comerciales, como por ejemplo, el kit de enhanced luciferase assay (Analytical Luminescence Laboratory, MI).

En una forma de realización preferida, el método de la invención se utiliza para identificar compuestos adecuados para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa en donde dicha enfermedad se caracteriza por un aumento en la expresión del gen DDIT3 y en donde el cambio de expresión en el gen reportero es una disminución de la expresión de dicho gen DDIT3.

Como se ha mencionado anteriormente, los inventores han observado que, sorprendentemente, se produce una capacidad de respuesta a estímulos diferente en función de la variante alélica (-1507C ó -1507G) del promotor del gen DDIT3 analizada. Así, en el análisis funcional del polimorfismo de la región promotora de DDIT3 los inventores han observado una respuesta a EO en el caso de la variante -1507G (SEQ ID NO: 2) que no se observa para la variante -1507C (SEQ ID NO: 1), y una respuesta a ERE mayor en el caso de la variante -1507C.

Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inducen estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de:

a): poner en contacto una célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

y

b): detectar la expresión del gen reportero;

en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

Los inventores han observado que, aunque la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 responde más a ERE que la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2, ambas responden a este tipo de estrés celular. Por tanto, en una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inducen estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de:

i): la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

y

b): detectar la expresión del gen reportero;

\quad: en donde el compuesto ensayado es identificado como inductor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es un aumento de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

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El término "variante funcionalmente equivalente" tal como aquí se emplea se refiere a cualquier variante de la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2 que mantiene la capacidad de dicho promotor de inducirse por estrés oxidativo.

Asimismo, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de:

a): poner una célula en condiciones de estrés de retículo endoplásmico, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora;

b): poner en contacto dicha célula con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza; y

c): detectar la expresión del gen reportero;

\quad: en donde el compuesto ensayado es identificado como inhibidor de dicho estrés si provoca una variación en la expresión del gen reportero donde el cambio es una disminución de expresión en comparación con la alteración de la expresión en ausencia de dicho compuesto.

Como se ha mencionado anteriormente, aunque la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 1 responde más a ERE que la región promotora del gen DDIT3 identificada en la SEQ ID NO: 2, ambas responden a este tipo de estrés celular. Por tanto, en una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

Para llevar a cabo la etapa (a) del método, es decir, para poner una célula en condiciones de estrés de retículo endoplásmico, el método de la invención incluye cualquier forma posible de llevar dicha célula a una condición de estrés de retículo endoplásmico. Como se ha mencionado anteriormente, existen distintas situaciones fisiológicas o patológicas que pueden afectar al plegamiento proteico y/o a la homeostasis del Ca^{2+}, como privación de glucosa, infecciones virales o la expresión de proteínas mutantes incapaces de plegarse y que pueden ser causa de ERE. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha condición de estrés se alcanza mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas. En una realización más particular, dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de:

a): poner una célula en condiciones de estrés de estrés oxidativo, en donde dicha célula expresa de forma estable una construcción de ADN que comprende:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora;

c): detectar la expresión del gen reportero;

Para llevar a cabo la etapa (a) del método, es decir, para poner una célula en condiciones de estrés oxidativo, el método de la invención incluye cualquier forma posible de llevar dicha célula a una condición de estrés oxidativo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos que inducen estrés oxidativo en una célula y que pueden ser empleados en la etapa (a) del presente método incluyen agentes reactivos de tiol como el óxido de fenilarsina, arsenito de sodio, cloruro de mercurio, cloruro de cadmio, cloruro de zinc, generadores de radicales libres como el peróxido de hidrógeno, el hidroperóxido de t-butilo, el hidroperóxido de cumeno, etc. Como se ha mencionado anteriormente, especies reactivas de oxígeno (ROS) someten al organismo a un estrés oxidativo. A modo ilustrativo, no limitativo, dicha condición de estrés se alcanza mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido. En una realización más particular, dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.

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En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o para determinar la predisposición de un sujeto a padecer una enfermedad neurodegenerativa, o para determinar el estadio o severidad de la enfermedad en un sujeto, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un sujeto con dicha enfermedad, que comprende determinar la presencia o ausencia del polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 del gen DDIT3 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de dicho polimorfismo es indicativo de dicha enfermedad, o de mayor predisposición de dicho sujeto a padecer dicha enfermedad, o de mayor severidad de la enfermedad, o de la no respuesta a la terapia en relación con un sujeto que no presenta dicho polimorfismo.

Según aquí se emplea, el término "polimorfismo" se refiere a una variación en la secuencia de nucleótidos de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una misma población. El polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen DDIT3 que comprende una transversión de Citosina (C) a Guanina (G). En una realización más particular, dicho polimorfismo se identifica con el código dbSNP rs3847699.

La detección del polimorfismo en el gen DDIT3 en el método de la invención, puede realizarse por mediante múltiples procedimientos conocidos por el experto en la materia, los cuales implican el aislamiento del ácido nucleico de una muestra biológica procedente del sujeto que se quiere evaluar.

El aislamiento del ácido nucleico de la muestra biológica puede realizarse por procedimientos conocidos por el experto en la materia. Dichos procedimientos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cols., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3^{rd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.

Además, la presente invención no está limitada por la fuente de ácido nucleico, sino que la muestra biológica puede comprender sangre, saliva, fluido amniótico, tejido, etc. Así, en una realización particular de la invención, la muestra biológica procedente del sujeto es una muestra de tejido que comprende un ácido nucleico, preferentemente, ADN o ARN.

Posteriormente al aislamiento del ácido nucleico, se procede a la detección del polimorfismo. Sistemas y métodos para la detección de polimorfismos asociados a genes incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación y tecnología array (e.g. tecnología disponible de Aclara BioSciences, Affymetrix, Agilent Technologies, Inc., etc), métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (e.g. TAQMAN, Applera Corp., GENECODE system, Erigen, etc.), ensayos de extensión de círculo rodante, ensayos de excisión invasiva, uso de espectroscopia de masas, ensayos de hibridación empleando una sonda complementaria al polimorfismo, ensayo de extensión de cebadores, métodos de escisión enzimática, NASBA, métodos de hibridación en sándwich, métodos que emplean marcadores moleculares, reacción en cadena de la ligasa y similares. Métodos de llevar a cabo la detección de polimorfismos se describen en Sambrook y cols., 2001 (citado at supra) y en la solicitud de patente US2007/0105128.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma. Dicha construcción génica de la invención comprende, además, elementos que regulan la expresión de dicha secuencia de ADN. Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores. Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición 5' con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la expresión de genes cuando se encuentran en posición 5' o 3' con respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un intrón. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores, secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento para los intrones, codones de terminación, secuencias señales, sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de poliadenilación.

En una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

Ventajosamente, dicha construcción génica comprende, adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de un gen de interés operativamente unida. Dicho gen puede ser, por ejemplo, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que posteriormente permita la selección de una célula hospedadora transformada, transfectada o infectada con dicha construcción o con un vector de expresión que comprenda dicha construcción génica. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos marcadores incluyen genes de resistencia a antibióticos, genes de resistencia a compuestos tóxicos, y, en general, todos aquellos que permitan seleccionar a las células transformadas genéticamente.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector de expresión que comprende una construcción génica de la invención que está operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicha construcción génica. El experto en la materia advertirá que el tipo de vector adecuado para la expresión de los ácidos nucleicos y construcciones génicas de la invención dependerá de la célula en el que se desee expresar dicha construcción génica. El vector de la invención puede ser utilizado para transformar, transfectar o infectar células susceptibles de ser transformadas, transfectadas o infectadas por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que comprende una construcción de la invención o un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha podido ser transformada, transfectada o infectada con una construcción o vector proporcionado por esta invención. Células transformadas, transfectadas o infectadas pueden ser obtenidas por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. En una realización particular, dicha célula hospedadora es una célula animal transfectada o infectada con un vector apropiado.

Células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas, levaduras y células eucariotas. En una realización particular, dicha célula se selecciona entre una célula de mamífero, una célula vegetal, una levadura y una bacteria. Las células hospedadoras preferidas son células eucariotas. En una realización preferida de la invención, dicha célula es una célula de una línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula que expresa una construcción génica que comprende

(i): la región promotora del gen DDIT3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

(ii): un gen de interés acoplado operativamente a dicha región promotora.

En otra realización particular, dicha célula es una célula de una línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una célula de la invención para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa que cursa con niveles alterados de DDIT3 o en la que es necesario alterar los niveles de DDIT3. Según se ha mencionado anteriormente, una célula que comprende una construcción o un vector de la invención, puede ponerse en contacto con un compuesto candidato en cualquier grado de pureza y, por tanto, puede emplearse para la identificación de compuestos para el tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa.

En una realización particular, dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo formado por la enfermedad de Alexander, la enfermedad de Alper, esclerosis lateral amiotrófica, Ataxia telangiectasia, la enfermedad de Batten, encefalopatía espongiforme (BSE), síndrome de cocaína, degeneración Corticobasal, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la enfermedad de Huntington, demencia asociada a VIH, la enfermedad de Kennedy, la enfermedad de Krabbe, demencia de cuerpos Lewy, la enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis múltiple, atrofia sistémica múltiple, Neuroborreliosis, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, la enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, Prion diseases, la enfermedad de Refsum's, la enfermedad de Sandhoff, la enfermedad de Schilder, esquizofrenia, la enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten, ataxia espinocerebelar, atrofia muscular espinal, la enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, Tabes dorsalis y la enfermedad inflamatoria cerebral.

Las construcciones, los vectores o las células descritos de la invención pueden emplearse para obtener un animal no-humano transgénico que presenta, insertada en su genoma, la secuencia de nucleótidos de la construcción de la invención. Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un animal transgénico que comprende la construcción de la invención.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un animal no-humano transgénico, en adelante animal no-humano transgénico de la invención, que contiene, insertado en su genoma, una construcción de la invención. En una realización particular de la invención, el animal no-humano transgénico de la invención es un vertebrado, mamífero, preferiblemente un roedor, más preferiblemente un ratón o una rata. En otra realización particular de la invención, dicho animal no-humano es un pez.

El animal no-humano transgénico de la invención puede presentar cualquier fondo genético de los conocidos en el estado de la técnica por el experto en la materia, es decir, dicho animal no-humano transgénico puede proceder de un animal tipo salvaje (wt) o bien de un animal no-humano con un fondo genético que incorpore algún marcador molecular relacionado, directa o indirectamente, con una enfermedad neurodegenerativa.

DDIT3 es un factor de transcripción que se activa en respuesta a agentes que inducen estrés celular, en particular estreses que alteran la maquinaria de plegamiento del RE y factores que causan estrés oxidativo. Por tanto, dicho promotor puede emplearse en la expresión de un gen de interés de forma regulada, tal como un sistema inducible de expresión de proteínas.

Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende:

a): introducir en una célula una construcción que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés;

b): someter la célula a condiciones que generan estrés de retículo endoplásmico y, opcionalmente,

c): recuperar de la célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.

El término "variante funcionalmente equivalente" tal como aquí se emplea se refiere a una variante que responda o se induzca bajo condiciones de estrés de retículo endoplásmico. Así, en una realización particular de la invención, dicha variante funcionalmente equivalente es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

En una realización particular, dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas. Más particularmente, dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.

En otro aspecto la invención se relaciona con un método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende:

a): introducir en una célula una construcción que comprende que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcionalmente equivalente de la misma en donde dicha secuencia se encuentra operativamente acoplada a dicho gen de interés,

b): someter la célula a condiciones que generan estrés oxidativo y, opcionalmente,

c): recuperar de dicha célula el producto resultante de la expresión del gen de interés.

En una realización particular de la invención, dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido en la célula. En una realización preferida, dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.

En lo siguiente, la presente invención se explica adicionalmente mediante ejemplos. En ningún caso deberá ser interpretado como una limitación del ámbito de la invención tal y como se define en las reivindicaciones.

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Ejemplo 1

I. Materiales y métodos 1. Plásmidos y clonajes

El promotor de DDIT3 amplificado por PCR se subclona en pcDNA3, de Invitrogen y posteriormente se clona en el plásmido pXP2 que no tiene actividad promotora per se (Nordeen, S.K. (1988) "Luciferase reporter gene vectors for analysis of promoters and enhancers". Biotechniques 6(5): 454-8). El plásmido que se empleó como control en los experimentos de transfección transitoria fue la construcción pSV-\beta-galactosidasa, de Promega.

1.1. Clonaje de la región promotora del gen DDIT3 (variante -1507 C) en un plásmido conteniendo un gen "reporter"

Para el gen de DDIT3 se amplificó por PCR la región correspondiente a los nucleótidos -1626 a +60, tomando como +1 el inicio de la transcripción (nucleotidos 20059232 a 20027547 de la secuencia de referencia NT_029419 de la base de datos del NCBI) a partir de ADN genómico de un individuo que presentaba la forma alélica - 1507C. Dicha región del promotor del gen DDIT3 amplificada corresponde con la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1.

Los oligonucleótidos para la PCR (Invitrogen) incluyen sendas dianas de restricción para facilitar el clonaje creando tras la restricción sendos extremos cohesivos (indicadas como texto subrayado) y unas colas para facilitar el corte por la enzima de restricción de la diana (en minúsculas):

Chop-PromU: 5' cta gta get tgg atC CGG CCT TGT GAC AGT TTC T 3': (SEQ ID NO: 3)

Chop-PromL: 5' tat aca cta caa gct TGC CAC CCG CTC ATC TTT 3': (SEQ ID NO: 4)

Se utilizaron las siguientes condiciones de PCR (reactivos de Biotools, excepto los nucleótidos, de Applied Biosystems): 50 ng de ADN genómico se incubaron con 75 mM de Tris HCl, pH 9.0, 1 mM de Cl_{2}Mg, 1 unidad de Taq polimerasa, 200 \muM de nucleótidos y 0,8 \muM de oligonucleótidos, en un programa de PCR que incluía una desnaturalización inicial a 94ºC 5 minutos, 40 ciclos de 94ºC 30 segundos, 55ºC 30 segundos y 72ºC 1 minuto y una elongación final de 72ºC 10 minutos, en el termociclador GeneAmp PCR System 9600, de Perkin Elmer.

Los productos amplificados se purificaron con el "QIAquick® PCR Purification kit", de Qiagen, se sometieron a digestión enzimática durante 16 horas a 37ºC en tampón 2 (New England Biolabs) con 10 unidades de BamHI (New England Biolabs) y de HindIII (promotor de DDIT3) y estos amplificados digeridos se purificaron de banda con el "QIAquick Gel Extraction kit", de Qiagen.

Posteriormente, el promotor digerido y purificado se insertó en el plásmido pcDNA3, que previamente había sido digerido y purificado de la misma manera que el promotor correspondiente, utilizando el "Quick Ligation Kit", de New England Biolabs, según instrucciones recomendadas por el fabricante, 10 minutos a temperatura ambiente.

Se transformaron bacterias XL1-Blue competentes mediante choque térmico (42ºC 30 segundos), y se crecieron en medio selectivo (LB: 5 gramos de extracto de levadura, 10 gramos de Triptona-Peptona -ambas de Difco- y 10 gramos de NaCl -Merck- por litro, con 100 \mug/ml ampicilina -Roche-). El ADN plasmídico fue extraído de las bacterias transformadas empleando el kit "Wizard® Plus SV Minipreps", de Promega.

Para subclonar la región promotora en pXP2 se extrajo mediante restricción desde pcDNA3 con las mismas condiciones y enzimas de restricción empleadas en los pasos anteriores, se purificó de banda y se ligaron en pXP2, también digerido y purificado de la manera ya descrita. Se transformaron bacterias competentes y el ADN plasmídico fue extraído de las mismas por el método ya descrito.

Una vez comprobada la secuencia, se realizaron MaxiPreps con el "QIAGEN® Plasmid Purification kit", de Qiagen, según indicaciones del fabricante, para obtener una cantidad de plásmido suficiente para las posteriores transfecciones celulares.

El plásmido pXP2 tiene el sitio de clonaje en 5' al inicio de la secuencia codificante del gen de la luciferasa. Esta enzima cataliza una reacción que, en presencia de luciferina, genera emisión de fotones. Así, la actividad luciferasa se puede medir en un luminómetro que cuantifica el destello emitido, y de esta forma, la medida de la actividad luciferasa es un indicador cuantitativo de la actividad transcripcional de la región promotora donada en el plásmido pXP2, que dirige su expresión.

1.2. Generación de la variante -1507G mediante mutagénesis dirigida

La otra variante alélica, de aquí en adelante variante -1507G, se obtuvo por mutagénesis dirigida con el
"QuickChange® Site-directed Mutagenesis kit", de Stratagene, según indicaciones del fabricante. La secuencia de los oligonucleótidos utilizados se indica a continuación, señalando con subrayado la base a mutar (fabricados por Invitrogen):

Ddit3-MutU: 5'ACT TTG CAT TCT GGG TGG TGC GTT TT 3': (SEQ ID NO: 5)

Ddit3-MutL: 5'AAA ACG CAC CAC CCA GAA TGC AAA GT 3': (SEQ ID NO: 6)

El programa de PCR consistió en una desnaturalización inicial a 95ºC durante 30 segundos y 16 ciclos de 95ºC 30 segundos y 68ºC 10 minutos en el mismo termociclador donde se realizó la PCR. Posteriormente, se incubó el producto de PCR a 37ºC durante 1 hora con DpnI para eliminar el plásmido original.

Se transformaron bacterias competentes y se purificó el ADN plasmídico de la misma manera ya descrita para la primera variante alélica.

La secuencia de todas las construcciones generadas fue comprobada en el servicio de Secuenciación del Parque Científico de Madrid (PCM).

2. Líneas Celulares

Se ha utilizado la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC (American Type Cultura Collection, ATCC, ref. HTB-10). Se creció en monocapa sobre placas de cultivo de 10 cm de diámetro (P100, de Falcon) y se mantuvo en medio mínimo esencial (MEM -Gibco-), suplementado con 10% de Suero Bovino Fetal (Sigma) descomplementado durante 30 minutos a 56ºC, aminoácidos no esenciales (L-alanina 39.2 mg/l, L-asparragina\cdotH_{2}O 60 mg/l, L-ácido aspártico 53.2 mg/l, L-ácido glutámico 58.8 mg/l y L-prolina 46 mg/1, todos de Merck), L-glutamina 4 mM -Merck-, piruvato sódico 1 mM -Merck-, y gentamicina 50 \mug/ml -Sigma-.

Las células se cultivaron a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} al 7%.

3. Transfección de células y medida de la actividad transcripcional

La colección de plásmidos generada se empleó para la transfección transitoria y estable de células de neuroblastoma humano SK-N-MC.

3.1. Transfección transitoria con las construcciones pXP2-DDIT3

El día previo a la transfección se siembran 2 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 24 pocillos (M24, de Falcon). Se transfectan 0,7 \mug de ADN por pocillo mezclando los plásmidos pXP2-DDIT3 y pSV-\beta-galactosidasa en una relación 1:1 (0,35 \mug de pXP2 y 0,35 \mug de \beta-gal) con Lipofectamina Plus (de Life Technologies), siguiendo las indicaciones del fabricante, en relación ADN:Lipofectamina 1:3 y dejando la incubación de las células con el plásmido 5 horas. A las 24 horas de la transfección se hace el tratamiento a las células para ver la respuesta al estímulo.

Para analizar las células transfectadas con construcciones que expresan luciferasa, tras lavar con Tampón Fosfato Salino (PBS) (8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCl, 2,89 g/l HNa_{2}(PO_{4})_{2}\cdot12 H_{2}O y 0,2 g/l HK(PO_{4}), todo de Merck), se usan las células con 200 \mul del kit "Cell Culture Lysis Reagent", de Promega (25 mM Tris pH 7,8 con H_{3}PO_{4}, 2 mM CDTA, 2 mM DTT, 10% glicerol y 1% Tritón X-100). Para facilitar la lisis se deja 10 minutos a temperatura ambiente y después se someten las células a un ciclo de congelación (mínimo 2 horas a -70ºC) y descongelación a temperatura ambiente; para desechar los restos celulares grandes se centrifugan las muestras a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos.

El lisado celular fue ensayado para las actividades \beta-galactosidasa, como indicador de la eficiencia de la transfección, y luciferasa, como indicador de la actividad transcripcional de los promotores:

-: Ensayo de actividad \beta-galactosidasa. Se incuban 50 \mul de usado celular en una placa de E.L.I.S.A. con 50 \mul de sustrato de enzima (2 mM MgCl_{2} -Merck-, 100 mM \beta-mercaptoetanol -Sigma-, 120 mM Na_{2}HPO_{4}, 80 mM NaH_{2}PO_{4} -ambos de Carlo Erba- y 1.33 mg/ml de ONPG (2-Nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido) -Sigma-). Esta reacción origina un producto coloreado cuya concentración se mide como absorbancia a 415 nm en un lector de placas de E.L.I.S.A. (Modelo 680, de BioRad).

-: Ensayo de actividad luciferasa. Se miden 40 \mul de lisado celular añadiendo 100 \mul de reactivo de la enzima (20 mM Tricina, 1,07 mM MgCO_{4}, 33,3 mM DTT, 270 \muM Coenzima A -todo de Sigma-, 2,67 mM MgSO_{4}, 0,1 mM EDTA -ambos de Merck-, 470 \muM sal potásica de Luciferina -Promega- y 530 \muM ATP -Boehringer Mannheim-); alternativamente, se empleó el del kit Luciferase Assay System -Promega-. La emisión de luminiscencia se registra en un luminómetro Monolight 2010 (Analytical Luminiscence Laboratory).

La actividad transcripcional de las diferentes construcciones se expresa como la actividad relativa luciferasa/\beta-galactosidasa.

3.2. Transfección estable con la construcción de pXP2-DDIT3

Dos días antes de la transfección, se siembran 3 x 10^{6} células en una placa de cultivo P100. Se mezclan los plásmidos pXP2-DDIT3 (construcciones -1507C o - 1507G) y pcDNA3 en una relación 90:10 para transfectar 16 \mug de ADN (14.4 \mug de pXP2 y 1,6 \mug de pcDNA3) por placa con Lipofectamina Plus, según indicaciones del fabricante, en relación ADN:Lipofectamina 1:4, durante 5 horas.

Se recogen las células de la placa P100 mediante tripsinización con una solución de tripsina 500 mg/l (Disco) y EDTA 160 mg/l (Merck) y se siembran diluciones de la transfección 1/2, 1/10, 1/100 y 1/1000. Al día siguiente, y a partir de ahí cada 3 ó 4 días (2 veces en semana), se sustituye el medio por medio fresco con Geneticina 400 \mug/ml - Gibco- hasta obtener clones aislados.

Se aíslan los clones resistentes al antibiótico por aspiración con una pipeta automática y se siembran en una M24 para su expansión. Se analiza la expresión de luciferasa y se mantienen las líneas que tienen mayor actividad luciferasa. Además, se realiza una normalización de la cantidad de construcción pXP2 en función del número de células. Para esto, se purifica el DNA celular de la mitad del volumen resultante de la lisis con el kit High Pure PCR Template Preparation y se realizan PCRs a tiempo real en el aparato AbiPrism® 7900HT Sequence Detection System, de Applied Biosystems en las condiciones universales de PCR indicadas por el fabricante: se determina la cantidad de plásmido que hay en el extracto amplificando un fragmento del gen de la luciferasa con los oligonucleótidos:

5'CCT TGA TTG ACA AGG ATG GAT GGC 3': (SEQ ID NO: 7) y

5'CAT CGT CGG GAA GAC CTG CCA CGC CC 3': (SEQ ID NO: 8)

y se calcula su cantidad relativa en función del número de células mediante el ensayo de Applied Biosystems Hs99999901_s1, para cuantificar la cantidad de 18S, constante en la célula.

4. Tratamientos celulares

Para inducir estrés oxidativo (EO) se emplea el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa (XXO) (Xantina 10 \muM -Sigma- en NaOH 0,1 mM -Merck- y Xantina-Oxidasa 50 mU/ml -Roche-), que produce liberación de aniones superóxido (O^{2-}).

Para inducir estrés de retículo endoplásmico (ERE) se emplea Tunicamicina (Tn) (2,5 \mug/ml en DMSO, todo de Sigma), que es un antibiótico producido por Streptomyces lysosuperficus que inhibe la N-glicosilación de las proteínas.

Para la convergencia de ambos estreses (RIE) se añade XXO y Tn simultáneamente en las cantidades ya indicadas.

Los tratamientos se realizaron de manera puntual, recogiendo a un determinado punto (normalmente, 18 horas), o en cinéticas, recogiendo puntos durante 24 horas a intervalos de 3 horas.

II. Resultados 1. Obtención de las construcciones plasmídicas empleadas

Se clonó en el vector de expresión pcDNA3 un producto amplificado que abarca la región entre las posiciones -1626 a +60 (promotor de DDIT3, forma alélica -1507C), tomando la posición +1 en el inicio de la transcripción. Posteriormente se extrajo por restricción la región promotora desde pcDNA3 para subclonarlas en el vector pXP2.

De esta manera, se obtuvo un plásmido que contenía el promotor de DDIT3 unido en 5' a la secuencia codificante de la luciferasa. Esta construcción fue empleada para realizar sobre ella la mutagénesis dirigida y así obtener la otra variante alélica: - 1507G (promotor de DDIT3).

Los plásmidos fueron secuenciados en el PCM, determinando que la secuencia promotora coincidía con la publicada con número de acceso NT_029419 de la base de datos del NCBI, nucleotidos del 20059232 al 20057547.

2. Obtención de dos líneas celulares que expresan de forma estable la luciferasa bajo el control del promotor de DDIT3

Se cotransfectó de forma estable la línea celular de neuroblastoma humano SK-N-MC con la construcción plasmídica de pXP2 con el promotor de DDIT3 (una construcción para cada alelo del -1507, C y G) ya descrita, junto con pcDNA3, que confiere resistencia al antibiótico Geneticina, para seleccionar los clones celulares que han adquirido los plásmidos.

Se aislaron y amplificaron 16 colonias resistentes a Geneticina y se analizó su expresión basal de luciferasa. En los clones para los que se obtenían cuentas de luciferasa de al menos orden 10^{4} por volumen de ensayo, se analizó su carga de la construcción de plásmido pXP2 normalizado en función del número de células y también la expresión de luciferasa en condiciones basales y en respuesta a estímulos. Los resultados obtenidos para cada clon celular se detallan en la Tabla 1.

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TABLA 1 Análisis de los clones transfectados establemente con las construcciones en pXP2 DDIT3(-1507C) - Luciferasa y DDIT3(-1507G) - Luciferasa. Para cada variante alélica de la posición -1507 del promotor de DDIT3 se indica, en cada clon analizado, las cuentas de luciferasa obtenidas en un 10% de extracto celular proveniente de un pocillo de M24 al 80% de confluencia y, en el caso de determinarse, la cantidad de copias relativas a la cantidad de 18S del extracto (nd, no determinado)

1

Se realizó la caracterización de las colonias C1 (alelo -1507C) y G7 (alelo - 1507G) por tener tanto un crecimiento celular como una carga plasmídica similares.

3. Estudio de la actividad transcripcional del promotor de DDIT3

Los plásmidos con la región promotora de DDIT3 fueron empleados en experimentos de transfección transitoria y estable en células SK-N-MC.

Las células fueron transfectadas empleando lipofectamina, que forma complejos con los plásmidos, y que son los que las células captan. Posteriormente, fueron tratadas según modelos puestos a punto en el laboratorio para simular situaciones de estrés (oxidativo y/o de retículo) durante suficiente tiempo como para permitir a las células expresar luciferasa, que es la actividad que se ensaya para determinar la actividad transcripcional de los promotores donados en respuesta a estos estímulos.

3.1. En células transfectadas transitoriamente

Se realizaron experimentos puntuales y de cinética de diferentes condiciones de cultivo en células SK-N-MC que expresan transitoriamente la enzima luciferasa bajo la regulación del promotor de DDIT3 con las variantes alélicas C y G en la posición -1507.

En la Figura 1 se muestra la actividad transcripcional de las dos construcciones en las diferentes condiciones de cultivo a lo largo del tiempo. Se representan las Cuentas de Luciferasa (x10^{-3}) por miliunidad de \beta-galactosidasa; se recogieron puntos para su análisis cada 3 horas hasta un tiempo final de 24.

En respuesta a las diferentes condiciones de cultivo se observa que, para ambas variantes alélicas, hay una ligera estimulación de la actividad transcripcional en respuesta a las condiciones de cultivo de EO y una activación más acusada en respuesta a las condiciones de ERE y de RIE.

A la luz de estos datos, se puede afirmar que la región promotora donada contiene los elementos mínimos necesarios para mantener la capacidad de respuesta del gen DDIT3 a estrés, por lo que los dos plásmidos generados (pXP2 DDIT3(-1507C) y pXP2 DDIT3(-1507G)) son útiles para ensayar la activación del gen DDIT3 e, indirectamente, por ser este gen un testigo de la inducción de muerte celular por apoptosis, para ensayar la actividad neurotóxica o neuroprotectora de compuestos.

3.2. En células transfectadas establemente (Líneas celulares estables C1 (-1507 C) y G7 (-1507 G)

Se realizaron experimentos puntuales y de cinética de diferentes condiciones de cultivo en células SK-N-MC que expresan la enzima luciferasa de forma estable bajo la regulación del promotor de DDIT3 con las variantes alélicas C y G en la posición -1507 (líneas C 1 y G7, respectivamente).

Las cuentas de actividad luciferasa se normalizaron respecto a la carga plasmídica por célula y respecto al número de células según se ha descrito anteriormente. Se comprobó que la carga plasmídica era la misma para ambas líneas celulares y que no se alteraba por los tratamientos utilizados.

En la Figura 2 se muestran los resultados obtenidos durante un tratamiento de 24 horas recogiendo puntos cada 3 horas, expresados en actividad luciferasa normalizada, que mide la actividad transcripcional del promotor DDIT3 para ambas variantes alélicas (-1507 C y G) durante el tratamiento.

En condiciones basales, se observa que la actividad transcripcional se mantiene prácticamente constante a lo largo de todo el estudio, sin apreciar diferencias estadísticamente significativas entre ambas variantes. A grosso modo, se observa para ambas líneas celulares una estimulación muy acusada en respuesta a las condiciones de cultivo de ERE y de RIE.

El análisis detallado del comportamiento de las líneas en respuesta a los diferentes estímulos mostró que:

Línea celular C1 (DDIT3 -1507C) (Fig. 2, panel A).

\bullet: En condiciones de EO, la actividad transcripcional del promotor se mantiene prácticamente constante a lo largo del tiempo, sin apreciar diferencias estadísticamente significativas respecto a la observada en condiciones basales.

\bullet: En condiciones de ERE, se empieza a observar a partir de las 6 horas de tratamiento un aumento progresivo de la actividad transcripcional estadísticamente significativa hasta llegar a valores máximos en torno a las 15-18 horas de tratamiento.

\bullet: En condiciones de RIE, la actividad transcripcional es similar a la ya descrita en condiciones de ERE, pero con unos niveles de actividad transcripcional ligeramente inferiores en RIE que en ERE.

Línea celular G7 (DDIT3 -1507G) (Fig. 2, panel B).

\bullet: En condiciones de EO se puede observar a partir de las 9 horas de tratamiento una actividad transcripcional en respuesta al estímulo mayor que la actividad observada en condiciones basales, con un máximo de actividad a las 15 horas.

\bullet: En condiciones de ERE, también se empieza a observar un aumento progresivo a lo largo del tiempo de la actividad transcripcional, estadísticamente significativo a partir de las 6 horas de tratamiento hasta alcanzar un máximo en tomo a las 15 horas. En el caso de esta variante alélica, el nivel de actividad transcripcional máximo no alcanza los niveles a los que llega la variante -1507C.

\bullet: En condiciones de RIE, el perfil de actividad transcripcional es similar al ya descrito en condiciones de ERE, pero observando mayor respuesta, de manera que a partir de las 15 horas de tratamiento la diferencia entre estas dos respuestas (RIE y ERE) es estadísticamente significativa.

En resumen, este estudio muestra una diferencia de comportamiento de los alelos C y G en respuesta a EO, así como a las condiciones de RIE respecto a los de ERE. Para cuantificar esta diferencia, se utilizaron los datos correspondientes a 15 horas de cultivo, tiempo en que la actividad transcripcional alcanzaba el máximo en todos los cultivos, aunque este comportamiento diferente se mantiene para todos los tiempos superiores a este tiempo. Los resultados de la comparación, expresando la actividad transcripcional en veces respecto a las condiciones basales de cultivo, se muestran en la Tabla 2.

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TABLA 2 Actividad luciferasa de las células transfectadas establemente con las construcciones pXP2 - DDIT3 - Luciferasa (-1507C o -1507G) a las 15 horas de tratamiento, respecto a las células no tratadas, en veces ± el error estándar de la media.

(*) Significativo respecto al alelo C (t de Student p<0.05)

2

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Discusión Papel del polimorfismo del promotor del gen DDIT3 sobre la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer

En el análisis funcional del polimorfismo de la región promotora de DDIT3 los inventores han observado una capacidad de respuesta a estímulos diferente en función de la variante alélica analizada. Los resultados experimentales indican una respuesta a EO en el caso de la variante -1507G que no se observa para la variante -1507C, lo que conduce a una mayor actividad transcripcional del promotor con esta variante polimórfica en respuesta a EO, lo que podrían conferir a las células una mayor predisposición a la apoptosis dirigida por este gen en condiciones de EO.

Este hecho podría explicar que el riesgo asociado en individuos de edad avanzada con la EA al hecho de ser portador del alelo G en este sitio polimórfico, porque se trata de individuos que, por el mismo proceso de envejecimiento hay un EO intrinseco que genera unos niveles transcripcionales superiores que en el caso del alelo protector, C. Esto podría ocurrir si hubiese un factor activador de la transcripción que se activara en respuesta a EO y que se uniera exclusivamente a la variante polimórfica -1507G.

En cuanto a la diferencia observada en respuesta a ERE, si bien ambas variantes presentan capacidad de respuesta transcripcional, ésta es mayor en el caso de -1507C, donde se alcanzan valores transcripcionales máximos. Unos niveles de ERE suficientemente elevados como para conducir a las células a apoptosis se encuentran en individuos con sobrecarga del RE, como podría ser el caso de individuos con mutaciones. En este caso, la alteración funcional producida por la mutación y/o la sobrecarga de retículo endoplásmico sería lo suficientemente fuerte como para alcanzar unos niveles de Chop que condujesen las células a apoptosis.

Esta sobreexpresión de DDIT3 en respuesta a ERE podría explicar el efecto observado de interacción entre el polimorfismo y la edad de aparición de los síntomas: en los individuos maduros más jóvenes puede haber una sobrecarga del RE que conduzca a ERE, pero aún no se ha producido el EO debido al envejecimiento. De este modo, los individuos homocigotos para la variante alélica -1507C presentarían unos niveles de expresión de DDIT3 mayor que la de los individuos portadores de la variante -1507G, que abocara a las células a apoptosis, adelantando así la edad de aparición de los síntomas de la enfermedad.

En respuesta a RIE se igualan los niveles transcripcionales en ambas variantes alélicas, obteniendo niveles transcripcionales máximos. Como se trata de una convergencia de estreses, oxidativo y de RE, probablemente estén actuando múltiples factores de transcripción que, en su totalidad, enmascaren el efecto diferencial en la actividad transcripcional en función de la variante alélica presentada.

Funcionalidad de las variantes alélicas -1507 C y G del promotor del gen DDIT3

Con el fin de analizar si este polimorfismo podría causar diferencias a nivel de expresión del gen, se realizaron ensayos de transfección transitoria en células SK-N-MC y se generaron líneas transfectantes estables, y se estudió la expresión en condiciones basales de cultivo y en respuesta a inductores de estrés relacionados con la neurodegeneración y la EA.

En ensayos de transfección transitoria

Los resultados obtenidos indican que todos los estímulos a los que se ha sometido a las células permiten ver una alteración de la actividad promotora a partir de las 6 horas de tratamiento; en concreto, la actividad transcripcional observada tras los tratamientos con el sistema Xantina/Xantina Oxidasa, que genera EO, con tunicamicina, para producir ERE, y con ambos tratamientos conjuntamente, que genera RIE, aumenta significativamente, con un comportamiento similar al observado para el promotor de DDIT3 endógeno.

Por otra parte, las dos variantes alélicas tienen un comportamiento similar en estos ensayos.

En las líneas neuronales trasfectantes estables

Se observa que estas líneas se comportan de forma similar a lo descrito en las transfecciones transitorias pero, a diferencia de lo que allí ocurría, aquí si se observa un comportamiento diferencial según el alelo que porte la línea celular estable:

Si bien la actividad en condiciones de cultivo basales no se diferencia entre ellas, la respuesta a los estímulos sí es diferente. En concreto, la variante -1507G parece responder menos a ERE y más a EO que la variante -1507C. Este hecho podría ser debido a que en la posición donde se encuentra el polimorfismo rs3847699 hubiera un sitio de unión de factores de transcripción relacionados con la respuesta a los estímulos. De hecho, con programas de predicción de sitios de transcripción, encontramos que los factores de transcripción humanos RREB-1 y LBP-1c/CP2/LSF (CP2) se podrían unir a la región entre las posiciones de -1500 a -1519 y de -1505 a -1515, respectivamente, pero solamente en el caso de que la variante alélica presente sea G. El factor de transcripción CP2 (gen TFCP2, localización 12q13) ha sido relacionado con la EA, en cuanto a que se ha descrito una asociación entre un polimorfismo (A/G) de la región 3'UTR del gen y la enfermedad. Se ha visto que la región 3'UTR se une a proteínas, de manera que el alelo A, protector frente a la EA, tienen una unión mas débil que el alelo G. Este factor regula la expresión de otros genes que ya han sido relacionados con la EA (GSK3, \alpha-2macroglobulina, NF\kappaB, interleukina 1 o TNF), puede modular la activación de distintos virus, como HSV-1, e interacciona con la proteína Fe65, que regula la internalización y el procesamiento del APP.

Es posible que el polimorfismo estudiado en la región promotora de DDIT3 tenga, como sugieren los datos aquí mostrados, una repercusión en la capacidad de respuesta de este gen a distintos estímulos porque dicho polimorfismo afecte la unión de CP2 u otros factores de transcripción, y que sea la respuesta diferencial a estímulos inductores de estrés la responsable de la asociación con la edad de inicio de la enfermedad de Alzheimer que los inventores han observado.

La respuesta a estímulos de las dos líneas celulares generadas, así como su respuesta diferencial al estrés oxidativo (EO) y del retículo endoplásmico (ERE) indica que estas dos líneas (y los plásmidos utilizados para generarlas) son unas herramientas muy útiles para ensayar la capacidad de compuestos para: activar el gen DDIT3, inducir o inhibir el estrés oxidativo y del retículo endoplásmico, así como inducir o inhibir la muerte neuronal por apoptosis (ensayos de neuroprotección).

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<110> UNIVERSIDAD AUTÓNIMA DE MADRID

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<120> MÉTODO PARA LA IDENTIFICAIÓN DE COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

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<130> P3185ES

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<160> 8

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<170> PatenIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 1686

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip0,8cm

5

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6

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<210> 2

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<211> 1686

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\hskip0,8cm

7

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8

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<210> 3

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<211> 34

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido Chop-PromU para el clonaje de la región promotora de DDTI3 variante -1507C

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 33

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido Chop-PromL para el clonaje de la región promotora de DDTI3 variante -1507C

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<400> 4

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10

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<210> 5

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido Ddit3-MutU para la generación de la variante -1507C

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<400> 5

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11

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<210> 6

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<211> 26

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<212> DNA

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<223> Oligonucleótido Ddit3-MutL para la generación de la variante -1507C

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<400> 6

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12

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<210> 7

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 1 para la amplificación del gen de la luciferasa

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Oligonucleótido 2 para la amplificación del gen de la luciferasa

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<400> 8

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\hskip0,8cm

14

Claims

1. Un método para la identificación de compuestos que inducen estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

\quad: y

b): detectar la expresión del gen reportero;

2. Un método para la identificación de compuestos que inducen estrés oxidativo o estrés de retículo endoplasmático en una célula que comprende las etapas de:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora

\quad: y

b): detectar la expresión del gen reportero;

3. Un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés de retículo endoplásmico en una célula que comprende las etapas de:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora;

c): detectar la expresión del gen reportero;

4. Un método según la reivindicación 3, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas, a tapsigargina o a una bajada de temperatura.

6. Método según la reivindicación 5, donde dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.

\newpage

7. Un método para la identificación de compuestos que inhiben estrés oxidativo en una célula que comprende las etapas de:

ii): un gen reportero acoplado operativamente a dicha región promotora;

c): detectar la expresión del gen reportero;

8. Método según las reivindicación 7, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido o de radicales libres en la célula.

9. Método según la reivindicación 8, donde dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa o agua oxigenada.

10. Una construcción génica que comprende una secuencia de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos identificada en la SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

11. Construcción génica según la reivindicación 10, donde dicha variante presenta el polimorfismo identificado en la SEQ ID NO: 2.

12. Construcción génica según la reivindicación 10 u 11, que comprende, adicionalmente, la secuencia de nucleótidos de un gen de interés operativamente unida.

13. Un vector de expresión que comprende una construcción génica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

14. Una célula que comprende una construcción génica según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, o un vector de expresión según la reivindicación 13.

15. Una célula que expresa una construcción génica que comprende

a): la región promotora del gen DDIT3 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma; y

b): un gen de interés acoplado operativamente a dicha región promotora.

16. Célula según la reivindicación 15, donde dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

17. Una célula según las reivindicaciones 14 a 16 donde dicha célula es una célula SK-N-MC.

18. Método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende

19. Un método según la reivindicación 18, en el que dicha variante es la identificada en la SEQ ID NO: 2.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 19, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inhibidor de la N-glicosilación de proteínas.

21. Método según la reivindicación 20, donde dicho inhibidor de la N-glicosilación de proteínas es la tunicamicina.

22. Método para la expresión regulada de un gen de interés que comprende

23. Método según las reivindicación 22, donde dichas condiciones de estrés se alcanzan mediante la exposición de dicha célula a un inductor de la liberación de aniones superóxido en la célula.

24. Método según la reivindicación 23, donde dicho inductor es el sistema Xantina/Xantina-Oxidasa.

25. Un animal no-humano transgénico que contiene, insertado en su genoma, una construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.