ES2327694B1 - Peptidos inhibidores selectivos de la actividad biologica de la calcineurina. - Google Patents
Peptidos inhibidores selectivos de la actividad biologica de la calcineurina. Download PDFInfo
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Abstract
Péptidos inhibidores selectivos de la actividad
biológica de la calcineurina.
La presente invención se encuadra en el sector
de la biotecnología aplicada al área de la salud humana y más
concretamente se basa en la sorprendente utilidad de los péptidos,
LxVPc1, c3 y c4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta
de señalización Calcineurina (CN)-NFAT y de la
actividad fosfatasa de la CN. Dichos compuestos son útiles
immunosupresores y sirven de base para la elaboración de
composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de
enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T,
tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes,
inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico
relacionado pueden constituir útiles herramientas para el
desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan
actividad antagonista selectiva de la CN.
Description
Péptidos inhibidores selectivos de la actividad
biológica de la calcineurina.
La presente invención se encuadra en el sector
de la biotecnología aplicada al área de la salud humana y más
concretamente se basa en la sorprendente utilidad de los péptidos,
LxVPc1, c3 y c4 como eficientes inhibidores selectivos de la ruta
de señalización Calcineurina (CN)-NFAT y de la
actividad fosfatasa de la CN. Dichos compuestos son útiles
immunosupresores y sirven de base para la elaboración de
composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de
enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T,
tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes,
inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico
relacionado pueden constituir útiles herramientas para el
desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad
antagonista selectiva de la CN.
La ruta Calcio/Calcineurina/NFAT desempeña un
papel destacado en una gran cantidad de procesos biológicos
importantes, incluyendo el desarrollo y funcionamiento de los
sistemas inmune y nervioso, formación de la vasculatura,
morfogénesis de las válvulas cardíacas y crecimiento y desarrollo
muscular (1-5). Las señales de calcio activan a la
fosfatasa calcineurina (CN), que desfosforila a los factores de
transcripción NFATc1, NFATc2, NFATc3 y NFATc4 (nomenclatura HUGO).
Esto induce su translocación desde el citoplasma al núcleo y
aumenta su capacidad de unión al ADN, provocando la expresión
génica dependiente de NFAT (6). La unión de CN a los NFATs es por
lo tanto un paso esencial en la activación de esta familia de
factores de transcripción.
La calcineurina, también conocida como la
proteína fosfatasa 2B, es un heterodímero que consta de una
subunidad catalítica (CnA) fuertemente unida a una subunidad
reguladora (CnB). La CnA se compone de un dominio catalítico y otro
regulador que contiene la secuencia de unión con la CnB, un dominio
de unión de calmodulina (CaM) y un segmento autoinhibidor (7). La
actividad fosfatasa de CnA se regula por un complejo formado por
Ca^{2+}, CnB y CaM; ambas proteínas reguladoras son esenciales
para esta actividad (7,8). La CN puede unirse tanto a NFAT
fosforilado como desfosforilado (9,10); y aunque la CN inactiva
puede unirse a los NFAT, la unión es más fuerte con la CN activada
(11). En los NFAT, esta interacción ha sido localizada dentro del
dominio regulador N-terminal, que está conservado en
los cuatro miembros (12-14). Mediante análisis
mutacional se analizaron los motivos conservados dentro del dominio
regulador de NFATc2, definiéndose la secuencia SPRIEIT como el
sitio de anclaje de calcineurina (15). En estudios posteriores se
identificaron los residuos conservados en las secuencias
correspondientes de los demás miembros de NFAT, definiéndose el
motivo PxIxIT (ver Fig. 1A), que parece ser funcional en todos los
miembros de NFAT regulados por CN (11,16-18).
NFAT se describió por primera vez como un factor
esencial para la expresión del gen de la IL-2 (19),
y posteriormente se ha implicado en la regulación de muchos otros
genes necesarios para una respuesta inmune eficaz
(20-23). El descubrimiento de que CN es la diana
intracelular de las drogas inmunosupresoras, como Ciclosporina A
(CsA) y FK506 (24), resaltó aún más la importancia de NFAT en el
sistema inmune así como de la ruta Ca^{2+}/CN/NFAT
(25-27). El empleo de estas drogas, CsA y FK506, es
el método más frecuente para bloquear la ruta de señalización
CN-NFAT, ya que inhiben la actividad enzimática de
CN (24). Sin embargo, esta estrategia también inhibe otras rutas no
relacionadas con NFAT dependientes de CN, lo que se asocia con los
efectos secundarios severos que desencadena su uso clínico (28). Se
ha visto mediante estudios usando péptidos inhibidores que el
bloqueo específico de las interacciones
proteína-proteína es terapéuticamente prometedor
para el tratamiento de enfermedades donde esté implicada la ruta
CN-NFAT. El péptido VIVIT, cuya secuencia está
basada en el motivo PxIxIT y que posee una elevada afinidad por CN,
es capaz de inhibir selectivamente la ruta de señalización
dependiente de NFAT sin afectar al resto de vías activadas por CN
(29). Sin embargo, en los últimos años se han descrito numerosas
proteínas que se unen a CN que presentan, la mayoría de ellas, un
motivo similar al PxIxIT dentro de la zona de interacción con CN
(41). El péptido VIVIT podría por lo tanto bloquear tanto la
interacción CN-NFAT como la de CN con otras
proteínas. Por el contrario, el motivo LxVP - que participa en la
interacción de NFAT con la CN activada - se ha descrito solamente en
NFAT. Por lo tanto, el efecto bloqueante tanto in vitro como
in vivo que aquí se describe muestra que el empleo de
péptidos derivados de estos motivos posee un efecto inhibidor
selectivo potencial en la ruta CN-NFAT, cubriendo
pues, la necesidad de encontrar moléculas altamente selectivas
capaces de inhibir la ruta
CN-NFAT.
CN-NFAT.
La presente invención se refiere a nuevos
péptidos y a derivados de los mismos útiles como antagonistas
(inhibidores) selectivos de la ruta de señalización
CN-NFAT y más concretamente como inmunosupresores
(además, se ha observado que son inhibidores de la actividad
fosfatasa de la CN). La invención también se refiere a
composiciones terapéuticas que comprenden dichos péptidos, a
ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad,
preferentemente, antagonista selectiva de la acción biológica de CN
sobre NFAT y el uso de dichos péptidos para la profilaxis y
tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de
linfocitos T, tales como, pero sin limitación, enfermedades
autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a
transplantes. De la misma forma, se refiere a herramientas
genéticas y métodos de producción de dichos péptidos.
Fig. 1A.- Representación esquemática del dominio
regulador NH_{2}-terminal y de las secuencias de
interacción con CN de los diferentes NFATs. Las regiones
conservadas entre los diferentes miembros de NFAT se muestran como
sigue: SP-1, SP-2 y
SP-3 son motivos repetitivos de
serina-prolina susceptibles de fosforilación;
SRR-1 y SRR-2 son regiones ricas en
serina; y NLS es la secuencia de localización nuclear. Las dos
regiones implicadas en la unión a CN, denominadas motivos PxIxIT y
LxVP se muestran en negro, y por debajo se muestran las secuencias
correspondientes a estos motivos en cada uno de los cuatro miembros
de NFAT humano; los aminoácidos conservados entre los diferentes
miembros se muestran en negrita. Los residuos indicados se
sustituyeron por alaninas para producir el correspondiente péptido
LxVPc1 mutante. Las abreviaturas empleadas para los diferentes
motivos PxIxIT y LxVP se muestran a la derecha. Fig. 1B.-
Secuencias de aminoácidos de los péptidos usados como control
positivo (VIVIT) o negativo (SCRAMBLED) de competición para los
experimentos de unión in vitro.
Fig. 2.- Comparación de la unión de CN a NFATc1
y NFATc2 in vitro. Fig. 2A.- La unión de NFATc1 y NFATc2 a CN
es dependiente de la concentración de NFAT. Se ensayó una
concentración fija de CN (20 nM) frente a concentraciones
decrecientes de los dominios reguladores de NFATc2 o NFATc1
fusionados a GST
(Glutathione-S-Transferase)
en ensayos de pull-down. La CN unida se
mostró mediante western blot usando un anticuerpo monoclonal
frente a CnA. Debido a las altas cantidades de CN unida a NFATc1 se
muestran dos exposiciones diferentes (panel superior e inferior
respectivamente) para mostrar claramente la interacción
NFATc1-CN. Se cuantificó la CN unida mediante
densitometría, dato mostrado en el gráfico inferior como unidades
de intensidad relativa de CN unida a cada concentración de NFAT.
Fig 2B.- La unión de CN-NFAT es dependiente de la
concentración de CN. Se ensayaron cantidades fijas de
GST-NFATc2 (izquierda) ó GST-NFATc1
(derecha) con concentraciones decrecientes de CN (20, 10, 5 y 2,5
nM de CN). La CN se detectó usando un anticuerpo monoclonal frente
a CnA: la CN unida se muestra en el panel superior; y en el inferior
se muestra la CN no unida (libre) en 1/3 de los sobrenadantes
obtenidos tras la reacción de unión. La tinción de las membranas de
western blot con Ponceau Red confirmó que se usaron
las mismas cantidades de las proteínas de fusión de GST en las
reacciones (panel intermedio).
Fig. 3.- Análisis de la interacción in
vitro de CN con los péptidos PxIxIT y LxVP fusionados a GST.
Las proteínas de fusión GST-péptido que contienen
las secuencias PxIxIT ó LxVP de NFATc1 y NFATc2 se utilizaron en
ensayos de pull-down. Las proteínas GST o
GST fusionada al péptido LxVPc1 mutado (AxAA) se usaron como
controles negativos. La CN unida se detectó mediante western
blot y la cantidad usada de las proteínas de fusión de GST se
analizó mediante tinción de proteínas totales en geles
SDS-PAGE.
Fig. 4.- Efecto de los péptidos PxIxIT y LxVP
derivados de NFATc1 y NFATc2 en la interacción in vitro de
NFAT y CN. Se realizaron los ensayos de unión
GST-NFAT-CN en presencia de los
péptidos sintéticos indicados, y se detectó la CN unida mediante
western blot usado un anticuerpo monoclonal frente a CnA.
Fig. 4A.- CN unida a GST-NFATc2 en presencia de los
péptidos competidores a 32 \muM o 200 \muM. El péptido
mutLxVPc1 contiene el motivo LxVP de NFATc1 con los residuos
Leucina, Valina y Prolina sustituidos por Alanina. Fig. 4B.- CN
unida a GST-NFATc2 en presencia de altas
concentraciones de péptidos competidores. Se usó como control
negativo el péptido control SCRAMBLED (SC). El panel inferior
muestra la CN no unida (libre) en 1/3 de los sobrenadantes
obtenidos tras la reacción de unión. Fig. 4C.-, CN unida a
GST-NFATc1 en presencia de los péptidos competidores
a 32 \muM o 200 \muM.
Fig. 5.- Comparación de la capacidad de los
péptidos VIVIT, LxVPc1 y PxIxITc2 para bloquear la unión de CN a
NFATc2. La unión de GST-NFATc2 a CN se competía por
concentraciones crecientes de los péptidos VIVIT, LxVPc1 o
PxIxITc2. Los paneles superiores muestran la cantidad de CN unida a
GST-NFATc2 mientras que los inferiores muestran la
CN no unida (libre) en 1/3 de los sobrenadantes obtenidos tras la
reacción de unión. La CN unida se cuantificó mediante análisis
densitométrico con el software Quantity One
(BIO-RAD), datos que se presentan en el gráfico
mostrando las curvas de inhibición de cada péptido competidor para
la unión de CN a GST-NFATc2. El 100% de CN unida se
asimila a la cantidad de CN unida a GST-NFATc2 en
ausencia de péptido competidor.
Fig. 6.- Competición de la interacción
NFATc1-CN y NFATc2-CN por péptidos
que mimetizan los motivos PxIxIT y LxVP de NFATc1, c2, c3 y c4. Fig.
6A.- Los péptidos correspondientes a los motivos LxVP de NFATc1, c2,
c3 y c4 (32 \muM) se usaron para competir in vitro la
unión de CN a GST-NFATc2 (izquierda) o
GST-NFATc1 (derecha). Debido a la elevada cantidad
de CN unida a NFATc1, se muestran dos exposiciones diferentes
(paneles superiores y centrales) para mostrar claramente el efecto
de los péptidos sobre la interacción de NFATc1 y CN. Los paneles
inferiores muestran la CN no unida (libre) en 1/3 de los
sobrenadantes obtenidos tras la reacción de unión. Fig. 6B.-, Unión
in vitro de GST-NFAT-CN en
presencia de 100 \muM de cada péptido PxIxIT. Se muestra la CN
unida y la libre. Las secuencias de los péptidos se detallan en la
Fig. 1.
Fig. 7- Competición cruzada de la interacción
GST-PxIxITc2-CN ó
GST-LxVPc1-CN por los péptidos
PxIxITc2 y LxVPc1. Se usaron las proteínas de fusión de GST
conteniendo los péptidos PxIxITc2 o LxVPc1 en ensayos de
pull-down de CN en presencia de los péptidos
competidores libres como se indica. Se usó el péptido SCRAMBLED
(SC: 200 \muM) como control negativo de competición, y también se
analizó el efecto del péptido VIVIT (12 \muM). Para una mejor
detección de la escasa CN unida a GST-PxIxITc2, se
empleó el doble de GST-PxIxITc2 que de
GST-LxVPc1.
Fig. 8.- Bloqueo in vivo de la regulación
de NFATc2 por el péptido LxVPc1. Se
co-transfectaron las células HeLa (NFAT negativas)
con las construcciones HA-NFATc2 wild type y
las proteínas de fusión de GFP con los péptidos PxIxIT o LxVP
derivados de NFATc2 o NFATc1. Se empleó como control el péptido
mutado LxVPc1 (mutLxVPc1) fusionado a GFP. Fig. 8A.- Las células
HeLa transfectadas se estimularon o no con PMA (20 ng/ml) más
ionóforo de calcio (Io) (1 \muM) (PMA+Io) durante 1 h. Los
extractos celulares totales se analizaron mediante western
blot usando un anticuerpo frente a HA para detectar NFATc2
(panel superior) ó un suero anti-GFP para controlar
la expresión de las proteínas de fusión a GFP (panel inferior). La
movilidad electroforética de las bandas superiores (fosforilado) e
inferiores (desfosforilado) corresponde al estado de fosforilación
de NFATc2. Los extractos de las células que expresaban solo la
proteína parental GFP se muestran con los carriles \phi. Los
asteriscos señalan bandas inespecíficas. Fig. 8B.- Localización
subcelular de NFATc2 en las células HeLa transfectadas tratadas con
lo durante 30 minutos. Las imágenes de la inmunofluorescencia
muestran campos representativos de células que expresaban la
correspondiente proteína de fusión de GFP-péptido
(izquierda) y la tinción de NFATc2 (derecha). Se indica el
porcentaje de células que mostraban una distribución citosólica de
NFATc2 (se contaron al menos 130 células por transfección).
La presente invención se basa en que los
inventores han encontrado la sorprendente utilidad de los péptidos,
LxVPc1, LxVPc3 y LxVPc4 como eficientes inhibidores selectivos de
la ruta de señalización CN-NFAT y más concretamente
como útiles compuestos immunosupresores base para la elaboración de
composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de
enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T,
tales como, pero sin limitarnos a, enfermedades autoinmunes,
inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
Igualmente, estos péptidos y el material genético y biológico
relacionado pueden constituir útiles herramientas para el
desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad
antagonista selectiva de la Calcineurina (en adelante
CN).
CN).
En la presente invención se ha comparado la
interacción de NFATc1 y NFATc2 con la CN activa. En los análisis
semicuantitativos se muestra claramente que la interacción de CN
con NFATc1 es más fuerte que con NFATc2. Por otro lado los
experimentos de competición utilizando péptidos basados en los
sitios LxVP de los diferentes NFATs sugieren que NFATc3 y NFATc4
tendrían una capacidad de interacción con CN similar a la de
NFATc1. Por lo tanto, mientras que el motivo PxIxIT es el principal
sitio de anclaje de CN en NFATc2, la presencia de sitios LxVP
funcionales en NFATc1, NFATc3 y NFATc4 contribuye a una interacción
NFAT-CN más fuerte.
Adicionalmente hemos visto que el péptido LxVPc2
es un competidor muy débil de la unión de CN a NFAT, lo que sugiere
que la interacción NFATc2-CN pudiera deberse
principalmente al motivo PxIxIT. El motivo LxVP de NFATc1 presenta
unas características diferentes. Este péptido LxVP se une mucho más
eficientemente a CN que los motivos PxIxIT de NFATc1 y NFATc2 (Fig.
3). También es capaz de inhibir in vitro la interacción de
CN con ambos NFATs y la translocación de NFATc2 en células
activadas (Figs. 4-6 y Fig. 8). La gran capacidad de
LxVPc1 para interferir en los complejos NFATc2-CN
tanto in vitro como in vivo es uno de los resultados
más sorprendentes de esta invención. Los péptidos LxVP basados en
las secuencias de NFATc1, NFATc3 y NFATc4 también han demostrado
ser unos competidores eficientes de la interacción in vitro
de CN con NFATc1 ó NFATc2. Sería pues esperable que la expresión en
células de los péptidos LxVPc3 y LxVPc4 acarrease un efecto similar
al observado con el péptido LxVPc1 sobre la activación de
NFATc2.
Por otro lado en esta invención presentamos
claras evidencias de que los residuos conservados en los motivos
LxVP, Leucina, Valina y Prolina, son esenciales para la interacción
de NFATc1 con CN. Sin embargo, el hecho de que el motivo LxVPc2
también presente conservados estos aminoácidos indica que otros
residuos presentes en dicho motivo han de ser importantes en la
interacción proteína-proteína. Más allá de los tres
residuos conservados, sólo NFATc1, NFATc3 y NFATc4 poseen un
aminoácido aromático adyacente al núcleo del motivo LxVP (Tirosina,
Fenilalanina y Tirosina, respectivamente). Otra diferencia en las
secuencias es la presencia en NFATc2 de un residuo de Prolina
adyacente al extremo C-terminal del núcleo del
motivo LxVP, lo que da lugar a dos residuos consecutivos de Prolina
de los que carecen el resto de miembros de NFAT. Esto hace que las
diferencias en las regiones que flanquean el núcleo del motivo
puedan explicar el comportamiento diferencial que posee el LxVPc2
comparado con LXVPc1, LxVPc3 y LxVPc4.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente
invención lo constituye una secuencia de aminoácidos, capaz de
inhibir selectivamente la ruta de señalización
CN-NFAT, que comprende la secuencia de aminoácidos
(aá)
R_{1}-L-R_{2}-V-P-R_{3},
donde R_{1} es un aá aromático
del tipo Tirosina o Fenilalanina; R_{2} es un aminoácido del tipo
Alanina o Serina y R_{3} no es el aminoácido Prolina (en adelante
a esta secuencia de aminoácidos lo llamaremos núcleo básico de la
invención). Dicha secuencia de aminoácidos constituye el núcleo
básico de partida para la constitución de todos aquellos compuestos
capaces de inhibir selectivamente la ruta de señalización
CN-NFAT y más concretamente capaces de inhibir la
acción biológica de la CN sobre, al menos, los factores de
transcripción NFATc1 y
NFATc2.
Otro aspecto preferente de la presente invención
lo constituye una secuencia de aminoácidos, capaz de inhibir
selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT y más
concretamente capaz de inhibir la acción biológica de la CN sobre
los factores de transcripción NFATc1 y NFATc2, que posee el núcleo
básico de la invención y pertenece al siguiente grupo:
- a)
- secuencia de aá SEQ ID NO 18 (LxVPc1) o SEQ ID NO 21 (LxVPc3) o SEQ ID NO 22 (LxVPc4),
- b)
- secuencia de aá análoga a la secuencia de a)
- c)
- secuencia de aá que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).
En el sentido utilizado en esta descripción, el
termino "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de aá
que pueda ser aislada o construida en base a las secuencia de aá
mostradas en la presente invención, por ejemplo, mediante la
introducción de sustituciones de aá, conservativas o no
conservativas, incluyendo la inserción de uno o más aminoácidos, la
adición de uno o más aá, en cualquiera de los extremos de la
molécula o la delección de uno o más aá, en cualquier extremo o en
el interior de la secuencia siempre y cuando esto no modifique el
núcleo básico de la invención y que constituya un péptido capaz de
inhibir selectivamente la ruta de señalización
CN-NFAT y más concretamente capaz de inhibir la
acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción
NFATc1 y NFATc2.
En general, una secuencia de aá análoga es
sustancialmente homóloga a la secuencia de aá comentada
anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la
expresión "sustancialmente homologa" significa que las
secuencias de aá en cuestión tengan un grado de identidad de, al
menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más
preferentemente de, al menos, un 95%.
Un aspecto particular de la invención lo
constituye un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de
señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de
inhibir la acción biológica de la Calcineurina sobre los factores de
transcripción NFATc1 y NFATc2, y que comprenda la secuencia de
aminoácidos SEQ ID NO 18 o una secuencia de aá análoga o
sustanciamente análoga a la SEQ ID NO 18.
Otro aspecto particular de la invención lo
constituye un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de
señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de
inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de
transcripción NFATc1 y NFATc2, y que comprenda la secuencia de aá
SEQ ID NO 21 o una secuencia de aá análoga o sustanciamente análoga
a la SEQ ID NO 21.
Un aspecto particular más de la invención lo
constituye un péptido capaz de inhibir selectivamente la ruta de
señalización CN-NFAT y más concretamente capaz de
inhibir la acción biológica de la CN sobre los factores de
transcripción NFATc1 y NFATc2, y que comprenda la secuencia de aá
SEQ ID NO 22 o una secuencia de aá análoga o sustancialmente
análoga a la SEQ ID NO 22.
Cualquiera de las secuencias de aá de la
presente invención puede ser obtenida mediante la expresión génica
de las secuencias de nucleótidos que permiten la codificación de
sus residuos, así como mediante su síntesis química. Algunas
modificaciones pueden ser importantes para estabilizar el péptido
en futuras formulaciones farmacéuticas en las que se incorpore para
su administración a un individuo o para su utilidad como
herramienta de investigación. De igual forma se sustituye uno ó más
nucleótidos del codón correspondiente a cada residuo de
interés.
Por consiguiente, las secuencias de aá de los
péptidos de la invención y las secuencias de nucleótidos
codificantes de las mismas comprenden una serie de secuencias que
cualquier experto en materia puede obtener de forma rutinaria, sin
excesiva experimentación, a partir de la información suministrada
en la presente invención. Dichas sustituciones o modificaciones
adecuadas para llevar a cabo los diversos aspectos de la presente
invención se pueden determinar mediante experimentación de rutina
para obtener péptidos con las propiedades estructurales y
funcionales descritas por ejemplo comparando las interacciones
proteína-proteína mediante ensayos de competición
in vitro o in vivo utilizando CN con cualquiera de
los NFATs c1-c4.
Se puede hacer cualquier combinación de
deleción, inserción y sustitución para llegar a expresar y producir
la construcción final del péptido deseado mediante mutaciones en el
ADN y técnicas de ingeniería genética utilizando células huésped
que comprendan dichas secuencias de nucleótidos.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención comprende una secuencia de nucleótidos capaz de codificar
la secuencia de aá de los péptidos LxVPc1 o LxVPc3 o LxVPc4 de la
presente invención constituida por una secuencia de nucleótidos
seleccionado de uno de los siguientes grupos:
a) secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su
secuencia complementaria SEQ ID NO 6,
b) secuencia de nucleótidos y/o su secuencia
complementaria que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO 21,
c) secuencia de nucleótidos y/o su secuencia
complementaria que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO 22,
d) secuencia de nucleótidos análoga a la
secuencia (a), o (b) o (c),
e) secuencia de nucleótidos que comprende una
secuencia cualquiera perteneciente de (a), (b), (c) y (d).
Un aspecto particular de la invención lo
constituye una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una
secuencia de aminoácidos o péptidos que pueden inhibir
selectivamente la ruta de señalización CN-NFAT, y
más concretamente, inhibir la acción biológica de la CN sobre los
factores de transcripción NFATc1 y NFATc2, y que comprenda la
secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia
complementaria SEQ ID NO 6.
La secuencia de nucleótidos descrito en la
presente invención también puede estar unida o fusionada, en caso
necesario y para permitir un mejor aislamiento o detección del
péptido expresado, a una secuencia de ADN que codifica para un
péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o
detección de dicho péptido.
Por lo tanto, otro aspecto particular de la
presente invención lo constituye una construcción genética que
comprende además de una secuencia de nucleótidos seleccionada en
entre la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia
complementaria SEQ ID NO 6, o la secuencia de nucleótidos que
codifica para el péptido LxVPc3, o la secuencia de nucleótidos que
codifica para el péptido LxVPc4, cualquier otra secuencia de
nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que
permita el aislamiento o la detección del/de los péptido/s
expresado/s.
La secuencia de nucleótidos y la construcción
genética de la presente invención pueden obtenerse mediante el
empleo de técnicas ampliamente conocidas por cualquier experto en
la materia (cfr. Sambrook et al. Molecular cloning, a
Laboratory Manual 2nd ed., Cold Sping Harbor Laboratory Press, New
York, 1989 vol. 1-3). Dichas secuencias de
nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión que
permite la regulación de la misma en condiciones adecuadas.
Por lo tanto, otro aspecto más de la presente
invención lo constituye un vector de expresión génica que comprende
la secuencia de nucleótidos LxVPc1 y/o su secuencia complementaria
o la secuencia de nucleótidos LxVPc3 y/o su secuencia
complementaria o la secuencia de nucleótidos LxVPc4 y/o su
secuencia complementaria o la construcción genética LxVPc1 o la
construcción genética LxVPc3 o la construcción genética LxVPc4 de
la presente invención y que permite la expresión de dicha
construcción en el citoplasma de una célula de la invención.
En general, el vector de expresión LxVPc1 o el
vector de expresión LxVpc3 o el vector LxVPc4 de la presente
invención comprende, además de la secuencia de nucleótidos LxVPc1
y/o su secuencia complementaria o la secuencia de nucleótidos
LxVPc3 y/o su secuencia complementaria o la secuencia de
nucleótidos LxVPc4 y/o su secuencia complementaria o la construcción
genética LxVPc1 o la construcción genética LxVPc3 o la construcción
genética LxVPc4 de la presente invención, un promotor que dirige su
transcripción, al que está operativamente enlazado, y otras
secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha
trasncripción y, en su caso, la traducción del producto de interés,
por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción,
señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de
unión a ribosomas, secuencias codificantes de reguladores
transcripcionales, silenciadores transcripcionales, represores,
etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden
seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada
uso concreto entre plásmidos de expresión de células que pueden
contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las
células transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés.
La elección del vector dependerá de la célula hospedadora y del
tipo de uso que se quiera realizar.
Por tanto, según un modo de realización
particular de la presente invención dicho vector es un plásmido. La
obtención de dicho vector puede realizarse por métodos
convencionales conocidos por los expertos en la materia al igual que
para la transformación de los microorganismos se pueden utilizar
diferentes métodos como, pero sin limitación, transformación
química, electroporación, microinyección, entre otros.
Un aspecto adicional de la presente invención lo
constituye una célula transformada que comprende una secuencia de
nucleótidos LxVPc1 y/o su secuencia complementaria o una secuencia
de nucleótidos LxVPc3 y/o su secuencia complementaria o una
secuencia de nucleótidos LxVPc4 y/o su secuencia complementaria o
una construcción genética LxVPc1 o una construcción genética LxVPc3
o una construcción genética LxVPc4 o un vector LxVPc1 o un vector
LxVPc3 o un vector LxVPc4 de la presente invención y que es capaz
de expresar el péptido LxVPc1 o el péptido LxVPc3 o el péptido
LxVPc4 respectivamente, de la presente invención en condiciones
adecuadas. La célula LxVPc1 o la célula LxVPc3 o la célula LxVPc4
de la invención puede ser una célula procariota o eucariota en
función de las necesidades concretas y pueden ser elaboradas por un
experto en la materia con la información descrita en la presente
invención.
La secuencia de nucleótidos, construcción
genética, vector de expresión, las células transformadas y el
péptido LxVPc1, c3 o c4 de la presente invención pueden ser
utilizados directamente o mediante su expresión genética en células
huésped para la elaboración de sistemas de identificación o
screening de compuestos farmacéuticos reguladores de la ruta de
señalización CN-NFAT, más concretamente de la
acción biológica de la CN sobre los factores de transcripción
NFATc1 y NFATc2, preferentemente antagonistas selectivos de
CN-NFAT mediante la determinación del efecto de la
adición de un potencial compuesto sobre dicha actividad. En estos
ensayos se pueden utilizar distintas combinaciones, uno o más, de
las potenciales formas posibles de los péptidos LXVPc1, c3 o c4. El
uso directo del péptido LXVPc1, c3 o c4, de la presente invención
puede utilizarse, después de su extracción y purificación, en un
ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas. En estos
ensayos se puede utilizar conjuntamente las proteínas o fragmentos
de las mismas implicadas en la interacción para la que se desea
identificar compuestos reguladores; mientras que la interacción de
dichas proteínas se puede valorar por ejemplo mediante Western blot
(ver ejemplos). Los compuestos a identificar pueden ser de distinto
origen: natural (plantas, procariota, etc) o sintético. Este sistema
de screening puede medir o detectar (cuantitativa o
cualitativamente) la unión competitiva de un compuesto candidato a
un péptido señal mediante marcaje directo o indirecto de alguno de
los elementos de dicho sistema.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención lo constituye un procedimiento o ensayo de identificación
o screening de nuevos compuestos farmacéuticos reguladores,
preferentemente antagonistas selectivos, de la ruta de señalización
CN-NFAT, más concretamente de la acción biológica de
la CN sobre los factores de transcripción NFATc1 y NFATc2 y que
comprende el uso de la secuencia de nucleótidos, construcción
génica, vector de expresión, las células huésped y/o los péptidos
de la presente invención de forma aislada o en una de sus
combinaciones posibles. Otro aspecto de la presente invención lo
constituye un ensayo de identificación de compuestos farmacéuticos
en el que el procedimiento es un ensayo de identificación de
compuestos farmacéuticos en el que el procedimiento es un ensayo
in vitro o es un ensayo in vivo, como por ejemplo, un
ensayo de co-inmunoprecipitación o de
inmunodetec-
ción.
ción.
Tal y como se utiliza en la presente invención
el término selectivos se refiere a que la capacidad del péptido de
la invención de actuar como antagonista de la actividad de CN es
considerablemente mayor que su capacidad de actuar como
antagonistas de otras proteínas y, por otro lado, a que pueden
seleccionarse péptidos más específicos para inhibir distintas
actividades de la misma proteína CN.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención lo
constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de
enfermedades que comprenda cualquiera de los péptidos anteriormente
mencionados (SEQs ID No 18, 21, 22) incluyendo sus análogos y
sustancialmente análogos o cualquier otro compuesto que comprenda
el núcleo básico y que sea capaz de inhibir selectivamente la ruta
de señalización CN-NFAT, en adelante composición
farmacéutica de la invención, que cursen con activación de la CN, y
preferentemente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, con la activación del sistema inmunológico.
Otro aspecto de la presente invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en
la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con
activación de la CN, y preferentemente, a título ilustrativo y sin
que limite el alcance de la invención, con activación de linfocitos
T, tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, inflamación,
alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
Finalmente, otro aspecto de la invención lo
constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención
como herramienta para la investigación básica para el aislamiento
de nuevos sustratos de CN importantes para la señalización mediada
por Calcio en diferentes especies.
A continuación los siguientes ejemplos y figuras
sirven para ilustrar pero no limitan la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Para analizar la capacidad de interacción de
NFATc1 y NFATc2 con la CN realizamos ensayos de unión in
vitro. Comparamos la CN unida a concentraciones decrecientes de
los dominios reguladores recombinantes purificados de NFATc1 o
NFATc2 fusionados a la proteína GST (GST-NFATc1 y
GST-NFATc2 respectivamente). La cuantificación
mediante densitometría de la CN unida indicó que NFATc1 tiene
capacidad de unión a CN del orden submicromolar, y que la afinidad
de NFATc2 parece ser mucho más baja que la de NFATc1 (Fig. 2A).
Se realizaron experimentos complementarios en
los que se varió la concentración de CN. En cada caso, la cantidad
de CN unida a las proteínas de fusión GST-NFAT
decrecía a medida que la concentración de CN era progresivamente
disminuida. Sin embargo, y concordando con los resultados obtenidos
variando las concentraciones de GST-NFAT, a cada
concentración de CN ensayada, la unión a NFATc1 era más fuerte que
a NFATc2 (Fig. 2B).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Estas diferencias de unión de CN podrían deberse
a una capacidad diferencial de unión de CN a los sitios PxIxIT y
LxVP de NFATc1 y NFATc2. Los segundos sitios de unión de CN
muestran una homología limitada entre los diferentes miembros de
NFAT, aunque su alineamiento indica que existen tres residuos
conservados en todos los miembros (Leucina, Valina y Prolina) (Fig.
1A). Para probar la capacidad de interacción de cada secuencia
independiente PxIxIT y LxVP con CN, fusionamos la proteína GST con
los motivos PxIxIT y LxVP de NFATc1 y NFATc2 (Fig. IA), y los
usamos en experimentos de pull-down con CN
(Fig. 3). La cantidad de CN unida a GST-LxVPc1 era
mucho mayor que la unida a GST-PxIxITcl o
GST-PxIxITc2, mientras que
GST-LxVPc2 era incapaz de unir CN en las mismas
condiciones experimentales. La relevancia de los aminoácidos
conservados (Valina, Leucina y Prolina) para la unión de LxVPc1 a
CN se estudió usando una construcción GST-mutLxVPc1,
en la cual cada residuo conservado se reemplazó por Alanina;
GST-mutLxVPc1 fue incapaz de unir CN (Fig. 3). Este
resultado sugiere que la mayor capacidad de unión de CN al motivo
LxVP de NFATc1 (con relación a los motivos PxIxITc1 y PxIxITc2)
podría ser la responsable de la mayor fortaleza en la interacción de
CN con NFATc1 versus NFATc2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Dadas las diferencias en la capacidad de
interacción de CN con los sitios PxIxIT y LxVP, evaluamos la
capacidad de los péptidos correspondientes a dichas secuencias para
competir la unión de GST-NFATc1 con CN in
vitro. Los péptidos sintéticos correspondientes a las
secuencias de unión de CN LxVP y PxIxIT de NFATc1 y NFATc2 se
muestran en la Fig. 1A. La cantidad de CN unida a GST NFAT se
detectó mediante análisis por western blot. En estos
ensayos, el péptido VIVIT (Fig. 1B), una secuencia altamente
específica seleccionada mediante una librería combinatorial de
péptidos (29), se usó como un potente competidor control.
Los péptidos PxIxIT correspondientes a NFATc1 y
NFATc2 (PxIxITc1 y PxIxITc2, respectivamente) tenían una potencia
similar desplazando la unión de NFATc2 y CN (Fig. 4A), pero
existían claras diferencias entre los dos péptidos basados en las
secuencias LxVP. LxVPc1, el péptido que contenía la secuencia LxVP
de NFATc1, interfería la unión de CN a NFATc2. Este efecto era
incluso más fuerte que el causado por la secuencia PxIxITc2,
descrita como el sitio de anclaje de CN a este NFAT (Fig. 4A). Por
contra, la misma concentración del péptido LxVP específico de
NFATc2 (LxVPc2) no fue capaz de competir la unión de NFATc2 con CN
(Fig. 4A, panel izquierdo). En estos ensayos, el péptido mutLxVPc1
no afectó a la unión de NFATc2 y CN, indicando que estos residuos
son necesarios para competir la unión de NFAT a CN in
vitro.
Estos resultados sugieren que LxVPc2 no
interacciona con CN, o más en profundidad, que su capacidad de
interacción con CN es mucho más débil que la de LxVPc1. Para
ahondar en este punto, incrementamos la concentración de péptidos
competidores en las reacciones de unión. Como se muestra en la Fig.
4B, mientras que una concentración de 100 \muM de PxIxITc1,
PxIxITc2 o LxVPc1 bloqueaba eficientemente la interacción de CN con
NFATc2, LxVPc2 era incapaz de afectar a la unión a esta
concentración, y usando concentraciones tan elevadas como 300
\muM sólo producía una inhibición parcial. Por otro lado, tanto
péptido control mutLxVPc1 como otro péptido que contenía una
distribución aleatoria de los aminoácidos del VIVIT
(scrambled) (Ver Fig. 1B) fueron incapaces de afectar la
unión de CN a NFATc2, incluso a las concentraciones de péptido más
elevadas.
Los péptidos que impidieron la interacción
CN-NFATc2 fueron también capaces de inhibir la
unión de NFATc1 a CN (Fig. 4C). Consistentemente con la capacidad
de unión diferencial observada de CN a NFATc1 y NFATc2 (Fig. 2),
los péptidos, incluso a 200 \muM, fueron menos efectivos
compitiendo la unión de CN con NFATc1 que con NFATc2 (Fig. 4C).
Estos resultados refuerzan aun más la hipótesis de que la afinidad
global de NFATc1 por CN es mayor que la de NFATc2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Experimentos de competición
"dosis-dependiente" confirmaron que el péptido
LxVPc1 es más potente que el LxVPc2 compitiendo la unión de
GST-NFATc2 a CN (Fig. 5). En estos experimentos, la
cantidad de CN unida se analizó mediante cuantificación
computerizada de ensayos de western blot. El péptido VIVIT,
usado como control positivo, fue el competidor más potente (Fig. 5,
panel izquierdo). Una concentración de 50 \muM del péptido LxVPc1
bloqueó totalmente la unión, mientras que la misma concentración de
PxIxITc2 produjo sólo un efecto inhibidor parcial (Fig. 5, panel
central y derecho).
Las diferencias entre la capacidad inhibidora de
los péptidos LxVPc1 y LxVPc2 nos hizo ampliar el estudio a los
motivos LxVP de los restantes miembros de NFAT. Los péptidos
sintéticos correspondientes a las secuencias LxVP de NFATc1, c3 y
c4 inhibieron la interacción de GST-NFATc1 con CN de
un modo similar cuando se usaron a 32 \muM (Fig. 6A); solo los
péptidos LxVPc2 y mutLxVPc1 (usado como control negativo) no fueron
capaces de alterar la unión NFAT-CN a esa
concentración. En experimentos paralelos, usamos los péptidos
basados en las secuencias PxIxIT de todos los miembros de NFAT como
competidores. Como se muestra en la Fig. 6B, una dosis de 100 \muM
de todos los péptidos PxIxIT (tres veces mayor que la concentración
usada para los péptidos LxVP) fue capaz de bloquear la interacción
de CN con NFATc1 o NFATc2, mientras que el péptido control
SCRAMBLED no fue capaz de hacerlo. De todos los péptidos
correspondientes a las dos secuencias de anclaje de los diferentes
NFAT, sólo el LxVPc2 no compitió eficientemente la interacción
in vitro de CN con NFATc1 o NFATc2; los demás péptidos LxVP
se han demostrado mejores competidores que los péptidos PxIxIT.
\newpage
Ejemplo
5
La capacidad que poseía el péptido LxVPc1 para
competir la unión de CN a NFATc2 (Fig. 4, 5 y 6) resultaba
sorprendente. Para profundizar en este hecho, realizamos nuevos
experimentos de competición, esta vez para analizar la capacidad de
los péptidos para competir la unión de CN a unas proteínas de
fusión de GST-péptido. El péptido LxVPc1 compitió la
unión de CN a GST-PxIxITc2, así como los péptidos
PxIxITc2 y VIVIT (péptido derivado de la secuencia PxIxIT)
compitieron la unión de CN a GST-LxVPc1 (Fig. 7).
Dada la falta de similitudes claras entre estos dos motivos de
NFAT, el resultado sugiere que las secuencias de CN que
interaccionan con los motivos PxIxIT y LxVP de NFAT deben ser
interdependientes de algún modo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para analizar si los péptidos derivados de los
sitios de unión de CN a NFATc1 tenían la capacidad de regular
NFATc2 en células vivas, co-transfectamos un vector
de expresión de NFATc2 wild type junto con otro que
codificaba para las proteínas de fusión GFP-LxVP o
GFP-PxIxIT de NFATc1 y NFATc2. Usamos la línea
celular HeLa porque carece de expresión endógena de NFAT. Como
control positivo y negativo se usaron las proteínas de fusión
GFP-VIVIT o GFT-mutLxVPc1
respectivamente.
El análisis mediante western blot de
extractos celulares totales mostró que la expresión de
GFP-LxVPc1 bloqueaba la desfosforilación de NFATc2
inducida mediante incremento del calcio intracelular (Fig. 8A), por
el contrario, la expresión de GFP, GFP-LxVPc2 o
GFP-mutLxVPc1 no tenía ningún efecto. Sin embargo,
y en aparente discrepancia con datos previamente publicados (15),
no detectamos ningún efecto significativo sobre la desfosforilación
de NFATc2 cuando se expresaron las construcciones
GFP-PxIxITs (datos no mostrados). Dado que la causa
de esta discrepancia podría ser la presencia de NFATc2 en células
GFP negativas, analizamos mediante inmunofluorescencia el efecto
directo de las construcciones GFP-péptidos en la
translocación nuclear de NFATc2. El análisis de
inmunofluorescencias control de células no estimuladas demostró que
NFATc2 se encontraba en el citoplasma de las células transfectadas
con las diferentes construcciones GFP (dato no mostrado). En la
mayoría de las células transfectadas con la construcción
GFP-péptido control, NFATc2 se localizaba en el
núcleo tras la activación con ionóforo de calcio, mostrando sólo un
9% de células tinción citosólica de NFATc2 (Fig. 8B). Al igual que
con la desfosforilación de NFATc2, el mayor efecto inhibidor sobre
la translocación nuclear de NFATc2 se lograba con la expresión de
GFP-VIVIT y GFP-LxVPc1: 92% y 77%
de células con tinción citosólica de NFATc2 respectivamente.
Además, observamos que la expresión de GFP-PxIxITc2
o GFP-PxIxITc1 inhibía parcialmente la
translocación nuclear de NFATc2: Entre el 33% y el 39% de células
GFP positivas mostraban localización citosólica de NFATc2 tras la
activación (Fig. 7B), dato concordante con los publicados por
Aramburu et al. (15). Estos resultados también estaban de
acuerdo con los estudios de unión in vitro, e indicaban
claramente que el péptido LxVPc1 mantenía su capacidad para
interaccionar fuertemente con CN e inhibir su interacción con
NFATc2 in vivo, evitando la desfosforilación y translocación
nuclear de
NFATc2.
NFATc2.
Por otro lado, se ha observado que el péptido
LxVPc1 inhibe la actividad fosfatasa de CN. Se valoró la actividad
fosfatasa de la calciuneurina in vitro en presencia de
distintos péptidos. Así se observó que el péptido PxIxIT no inhibía
la actividad fosfatasa (datos no mostrados). Sin embargo, la adición
del péptido LxVPc1 (pero no su forma mutada) bloqueó severamente
in vitro la actividad fosfatasa de la CN.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Las construcciones GST-NFATc1
que expresa la región reguladora de NFATc1 (1-418
aa) fusionada a la proteína glutathione
S-transferase (GST) fue generosamente
suministrada por la Dra. A. Rao (12). La construcción
GST-NFATc2 se generó mediante subclonaje en fase a
partir de un cDNA que codificaba la secuencia desde el aminoácido 4
hasta el 385 de NFATc2 en un vector pGEX4T3 (Amersham Biosciences)
digerido con BamH1-SmaI:
Las vectores de expresión
GST-péptido y GFP-péptido se
generaron mediante clonaje en fase en el vector digerido pGEX
(Amersham Biosciences) o pEGFP-C (Clontech) de
oligonucleótidos anillados con extremos protuberantes que
codificaban las diferentes secuencias peptídicas.
El plásmido de expresión pEF-BOS
HA-NFATc2 se ha descrito previamente (39), y
codifica la proteína NFATc2 completa fusionada al epítopo HA
(influenza virus hemagglutinin) en su extremo
NH_{2}-terminal.
\newpage
Ejemplo
7.1
Las células HeLa se cultivaron en medio Dulbecco
modificado por Eagle (DMEM) (Gibco) completado con suero fetal
bovino (FBS) (Sigma) al 10%. El día anterior a la transfección, las
células se sembraron en placas de 6 pocillos para que alcanzasen
una confluencia del 80% en el momento de la transfección. Las
células se transfectaron con 18 ng de pEF-BOS
HA-NFATc2 mas 1,1 \mug de los plásmidos
GFP-péptido con 4 \mul de reactivo Plus más 6
\mul de reactivo Lipofectamina (Invitrogen) durante 3 h en 1 ml
de medio OPTIMEM (Gibco). Mediante citometría de flujo se
cuantificó la eficiencia de transfección como el porcentaje de
células que expresaban GFP. Se obtuvieron eficiencias de
transfección similares para las diferentes construcciones y en
experimentos independientes.
Veinticuatro horas después de la transfección,
el medio de cultivo de las HeLa se reemplazó por DMEM+1%FBS. Tras
dos horas más, las células se estimularon durante 1 hora usando 20
ng/ml de PMA (phorbol 12 myristrate 13 acetato) (Sigma) más
1 \muM de ionóforo de calcio A23187 (Sigma) y 3 mM de CaCl_{2}.
A continuación las células se lavaron usando un tampón fosfato
salino frío (PBS) y se obtuvieron los extractos celulares usando un
tampón de rotura [20 mM Hepes pH 7,6 con 0,4 M de NaCl, 1 mM EDTA, 3
mM EGTA, 1 \muM DTT (dithiothreitol), 1 mM PMSF
(phenylmethylsulfonyl fluoride), 100 \muM benzamidina, 1
\mug/ml de pepstatina, 1 \mug/mi de aprotinina y 1% de Triton
X-100]. Las proteínas celulares se extrajeron
durante 15' usando una noria y posteriormente se centrifugaron a
14000xg durante 15'. Todos los pasos anteriores se realizaron a
4ºC. Tras la centrifugación, se añadió tampón Laemmli a los
sobrenadantes obtenidos. Los extractos celulares totales se
hirvieron durante 10' y se cargaron en geles de poliacrilamida con
SDS (sodium dodecyl sulphate) (6% para NFAT y 10% para CN
activa o GFP). Las proteínas se separaron mediante electroforesis
en condiciones reductoras. Los geles de proteínas se transfirieron
a membranas de nitrocelulosa y se incubaron durante 1 h a
temperatura ambiente con una solución de bloqueo [10% (peso/volumen)
de leche desnatada en PBS]. Tras algunos lavados con
PBS-T (0,1% de Tween-20 en PBS),
las membranas se incubaron durante 2 h con la solución de
anticuerpo primario respectiva: anti-HA monoclonal
de ratón 12CA5 [0,05% (vol/vol)] en PBS-T con 1% de
albúmina sérica bovina (BSA) para detectar NFATc2; o el
anti-GFP policlonal de conejo suministrado por el
Dr. I. Crespo [0,1% (vol/vol)] en PBS-T con 5% de
leche desnatada. Posteriormente se lavaron las membranas tres veces
durante 5' cada vez con PBS-T, y se incubaron
durante 1 h con los anticuerpos hechos en cabra
anti-IgG de ratón (Pierce) o
anti-IgG de conejo (Pierce) conjugados con
peroxidasa. Tras tres lavados con PBS-T y uno
adicional con H_{2}O, el anticuerpo unido a las membranas se
detectó mediante el sistema ECL (Amersham Biosciences).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.2
Las células HeLa se transfectaron como se
describe en el apartado anterior usando 1,2 \mug de los plásmidos
de expresión GFP-péptido junto con 40 ng de
pEF-BOS HA-NFATc2. Dos horas antes
de la estimulación, se reemplazó el medio de cultivo por DMEM+1
%FBS. Tras estimular durante 30' con ionóforo de calcio A23187 (1
\muM) y CaCl_{2} (3 mM), las células se fijaron a temperatura
ambiente durante 10' con una solución al 10% de formaldehído en PBS
conteniendo un 4% de sacarosa. Posteriormente se lavaron tres veces
con PBS y se permeabilizaron a temperatura ambiente durante 10' con
una solución de PBS con 0,25% de Triton X-100. A
continuación se incubaron las células durante 20' con un tampón de
bloqueo (10% BSA en PBS) y posteriormente con una solución 1:500
del anticuerpo 12CA5 (anti-HA) durante 1 h. La
localización subcelular de los NFATs se detectó usando un
microscopio de fluorescencia (Axiovert-200, Zeiss)
utilizando un anti-IgG de ratón conjugado con el
fluorocromo Alexa 594 (Molecular Probes) como anticuerpo
secundario. Se calculó el porcentaje de células con una distribución
citosólica o nuclear de NFAT usando no menos de 130 células
positivas por transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.3
Las proteínas de fusión de GST se expresaron en
la cepa deficiente de proteasas de E. coli BL21(DE3).
Se purificaron usando el reactivo glutathione
(GSH)-Sepharose B beads (Amersham Biosciences).
La unión de CN a estas proteínas de fusión de GST se usó para
realizar ensayos de pull-down, que se
realizaron como se explica a continuación. Se empleó una cantidad
variable de las bolas que contenían las proteínas de fusión de GST
fusionadas a los dominios reguladores de NFAT (1-2
\mug) o a los péptidos (10-30 \mug). Éstas se
lavaron dos veces con el tampón de unión (20 mM Tris pH 8, 100 mM
NaCl, 1,5 mM CaCl_{2}, 6 mM MgCl_{2}, 1 mM PMSF, 1 \muM DTT,
1 \mug/ml de aprotinina, 1 \mug/ml de pepstatina, 100 \muM de
benzamidina y 0,2% de Triton X-100) y
posteriormente se incubaron durante 30' en una noria a 4ºC con una
solución de 20 nM de Calcineurina (Sigma) más 600 nM de Calmodulina
(Sigma) en tampón de unión con o sin el péptido correspondiente. A
continuación se centrifugaron brevemente las muestras a 4ºC. Se
añadió tampón Laemmli a los sobrenadantes (fracción no unida) y se
guardaron para su posterior análisis. Las bolas se lavaron cinco
veces con tampón de unión frío y recién preparado y se añadió
tampón Laemmli; las muestras se hirvieron para separar las
proteínas unidas (fracción unida). Las fracciones unida y no unida
se cargaron en geles al 10% de SDS-poliacrilamida y
se separaron mediante electroforesis en condiciones reductoras. La
Calcineurina se detectó mediante western blot usando un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-CnA (clon
G182-1847, PharMingen). Donde se indica, la cantidad
de CN unida a las proteínas de fusión de GST se cuantificó mediante
densitometría usando el programa Quantity One
(BIO-RAD).
Los péptidos se sintetizaron en el Servicio de
Proteomica del Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa"
CSIC-UAM.
En esta solicitud, sobre todo en las figuras,
los aminoácidos se abrevian utilizando los códigos de una letra
aceptados en el campo, en la forma que se muestra a
continuación:
- A = {}\hskip0,5cm Ala =
- Alanina
- C = {}\hskip0,5cm Cys =
- Cisteína
- D = {}\hskip0,5cm Asp =
- Ácido aspártico
- E = {}\hskip0,5cm Glu =
- Ácido glutámico
- F = {}\hskip0,55cm Phe =
- Fenilalanina
- G = {}\hskip0,5cm Gly =
- Glicina
- H = {}\hskip0,5cm His =
- Histina
- I = {}\hskip0,6cm Ile =
- Isoleucina
- K = {}\hskip0,5cm Lys =
- Lisina
- L = {}\hskip0,5cm Leu =
- Leucina
- M = {}\hskip0,45cm Met =
- Metionina
- N = {}\hskip0,5cm Asn =
- Asparagina
- P = {}\hskip0,55cm Pro =
- Prolina
- Q = {}\hskip0,5cm Gln =
- Glutamina
- R = {}\hskip0,5cm Arg =
- Arginina
- S = {}\hskip0,5cm Ser =
- Serina
- T = {}\hskip0,5cm Thr =
- Treonina
- V = {}\hskip0,5cm Val =
- Valina
- W = {}\hskip0,4cm Trp =
- Triptófano
- Y = {}\hskip0,5cm Tyr =
- Tirosina
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<120> Péptidos inhibidores selectivos de
la actividad biológica de la Calcineurina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Csic/Cnic
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> VIVITfw
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica codificante
del peptido Vivit
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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\hskip0,8cm
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VIVITrev
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica
complementaria del peptido Vivit
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> PxIxITc1fw
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia Nucleotídica codificante
del peptido PxIxITc1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> PxIxITc1rev
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica
complementaria del peptido PxIxITc1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LxVPc1fw
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica codificante
del peptido LxVPc1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> LxVPc1rev
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(53)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica
complementaria del peptido LxVPc1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 7
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<211> 60
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<212> DNA
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<213> mutLcVPc1fw
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica codificante
del peptido mutLxVPc1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<212> DNA
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<213> mutLxVPc1rev
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica
complementaria del peptido mutLxVPc1
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<400> 8
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\hskip0,8cm
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<212> DNA
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<213> PxIxITc2fw
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(63)
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<223> Secuencia nucleotídica codificante
del peptido PxIxITc2
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<400> 9
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<211> 63
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<212> DNA
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<213> PxIxITc2rev
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(63)
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<223> Secuencia nucleotídica
complementaria del peptido PxIxITc2
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<400> 10
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\hskip0,8cm
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<211> 60
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<212> DNA
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<221> misc_feature
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<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica codificante
del peptido LxVPc2
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<400> 11
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\hskip0,8cm
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<211> 60
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<212> DNA
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<213> LxVPc2rev
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica
complementaria del peptido LcVPc2
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> VIVIT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
Vivit
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
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<213> PxIxITc1ç
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
PxIxITc1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PxIxITc2
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
PxIxITc2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PxIxITc3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
PxIxITc3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> PxIxITc4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
PxIxITc4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> LxVPc1
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
LxVPc1
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> mutLxVPc1
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<220>
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<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
mutLxVPc1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hskip0,8cm
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<210> 20
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> LxVPc2
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
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<223> Secuencia aminoacídica del peptido
LxVPc2
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 21
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> LxVPc3
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
LxVPc3
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LxVPc4
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
LxVPc4
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SCRAMBLED
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PEPTIDE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica del peptido
scrambled
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (18)
1. Secuencia de aminoácidos, para inhibir
selectivamente la ruta de señalización de la Calcineurina (CN)
sobre los factores de transcripción NFAT (CN-NFAT),
que comprende la secuencia de aminoácidos
R_{1}-L-R_{2}-V-P-R_{3},
donde R_{1} es un aminoácido
aromático del tipo Tirosina o Fenilalanina; R_{2} es un
aminoácido del tipo Alanina o Serina y R_{3} no es el aminoácido
Prolina.
2. Secuencia de aminoácidos según la
reivindicación 1, donde dichos factores de transcripción son, al
menos, NFATc1 y NFATc2.
3. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de
las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque está
constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al
siguiente grupo:
- a)
- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 18,
- b)
- secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).
4. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de
las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque está
constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al
siguiente grupo:
- a)
- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21,
- b)
- secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).
5. Secuencia de aminoácidos según cualquiera de
las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque está
constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al
siguiente grupo:
- a)
- secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22,
- b)
- secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a),
- c)
- secuencia de aá que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a (a) o (b).
6. Secuencia de nucleótidos capaz de codificar
una secuencia de aminoácidos según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5.
7. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 6, donde dicha secuencia está seleccionada de uno de
los siguientes grupos:
- a)
- secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 y/o su secuencia de nucleótidos complementaria SEQ ID NO 6,
- b)
- secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 21,
- c)
- secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 22,
- d)
- secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia (a), o (b) o (c),
- e)
- secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de (a), (b), (c) y (d).
8. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 7, donde dicha secuencia es la SEQ ID NO 5 y/o la
SEQ ID NO 6.
9. Construcción genética caracterizada
porque comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de
las reivindicaciones 6-8.
10. Construcción genética según la
reivindicación 9 que además comprende una secuencia de nucleótidos
codificante de un péptido o secuencia peptídica que permita el
aislamiento o la detección del péptido expresado.
11. Vector de expresión génica que comprenda una
secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones
6-8 o la construcción génica según las
reivindicaciones 9-10.
12. Vector de expresión génica según la
reivindicación 11, donde dicho vector es un plásmido.
13. Célula transformada que contiene una
secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones
6-8, la construcción génica según las
reivindicaciones 9-10 o el vector de expresión según
cualquiera de las reivindicaciones 11-12.
14. Procedimiento de identificación de nuevos
compuestos farmacéuticos capaces de inhibir la acción biológica de
la Calcineurina sobre los factores de transcripción NFATc1 y
NFATc2, que comprende el uso de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, una secuencia de nucleótidos
según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, la
construcción génica según las reivindicaciones
9-10, el vector de expresión según cualquiera de las
reivindicaciones 11-12 o la célula transformada
según la reivindicación 13.
15. Procedimiento de identificación de nuevos
compuestos según la reivindicación 14, caracterizado porque
dichos compuestos son antagonistas selectivos de la actividad
biológica de Calcineurina A.
16. Procedimiento de identificación de nuevos
compuestos según la reivindicación 14, caracterizado porque
dicho procedimiento es un ensayo in vitro de interacción o
unión de proteínas.
17. Uso de los péptidos según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 para la elaboración de una
composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de
enfermedades que cursen con activación de la Calcineurina.
18. Uso de los péptidos según la reivindicación
17, donde dicha enfermedad cursa con activación de linfocitos T y
pertenece al siguiente grupo: enfermedades autoinmunes,
inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
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| PARK, S. et al. "{}A second calcineurin binding site on the NFAT regulatory domain"{}. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES. 20.06.2000. Vol. 97, n$^{o}$ 13, páginas 7130-7135; todo el documento, especialmente Fig. 2b. * |
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