WO2006064072A1 - Péptidos, secuencias de nucleótidos y células cnalinker13 y sus aplicaciones - Google Patents

Péptidos, secuencias de nucleótidos y células cnalinker13 y sus aplicaciones Download PDF

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WO2006064072A1
WO2006064072A1 PCT/ES2005/070164 ES2005070164W WO2006064072A1 WO 2006064072 A1 WO2006064072 A1 WO 2006064072A1 ES 2005070164 W ES2005070164 W ES 2005070164W WO 2006064072 A1 WO2006064072 A1 WO 2006064072A1
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cna
seq
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peptide
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PCT/ES2005/070164
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Juan Miguel Redondo Moya
Antonio Rodriguez Marquez
Sara Martinez Martinez
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention falls within the biotechnology sector applied to the area of human health, and more specifically in the field of development of tools for the identification of new pharmaceutical compounds that inhibit the activation of the immune system and new pharmaceutical compositions - peptides - for the treatment of pathologies such as autoimmune diseases, inflammation, allergy or transplant rejection situations.
  • Calcineurin the only known calcium-regulated serine / threonine phosphatase and calmodulin, is a key calcium influx sensor.
  • CN also called protein phosphatase 2B, is expressed ubiquitously and its structure is unique and highly conserved from yeast to human (Klee et al 1998).
  • CN is a heterodimer composed of a catalytic subunit that binds Calmodulin, calcineurin A (CnA), which is strongly bound to a regulatory subunit that binds calcium, calcineurin B (CnB) (Aramburu et al 2000).
  • CnA In mammals, three isoforms of CnA (Aa, A ⁇ and A ⁇ ) and two isoforms of CnB (CnBl and CnB2) have been described.
  • the three isoforms of CnA are encoded by three different genes, located in humans on chromosomes 4, 10, and 8, respectively (Muramatsu and Kincaid, 1992; Wang et al 1992).
  • the transcripts encoding Aa and A ⁇ are widely distributed, while the A ⁇ isoform is restricted to testis (Buttini 1995; Mukai 1991; Takaishi 1991).
  • Aa is the predominant form in the brain, while the A ⁇ isoform predominates in skeletal muscle and immune system (Jiang 1997; Kuo 1992).
  • CnBl and CnB2 are also located on different chromosomes (2 and 9, respectively), and are differentially expressed: CnBl has a wide distribution, while CnB2 is expressed only in testis (Mukai 1991; Wang 1996).
  • CN is important in developmental processes such as the structuring of the vascular and cardiac system, and the growth of skeletal muscle. In adults, the CN plays a role essential in the activation of T lymphocytes. All these processes are controlled by the regulation of the family of transcription factors NFAT (nuclear activated T cell factor). This family of factors, composed of four members called NFATc l-c4 (HUGO nomenclature), are regulated by CN, which dephosphorylates promoting their transport to the nucleus and consequently the expression of NFAT-dependent genes.
  • NFAT nuclear activated T cell factor
  • PxIxIT Two motifs, called PxIxIT and CnBP (B) 2 / CNBR2, have been described within the NFAT regulatory domain that mediate the interaction of said factor with CN.
  • the PxIxIT motif is present in the four-member regulatory domain NFAT (NFATc 1-4), while the second domain is involved in the interaction of NFATcI, NFATc3 and NFATc4 with CN.
  • this second motive will be referred to as LxVP, based on the sequence conserved among the NFAT members.
  • CN-binding proteins have been classified into three categories: a first group called CN inhibitors that includes Cabin-1 / Cain; a second group of dual regulators such as MCIP / Calsipresin / DSCR-1 conserved across species; and a third group of anchor proteins, of which the best known is AKAP79.
  • the present invention relates to new peptides and derivatives thereof useful as regulators, preferably selective Calcineurin A antagonists (inhibitors) and more specifically as immunosuppressants.
  • the invention also relates to therapeutic compositions comprising said peptides, to assays to find compounds that have activity, preferably, selective Calcineurin antagonist, and to the use of said peptides in the prophylaxis and treatment of human diseases that occur with lymphocyte activation.
  • T such as, but not limited to, autoimmune diseases, inflammation and allergy or transplant rejection situations.
  • it refers to genetic tools and production methods of said peptides.
  • the present invention is based on the fact that the inventors have identified the specific amino acid sequence of CN, linker peptide, which is involved in the interaction with other proteins such as NFATs proteins - have determined that this aa sequence. It binds to both motifs, PxIxIT and LxVP, from NFAT - or as Cabin-1 and AKAP79 proteins that possess a domain similar to PxIxIT. With subsequent analyzes, some of the individual amino acids within this linker sequence have been identified and isolated that are involved in their specific interaction with the PxIxIT and LxVP sites of NFAT, but that do not play a relevant role in the interaction of CN with Cabin- 1 and AKAP79.
  • These new peptides and their derivatives may constitute useful regulators, preferably, selective Calcineurin antagonists (inhibitors) and more specifically as immunosuppressants and may be the basis for the elaboration of therapeutic compositions for the prophylaxis and treatment of human diseases that occur with activation. of T lymphocytes, such as, but not limited to, autoimmune diseases, inflammation and allergy or transplant rejection situations. Likewise, it refers to genetic tools and production methods of said peptides. On the other hand, these new peptides and related genetic and biological material can be useful tools for the development of tests to find compounds that have Calcineurin regulatory activity, preferably selective Calcineurin antagonist.
  • an object of the present invention is an amino acid sequence (aa.), Hereinafter CnAlinkerl3 peptide of the present invention, that mimics interactions of Calcineurin A (CnA) and that is constituted by an amino acid sequence belonging to the following group: a) amino acid sequence consisting of the aá sequence.
  • linker region of Calcineurin A refers to the Calcineurin A domain that binds the carboxyl terminus of the catalytic domain with the CnB binding domain.
  • an analogous amino acid sequence is substantially homologous to the amino acid sequence discussed above.
  • the expression "substantially homologous” means that the sequences of aá. in question they have a degree of identity of at least 40%, preferably of at least 85%, or more preferably of at least 95%.
  • CnA linker 13 (SEQ ID NO1) peptide sequence of the present invention is identical to the linker region of the Calcineurin existing in the following species: Homo sapiens, Drosophila melanogaster Rabbit, Schizosaccharomyces pombe, Rattus norvegicus, Mus musculus, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, Anopheles gambiae, Gallus gallus, Sus scrofa, Bos taurus, Canis familiaris, Oryctolagus cuniculus, Apis mellifera, Bombyx mori, Mizuhopecten yessoensis, Patinopecten yessoensis, Tetraodon nig.
  • a particular object of the invention is the peptide of the invention in which the aa sequence. c) which represents a mutation belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention to the following group:
  • Another particular object of the invention is the peptide of the invention in which the aa sequence. d) belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention to the following group:
  • the CnAlinkerl3 amino acid sequence of the present invention can be obtained by gene expression of the nucleotide sequences that allow the coding of their residues, as well as by their chemical synthesis.
  • the mutated forms or variants of the CnAlinkerl3 peptide of the present invention are those in which at least one amino acid residue has been non-conservatively substituted in the peptide by an amino acid having different properties, such as an amino acid natural belonging to a different group, or alternatively, in which a natural amino acid is replaced by an unconventional amino acid; the situation and nature of such substitutions being selected in order to significantly affect the binding properties of said substitution peptide with other proteins or peptides.
  • Amino acid substitutions are typically of individual moieties, but they can be of multiple moieties, grouped or dispersed (see patent ES2 200558 T3; p-conotoxin peptides having selective activity on the alpha-1 receptor).
  • amino acid sequences of CnAlinkerl3 and nucleotide sequences encoding them comprise a finite series of sequences that any person skilled in the art can routinely obtain, without undue experimentation, from the information provided herein. .
  • substitutions suitable for the purpose of the present invention can be determined by routine experimentation to obtain peptides with the desired structural and functional properties by comparing the protein-protein interactions of interest, among others, by way of illustration and without limiting the scope of the invention: CnA with NFATs or with Cabin-1, or with AKAP79 or with MCIP.
  • Knowledge of the secondary or tertiary structure will help those skilled in the art in determining which of these substitutions is expected to significantly affect the biological activity studied.
  • mutated forms of the peptide of the present invention can be obtained by DNA mutations and genetic engineering techniques using host cells comprising said nucleotide sequences. So, it can be done any combination of deletion, insertion and substitution to express and produce the final construction of the desired peptide.
  • another object of the present invention is a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the CnAlinkerl3 peptide of the invention, hereinafter CnAlinkerl3 nucleotide sequence of the present invention, consisting of a nucleotide sequence belonging to the following group : a) nucleotide sequence consisting of the CnA linker 13 sequence (SEQ ID NO9), b) nucleotide sequence analogous to the sequence of a), c) nucleotide sequence. which represents a mutation of any of the sequences of a) and b), and d) nucleotide sequence comprising any sequence belonging to a), b) and c).
  • nucleotide sequence of the invention CnAlinkerl3 in which the nucleotide sequence of c) representing a mutation belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention to the following group:
  • nucleotide sequence of the invention in which the nucleotide sequence of d) belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention to the following group:
  • the CnAlinkerl3 nucleotide sequence of the invention can also be linked or fused, if necessary and to allow better isolation or detection of the expressed peptide, to a DNA sequence encoding a peptide capable of being used for isolation or detection purposes. of said peptide.
  • CnAlinkerl3 genetic construct of the present invention which comprises in addition to the CnAlinkerl3 sequence of the present invention any other nucleotide sequence encoding a peptide or peptide sequence that allow isolation or detection of the peptide expressed, for example, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, a polyhistidine sequence (6xHis), a peptide sequence recognizable by a monoclonal antibody (e.g., flag, for its identification, or any other that serves to purify the resulting fusion protein by immunoaffinity chromatography: tag peptides such as c-myc, HA, E-tag) (see SEQ ID NO53; Using antibodies: a laboratory manual. Ed. Harlow and David La ⁇ e (1999), CoId Spring Harbor Laboratory Press, New York, Chapter: Tagging proteins, Pp. 347-377).
  • the CnAlinkerl3 nucleotide sequence and the CnAlinkerl3 genetic construct of the invention can be obtained by employing techniques widely known in the state of the art (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., CoId Sping Harbor Laoratory Press, NY, 1989 vol 1-3) Said nucleotide sequences may be integrated into an expression vector that allows the regulation of expression thereof under suitable conditions.
  • another object of the present invention is a gene expression vector, hereinafter Iinkerl3 expression vector, which comprises the nucleotide sequence CnAlinkerl3 or the genetic construction CnAlinkerl3 of the present invention and which allows the expression of said construction in the cytoplasm of a cell of the invention.
  • the Iinkerl3 expression vector of the present invention comprises, in addition to the CnAlinkerl3 nucleotide sequence or the CnAlinkerl3 genetic construct of the present invention, a promoter that directs its transcription (e.g., pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ptet, etc.), to which it is operatively linked, and other necessary or appropriate sequences that control and regulate said transcription and, where appropriate, the translation of the product of interest, for example, transcription start and end signals (tlt2 , etc.), polyadenylation signal, origin of replication, ribosome binding sequences (RBS), coding sequences of transcriptional regulators, (enhancers), transcriptional silencers (silencers), repressors, etc.
  • a promoter that directs its transcription e.g., pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ptet, etc
  • Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among cell expression plasmids that may also contain markers usable to select cells transfected or transformed with the gene or genes of interest.
  • the choice of the vector will depend on the host cell and the type of use to be performed. Therefore, according to a particular embodiment of the present invention said vector is a plasmid.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art as well as for the transformation of microorganisms different methods can be used - chemical transformation, electroporation, microinjection, etc. - described in various manuals [Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY].
  • Iinkerl3 cell of the invention which contains the nucleotide sequence CnAlinkerl3 or the expression vector Iinkerl3 of the present invention and in which it is capable of expressing the CnAlinkerl3 peptide of the present invention under suitable conditions.
  • the Iinkerl3 cell of the invention can be a prokaryotic or eukaryotic cell depending on the specific needs and can be prepared by a person skilled in the art with the information described herein.
  • the nucleotide sequence, genetic construct, expression vector, host cells and the CnAlinkerl3 peptide of the present invention can be used directly or by their genetic expression, in host cells for the development of identification or screening systems for pharmaceutical regulatory compounds of Calcineurin A activity, preferably selective Calcineurin A antagonists, by determining the effect of the addition of a compound potential on said activity. In these tests different combinations, one or more, of the potential possible forms of the CnAlinkerl3 peptide can be used.
  • the direct use of the CnAlinkerl3 peptide of the present invention can be used, after its extraction and purification, in an in vitro protein interaction or binding assay.
  • NFATc l-c4 the other proteins or fragments thereof involved in the interaction for which it is desired to identify regulatory compounds
  • Cabin-1 / Cain AKAP79 and MCIP
  • the interaction or not of said proteins can be assessed, for example, by Western blotting (see Example 1 and 2).
  • in vivo assays can be carried out in which the CnAlinkerl3 peptide is expressed in said host cells and in which said protein-protein interaction is determined, for example, by a co-immunoprecipitation or subcellular localization assay of NFAT ( see Example 3).
  • the compounds to be identified can be of different origin: natural (plants, prokaryotic, etc.) or synthetic.
  • This screening system can measure or detect (quantitatively or qualitatively) the competitive binding of a candidate compound to a signal peptide, for example NFAT, by direct or indirect marking of any of the elements of said system.
  • another object of the present invention is a procedure or test for the identification or screening of new regulatory pharmaceutical compounds, preferably selective antagonists, of the interaction of Calcineurin A with other proteins, for example, by way of illustration and without limit the invention, NFATc 1-4, cabin-1, AKAP79 and MCIP, and which comprises the use of the nucleotide sequence, genetic construct, expression vector, host cells and / or CnAlinkerl3 peptide of the present invention in a manner isolated or in one of its possible combinations.
  • Another particular object of the invention is an identification test for pharmaceutical compounds in which the method is an in vitro protein interaction or binding assay in which the CnAlinkerl3 peptide of the present invention (see Example 1 and 2).
  • Another particular object of the invention is an identification test for pharmaceutical compounds in which the process is an in vivo test, for example a co-immunoprecipitation test or NFAT cell immunodetection, in which the CnAlinkerl3 vectors or cells of the present invention are used (see Example 3).
  • the present invention relates to new peptides and derivatives thereof useful as selective antagonists of the activity of Calcineurin A, as for example, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, inhibitors of lymphocyte activation, that is, as immunosuppressants.
  • the CN plays an essential role in the activation of T lymphocytes that is controlled by the regulation of the family of transcription factors NFAT (nuclear activated T cell factor) and specifically by CN, which dephosphorylates by promoting their transport to the nucleus and consequently the expression of NFAT-dependent genes.
  • NFAT nuclear activated T cell factor
  • the different isoforms of CN, Aa, A ⁇ and A ⁇ have an homology of the absolute linker region among themselves (100%).
  • the term "selective antagonists of the activity of Calcineurin A” refers to a selective antagonist of the activity of any of the forms of Calcineurin A, that is, Aa, A ⁇ and A ⁇ .
  • the CN / NFAT signaling pathway is the target of the immunosuppressive action of Ciclosporin A (CsA) and FK506.
  • the term "selective" refers to the ability of the peptide of the invention to act as an antagonist of the activity of Calcineurin A is considerably greater than its ability to act as an antagonist of other proteins and, on the other hand, to which more specific peptides can be selected to inhibit different activities of the same Calcineurin A protein depending on the protein with which it interacts, for example, any of the isoforms of NAFTcI, 2, 3 and 4., or cabin- 1, AKAP79 and MCIP.
  • another object of the present invention is a pharmaceutical composition useful for the treatment of diseases, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, which are activated with activation of Calcineurin A, and preferably, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, with the activation of the immune system comprising the CnAlinkerl3 peptide of the present invention, synthetic or recombinant, in an effective amount or dose.
  • Another particular object of the present invention is a pharmaceutical composition of the invention in which the CnAlinkerl3 peptide belongs to the following group: a) amino acid sequence consisting of the aa sequence. CnA linker 13 (SEQ ID NOlO), b) amino acid sequence analogous to the sequence of a), c) sequence of aá. which represents a mutation of any of the sequences of a) and b), and d) sequence of aá. which comprises any sequence belonging to a). b) and c).
  • Another specific embodiment of the invention is a pharmaceutical composition of the invention in which the CnAlinkerl3 peptide is the peptide characterized by SEQ ID NO1.
  • Another specific embodiment of the invention is a pharmaceutical composition of the invention in which the CnAlinkerl3 peptide is a peptide that belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group:
  • Another object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention in the prophylaxis and treatment of human diseases. which occur with activation of Calcineurin A, and preferably, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, with activation of T lymphocytes, such as, for example, autoimmune diseases, inflammation, allergy or transplant rejection situations.
  • Another object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition of the invention as a tool for basic research for the isolation of new Calcineurin substrates important for calcium-mediated signaling in different species.
  • FIG. 1 The region that unites the catalytic domains and regulator of the catalytic subunit of Calcineurin (CnA) is involved in the interaction with proteins
  • NFAT A Alignment of the sequences of the three known isoforms of the catalytic subunit of human Calcineurin (Aa, A ⁇ and A ⁇ ). Identical amino acids appear in boxes and unconserved residues are in light gray.
  • C Amino acids 268 to 389 are necessary for interaction with the regulatory domain of NAFTc2.
  • the membranes show the result of the binding assay of the CnAa deletions to the GST fusion protein that contains the NFATc2 regulatory domain.
  • This assay was performed in the presence of a control peptide [C] or the high affinity competitor VIVIT, both at a concentration of 10 ⁇ M.
  • Membrane bound proteins were analyzed by immunodetection (western blotting).
  • D) NFATc2 interacts with amino acids 267 to 388 of CnAa in vivo.
  • the amount and phosphorylation status of the co-immunoprecipitated NFAT proteins was analyzed by western blotting.
  • the positions of phosphorylated (P) and dephosphorylated (P) NFATc2 proteins are indicated by arrows.
  • IP Immunoprecipitation: ⁇ -FLAG (anti-FLAG antibody); WB (Western-blot): ⁇ -NFATc2 (anti-NFATc2 antibody) and ⁇ (equivalent to vacuum, without insert)
  • SEQ ID NOO A synthetic peptide based on the 'linker' region of CnA (SEQ ID NOO) competes the interaction between NFATcI and calcineurin.
  • the membrane shows the result of a GST protein binding assay fused to the amino acids 267-388 of CnAa with cell extracts from cells transfected with NFATcI.
  • Figure 2. Three point mutations in the 'linker' region of CnA prevent the in vitro interaction of Calcineurin with NFATcI, NFATc2, Cabin-1 and AKAP79.
  • a and B Mutations prevent the interaction between NFATcI and NFATc2 with Calcineurin.
  • GST-NFAT binding assays were performed with cell extracts from cells transfected with the mutant CnA proteins in one, two or three positions (Serine 337 to Proline, Histidine 339 to Leucine and Leucine 343 to Serine, as indicated). Bound protein was detected by immunodetection assays with the anti-Flag M5 antibody.
  • Figure 3. The mutated proteins in the 'linker' region of CnA do not regulate NFAT in vivo.
  • a and B CnA proteins mutated in two or three positions within the region 'linker' do not dephosphorylate either NFATc2 (A) or NFATcI (B) in vivo.
  • Total cell extracts co-transfected with the mimics of CnA and NFATc2 (A) or NFATcI (B) were loaded into poly-acrylamide gels to analyze the phosphorylation status of these members of the NFAT family.
  • C Mutations in the linker region do not affect the phosphatase activity of the protein.
  • D CnA proteins mutated in two and three residues of the 'linker' region do not translocate NFATc2 to the nucleus. HeLa cells were co-transfected with NFATc2 and the proteins mutated in one, two or three residues of the linker region The photographs show the subcellular localization of NFATc2 and CnA after analysis by confocal microscopy.
  • FIG. 4 Ectopic expression of the 'linker' peptide in cells selectively inhibits the dephosphorylation of NFATc2.
  • the binding of the flag proteins was carried out in the presence of 10 ⁇ M of a control peptide ((C), SEQ ID NO42) or of the high affinity peptide derived from PxIxIT (VIVIT) (SEQ ID NO39) (Aramburu et al 1999), which inhibits the CN / NFAT interaction.
  • the bound protein or was not detected by "immunoblotting" with anti-flag antibody. Only the protein containing residue 2 to 389 (SEQ ID NO8), which retains the structure of the complete protein and is constitutively active (O'Keefe et al 1992), specifically interacted with the regulatory domain of NFATc2 ( Figure IC).
  • the constitutively active CN - does not possess the inhibitory domain - (ca, residues 2-389, SEQ ID NO8) binds to NFATc2 which dephosphorylates (lane 2), while the complete protein ( pc or fl, SEQ ID NO2) and CnA 267-388 (SEQ ID NO41) bind to the phospho-NFATc2 protein in the same way (lane 4 and 3, respectively).
  • the X-ray CN structure indicated that the only accessible amino acids in the 269-389 region are located in the sequence of 13 amino acids (residues 335 to 347 of the original CnA alpha protein deposited in the Genbank with accession number NM 000944, or residues 348 to 360 of the fusion protein used in the present invention CnA (2-521), SEQ ID NO2) linking the catalytic and regulatory domains of CnA - linker region - (Griffith et al 1995; Kissinger et al 1995 ) (see Figure 4B).
  • yeasts lack NFAT, these residues are conserved in all known CN sequences, so their potential implication in the interaction between human CnA and two NFAT members was analyzed. The homology between this linker domain of CnA in yeasts (S. cerevisae and S. Pombe) and in humans is complete.
  • synthetic peptides were constructed, comprising said linker region in which each of these three amino acids was substituted (S337P, H339L and L343S, are mutated representations of said linker region,), separately or in combination, within the sequence which codes for residues 2-389 of human CnAa (these peptide sequences are defined in SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 and 38).
  • HEK-293 cell extracts expressing the different CnA flag proteins with single, double or triple substitutions, were analyzed in in vitro binding experiments to GST ( Figure 2A and 2B, lane 10), GST-NF ATc2 (SEQ ID NO45; Figure 2A, lanes 1-9) or GST-NFATcI (SEQ ID NO51; Figure 2B, lanes 1-9).
  • GST GST-NF ATc2
  • GST-NFATcI SEQ ID NO51; Figure 2B, lanes 1-9
  • Figure 2A the interaction between CnA and NFATcI was detected after substitution at position 337 ( Figure 2B, lane 3), which showed that the interaction with CN differs between the NFAT members.
  • Figure 2B lane 3
  • the two known NFAT sequences that interact with CN are the PxIxIT motif, present in all NFAT proteins (el, c2, c3 and c4) regulated by CN, and the LxVP site, which is involved in the interaction of NFATcI, c3 and c4 with CN.
  • GST fusion proteins were generated with the PxIxIT motif (from NFATc2, SEQ ID NO45) or the LxVP motif (from NFATcI) (SEQ ID NO51 , see also SEQ ID NO47).
  • Example 2 The linker region of CnA is also involved in the interaction with other proteins that bind CN. Some of the endogenous proteins that bind CN contain a motif similar to
  • Example 3 Role of the CnA linker region in the dephosphorylation and nuclear transport of NFAT.
  • NFATcI protein that bound to each flag-CnA protein was analyzed by co-immunoprecipitation with anti-flag antibody (SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 and 38).
  • SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 and 38 anti-flag antibody
  • the next step was to analyze the effect of the expression of the mutated CnA proteins (SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 and 38) on the subcellular location of NFAT.
  • co-transfections were performed in HeLa cells with HA-NF ATc2 and the Flag-CnA proteins.
  • the expression of the complete CnA protein, amino acids 2-521 (wt full length) that is not constitutively active (requires high intracellular calcium levels) did not cause translocation to the NFATc2 nucleus.
  • the expression of the constitutively active non-mutant construct, wt CnA (2-389) caused a nuclear expression pattern of the NFATc2 protein.
  • NFATc2 was co-expressed and the constitutively active construction of non-mutated Calcineurin in the presence of a GFP protein fused either to the competitor and inhibitor peptide VIVIT or to the sequence wild 'linker' (SEQ ID NOlO).
  • IPTG Iso-Propyl Thio-galactoside
  • GSH resin was obtained from Amersham-Pharmacia.
  • the anti-Flag monoclonal antibodies (M5 and M2) and the agarose-coupled antibody were purchased from Sigma-Aldrich.
  • the supernatant containing the anti-HA antibody was grown from clone 12CA5.
  • the anti-NFATcl antibody (7A6) was obtained from Alexis.
  • GFP was generously provided by Dr. I. Crespo. All oligonucleotides and the 'linker' peptide (NCSPHPYWLPNFM) were synthesized in Isogen. VIVIT (MAGPHPVIVITGPHEE) and Control (MVGIPVAIHGTPPHEE) peptides were obtained from the protein synthesis service of the 'Severo Ochoa' Molecular Biology Center.
  • the complete complementary DNA sequence encoding the alpha isoform of the catalytic subunit of Human Calcineurin (hCnA ⁇ ) (amino acids 2-521) was amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction) from total RNA of human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) ). The conditions of the 25 cycles were: 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 58 ° C and 2 minutes at 72 ° C.
  • the oligonucleotide sequences used were: Coding (5 'CGGGATCCGAGCCCAAGGCAATTGATC 3') and Reverse (5 '
  • the region encoding amino acids 2-397 of hCnA ⁇ was amplified by PCR from total RNA extracted from a Jurkat cell line culture.
  • the PCR conditions were: 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 62 ° C, 1 minute at 72 ° C during the first 10 cycles, and 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 68 ° C and 1 minute at 72 ° C for the remaining 20 cycles.
  • the sequences of the oligonucleotides used were: Encoder (5 'AGATCTGAGCCCAAGGCAATTGATCCC 3') and Reverse (5 '
  • Plasmid pEF-Flag-hCnA ⁇ (2-268) was generated by cloning the DNA fragment obtained by digestion with BamHI and EcoRI of the construction pGEM-T-hCnA ⁇ (2-397) and subsequent cloning into the pEF vector -Flag. Plasmid pEF-Flag-hCnA ⁇ (2-173) was obtained by cloning into the pEF-Flag vector of a protruding BamHI DNA fragment at one end and blunt at the other end (generated by digestion with MIuI plus filling reaction with Klenow) The directed mutagenesis reactions were carried out with Stratagene's 'Quikchange mutagenesis kit'. All sequences were confirmed by sequencing reactions.
  • Plasmids pGEX-hCnA ⁇ (267-388) and pEF-Flag-hCnA ⁇ (267-388) were generated by cloning an isolated DNA fragment by EcoRI digestion of the construction pEF-Flag-hCnA ⁇ (2-389) in the corresponding parental vector (pGEX or pEF-Flag) digested with EcoRI and subsequently dephosphorylated.
  • the expression plasmid encoding the Calcineurin regulatory subunit, CnB (pBJ5-mCnB) and used in transfections was sent by Dr. J. Heitman.
  • the pGEX-NFATcl construct containing the NFATcI regulatory domain (amino acids 1-418) fused to the Glutathione-S-Transferase (GST) protein was generously sent by Dr. A. Rao.
  • the construct containing the regulatory domain of NFATc2 fused to GST, pGEX-NFATc2 was obtained by cloning the complementary DNA encoding amino acids 4 to 385 of NFATc2 into the vector pGEX4-T3 (Amersham Biosciences).
  • NFATc2 complete with the hemagglutinin (HA) epitope of influenza virus in its amino terminal has been previously described in the literature (Gómez del Arco et al., 2000).
  • the pcDNA3.1-NFATcl expression plasmid was obtained by cloning into the pcDNA3.1-myc-His-B (Invitrogen) vector of an amplified PCR product from plasmid pSH107c-NFATcl.
  • the oligonucleotide sequences used were: Coding (5 '
  • Plasmids expressing the sequences of the GFP fused peptides were obtained by cloning double-band oligonucleotides (generated by in vitro ringing of complementary oligonucleotides) in the pEGFP vector
  • the DNA fragment containing the sequence LxVPcI was obtained by digestion of plasmid pGFP-LxVPcl with BamHI and EcoRI and was cloned into the vector pGEX-3X to generate plasmid pGEX-LxVPcl.
  • the DNA fragment containing the PxIxITcI sequence obtained after digesting the pGFP-PxMTc2 construct with the restriction enzymes BgIII and BamHI was cloned into the pGEX-3X vector to obtain the plasmid pGEX-PxMTc2.
  • Fragments encoding Calcineurin interaction sequences of the human proteins AKAP79 and Cabin-1 were obtained by PCR amplification from total RNA extracted from Jurkat cells. The conditions of the 40 cycles were: 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 58 ° C and 50 seconds at 72 ° C.
  • the oligonucleotides used were: hCabin-1 coding (5 '
  • All proteins fused to GST were expressed in the bacterial strain E. coli BL-21.
  • the inoculated culture last night was diluted 1/20 with culture medium the next morning and allowed to grow at 37 ° C with stirring until the culture reached an absorbance between 0.6 and 0.8 at an optical density of 600 nm .
  • the expression of fusion proteins was induced by adding IPTG to the culture at a final concentration of ImM and incubating it for a further 3 hours at 37 ° C with strong stirring.
  • the bacterial culture was then centrifuged, and the bacteria were resuspended in PBS containing 10 mM EDTA, subjected to the sonication process and then Triton X-100 detergent was added to the final 1% concentration.
  • the HEK-293 and HeLa cell lines were grown in DMEM (Dulbecco-Modified Eagle Medium) culture medium with 10% fetal bovine serum and supplemented with L-Glutamine and antibiotics (penicillin and streptomycin).
  • DMEM Dulbecco-Modified Eagle Medium
  • L-Glutamine and antibiotics penicillin and streptomycin.
  • Transient transfections in HEK-293 cells were performed following the modified calcium phosphate method already described (Rodr ⁇ guez and Flemington, Anal Biochem 1999). HeLa cells were transferred with Invitrogen lipofectamine Plus reagent following the manufacturer's recommendations. The transfected cells were washed with phosphate buffer (PBS), detached from the culture plates and centrifuged at 4 ° C.
  • PBS phosphate buffer
  • the lysis of the cells was performed with 100 microliters well with buffer BB02 (20 mM Tris pH8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 1.5 mM CaCl 2 , 0.2% Triton X-100) for protein transfections containing the Flag epitope or with 1% Triton X-100 buffer supplemented with 1 mM CaCl 2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM sodium pyrophosphate, 10 mM NaF and 1% Triton X- 100) for transfections with NFAT.
  • buffer BB02 20 mM Tris pH8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 1.5 mM CaCl 2 , 0.2% Triton X-100
  • the transfected cells were used in a high salt buffer (20 mM Hepes pH 7.6, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100). Lysis in all cases was completed by incubation with shaking at 4 ° C for 15 minutes. The samples were subsequently centrifuged at high speed (13,000 rpm) in a refrigerated table centrifuge for 15 minutes. The supernatant containing soluble proteins was transferred to other tubes and immediately frozen at -70 ° C.
  • Transfected HeLa cells seeded on glass coverslips were fixed with a solution of 4% formaldehyde and 4% Sucrose in phosphate buffer (PBS) for 10 minutes at room temperature. After this incubation the coverslips were washed three times with phosphate buffer, and treated for 10 minutes with phosphate buffer containing 0.25% Triton X-100 to permeabilize the fixed cells. The coverslips were then incubated with a saturating buffer (10% bovine serum albumin in phosphate buffer) for 10 minutes at room temperature, followed by incubation for 1 hour with saturating buffer containing the primary antibody (diluted anti-NFAT 672 polyclonal antiserum 1: 1000 or anti-Flag M2 diluted 1: 750).
  • PBS phosphate buffer
  • the samples were washed three times with phosphate buffer and incubated for Ih with the secondary antibodies labeled with fluorochromes and diluted 1: 000 in saturating buffer (Alexa Fluorine 594 diluted for the antiserum and Alexa 488 for the monoclonal antibody). After three washes with saturating buffer, the samples were analyzed with the Radiance 2100 confocal microscope (Bio-Rad) to analyze the subcellular location of the transfected NFAT and Calcineurin proteins.
  • GST fusion protein binding assays GST fusion proteins bound to the Glutathione (GSH) -sepharose column
  • BB02 buffer BB02 (20 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 1.5 mM CaCl 2 , 0.2% Triton X-100) and incubated for 30 minutes at 4 ° C in the presence of 60 microliters of the Used of HEK-293 cells transfected with the Flag-Calcineurin proteins. After this incubation, the column was washed five times with 1 volume (60 microliters) of BB02 and the proteins retained in the column were eluted by heating the samples at 99 ° C for 10 minutes in the presence of the Ix Laemli buffer. The samples were loaded on a poly-acrylamide / SDS gel, this gel it was transferred to a nitrocellulose membrane and the proteins present in the membrane were detected by the western blotting technique.
  • buffer BB02 20 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 1.5 mM CaCl 2
  • Transfected HEK-293 cells were used in a calcium-free buffer (20 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl 2 , 0.2% Triton X-100), and proteins were purified from 100 microliters of these cell extracts expressed containing the Flag epitope with 10 microliters of the anti-Flag antibody coupled to agarose (the agarose had previously been equilibrated with the same buffer with 0.2% bovine serum albumin). The extract mixture with the agarose was incubated rotating for 1 hour at 4 ° C. After incubation, the samples were centrifuged cold, washed five times with 1 volume (100 microliters) of the same cold buffer, and bound proteins to agarose were analyzed by western blotting.
  • Laemli buffer (recipe) was added to the samples to a final concentration IX, and these were heated for 10 minutes at 99 ° C, loaded into poly acrylamide / SDS gels and, after electrophoretic separation of the proteins under conditions reducing, they were transferred to nitrocellulose membranes.
  • the membranes were first incubated with a saturating buffer (5% skimmed milk powder dissolved in phosphate buffer) for 30 minutes at room temperature. After washing the membranes with phosphate buffer containing 0.1% Tween-20 detergent, they were incubated with the primary antibody solution (see table with dilutions, time and buffer).
  • the membranes were washed with the corresponding buffer and incubated with the secondary antibody solution coupled to peroxidase, followed by washing with the corresponding buffer.
  • the detection of membrane bound antibodies was performed by chemiluminescence reaction (ECL) following the manufacturer's recommendations.
  • the measurement of phosphatase activity was made from cell extracts of cells transfected with the different Calcineurin imitating proteins using the BIOMOL 'Biomol Green Cellular Assay Kit' test, following the protocol recommended by the manufacturer.

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos péptidos y a derivados de los mismos útiles como reguladores, preferentemente, antagonistas (inhibidores) selectivos de la Calcineurina a y más concretamente como inmunosupresores. La invención también se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden dichos péptidos, a ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad, preferentemente, antagonista selectiva de la Calcineurina, y al uso de dichos péptidos en la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, se refiere a herramientas genéticas y métodos de producción de dichos péptidos.

Description

TÍTULO
PÉPTIDOS, SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS Y CÉLULAS CnAlinkerl3 Y SUS APLICACIONES
SECTOR DE LATÉCNICA
La presente invención se encuadra en el sector de biotecnología aplicada al área de la salud humana, y más concretamente en el sector del desarrollo de herramientas para la identificación de nuevos compuestos farmacéuticos inhibidores de la activación del sistema inmune y de nuevas composiciones farmacéuticas - péptidos -para el tratamiento de patologías como las enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La Calcineurina (CN), la única serina/treonina fosfatasa regulada por calcio y calmodulina conocida, es un sensor clave del influjo de calcio. CN, también llamada proteína fosfatasa 2B, se expresa de forma ubicua y su estructura es única y altamente conservada desde levaduras a humano (Klee et al 1998). CN es un heterodímero compuesto de una subunidad catalítica que une Calmodulina, calcineurina A (CnA), que está unida fuertemente a una subunidad reguladora que une calcio, calcineurina B (CnB) (Aramburu et al 2000). En mamíferos, se han descrito tres isoformas de CnA (Aa, Aβ y Aγ) y dos isoformas de CnB (CnBl y CnB2). Las tres isoformas de CnA están codificadas por tres genes diferentes, localizados en humanos en los cromosomas 4, 10, y 8, respectivamente (Muramatsu and Kincaid, 1992; Wang et al 1992). Los transcriptos que codifican Aa y Aβ están ampliamente distribuidos, mientras que la isoforma Aγ esta restringida a testículo (Buttini 1995; Mukai 1991; Takaishi 1991). A nivel de proteína, Aa es la forma predominante en cerebro, mientras que la isoforma Aβ predomina en músculo esquelético y sistema inmune (Jiang 1997; Kuo 1992). Los genes que codifican CnBl y CnB2 están también localizados en diferentes cromosomas (2 y 9, respectivamente), y se expresan diferencialmente: CnBl tiene una amplia distribución, mientras que CnB2 se expresa solo en testículo (Mukai 1991; Wang 1996).
Estudios con ratones manipulados genéticamente, han demostrado que la CN es importante en procesos de desarrollo como la estructuración de sistema vascular y cardiaco, y el crecimiento de músculo esquelético. En adultos, la CN juega un papel esencial en la activación de linfocitos T. Todos estos procesos están controlados por la regulación de la familia de factores de transcripción NFAT (factor nuclear de células T activadas). Esta familia de factores, compuesta por cuatro miembros denominados NFATc l-c4 (nomenclatura HUGO), están regulados por CN, que los desfosforila promoviendo su transporte al núcleo y en consecuencia la expresión de genes dependientes de NFAT. La ruta de señalización CN/NFAT es la diana de la acción inmunosupresora de Ciclosporina A (CsA) y FK506. Estas drogas, una vez unidas a sus receptores celulares, bloquean el sitio activo de CN, inhibiendo su actividad fosfatasa. Como resultado, la desfosforilacion de NFAT y su transporte nuclear no se produce, inhibiéndose la expresión de genes esenciales para la respuesta inmune. Sin embargo, el tratamiento con estos inmunosupresores se asocia a efectos secundarios severos que se cree son debidos a la inhibición de la acción de la CN sobre otros sustratos. Por esta razón, su aplicación ha sido descartada en determinadas situaciones clínicas, como inflamación, alergia y enfermedades autoinmunes, donde esta indicado un tratamiento inmunosupresor. Estos antecedentes revelan la necesidad de desarrollar agentes inmunosupresores más específicos y menos tóxicos con un espectro terapéutico más amplio.
Se han descrito dos motivos, denominados PxIxIT y CnBP(B)2/CNBR2, dentro del dominio regulador de NFAT que median la interacción de dicho factor con CN. El motivo PxIxIT esta presente en el domino regulador de los cuatro miembros NFAT (NFATc 1-4), mientras que el segundo dominio está implicado en la interacción de NFATcI, NFATc3 y NFATc4 con CN. En adelante, en la presente invención este segundo motivo se referirá como LxVP, basándonos en la secuencia conservada entre los miembros NFAT. Aunque la CN, a través de su propio dominio autoinhibidor está finamente regulada, se han descrito un creciente número de proteínas endógenas que se unen a CN modulando de alguna forma su actividad fosfatasa (Liu, 2003). Basándose en su efecto sobre la actividad fosfatasa de CN han sido clasificadas en tres categorías las proteínas de unión a CN: un primer grupo denominado inhibidores de CN que incluye Cabin- 1/Cain; un segundo grupo de reguladores duales como es MCIP/Calsipresina/DSCR-1 conservados a través de especies; y un tercer grupo de proteínas de anclaje, de las cuales la mejor conocida es AKAP79. Las regiones de Cabin-1/Cain, AKAP79 y MCIP que están implicadas en su interacción con CN han sido identificadas (Lai et al., 1998; Sun et al., 1998; Dell'Acqua et al., 2002; Vega et al., 2002). Todas ellas contienen un motivo que se asemeja al sitio PxIxIT presente en el dominio regulador de la proteína NFAT, y todas interaccionan con la subunidad catalítica (CnA) del heterodimero CN (Dodge and Scott, 2003; Liu, 2003). La estructura de CN es esencial para su regulación, interacción con substratos, y actividad fosfatasa. Análisis de deleción dirigidos a identificar las regiones de CN que interaccionan con NFAT, así como con otros substratos, no han sido concluyentes, probablemente debido al estricto requerimiento estructural de la CN para mantener su apropiada conformación.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve
La presente invención se refiere a nuevos péptidos y a derivados de los mismos útiles como reguladores, preferentemente, antagonistas (inhibidores) selectivos de la Calcineurina A y más concretamente como inmunosupresores. La invención también se refiere a composiciones terapéuticas que comprenden dichos péptidos, a ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad, preferentemente, antagonista selectiva de la Calcineurina, y al uso de dichos péptidos en la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, se refiere a herramientas genéticas y métodos de producción de dichos péptidos.
Descripción detallada La presente invención se basa en que los inventores han identificado la secuencia de aminoácidos especifica de CN, péptido linker, que está implicada en la interacción con otras proteínas como las proteína NFATs - han determinado que esta secuencia de aá. se une a ambos motivos, PxIxIT y LxVP, de NFAT - o como las proteínas Cabin-1 y AKAP79 que poseen una dominio similar a PxIxIT. Con análisis posteriores, se han identificado y aislado algunos de los aminoácidos individuales dentro de dicha secuencia linker que están implicados en su interacción específica con los sitios PxIxIT y LxVP de NFAT, pero que no juegan un papel relevante en la interacción de CN con Cabin-1 y AKAP79. Además, se ha demostrado que una única sustitución de un aminoácido dentro de esta región linker afecta selectivamente la unión in vitro con dichas proteínas: NFAT, Cabin-1 y AKAP79, y viceversa. Por otro lado, experimentos in vivo muestran que la expresión de esta secuencia linker con mutaciones dobles o triples de los residuos implicados en dicha unión inhibe la desfosforilación y el transporte nuclear de NFAT con respecto a la forma de CN constitutivamente activa.
Estos nuevos péptidos y sus derivados pueden constituir útiles reguladores, preferentemente, antagonistas (inhibidores) selectivos de la Calcineurina y más concretamente como inmunosupresores y pueden ser la base para la elaboración de composiciones terapéuticas para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de linfocitos T, tales como, pero sin limitación, enfermedades autoinmunes, inflamación y alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Igualmente, se refiere a herramientas genéticas y métodos de producción de dichos péptidos. Por otro lado, estos nuevos péptidos y el material genético y biológico relacionado pueden constituir útiles herramientas para el desarrollo de ensayos para encontrar compuestos que tengan actividad reguladora de Calcineurina, preferentemente, antagonista selectiva de la Calcineurina.
Por otro lado, los resultados con los imitantes puntuales son de particular interés: todas las sustituciones (Serina 337 a Prolina, Histidina 339 a Leucina y Leucina 343 a Serina) inhiben completamente la interacción con el motivo PxIxIT, mientras que la sustitución en la posición 337 (S337P) tiene un efecto limitado en la interacción con el motivo LxVP (Ejemplo 1.3). Por otro lado, la sustitución del residuo 343 (L343S) no tiene ningún efecto en la interacción con otras secuencias tipo 'PxIxIT' encontrada en las regiones de interacción con Calcineurina de las proteínas Cabin-1 y AKAP79.
Además, la información descrita en la presente memoria permitiría realizar el diseño de nuevos compuestos farmacéuticos con estructura similar a las cadenas laterales de los aminoácidos que se observan que afectan a la normal interacción de
CnA con otras proteínas y que al sustituirlos afectan de manera selectiva a la interacción con una u otra proteína (ver Figura 4B). Por ejemplo, la sustitución de Leucina (cadena lateral larga) por Serina en posición 343 no tiene ningún efecto en la interacción con Cabin-1 y AKAP79, sugiriendo que este aminoácido no participa de forma directa en la interacción; por lo tanto, un fármaco que bloquease la interacción entre ambas proteínas a través de este residuo afectaría de manera selectiva sobre las secuencias NFAT específicas. Por otro lado, los ensayos 'in vitro' sugieren que la posición 337 no está directamente implicada en la interacción con el motivo 'LxVP' de NFAT; por lo tanto, un compuesto químico que bloquease la interacción a través de este residuo sólo afectaría a la interacción con el motivo PxIxIT de NFAT y no con el motivo LxVP.
Por lo tanto, un objeto de presente invención lo constituye una secuencia de aminoácidos (aá.), en adelante péptido CnAlinkerl3 de la presente invención, que mimetiza interacciones de la Calcineurina A (CnA) y que está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aá. CnA linker 13
(SEQ ID NOlO), b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a), c) secuencia de aá. que representa una mutación de cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) secuencia de aá. que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c). En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de aá. mostradas en la presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de aá. conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más aás, la adición de uno o más aás. en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más aás. en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que constituya un péptido con actividad similar o antagónica al péptido de la invención, es decir, sea capaz de mimetizar la interacción de la región linker de Calcineurina A o de inhibir dicha interacción. Tal como se utiliza el término "región linker de Calcineurina A" se refiere al dominio de la Calcineurina A que une extremo carboxilo terminal del dominio catalítico con el dominio de unión a CnB.
En general, una secuencia de aminoácidos análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aá. en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. Hay que indicar que la secuencia péptido CnA linker 13 (SEQ ID NOlO) de la presente invención es idéntica a la región linker de la Calcineurina existente en las siguientes especies: Homo sapiens, Drosophila melanogaster Rabbit, Schizosaccharomyces pombe, Rattus norvegicus, Mus musculus, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, Anopheles gambiae, Gallus gallus, Sus scrofa, Bos taurus, Canis familiaris, Oryctolagus cuniculus, Apis mellifera, Bombyx morí, Mizuhopecten yessoensis, Patinopecten yessoensis, Tetraodon nigroviridis.
Un objeto particular de la invención lo constituye el péptido de la invención en el que la secuencia de aá. de c) que representa una mutación pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención al siguiente grupo:
- secuencia de aá. CnA S337P (SEQ ID NO12),
- secuencia de aá. CnA H339L (SEQ ID NO14),
- secuencia de aá. CnA L343 S (SEQ ID NO 16), - secuencia de aá. CnA S337P-H339L (SEQ ID NO18),
- secuencia de aá. CnA H339L-L343S (SEQ ID NO20),
- secuencia de aá. CnA S337P-L343S (SEQ ID NO22), y
- secuencia de aá. CnA S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO24).
Otro objeto particular de la invención lo constituye el péptido de la invención en el que la secuencia de aá. de d) pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención al siguiente grupo:
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P (SEQ ID NO26),
- secuencia de aá. CnA (2-389) H339L (SEQ ID NO28),
- secuencia de aá. CnA (2-389) L343 S (SEQ ID NO30), - secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-H339L (SEQ ID NO32),
- secuencia de aá. CnA (2-389) H339L-L343S (SEQ ID NO34),
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-L343S (SEQ ID NO36), y
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO38).
La secuencia de aminoácidos CnAlinkerl3 de la presente invención puede ser obtenida mediante la expresión génica de las secuencias de nucleótidos que permiten la codificación de sus residuos, así como mediante su síntesis química.
Por ejemplo, las formas mutadas o variantes del péptido CnAlinkerl3 de la presente invención son aquellas en las que se ha sustituido, al menos, un residuo de aminoácido de forma no conservadora en el péptido por un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tal como un aminoácido natural perteneciente a un grupo distinto, o como forma alternativa, en las que un aminoácido natural se substituye por un aminoácido no convencional; siendo seleccionada la situación y naturaleza de tales sustituciones a fin de afectar significativamente a las propiedades de unión de dicho péptido con otras proteínas o péptidos. Las sustituciones de aminoácidos típicamente son de restos individuales, pero pueden ser de múltiples restos, agrupados o dispersos (ver patente ES2 200558 T3; Péptidos de p-conotoxina que tienen actividad selectiva sobre el receptor alpha-1). Igualmente, algunas modificaciones pueden ser importantes para estabilizar el péptido en futuras formulaciones farmacéuticas en las que se incorpore para su administración a un individuo o para su utilidad como herramienta de investigación. De igual forma se sustituye uno ó más nucleótidos del codón correspondiente a cada residuo de interés.
Por consiguiente, las secuencias de aminoácidos de CnAlinkerl3 y las secuencias de nucleótidos codificantes de las mismas comprenden una serie finita de secuencias que cualquier experto en la materia puede obtener de forma rutinaria, sin excesiva experimentación, a partir de la información suministrada en la presente memoria. Dichas sustituciones adecuadas para el objeto de la presente invención se pueden determinar mediante experimentación de rutina para obtener péptidos con las propiedades estructurales y funcionales deseadas comparando las interacciones proteína-proteína de interés, entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: CnA con NFATs o con Cabin-1, o con AKAP79 o con MCIP. El conocimiento de la estructura secundaria o terciaria ayudará a los expertos en la materia en la determinación de cual de dichas sustituciones es de esperar que afecten significativamente a la actividad biológica estudiada.
Para una descripción detallada de la química y estructura de las proteínas véase Schultz et al. Principies of Protein Structure, Springer-Verlag, nueva Cork, 1978 y Creighton, Proteins, Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco 1983, que se incorporan de este modo como referencias. Para una presentación de las sustituciones de la secuencia de nucleótido, tales como las preferencias de codón, véase a asubel et al. Eds. Current Protocols, in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, N.Y. (1994) y Sambroock et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, segunda edición, cold Spring Harbor Press. CoId spring Harbor, NY (1989). Estas formas mutadas del péptido de la presente invención se pueden obtener mediante mutaciones en el ADN y técnicas de ingeniería genética utilizando células huésped que comprendan dichas secuencias de nucleótidos. Así, se puede hacer cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a expresar y producir la construcción final del péptido deseado.
Por lo tanto, otro objeto de la presente invención lo constituye una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia de aminoácidos del péptido CnAlinkerl3 de la invención, en adelante secuencia de nucleótidos CnAlinkerl3 de la presente invención, constituida por una secuencia de nucleótidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia CnA linker 13 (SEQ ID NO9), b) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a), c) secuencia de nucleótidos. que representa una mutación de cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
Otro objeto particular de la invención lo constituye la secuencia de nucleótidos de la invención CnAlinkerl3 en la que la secuencia de nucleótidos de c) que representa una mutación pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención al siguiente grupo:
- secuencia de nucleótidos CnA S337P (SEQ ID NOl 1),
- secuencia de nucleótidos CnA H339L (SEQ ID NOl 3), - secuencia de nucleótidos CnA L343 S (SEQ ID NO 15),
- secuencia de nucleótidos CnA S337P-H339L (SEQ ID NO17),
- secuencia de nucleótidos CnA H339L-L343 S (SEQ ID NO 19),
- secuencia de nucleótidos CnA S337P-L343 S (SEQ ID NO21 ), y
- secuencia de nucleótidos CnA S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO23). Otro objeto particular de la invención lo constituye la secuencia de nucleótidos de la invención en la que la secuencia de nucleótidos de d) pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención al siguiente grupo:
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P (SEQ ID NO25),
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) H339L (SEQ ID NO27), - secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) L343 S (SEQ ID NO29),
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P-H339L (SEQ ID NO31), - secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) H339L-L343S (SEQ ID NO33),
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P-L343S (SEQ ID NO35), y - secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P-H339L-L343S
(SEQ ID NO37).
La secuencia de nucleótidos CnAlinkerl3 de la invención también puede estar unida o fusionada, en caso necesario y para permitir un mejor aislamiento o detección del péptido expresado, a una secuencia de ADN que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o detección de dicho péptido. Por tanto, otro objeto particular de la presente invención lo constituye una construcción genética, en adelante construcción genética CnAlinkerl3 de la presente invención, que comprende además de la secuencia CnAlinkerl3 de la presente invención cualquier otra secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o la detección del péptido expresado, por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, una secuencia de polihistidina (6xHis), una secuencia peptídica reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, flag, para su identificación, o cualquier otra que sirva para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad: péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E-tag) (ver SEQ ID NO53; Using antibodies: a laboratory manual. Ed. Harlow and David Lañe (1999). CoId Spring Harbor Laboratory Press. New York. Capítulo: Tagging proteins. Pp. 347-377).
La secuencia de nucleótidos CnAlinkerl3 y la construcción genética CnAlinkerl3 de la invención pueden obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., CoId Sping Harbor Laoratory Press, N. Y., 1989 vol 1-3). Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión que permite la regulación de la expresión de la misma en condiciones adecuadas.
Por tanto, otro objeto de la presente invención lo constituye un vector de expresión génica, en adelante vector de expresión Iinkerl3, que comprende la secuencia de nucleótidos CnAlinkerl3 o la construcción genética CnAlinkerl3 de la presente invención y que permite la expresión de dicha construcción en el citoplasma de una célula de la invención. En general, el vector de expresión Iinkerl3 de la presente invención comprende, además de la secuencia de nucleótidos CnAlinkerl3 o de la construcción genética CnAlinkerl3 de la presente invención, un promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ptet, etc), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2, etc), señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión de células que pueden contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización particular de la presente invención dicho vector es un plásmido. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia al igual que para la transformación de microorganismos se pueden utilizar diferentes métodos - transformación química, electroporación, microinyección, etc - descritos en diversos manuales [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N.Y.].
Por otro lado, otro objeto adicional de la presente invención lo constituye una célula transformada, en adelante célula Iinkerl3 de la invención, que contiene la secuencia de nucleótidos CnAlinkerl3 o el vector de expresión Iinkerl3 de la presente invención y en la que es capaz de expresarse el péptido CnAlinkerl3 de la presente invención en condiciones adecuadas. La célula Iinkerl3 de la invención puede ser una célula procariota o eucariota en función de las necesidades concretas y pueden ser elaboradas por un experto en la materia con la información descrita en la presente memoria. La secuencia de nucleótidos, construcción genética, vector de expresión, las células huésped y el péptido CnAlinkerl3 de la presente invención pueden ser utilizado directamente o mediante su expresión genética, en células huésped para la elaboración de sistemas de identificación o screening de compuestos farmacéuticos reguladores de la actividad Calcineurina A, preferentemente antagonistas selectivos de Calcineurina A, mediante la determinación del efecto de la adición de un potencial compuesto sobre dicha actividad. En estos ensayos pueden utilizarse distintas combinaciones, uno o más, de las potenciales formas posibles del péptido CnAlinkerl3. El uso directo del péptido CnAlinkerl3 de la presente invención puede utilizarse, después de su extracción y purificación, en un ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas. En estos ensayos se puede utilizar conjuntamente las otras proteínas o fragmentos de las mismas implicadas en la interacción para la que se desea identificar compuestos reguladores, siendo en el presente caso por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: NFATc l-c4, Cabin-1/Cain, AKAP79 y MCIP; mientras que la interacción o no de dichas proteínas se puede valorar por ejemplo mediante Western blot (ver Ejemplo 1 y 2). Además, pueden llevarse a cabo ensayos in vivo en los que el péptido CnAlinkerl3 se expresa en dichas células huésped y en las que se determina dicha interacción proteína-proteína, por ejemplo, mediante un ensayo de co- inmunoprecipitación o de localización subcelular de NFAT (ver Ejemplo 3). Los compuestos a identificar pueden ser de distinto origen: natural (plantas, procariota, etc) ó sintético. Este sistema de screening puede medir o detectar (cuantitativa o cualitativamente) la unión competitiva de un compuesto candidato a un péptido señal, por ejemplo NFAT, mediante el mareaje directo o indirecto de alguno de los elementos de dicho sistema.
Por lo tanto, otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento o ensayo de identificación o de screening de nuevos compuestos farmacéuticos reguladores, preferentemente antagonistas selectivos, de la interacción de Calcineurina A con otras proteínas, por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite la invención, NFATc 1-4, cabin-1, AKAP79 y MCIP, y que comprende el uso de la secuencia de nucleótidos, construcción genética, vector de expresión, las células huésped y/o el péptido CnAlinkerl3 de la presente invención de forma aislada o en una de sus combinaciones posibles.. Otro objeto particular de la invención lo constituye un ensayo de identificación de compuestos farmacéuticos en el que el procedimiento es un ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas en el se utiliza el péptido CnAlinkerl3 de la presente invención (ver Ejemplo 1 y 2). Otro objeto particular de la invención lo constituye un ensayo de identificación de compuestos farmacéuticos en el que el procedimiento es un ensayo in vivo, por ejemplo un ensayo de co-inmunoprecipitación o de inmunodetección celular de NFAT, en el que se utiliza los vectores o células CnAlinkerl3 de la presente invención (ver Ejemplo 3).
Por otro lado, la presente invención se refiere a nuevos péptidos y a derivados de los mismos útiles como antagonistas selectivos de la actividad de la Calcineurina A, como por ejemplo, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, inhibidores de la activación de los linfocitos, es decir, como inmunosupresores. Como se ha comentado en el estado de la técnica en adultos, la CN juega un papel esencial en la activación de linfocitos T que está controlada por la regulación de la familia de factores de transcripción NFAT (factor nuclear de células T activadas) y en concreto por CN, que los desfosforila promoviendo su transporte al núcleo y en consecuencia la expresión de genes dependientes de NFAT. Además, las distintas isoformas de CN, Aa, Aβ y Aγ, presentan una homología de la región linker absoluta entre si (100%). Así, tal como se utiliza en la presente invención el término "antagonistas selectivos de la actividad de la Calcineurina A" se refiere a un antagonista selectivo de la actividad de cualquiera de las formas de Calcineurina A, es decir, Aa, Aβ y Aγ. Hay que recordar que la ruta de señalización CN/NFAT es la diana de la acción inmunosupresora de Ciclosporina A (CsA) y FK506. Así, estos nuevos péptidos inhibidores de las interacciones de Calcineurina A son útiles como herramientas para la investigación básica y como agentes terapéuticos por su efecto antagonista de la actividad de la calcineurina.
Tal como se usa en la presente invención el término "selectivos" se refiere a que la capacidad del péptido de la invención de actuar como antagonista de la actividad de la Calcineurina A es considerablemente mayor que su capacidad de actuar como antagonista de otras proteínas y, por otro lado, a que pueden seleccionarse péptidos más específicos para inhibir distintas actividades de la misma proteína Calcineurina A en función de la proteína con que interactúe, por ejemplo, cualquiera de las isoformas de NAFTcI, 2, 3 y 4., o cabin-1, AKAP79 y MCIP.
Por lo tanto, otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades, en adelante composición farmacéutica de la invención, que cursen con activación de la Calcineurina A, y preferentemente, a tílulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, con la activación del sistema inmunológico que comprende el péptido CnAlinkerl3 de la presente invención, sintético o recombinante, en una cantidad o dosis efectiva. Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el péptido CnAlinkerl3 pertenece al siguiente grupo: a) secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aá. CnA linker 13 (SEQ ID NOlO), b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a), c) secuencia de aá. que representa una mutación de cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) secuencia de aá. que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a). b) y c).
Otra realización concreta de la invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el péptido CnAlinkerl3 es el péptido caracterizado por la SEQ ID NOlO.
Otra realización concreta de la invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el péptido CnAlinkerl3 es un péptido que pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo:
- secuencia de aá. CnA S337P (SEQ ID NO12),
- secuencia de aá. CnA H339L (SEQ ID NO14), - secuencia de aá. CnA L343 S (SEQ ID NO 16),
- secuencia de aá. CnA S337P-H339L (SEQ ID NOl 8),
- secuencia de aá. CnA H339L-L343S (SEQ ID NO20),
- secuencia de aá. CnA S337P-L343S (SEQ ID NO22),
- secuencia de aá. CnA S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO24), - secuencia de aá. CnA (2-389) S337P (SEQ ID NO26),
- secuencia de aá. CnA (2-389) H339L (SEQ ID NO28),
- secuencia de aá. CnA (2-389) L343 S (SEQ ID NO30),
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-H339L (SEQ ID NO32),
- secuencia de aá. CnA (2-389) H339L-L343S (SEQ ID NO34), - secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-L343S (SEQ ID NO36), y
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO38).
Otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursen con activación de la Calcineurina A, y preferentemente, a tílulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, con activación de linfocitos T, tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes. Finalmente, otro objeto de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención como herramienta para la investigación básica para el aislamiento de nuevos sustratos de Calcineurina importantes para la señalización mediada por Calcio en diferentes especies.
DESCRIPCIÓN DE FIGURAS
Figura 1.- La región que une los dominios catalíticos y regulador de la subunidad catalítica de Calcineurina (CnA) está implicado en la interacción con las proteínas
NFAT. A) Alineamiento de las secuencias de las tres isoformas conocidas de la subunidad catalítica de Calcineurina humana (Aa, Aβ y Aγ). Los aminoácidos idénticos aparecen en recuadros y los residuos no conservados están en gris claro. B) Esquema de las construcciones de la subunidad catalítica CnAa humana que contienen el epítopo Flag. Los dominios funcionales están subrayados. Los recuadros en negro indican la posición de los dominios de unión a la subunidad reguladora [B] y a Calmodulina [C], y del dominio auto-inhibidor [AI] (f.l.= full length; c.a.= constitutivamente activa). C) Los aminoácidos 268 al 389 son necesarios para la interacción con el dominio regulador de NAFTc2. Las membranas muestran el resultado del ensayo de unión de las deleciones de CnAa a la proteína de fusión GST que contiene el dominio regulador de NFATc2. Este ensayo se realizó en presencia de un péptido control [C] o del competidor de alta afinidad VIVIT, ambos a una concentración de 10 μM. Las proteínas unidas a la membrana se analizaron mediante inmunodetección (western blotting). D) NFATc2 interacciona con los aminoácidos 267 al 388 de CnAa in vivo. La cantidad y el estado de fosforilación de las proteínas NFAT co-inmunoprecipitadas se analizó mediante 'western blotting'. Las posiciones de la proteínas NFATc2 fosforiladas (P) y desfosforilas (deP) están indicadas con flechas. IP (Inmunoprecipitación): α-FLAG (anticuerpo anti-FLAG); WB (Western-blot): α-NFATc2 (anticuerpo anti-NFATc2) y φ (equivale a vacío, sin inserto) E) Un péptido sintético basado en la región 'linker' de CnA (SEQ ID NOlO) compite la interacción entre NFATcI y Calcineurina. La membrana muestra el resultado de un ensayo de unión a la proteína GST fusionada a los aminoácidos 267-388 de CnAa con extractos celulares de células transfectadas con NFATcI. En este experimento se utilizaron bien un péptido control a 83 micromolar o un péptido basado en la secuencia 'linker' de CnA a dos concentraciones, 10 y 83 micromolar. La cantidad de NFATcI, indicada por las flechas, se detectó mediante 'western-blotting'.
Figura 2.- Tres mutaciones puntuales en la región 'linker' de CnA impiden la interacción in vitro de Calcineurina con NFATcI, NFATc2, Cabin-1 y AKAP79. (A y B) Las mutaciones impiden la interacción entre NFATcI y NFATc2 con Calcineurina. Los ensayos de unión a GST-NFAT se realizaron con extractos celulares de células transfectadas con las proteínas CnA mutantes en una, dos o tres posiciones (Serina 337 a Prolina, Histidina 339 a Leucina y Leucina 343 a Serina, según se indica). La proteína unida se detectó por ensayos de inmunodetección con el anticuerpo anti- Flag M5. (C) Las mutaciones en la región linker impiden la interacción con las secuencias de unión a Calcineurina de NFAT. (Arriba) Esquema de las proteínas de fusión GST-PxIxIT y GST-LxVP. (Abajo) Los ensayos de unión a GST-PxIxIT y GST- LxVP se llevaron a cabo con Calcineurina. Los ensayos de unión a GST-PxIxIT y GST- LxVP se realizaron con extractos celulares de células transfectadas con las proteínas CnA mutantes en una, dos o tres posiciones. La proteína unida se detectó por ensayos de inmunodetección con el anticuerpo anti-Flag M5. (D) Las mutaciones en la región 'linker' impiden la interacción con otras secuencias tipo PxIxIT. (Arriba) Representación esquemática de las construcciones GST-Cabin-1 y GST-AKAP79 empleada en los ensayos. Los números indican la posición de estos aminoácidos en la proteína silvestre, Cabin-1 y AKAP79, respectivamente. La secuencia tipo PxIxIT aparece detallada. (Abajo) Los ensayos de unión a GST-Cabin-1 y GST-AKAP79 se llevaron a cabo con Calcineurina. Los ensayos de unión a GST-Cabin-1 (carriles 1 al 7) y GST-AKAP79 (carriles 8 al 13) se realizaron con extractos celulares de células transfectadas con las proteínas CnA mutantes en una, dos o tres posiciones. La proteína unida se detectó por ensayos de inmunodetección con el anticuerpo anti-Flag M5. (E) Los extractos celulares utilizados en todos los ensayos fueron los mismos, procediendo todos ellos de la misma transfección, repartidos en alícuotas y conservadas a -70° C. Esta membrana muestra la cantidad usada por ensayo.
Figura 3.- Las proteínas mutadas en la región 'linker' de CnA no regulan a NFAT in vivo. (A y B) Las proteínas CnA mutadas en dos o tres posiciones dentro de la región 'linker' no desfosforilan ni a NFATc2 (A) ni a NFATcI (B) in vivo. Los extractos totales de células co-transfectadas con los imitantes de CnA y NFATc2 (A) o NFATcI (B) se cargaron en geles de poli-acrilamida para analizar el estado de fosforilación de estos miembros de la familia NFAT. La posición de NFAT tanto fosforilado (P) como desfosforilado (deP), indicada por flechas, se determinó mediante inmunodetección con anticuerpos específicos. (C) Las mutaciones en la región 'linker' no afectan a la actividad fosfatasa de la proteína. Los extractos celulares de las células transfectadas con las proteínas CnA mutadas en dos y tres posiciones dentro de la región 'linker' se utilizaron para valorar su actividad fosfatasa frente a un sustrato fosforilado específico de Calcineurina, el péptido RII. Este ensayo se realizó con el método "Biomol Green Cellular Assay Kit' de BIOMOL. (D) Las proteínas CnA mutadas en dos y tres residuos de la región 'linker' no translocan NFATc2 al núcleo. Las células HeLa se co- transfectaron con NFATc2 y las proteínas mutadas en uno, dos o tres residuos de la región 'linker'. Las fotografías muestran la localización subcelular de NFATc2 y CnA tras el análisis por microscopía confocal.
Figura 4.- La expresión ectópica del pέptido 'linker' en células inhibe de manera selectiva la desfosforilación de NFATc2. A) Las células HeLa se co-transfectaron con HA-NF ATc2, la construcción CnA constitutivamente activa y una construcción que expresaba la secuencia "VTVIT (carril 1) o la secuencia 'linker (carril 2) fusionada a GFP en su amino terminal. Los extractos celulares se analizaron por inmunodetección en membrana de nitrocelulosa utilizando un anticuerpo anti-HA (panel superior) o un anti- GFP (panel inferior). Las posiciones de la proteína NFATc2 fosforilada (P) y desfosforilada (deP) se indican con flechas. B) Estructura tridimensional de la subunidad catalítica derivada de la imagen cristalográfica del heterodímero Calcineurina. Representación tridimensional de la zona linker con la representación de los aminoácidos sustituidos en la región 'linker' durante la mutagénesis. La representación se realizó con el programa de uso público 'Deep View Swiss-Pdb Viewer' (Swiss Institute of Bioinformatics). Aparece detallada la región 'linker' (en blanco) y el cambio producido en las cadenas laterales por las mutaciones puntuales (en color). La tabla resume el efecto de las mutaciones puntuales en la interacción in vitro con las distintas secuencias de interacción con Calcineurina analizadas en este trabajo. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1.- Identificación del dominio de CnA que interviene en la regulación de
NFTAs
1.1.- La región que conecta el dominio catalítico con el dominio regulador de CnA se requiere para la interacción de la fosfatasa con NFAT.
Para identificar la región de CN que interacciona con las proteínas NFATs, se generaron una serie de construcciones con deleciones de la isoforma α de CnA humana (Figura IB) y se las expresó en células HEK-293. Los extractos celulares de estas células que expresan las indicadas proteínas etiquetadas con el epítopo flag se emplearon en experimentos de unión o interacción in vitro, usando el dominio regulador de NFATc2 fusionado a la proteína GST como cebo (SEQ ID NO 45; ver también SEQ ID NO43 y 44). A modo de ejemplo de las construcciones genéticas Cnalinkerl3 de la invención elaboradas con la secuencia flag se describe la SEQ ID NO53 - flag-CnA (267-388) - donde los nucleótidos 7-45 codifican para el péptido flag. La unión de las flag-proteínas se llevó a cabo en presencia de 10 μM de un péptido control ((C), SEQ ID NO42) o del péptido de alta afinidad derivado del PxIxIT (VIVIT) (SEQ ID NO39) (Aramburu et al 1999), que inhibe la interacción CN/NFAT. La proteína unida o no se detectó por "inmunoblotting" con anticuerpo anti-flag. Únicamente la proteína que contiene del residuo 2 al 389 (SEQ ID NO8), que conserva la estructura de la proteína completa y es constitutivamente activa (O'Keefe et al 1992), interaccionó específicamente con el dominio regulador de NFATc2 (Figura IC). El análisis de estos resultados sugiere que los aminoácidos entre los residuos 269 y 389 son necesarios para la interacción entre estas dos moléculas (ver Figura IB). Para comprobar si esta región mediaba la interacción específica y descartar que simplemente mantenía la conformación adecuada de la proteína, se co-expresó la región de CnAa que contiene los residuos del 267 al 388 (CnA267-388, SEQ ID NO41) con NFATc2 (SEQ ID NO 45) para analizar su interacción in vivo en experimentos de co- inmunoprecipitación. Como se muestra en la Figura ID, la CN constitutivamente activa - no posee el dominio inhibidor - (c.a., residuos 2-389, SEQ ID NO8) se une a NFATc2 la cual se desfosforila (carril 2), mientras que la proteína completa (p.c o f.l., SEQ ID NO2) y CnA267-388 (SEQ ID NO41) se unen a la proteína fosfo-NFATc2 de igual forma (carril 4 y 3, respectivamente). Estos resultados confirmaron la interacción in vivo entre NFATc2 y los residuos 267-388 de CnA (SEQ ID NO41). Posteriormente, se realizaron ensayos in vitro con la proteína de fusión GST- CnA267-388 y extractos de células HEK-293 transfectadas con NFATcI (SEQ ID NO51). En estos experimentos, GST- CnA267-388 fue capaz de arrastrar NFATcI de las células transfectadas (Figura IE, carril 2). La secuencia de CnA267-388 (SEQ ID NO41) contiene el extremo carboxilo terminal del dominio catalítico, el dominio de unión a CnB, y la secuencia linker que une ambas regiones. La estructura de CN por rayos -X indicaba que los únicos aminoácidos accesibles en la región 269-389 están ubicados en la secuencia de 13 aminoácidos (residuos 335 a 347 de la proteína CnA alpha original depositada en el Genbank con número de acceso NM 000944, o los residuos 348 a 360 de la proteína de fusión utilizada en la presente invención CnA (2-521), SEQ ID NO2) que une los dominios catalítico y regulador de CnA - región linker - (Griffith et al 1995; Kissinger et al 1995) (ver Figura 4B). Para comprobar si esta secuencia estaba implicada en la interacción de NFATcI con CN, se generó un péptido sintético con esta secuencia (SEQ ID NOlO) y se empleó como un posible competidor en los experimentos de interacción in vitro. Como se muestra en la Figura IE, este péptido de 13 aminoácidos de la región linker a concentraciones tan bajas como 10 μM bloqueaba la interacción (carril 3 y 4), mientras que un péptido control (C) no tenía efecto (carril 5).
1.2.- La sustitución de aminoácidos específicos dentro de la región linker altera la interacción con NFAT in vitro. Un análisis mutacional en levaduras ha mostrado que tres residuos específicos -
337, 339 y 343 - dentro de la región linker de CnA de levaduras son necesarios para la actividad CN inducida por stress in vivo (Jiang & Cyert, 1999). Aunque las levaduras carecen de NFAT, estos residuos están conservados en todas las secuencias conocidas de CN, por lo que se analizó su implicación potencial en la interacción entre CnA humana y dos miembros NFAT. La homología existente entre este dominio linker de CnA en levaduras (S. cerevisae y S. Pombe) y en humanos es completa. Para ello se construyeron péptidos sintéticos, que comprenden dicha región linker en la que se sustituyó cada uno de estos tres aminoácidos (S337P, H339L y L343S, son representaciones mutadas de dicha región linker,), por separado o en combinación, dentro de la secuencia que codifica para los residuos 2-389 de la CnAa humana (estas secuencias peptídicas se definen en las SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 y 38). Se analizaron extractos de células HEK-293, que expresaban las distintas flag- proteínas CnA con las sustituciones simples, dobles o triples, en experimentos de unión in vitro a GST (Figura 2A y 2B, carril 10), GST-NF ATc2 (SEQ ID NO45; Figura 2A, carriles 1- 9) o GST-NFATcI (SEQ ID NO51; Figura 2B, carriles 1-9). Mediante inmunodetección con un anticuerpo anti-flag, se observó que la mutación de cualquiera de estos residuos abolía la interacción entre CnA y el dominio regulador de NFATc2 (Figura 2A). Sin embargo, la interacción entre CnA y NFATcI se detectó tras la sustitución en la posición 337 (Figura 2B, carril 3), lo que mostraba que la interacción con CN difiere entre los miembros NFAT. Cuando se ensayaron las restantes proteínas imitantes de CnA se observó una inhibición completa de la interacción con NFATcI. 1.3.- Los motivos de unión a CN, PxIxIT y LxVP, en NFAT intcraccionan con la región linker de CnA.
Las dos secuencias conocidas de NFAT que interaccionan con CN son el motivo PxIxIT, presente en todas las proteínas NFAT (el, c2, c3 y c4) reguladas por CN, y el sitio LxVP, que está implicado en la interacción de NFATcI, c3 y c4 con CN. Para identificar la(s) región(es) de CnA que interaccionan con estas secuencias de NFAT, se generaron proteínas de fusión GST con el motivo PxIxIT (de NFATc2, SEQ ID NO45) o el motivo LxVP (de NFATcI) (SEQ ID NO51, ver también SEQ ID NO47). Las proteínas imitantes de CnA expresadas en células HEK-293 (SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 y 38) se ensayaron en experimentos de interacción in vitro con GST (Figura 2C, carril 1), GST-PxIxIT (Figura 2C, carriles 2-7), y GST-LxVP (Figura 2C, carriles 8-13) como cebos. La unión de las proteínas CN se analizó por inmunodetección con anti- flag. En estos ensayos la proteína salvaje de CnA (2-389) se unió eficientemente a ambas proteínas de fusión GST-PxIxITb y GST-LxVP (Figura 2C, carriles 2, 8), pero ninguno de las proteínas imitantes fue capaz de unirse a la proteína GST-PxIxIT (Figura 2C, carriles 3-7). Únicamente la CnA con la sustitución en la posición S337P se unió a GST-LxVP (Figura 2C, carril 9). Por tanto, los motivos PxIxIT y LxVP parece que se unen con la región linker de CnA a través de distintos aminoácidos pero solapantes.
Ejemplo 2.- La región linker de CnA también esta implicada en la interacción con otras proteínas que unen CN. Algunas de las proteínas endógenas que unen CN contienen un motivo similar al
PxIxIT dentro de la región que interacciona con CN (Cabin-1/Cain, AKAP79 y MCIP, ver estado de la técnica). Se analizó la interacción de las proteínas imitantes de CN con las secuencias de unión a CN de dos de estas proteínas, Cabin-1 y AKAP79 (Figura 2D). Los extractos celulares de HEK-293 expresando las indicadas proteínas imitantes de CnA (SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 y 38) se ensayaron en experimentos de interacción in vitro, y la unión a GST (Figura 2D, carril 1), GST-Cabin 1 (Figura 2D, carriles 2-7) y GST-AKAP79 (Figura 2D, carriles 8-13) se determinó por inmunodetección con anticuerpo anti-flag. Únicamente, la CnA mutada en la posición L343S (carriles 5 y 11) fue capaz de interaccionar con los dominios de Cabin 1 y AKAP79 de forma tan eficiente como la proteína salvaje de CnA (carriles 2 y 8). La región linker de la CN, por tanto, parece ser crítica para su interacción con estas dos proteínas, y sustituciones en un único aminoácido afectan diferencialmente la unión de la CN a diferentes proteínas que contienen motivos PxIxIT.
En todos estos ensayos se emplearon cantidades equivalentes de la forma salvaje y las proteínas imitantes de CN (Figura 2E). Además, la capacidad de todos los imitantes de CnA para interaccionar con CnB fue similar a la de la proteína salvaje de CnA.
Ejemplo 3.- Papel de la región linker de la CnA en la desfosforilación y en el transporte nuclear de NFAT.
Para determinar el impacto de estas sustituciones de aminoácidos en la interacción proteína-proteína in vivo, se analizó por co-inmunoprecipitación con anticuerpo anti-flag la proteína NFATcI que se unía a cada proteína flag-CnA (SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 y 38). La sustitución de un simple aminoácido no alteraba la unión de NFATcI que mostraba la forma salvaje constitutivamente activa de CN. Sin embargo, las proteínas CnA con una mutación doble o triple no interactuaban con NFATcI (datos no mostrados). Para analizar la desfosforilación y la localización subcelular de NFATcI in vivo, se realizaron ensayos de inmunodetección a partir extractos celulares de células HEK-293 co-transfectadas con NFATcI ó NFATc2 y las diferentes construcciones de CnA(2-389). Estos extractos celulares se utilizaron para analizar el estado de desfosforilación de NFAT. Como se muestra en la Figura 3A, la proteína silvestre constitutivamente CnA (2-389) desfosforila NFATc2, y la mutación de dos o tres residuos en la zona 'linker' inhibe dicha desfosforilación. El mismo resultado se obtuvo cuando se analizó NFATcI (Figura 3B).
Para descartar que las mutaciones en más de un residuo podrían afectar a la actividad per se de la subunidad catalítica de Calcineurina, CnA, se analizó la actividad fosfatasa de dichas proteínas mutadas utilizando como sustrato específico de Calcineurina el péptido RII fosforilado. La actividad fosfatasa de las proteínas mutadas en más de un residuo de la zona 'linker' era incluso mayor que la detectada cuando se comparaba con la proteína sin mutar o silvestre (Figura 3C). El hecho de que las proteínas mutadas en más de un residuo puedan no interaccionar con proteínas o sustratos inhibidores de la actividad fosfatasa (como es el caso de Cabin-1 y AKAP79) podría ser la explicación al aumento de la actividad fosfatasa de las proteínas mutadas en comparación con la CnA(2-389) silvestre.
El siguiente paso fue analizar el efecto de la expresión de las proteínas de CnA mutadas (SEQ ID NO26, 28, 30, 32, 34, 36 y 38) en la localización subcelular de NFAT. Con este fin, se realizó co-transfecciones en células HeLa con HA-NF ATc2 y las proteínas Flag-CnA. Como era de esperar, la expresión de la proteína CnA completa, aminoácidos 2-521 (wt full length) que no es constitutivamente activa (precisa de altos niveles intracelulares de Calcio) no provocaba la translocación al núcleo de NFATc2. Sin embargo, la expresión de la construcción constitutivamente activa sin mutar, wt CnA (2-389), provocaba un patrón de expresión nuclear de la proteína NFATc2. En cambio, las proteínas mutadas en más de un residuo de la zona 'linker', no afectaban a la localización citosólica de NFATc2, es decir, inhibían su entrada en el núcleo de la célula (Figura 3D). Los resultados al analizar NFATcI fueron similares (datos no mostrados). Estos resultados confirmaban el resultado obtenido en la Figura 3C. Aunque las mutaciones puntuales afectaban de forma notable la interacción in vitro de estas proteínas con NFAT, in vivo es necesario mutar más de un residuo de la zona 'linker' para evitar la desfosforilación y, por consiguiente, translocación al núcleo de las proteínas NFAT en células transfectadas. Para finalmente confirmar el papel de la secuencia linker de Calcineurina en la interacción in vivo con NFAT, se co -expresó NFATc2 y la construcción constitutivamente activa de Calcineurina no mutada en presencia de una proteína GFP fusionada bien al péptido competidor e inhibidor VIVIT o a la secuencia 'linker' silvestre (SEQ ID NOlO). Como se puede observar en la Figura 4A, ambas proteínas de fusión inhibieron la desfosforilación de NFATc2 (carriles 1 y 2) que se observa cuando se transfecta la proteína GFP sin fusionar a ninguna secuencia. Estos resultados demuestran que NFAT interacciona con la secuencia 'linker' de CnAa in vivo. MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos
IPTG (Iso-Propil Tio-galactósido) se compró en Apollo Scietific. La resina GSH se obtuvo de la casa Amersham-Pharmacia. Los anticuerpos monoclonales anti-Flag (M5 y M2) y al anticuerpo acoplado a agarosa se compraron a Sigma-Aldrich. El sobrenadante que contiene el anticuerpo anti-HA se creció a partir del clon 12CA5. El anticuerpo anti-NFATcl (7A6) se obtuvo de la casa Alexis. El suero policlonal anti-
GFP fue generosamente cedido por el Dr. I. Crespo. Todos los oligonucleótidos y el péptido 'linker' (NCSPHPYWLPNFM) se sintetizaron en Isogen. Los péptidos VIVIT (MAGPHPVIVITGPHEE) y Control (MVGIPVAIHGTPPHEE) se obtuvieron del servicio de síntesis de proteínas del Centro de Biología Molecular 'Severo Ochoa'.
Plásmidos
La secuencia completa de ADN complementario que codifica la isoforma alfa de la subunidad catalítica de Calcineurina humana (hCnAα) (aminoácidos 2-521) se amplificó mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) a partir de ARN total de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC). Las condiciones de los 25 ciclos fueron: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 58°C y 2 minutos a 72°C. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados fueron: Codificante (5' CGGGATCCGAGCCCAAGGCAATTGATC 3') y Reverso (5'
GCTCTAGAAGTGGTCACTGAATATTGCTGCTATTAC 3'). El producto amplificado se digirió con las enzimas de restricción BamHI y Xbal y se clonó en el vector pEF-Flag (generosamente enviado por el Dr. R. Treissman) previamente digerido con estas enzimas. El resultado final fue la obtención de la construcción pEF-Flag- hCnAα(2-521).
La región que codifica los aminoácidos 2-397 de hCnAα se amplificó por PCR a partir de ARN total extraído de un cultivo de la línea celular Jurkat. Las condiciones de PCR fueron: 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 62° C, 1 minuto a 72°C durante los 10 primeros ciclos, y 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 68° C y I minuto a 72° C durante los 20 ciclos restantes. La secuencias de los oligonucleótidos utilizados fueron: Codificante (5' AGATCTGAGCCCAAGGCAATTGATCCC 3') y Reverso (5'
TCGCGACCTTATCACTTTCCGGGC 3'). El producto de PCR se clonó directamente en el vector pGEM-T de Promega y de ahí se aisló un fragmento tras digerir con las enzimas de restricción BgIII y PvuII que codifica para la deleción constitutivamente activa de Calcineurina (aminoácidos 2-389). Este fragmento se clonó en el vector pEF- Flag para general el plásmido pEF-Flag-hCnAα(2-389). El plásmido pEF-Flag- hCnAα(2-268) se generó mediante el clonaje del fragmento de ADN obtenido mediante la digestión con BamHI y EcoRI de la construcción pGEM-T-hCnAα(2-397) y su posterior clonaje en el vector pEF-Flag. El plásmido pEF-Flag-hCnAα(2-173) se obtuvo mediante el clonaje en el vector pEF-Flag de un fragmento de ADN BamHI protuberante en un extremo y romo en el otro extremo (generado mediante digestión con MIuI más reacción de relleno con Klenow). Las reacciones de mutagénesis dirigida se llevaron a cabo con el 'Quikchange mutagénesis kit' de Stratagene. Todas las secuencias se confirmaron mediante reacciones de secuenciación.
Los plásmidos pGEX-hCnAα(267-388) y pEF-Flag-hCnAα(267-388) se generaron mediante el clonaje de un fragmento de ADN aislado mediante digestión con EcoRI de la construcción pEF-Flag-hCnAα(2-389) en el vector parental correspondiente (pGEX o pEF-Flag) digerido con EcoRI y posteriormente desfosforilado. El plásmido de expresión que codifica la subunidad reguladora de Calcineurina, CnB (pBJ5-mCnB) y utilizado en las transfecciones fue enviado por el Dr. J. Heitman.
La construcción pGEX-NFATcl que contiene el dominio regulador de NFATcI (aminoácidos 1-418) fusionado a la proteína Glutatión-S-Transferasa (GST) fue generosamente enviada por la Dra. A. Rao. La construcción que contiene el dominio regulador de NFATc2 fusionado a GST, pGEX-NFATc2, se obtuvo mediante el clonaje del ADN complementario que codifica para los aminoácidos 4 a 385 de NFATc2 en el vector pGEX4-T3 (Amersham Biosciences). El plásmido de expresión pEF-BOS-HA-NFATc2, que codifica la proteína
NFATc2 completa con el epítopo de la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza en su amino terminal ha sido descrito previamente en la literatura (Gómez del Arco et al., 2000).
El plásmido de expresión pcDNA3.1-NFATcl se obtuvo mediante el clonaje en el vector pcDNA3.1-myc-His-B (Invitrogen) de un producto de PCR amplificado a partir del plásmido pSH107c-NFATcl. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados fueron: Codificante (5'
GGGGGATCCAGGATGCCAAGCACCAGCTTTCCA 3') Reverso (5' GGGTCTAGACTGAAAAAGCACCCCACGCGCTC 3'). Las condiciones durante los 30 ciclos de reacción fueron: 1 minuto a 94° C, 1 minuto a 60° C y 2 minutos a 72° C.
Los plásmidos que expresan las secuencias de los péptidos fusionados a GFP se obtuvieron mediante el clonaje de oligonucleótidos de doble banda (generados mediante el anillamiento in vitro de oligonucleótidos complementarios) en el vector pEGFP
(Clontech). Las secuencias de los oligonucleótidos empleados fueron: Linker codificante (5'
GATCCACCATGAACTGTTCTCCTCATCCATACTGGCTTCCAAATTTCATG 3 '),
Linker complementario (5' TCGACATGAAATTTGGAAGCCAGTATGGATGAGGAGAACAGTTCATGGTG
3'),
VIVIT codificante (5'
TCGAGCATGGCAGGTCCACATCCAGTCATCGTTATCACCGGTCCACATGAG GAAGGCGGACC 3') y VIVIT complementario (5' CATGGGTCCGCCTTCCTCATGTGGACCGGTGATAACGATGACTGGATGTGG
ACCTGCCATGC3').
El fragmento de ADN que contiene la secuencia LxVPcI se obtuvo mediante digestión del plásmido pGFP-LxVPcl con BamHI y EcoRI y se clonó en el vector pGEX-3X para generar el plásmido pGEX-LxVPcl. El fragmento de ADN que contiene la secuencia PxIxITcI obtenido tras digerir la construcción pGFP-PxMTc2 con las enzimas de restricción BgIII y BamHI se clonó en el vector pGEX-3X para obtener el plásmido pGEX-PxMTc2.
Los fragmentos que codifican las secuencias de interacción con Calcineurina de las proteínas humanas AKAP79 y Cabin-1 se obtuvieron mediante amplificación por PCR a partir de ARN total extraído de células Jurkat. Las condiciones de los 40 ciclos fueron: 1 minuto a 94° C, 1 minuto a 58° C y 50 segundos a 72° C. Los oligonucleótidos empleados fueron: hCabin-1 codificante (5'
GCGGATCCAAGTTCCCCCCTGAGATCACC 3'), hCabin-1 reverso (5' GCGAATTCAAATGTCCATGTAGTCGTCGTCC 3'), hAKAP79 codificante (5' GCGGATCCGAAAAACAAGATGTTCAACCCCAGCAAG 3') y hAKAP79 Reverso (5' GCGAATTCAAAAACCATTATCATTAGCAAAAACCCCTACTTGC 3'). Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron en el vector pGEX-6Pl para obtener las correspondientes construcciones, pGEX-hCabin-1 y pGEX-AKAP79. Expresión y purificación de las proteínas de fusión GST
Todas las proteínas fusionadas a GST se expresaron en la cepa bacteriana E. coli BL-21. El cultivo inoculado la noche anterior se diluyó 1/20 con medio de cultivo a la mañana siguiente y se dejó crecer a 37°C con agitación hasta que el cultivo alcanzó una absorbancia entre 0,6 y 0,8 a una densidad óptica de 600nm. La expresión de las proteínas de fusión se indujo al añadir IPTG al cultivo a una concentración final de ImM e incubándolo durante 3 horas más a 37° C con agitación fuerte. Después el cultivo bacteriano se centrifugó, y las bacterias se resuspendieron en PBS que contenía 10 mM EDTA, se sometieron al proceso de sonicación y después se les añadió el detergente Tritón X-100 hasta el 1% concentración final. Para eliminar los restos celulares presentes en la muestra, esta se sometió a centrifugación y el sobrenadante que contiene las proteínas solubles se cargó en una columna Glutatión (GSH)-sefarosa 4B (Amersham Biosciences), y las proteínas de fusión que contienen GST, unidas a la columna de sefarosa, se guardaron a 4°C. La cantidad de proteína purificada y su grado de pureza se comprobó mediante tinción de coomassie en gel de acrilamida.
Cultivos celulares, transfecciones y extractos celulares
Las líneas celulares HEK-293 y HeLa se crecieron en medio de cultivo DMEM (Dulbecco-Modified Eagle Médium) con 10% de suero fetal bovino y suplementado con L-Glutamina y antibióticos (penicilina y estreptomicina). Las transfecciones transitorias en las células HEK-293 se realizó siguiendo el método modificado del fosfato calcico ya descrito (Rodríguez and Flemington, Anal Biochem 1999). Las células HeLa se transfretaron con el reactivo lipofectamina Plus de Invitrogen siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las células transfectadas se lavaron con buffer fosfato (PBS), se despegaron de las placas de cultivo y se centrifugaron a 4°C. La lisis de las células se realizó con 100 microlitros bien con el tampón BB02 (20 mM Tris pH8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 0.2% Tritón X-100) para las transfecciones con las proteínas que contienen el epítopo Flag o con el tampón 1% Tritón X-100 suplementado con 1 mM CaCl2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 10 mM sodio pirofosfato, 10 mM NaF and 1% Tritón X-100) para las transfecciones con NFAT. Para el análisis del estado de fosforilación de NFAT las células transfectadas se Usaron en un tampón de alta sal (20 mM Hepes pH 7.6, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Tritón X-100). La lisis en todos los casos se completó mediante la incubación con agitación a 4°C durante 15 minutos. Las muestras se centrifugaron posteriormente a alta velocidad (13.000 rpm) en centrífuga de mesa refrigerada durante 15 minutos. El sobrenadante que contiene las proteínas solubles se transfirieron a otros tubos y se congelaron inmediatamente a -70° C.
Inmunofluorcsccncias y análisis confocal
Las células HeLa transfectadas sembradas sobre cubreobjetos de vidrio se fijaron con una solución de 4% formaldehído y 4% Sacarosa en tampón fosfato (PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras esta incubación los cubreobjetos se lavaron tres veces con tampón fosfato, y se trataron durante 10 minutos con tampón fosfato que contenía 0,25% de Tritón X-100 para permeabilizar las células fijadas. Los cubreobjetos se incubaron después con un tampón saturante (10% albúmina de suero bovino en tampón fosfato) durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación durante 1 hora con tampón saturante que contenía el anticuerpo primario (antisuero policlonal anti-NFAT 672 diluido 1:1000 o anti-Flag M2 diluido 1:750). Las muestras se lavaron tres veces con tampón fosfato y se incubaron durante Ih con los anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos y diluidos 1:000 en tampón saturante (Alexa Flúor 594 diluido para el antisuero y Alexa 488 para el anticuerpo monoclonal). Tras tres lavados con tampón saturante, las muestras se analizaron con el microscopio confocal Radiance 2100 (Bio-Rad) para analizar la localización subcelular de las proteínas NFAT y Calcineurina transfectadas.
Ensayos de unión a proteínas de fusión GST Las proteínas de fusión GST unidas a la columna de Glutatión (GSH)-sefarosa
4B se lavaron con el tampón BB02 (20 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 1.5 mM CaCl2, 0.2% Tritón X-100) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C en presencia de 60 microlitros del Usado de células HEK-293 transfectadas con las proteínas Flag-Calcineurina. Tras esta incubación, la columna se lavó cinco veces con 1 volumen (60 microlitros) de BB02 y las proteínas retenidas en la columna se eluyeron mediante el calentamiento de las muestras a 99°C durante 10 minutos en presencia del tampón Ix Laemli. Las muestras se cargaron en un gel de poli-acrilamida/SDS, este gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y las proteínas presentes en la membrana se detectaron mediante la técnica 'western-blotting'.
Ensayos de co-inmunoprecipitación
Las células HEK-293 transfectadas se Usaron en un tampón sin calcio (20 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 0.2% Tritón X-100), y a partir de 100 microlitros de estos extractos celulares se purificaron las proteínas expresadas que contenían el epítopo Flag con 10 microlitros del anticuerpo anti-Flag acoplado a agarosa (la agarosa había sido previamente equilibrada con el mismo tampón con 0.2% de albúmina de suero bovino). La mezcla de extracto con la agarosa se incubó girando durante 1 hora a 4o C. Tras la incubación, las muestras se centrifugaron en frío, se lavaron cinco veces con 1 volumen (100 microlitros) del mismo tampón en frío, y las proteínas unidas a la agarosa se analizaron mediante 'western-blotting'.
Western-blotting (Inmuno-detección de proteínas en membrana o filtro)
El tampón Laemli (receta) se añadió a las muestras hasta una concentración final IX, y éstas se calentaron durante 10 minutos a 99°C, se cargaron en geles de poli- acrilamida/SDS y, tras la separación electroforética de las proteínas en condiciones reductoras, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se incubaron primero con un tampón saturante (5% de leche desnatada en polvo disuelta en tampón fosfato) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras lavar las membranas con tampón fosfato que contiene 0,1% de detergente Tween-20, se incubaron con la solución de anticuerpo primario (ver tabla con diluciones, tiempo y tampón). Tras la incubación, las membranas se lavaron con el tampón correspondiente y se incubaron con la solución de anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa, seguido de los lavados con el tampón correspondiente. La detección de los anticuerpos unidos a la membrana se realizó mediante reacción de quimioluminiscencia (ECL) siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Figure imgf000028_0001
Medida de la actividad fosfatasa
La medida de la actividad fosfatasa se realizó a partir de extractos celulares de células transfectadas con las diferentes proteínas imitantes de Calcineurina utilizando el ensayo 'Biomol Green Cellular Assay Kit' de BIOMOL, siguiendo el protocolo aconsejado por el fabricante.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Secuencia de aminoácidos (aá.) caracterizado porque mimetiza interacciones de la Calcineurina A y porque está constituida por una secuencia de aminoácidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aá. CnA linker 13
(SEQ ID NOlO), b) secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a), c) secuencia de aá. que representa una mutación de cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) secuencia de aá. que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
2.- Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 caracterizada porque es el péptido CnA linker 13 (SEQ ID NOlO).
3.- Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de aá. de c) que representa una mutación pertenece al siguiente grupo:
- secuencia de aá. CnA S337P (SEQ ID NO12),
- secuencia de aá. CnA H339L (SEQ ID NO14),
- secuencia de aá. CnA L343S (SEQ ID NO16),
- secuencia de aá. CnA S337P-H339L (SEQ ID NO18), - secuencia de aá. CnA H339L-L343S (SEQ ID NO20),
- secuencia de aá. CnA S337P-L343S (SEQ ID NO22), y
- secuencia de aá. CnA S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO24).
4.- Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 1 caracterizada porque la secuencia de aá. de d) pertenece al siguiente grupo: - secuencia de aá. CnA (2-389) S337P (SEQ ID NO26),
- secuencia de aá. CnA (2-389) H339L (SEQ ID NO28),
- secuencia de aá. CnA (2-389) L343 S (SEQ ID NO30),
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-H339L (SEQ ID NO32),
- secuencia de aá. CnA (2-389) H339L-L343S (SEQ ID NO34), - secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-L343S (SEQ ID NO36), y
- secuencia de aá. CnA (2-389) S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO38).
5.- Secuencia de nucleótidos caracterizada porque codifica una secuencia de aminoácidos según las reivindicaciones 1 a la 4.
6.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5 caracterizada porque está constituida por una secuencia de nucleótidos perteneciente al siguiente grupo: a) secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia CnA linker 13 (SEQ
ID NO9), b) secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a), c) secuencia de nucleótidos. que representa una mutación de cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).
7.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 caracterizada porque es la secuencia CnA linker 13 (SEQ ID NO9).
8.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 caracterizada porque la secuencia de nucleótidos de c) que representa una mutación pertenece al siguiente grupo:
- secuencia de nucleótidos CnA S337P (SEQ ID NOl 1), - secuencia de nucleótidos CnA H339L (SEQ ID NOl 3),
- secuencia de nucleótidos CnA L343 S (SEQ ID NO 15),
- secuencia de nucleótidos CnA S337P-H339L (SEQ ID NOl 7),
- secuencia de nucleótidos CnA H339L-L343S (SEQ ID NO19),
- secuencia de nucleótidos CnA S337P-L343 S (SEQ ID NO21 ), y - secuencia de nucleótidos CnA S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO23).
9.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 caracterizada porque la secuencia de de nucleótidos de d) pertenece al siguiente grupo:
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P (SEQ ID NO25),
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) H339L (SEQ ID NO27), - secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) L343 S (SEQ ID NO29),
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P-H339L (SEQ ID NO31),
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) H339L-L343S (SEQ ID NO33), - secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P-L343S (SEQ ID
NO35), y
- secuencia de secuencia de nucleótidos CnA (2-389) S337P-H339L-L343S (SEQ ID NO37).
10.- Construcción genética caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a la 9.
11.- Construcción genética según la reivindicación 11 caracterizada porque comprende además una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o la detección del péptido expresado.
12.- Construcción genética según la reivindicación 11 caracterizada porque es una secuencia de polihistidina (6xHis) o una secuencia peptídica flag reconocible por un anticuerpo.
13.- Vector de expresión génica caracterizado porque comprende la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a la 9 o la construcción genética según las reivindicaciones 10 a la 12.
14.- Vector de expresión génica según la reivindicación 13 caracterizado porque es un plásmido.
15.- Célula transformada caracterizada porque contiene la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a la 9, la construcción genética según las reivindicaciones
10 a la 12 o el vector de expresión según las reivindicaciones 13 y 14.
16.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos reguladores de la interacción de Calcineurina A con otras proteínas caracterizado porque comprende el uso de un péptido según las reivindicaciones 1 a la 4, la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 5 a la 9, la construcción genética según las reivindicaciones
10 a la 12, el vector de expresión según las reivindicaciones 13 y 14 o la célula transformada según la reivindicación 15 de forma aislada o en una de sus combinaciones posibles.
17.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos según la reivindicación 16 caracterizado porque los compuestos potencialmente de interés son antagonistas selectivos de la actividad biológica de Calcineurina A.
18.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos según la reivindicación 16 caracterizado porque los compuestos regulan la interacción de
Calcineurina A con las proteínas NFATcl-4, cabin-1, AKAP79 y MCIP.
19.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos según la reivindicación 16 porque es un ensayo in vitro de interacción o unión de proteínas.
20.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos según la reivindicación 15 caracterizado porque es un ensayo in vivo.
21.- Procedimiento de identificación de nuevos compuestos farmacéuticos según la reivindicación 20 caracterizado porque el ensayo in vivo pertenece al siguiente grupo: un ensayo de co-inmunoprecipitación o de inmunodetección celular de NFAT.
22.- Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades humanas caracterizada porque comprende un péptido según las reivindicaciones 1 a la 4 en una cantidad o dosis efectiva.
23.- Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 22 en la profilaxis y tratamiento de enfermedades humanas que cursan con activación de la Calcineurina A.
24.- Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 23 caracterizado porque la enfermedad humana cursa con activación de linfocitos T y pertenece al siguiente grupo: enfermedades autoinmunes, inflamación, alergia o situaciones de rechazo a transplantes.
25.- Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 22 como herramienta para la investigación básica para el aislamiento de nuevos sustratos de Calcineurina para la señalización mediada por Calcio.
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