ES2322704T3 - Procedimiento de deteccion de la prp utilizando un antibiotico de los aminoglicosidos del grupo ii. - Google Patents
Procedimiento de deteccion de la prp utilizando un antibiotico de los aminoglicosidos del grupo ii. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2322704T3 ES2322704T3 ES03799681T ES03799681T ES2322704T3 ES 2322704 T3 ES2322704 T3 ES 2322704T3 ES 03799681 T ES03799681 T ES 03799681T ES 03799681 T ES03799681 T ES 03799681T ES 2322704 T3 ES2322704 T3 ES 2322704T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- prp
- aminoglycoside
- group
- streptomycin
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 title claims abstract description 31
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 23
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 98
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 49
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 claims description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 17
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 17
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 11
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 9
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 9
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 9
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 5
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 claims description 4
- 241000282817 Bovidae Species 0.000 claims description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 claims description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 abstract description 16
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 101710138751 Major prion protein Proteins 0.000 description 55
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 6
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 6
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 2
- 108010007288 PrPSc Proteins Proteins 0.000 description 2
- QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N Streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@H](N=C(N)N)[C@@H](O)[C@@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YZTFXSNBSA-N 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000000389 anti-prion effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000017580 chronic wasting disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108010071967 protein K Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2828—Prion diseases
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/104998—Glucose, ketone, nitrate standard or control
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
Abstract
Procedimiento de detección de la PrP, en particular de la PrP sc , caracterizado porque se pone en presencia un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano con un antibiótico elegido entre la familia de los aminoglicósidos del grupo II.
Description
Procedimiento de detección de la PrP utilizando
un antibiótico de los aminoglicósidos del grupo II.
La presente invención se refiere a un método de
precipitación total de PrP^{sc} con sulfato de estreptomicina y
su utilización para la inmunodetección o la eliminación de la
PrP^{sc} de líquidos o de soluciones.
La proteína prión nativa o normal, designada PrP
o PrP^{c} para la proteína prión celular, es una glicoproteína
ampliamente expresada en las células linfoides y neuronales de los
mamíferos.
Cambios conformacionales de PrP^{c} conducen a
la aparición y a la propagación de la proteína patógena PrP^{sc}
que es resistente a la proteinasa K. Esta proteína patógena puede
denominarse PrP^{sc} o PrP^{res} indiferentemente. La
acumulación de PrP^{sc} en los órganos de los animales está en el
origen de numerosas enfermedades y principalmente de la tembladera
de los pequeños rumiantes, de la enfermedad caquetizante crónica (o
chronic wasting disease "CWD" en inglés) del alce y el
antílope, de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y de la
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (ECJ) en el ser
humano.
La aparición tardía después de un período de
incubación de 2 a 6 años y el desarrollo lento de los síntomas en
el ganado infectado por la EEB ha ralentizado el desarrollo de
modelos epidemiológicos. La ESB es transmisible por ingestión en el
ser humano y a conducido a la aparición de una nueva forma de
enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (vECJ).
La detección de la proteína patógena PrP^{sc}
es difícil en los animales infectados sanos antes del desarrollo de
la enfermedad y sobre todo en la sangre y la orina de los animales
enfermos. En la actualidad se ha establecido que la PrP^{sc}
presente en los animales destinados a la alimentación humana se
transmite en el ser humano durante la ingestión de los tejidos
infectados. Un objetivo mayor de salud pública es por lo tanto
evitar esta transmisión al detectar la PrP^{sc} en animales
destinados al consumo humano con vista a retirarlos de la cadena
alimentaria.
La detección de la presencia de PrP^{sc} en
muestras biológicas o en animales se vuelve por lo tanto de extrema
importancia y varios equipos de investigadores desarrollan métodos
de detecciones inmunológicas (WO02/086511). Además, métodos para
complejar péptidos a la PrP^{sc}, pequeñas moléculas o inhibidores
en vista del tratamiento de vECJ son objeto de investigaciones
activas. Sin embargo, los métodos en el estado de la técnica se
chocan sin parar con la dificultad de identificar la PrP^{sc} de
manera fiable cuando está en baja cantidad en una muestra
biológica.
Los inventores han puesto en evidencia una nueva
propiedad de aminoglicósidos, y principalmente aminoglicósidos del
grupo II y más particularmente de la estreptomicina, y han
demostrado la capacidad de estos antibióticos para complejarse con
la PrP^{sc} y hacerla precipitar.
Los inventores han observado así que la adición
de un aminoglicósido del grupo II, y más particularmente la
estreptomicina, en una muestra biológica que proviene de diversos
orígenes animales y que contiene priones tiene como consecuencia
hacer aumentar la masa molecular aparente de las 3 bandas de los
priones. Esta observación y los experimentos que han seguido les
han permitido demostrar que los aminoglicósidos del grupo II se
complejan con la PrP^{sc} y que esta complejación tiene como
consecuencia precipitar la PrP^{sc} y aumentar considerablemente
las posibilidades de detección de la PrP^{sc} con respecto a los
métodos clásicamente empleados por el experto en la técnica.
La presente invención tiene por lo tanto por
objetivo un procedimiento de concentración para precipitación de la
PrP^{sc} a utilizar durante el diagnóstico de las enfermedades
debidas a los priones o por eliminación de los priones presentes en
un líquido biológico y caracterizado porque se pone en presencia una
suspensión del tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de
un organismo animal o humano con un antibiótico preferentemente
elegido dentro de la familia de los aminoglicósidos del grupo II y
preferentemente la estreptomicina.
Más precisamente, el procedimiento según la
invención comprende las etapas siguientes:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, un aminoglicósido del grupo II,
- b)
- se sitúa la solución en un tampón adecuado, y se somete a un calentamiento, luego se centrífuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- c)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
El procedimiento de la invención puede
comprender igualmente una etapa suplementaria de digestión de la
muestra a valorar con una proteinasa y principalmente la proteinasa
K. Así, el procedimiento de la invención comprende las etapas
siguientes:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o de un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, la proteinasa, por ejemplo la proteinasa K,
- b)
- se pone un aminoglicósido del grupo II,
- c)
- se sitúa la suspensión en un tampón adecuado, y se somete a un calentamiento, luego se centrífuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- d)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
Más precisamente, el procedimiento de la
invención comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparación de una suspensión al 10% por homogeneización del fluido biológico o del tejido obtenido de organismo animal o humano en 5% de solución de glucosa,
- b)
- se añade, a los 100 \mul de la suspensión obtenida, la proteinasa K luego se incuba a 37ºC durante una hora,
- c)
- se añade, a la suspensión, un aminoglicósido del grupo II luego se incuba una segunda hora a 37ºC,
- d)
- se sitúa la suspensión en un tampón adecuado, y se somete a un calentamiento, luego se centrífuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- e)
- se suspende el precipitado en 50 \mul de una solución de 50% v/v de urea 8M y del tampón Laemmli desnaturalizado como describe Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685. Después de una agitación vortex vigorosa, se calienta 5 mn a 100ºC, se centrifuga a 12000 g y se recuperan los líquidos sobrenadantes para hacerlos migrar sobre SDS PAGE,
- f)
- después de migración sobre un gel de electroforesis, principalmente una electroforesis unidimensional sobre gel de poliacrilamida dodecil-sulfato al 15% (SDS PAGE) como describe Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685, las proteínas se transfieren por electroforesis sobre membranas de nitrocelulosas y son inmunoelectrotransferidas a temperatura ambiente durante 60 minutos con un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope específico constituido por aminoácidos 126-160. El anticuerpo secundario (1/5000) es un anticuerpo de cabra dirigido contra las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas de ratones conjugadas a la peroxidasa de rábano (IgG H+L); los borrones se lavan luego y las señales se detectan por quimioluminiscencia bien con un kit ECL (Amersham) sobre películas (Biomex light, Kodak) o con un super Signal Ultra (Pierce) y visualización sobre Fluor S. Multimager (BioRad).
El procedimiento de la invención presenta la
ventaja de no necesitar ultracentrifugación. El procedimiento de la
invención se refiere igualmente a la complejación del aminoglicósido
del grupo II con las proteínas del prión y la precipitación de las
proteínas del prión por dicho aminoglicósido.
Siguiendo un modo de realización de la
invención, el tejido biológico deriva o se obtiene a partir de un
cerebro o de otro tejido animal o humano, o de un fluido biológico
tal como líquido cefalorraquídeo o suero.
La proteinasa utilizada en el procedimiento
según la invención es una proteinasa elegida por su capacidad para
digerir las proteínas presentes que incluye las formas normales de
la proteína del prión, y por su incapacidad para digerir las formas
patológicas de esta proteína. Ventajosamente, se trata de la
proteinasa K.
Según un procedimiento de la realización
preferido de la invención, el tejido previamente a ponerlo en
contacto con dicho aminoglicósido del grupo II, se homogeneiza en
una solución de glucosa. Preferentemente, se trata de una solución
de glucosa al 5%.
La etapa de calentamiento después de haber
añadido 100 \mul del tampón Laemmli a la suspensión que resulta
de poner en contacto la muestra biológica con la proteinasa K y el
aminoglicósido del grupo II, corresponde a un aumento de
temperatura comprendido entre 60 y 150ºC, preferentemente
aproximadamente 100ºC.
Siguiendo un modo de realización preferido de la
invención, el aminoglicósido del grupo II es la estreptomicina o
uno de sus derivados.
La invención tiene igualmente por objetivo la
utilización de tal aminoglicósido del grupo II para la
precipitación, la detección incluso en detección por
inmunohistoquímica y/o el diagnóstico de la PrP^{sc}.
La invención tiene también por objetivo la
utilización de tal aminoglicósido del grupo II para la eliminación
del PrP^{sc} de un fluido biológico.
Finalmente, la invención se refiere igualmente a
la utilización de un kit de diagnóstico de las patologías ligadas a
la presencia de PrP^{sc}, caracterizado porque comprende tal
aminoglicósido del grupo II.
Otras ventajas y características de la invención
aparecerán con la lectura de los ejemplos que siguen que se
refieren a la amplificación de la detección de la PrP^{sc} cuando
la muestra biológica se pone en presencia de un aminoglicósido del
grupo II.
Se hará referencia en estos ejemplos a los
dibujos en anexo en los que:
\bullet la figura 1A es un ejemplo comparativo
de la detección después de electroforesis sobre gel de
poliacrilamida al 15%, transferencia e inmunodetección, de
PrP^{sc} en una muestra de cerebro de cordero alcanzado la
tembladera y puesto en presencia de cantidades cada vez más
importantes de estreptomicina;
\bullet la figura 1B es un gráfico de
comparación del peso molecular medio medido de cada banda PrP^{sc}
de la figura 1B antes y después de la mezcla con cantidades
crecientes de estreptomicina;
\bullet la figura 2 es un ejemplo comparativo
de la detección después de electroforesis sobre gel de
poliacrilamida al 15%, transferencia e inmunodetección, de
PrP^{sc}, respectivamente en el líquido sobrenadante y en los
precipitados, obtenidos derivados de la segunda hora de incubación
de una suspensión muy rica en proteína PrP^{sc} en ausencia y
presencia de una cantidad variable de estreptomicina;
\bullet la figura 3 muestra la adición al
mismo tiempo de la proteinasa K y de estreptomicina a una
suspensión
que contiene una baja cantidad de la PrP^{sc}
tiene como consecuencia la desaparición de la PrP^{sc} del
líquido sobrenadante y su aparición en los precipitados;
\bullet las figuras 4A, 4B y 4C muestran,
después de electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 15%,
transferencia e inmunodepresión, el aumento del umbral de detección
de la PrP^{sc} durante la adición de cantidades crecientes de
estreptomicina;
\bullet la tabla de la figura 5 se refiere al
ejemplo 5 y presenta una comparación de los resultados del
diagnóstico de la PrP^{sc} sobre 97 cerebros de animales
obtenidos por la técnica según la invención con aquellos obtenidos
por la técnica de referencia;
\bullet la figura 6 muestra imágenes en
microscopía de sonda de barrido (también denominado SPM por sus
siglas en inglés) en modo sin contacto para películas secadas de la
proteína prión recombinante (recPrP) sola (A), de recPrP en
presencia de estreptomicina (B) y de estreptomicina sola (C);
\bullet la figura 7A es un ejemplo comparativo
de la detección después de electroforesis sobre gel al 12% de
bis-tris acrilamida, transferencia e
inmunodetección, de la proteína prión en muestras de líquido
cefalorraquídeo (LCR) de pacientes alcanzados por la enfermedad de
Creutzfeld-JaKob (ECJ+) y de pacientes no alcanzados
por la ECJ (EJC-) tratados con una gama de estreptomicina. La tabla
7B resume los depósitos efectuados en las pistas de la figura
7A;
\bullet la figura 8A muestra los resultados de
un western blot, de muestras de LCR(+) y de LCR (-) a la EJC
digeridos o no por la proteinasa K según una gama de concentración
y tratados o no con la estreptomicina. La revelación inmunológica
se asegura con un anticuerpo anti-prión. La tabla 8B
resume los depósitos efectuados en las pistas de la figura 8A.
Las muestras biológicas sobre las que los
ejemplos 2 y 3 descritos a continuación se realizaron se obtuvieron
a partir de homogeneizado de cerebro bovino situado en una solución
de glucosa al 5%. Se utilizaron volúmenes de 100 \mul de esta
suspensión, que corresponde a 10 mg de tejido cerebral, se
utilizaron para los experimentos que siguen. Cada muestra está
constituida por lo tanto por 100 \mul, en los que se añade
proteinasa K. Después de una hora a 37ºC se añade o no
estreptomicina. La solución se agita bajo vortex y se incuba a 37ºC
durante otra hora. Después de añadir 100 \mul de tampón Laemmli
desnaturalizado, se calienta a 100ºC durante 5 mn y se centrifuga a
12000 g durante 5 minutos, luego se recuperan los líquidos
sobrenadantes para hacerlos migrar sobre SDS-PAGE.
Los precipitados se recuperan igualmente y se les añade 50 \mul de
una solución al 50% v/v de urea 8M y el tampón de laemmli. Después
de una agitación vigorosa bajo vortex, se calienta a 100ºC durante
5 mn y se centrifuga a 12000 g durante 5 minutos, luego se recuperan
los líquidos sobrenadantes para hacerlos migrar sobre
SDS-PAGE.
Ejemplo
1
El ejemplo 1 se refiere a las figuras 1A y 1B
relativas a los ensayos en los que se añadieron concentraciones
crecientes (0 \mug; 62,5 \mug; 125 \mug; 500 \mug y 2000
\mug) de estreptomicina a cantidades constantes de la PrP^{sc}
extraída del equivalente de 920 \mug de cerebro de un cordero
alcanzado de tembladera luego la mezcla se centrifugó. El líquido
sobrenadante se utilizó para la detección inmunológica por Western
Blot (figura 1A) y la medida de la masa molecular media de las
bandas de PrP^{sc} (figura 1B). Los resultados muestran que el
incremento de la cantidad de estreptomicina, a saber una adición de
0; 62,5, 125, 500, 1000 y 2000 \mug permite constatar que a las
concentraciones más bajas de estreptomicina, la banda de proteína
no glicosidada es la primera en mostrar un aumento de la masa
molecular aparente. Luego, la complejación se refiere a la banda de
la proteína mono-glicosidada y finalmente la
proteína bi-glicosidada se compleja cuando la
concentración de estreptomicina es la más importante.
El número de moléculas de estreptomicina ligadas
a cada una de las bandas de PrP^{sc} a una concentración dada se
evaluó midiendo el peso molecular de cada banda. Los inventores han
estimado que el aumento del peso molecular aparente de cada una de
las bandas de PrP^{sc} en presencia de 2000 \mug de
estreptomicina corresponde al acoplamiento de 10 a 12 moléculas de
estreptomicina por banda de PrP^{sc}.
Ejemplo
2
El ejemplo 2 se refiere a la figura 2 relativa a
los ensayos en los que se añadieron concentraciones
crecientes
(0 \mul; 5 \mul; 10 \mul; 20 \mul) de estreptomicina a 1 g/ml a cantidades constantes de muestra biológica preparada como se ha indicado anteriormente. En ausencia de estreptomicina, todas las bandas de PrP^{sc} se identificaron como que estaban en el líquido sobrenadante. Y progresivamente, serán detectadas simultáneamente en el precipitado y en el líquido sobrenadante. La cantidad de PrP^{sc} presente en el líquido sobrenadante disminuye progresivamente mientras que la cantidad aumenta progresivamente en los precipitados. La adición de 20 \mul de estreptomicina precipitó totalmente el PrP^{sc} que entonces solo se detectó en los precipitados.
(0 \mul; 5 \mul; 10 \mul; 20 \mul) de estreptomicina a 1 g/ml a cantidades constantes de muestra biológica preparada como se ha indicado anteriormente. En ausencia de estreptomicina, todas las bandas de PrP^{sc} se identificaron como que estaban en el líquido sobrenadante. Y progresivamente, serán detectadas simultáneamente en el precipitado y en el líquido sobrenadante. La cantidad de PrP^{sc} presente en el líquido sobrenadante disminuye progresivamente mientras que la cantidad aumenta progresivamente en los precipitados. La adición de 20 \mul de estreptomicina precipitó totalmente el PrP^{sc} que entonces solo se detectó en los precipitados.
Ejemplo
3
El ejemplo 3 se refiere a la figura 3.
Se repitió el experimento del ejemplo 2 pero con
la misma muestra de cerebro diluido al 1/25 con respecto al ejemplo
2 y disminuyendo el período de incubación a una hora después de la
adición simultánea de la proteinasa K y la estreptomicina a las
suspensiones de cerebro. El resultado es que solo se detectaron
bandas de PrP^{sc} en el líquido sobrenadante en ausencia de
estreptomicina y en el precipitado en presencia de cualquier
concentración de estreptomicina.
Ejemplo
4
El ejemplo 4 se refiere a las figuras 4A, 4B y
4C.
A partir de una dilución madre de 1:2 en serie
de un homogeneizado al 10% de cerebro bovino infectado con EEB en
una solución de glucosa al 5% se prepararon 3 juegos de tubos que
contenían cada uno 100 \mul de la misma dilución.
A cada tubo del primer juego de dilución (de
puro a 1/64) se añadieron 1 \mug de proteinasa K en un volumen
de
10 \mul.
10 \mul.
A cada tubo del segundo juego (de 1/2 a 1/256)
se añadieron simultáneamente 5 \mul de estreptomicina y 1 \mug
de proteinasa K en un volumen de 10 \mul.
A cada tubo del tercer juego (de 1/2 a 1/256) se
añadieron simultáneamente 10 \mul de estreptomicina y 1 \mug de
proteinasa K en un volumen de 10 \mul.
Todos los tubos se incubaron a 37ºC durante una
hora luego se añadieron 100 \mul de tampón Laemmli
desnaturalizado. Se calentó a 100ºC durante cinco minutos se
centrifugó a 12000 g durante 5 minutos, y se recuperaron los
líquidos sobrenadantes del primer juego de tubos por deposición
sobre SDS-PAGE. Los líquidos sobrenadantes de los
tubos del segundo y tercer juego de tubos se eliminaron y se
añadieron en cada tubo 50 \mul de urea 8M al 50% v/v y del tampón
Laemmli desnaturalizado. Después de una agitación vortex vigorosa,
se calentó 5 mn a 100ºC, se centrifugó a 12000 g y se recuperaron
los líquidos sobrenadantes para los segundos y tercer juego de
tubos,
La figura 4A muestra que el límite de detección
de PrP^{sc} detectado en ausencia de estreptomicina está en
1/16.
La figura 4B muestra la cantidad de PrP^{sc}
precipitada en presencia de 5 \mul de estreptomicina: la
PrP^{sc} se detectó hasta la dilución 1/128, lo que muestra un
umbral de detección ampliamente aumentado.
La figura 4C muestra la cantidad de PrP^{sc}
precipitada en presencia de 10 \mul de estreptomicina: la figura
4C muestra que incluso sobre las muestras más diluidas (1/256), la
detección es posible y es representativa.
Ejemplo
5
Ejemplo
comparativo
La técnica de referencia está basada en la
extracción de la PrP^{sc} a partir de 1,2 ml de homogeneizado
cerebral (Madec et al., Microbial Pathogenesis, 28 (2000)
353-362). Los homogeneizados se forzaron a través
de una aguja de diámetro 0,4 mm antes de ser tratados durante una
hora a 37ºC con 10 \mug de proteinasa K por 100 mg de tejido
cerebral. Después de haber añadido sarkosyl (10%) y 10 mM de tampón
Tris (pH 7,4), las muestras se incubaron durante 15 mn a
temperatura ambiente luego se centrifugaron a 245,000 g durante 4
horas a 20ºC sobre un cojín de sacarosa al 10% (Beckman TL 100
ultracentrífuga). El precipitado se volvió a poner finalmente en
suspensión en
50 \mul de tampón desnaturalizado Laemmli calentado durante 5 mn a 100ºC y se centrifugó todavía durante 5 mn a 12000 g. Se recuperaron los líquidos sobrenadantes para migración sobre SDS PAGE.
50 \mul de tampón desnaturalizado Laemmli calentado durante 5 mn a 100ºC y se centrifugó todavía durante 5 mn a 12000 g. Se recuperaron los líquidos sobrenadantes para migración sobre SDS PAGE.
Según la técnica de la invención, se utilizaron
100 \mul de suspensión cerebral obtenida después de trituración
del cerebro descrito en la técnica de referencia. Se añadieron 1
\mug de proteinasa K y se incubaron una primera vez durante una
hora. Se añadieron luego 20 \mug de estreptomicina K y se
incubaron una segunda vez durante una hora. Se añadieron luego 100
\mul de tampón desnaturalizado Laemmli. Después de 5 mn de
calentamiento a 100ºC, se centrifugó 2 mn a 12000 g. Se eliminaron
los líquidos sobrenadantes, luego se añadieron 50 \mul de 50% v/v
de urea 8M y del tampón desnaturalizado Laemmli. Después de una
agitación vortex vigorosa, se calentó 5 mn a 100ºC y se centrifugó
todavía durante 2 mn a 12000 g. Se recuperaron los líquidos
sobrenadantes para la migración sobre SDS PAGE.
Los resultados presentes en la tabla 1: en
conclusión, la utilización de sulfato de estreptomicina permite una
mejor detección de casos bajamente positivos y además permite evitar
una ultracentrifugación larga y costosa.
Ejemplo
6
Se prepararon muestras de recPrP (proteína prión
recombinante) diluyendo una solución de recPrP (42 \muM) con un
volumen equivalente de agua o con una solución de estreptomicina (1
g/ml); la referencia para la estreptomicina sola se preparó
utilizando una solución de 0,5 g/ml.
Las muestras se prepararon por deposición de 10
\mul de estas soluciones sobre mica recientemente clivada y
secado durante 24 horas a 37ºC.
Se efectuó un análisis por imagen por medio de
un Thermomicroscope Explorer AFM equipado con un escáner trípode
100 \mum, en modo sin contacto, utilizando frecuencias de
resonancia elevadas (F_{0} = 320 kHz) de viga flexible piramidal
con sondas de silicona con una frecuencia de barrido de 1 Hz. El
tratamiento de las imágenes se realizó con el programa informático
SPMlab 5.1 y se presenta no filtrado.
Se concluye de la figura 6 que la imágenes de
recPrP solas muestran una estructura de agregados circulares
característicos. Las películas de estreptomicina sola muestran una
organización de superficie pseudo-cristalina. Las
películas que contienen la mezcla muestran una superficie amorfa: no
se constata ninguna organización cristalina o globular. La
interacción entre la estreptomicina y la PrP inhibe por lo tanto las
propiedades de organización de superficie de los dos componentes de
la mezcla.
Ejemplo
7
Se tomaron muestras de extracciones
post-mortem de líquido cefalorraquídeo (LCR)
preferentemente no hemolizados y sin deshechos celulares en
pacientes no alcanzados por la EJC y en pacientes alcanzados por la
EJC. Se pusieron en contacto una muestra de LCR de paciente no
alcanzado por la ECJ y una muestra de LCR de paciente alcanzado por
la ECJ con una solución de estreptomicina, según una gama de
concentración comprendida entre 0,05 g/mL y 0,2 g/mL (0,05 - 0,1 y
0,2 g/mL). Después de homogeneización con vortex, las muestras se
incubaron durante 1 hora a 37ºC luego se centrifugaron durante 5
minutos a 12000 g.
Los precipitados obtenidos se retomaron con
tampón de extracción proteica. Después de calentamiento a 100ºC
durante 10 minutos, las muestras se centrifugaron de nuevo durante 5
minutos a 12000 g. 15 \muL de cada líquido sobrenadante se
depositaron sobre gel SDS-PAGE (iniciales del inglés
de electroforesis en gel de poliacrilamida en dodecilsulfato
sódico) 12% bis-tris acrilamida. En paralelo, se
depositaron 5 \muL de un extracto de PrP^{sc} cerebral diluido
al 1/100 en el tampón de desnaturalización como control positivo.
Este extracto se preparó según el protocolo de referencia utilizado
para el diagnóstico de la enfermedad de
Creutzfeld-Jakob. La migración electroforética se
realizó con voltaje constante (220 V) durante 40 minutos en tampón
de migración 1 vez concentrado. Las proteínas se transfirieron
luego sobre una membrana de PVDF activada por sistema
semi-seco entre dos electrodos de grafito, durante
1 hora a potencia constante (1 W). La revelación inmunológica
directa se aseguró entonces por el anticuerpo
anti-prión AC23 (que reconoce la región definida por
los aminoácidos 145-154 de la PrP humana y las
regiones homólogas de PrP animales) a 0,5 \mug/ml acoplada a la
peroxidasa de rábano.
La figura 7A muestra que la estreptomicina se
une bien a la proteína prión en ausencia de digestión por la
proteína K. En efecto, después de tratamiento con la estreptomicina
a 0,1 g/mL y 0,2 g/mL, solo se observó una banda y su peso
molecular aparente se desplazó de una manera proporcional a la
concentración de estreptomicina. El tamaño aparente de esta banda
es de aproximadamente 50 kDa para 0,1 g/mL de estreptomicina y
aproximadamente de 80 kDa para
0,2 g/mL de estreptomicina. Además, el perfil de la banda (aspecto no curvado, arrastre) sugiere una agregación molecular.
0,2 g/mL de estreptomicina. Además, el perfil de la banda (aspecto no curvado, arrastre) sugiere una agregación molecular.
Ejemplo
8
Un LCR de paciente no alcanzado por la ECJ y un
LCR de paciente alcanzado para la ECJ son digeridos por la
proteinasa K, utilizada a 0,5 \mug/mL o 1 \mug/mL. En paralelo,
una alícuota de cada muestra no se sometió a digestión por la
proteinasa K. La digestión se realizó a 37ºC durante 1 hora bajo
agitación suave. Después de la digestión, las muestras se incubaron
durante 1 hora a 37ºC en presencia de estreptomicina a 50 mg/mL de
concentración final, luego se procedió a una centrifugación durante
5 minutos a 12000 g.
Las proteínas se extrajeron luego y se
desnaturalizaron por calentamiento en presencia de tampón de
desnaturalización proteica luego se analizaron en western blot
conforme al protocolo del ejemplo 7. La revelación inmunológica
directa se realizó con ayuda del anticuerpo AC23 (utilizado a 0,5
\mug/ml) acoplado a la peroxidasa de rábano.
\newpage
La figura 8A muestra que una banda única, de
baja intensidad, se observa cuando la muestra se trató con
estreptomicina. Esta banda, de aproximadamente 35 kDa de masa
molecular aparente, es visible para la muestra negativa únicamente
en ausencia de digestión por la proteinasa K (pista 5 del gel LCR
(-)) mientras que es visible para la muestra positiva cualquiera
que sea la concentración de proteinasa K utilizada (pistas 5, 6 y 7
del gel LCR (+)), característico de la forma resistente de la
proteína prión.
La detección de la proteína prión en el LCR se
hace posible por la utilización de la estreptomicina. En efecto, en
ausencia de digestión por la proteinasa K, la detección de la PrP
total (celular o patológica) se amplifica en presencia de
estreptomicina y, de manera inesperada, la PrP^{sc} se detecta
preferentemente. Después de digestión por la proteinasa K, esta
tecnología permite poner en evidencia una señal significativamente
diferente entre los LCR derivados de pacientes no alcanzados por el
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y los LCR
derivados de pacientes alcanzados por esta misma enfermedad. La
estreptomicina presenta por lo tanto un interés para la detección
de la PrP^{res} en los fluidos biológicos.
Además, los aminoglicósidos tal como la
estreptomicina pueden utilizarse para la eliminación de la
PrP^{sc} por el hecho de la precipitación de la PrP^{sc}
después de contacto con los aminoglicósidos.
Claims (12)
1. Procedimiento de detección de la PrP, en
particular de la PrP^{sc}, caracterizado porque se pone en
presencia un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un
organismo animal o humano con un antibiótico elegido entre la
familia de los aminoglicósidos del grupo II.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, un aminoglicósido del grupo II,
- b)
- se sitúa la solución en un tampón adecuado, y se la somete a un calentamiento, luego se centrifuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- c)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque:
- a)
- se añade, a la suspensión de un tejido o un fluido biológico derivado u obtenido de un organismo animal o humano, proteinasa K,
- b)
- se pone un aminoglicósido del grupo II,
- c)
- se sitúa la suspensión en un tampón adecuado, y se la somete a un calentamiento, luego se centrifuga la solución obtenida y se separa el precipitado del líquido sobrenadante,
- d)
- se detecta la PrP^{sc} después de migración sobre un gel de electroforesis, transferencia e inmunodetección.
4. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho tejido
biológico deriva o se obtiene de un cerebro u otro tejido animal o
humano.
5. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque dicha proteinasa
es una proteinasa K.
6. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el tejido o el
fluido biológico, previamente a ponerse en contacto con dicho
aminoglicósido, se homogeneiza en una solución de glucosa.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la etapa de
calentamiento corresponde a un aumento de temperatura comprendido
entre 60 y 150ºC.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicho
aminoglicósido del grupo II es la estreptomicina.
9. Utilización de un aminoglicósido del grupo II
para la precipitación, la detección y/o el diagnóstico de la
PrP^{sc} incluso durante la detección en inmunohistoquímica.
10. Utilización in vitro de un
aminoglicósido del grupo II para la eliminación de la PrP^{sc} de
un tejido o de un fluido biológico.
11. Utilización de un kit que comprende un
aminoglicósido del grupo II para el diagnóstico de patologías
ligadas a la presencia de la PrP^{sc} como la tembladera de los
pequeños rumiantes, la enfermedad caquetizante crónica del alce y
del antílope, la encefalopatía espongiforme bovina y la enfermedad
de Creutzfeldt-Jacob.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho aminoglicósido del grupo II es la
estreptomicina.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0216382 | 2002-12-20 | ||
FR0216382A FR2849204B1 (fr) | 2002-12-20 | 2002-12-20 | Procede de detection de la prpsc utilisant un antibiotique d de la famille des aminoglycosides pour l'elimination et la detection de la prpsc dans des echantillons biologiques |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2322704T3 true ES2322704T3 (es) | 2009-06-25 |
Family
ID=32406304
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES03799681T Expired - Lifetime ES2322704T3 (es) | 2002-12-20 | 2003-12-19 | Procedimiento de deteccion de la prp utilizando un antibiotico de los aminoglicosidos del grupo ii. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7695918B2 (es) |
EP (1) | EP1573336B1 (es) |
JP (1) | JP4471844B2 (es) |
CN (1) | CN1729396A (es) |
AT (1) | ATE423321T1 (es) |
AU (1) | AU2003299389A1 (es) |
BR (1) | BR0317224A (es) |
DE (1) | DE60326269D1 (es) |
ES (1) | ES2322704T3 (es) |
FR (1) | FR2849204B1 (es) |
MX (1) | MXPA05006765A (es) |
WO (1) | WO2004059321A1 (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2865280B1 (fr) * | 2004-01-20 | 2007-01-12 | Biomerieux Sa | Procede de detection de la prp utilisant une molecule ayant au moins une charge positive et/ou au moins une liaison osidique et un ligand autre qu'un ligand proteique |
FR2888937B1 (fr) * | 2005-07-21 | 2012-10-26 | Biomerieux Sa | Procede de detection des fcpa utilisant un agent d'agregation des fcpa et un agent de capture des agregats formes |
US7325983B1 (en) * | 2006-08-25 | 2008-02-05 | Emcore Corporation | 10GBASE-LX4 optical transceiver in XFP package |
US10010029B2 (en) * | 2011-11-21 | 2018-07-03 | Innovation Hammer, Llc | Methods and systems for growing plants using silicate-based substrates, cultivation of enhanced photosynthetic productivity and photosafening by utilization of exogenous glycopyranosides for endogenous glycopyranosyl-protein derivatives, and formulations, processes and systems for the same |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3993544A (en) * | 1975-01-20 | 1976-11-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Derivatives of streptomycin and method of producing streptomycin derivatives by mutational biosynthesis |
US6322802B1 (en) * | 1999-06-01 | 2001-11-27 | The Regents Of The University Of California | Method of sterilizing |
EP0861900A1 (en) * | 1997-02-21 | 1998-09-02 | Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich | Immunological detection of prions |
US6221614B1 (en) * | 1997-02-21 | 2001-04-24 | The Regents Of The University Of California | Removal of prions from blood, plasma and other liquids |
AU7365298A (en) | 1997-05-02 | 1998-11-27 | Integrated Research Technology, Llc | Betaines as adjudvants to susceptibility testing and antimicrobial thera py |
AU5241100A (en) * | 1999-09-28 | 2001-04-30 | Universitat Zurich | Factors having prion-binding activity in serum and plasma and agents to detect transmissible spongiform encephalopathitis |
ES2247085T3 (es) | 2000-02-01 | 2006-03-01 | Tiax, Llc | Sistema de descontaminacion quimica y biologica. |
IL141950A0 (en) * | 2000-10-22 | 2002-03-10 | Hadasit Med Res Service | Diagnosis of prion diseases |
DE10119713A1 (de) * | 2001-04-21 | 2002-10-24 | Prionics Ag Zuerich | Verfahren zur Untersuchung von Prion-Protein enthaltenden Proben auf das eventuelle Vorliegen der PrPSc-Form |
FR2865280B1 (fr) * | 2004-01-20 | 2007-01-12 | Biomerieux Sa | Procede de detection de la prp utilisant une molecule ayant au moins une charge positive et/ou au moins une liaison osidique et un ligand autre qu'un ligand proteique |
US20150041230A1 (en) | 2013-08-12 | 2015-02-12 | GKart Inc. | Amusement vehicle, amusement environment for a vehicle and method of using the same |
-
2002
- 2002-12-20 FR FR0216382A patent/FR2849204B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-12-19 MX MXPA05006765A patent/MXPA05006765A/es active IP Right Grant
- 2003-12-19 EP EP03799681A patent/EP1573336B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-19 BR BR0317224-4A patent/BR0317224A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-12-19 AT AT03799681T patent/ATE423321T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-12-19 CN CNA2003801067738A patent/CN1729396A/zh active Pending
- 2003-12-19 ES ES03799681T patent/ES2322704T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-19 JP JP2004563298A patent/JP4471844B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-19 WO PCT/FR2003/003856 patent/WO2004059321A1/fr active Application Filing
- 2003-12-19 AU AU2003299389A patent/AU2003299389A1/en not_active Abandoned
- 2003-12-19 DE DE60326269T patent/DE60326269D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-06-13 US US11/151,066 patent/US7695918B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE423321T1 (de) | 2009-03-15 |
US20060014215A1 (en) | 2006-01-19 |
EP1573336A1 (fr) | 2005-09-14 |
AU2003299389A1 (en) | 2004-07-22 |
WO2004059321A8 (fr) | 2005-06-30 |
AU2003299389A8 (en) | 2004-07-22 |
JP2006510913A (ja) | 2006-03-30 |
FR2849204A1 (fr) | 2004-06-25 |
US7695918B2 (en) | 2010-04-13 |
CN1729396A (zh) | 2006-02-01 |
EP1573336B1 (fr) | 2009-02-18 |
MXPA05006765A (es) | 2006-02-17 |
WO2004059321A1 (fr) | 2004-07-15 |
DE60326269D1 (de) | 2009-04-02 |
FR2849204B1 (fr) | 2005-02-11 |
BR0317224A (pt) | 2005-11-01 |
JP4471844B2 (ja) | 2010-06-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2322660T3 (es) | Diagnostico precoz de enfermedades conformacionales. | |
BRPI0613525A2 (pt) | métodos para produzir uma composição imunogênica, para melhorar a imunogenicidade de uma composição, para intensificar a imunogenicidade de uma composição de vacina, e para determinar a quantidade de estruturas beta-cruzadas em uma composição de vacina, usos de estruturas beta-cruzadas, e de uma composição imunogênica, vacina de subunidade, e, composição imunogênica | |
CN113238045B (zh) | Crmp2及抗crmp2抗体的应用 | |
ES2322704T3 (es) | Procedimiento de deteccion de la prp utilizando un antibiotico de los aminoglicosidos del grupo ii. | |
WO2018213440A1 (en) | Detection of misfolded tau protein | |
Cheng et al. | Role of local allergic inflammation and Staphylococcus aureus enterotoxins in Chinese patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps | |
CN104380106B (zh) | 用于生产抗体检测试剂的方法及其用途 | |
TW200840820A (en) | Shrimp allergen and anti-shrimp allergen antibody and uses thereof | |
PT1054897E (pt) | Processo para a purificação de prpres a partir de uma amostra biológica e suas aplicações | |
ES2282733T3 (es) | Procedimiento de deteccion de la prp que utiliza un ligando adyuvante macrociclico. | |
RU2141969C1 (ru) | Антигенные пептиды, способ обнаружения выделяемых опухолями частиц | |
WO2015028537A1 (en) | Method for the isolation of recombinant prion protein and the use thereof | |
Inoue et al. | Infection route-independent accumulation of splenic abnormal prion protein | |
US7566530B2 (en) | Method for detecting PrP using at least one positive charge and/or at least one glycosidic bond and a ligand other than a protein ligand | |
WO2014006224A1 (en) | Tropomyosin isoforms related to alzheimers disease and mild cognitive impairment | |
Stepanenko et al. | Mammalian odorant-binding proteins are prone to form amorphous aggregates and amyloid fibrils | |
KR101355369B1 (ko) | 프리온 식별용 펩타이드 | |
CN111537744B (zh) | 一种基于乳脂肪球膜特性的乳凝集素或粘蛋白1的elisa定量检测方法 | |
CN116286978B (zh) | 一种重组载体、重组菌株或细胞系、重组钙结合蛋白及其应用 | |
EP1229331A1 (en) | Mass spectrometic detection of abnormal prion protein in the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies | |
BRPI0711096A2 (pt) | identificação de proteìnas de prion no leite | |
Hnasko et al. | Enhanced detection of infectious prions by direct ELISA from the brains of asymptomatic animals using DRM2-118 monoclonal antibody and Gdn-HCl | |
WO2005026740A1 (en) | Methods and kits for the detection of prion diseases | |
Kariv-Inbal et al. | Characterization of light chain immunoglobulin in urine from animals and humans infected with prion diseases | |
ES2246113B1 (es) | Procedimiento de deteccion ante-mortem de proteinas prionicas por espectroscopia infrarroja y su uso en el diagnostico de encefalopatias espongiformes transmisibles. |