ES2246113B1

ES2246113B1 - Procedimiento de deteccion ante-mortem de proteinas prionicas por espectroscopia infrarroja y su uso en el diagnostico de encefalopatias espongiformes transmisibles.

Info

Publication number: ES2246113B1
Application number: ES200302561A
Authority: ES
Inventors: Pedro Carmona Hernandez; Jaime Monreal Llop; Eva Monleon Moscardo; Marta Monzon Garces; Juan Jose Badiola Diez
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Zaragoza
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Zaragoza
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2007-04-01
Anticipated expiration: 2023-10-31
Also published as: ES2246113A1; WO2005043136A1

Abstract

Procedimiento de detección ante-mortem de proteínas priónicas por espectroscopia infrarroja y su uso en el diagnostico de encefalopatías espongiformes transmisibles. La presente invención proporciona un método de detección in vivo, por espectroscopia infrarroja, de proteínas priónicas infectivas en sangre de animales afectados por una encefalopatía espongiforme transmisible. El procedimiento de detección consta de una primera etapa destinada a preparar la fracción sanguínea donde están más concentradas las proteínas priónicas infectivas. Esta fracción se obtiene mediante lisado de elementos celulares y técnicas de centrifugación. La identificación de proteínas priónicas se realiza a través de la región espectral amida I (intervalo de 1700-1600 cm {sup,-1}) previa deuteración de las muestras mediante intercambio isotópico con agua pesada. Los resultados espectroscópicos de este procedimiento de detección de proteínas priónicas infectivas han concordado al 100% con los test paralelos de biodiagnóstico post-mortem en los mismos animales sujetos de estudio.

Description

Procedimiento de detección ante-mortem de proteínas priónicas por espectroscopia infrarroja y su uso en el diagnóstico de encefalopatías espongiformes transmisibles.

Sector de la técnica

La invención concierne a un primer sector prioritario correspondiente al área de la seguridad alimentaria y de la ganadería, con subsiguiente aplicación a un segundo sector de la salud. Más concretamente la invención se refiere a un método de diagnóstico precoz para enfermedades priónicas basado en espectroscopia infrarroja.

Estado de la técnica

Las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas de curso progresivo y desenlace fatal que afectan tanto a la especie humana como a la animal, y se caracterizan principalmente por:

a): Compartir un agente causal transmisible de forma experimental o natural, y con una elevada resistencia a su degradación proteolítica, denominado prión.

b): Estar asociado a ausencia de respuesta inmune en el animal infectado.

c): Presentar, principalmente en el sistema nervioso central (SNC), la acumulación de una isoforma anormal (PrP^{Sc}) de una glicoproteína de membrana (PrP^{c}) codificada por el propio hospedador que se diferencia de la normal en su conformación (concretamente, en un mayor porcentaje que presenta de estructura de hoja plegada \beta).

d): Producir un cuadro de lesiones característico, consistente en un cambio espongiforme que afecta, principalmente al tronco del encéfalo, tanto al neuropilo de la sustancia gris como al pericarion de las neuronas.

El escrapie o tembladera, descrita por primera vez en 1732 en Reino Unido y posteriormente diagnosticada en ovejas y cabras de un gran número de países, es la EET animal más ampliamente estudiada, y es considerada como prototipo de este grupo de enfermedades. Entre otras especies animales afectadas aparecen los visones, ciervos, alces, gatos, guepardos, pumas, ocelotes y tigres. Sin embargo, la recientemente descrita Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB; Reino Unido, 1986) ha adquirido una mayor relevancia debido a sus implicaciones en la Salud Pública, tras la aparición de la nueva variante de Creuzfeldt-Jakob (v-CJD; Reino Unido, 1996) en humanos asociada al consumo de productos cárnicos contaminados con el agente de la EEB.

En lo que respecta a las enfermedades priónicas que afectan a la especie humana destacan: enfermedad de Creutzfeldt-Jakob: esporádica, iatrogénica y familiar; variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (v-CJD); Kuru; síndrome de Gerstmann-Straüssler-Scheinker (GSS); Insomnio Familiar Fatal o Letal (FFI) y; enfermedades atípicas producidas por priones.

Existen también otras \beta-fibrilosis (Gajdusek, Nutrition, Health and Peace Linus Pauling Inst., Palo Alto, 21-55, 1987), caracterizadas por la acumulación de proteínas neurotóxicas de configuración \beta, entre las que la enfermedad de Alzheimer es la más caracterizada y difundida.

Actualmente, el diagnóstico de las EETs (humanas y animales) se basa en la sospecha clínica de la enfermedad seguida de su confirmación mediante la demostración del cuadro lesional característico en el SNC y la detección de la acumulación de las isoformas anormales de las proteínas PrP mediante los métodos de diagnóstico establecidos por la OIE (Organización Internacional de Epizootías; Reglamento 1248/2001), concretamente la histopatología y técnicas inmunoquímicas (inmunohistoquímica y western blotting), así como la observación de Scrapie associated fibril (SAF).

Desde que comenzó la crisis de la EEB en Europa un gran número de bovinos y ovinos han sido sacrificados pese a que, tras los respectivos análisis post mortem de los encéfalos de dichos animales, se ha demostrado que la gran mayoría de éstos eran animales no infectados. Así, con el fin de evitar, en la medida de lo posible, este sacrificio masivo y, por supuesto, la posible transmisión de la EEB a humanos, se cree que es la causa de la v-CJD, se ha hecho cada vez más necesario el desarrollo de un test de diagnóstico in vivo para este tipo de enfermedades. Por otro lado, en lo que respecta a la enfermedad en humanos, existe la posibilidad de que un reservorio de individuos asintomáticos esté presente en la población. Estos individuos podrían transmitir el agente infeccioso a otros individuos a través de donaciones de sangre o de material quirúrgico no esterilizado adecuadamente.

Por tanto, es evidente la urgente necesidad de poner a punto un test analítico no invasivo, rápido y de bajo coste de proteínas priónicas in vivo que permita un diagnóstico ante mortem de este tipo de enfermedades, evitando también así el sacrificio de animales libres de la enfermedad y garantizando la repoblación de rebaños con animales sanos.

Aunque el agente causal de la EEB y v-CJD nunca ha sido aislado a partir de sangre de animales infectados de forma natural, y los pocos resultados satisfactorios obtenidos a partir de sangre humana no han sido reproducibles, en modelos experimentales se ha demostrado que la sangre y sus componentes pueden ser infecciosos durante las fases clínica y de incubación de la v-CJD. Bajo esta perspectiva, la sangre es un fluido biológico de fácil extracción que se puede utilizar para análisis de proteínas priónicas, sin necesidad de recurrir a biopsias de tejido cerebral u otros órganos. En la literatura relacionada con este tema, se ha descrito un test capaz de detectar proteínas PrP^{Sc} en sangre utilizando una combinación de competición antígeno-anticuerpo y electroforesis capilar (Schmerr y Jenny, Electrophoresis, 19, 409-414 (1998); Schmerr y cols., J. Chromatogr. A, 853, 207-214 (1999)). El test es laborioso y difícil de estandarizar, y depende de una relación de señales más que de una medida directa de proteínas PrP^{Sc}. Además, los resultados obtenidos con muestras afectadas de escrapie no se han reproducido en muestras de otras EETs (Brown y cols., J. Lab. Clin. Med., 137, 5-13 (2001)).

La espectroscopia de fluorescencia de correlación cruzada (Bieschke y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5468-5473 (2000)) se ha utilizado para la detección de priones en líquido cerebroespinal de pacientes con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD). Pero de 24 pacientes afectados de CJD solamente 5 resultados espectroscópicos fueron positivos, lo que representa solamente un 20% de aciertos.

En el documento de patente DE 19918141 A1 (26 Oct. 2000) se describe por Matthias y cols. un método para el diagnóstico de mieloencefalopatía espongiforme transmisible (BSE y escrapie) usando inmunoensayos y RT-PCR. En otro documento de patente WO 2000052197 A1 (8 Sep. 2000) se describe por Prusiner y Safar un método de detección de proteínas priónicas en sangre coagulada de Syrian hamsters.

Estos métodos y otros descritos en la literatura sobre la detección de proteínas priónicas infectivas en sangre (Maissen y cols., Lancet, 357, 2026-2028 (2001); Miele y cols., Nature Medicine, 7, 361-364, (2001); Beekes y cols., J. Infect. Dis., 180, 518-520 (1999); Otto y cols., Brit. Med. J., 316, 577-582 (1998)), incluyen una parte inmunológica y se utilizan con escaso éxito. Asimismo, de las manifestaciones recientes de S. B. Prusiner se desprende que los métodos hasta ahora probados (publicados y/o patentados) no son fiables, debido a múltiples causas, entre ellas, la posible existencia de varias isoformas infectivas dentro de una misma especie o varias especies animales. La no idoneidad de los métodos descritos en la literatura tiene una incidencia negativa directa en el control de carne en mataderos, de forma que un tiempo prolongado de inmovilizado de la carne en los almacenes más un gasto de energía de refrigeración, tiene unas implicaciones económicas que podrían evitarse si se consiguiera desarrollar un método rápido y fiable de biodiagnóstico.

La espectroscopia infrarroja, en su moderna instrumentación, es una poderosa y rápida técnica para el análisis de estructura secundaria de proteínas, dado que permite distinguir y cuantificar estructuras \alpha, \beta y desordenada. Como las proteínas priónicas infectivas (PrP^{Sc}) tienen un alto contenido en estructura \beta con respecto a la isoforma priónica normal, la espectroscopia infrarroja, utilizada según los procedimientos de esta invención, permite identificar proteínas PrP^{Sc} en muestras de sangre de animales ovinos afectados por escrapie, incluso en fase preclínica. No existen antecedentes en la literatura sobre trabajos de espectroscopia infrarroja enfocada al análisis de proteínas priónicas en sangre. Tan sólo recientemente se ha publicado un trabajo sobre análisis infrarrojo de suero sanguíneo, en donde se ha demostrado que existen diferencias en las bandas lipídicas del suero de roedores, a los que se les había inducido el escrapie, en relación con animales sanos (Schmitt y cols., Anal. Chem., 74, 3865-3868 (2002)). Este trabajo no aborda el análisis del agente causal de la enfermedad que es la proteína infectiva PrP^{Sc}, y además, se trata de un modelo experimental, y no de una enfermedad natural. Sin embargo, en nuestra invención todos los animales analizados habían sido infectados de forma espontánea y natural. Tampoco está demostrado que esos cambios de las bandas lipídicas sean exclusivamente característicos del escrapie y no de otros estados patológicos. Por otra parte, se ha utilizado la microespectroscopia infrarroja para diferenciar tejido cerebral de roedores sanos y afectados de escrapie (Kenipp y cols., Biochim. Biophys. Acta, 1501, 189-199 (2000); Naumann y cols., Patente WO 00/72007 A2, 30 Nov 2000; Kneipp y cols., J Neuroscience, 22, 2989-2997 (2002)).

Descripción de la invención Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento, por espectroscopia infrarroja, para la detección de proteínas priónicas infectivas (PrP^{Sc}) en muestras biológicas de animales vivos afectados de una EET adquirida de modo natural. Su aplicación es extensible a sangre de, entre otros, ovinos, bovinos, caprinos y humanos y a otras \beta-fibrolisis, por ejemplo Alzheimer. Una primera etapa de este procedimiento que permite obtener una fracción de la sangre donde están más concentradas las proteínas priónicas infectivas, para la detección por espectroscopia de las citadas proteínas también ha sido reivindicada en la presente invención. La sangre completa, como se sabe, es muy compleja en su composición, y tiene además gran cantidad de hemoglobina que enmascara los espectros de las proteínas priónicas. Por ello, la detección de las proteínas PrP^{Sc} resulta inabordable por estar muy diluidas en la sangre completa. Con respecto al cerebro, la cantidad de agentes infecciosos en la sangre se cree que es de 100 a 1000 veces más baja (Grassi, Transf Clin. Biol. 10, 19-22, 2003). De ahí la importancia que tienen estos métodos de separación previa para poder tener éxito en la detección óptima de las proteínas PrP^{Sc}. No se tiene seguridad actualmente de en qué elementos celulares de la sangre están preferentemente localizadas las proteínas priónicas infectivas. Recientemente, se ha descrito que el escrapie no está asociado a las plaquetas (Holada y cols., J. Virol., 76, 4649-4650, 2002), pero se tiene la sospecha de que pueden estar asociadas a linfocitos T (Lewicki y cols., J. Virol., 77, 3799-3808, 2003). Por todo ello, y con el fin de confirmar en qué tipos de células sanguíneas están preferentemente localizadas las proteínas priónicas, se ha realizado un fraccionamiento celular en gradiente de densidad seguido por tinción específica de las células y su caracterización morfológica y, posteriormente, espectroscópica.

La presencia de priones se pone de manifiesto de forma cualitativa mediante la aparición de bandas de absorción infrarroja en el intervalo comprendido entre 1615 y 1640 cm^{-1}, muchas veces en forma de hombros que se hacen bien visibles mediante espectroscopia de derivadas, tal como se puede observar en los ejemplos descritos más adelante. La identificación cualitativa de proteínas priónicas infectivas en la fracción de lisados celulares de la sangre mediante espectroscopia infrarroja con la medida del espectro infrarrojo de dicha fracción en la región espectral amida I, comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1}, y la identificación de la presencia de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observen bandas características entre 1640 y 1620 cm^{-1}, o más preferentemente entre 1638 y 1630 cm^{-1}, ha sido reivindicado en la presente invención.

Además de este procedimiento espectroscópico cualitativo, la existencia de proteínas priónicas infectivas en una muestra se puede determinar calculando los porcentajes de estructura \beta, que sufre un aumento significativo en estas proteínas infectivas con respecto a los controles correspondientes a animales sanos. Este método de identificación cuantitativo forma parte también de la presente invención.

Los resultados analíticos obtenidos según esta invención han concordado al 100% en unos 100 animales investigados y cuyos resultados han sido validados con los tests de diagnóstico post mortem admitidos por la OIE de muestras de SNC realizadas en los correspondientes animales de los que previamente se obtuvieron muestras sanguíneas. Estos mismos tests aplicados sobre diferentes muestras procedentes del sistema linforreticular (SLR; concretamente, la amígdala, tercer párpado, placa de Peyer intestinal, bazo, ganglios mesentérico, mediastino y retrofaringeo) de los animales estudiados fueron llevados a cabo con el fin de descartar una posible fase preclínica de la enfermedad en la que la PrP^{Sc} sólo fuera detectable en tejido linfoide y no en tejido de naturaleza nerviosa. Se consideró que un animal era negativo cuando se demostró ausencia, tanto de lesiones histopatológicas mediante examen microscópico (utilizando la tinción hematoxilina/eosina) en el SNC, como de marcaje mediante la técnica inmunohistoquímica (utilizando el anticuerpo monoclonal específico anti-PrP: L42, R-Biopharm) en el SNC y SLR. Estos resultados han puesto de manifiesto, además, que el test descrito en esta memoria posee mayor sensibilidad que el análisis de biopsias del tercer párpado de ovinos (la biopsia de tejido linfoide en ovino, concretamente de tercer párpado o amígdala, es el método de diagnóstico in vivo de escrapie utilizado actualmente), donde se consideran más constantes, precoces y fácilmente detectables las acumulaciones priónicas (a pesar de que se ha demostrado que, en función de diversas variables todavía no determinadas pueden ofrecer resultados negativos a partir de animales enfermos de escrapie). De hecho, el análisis infrarrojo de una muestra de una fracción de sangre de animales que habían mostrado un resultado negativo mediante el análisis inmunohistoquímico de la biopsia del tercer párpado, demostró inequívocamente que el animal estaba afectado de escrapie, siendo confirmado posteriormente mediante técnicas de diagnóstico post mortem.

El uso de este procedimiento de detección precoz de proteínas infectivas (PrP^{Sc}) en sangre para el diagnóstico de animales vivos infectados de EETs o para el estudio de la evolución de dicha enfermedad constituye la aplicación más inmediata de esta invención.

Además, a la presente invención no le afecta el tipo de isoformas que puedan existir en el tejido en cuestión, tal como puede ocurrir en los métodos que usan anticuerpos, porque aquí se determinan porcentajes de estructura \beta con respecto a los correspondientes animales sanos.

La muestra biológica para realizar este procedimiento puede provenir de un fluido biológico, como por ejemplo, sangre, suero, líquido cefalorraquídeo y linfático, y orina, o de un tejido, bien como tal, u homogeneizado o solubilizado por procedimientos estándar. Por otra parte los seres vivos objeto de análisis son, entre otros, ovejas, vacas, cabras, muflones, visones, ciervos, gatos, roedores, y humanos. Este procedimiento tiene aplicación para el diagnóstico de animales preclínica o clínicamente infectados de EETs y de humanos afectados de otras \beta-fibrilosis, y el estudio de la evolución de la infección, entre otras, de escrapie en ovinos y caprinos, muflones, EEB, la enfermedad crónica caquetizante del ciervo, todas las variantes de la enfermedad de CJD, la enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, y el insomnio familiar fatal, y su uso para tales fines ha sido reivindicado en la presente invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en que los autores han observado que las proteínas priónicas infectivas (PrP^{Sc}) pueden ser identificadas, cualitativa y cuantitativamente, de forma específica a partir de muestras biológicas de animales infectados. Dicha presencia puede constatarse de forma diferenciada en un mismo animal que sufre una infección priónica a lo largo del tiempo, tras un proceso de obtención específico de dichas proteínas priónicas infectivas en una fracción celular de la sangre y de la detección posterior de las mismas por espectroscopia infrarroja.

La presente invención proporciona un nuevo procedimiento de detección de las proteínas priónicas infectivas marcadoras, PrP^{Sc}, en la que se basa el diagnóstico de las EETs en animales, y que comprende la obtención de una muestra enriquecida en PrP^{Sc}, procedente de muestras biológicas animales y la identificación, por espectroscopia infrarroja, de las proteínas marcadoras PrP^{Sc} en dicha muestra. Sin limitar el ámbito de la invención y a modo de ejemplo, el procedimiento comprende los siguientes pasos:

1): obtención de una fracción procedente de la sangre y de sus células sanguíneas sometidas a una lisis con agua y que tras su centrifugación el pelet resultante está enriquecido en PrP^{Sc} (procedimientos a), b) y c));

2): intercambio isotópico H/D (hidrógeno/deuterio) en cada una de las fracciones celulares obtenidas;

3): la identificación, por espectroscopia infrarroja, de las proteínas marcadoras PrP^{Sc} en dicha fracción de lisado.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "animales" se refiere a aquellas especies que pueden ser infectados por proteínas PrP^{Sc}, entre otros, ovejas, vacas, cabras, muflones, visones, ciervos, roedores, gatos y humanos.

El término "muestra biológica" en la presente invención se refiere no sólo a fluidos biológicos de animales, por ejemplo: sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo y linfático, y orina, sino también a muestras biológicas provenientes de tejidos, que hayan sido homogeneizadas por procedimientos mecánicos, sonicación o cualquier otro procedimiento conocido en el estado de estas técnicas, y solubilizadas. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "fracción de lisado de elementos celulares" se refiere a la fracción de la muestra biológica de donde se parte y en donde se encuentran concentradas las proteínas priónicas infectivas.

1.- Procedimientos para la obtención de fracciones enriquecidas en proteínas priónicas a partir de muestras sanguíneas

Se realizaron extracciones de sangre en condiciones estériles de animales sanos pertenecientes a rebaños negativos (controles) y de otros procedentes de rebaños en los que se habían detectado diversos casos de escrapie y en los que se había llevado a cabo una selección genotípica por su sensibilidad a la enfermedad. Esta selección consiste en determinar el genotipo del animal para el gen PrP con el fin de determinar la susceptibilidad o resistencia genética del individuo al escrapie. En función de la combinación alélica obtenida para determinados codones (136, 1554 y 171 dentro del gen PrP), se establece la asociación con los distintos genotipos. En nuestro caso se seleccionaron aquellos animales con genotipos sensibles (grupos mayoritarios de riesgo 3 y 4), es decir, con una mayor susceptibilidad a padecer la enfermedad. Concretamente, las combinaciones ARQ/ARQ o ARH/ARQ, correspondientes a un riesgo 4 y ARR/ARH o ARH/AHQ, correspondientes al riesgo 3 (National Scrapie Plan for Great Britain). Una vez realizada esta selección, tanto animales sanos como enfermos con escrapie fueron sometidos a estudio, realizando una clasificación adicional de estos últimos en función de la fase clínica de la enfermedad (Tabla 1).

Procedimiento a)

Un objetivo particular de la presente invención es un procedimiento de detección de proteínas priónicas infectivas, mediante el cual, la obtención de una fracción de lisado de elementos celulares de muestras biológicas (sangre) de animales, enriquecida en PrP^{Sc}, (procedimiento a) de la presente invención (ver Ejemplos 1 y 2), comprende los siguientes pasos:

-: extracción de sangre de ovino, 8-10 ml, con EDTA 1,4 mM, en tubos estériles.

-: centrifugación refrigerada y a 4.300 g (6.000 rpm) durante 30 minutos, de los 8-10 ml de sangre situados en tubos de aproximadamente 40 ml.

-: extracción del sobrenadante,

-: sobre el pellet se añaden unos 10 ml de disolución salina isotónica comercial estéril (NaCl 154 mM, osmomolaridad de 307 miliosmomolar mOsm/L) y se disgrega el pelet

-: centrifugación posterior, y eliminación del sobrenadante,

-: choque osmótico de los elementos celulares resuspendidos con aproximadamente 40 ml de agua Milli-Q (Millipore), y centrifugación de la suspensión resultante a 17.200 g durante 30 minutos,

-: eliminación completa del sobrenadante con el fin de obtener un pelet concentrado en priones.

-: realización de un nuevo choque osmótico en las mismas condiciones descritas, eliminación del sobrenadante y de los restos acuosos que quedan en el tubo.

: Finalmente se obtiene un pelet concentrado en priones y formado mayoritariamente por fragmentos y membranas de células blancas de la sangre.

Procedimiento b)

Otro objetivo particular de la presente invención es un procedimiento de preparación mucho más rápido que el procedimiento a) de detección de proteínas priónicas infectivas. Mediante este método b), la obtención de una fracción de lisado de elementos celulares de muestras biológicas (sangre) de animales, enriquecida en proteínas PrP^{Sc}, (ver Ejemplos 3 y 4), comprende los siguientes pasos:

-: Se parte de tubos de aproximadamente 40 ml, que contienen aproximadamente 3/4 de su capacidad de agua Milli-Q. Se les añade unos 4-5 ml de sangre de ovino refrigerada, extraída preferentemente 24-48 horas antes. Se enrasan con más agua, y se invierten varias veces los tubos. Se centrifugan a 4.300 g durante 30 minutos.

-: se decantan completamente todos los sobrenadantes y se le añaden a los pelets resultantes 2-3 ml de la disolución salina isotónica comercial de NaCl descrita en el procedimiento a); esta operación de lavado se repite 2-3 veces. Una muestra de los pelets se recoge para ulteriores análisis. Estos pelets están constituidos, preferentemente, por restos celulares y membranas de células blancas. Para facilitar la conservación de los pelets o su ulterior ultracongelación, se desprenden los mismos con disolución salina, y se trasladan por decantación a tubos ependorfs. Se centrifugan durante 10 minutos en una microcentrifuga a 4ºC. Se separa el sobrenadante, y los restos de agua que puedan quedar en los ependorfs se eliminan. Los pelets resultantes se guardan refrigerados o se congelan a -80ºC para posteriores análisis.

Este procedimiento es más rápido en realizar que el método a), pero las señales espectrales correspondientes a las proteínas priónicas están más solapadas con las de otras proteínas globulares, si bien la moderna instrumentación infrarroja permite identificar bien las bandas de las proteínas PrP^{Sc}, como se observa en las Figuras 2 y 4.

Con el fin de poder investigar en qué elementos celulares intactos de la sangre se encuentran preferentemente las proteínas priónicas PrP^{Sc}, se ha desarrollado el siguiente procedimiento.

Procedimiento c)

-: Se colocan 10 ml de sangre con EDTA 1,4 mM, recientemente extraída, en un tubo de poliestireno con fondo cónico y tapón roscado y estéril de 15 ml de capacidad, y se centrifuga en un rotor oscilante a 1.250 g durante 15 minutos, obteniendo en la interfase las células blancas (fracción A, buffy coat).

-: Se recoge la interfase (fracción A, aproximadamente 1 ml) y se añade a 6 ml de TBS 0,05M Tris/HCl, 0,15M NaCl, pH 7,6. En un tubo apropiado se forma el gradiente, constituido por 3 ml de disolución de Ficoll-Paque™ PLUS (Sweden), sobre los cuales se colocan los 7 ml de la fracción A suspendida en TBS. Se centrifuga de nuevo a 1.250 g durante 15 minutos, obteniéndose las siguientes fracciones: fracción C (interfase), formada por células mononucleares (linfocitos y en menor medida, monocitos; Figura 9 (a), y la fracción B (pelet), formada principalmente por eritrocitos y células polimorfonucleares (neutrófilos y en menor medida, eosinófilos y basófilos; Figura 9 (b).

-: A las fracciones A y B, se les aplica un choque osmótico con 25 ml de agua Milli-Q en un tubo (Falcon) de fondo cónico de 50 ml, y posteriormente se añaden 25 ml de una solución salina (1.8% NaCl); se realizan posteriores lavados (x3) con 25 ml de TBS por centrifugación a 500 g durante 10 min; finalmente se resuspende el pelet en TBS en un tubo ependorf para su posible análisis o congelación.

-: De la interfase (fracción C) se recoge aproximadamente 1 ml de suspensión celular, que se recoge en un tubo ependorf de 1 ml. Se centrifuga a la máxima velocidad durante 10 minutos en una microcentrífuga a 4ºC, se desecha el sobrenadante y el pelet resultante se resuspende en agua Milli-Q para el correspondiente choque osmótico. Se centrifuga de nuevo en las mismas condiciones, se desecha el sobrenadante y el precipitado resultante se suspende para lavar en disolución salina isotónica descrita anteriormente. Se centrifuga de nuevo y se decanta completamente el sobrenadante. Se eliminan los restos de disolución salina que quedan adheridos a las paredes del tubo. La muestra resultante se analiza u, optativamente, se congela a -80ºC.

Los componentes celulares de las fracciones A, B y C se han identificado mediante tinciones específicas (GIEMSA) y observaciones morfológicas utilizando microscopía óptica.

2. Intercambio isotópico H/D (hidrógeno/deuterio) de los pelets preparados por los procedimientos a) y b) para análisis infrarrojo

Este intercambio isotópico, que tiene como finalidad eliminar la influencia de la banda \deltaH_{2}O (que aparece hacia 1643 cm^{-1}) en las bandas amida I de las proteínas a analizar, se ha realizado siguiendo dos procedimientos:

1.- En un minidializador con corte molecular de 3.500 de la firma Pierce (Slide-A-Lyzer® mini dialysis units) se introducen aproximadamente 10-15 \mul de pelet de la fracción celular lisada a analizar. El minidializador, que contiene la membrana dializadora en la base del mismo, se deja flotar en un pequeño vaso de precipitado de 10 ml en el que se depositan varios ml de agua pesada. Se tapa herméticamente el vaso con papel parafilm, y se realiza la diálisis mediante agitación durante 30 minutos para que se logre el intercambio isotópico de los protones del agua y los protones amídicos del esqueleto polipeptídico de las proteínas. Con ello la banda amida I de las proteínas queda libre de la influencia de las especies moleculares H_{2}O, cuya banda de deformación angular (scissoring) se desplaza por deuteración hacia 1200 cm^{-1}.

2.- En un tubo ependorf de 1 ml de capacidad se introduce aproximadamente 0,6 ml de agua pesada (D_{2}O), y se deja flotar sobre ésta un pequeño tubo de vidrio de unos 5 mm de diámetro y 1 cm de altura. Se introducen sobre el tubo de vidrio 5-10 \mul de pelet acuoso de la fracción celular obtenida, se cierra herméticamente el tubo ependorf y se deja a temperatura ambiente varias horas (2-4 h). Este segundo procedimiento es más lento que el anterior, pero es más económico e igual de eficaz si se deja el tiempo suficiente para realizar el referido intercambio isotópico.

3. Identificación, por espectroscopia infrarroja, de las proteínas marcadoras PrP^{Sc} en las fracciones celulares lisadas

La presencia de proteínas priónicas infectivas, por su predominante estructura \beta que es característica de ellas (Caughey y cols., J. Biol. Chem., 273, 32230-32235 (1998); Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 23, 13363-13383 (1998)) se puede detectar por espectroscopia infrarroja por dos procedimientos: 1) cualitativamente y 2) cuantitativamente como sigue:

1) Cualitativamente. Las proteínas con estructura \beta, como las priónicas infectivas, generan bandas de absorción infrarroja próximas a 1637 cm^{-1}, lo que se ha demostrado mediante espectros sobre patrones de estas proteínas (Caughey y cols., Biochemistry, 48, 32230-32235 (1998); Pan y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10962-10966 (1993); Caughey y cols., Biochemistry, 30, 7672-7680 (1991)). Aunque obviamente podrían existir otras proteínas con un alto contenido en estructura \beta, (como, por ejemplo, podría ser la proteína \beta-amiloide de la enfermedad de Alzheimer) la detección de un aumento relativo de esta estructura, respecto a los controles, unido al progreso en la evolución de la enfermedad, hay que atribuirlo inequívocamente a la presencia de proteínas PrP^{Sc}. Hasta ahora no se ha encontrado ningún caso en otras patologías catalogadas clínicamente como \beta-fibrilosis en el rebaño de ovejas utilizado. Nuestros resultados, con una muy clara detección de proteínas priónicas infectivas en casos clínicos en los que la enfermedad ha sido posteriormente confirmada (post mortem) mediante las técnicas establecidas por la OIE, e incluso en algunos casos donde la inmunohistoquímica a partir de biopsia de tercer párpado arrojó resultados negativos o dudosos, sugieren que la técnica espectroscópica podría ser también empleada en el diagnóstico de otras \beta-fibrilosis, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer, donde las técnicas de diagnóstico precoz fiables son prácticamente inexistentes. Finalmente, datos obtenidos por métodos inmunocitoquímicos e inmunoelectroforéticos (Madec y cols., J. Virol. Methods, 75, 169-177 (1998); Madec y cols., Veterinary. Record, 146, 74-76 (1998)) no mostrados, revelan la presencia de PrP^{Sc} en la fracción del lisado de los elementos celulares. Sobre la base de las señales espectroscópicas medidas y cantidades de muestras obtenidas, mediante esta técnica infrarroja se pueden detectar cantidades de PrP^{Sc} en sangre menores que 10 \mug/ml, que es del mismo orden de magnitud que la sensibilidad de las espectroscopia s de fluorescencia y ultravioleta (Brown y cols., J Lab. Clin. Med., 137, 5-13 (2001)). Este nivel de detección es debido, por una parte, al procedimiento de obtención de la fracción celular donde se localizan estas proteínas priónicas, y por otro lado a que en los monómeros de proteínas PrP^{Sc}, esta proteína adopta una estructura predominantemente \beta, y en sus agregados la proporción de esta estructura es del orden de 80-100%. (Caughey y cols., J. Biol. Chem., 273, 32230-32235 (1998); Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 23, 13363-13383 (1998); Saborio y cols., Nature, 411, 810-813 (2001)).

Aunque a veces estas bandas aparecen con una intensidad relativamente débil en forma de hombro, el uso de la espectroscopia de segundas derivadas en el dominio de frecuencias espectrales revelan inequívocamente esta estructura proteica \beta, como se ilustra en los ejemplos descritos más adelante.

2) Cuantitativamente. Consiste en medir los porcentajes de estructura \beta existentes en muestras positivas afectadas de escrapie y comparar dichos porcentajes con los obtenidos de muestras negativas controles. Para ello, se considera la región espectral amida I comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1}. Debido a la utilización de agua pesada como disolvente espectroscópico de las muestras, el perfil espectral en la región citada se deberá fundamentalmente a la presencia de las diferentes estructuras secundarias de proteínas. Por tanto, un ajuste de dicho perfil a una suma de funciones Gaussianas y/o Lorentzianas componentes dará, en términos de porcentajes relativos de áreas, la proporción de estructuras secundarias presentes en cada muestra.

Explicación detallada de las figuras

Figura 1. Espectros infrarrojos de un pelet constituido, preferentemente, por células blancas usadas y sus membranas procedentes de sangre de un ovino sano (control), validado por biopsia y necropsia negativas, y obtenido por el procedimiento a. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 2. Espectros infrarrojos de un pelet constituido, preferentemente, por células blancas usadas y sus membranas procedentes de sangre de un ovino infectado, validado con una necropsia positiva de escrapie, obtenido por el procedimiento a. Hay que hacer notar que este animal muestra una biopsia del tercer párpado negativa. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 3. Espectros infrarrojos de un pelet constituido, preferentemente, por células blancas lisadas y sus membranas procedentes de sangre de ovino sano (control), validado por una biopsia y necropsia negativas, y obtenido por el procedimiento b. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 4. Espectros infrarrojos de un pelet constituido, preferentemente, por células blancas usadas y sus membranas procedentes de sangre de ovino infectado, validado por biopsia y necropsia positivas de escrapie, y obtenido por el procedimiento b. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 5. Espectros infrarrojos de un pelet formado por células blancas correspondientes a la fracción A ("buffy coat") de sangre extraída de un ovino sano (control), con biopsia y necropsia negativas, y obtenido por el procedimiento c. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 6. Espectros infrarrojos de un pelet formado por células blancas correspondientes a la fracción A (buffy coat) de sangre extraída de un ovino infectado, validado por biopsia y necropsia positivas, y obtenido por el procedimiento c. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 7. Espectros infrarrojos de un pelet formado por linfocitos lisados y, en menor medida, monocitos que corresponden a la fracción C de sangre extraída de ovino sano (control), validado por biopsia y necropsia negativas, y obtenido por el procedimiento c. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 8. Espectros infrarrojos de un pelet formado por linfocitos lisados y, en menor medida, monocitos (células mononucleares) que corresponden a la fracción C de sangre extraída de ovino afectado de escrapie según biopsia y necropsia positivas, obtenido por el procedimiento c. Espectro original (superior), y espectro de segunda derivada (inferior).

Figura 9 (a). Tinción Giemsa de la fracción C de sangre obtenida mediante el procesamiento c) procedente de un ovino afectado por la enfermedad de escrapie, compuesta principalmente por células mononucleares (linfocitos preferentemente y en menor medida monocitos) (x 400).

Figura 9 (b). Tinción Giemsa de la fracción B de sangre obtenida mediante el procesamiento c) procedente de un ovino afectado por la enfermedad de escrapie, compuesta principalmente por células polimorfonucleares (preferentemente neutrófilos, y en menor medida eosinófilos y basófilos) (x 400).

Ejemplos de realización de la invención

Esta invención se ilustra con más detalle mediante los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Espectroscopía infrarroja de pelets, procedentes de lisados celulares, obtenidos de sangre de oveja sana (control), a partir del procedimiento a)

Siguiendo este procedimiento, se introdujeron aproximadamente 5-10 \mul de pelet deuterado entre dos cristales de CaF_{2} con un separador de teflón de 25 \mu. El espectro obtenido, medido en un espectrómetro FTIR Perkin-Elmer modelo 1725X, fue el resultado de promediar 64 barridos a una resolución de 2 cm^{-1} y de restar el espectro de agua pesada en las mismas condiciones experimentales. Este espectro se incluye en la Figura 1 junto con el espectro de la segunda derivada, en donde se advierte como principales bandas componentes amida I las situadas hacia 1662, 1655 y 1646 cm^{-1}, que están originadas por estructuras de acodamientos, \alpha-hélices y desordenadas, respectivamente. De manera análoga se procedió a medir los espectros de siete pelets más de controles negativos y se procedió a determinar los porcentajes de estructura proteica \beta, que como se ha indicado anteriormente son indicativos de la existencia de infección de escrapie o bien de animales sanos. Las 8 primeras muestras de la Tabla 1 corresponden a controles negativos o animales sanos seleccionados según el aspecto clínico de los mismos y de las necropsias post mortem. La espectroscopia infrarroja indica que los porcentajes de estructura \beta en ellas están por debajo del 10%. En cambio, la proporción de esta estructura es significativamente mayor en animales infectados, como se describe en el Ejemplo 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Correlación entre porcentajes de estructura \beta en lisados de células sanguíneas obtenidos según el método a) y los respectivos análisis de biopsia y post mortem del SNC/SLR

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1

\NAK \begin{minipage}[t]{150mm} Los 8 primeros animales corresponden a controles negativos de ovinos, y los numerados del 9 al 23 corresponden a ovinos afectados de escrapie. El animal N^{o} 24 es una cabra control negativo (raza Saanen) y los Nos. 25 y 26 (razas Cruce y Alpina, respectivamente) corresponden a cabras infectadas de escrapie. La gran mayoría de ovinos analizados son hembras de Raza Aragonesa. El genotipo es en la mayoría de los ovinos es ARQ/ARQ, solamente dos ARQ/ARH y una ARQ/VRQ.\end{minipage}

* \begin{minipage}[t]{150mm} Estos números corresponden al mismo animal que el del número inmediato anterior, pero se le ha extraído sangre 1-2 meses después.\end{minipage}

\dagger C.C., cuadro clínico en el momento de realizar la extracción sanguínea.

\ddagger Biopsias realizadas después de la extracción sanguínea.

NT: \begin{minipage}[t]{150mm} no testado. Las necropsias no realizadas es porque los animales respectivos no se han sacrificado.\end{minipage}

SNC/SLR, Sistema Nervioso Central/Sistema Linforreticular.

Ejemplo 2 Espectroscopia infrarroja de pelets procedentes de lisados celulares, obtenidos de sangre de ovejas infectadas, a partir del procedimiento a)

La Figura 2 incluye el espectro infrarrojo del pelet procedente de la fracción de lisado celular obtenida por el procedimiento a), correspondiente a un animal afectado de escrapie. Las medidas espectroscópicas se realizaron en las mismas condiciones experimentales que en el Ejemplo 1. En el espectro de la segunda derivada de dicha Figura se advierte una banda hacia 1636 cm^{-1} que es mucho más intensa que la correspondiente al espectro de la Figura 1 (control negativo), y que cabe atribuir a estructuras \beta de proteínas priónicas. Los espectros infrarrojos correspondientes a patrones de estas proteínas priónicas (Caughey y cols., J. Biol. Chem., 48, 32230-32235 (1998); Pan y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10962-10966 (1993); Caughey y cols., Biochemistry, 30, 7672-7680 (1991)) muestran una banda prominente amida I en esta frecuencia, coincidente con la de la banda citada en el espectro de la
Figura 2.

Por otra parte, en la Tabla 1 se observa que todas las muestras procedentes de animales afectados por la enfermedad según biopsias o necropsias, presentan unos porcentajes de estructura \beta que están por encima del 10%, lo que permite distinguirlas espectroscópicamente de los animales sanos o controles negativos. Además, las muestras 10 y 13 de la Tabla 1, procedentes del mismo animal que las muestras inmediatas anteriores (9 y 12 respectivamente), pero extraídas 1-2 meses después, presentan un contenido en estructura \beta superior. Esto permite seguir, por espectroscopia infrarroja, la evolución en agravamiento de la enfermedad de los animales. También se debe hacer notar que hay casos, como los correspondientes a las muestras números 12 y 13 de la Tabla 1, en que las biopsias resultaron inicialmente negativas en la primera extracción sanguínea y sin embargo, el análisis infrarrojo dio como resultado unos porcentajes de estructura \beta típicos de animales infectados, lo que se confirmó posteriormente mediante necropsia post mortem. Este caso es indicativo de que esta técnica espectroscópica es incluso capaz de dar un diagnóstico preclínico de escrapie que, sin embargo, la biopsia de tercer párpado no ha sido capaz de detectar. Por otra parte, es de notar el hecho de que en las ovejas con un cuadro clínico negativo (animal en fase preclínica), como ocurre en las de los números. 19 a 23, la espectroscopia infrarroja es capaz de detectar infectividad, sobre la base de los porcentajes de estructura \beta hallados. Esta infectividad, como se advierte en esta tabla, se confirma con las correspondientes biopsias y/o necropsias positivas.

Mediante esta metodología espectroscópica, dada la duración de la medida de espectros, se pueden analizar aproximadamente unas cien muestras de sangre por día si éstas están previamente preparadas (fraccionadas e intercambiadas isotópicamente).

Ejemplo 3 Espectroscopia infrarroja de pelets de muestras procedentes de lisados celulares, obtenidos de sangre de oveja sana (control), a partir del procedimiento b)

La Figura 3 presenta un espectro infrarrojo de un pelet de lisado celular de ovino sano (control negativo) obtenido por el procedimiento b). En el espectro en cuestión y el de su segunda derivada, medidos en las mismas condiciones experimentales que en el Ejemplo 1, se advierte como bandas más prominentes las situadas hacia 1660, 1651 y 1644 cm^{-1}, atribuibles a estructuras de acodamientos, \alpha-hélices y desordenadas. Por otra parte, los porcentajes de estructura \beta de este control negativo y cinco más (Tabla 2), corresponden a unos valores que se sitúan, análogamente a la Tabla 1, por debajo del 10%. Sin embargo, y como se describe en el ejemplo siguiente, estos porcentajes son inferiores a los correspondientes a muestras de sangre de animales infectados.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Correlación entre porcentajes de estructura \beta en lisados de células sanguíneas obtenidos según el método b) y los respectivos análisis de biopsia y post mortem del SNC/SLR

2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}[t]{150mm} Los 3 primeros animales corresponden
a controles  negativos de ovinos, y los numerados  del 4 al 13
corresponden a ovinos afectados de escrapie. El animal No. 14 es 
caprino  control negativo (raza Saanen) y el No.15 es caprino
infectado (raza Alpina).  Todos los  ovinos son hembras de Raza
Aragonesa excepto uno que es Cruce. El genotipo de  todos  los
ovinos es ARQ/ARQ.\end{minipage} \cr   \dagger  C.C., cuadro
clínico en el momento de realizar la extracción sanguínea.\cr 
 \ddagger  Biopsias realizadas después de la extracción
sanguínea.\cr  \begin{minipage}[t]{150mm} NT, no testado. Las
necropsias no realizadas es  porque los animales respectivos no se 
han
sacrificado.\end{minipage} \cr}

Ejemplo 4 Espectroscopia infrarroja de muestras de pelets procedentes de lisados celulares, obtenidos de sangre de ovejas infectadas, a partir del procedimiento b)

La Figura 4 muestra el espectro infrarrojo de un pelet deuterado, medido en las mismas condiciones que en los ejemplos anteriores, y correspondiente a un lisado celular de sangre de ovino infectado obtenido por el procedimiento b). Como detalle más llamativo, en dicha Figura se puede observar que la banda más intensa en el espectro de la segunda derivada aparece hacia 1637 cm^{-1}, que como se ha descrito anteriormente, se atribuye a la presencia de proteínas priónicas infectivas con estructura \beta, estructura que en esta muestra se presenta con un porcentaje del 32%. Además, el análisis de los resultados de la Tabla 2 revela que todas las muestras con biopsia y/o necropsia positiva poseían un contenido en estructura \beta superior al 15-20%. Estos resultados indican asimismo que el método b) de esta invención es también adecuado para distinguir entre sangre de ovinos controles e infectados de escrapie.

Ejemplo 5 Espectroscopia infrarroja de células blancas sanguíneas (Fracción A), obtenidas por el procedimiento c)

En las Figuras 5 y 6 se incluyen los espectros de la Fracción A (buffy coat), compuesta preferentemente por células blancas sanguíneas, correspondientes respectivamente a un animal sano (control negativo) e infectado. Como diferencias cualitativas más significativas entre dichas figuras caben señalar las intensidades de las bandas en los espectros de las segundas derivadas, en particular las bandas correspondientes a las estructuras \beta que aparecen hacia 1638 y 1631 cm^{-1}. En el caso de la muestra infectada (Fig. 6), estas bandas aparecen mucho más intensas que en el espectro del control negativo (Fig. 5). Por otra parte, es de interés también el hecho de que en la Figura 6 las frecuencias de las estructuras \beta priónicas no coinciden exactamente con las frecuencias correspondientes a las de otros animales infectados, lo que sugiere la existencia de varias isoformas que ya han sido identificadas en trabajos previos (Caughey y cols., J. Biol. Chem., 48, 32230-32235 (1998)).

El análisis infrarrojo de la Fracción B, formada principalmente por neutrófilos, y en menor medida eosinófilos y basófilos, obtenida de un animal sano y otro infectado no presentan diferencias significativas entre ellas en cuanto a contenido en estructura \beta, lo que sugiere que las proteínas priónicas no están localizadas preferentemente en este tipo de células. Por este motivo se han omitido sus espectros.

Ejemplo 6 Espectroscopia infrarroja de células blancas sanguíneas (Fracción C), obtenidas por el procedimiento c)

Las Figuras 7 y 8 muestran respectivamente los espectros infrarrojos de células blancas (mayoritariamente linfocitos y en menor medida, monocitos) obtenidas en la Fracción C de ovino sano y afectado de escrapie. Como diferencia más significativa entre dichos espectros cabe referirse a las bandas generadas por las estructuras \beta priónicas hacia 1637 y 1631 cm^{-1}, que en el caso del espectro control aparecen muy débiles y sin embargo son mucho más intensas en el espectro del animal infectado. Análogamente a la Fracción A, se observa también la existencia de varias isoformas de
estructura \beta-priónica que corresponden a las bandas citadas (1637, 1631 y 1626 cm^{-1}). La frecuencia de la banda hacia 1618 cm^{-1} puede corresponder a proteínas priónicas que estén agregadas en los elementos celulares aislados.

A la vista de estos resultados cabe concluir que las proteínas priónicas infectivas están localizadas preferentemente en la fracción celular sanguínea C, constituida principalmente por linfocitos.

Claims

1. Procedimiento de detección de proteínas priónicas en animales y humanos, vivos o muertos, caracterizado por la identificación de dichas proteínas priónicas mediante espectroscopia infarroja.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a): obtención de una fracción que contiene proteínas PrP^{Sc} a partir de muestras biológicas de animales y humanos

b): la identificación por espectroscopia infrarroja de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque el paso a) de obtención de una fracción que contiene proteínas PrP^{Sc} se basa entre otros, en la obtención de un pelet de una fracción de usado de elementos celulares sanguíneas, enriquecido en proteínas PrP^{Sc}, a partir de muestras biológicas de animales o humanos.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3 caracterizado porque la obtención de la fracción de usado de elementos celulares comprende los siguientes pasos:

-: extracción de sangre de ovino, 8-10 ml, con EDTA 1,4 mM

-: centrifugación refrigerada a 4ºC y a 6.000 rpm (\sim 4.300 g) durante 30 minutos,

-: extracción del sobrenadante (plasma),

-: resuspensión del pelet del fondo del tubo con 10 ml de disolución salina isotónica comercial estéril y apirógena (NaCl 154 mM, osmomolaridad de 307 miliosmomolar mOsm/L). Se invierte el tubo repetidas veces hasta conseguir la completa disgregación del pelet,

-: centrifugación posterior a 4.300 g durante 30 minutos, y eliminación del sobrenadante,

-: eliminación completa del sobrenadante con el fin de obtener un pelet concentrado en priones,

-: choque osmótico en las mismas condiciones descritas, se elimina el sobrenadante y los restos acuosos que quedan en el tubo se eliminan, y finalmente se obtiene un pelet concentrado en priones para sus posteriores análisis o congelación. Estos pelets están constituidos, preferentemente, por células blancas lisadas y sus membranas.

5. Un procedimiento rápido según la reivindicación 2, caracterizado porque en el paso a) no se realiza la separación previa entre los componentes celulares y no celulares de la muestra biológica y en cambio se realizan los siguientes pasos:

-: adición a tubos de aproximadamente 40 ml de capacidad que contienen aproximadamente 3/4 de su capacidad de agua Milli-Q de unos 4-5 ml de sangre de ovino refrigerada, que ha sido extraída preferentemente no más de 24-48 horas antes. Se invierten varias veces los tubos. Se centrifugan a 4.300 g durante 30 minutos;

-: decantación de todos los sobrenadantes, y lavado de cada uno de los tubos con 2-3 ml de la disolución salina isotónica comercial de NaCl descrita en el procedimiento a); esta operación se repite 2-3 veces. Se eliminan los restos acuosos que quedan. Una muestra de los mismos se recoge para ulteriores análisis. Estos pelets están constituidos, preferentemente, por restos celulares y membranas de células blancas. Para facilitar la conservación de los pelets o su ulterior ultracongelación, y se trasladan por decantación a ependorfs de aproximadamente 1 ml de capacidad. Se centrifugan a la máxima velocidad durante 10 minutos en una microcentrífuga a 4ºC. Se separa el sobrenadante, y los restos de agua. Los pelets resultantes se guardan refrigerados o se ultracongelan a -80ºC para posteriores análisis.

6. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por la identificación, por espectroscopia infrarroja, de proteínas priónicas infectivas en las Fracciones A y C de células blancas de sangre obtenidas por centrifugación en gradiente de densidad y lisadas según el método c) del procedimiento para la obtención de fracciones enriquecidas en proteínas priónicas a partir de muestras sanguíneas.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6 caracterizado porque la identificación de proteínas priónicas infectivas en la fracción de lisados celulares de la sangre se realiza mediante un proceso de identificación cualitativa por espectroscopia infrarroja que comprende, al menos:

a): medida del espectro infrarrojo de dicha fracción en la región espectral amida I, comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1}, y

b): la identificación de la presencia de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observen bandas características entre 1640 y 1620 cm^{-1}, o más preferentemente entre 1638 y 1630 cm^{-1}.

8. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6 caracterizado porque la identificación de proteínas priónicas infectivas en la fracción de lisados celulares se realiza mediante un proceso de identificación cuantitativa por espectroscopia infrarroja que comprende, al menos:

a): la medida del espectro infrarrojo de dicha fracción en la región espectral amida I comprendida entre 1600 y 1700 cm^{-1},

b): la sustracción espectral de la contribución del fondo del agua pesada,

c): la determinación del porcentaje de estructura proteica \beta,

d): la identificación cuantitativa de la presencia de proteínas PrP^{Sc} en dicha fracción cuando se observe un porcentaje de estructura proteica \beta de, al menos un 10%, o preferentemente mayor del 15%, medido como área porcentual en la banda amida I'.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado porque la muestra biológica puede provenir de un fluido biológico, entre otros, sangre, suero, líquido cefalorraquídeo y linfático, y orina, o de un tejido que, o bien como tal, o ha sido homogeneizado o solubilizado por procedimientos estándar.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado porque los seres vivos objeto de análisis pertenecen, entre otros, al siguiente grupo: ovejas, vacas, cabras, muflones, visones, ciervos, gatos, roedores, y humanos.

11. Uso de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 10 para el diagnóstico de animales preclínica o clínicamente infectados de EETs y de humanos afectados de otras \beta-fibrilosis (por ejemplo Alzheimer), y el estudio de la evolución de la infección, entre otras, de escrapie en ovinos y caprinos, muflones, EEB, la enfermedad crónica caquetizante del ciervo, todas las variantes de la enfermedad de CJD, la enfermedad de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, y el insomnio familiar fatal.