ES2321045T3 - Metodo para detectar salmonella a partir de un cultivo enriquecido. - Google Patents

Abstract

Un método de determinación microbiológica, caracterizado por que las bacterias pertenecientes al género Salmonella se detectan con claridad en el medio de cultivo antes del pico de crecimiento poblacional mediante el uso de antígenos fimbriales proteínaceos cuyas células se expresan tras su inoculación en el medio y con anterioridad a la fase de crecimiento logarítmico o al comienzo de ésta.

Description

Método para detectar salmonella a partir de un cultivo enriquecido.

Actualmente la Salmonella es uno de los principales contaminantes bacterianos presentes en alimentos. Su capacidad para adaptarse rápidamente, por la cual se caracteriza, dificulta su detección. En la actualidad existen más de 2000 cepas de Salmonella identificadas, de las cuales en torno a 100 son destacables en términos higiénicos y clínicos. La Salmonella es una causa frecuente de enfermedades entéricas en seres humanos y animales. El número de cepas de mayor relevancia presentes durante epidemias es aproximadamente de diez. La presencia de la Salmonella en alimentos suele provocar que un gran número de personas se vean expuestas a la infección. La detección de la fuente original de contaminación es a menudo una tarea compleja. Los alimentos o el agua contaminados constituyen fuentes comunes de propagación del contagio. La Salmonella pertenece a las denominadas bacterias entéricas. La mayoría de las cepas provocan gastroenteritis.

Por regla general, las Salmonellas habitan en el exterior del cuerpo de las personas y animales huésped en condiciones de crecimiento muy deficientes. Estas bacterias tienen que sobrevivir y mantener su viabilidad por ejemplo en el agua, donde normalmente otros microbios compiten con ellos por los nutrientes. En estas circunstancias es muy común que las células evolucionen y se conviertan en células en reposo. Una vez que alcanzan unas condiciones de crecimiento adecuadas deben adaptarse rápidamente a las nuevas condiciones para poder colonizar, por ejemplo, la superficie epitelial de las células del tracto gastrointestinal.

Fuera del cuerpo, la Salmonella y otras bacterias entéricas suelen estar expuestas a condiciones de elevado estrés medioambiental. Cuando la Salmonella u otros microorganismos penetran en el cuerpo con los alimentos, alcanzan rápidamente el ambiente de pH bajo del estómago, lo que destruye un elevado número de células vivas microbianas. Por otro lado, un pH bajo también disocia los apéndices en la superficie de las células, de las cuales, especialmente las fimbrias o estructuras análogas se utilizan para adherirse sobre el epitelio. Una vez han penetrado en el duodeno, para invadir el organismo, las Salmonellas y otras especies entéricas patógenas deben sintetizar rápidamente los componentes de los distintos filamentos de unión y construir correspondientemente estos apéndices en la superficie de las células. Estos filamentos pueden servir de base de métodos inmunológicos de detección de microbios, puesto que normalmente son altamente inmunogénicos. Asimismo, pueden disociarse en las moléculas independientes que los componen. Del mismo modo, para la detección inmunológica de microbios, puede aprovecharse la detección de los flagelos que numerosas bacterias sintetizan para poder moverse, así como la proteína flagelina, componente principal del flagelo.

Por lo general, antes de utilizar un método de detección inmunológica, el cultivo de Salmonella o la muestra o el cultivo de la bacteria entérica, otras bacterias u otros microorganismos deben desarrollarse selectivamente y deben enriquecerse los microbios deseados.

Normalmente, en un cultivo de enriquecimiento, la muestra o cultivo suele cultivarse durante el tiempo suficiente para que las células en cuestión superen con creces el número de las de la muestra original, lo cual suele requerir al menos 12 horas. Generalmente, es de esperar que el número de antígenos también aumente en una proporción aproximadamente directa al número de células o a la masa celular.

Uno de los principales objetivos de la higiene de los alimentos y el agua, entre otros, es la prevención de la propagación de la Salmonella. Este es el motivo por el cual la detección de la Salmonella y otros microbios similares constituye un importante campo de expansión para la investigación y la actividad económica. El problema de la utilización de métodos tradicionales de cultivo bacteriano para diagnósticos de Salmonella y otros patógenos es que la obtención de resultados requiere mucho tiempo. Esto genera gastos muy elevados por ejemplo en la industria alimentaria, en la que suele ser necesario almacenar los productos mientras se esperan los resultados del control higiénico o retirarlos del mercado o de la cadena de distribución en caso de que éstos concluyan la contaminación con Salmonella u otras bacterias. Recientemente, los trabajos de investigación y el desarrollo destinados a la determinación microbiana vienen centrándose en la búsqueda de métodos de detección de microbios más rápidos.

Son necesarios métodos más rápidos, fiables y eficaces de muestreo clínico en los hospitales y de categorización higiénica de cepas microbianas resistentes a los antibióticos. Estos métodos deben servir al mismo tiempo para la detección de microbios en las condiciones más sencillas posibles, incluso fuera de los laboratorios.

Asimismo, la industria alimentaria requiere métodos de detección y enriquecimiento nuevos y rápidos para mantener la seguridad de los productos, reducir el tiempo de almacenamiento y controlar las materias primas. Por otra parte, distintos análisis medioambientales y de agua, cuya importancia se ha incrementado en los últimos tiempos, requieren urgentemente métodos de este tipo.

Antecedentes de la invención

En la detección de microbios a partir de por ejemplo muestras clínicas, muestras de alimentos o medioambientales, las concentraciones microbianas de la muestra original suelen ser tan bajas que son necesarios los denominados métodos de enriquecimiento. Estos métodos aumentan la cantidad y concentración de microbios detectados en la muestra. Se utilizan métodos microbianos específicos de cultivo, que suelen implicar la utilización de un factor selectivo para prevenir la multiplicación de otros microbios. Este factor puede ser una sustancia química, un antibiótico o producto equivalente, o un determinado factor físico, como la presión parcial de un gas. El pH puede constituir también un factor selectivo. A menudo, en una selección, puede aprovecharse la sinergia de los distintos factores selectivos para el cultivo de enriquecimiento del microbio deseado.

La necesidad de recurrir a métodos de enriquecimiento para la detección de microbios implica una pérdida de tiempo significativa y por tanto, lo más deseable el ahorro de tiempo en estos procedimientos supondría una gran ventaja.

La identificación microbiana específica suele recurrir a anticuerpos producidos en animales o cultivos de células (métodos inmunológicos). Se utilizan a menudo para detectar, por ejemplo, microbios de cultivos de enriquecimiento. En dichas situaciones, el problema puede residir en que el usuario de la prueba no sepa a ciencia cierta si el cultivo en cuestión, u otra muestra y sus células, contienen el número suficiente de moléculas de antígenos para la detección.

La invención puede utilizarse a gran escala para el control de la Salmonella en productos alimentarios. Así por ejemplo, en los controles de higiene que se realizan en la industria cárnica, las concentraciones de Salmonella suelen ser tan bajas que, con los métodos actuales, la detección directa mediante el uso de análisis inmunológicos resulta imposible. En estos casos, a menudo es necesario realizar un cultivo de enriquecimiento en un medio líquido durante al menos 24 horas. El proceso de enriquecimiento suele dividirse en dos fases: la fase de pre-enriquecimiento y la fase de enriquecimiento propiamente dicha. Este proceso puede acelerarse mediante el control de las condiciones de crecimiento durante el preenriquecimiento de la posible bacteria Salmonella y la expresión de sus antígenos deseados en la muestra. El ajuste de las condiciones del cultivo también ayuda a evitar que se desarrollen cepas indeseables, con reacciones cruzadas. El cultivo de enriquecimiento también se utiliza como una ayuda para la detección e identificación de muchas otras bacterias y microorganismos.

Debido a que la invención acelera el proceso de detección de la Salmonella, puede utilizarse por ejemplo en la industria cárnica y en diagnósticos clínicos, con necesidades urgentes de métodos rápidos. En En la industrial, es habitual que se suministren los productos antes de que pueda disponerse de los resultados del control microbiológico. Esto, en caso de contaminación, puede provocar grandes pérdidas. Los métodos rápidos permitirían retirar productos contaminados con la antelación suficiente.

En una publicación previa (GB 2 234 587A) se describe un método que usa moléculas de lipopolisacáridos (LPS) como antígenos diana. En dicho método la detección más rápida de E. coli tiene lugar en 5 + 2 horas. El método depende directamente de la consecución de concentraciones bacterianas que sean lo suficientemente elevadas para su uso con fines de detección, ya que la cantidad de LPS es proporcional al número de células.

En los documentos de patente WO 92/06197, WO 94/28163 y WO 94/28420 se describen otros métodos anteriores de detección de la Salmonella y otras bacterias entéricas usando métodos inmunológicos. Dichos métodos utilizaban el crecimiento de la población celular como factor determinante para conseguir una mejora de los resultados de la detección. En el documento de patente WO 92/06197 la detección bacteriana se basa en los epítopos de las regiones de la fimbria. El método implica tiempos de cultivo tales como 24 horas o de un día para otro.

Descripción de la invención

Durante el cultivo de especies bacterianas del género Salmonella y otras bacterias entéricas en medios de nutrientes selectivos, se observó que éstas producían multitud de moléculas de antígenos específicos incluso antes de que el crecimiento de la población microbiana, basado en el número de células, alcanzase su punto máximo. De hecho, la concentración de antígeno que pudo detectar el anticuerpo específico en las superficies celulares decrecía de forma sustancial en comparación con las cifras registradas a medida que el crecimiento celular del cultivo de enriquecimiento aumentaba hasta alcanzar prácticamente sus niveles máximos. Esto hace que sea posible aplicar un método de detección inmunológica en una fase anterior a la de los métodos actuales, justo después de la denominada fase de latencia y antes de que el número de células, definido por ejemplo a partir de métodos de cálculo basados en recuento de colonias, haya aumentado de forma notable. Así, la temperatura, la composición del medio nutritivo, los anticuerpos u otras moléculas selectivas y el control de las presiones parciales de distintos gases pueden utilizarse como factores selectivos en el cultivo de enriquecimiento.

Según el método de esta invención, el procedimiento de identificación de microbios procedentes de distintas muestras puede realizarse con mayor rapidez al utilizar modificaciones de las expresiones de las distintas estructuras superficiales de los microbios de acuerdo con los cambios en la fase de crecimiento y con las condiciones de crecimiento. Gracias a la explotación del enriquecimiento "mejorado" de antígenos es posible observar, por ejemplo, un aumento de las concentraciones de antígenos fimbriales tipo 1 en un lapso de tiempo de entre 3 y 10 horas a partir del comienzo del crecimiento (Ejemplos 4 y 5). Estas fimbrias o sus componentes, las cuales son producidas por los microbios para, por ejemplo, adherirse a las células epiteliales del tracto alimentario, pueden utilizarse en métodos de detección de microbios más rápidamente que en los métodos de acuerdo con los conocimientos actuales.

En una posible forma de aplicación, tras un periodo de tiempo de enriquecimiento adecuado, pueden detectarse microbios mediante la extracción con filtro (Patente finlandesa n.º 93742). Dicha detección inmunológica puede realizarse con tiras inmunocromatográficas (immunostrips), el método ELISA, un método luminométrico u otro dispositivo o método similar que utiliza anticuerpos, que resultan adecuados específicamente para estructuras superficiales extraídas. En teoría, este procedimiento puede añadir sensibilidad a la detección cuando el número de células continúa siendo relativamente bajo.

En teoría, las características de la adhesión también podrían aprovecharse para revestir el émbolo de la jeringa de inyección utilizada para tomar la muestra (Patente de EE.UU. n.º 5.846.209). El émbolo usado para tomar la muestra a su vez, podría convertirse en un émbolo revestido de anticuerpos específicos frente a las moléculas de adhesión o las moléculas que imitan el objeto de las moléculas de adhesión de las bacterias que se buscan. Cuando se utilicen muestras de líquidos, no es necesario cambiar el émbolo. Una vez que los microbios han alcanzado unas condiciones de crecimiento adecuadas, comienzan a expresar sus moléculas de adhesión y se adhieren con ellas a las moléculas de la superficie del émbolo. La adhesión se verifica mediante un método adecuado (por ejemplo, eléctricamente u ópticamente).

Los ejemplos 4 - 5 describen las reacciones de un anticuerpo anti-péptido producido contra distintas cepas de Salmonella con cultivos bacterianos en distintas fases de crecimiento. Los resultados de estos experimentos sirvieron de base para demostrar que existían niveles elevados de reacción inmunológica incluso antes del comienzo de la fase de crecimiento logarítmico. Durante la producción de anticuerpos contra las proteínas fimbriales y los péptidos derivados de éstas, se observaron niveles de reactividad inmunológica elevados en el periodo de entre 3 y 5 horas posterior a la producción de los anticuerpos contra péptidos fimbriales (Ejemplos 4 - 5). Los resultados implican que la secuencia fimbrial tipo 1 de Salmonella, utilizada en el experimento como material de partida para la producción de péptidos sintéticos, se expresaría en unos niveles extremadamente elevados incluso con anterioridad a la fase de crecimiento logarítmico o en el momento en que ésta comienza.

Al analizar el crecimiento de los cultivos bacterianos en distintos medios y bajo distintas condiciones de crecimiento, se observó que, por ejemplo, el crecimiento de un cultivo de S. enteritidis en un medio selectivo (RVS) alcanza su punto álgido tras un periodo de entre 3 y 6 horas a +37ºC de temperatura, y que la masa del cultivo crece hasta alcanzar prácticamente su nivel máximo en un plazo de 8 horas (Ejemplo 4).

El fenómeno descrito anteriormente se basa en la teoría según la cual, al alcanzar las condiciones favorables del intestino humano o de un animal de sangre caliente, la bacteria Salmonella, relacionada con intoxicación alimentaria, u otras bacterias entéricas, producen, en un primer momento, fimbrias y otras estructuras moleculares necesarias para la adhesión para poder adaptarse a este entorno favorable en el que tienen acceso inmediato a los nutrientes. Igualmente, cabe la posibilidad de que, en las células en fase estacionaria, las proteínas de adhesión o sus precursoras estén preparadas, al menos parcialmente, en el citoplasma o en un sitio similar desde el cual, desde el punto de vista de la célula bacteriana, pueden moverse con mayor rapidez.

Ejemplo 1 Cultivo de Salmonella en un medio RVS

Se mantuvieron cepas de Salmonella enteriditis 9, 12:-g, m:-, fago tipo 4 (IHS 59813) y Salmonella tiphymurium 4,5,12: i:1,2, fago tipo 1 (IHS 59929) a 37ºC de temperatura en un medio THG (5% de triptona, 2,5% de extracto de levadura, 1% de glucosa) y se sembraron en intervalos de dos semanas durante el experimento. Las cepas de Salmonella se obtuvieron en el Instituto Nacional de Salud Pública (Helsinki, Finlandia). Los cultivos se iniciaron a partir de un cultivo de 3-4 días de edad mediante inoculando 5% del cultivo en un medio RVS nuevo selectivo para Salmonella (caldo Rappaport-vassiliadis de peptona de soja, Oxoid, Inglaterra). La suspensión RVS se cultivó en matraces Erlenmeyer con agitación (de 100 ml) a dos temperaturas distintas: +37ºC y +43ºC, y se tomaron muestras cada hora.

Ejemplo 2 Descripción del péptido

La secuencia en la síntesis del péptido fue trazada a partir de las fimbrias tipo 1 de Salmonella tipimurium. Se compararon ambas secuencias para seleccionar una secuencia específica distinta de las fimbrias tipo 1 de E.coli correspondientes. Se seleccionó la secuencia de 18 aminoácidos Ala Ser Phe Thr Ala Ile Gly Asp Thr Thr Ala Gln Val Pro Phe Ser Ile Val. El péptido se sintetizó en forma de moléculas y a uno de sus extremos se adhirieron 4 péptidos idénticos, formando una presentación antigénica multipeptídica (MAP). Para la síntesis de péptidos se utilizó el sintetizador de péptidos automático Millipore PerSeptive 9050 Plus y la estrategia de síntesis Fmoc. Se utilizó Fmoc-Lys(Fmoc)-OH a modo de esqueleto para la estructura en ramificada.

Ejemplo 3 Inmunizaciones

Para la inmunización se utilizaron péptidos sin ninguna conjugación con moléculas portadoras. Se inmunizaron conejos mediante inyección subcutánea de 500 \mug de péptido MAP. La solución de inmunización también contenía adyuvante completo de Freund. Se inyectaron potenciadores en intervalos de dos semanas. La solución también contenía adyuvante incompleto de Freund. Junto con la inmunización, se extrajo sangre de los conejos para tomar muestras de suero, las cuales se almacenaron en la cámara refrigeradora (-20ºC).

Ejemplo 4

Para el estudio de las reacciones del anticuerpo anti-péptido frente a cultivos de bacterias en distintas fases de crecimiento, se realizó una prueba ELISA para velocidad de crecimiento utilizando dos cultivos bacterianos con distintas densidad celular. En el experimento se utilizó la cepa Salmonella enteriditis IHS 59813, y el medio de crecimiento escogido fue un caldo RVS a +37ºC de temperatura. Se iniciaron las placas de cultivo de forma simultánea a las mediciones de la prueba ELISA. Al comienzo del experimento las densidades bacterianas eran de 1,3 E+6 y 1,0 E+4. Los resultados de la prueba ELISA y los recuentos de placas se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 1. La prueba ELISA para velocidad de crecimiento se realizó del modo siguiente:

1. Las placas de microtitulación se trataron con glutaraldehído:

a)

Se añadieron 150 \mug de glutaraldehído al 0,5% en los pocillos y

b)

se incubó la microplaca a temperatura ambiente con un agitador durante 15 minutos.

2. Lavado: Se vaciaron los pocillos de glutaraldehído y se lavaron dos veces con 200 \mul de solución de lavado 1 x ELISA de (5 mM de Tris + 0,15 M de NaCl + 0,05 de Tween20).

3. Se añadió el antígeno a los pocillos correspondientes en forma de disolución de tampón de ensayo (1:1) 50 \mul por pocillo (tampón de ensayo PBS + 1% de BSA + 0,05% de NaCL + 1 mM de EDTA).

No se añadió antígeno a los pocillos cero, se pipeteó una solución de lavado de 1 x 50 \mul por pocillo. Posteriormente, se envolvió la microplaca en un pliego y se dejó incubar durante la noche en una sala de frío.

4. Al día siguiente se vaciaron los pocillos y se lavaron tres veces utilizando el método descrito anteriormente.

5. Se añadió solución 1,5% de BSA/TBS a los pocillos (200 \mul/pocillo) para el bloqueo y se incubó la microplaca en un agitador durante una hora.

6. Se lavaron los pocillos según lo descrito en el punto 4.

7. Se añadieron anticuerpos primarios (suero péptido H463):

a)

Se pipeteó una disolución de suero (1:100) (50 \mul por pocillo).

b)

Se incubó la placa en un agitador durante 0,5 horas a temperatura ambiente.

8. Se lavaron los pocillos cuatro veces mediante el procedimiento descrito anteriormente.

9. Se añadieron los anticuerpos secundarios:

a)

Anticuerpo secundario (anti-conejo). Se pipeteó una dilución a 1:1000, 50 \mul por pocillo

b)

Se incubó la placa en un agitador durante 0,5 horas a temperatura ambiente.

10. Las placas se lavaron tres veces mediante el procedimiento descrito anteriormente y una vez con tampón Afos (200 \mul/pocillo).

11. Se pipeteó solución de color (pNPP) en la placa (50 \mul/pocillo).

12. Se midió la absorbancia con un lector ELISA (longitud de onda de 405 nm) a los 15 minutos, media hora, hora y media y tres horas posteriores a la adición del color.

TABLA 1 Cifras de absorbancia para el antígeno IHS 59813 (una hora después de la adición de color) y densidades bacterianas como función de tiempo

1

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Ejemplo 5

Para el estudio de las reacciones del anticuerpo anti-péptido frente a los cultivos bacterianos en distintas fases de crecimiento se realizó un experimento ELISA para velocidad de crecimiento mediante el uso de dos cepas de Salmonella distintas (IHS 59813 e IHS 59929).

El medio de crecimiento utilizado fue caldo RVS y la temperatura de cultivo 43ºC. Las placas comenzaron a cultivarse de forma simultánea al comienzo del experimento ELISA. El experimento ELISA se llevó a cabo tal y como describe el Ejemplo 4. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la Figura 2.

TABLA 2 Cifras de absorbancia para los antígenos IHS 59813 y IHS 59929 (tres horas tras la adición del color) y densidades bacterianas como función de tiempo

2

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Bibliografía

Hakalehto, E. Patente finlandesa n.º 93742, Menetelmä ja laite solujen osoittamiseksi, (A method and an apparatus for detecting cells), 1995.

Hakalehto, E. Patente de EE.UU. n.º 5.846.209, Syringe comprising an adhering substrate for microbes, 1998.

Claims (8)

1. Un método de determinación microbiológica, caracterizado por que las bacterias pertenecientes al género Salmonella se detectan con claridad en el medio de cultivo antes del pico de crecimiento poblacional mediante el uso de antígenos fimbriales proteínaceos cuyas células se expresan tras su inoculación en el medio y con anterioridad a la fase de crecimiento logarítmico o al comienzo de ésta.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que los antígenos microbianos se detectan inmunológicamente utilizando anticuerpos de forma directa después de que el crecimiento del cultivo por división celular haya comenzado.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado por que las bacterias detectadas son bacterias entéricas.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que los antígenos detectados son proteínas fimbriales tipo 1.

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que se detectan antígenos microbianos con anticuerpos producidos frente al péptido sintético Ala Ser Phe Thr Ala Ile Gly Asp Thr Thr Ala Gln Val Pro Phe Ser Ile Val o a un derivado del mismo.

6. Un método de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que las bacterias se cultivan en la fase de 3-10 horas previa a la detección.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado por que los microbios se incuban antes de la detección inmunológica en su temperatura de crecimiento óptima.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que los microbios se incuban con anterioridad a la detección a temperaturas próximas a los 37ºC.