MXPA00008977A - Metodo para detectar microbios a partir de un cultivo de enriquecimiento - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para la detección microbiana en una fase temprana del cultivo de crecimiento con la ayuda de la expresión extensiva de ciertos antígenos iniciados por los microbios ya antes de la fase logarítmica del crecimiento celular. El método se puede aplicar particularmente para la detección de la Salmonella y otras bacterias entéricas.

Description

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MÉTODO PARA DETECTAR MICROBIOS A PARTIR DE UN CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO INTRODUCCIÓN La Sa lmonel l a es hoy en día uno de los principales contaminantes bacterianos encontrados en los productos alimenticios. La rápida capacidad de adaptación, que es su característica típica, provoca dificultades en la detección de la bacteria. En la actualidad, existen más de 2000 cepas caracterizadas de Salmonel l a de las cuales cerca de 100 son clínicamente e higiénicamente importantes. La Salmonel l a es una causa común de enfermedades entéricas tanto para humanos como animales. El número de las cepas más importantes encontradas durante las epidemias es aproximadamente 10. La ocurrencia de Salmonel l a en el alimento frecuentemente provoca que grandes cantidades de gente se expongan a una infección. El hallazgo de la fuente original de contaminación es una tarea desafiante. El alimento o agua contaminada proporciona una vía típica para que se extienda la infección. La Sa lmonel l a corresponde a las llamadas bacterias entéricas. La mayoría de las cepas provocan gastroenteritis.

Normalmente, las Salmonel l a viven fuera del cuerpo de la gente o animales hospedadores en condiciones de crecimiento muy pobres. Tienen que sobrevivir y retener su capacidad, es decir en agua, donde usualmente varios microbios diferentes compiten con ellos por los nutrientes. Usualmente en estas circunstancias las células probablemente desarrollarán en alguna forma de células adormecidas. Una vez que alcanzan buenas condiciones de crecimiento, tienen que adaptarse rápidamente a las nuevas condiciones para poder ser capaces de economizar, por ejemplo, las células epiteliales de superficie del tracto gastrointestinal . Fuera del cuerpo, la Salmonel l a y otras bacterias entéricas están usualmente bajo una fuerte tensión ambiental. Cuando la Salmonel l a u otros microorganismos entran al cuerpo con el alimento, pronto entran al ambiente de pH bajo del estómago, que destruye una gran cantidad de células microbianas vivas. Por otra parte, un pH bajo también desasocia los apéndices en las superficies celulares, de los cuales especialmente las fimbrias o estructuras correspondientes se usan para unirse sobre el epitelio. Luego después de que entran al duodeno las Sa lmonel l a y otras especies entéricas patógenas a fin de invadir el cuerpo tienen que sintetizar rápidamente las partes de construcción de los diferentes filamentos de unión y de manera correspondiente construyen estos apéndices en las superficies celulares. Estos filamentos se pueden utilizar como la base de métodos inmunológicos para detectar microbios, debido a que normalmente son fuertemente inmunogénicos. También se puede disociar en moléculas individuales las cuales son sus partes constituyentes. De la misma manera, se puede hacer buen uso de la detección de las flagelias que muchas bacterias sintetizan para permitirles moverse y la proteína flagelina, las partes constituyentes del flagelo, en la detección inmunológica de microbios. Normalmente, antes de usar un método de detección inmunológico, el cultivo o muestra de Sa lmon el l a o el cultivo de bacterias entéricas, otras bacterias u otros microorganismos se deben cultivar selec ivamente y los microbios deseados se deben enriquecer. Normalmente en un cultivo de enriquecimiento, la muestra o cultivo se cultiva usualmente por un tiempo suficiente para que el número de células crezca de forma múltiple que la muestra original, usualmente durante al menos 12 horas. En general se supone que también la cantidad de antígenos se incrementa entre una relación aproximadamente directa a la cantidad de células o masa celular. Uno de los objetivos claves del alimento, agua y otra higiene ambiental es impedir que se extienda la bacteria Salmonel l a . Por esta razón, la detección de Salmonel l a y otros microbios similares es un campo importante de ampliación de investigación y actividad económica. El problema al usar los métodos tradicionales de cultivo bacteriano para el diagnóstico de las bacterias Sa lmon el l a y otros patógenos es el largo tiempo necesario para lograr los resultados. Esto provoca grandes gastos, por ejemplo, en la industria de los alimentos, en donde los productos frecuentemente necesitan ser almacenados en tanto que se está esperando los resultados del control de higiene o retirar del mercado o distribución, si los resultados muestran contaminación con Salmonel l a u otras bacterias. El trabajo de investigación y desarrollo dirigido a determinaciones microbianas se ha concentrado en encontrar métodos de detección más rápidos para microbios . Para el muestreo clínico en hospitales y para la correlación de higiene de las cepas microbianas resistentes a antibióticos, se requieren métodos más rápidos, más confiables y más efectivos. Estos métodos deben ser al mismo tiempo útiles también para detectar microbios en condiciones tan simples como sean posibles, aún fuera de los laboratorios. La industria de los alimentos también necesita nuevos métodos rápidos de detección y métodos más rápidos de enriquecimiento para mantener la seguridad del producto, acortar el tiempo de almacenamiento y controlar las materias primas. Igualmente diferentes análisis de agua y ambientales, el significado de lo cual ha crecido recientemente, necesitan estos métodos urgentemente .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Cuando se detectan microbios a partir de por ejemplo muestras clínicas, muestras de alimentos o muestras ambientales, las concentraciones microbianas en la muestra original usualmente son tan bajas que se necesitan los llamados métodos de enriquecimiento. Estos métodos incrementan la cantidad y concentración de los microbios detectados en la muestra. Se usan métodos de cultivo específico de microbios, que usualmente comprenden el uso de un factor selectivo para impedir la multiplicación de otros microbios. Este factor puede ser una sustancia química, un antibiótico o un equivalente o algún factor físico tal como la presión parcial de un gas. El pH también puede ser un factor selectivo. Frecuentemente la sinergia de los diferentes factores selectivos se puede usar en el cultivo de enriquecimiento del microbio deseado en una selección . La necesidad de hacer uso de métodos de enriquecimiento en la detección de microbios significa una pérdida de tiempo y por lo tanto es más deseable el acortamiento del tiempo usado para estos procedimientos. La identificación microbiana, específica frecuentemente usa anticuerpos que se producen en animales o cultivos celulares (métodos inmunológicos) . Frecuentemente se usan para detectar microbios a partir de cultivos de enriquecimiento, por ejemplo. En este caso, el problema puede ser que el usuario de la prueba no conoce con seguridad, si el cultivo de interés u otra muestra y las células en la misma tengan suficientes moléculas antigénicas para la detección. La invención se puede aplicar a gran escala para monitorear la Salmonel l a en los alimentos.

Por ejemplo en controles de higiene en la industria de la carne, la Salmonel l a frecuentemente existe en porcentajes bajos de modo que es imposible la detección directa usando el análisis inmunológico con los presentes métodos. En estos casos, se necesita frecuentemente un cultivo de enriquecimiento en el medio líquido durante al menos 24 horas. El proceso de enriquecimiento frecuentemente se divide en dos fases : la etapa de pre -enriquecimiento y la etapa actual de enriquecimiento. Al controlar las condiciones del pre - enriquecimiento , se puede acelerar el crecimiento de las posibles bacterias de Salmon el l a y la expresión de sus antígenos deseados en la muestra. El ajuste de las condiciones del cultivo también ayuda a excluir la posibilidad de reacción cruzada, que perturba las cepas. El cultivo de enriquecimiento se usa de la misma manera como un auxiliar para detectar e identificar muchas otras bacterias y también microorganismos. Debido a que la invención elabora el proceso para detectar la Salmonel l a y otros microbios de forma más rápida puede también servir por ejemplo para la industria de la carne y diagnóstico clínico, que están en necesidad de métodos rápidos. En la industria, la distribución de los productos frecuentemente se pone en práctica antes de que estén completos los resultados de monitoreo microbiológico . Esto puede conducir a mayores pérdidas si se presenta la contaminación. Los métodos rápidos harán posible remover los productos estropeados de una forma suficientemente temprana .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Cuando se cultivan especies de bacterias de género Sa lmonel l a y otras bacterias entéricas en medios nutrientes, selectivos se percibió que producen lotes de moléculas antigénicas específicas ya antes de que estuviera a su máximo el crecimiento de la población microbiana actual, basándose en el número de células. En realidad, la concentración del antígeno que puede detectar el anticuerpo específico en las superficies celulares ha disminuido substancialmente de sus cifras de registro como conforme el crecimiento celular en el cultivo de enriquecimiento está cerca de su máximo. Por esta razón, el uso de un método de detección inmunológico puede tomar lugar de manera temprana en los métodos actualmente conocidos, directamente después de la llamada fase estacionaria antes de que se haya incrementado notablemente el número de células, definido con por ejemplo los métodos de cálculo basados en la cuenta de colonias. Por ejemplo, la temperatura, la composición del medio nutriente, anticuerpos u otras moléculas selectivas y el control de presiones parciales de varios gases se puede usar como factores selectivos en el cultivo de enriquecimiento. De acuerdo con el método de esta invención, el proceso de identificación de microbios de varias muestras se puede hacer más rápido al hacer uso de los cambios en las expresiones de las diferentes estructuras superficiales de los microbios de acuerdo a los cambios de la fase de crecimiento y las condiciones de crecimiento. Al explotar el enriquecimiento "mejorado'' de los antígenos, se pudo observar por ejemplo las concentraciones incrementadas de los antígenos fimbriales tipo 1 en 3-10 horas desde el comienzo del cultivo (Ejemplos 4-5) . Estas fimbrias por sus partes constituyentes, que los microbios producen por ejemplo para permitirles unirse a las células epiteliales del tracto alimentario, se pueden usar en métodos para detectar microbios de forma más rápida que en los métodos de acuerdo con el presente conocimiento. En una posible forma de aplicación, después de un periodo adecuado de enriquecimiento es posible detectar los microbios al aprovechar la extracción con filtro (Patente Finlandesa No. 93742) . La detección inmunológica misma se puede llevar a cabo con una inmuno-tira, el método de ELISA, un método luminomét rico u otro aparato o método correspondiente que usa anticuerpos, que son específicamente adecuados para estructuras superficiales extraídas. Este procedimiento puede adicionar, en teoría, la sensibilidad de detección cuando la cantidad de células es aún relativamente pequeña . En teoría, las características de unión se pueden usar también en el revestimiento del émbolo de la jeringa de inyección usada al tomar la muestra (Patente de los Estados Unidos No. 5,846,209) . El émbolo usado al tomar la muestra luego se puede cambiar en un émbolo revestido con anticuerpos específicos contra las moléculas de unión o moléculas que imitan el objeto de las moléculas de unión de las bacterias buscadas. Cuando se manejan muestras fluidas, el émbolo no necesita ser cambiado. Una vez que los microbios se ponen en condiciones adecuadas de cultivo empiezan a expresar sus moléculas de unión y se unen con ellas a las moléculas en la superficie del émbolo. La unión se verifica con algún método adecuado (por ejemplo, de forma eléctrica u óptica ) . Los ejemplos 4 y 5 describen las reacciones de un anticuerpo peptídico, producido contra diferentes cepas de Salmonel l a , con cultivos bacterianos en diferentes fases de crecimiento. En base a los resultados de estos experimentos, se fue capaz de demostrar altos niveles de reacción inmunológica ya antes del comienzo de la fase de crecimiento logarítmica actual. Cuando se produce el anticuerpo a las proteínas fimbriales y a los péptidos derivados de las mismas, se percibieron fuertes reactividades inmunológicas ya a las 3-5 horas con anticuerpos producidos contra péptidos fimbriales (Ejemplos 4-5) . Los resultados implican que la secuencia fimbrial tipo 1 de Sa lmon el l a , usado en el experimento como material de fuente en la producción de péptidos sintéticos, se expresará de una manera fuertemente notable ya antes de la fase de crecimiento logarítmica actual o inmediatamente en su comienzo. Cuando se examina el crecimiento de cultivos baterianos en diferentes medios y en diferentes condiciones de crecimiento, se percibe que por ejemplo el crecimiento de un cultivo de S . en teri t i di s en un medio selectivo (RVS) estaba en su punto más fuerte después de 3-6 horas, la temperatura que es de +37°C y la masa del cultivo que creció hasta acercarse a su máximo en 8 horas (Ej emplo 4 ) . La base del fenómeno descrito anteriormente es la teoría que buscando condiciones favorables en los intestinos del hombre o en un animal de sangre caliente, la bacteria Sa lmonel l a que crece en el alimento u otra bacteria entérica produce primero fimbrias y otras estructuras moleculares requeridas para la unión, a fin de ser capaz de adherirse a este ambiente favorable, donde los nutrientes están fácilmente disponibles. También es posible que ya en la fase estacionaria, las células, las proteínas de unión o sus precursores estén preparados al menos parcialmente en el citoplasma o en un sitio correspondiente desde donde se puede movilizar de la manera más rápida desde el punto de vista de la célula bacteriana.

Eiemplo 1 Cultivo de Salmonel l a en medio RVS La cepa 9,12:g,m: de Salmonel l a en teri di i s , fago tipo 4 (IHS 59813) y la cepa 4,5,12:1:1,2 de Salmonel l a typhimuri um , fago tipo 1 (IHS 59929) se mantuvieron a 37°C en el medio THG (5 % de triptona, 2.5 % de extracto de levadura y 1 % de glucosa) y se sembraron en los intervalos de dos semanas durante el experimento. Las cepas de Salmonel l a se obtuvieron a partir del National Public Health Institute (Helsinki, Finlandia) . El cultivo se inició de 3-4 días de cultivo anterior al inocular 5 % de cultivo a un medio RVS fresco (caldo de peptona de soya de Rappaport -vassil iadi s , Oxoid, Inglaterra) , que es selectivo para Sa lmonel l a . La suspensión RVS se cultivó en matraces Erlenmeyer agitados (cada uno de 100 ml ) a dos diferentes temperaturas: +37°C y +43°C. Las muestras se tomaron cada hora.

Eiemplo 2 Descripción del péptido La presencia en la síntesis peptídica se trazó a partir de las fimbrias tipo 1 de Salmonel l a typhimuri um . A fin de seleccionar una secuencia específica que difiera de las fimbrias tipo I de E. coli correspondientes, se compararon las dos secuencias entre sí. La secuencia de 18 aminoácidos Ala Ser Phe Thr Ala lie Gly Asp Thr Thr Ala Gln Val Pro Phe Ser lie Val se seleccionó. El péptido se sintetizó como moléculas, en la cual se unieron cuatro péptidos idénticos de manera conjunta de un extremo que forma de este modo un péptido de múltiples antígenos (MAP) . Los péptidos se sintetizaron con el sintetizador de péptidos automatizados Millipore PerSeptive 9050 Plus y con la estrategia de síntesis Fmoc. Se usó Fmoc-Lys (Fmoc) -OH como el armazón para la estructura rami f icada .

Ejemplo 3 Inmuni zaciones Se usaron péptidos para la inmunización sin ninguna conjugación a moléculas portadoras. Se inmunizaron conejos con 500 µg de MAP-péptido inyectado subcutáneamente. La solución de inmunización contuvo también el adyuvante completo de Freund. Los refuerzos se inyectaron en intervalos de dos semanas. La solución contuvo también el adyuvante incompleto de Freund. Junto con las inmunizaciones, los conejos de sangraron a fin de tomar muestras séricas, que se almacenaron en el congelador (-20°C)-.

Eiemplo 4 Para estudiar las reacciones del anticuerpo anti-péptido contra cultivos bacterianos en diferentes fases de crecimiento, se llevó a cabo un experimento ""de velocidad de crecimiento - ELI SA ' ' usando dos cultivos bacterianos que difieren entre sí en la densidad celular. La cepa IHS 59813 de Salmonel la en ter i di ti s se usó en el experimento, el medio de cultivo fue caldo RVS y la temperatura +37°C. Los cultivos en placa se iniciaron simultáneamente con mediciones de ELISA. Las densidades bacterianas estaban en el comienzo del experimento en 1.3 E+6 y 1.0 E+4. Los resultados del experimento de ELISA y las cuentas de placas se presentan en la Tabla 1 y en la Figura 1. Se llevó a cabo el ""ELISA de velocidad de crecimiento ' ' como sigue : 1. Las placas de microtítulo se trataron con glutaraldehído: a) 150 µg de glutaraldehído al 0.5 % se adicionó a los pozos, y b) la microplaca se incubó a temperatura ambiente en un agitador durante 15 minutos. 2. lavados: el glutaraldehído se vertió de los pozos y los pozos se lavaron dos veces con 200 µl de 1 x solución de lavado de ELISA (Tris 5 mM + NaCl 0.15 M + Tween 20 0.05) . 3. El antígeno se adicionó a los pozos deseados como una dilución de amortiguador del ensayo (1:1) 50 µl por pozo (Amortiguador de ensayo PBS +6 1 % de BSA + NaCL al 0.05 % + EDTA 1 mM) . En los pozos cero, donde no se adicionó antígeno, se tomó con pipeta por pozo 5 µl 1 x solución de lavado. Posteriormente, la microplaca se envolvió en una hoja y se incubó durante la noche en un cuarto frío. 4. Al día siguiente, los pozos se vertieron vacíos y se lavaron tres veces como se describe con anterioridad. 5. Para el bloqueo se adicionó una solución de BSA al 1.5 %/TBS a los pozos (200 µl/pozo) y la microplaca se incubó en un agitador durante 1 hora. 6. Los pozos se lavaron como en el punto 4. 7. Los anticuerpos primarios adicionales (suero peptídico H463) : a) Se pipeteó la dilución sérica (1:100) (50 µl por pozo) b) La placa se incubó en un agitador durante 0.5 horas a temperatura ambiente . 8. Los pozos se lavaron cuatro veces como antes. 9. Los anticuerpos secundarios se adicionaron: a) Se pipeteraron 50 µl por pozo de la dilución de anticuerpo secundario ( ant i - conej o) 1 : 1000 b) La placa se incubó en un agitador durante 0.5 horas a temperatura ambiente. 10. Las placas se lavaron tres veces como antes y una vez con amortiguador Afos (200 µl/pozo) 11. Se pipeteó la solución de color (pNPP) (50 µl/pozo) a la placa. 12. Se midió la absorbancia con un lector de ELISA (longitud de onda 405 nm) después de 15 minutos, media hora, una y media horas y tres horas después de la adición del color.

Tabla 1 Las cifras de absorbancia para el antígeno IHS 59813 (una hora después de la adición de color) y densidades bacterianas como la función del tiempo Densidad bacteriana en el comienzo 1.3*10' Densidad bacteriana al comienzo 1.0* 10' Eiemplo 5 Para estudiar las reacciones del anticuerpo anti-péptido contra cultivos bacterianos en diferentes fases de crecimiento, se llevó a cabo un experimento de ""ELISA de velocidad de crecimiento'1 usando dos diferentes cepas de Salmon el l a (IHS 59813 y IHS 59929) . El medio de crecimiento caldo RVS de temperatura de cultivo 43°C. Los cultivos en placa se iniciaron simultáneamente con el experimento de ELISA. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se presentan en la Tabla 2 y Figura 2.

Tabla 2 Las cifras de absorbancia para el antígeno IHS 59813 y el antígeno IHS 59929 (tres horas después de la adición del color) y las densidades bacterianas como la función del tiempo Cepa IHS 59813 de Salmonel l a Cepa IHS 59929 de Sa lmonel l a Literatura Patente Finlandesa de Hakalehto, E. n:o 93742, Manetelmá ja laite solujen osoi t tamiseks i , (Un método y aparato para detectar células) , 1995.

Patente de los Estados Unidos No. 5,846,209 de Hakalehto, E, Jeringa que comprende un substrato adherente para microbios, 1998.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Método de determinación microbiológica, caracterizado en que las bacterias se detectan a partir de su medio de cultivo claramente antes del pico del crecimiento de población usando los antígenos que las células expresan tan pronto después de su inoculación al medio de enriquecimiento, antes de la fase de crecimiento actual o en el comienzo de ésta.
2. 2. Método según la reivindicación 1, caracterizado en que los antígenos microbianos se detectan inmunológicamente usando anticuerpos directamente después de la fase estacionaria.
3. 3. Método según la reivindicación 2, caracterizado en que los antígenos microbianos se detectan inmunológicamente en 3-4.5 horas después del comienzo del cultivo de enriquecimiento.
4. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, caracterizado en que los antígenos detectados son proteínas.
5. 5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado en que los antígenos detectados son proteínas fimbriales.
6. 6. Método según la reivindicación 5, caracterizado en que los antígenos detectados son proteínas fimbriales tipo I o comparables a las mismas .
7. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado en que los antígenos microbianos se detectan con anticuerpos, que se han producido contra el péptido sintético Ala Ser Phe Thr Ala lie Gly Asp Thr-Thr Ala Gln Val Pro Phe Ser lie Val o un derivado del mismo.
8. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado en que los microbios detectados son bacterias entéricas.
9. 9. Método según la reivindicación 8, caracterizado en que los microbios detectados son coliformes fecales.
10. 10. Método según la reivindicación 9, caracterizado en que los microbios detectados corresponden al género Sa lmonel l a .
11. 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado en que los microbios se incuban antes de la detección inmunológica en su temperatura óptima de crecimiento .
12. 12. Método según la reivindicación 11, caracterizado en que los microbios se incuban antes de la detección a temperaturas de aproximadamente 37°C.
13. 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado en que los microbios se incuban antes de la detección a temperaturas por arriba de 42°C.