ES2320084A1

ES2320084A1 - Mezclas no racmicas de (r)-n-piperidimil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1n-pirazol-3-carboxamida y (s)-n-piperidimil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5dihidro-1h-pirazol-3-carboxamida.

Info

Publication number: ES2320084A1
Application number: ES200800065A
Authority: ES
Inventors: Helmut H. Buschmann; Antonio Torrens Jover
Original assignee: Laboratorios del Dr Esteve SA
Current assignee: Esteve Pharmaceuticals SA
Priority date: 2007-01-15
Filing date: 2008-01-11
Publication date: 2009-05-18
Anticipated expiration: 2028-01-11
Also published as: ES2320084B1; EP1944295A1

Abstract

Mezclas no racémicas de (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida La presente invención se refiere a mezclas no racémicas de (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidrolH-pirazol-3-carboxamida, a procedimientos para su preparación, a medicamentos que comprenden las mezclas, así como a su uso para preparar un medicamento para el tratamiento de seres humanos y animales, y al uso de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en la profilaxis y/o tratamiento de la dislipidemia y otras alteraciones metabólicas que resultan del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos.

Description

Mezclas no racémicas de (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a mezclas no racémicas de (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, a procedimientos para su preparación, a medicamentos que comprenden las mezclas, así como al uso para preparar un medicamento para el tratamiento de seres humanos y animales, y al uso de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en la profilaxis y/o tratamiento de la dislipidemia y otras alteraciones metabólicas que resultan del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos.

Antecedentes de la invención

Los Cannabinoides son compuestos que derivan de la planta Cannabis sativa que se conoce normalmente como marihuana. El compuesto químico más activo de los cannabinoides naturales es el tetrahidrocannabinol (THC), en particular el \Delta^{9}-THC.

Estos cannabinoides naturales así como sus análogos sintéticos promueven sus efectos fisiológicos mediante la unión a receptores acoplados a proteínas G específicos, los llamados receptores de cannabinoides.

Hasta ahora se han identificado y clonado dos tipos distintos de receptores que unen los cannabinoides tanto sintéticos como naturales. Estos receptores, que se denominan CB_{1} y CB_{2} están implicados en una variedad de procesos fisiológicos o fisiopatológicos en seres humanos y animales, por ejemplo, procesos relacionados con el sistema nervioso central, sistema inmunitario, sistema cardiovascular, sistema endocrino, sistema respiratorio, el tracto gastrointestinal o la reproducción, como describen, por ejemplo, Hollister, Pharm. Rev. 38, 1986, 1-20; Reny and Singha, Prog. Drug. Res., 36, 71-114, 1991; Consroe and Sandyk, en Marijuana/Cannabinoids, Neurobiology and Neurophysiology, 459, Murphy L. and Barthe A. Eds., CRC Press, 1992.

Por lo tanto, los compuestos que tienen una alta afinidad de unión por estos receptores de cannabinoides y que son adecuados para modular estos receptores, son útiles en la prevención y/o tratamiento de trastornos relacionados con los receptores de cannabinoides.

En particular, el receptor CB_{1} está implicado en muchos trastornos diferentes relacionados con la ingestión de alimento, tales como la bulimia o la obesidad, incluida la obesidad asociada con la diabetes de tipo II (diabetes no dependiente de insulina), y por lo tanto los compuestos adecuados para regular este receptor se pueden usar en la profilaxis y/o tratamiento de estos trastornos.

Ahora está perfectamente claro que el abundante acceso a dietas occidentalizadas, baratas, de alta densidad energética y muy sabrosas está produciendo un aumento de la frecuencia de la dislipidemia, obesidad, en particular adiposidad central, resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada y/o diabetes de tipos 2 (Zephier y col., 1997; International Diabetes Federation, 2003; Grundy, 2004; Deedwania, 2004). Además, cuando estos riesgos cardiometabólicos se producen de forma combinada comprenden el síndrome metabólico como definen, por ejemplo, los organismos expertos, por ejemplo la Organización Mundial de la Salud (OMS, 1999), y el Programa Nacional de Educación sobre Colesterol - Tercer panel de tratamiento de adultos (NCEP ATP III por sus siglas en inglés, 2001)y la Federación internacional de diabetes (FID, 2005). Además, hay sujetos para los que la susceptibilidad a tener sobrepeso o ser obeso y a padecer trastornos metabólicos relacionados con la obesidad con los riesgos asociados de morbosidad y mortalidad prematuros, no está relacionada con el consumo excesivo de una dieta equilibrada, sino que viene dado por el consumo excesivo, y en algunos casos por los "atracones" de fuentes de macronutrientes específicas, por ejemplo "el ansia por hidratos de carbono" por dulces, chocolate, galletas y pasteles, o fuentes procesadas con alto contenido en grasa, incluidas las hamburguesas, patatas fritas y empanadas, o fuentes con alto contenido de proteínas, incluido en consumo excesivo de carne roja (White y col., 2002; Phelan & Whadden, 2002; Yanovski, 2003; White & Grilo, 2005).

Descripción de la invención

Un objetivo de la presente invención era proporcionar nuevas formas relacionadas con compuestos o mezclas de compuestos para usar como sustancias activas en medicamentos en la profilaxis y/o tratamiento de la obesidad, diabetes de tipo II, dislipidemia o síndrome metabólico. Se ha centrado mucho la atención en la profilaxis y/o tratamiento de la dislipidemia y otras alteraciones metabólicas que son resultado del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos.

Sin embargo, también hay que reconocer, que la población de pacientes que padece estos síntomas o el grupo de personas que tienen cuidado para prevenir la aparición de estos síntomas es o puede ser muy diversa, y algunos subgrupos son obesos o tienen sobrepeso, algunos grupos están en el límite de esto, y algunos grupos tienen peso normal. Por lo tanto, también era parte del objetivo de la presente invención proporcionar un enfoque más adecuado y más a la medida del tratamiento/profilaxis para adaptar más las necesidades específicas de estos grupos heterogéneos.

Dicho objetivo se logró proporcionando la mezcla no racémica de los compuestos de pipieridinil-pirazolina dados a continuación.

Así, en uno de sus aspectos la presente invención se refiere a la mezcla no racémica de (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, a sus las sales, polimorfos o solvatos, en especial hidratos.

Se ha encontrado que uno de los 2 compuestos de esta mezcla racémica de acuerdo con la invención, la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (en lo sucesivo denominado también compuesto A), tiene una afinidad alta por los receptores de cannabinoides, en particular por el receptor CB_{1}, y que actúa como modulador, por ejemplo antagonista, agonista inverso o agonista de estos receptores. Por lo tanto, la mezcla no racémica de acuerdo con la invención es adecuada para la profilaxis y/o tratamiento de diferentes trastornos relacionados con el sistema nervioso central, el sistema inmunitario, el sistema cardiovascular, el sistema endocrino, el sistema respiratorio, el tracto gastrointestinal o la reproducción en seres humanos y/o animales, preferiblemente seres humanos incluidos bebés, niños, y adultos.

Aunque la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (en lo sucesivo llamada también Compuesto B) carece de afinidad con importancia farmacológica por el receptor CB1 en ratas, se ha mostrado sorprendentemente que la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida reduce el ansia por el consumo excesivo de alimentos con macronutrientes con alta densidad energética y muy sabrosos, y también la dislipidemia y resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada resultantes de la obesidad y las alteraciones metabólicas. Como se muestra más adelante, los alimentos con alto contenido en grasa se han ilustrado con comida con alto contenido en grasa, los alimentos con hidratos de carbono se han ilustrado con chocolate con leche molido y los alimentos con alto contenido en proteínas salados se han ilustrado con cacahuetes salados tostados molidos; todos estaban totalmente disponibles para los animales como fuentes individuales de macronutrientes de tipo "cafetería". Las reducciones del consumo excesivo de los alimentos muy sabrosos provocadas por la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida producen los beneficios terapéuticos de disminución del peso corporal, menor adiposidad, menores concentraciones en el plasma de ácidos grasos no esterificados (AGNE, o ácidos grasos libres [AGL]), triglicéridos (triacilgliceroles y glicerol) e
insulina.

Estos descubrimientos son inesperados por 3 razones. Primero, como se describe en la bibliografía, los antagonistas o agonistas inversos de los receptores de cannabinoides CB1 y los respectivos fármacos producen sus efectos metabólicos beneficiosos a través de esta diana molecular; puesto que el Compuesto B carece de afinidad por este receptor con importancia farmacológica en el receptor CB1 de rata, en el que se han hecho los experimentos, sus efectos terapéuticos en el peso corporal, adiposidad y concentraciones en el plasma de AGNE, triglicéridos e insulina son por consiguiente independientes del bloqueo de los receptores CB1 centrales o periféricos. Segundo, las mejoras en los perfiles de lípidos en el plasma producidas por el tratamiento con el Compuesto B son mayores que las que se pueden explicar basándose en la reducción de peso, demostrando que el Compuesto B tiene beneficios independientes de la pérdida de peso, como compuesto para tratar la dislipidemia. Tercero, el Compuesto B también reduce de forma inesperada las concentraciones en el plasma de los AGNE, y puesto que son conductores clave del progreso de la resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada (prediabetes) a la diabetes de tipo II (Boden & Laakso, 2004; Bays y col., 2004; IDF, 2005), este descubrimiento inesperado demuestra que el Compuesto B también será beneficioso en la gestión de la prediabetes y diabetes de tipo 2. En conjunto, estos efectos beneficiosos sorprendentes del Compuesto B en las anomalías del peso corporal, adiposidad, y concentraciones en plasma de los AGNE, triglicéridos e insulina que resultan del consumo excesivo o de los atracones de alimentos con macronutrientes muy sabrosos, demuestra que este compuesto también será útil como medicamento para el tratamiento y/o profilaxis del síndrome metabólico. Puesto que la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Compuesto B) estaba demostrando sus efectos beneficiosos también en parte de forma independiente de la pérdida de peso mostrando una pérdida de peso corporal sólo un poco mayor que con la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Compuesto A; véase a continuación), se pueden diseñar mezclas no racémicas de Compuesto A y B para las necesidades de un individuo (por ejemplo, más Compuesto B en un individuo que no es obeso pero que tiene riesgo y que necesita prevención o tratamiento, o al contrario con una persona que tiene un ligero sobrepeso).

"No racémica" de acuerdo con la invención se define como que significa cualquier mezcla que no es exactamente 1:1.

Como realización preferida de la presente invención en la mezcla no racémica de acuerdo con la invención

la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en la mezcla en una cantidad X de 99 a 51 por ciento en peso, preferiblemente 95 a 55 por ciento en peso, más preferiblemente 90 a 60 por ciento en peso, de la forma más preferida 80 a 60 por ciento en peso, y

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la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en la mezcla en una cantidad Y de 1 a 49 por ciento en peso, preferiblemente 5 a 45 por ciento en peso, más preferiblemente 10 a 40 por ciento en peso, de la forma más preferida 20 a 40 por ciento en peso,

y X + Y es 100.

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Como otra realización preferida de la presente invención, en la mezcla no racémica de acuerdo con la invención

la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en la mezcla en una cantidad X de 99 a 51 por ciento en peso, preferiblemente 95 a 55 por ciento en peso, más preferiblemente 90 a 60 por ciento en peso, de la forma más preferida 80 a 60 por ciento en peso y

la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en la mezcla en una cantidad Y de 1 a 49 por ciento en peso, preferiblemente 5 a 45 por ciento en peso, más preferiblemente 10 a 40 por ciento en peso, de la forma más preferida 20 a 40 por ciento en peso,

y X + Y es 100.

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Como otra realización preferida de la presente invención, en la mezcla no racémica de acuerdo con la invención uno de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida o la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en forma de su base o clorhidrato, preferiblemente ambas están presentes en forma de sus respectivas bases o clorhidratos, de la forma más preferida ambas están en forma de sus respectivas bases.

La (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (fórmula Ia) se puede preparar con un compuesto de fórmula IIa

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que se transforma opcionalmente en atmósfera inerte en un compuesto de fórmula general (IIIa) por reacción con un agente de activación,

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en la que A representa un grupo saliente, preferiblemente un átomo de cloro, aislándose opcionalmente y/o purificándose opcionalmente dicho compuesto, y un compuesto de fórmula (IIa) o fórmula general (IIIa) se hace reaccionar con un compuesto de fórmula VIII,

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en atmósfera inerte para dar la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida de fórmula (Ia),

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que se aísla opcionalmente y/o se purifica opcionalmente.

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La (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida se puede preparar con un compuesto de fórmula IIb

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que se transforma opcionalmente en atmósfera inerte en un compuesto de fórmula general (IIIb) por reacción con un agente de activación,

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en la que A representa un grupo saliente, preferiblemente un átomo de cloro, aislándose opcionalmente y/o purificándose opcionalmente dicho compuesto, y un compuesto de fórmula (IIb) o fórmula general (IIIb) se hace reaccionar con un compuesto de fórmula VIII,

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en atmósfera inerte para dar la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida de fórmula (Ib),

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que se aísla opcionalmente y/o se purifica opcionalmente.

Preferiblemente los compuestos IIa o IIb se obtienen de una mezcla que comprende los enantiómeros

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Los compuestos (IIa) o (IIb) se pueden obtener a partir de la mezcla de enantiómeros por medios que conocen los expertos en la materia. Preferiblemente, los compuestos IIa o IIb se obtienen de la mezcla en forma de un compuesto de adición con una base quiral, preferiblemente (+)-cinchonina o R-(+)-1-feniletilamina, y preferiblemente se liberan del compuesto de adición.

Preferiblemente, la mezcla racémica de acuerdo con la fórmula II

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que comprende los enantiómeros IIa y IIb se puede obtener haciendo reaccionar un compuesto benzaldehído de fórmula general IV

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con un compuesto piruvato de fórmula (V)

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en la que G representa un grupo OR, siendo R un radical alquilo C_{1-6} ramificado o lineal, o G representa un grupo O^{-}K, siendo K un catión, para dar un compuesto de fórmula (VI)

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que se aísla opcionalmente y/o se purifica opcionalmente, y que se hace reaccionar con una fenil-hidrazina opcionalmente sustituida de fórmula (VII)

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o una sal correspondiente de la misma, en atmósfera inerte, para dar un compuesto de fórmula (II)

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que se aísla opcionalmente y/o se purifica opcionalmente.

La producción del compuesto de acuerdo con la fórmula II ya está descrita con detalle en las solicitudes de patente internacional WO 2005/077909 y WO 2005/077911. Las respectivas descripciones se incorporan en el presente documento por referencia y forman parte de la presente descripción.

Las reacciones de los compuestos de fórmula general (IIa) o (IIb) con un compuesto de fórmula VIII para dar los compuestos de fórmula general Ia o Ib, se llevan a cabo preferiblemente en presencia de una base tal como trietilamina en un medio de reacción tal como cloruro de metileno. La temperatura preferiblemente está en el intervalo de 0ºC al punto de ebullición del medio de reacción. El tiempo de reacción puede variar en un amplio intervalo, por ejemplo, de varias horas a varios días.

La reacción anteriormente mencionada que implica la síntesis del anillo de 4,5-dihidro-pirazol preferiblemente se lleva a cabo en atmósfera inerte, preferiblemente nitrógeno o argón, para evitar la oxidación del sistema anular.

Durante el procedimiento descrito antes, puede ser necesaria y/o conveniente la protección de grupos sensibles o de reactivos. La introducción de los grupos protectores convencionales, así como su eliminación, se pueden llevar a cabo por procedimientos que conocen bien los expertos en la materia.

La purificación y el aislamiento de la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida o la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida o cualquier producto intermedio del mismo, se puede llevar a cabo, si es necesario, por procedimientos convencionales que conocen los expertos en la materia, por ejemplo, procedimientos cromatográficos o recristalización.

La mezcla no racémica de acuerdo con la invención, es adecuado como sustancia farmacéutica activa para preparar medicamentos.

Se ha encontrado en particular que los componentes de la mezcla no racémica así como la propia mezcla no racémica no muestran o muestran poco desarrollo de tolerancia durante el tratamiento, en particular respecto a la ingestión de alimento, es decir, si se interrumpe el tratamiento durante un periodo de tiempo dado y después se continúa, el compuesto de la invención usado mostrará otra vez el efecto deseado. Tras terminar el tratamiento con el compuesto, se encuentra que la influencia positiva en el cuerpo continua durante al menos un determinado periodo de tiempo.

Además, los componentes de la mezcla no racémica así como la propia mezcla no racémica de acuerdo con la invención, están conectados con la afinidad relativamente baja del canal Herg, y así se espera un riesgo bajo de prolongación del intervalo QT para este compuesto.

En resumen, la mezcla no racémica de acuerdo con la invención usada en la invención se distingue por un amplio espectro de efectos beneficiosos, mientras que al mismo tiempo muestra relativamente pocos efectos indeseados, es decir, efectos que no contribuyen positivamente o incluso que interfieren con el bienestar del paciente.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un medicamento que comprende la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para modular los receptores de cannabinoides, preferiblemente los receptores de cannabinoides 1 (CB_{1}), para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, trastornos del sistema inmunitario, trastornos del sistema cardiovascular, trastornos del sistema endocrino, trastornos del sistema respiratorio, trastornos del tracto gastrointestinal o trastornos reproductivos.

También se prefiere el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para la profilaxis y/o tratamiento de la psicosis.

También se prefiere en particular el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de los trastornos de ingestión de alimento, preferiblemente bulimia, anorexia, caquexia, obesidad y/o diabetes mellitus de tipo II (diabetes mellitus no dependiente de insulina), más preferiblemente obesidad.

También es muy preferido el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de los trastornos de ingestión de alimento, preferiblemente bulimia, anorexia, caquexia, obesidad, diabetes mellitus de tipo II (diabetes mellitus no dependiente de insulina), más preferiblemente obesidad, diabetes de tipo II, síndrome metabólico y/o dislipidemia.

También se prefiere el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento del cáncer, preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de cáncer seleccionados del grupo constituido por cáncer cerebral, cáncer de hueso, cáncer de labio, cáncer de boca, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de piel, cáncer de colon, cáncer de intestino y cáncer de próstata, más preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de cáncer seleccionados del grupo constituido por cáncer de colon, cáncer de intestino y cáncer de próstata.

También se prefiere el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento del abuso de alcohol y/o adicción al alcohol, abuso de nicotina y/o adicción a la nicotina, abuso de drogas y/o adicción a drogas y/o abuso de medicamentos y/o adicción a medicamentos, preferiblemente abuso de drogas y/o adicción a drogas y/o abuso de nicotina y/o adicción a nicotina.

Los medicamentos/drogas que con frecuencia son objeto de abuso incluyen opiáceos, barbitúricos, cannabis, cocaína, anfetaminas, fenciclidina, alucinógenos y benzodiacepinas.

También se prefiere el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más trastornos seleccionados del grupo constituido por trastornos óseos, preferiblemente osteoporosis (por ejemplo osteoporosis asociada con una predisposición genética, deficiencia de hormonas sexuales, o envejecimiento), enfermedad ósea asociada con cáncer o enfermedad ósea de Paget; esquizofrenia, ansiedad, depresión, epilepsia, trastornos neurodegenerativos, trastornos cerebelosos, trastornos espinocerebelosos, trastornos cognitivos, traumatismo craneal, traumatismo cefálico, infarto cerebral, ataques de pánico, neuropatía periférica, inflamación, glaucoma, migraña, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Raynaud, trastornos de temblores, trastornos compulsivos, demencia senil, trastornos tímicos, discinesia tardía, trastornos bipolares, trastornos del movimiento inducidos por medicamentos, distonia, choque endotoxémico, choque hemorrágico, hipotensión, insomnio, trastornos inmunológicos, placas escleróticas, vómitos, diarrea, asma, trastornos de la memoria, pruritos, dolor, o para potenciar el efecto analgésico de analgésicos narcóticos o no narcóticos, o para influir en el tránsito intestinal.

También se prefiere en particular el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más trastornos seleccionados del grupo constituido por demencia y trastornos relacionados, preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de demencia seleccionados del grupo constituido por pérdida de memoria, demencia vascular, deterioro cognitivo leve, demencia frontotemporal y enfermedad de Pick; trastornos de alimentación excesiva; obesidad juvenil; obesidad inducida por fármacos; depresión atípica; adicciones conductuales; trastornos por déficit de atención; síndrome de Tourette; supresión de comportamientos relacionados con recompensa; por ejemplo evitación condicionada de lugares tales como la supresión de la preferencia condicionada de lugares inducida por la cocaína y la morfina; impulsividad; disfunción sexual; preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de disfunción sexual seleccionados del grupo constituido por dificultad eréctil y disfunción sexual femenina; trastornos de ataques; náuseas; emesis; enfermedad neuroinflamatoria, preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de enfermedades neuroinflamatorias seleccionadas del grupo constituido por esclerosis múltiple, trastornos relacionados con la desmielinización, síndrome de Guillan-Barré, encefalitis vírica y accidentes cerebrovasculares; trastornos neurológicos; espasticidad muscular; lesión cerebral traumática; lesión de la médula espinal; inflamación y trastornos inmunomoduladores, preferiblemente para el tratamiento y/o profilaxis de uno o más tipos de inflamación y trastornos inmunomoduladores seleccionados del grupo constituido por linfoma cutáneo de células T, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, sepsis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, displasia broncopulmonar, enfermedad retinal, escleroderma, isquemia renal, infarto de miocardio, isquemia cerebral, nefritis, hepatitis, glomerulonefritis, alveolitis fibrosante criptogénica, psoriasis, rechazo de transplante, dermatitis atópica, vasculitis, alergia, rinitis alérgica estacional, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino, obstrucción reversible de las vías aéreas, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y bronquitis; infarto cerebral; traumatismo craneoencefálico; trastornos de dolor neuropático; úlceras gástricas; arteriosclerosis y cirrosis hepática.

La demencia es una enfermedad que se caracteriza por el deterioro progresivo de las funciones cognitivas y de adaptación social que finalmente pueden interferir en la capacidad del paciente para vivir de forma independiente. La demencia también significa un deterioro de la memoria a corto y largo plazo más síntomas adicionales, tales como problemas con el pensamiento abstracto, criterio o personalidad. Se calcula que 18 millones de pacientes en el mundo padecen demencia. Las formas de demencia más comunes incluyen la enfermedad de Alzheimer y la demencia vascular. Otras formas son la demencia frontotemporal y la enfermedad de Pick.

La demencia también puede ser de origen vascular. La demencia vascular (enfermedad cerebrovascular aterosclerótica) se considera que es la segunda demencia más común en la vejez, que afecta a aproximadamente 10-15% de todos los casos. La enfermedad de Alzheimer (EA) y la demencia vascular pueden existir aislados o juntos (demencia mixta). En la demencia vascular, los cambios ateroscleróticos en los vasos cerebrales pueden conducir a un menor flujo sanguíneo que da como resultado múltiples pequeños infartos cerebrales (demencia multiinfarto). La demencia vascular se trata farmacológicamente con profilaxis de infarto cerebral y por tratamiento de déficit cognitivo.

La enfermedad de Alzheimer (EA), la forma de demencia más común e importante, es un trastorno neurodegenerativo que se caracteriza por el deterioro progresivo de las funciones cognitivas, tales como el razonamiento abstracto y la memoria. Actualmente, se calcula que 2 millones de personas en los Estados Unidos y 12 millones en el mundo están afectadas por esta enfermedad. Debido al aumento de la esperanza de vida, se predice que habrá alrededor de 100 millones de pacientes con EA en el mundo en el año 2050. La EA es una de las enfermedades más extendidas en las personas mayores. La mayoría de los pacientes con EA están en la edad de los sesenta o más. Más del 5% de todas las personas con alrededor de 70 años tienen pérdida de memoria significativa debido a la EA.

La EA se caracteriza principalmente por un desarrollo gradual de la falta de memoria. En las etapas más avanzadas de la enfermedad, se hacen cada vez más evidentes otros fallos de la función cerebral. Estos incluyen deterioro del habla, la escritura y habilidades aritméticas. La orientación espaciovisual, tal como aparcar el coche, vestirse de forma apropiada, y dar y entender direcciones de un sitio, se vuelven defectuosos o están perjudicados. En una etapa final de la enfermedad, los pacientes olvidan como se usan los objetos y herramientas comunes aunque mantienen la potencia motora y coordinación necesarias para estas actividades.

La esquizofrenia se caracteriza por la alteración profunda de la cognición y emoción, que afecta a las características humanas más fundamentales: lenguaje, pensamiento, percepción, afecto y la autoconcencia. Los síntomas positivos incluyen manifestaciones psicóticas, tales como oír voces interiores o experimentar otras sensaciones no conectadas con una fuente obvia (alucinaciones) y asignar una importancia o significado inusual a sucesos normales o mantener creencias personas falsas fijas (falsas ilusiones). Los síntomas negativos se caracterizan por aplanamiento afectivo y falta de iniciativa u objetivos (abolición), pérdida de intereses o placeres habituales (anhedonia), alteraciones del sueño y la alimentación, humor disfórico (deprimido, ansioso, irritable, o humor enfadado) y dificultad de concentración o de centrar la atención.

La depresión mayor es un trastorno multifacético que se caracteriza principalmente por humor disfórico y pérdida de interés o placer en actividades que antes fueron agradables. Otros síntomas físicos y psicológicos incluyen incapacidad para concentrarse, alteraciones motoras (retardo psicomotor o agitación), sentimientos de inutilidad, culpabilidad inadecuada, pensamientos de suicidio, y alteraciones en el apetito y el sueño.

Los trastornos de ansiedad son un grupo de síndromes que incluyen el trastorno de ansiedad generalizada, trastorno de pánico, fobias, trastorno obsesivo compulsivo, y trastorno de estrés postraumático. Aunque cada trastorno tiene sus propias características definidas, todos comparten síntomas comunes de preocupación excesiva, miedos intensos y terror, hipervigilancia y/o síntomas somáticos, en ausencia de una situación peligrosa.

La función sexual normal requiere, entre otras, la capacidad para lograr y mantener la erección del pene. Las estructuras anatómicas principales del pene que están implicadas en la función eréctil incluyen el cuerpo cavernoso, cuerpo espinoso, y la túnica albugínea (una cubierta de colágeno que rodea cada uno de los cuerpos). Los cuerpos están compuestos de una masa de músculo liso (trabécula) que contiene una red de vasos revestidos por endotelio (espacios lacunares). La tumescencia y erección del pene se producen por la relajación de las arterias y músculos lisos de los cuerpos, mientras que se cierran las venas emisarias, conduciendo a un aumento del flujo sanguíneo en la red lacunar. La inervación central y periférica contribuye a regular la respuesta eréctil.

La disfunción eréctil (DE) puede ser el resultado del fracaso para iniciar, llenar o almacenar el volumen de sangre adecuado en la red lacunar del pene. Dependiendo de la disfunción subyacente, la DE puede ser vasculogénica, neurogénica, endocrinológica, diabética, psicogénica o relacionada con la medicación.

La DE afecta al 10-25% de los hombres de mediana edad y hombres mayores, y tiene un gran impacto en el bienestar de los hombres afectados. Actualmente se trata usando inhibidores de la PDE5 tales como vardenafilo, tadalifilo y sildenafilo. Se puede usar alpostadilo intrauretral (prostaglandina EI) en pacientes en los que fracasan los agentes orales. Además, los dispositivos de estrangulamiento de vacío (VCD) son una terapia no invasiva bien establecida.

La disfunción sexual femenina (DSF) tiene una prevalencia alta, está relacionada con la edad, y es progresiva. Afecta de 30 a 50ó de las mujeres. La DSF indica una variedad de problemas médicos y se clasifica de acuerdo con trastornos en (1) el deseo, (2) excitación, (3) orgasmo y (4) dolor sexual, y los síntomas incluyen lubricación vaginal reducida, dolor e incomodidad en el coito, menor excitación, y dificultad para lograr el orgasmo. A un nivel molecular, se ha sugerido que el péptido intestinal vasoactivo (VIP), el óxido nítrico (NO) y las hormonas sexuales tales como los estrógenos y andrógenos son importantes en la función sexual femenina. Los procedimientos de tratamiento actuales incluyen terapia de sustitución con estrógenos, metil-testosterona, inhibidores de la PDE5 tales como sildenafilo, el donador de NO L-arginina, prostaglandina EI, fentolamina, y el agonista de dopamina apomorfina.

También se prefiere el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento del síndrome metabólico, en especial independiente del peso, enfermedades cardiovasculares, factores de riesgo cardiovascular, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina; para la profilaxis y/o tratamiento y/o influencia de la dislipidemia; para la profilaxis y/o tratamiento y/o influencia de los parámetros sanguíneos en especial los parámetros de lípidos, que parece que disminuyen los cuerpos de LDL mientras que aumentan los cuerpos de HDL, incluido también el tratamiento de trastornos de la alimentación (obesidad) en afecciones de diabetes desarrollada, en especial de Tipo II.

Describen con detalle el síndrome metabólico y las definiciones del mismo Eckel y col., The Lancet, Vol. 365 (2005), 1415-1428, incluido en el presente documento por referencia. Una de las respectivas definiciones fue establecida por la OMS en 1998 (como describen Alberti y col., Diabet. Med. 1998, 15, páginas 539-53, cuya descripción respectiva se incorpora en el presente documento por referencia y forma parte de la presente descripción). La otra definición, más ampliamente aceptada, del síndrome metabólico fue establecida por el Adult Treatment Panel (ATP III) del programa de educación de colesterol nacional de EE.UU. (NCEP) en 2001, como se describe en JAMA 2001; 285; 2486-97, cuyas respectivas descripciones se incorporan en el presente documento por referencia y forman parte de la presente descripción.

El síndrome metabólico se caracteriza por una interacción de varios parámetros fisiológicos tales como los triglicéridos, lípidos, presión sanguínea, niveles de glucosa y niveles de insulina. Aunque la obesidad puede jugar un papel crítico en el desarrollo del síndrome metabólico, muchos de sus aspectos son independientes del peso, en especial los parámetros de lípidos. En especial la influencia positiva en los aspectos independientes del peso del síndrome metabólico (véase, por ejemplo, Pagotto and Pasquali, The Lancet, Vol. 365 (2005), 1363, 1364, incluido en el presente documento por referencia) tal como algunos parámetros de la sangre, en especial los parámetros de lípidos, es una de las mayores ventajas y más sorprendentes de los compuestos de pirazolina sustituida usados de la invención.

Puesto que la mezcla no racémica de acuerdo con la invención también tiene un efecto beneficioso en la relación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a lipoproteínas de alta densidad (HDL), es decir, disminuye los niveles de LDL y/o eleva los niveles de HDL, también es útil como material de recubrimiento o material de co-recubrimiento en los stents con el fin de prevenir la reestenosis.

El término "tratamiento" como se usa en la presente solicitud abarca la prevención, mejora y/o recuperación completa de la enfermedad. Dicho término también incluye la prevención, mejora y/o recuperación completa de uno o más síntomas asociados con la enfermedad.

Además la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida de acuerdo con la invención está conectada con la afinidad relativamente baja del canal Herg, por lo que se puede esperar un riesgo bajo de prolongación del intervalo QT para el compuesto.

En resumen, la mezcla no racémica de acuerdo con la invención usada en la invención se distingue por un amplio espectro de efectos beneficiosos, mientras que al mismo tiempo muestra relativamente pocos efectos indeseados, es decir, efectos que no contribuyen de forma positiva o que incluso interfieren en el bienestar del paciente.

Otro aspecto de la invención es el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención para fabricar un medicamento para mejorar los factores de riesgo cardiovascular y/o metabólico, tales como uno o más de los siguientes factores:

- Triglicéridos elevados, por lo que se entiende que los niveles elevados de triglicéridos son preferiblemente > 150 mg/dl,

- Colesterol HDL bajo, por lo que se entiende que los niveles bajos de colesterol HDL son preferiblemente < 40 mg/dl en hombres y < 50 mg/dl en mujeres,

- Hipertensión, por lo que se entiende que la hipertensión preferiblemente es > 130/85 mm de Hg,

- Glucosa en ayunas alterada, por lo que se entiende que los niveles de glucosa en ayunas alterados son preferiblemente > 110 mg/dl.

- Resistencia a la insulina

- Dislipidemia.

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Otro aspecto de la invención es el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, para fabricar un medicamento para tratar los aspectos del síndrome metabólico independientes del peso.

Otro aspecto de la invención es el uso de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, para fabricar un medicamento para tratar la dislipidemia.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para mejorar los factores de riesgo cardiovascular y/o metabólico, tales como uno o más de los siguientes factores:

- Resistencia a la insulina

- Dislipidemia,

en un sujeto, preferiblemente un ser humano.

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Otro aspecto preferido de la invención también es un procedimiento de tratamiento que abarca todos los usos mencionados, en los que la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, se aplica a una persona que lo necesite, para tratar el síndrome metabólico, en especial el independiente del peso, enfermedades cardiovasculares en especial los factores de riesgo cardiovascular, para influir en los parámetros sanguíneos, en especial los parámetros de lípidos, diabetes, en especial de tipo II, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina, trastornos óseos, preferiblemente osteoporosis (por ejemplo, osteoporosis asociada con una predisposición genética, deficiencia de hormonas sexuales o envejecimiento), enfermedad ósea asociada con el cáncer o enfermedad ósea de Paget; esquizofrenia, ansiedad, depresión, epilepsia, trastornos neurodegenerativos, trastornos cerebelosos, trastornos espinocerebelosos, trastornos cognitivos, traumatismo craneal, traumatismo en la cabeza, infarto cerebral, ataques de pánico, neuropatía periférica, inflamación, glaucoma, migraña, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Raynaud, trastornos de temblores, trastornos compulsivos, demencia senil, trastornos tímicos, discinesia tardía, trastornos bipolares, trastornos del movimiento inducido por medicamentos, distonia, choque endotoxémico, choque hemorrágico, hipotensión, insomnio, trastornos inmunológicos, placas escleróticas, vómitos, diarrea, asma, trastornos de la memoria, pruritos, dolor, o para potenciar el efecto analgésico de analgésicos narcóticos o no narcóticos, o para influir en el tránsito intestinal; abuso de alcohol y/o adicción al alcohol, abuso de nicotina y/o adicción a la nicotina, abuso de drogas y/o adicción a drogas y/o abuso de medicamentos y/o adicción a medicamentos, preferiblemente abuso de drogas y/o adicción a drogas y/o abuso de nicotina y/o adicción a nicotina; cáncer, preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de cáncer seleccionados del grupo constituido por cáncer cerebral, cáncer de hueso, cáncer de labio, cáncer de boca, cáncer esofágico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de cuello de útero, cáncer de pulmón, cáncer de pecho, cáncer de piel, cáncer de colon, cáncer de intestino y cáncer de próstata, más preferiblemente para la profilaxis y/o tratamiento de uno o más tipos de cáncer seleccionados del grupo constituido por cáncer de colon, cáncer de intestino y cáncer de próstata; trastornos de ingestión de alimento, preferiblemente bulimia, anorexia, caquexia, obesidad y/o diabetes mellitus de tipo II (diabetes mellitus no dependiente de insulina), más preferiblemente obesidad; psicosis; trastornos del sistema nervioso central, trastornos del sistema inmunitario, trastornos del sistema cardiovascular, trastornos del sistema endocrino, trastornos del sistema respiratorio, trastornos del tracto gastrointestinal o trastornos reproductivos.

El medicamento de acuerdo con la presente invención puede estar en cualquier forma adecuada para aplicar a seres humanos y/o animales, preferiblemente seres humanos incluidos bebés, niños y adultos, y se pueden producir por procedimientos convencionales que conocen los expertos en la materia. La composición del medicamento puede variar dependiendo de la vía de administración.

El medicamento de la presente invención se puede administrar por ejemplo, por vía parenteral combinado con vehículos líquidos inyectables convencionales, tales como agua o alcoholes adecuados. Se pueden incluir excipientes farmacéuticos convencionales para inyección, tales como agentes estabilizantes, agentes solubilizantes y tampones, en dichas composiciones inyectables. Estos medicamentos se pueden inyectar, por ejemplo, por vía intramuscular, intraperitoneal o intravenosa.

Los medicamentos de acuerdo con la invención también se pueden formular en composiciones para administrar por vía oral que contienen uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente compatibles en forma sólida o líquida. Estas composiciones pueden contener ingredientes convencionales tales como agentes aglutinantes, cargas, lubricantes y agentes humectantes adecuados. Las composiciones pueden tener cualquier forma conveniente tal como comprimidos, pellas, cápsulas, pastillas, soluciones, suspensiones, emulsiones acuosas o aceitosas, o formas en polvo secas adecuadas para reconstituir con agua u otro líquido adecuado antes de usar, para la liberación inmediata o retardada.

Las formas orales líquidas también pueden contener determinados aditivos tales como edulcorantes, agentes de sabor, conservantes y agentes emulsionantes. También se pueden formular composiciones líquidas no acuosas para administración oral que contienen aceites comestibles. Dichas composiciones líquidas se pueden encapsular de forma conveniente, por ejemplo en cápsulas de gelatina en una cantidad de dosificación unitaria.

Las composiciones de la presente invención también se pueden administrar por vía tópica o por vía de supositorio.

La dosificación diaria para seres humanos y animales puede variar dependiendo de factores que se basan en las respectivas especies y otros factores, tales como la edad, sexo, peso o grado de la enfermedad etc. La dosificación diaria para seres humanos puede estar preferiblemente en el intervalo de 1 a 2000, preferiblemente de 1 a 1500, más preferiblemente de 1 a 1000 miligramos o también de 20 a 200 mg de sustancia activa para administrar durante una o varias ingestiones al día.

En otro aspecto la presente invención también proporciona una formulación farmacéutica que comprende

- la mezcla de acuerdo con la invención y (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida; o

- la mezcla de acuerdo con la invención y (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida; o

- la mezcla de acuerdo con la invención y (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida; o

- la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida;

en compartimentos separados de la formulación farmacéutica.

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Este aspecto de la invención se basa en los descubrimientos y beneficios sorprendentes de la mezcla no racémica de acuerdo con la invención, y se aborda de una forma muy similar el objetivo ya descrito antes de proporcionar una solución a medida de las necesidades de un individuo. Las posibles formas, dosificaciones, excipientes, etc. de la formulación farmacéutica ya se han explicado antes, por ejemplo para los medicamentos.

Los "compartimentos", en especial los "compartimentos separados" de acuerdo con la invención se definen como partes de una formulación farmacéutica que por su composición o por su posición en la formulación se pueden identificar como entidades separadas, los ejemplos incluyen capas sobre o en una pella, capas sobre o en un comprimido, diferentes pellas por ejemplo, comprimidos en un comprimido o cargados en una cápsula, etc.

En una realización preferida de la formulación farmacéutica de acuerdo con la invención, los compartimentos separados son capas o pellas.

En otro aspecto de la presente invención también se proporciona el uso de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, sus respectivas sales, polimorfos o solvatos, en especial hidratos, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de la dislipidemia y otras alteraciones metabólicas que resultan del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos.

Este aspecto es un aspecto principal de la actual invención, y se basa en los descubrimientos y beneficios sorprendentes de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida que forma parte de la mezcla no racémica de la invención, y aparte de la discusión/explicaciones dadas antes, se discute y explica con más detalle en la siguiente parte experimental basada en los resultados experimentales directos.

Una realización preferida, es el uso de acuerdo con la invención, en la que las otras alteraciones metabólicas que resultan del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos se seleccionan de obesidad, adiposidad central, resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada (prediabetes), diabetes de tipo 2 y síndrome metabólico; en especial síndrome metabólico o diabetes de tipo II.

La presente invención se ilustra a continuación con ayuda de ejemplos. Estas ilustraciones se dan sólo a modo de ejemplo y no limitan el espíritu general de la presente invención.

Ejemplos Parte química Abreviaturas

Eq.: Equivalente

Proc.: Procedimiento

Disol. Crist.: Disolvente usado en el experimento de cristalización

T Crist.: Temperatura a la que se lleva a cabo el experimento de cristalización

1ª Crist.: primera cristalización

2ª Cris.: segunda cristalización

t.a.: temperatura ambiente (\approx 20-25ºC)

Descripción general

El ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico racémico se obtiene como se describe en las solicitudes de patente internacional WO 2005/077909 (ilustrado en el ejemplo 0) y WO 2005/077911. Las respectivas descripciones se incorporan en el presente documento por referencia y forman parte de la presente descripción.

La resolución del racemato de la N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida se puede llevar a cabo por procedimientos que conocen los expertos en la materia, por ejemplo, cromatografía en columna que conduce al Compuesto A o Compuesto B como se describe a continuación. El racemato de la N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida se obtiene como se describe en la solicitud de patente internacional WO 2005/077911. La respectiva descripción se incorpora en el presente documento por referencia y forma parte de la presente descripción.

Sin embargo, su producto intermedio el ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico racémico se puede separar fácilmente en los respectivos enantiómeros por reacción con una base quiral. El procedimiento para esta resolución se describe a continuación.

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Resolución de los enantiómeros del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico

La resolución de los enantiómeros del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico se llevó a cabo por reacción con las siguientes bases quirales:

\bullet: \vtcortauna Brucina

\bullet: \vtcortauna Quinina

\bullet: \vtcortauna (-)-Cinchonidina

\bullet: \vtcortauna (+)-Cinchonina

\bullet: \vtcortauna R-(+)-1-Feniletilamina

\bullet: \vtcortauna Clorhidrato de (1R,2S)-(-)-Efedrina

\bullet: \vtcortauna Clorhidrato de (1S,2R)-(+)-Efedrina

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En cada caso las reacciones se llevaron a cabo con 0,5 y 1 equivalentes de base con respecto a 1 equivalente de compuesto ácido y usando los siguientes disolventes

\bullet: \vtcortauna Etanol

\bullet: \vtcortauna Acetona

\bullet: \vtcortauna Acetonitrilo

\bullet: \vtcortauna Dioxano

\bullet: \vtcortauna Acetato de etilo

\bullet: \vtcortauna Cloroformo

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Los resultados se resumen en las siguientes tablas. Hay que entender que los experimentos de cristalización mencionados antes que no se reflejan en las siguientes tablas no dieron los cristales de las respectivas sales en las condiciones dadas.

Sin embargo, las condiciones adecuadas para la cristalización de estas sales las pueden determinan los expertos en la materia mediante experimentos rutinarios.

En las siguientes tablas

Ácido representa el ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico racémico

R-ácido representa el respectivo derivado del ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico

S-ácido representa el respectivo derivado del ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico

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Procedimientos de cristalización

Procedimiento A: Se añadió una solución de la base quiral en la parte superior de una solución del ácido racémico a temperatura ambiente.

Procedimiento C: Se añadió una solución del ácido racémico en la parte superior de una solución de la base quiral. La mezcla se calentó a reflujo y se añadió disolvente hasta que se completó la disolución. La solución se dejó cristalizar a t.a.

Procedimiento D: La base quiral se añadió directamente en la parte superior de una solución del ácido racémico a temperatura ambiente.

Procedimiento E: La base quiral se añadió directamente a la parte superior de una solución del ácido racémico a temperatura de reflujo.

Procedimiento F: La solución de la sal se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en una cantidad mínima del disolvente calentando a temperatura de reflujo. La solución se dejó cristalizar a t.a.

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Resolución con Brucina

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Resolución con quinina

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Resolución con (-)-Cinchonidina

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Resolución con (+)-Cinchonina

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Resolución con R-(+)-1-Feniletilamina

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Descripción detallada

Ejemplo químico 1

(R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Compuesto A) Resolución del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico con (+)-Cinchonina

Se añadieron 35 g (294,68 mmol) del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico racémico en 630 ml de acetonitrilo a una suspensión de 16,39 g (47,34 mmol) de (+)-Cinchonina en 920 ml de acetonitrilo con agitación vigorosa. La suspensión resultante se calentó a reflujo y se añadió acetonitrilo (1300 ml) hasta que la disolución fue completa. La solución resultante se dejó cristalizar a temperatura ambiente durante el fin de semana, después de lo cual se obtuvo un sólido cristalino. El sólido cristalino se filtró, se lavó con 50 ml de acetonitrilo frío y se secó para dar 25,26 g de un sólido blanco (\approx 91-92%). No se pudo obtener una segunda fracción de cristales de los líquidos madre, ni tras enfriar en el frigorífico ni tras concentración. Por lo tanto, la recristalización de la sal diastereoisómera se llevó a cabo en disolventes diferentes con el fin de mejorar el exceso
enantiomérico:

25

Por consiguiente, el producto se recristalizó en acetonitrilo para dar 22,6 g de cristales (rendimiento de 72% en moles respecto a la base quiral). La relación de enantiómeros determinada por electroforesis capilar fue:

99,7% de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-(+)-Cinchonina

0,3% de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-(+)-Cinchonina ee =
99,4%.

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Preparación del ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico a partir del compuesto de adición ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-(+)-Cinchonina

Se suspendieron 22,59 g (34 mmol) de la sal diastereoisómera, que se recristalizó en acetonitrilo, en 200 ml de HCl 6 N y se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después, se añadieron 200 ml de tolueno hasta que la disolución fue completa. La mezcla se agitó durante 30 minutos y se separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con tolueno, las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad, después de lo cual se obtuvieron 11,9 g (95%) de un sólido blanco microcristalino (punto de fusión 129-133).

Exceso enantiomérico determinado por electroforesis capilar: ee = 99,2%

Pureza química determinada por HPLC: 99,3%

[\alpha]_{D} (c=1,23ºC, MeOH) = -429.

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Aislamiento del enantiómero ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2, 4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico a partir de los líquidos madre obtenidas de la cristalización del enantiómero ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico con Brucina

El residuo obtenido en la evaporación de los líquidos madre obtenidas de la cristalización del ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico con Brucina (véase a continuación) se trató con HCl 6 N como se ha descrito antes para obtener el ácido libre. Después de evaporar la fase orgánica se añadieron 21,86 g de una mezcla con una composición teórica de 20 mmoles de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico y 39,9 mmoles de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico. Se añadió una suspensión de 13,82 g (39,9 mmoles) de (+)-cinchonina en 1000 ml de acetonitrilo y la mezcla se calentó a reflujo. Se añadió más acetonitrilo hasta que la disolución fue completa (volumen total de acetonitrilo 4000 ml). Después la mezcla se dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente para obtener cristales. Después de unas horas se obtuvo un sólido blanco, que se filtró y se secó para dar 22,42 (rendimiento 84,5% respecto a la sal del ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico).

El exceso enantiomérico determinado por electroforesis capilar era ee = 92%.

La pureza de la sal aislada era comparable a la de la sal obtenida directamente de la resolución del racemato. Por consiguiente, se podía aplicar el mismo procedimiento de purificación descrito antes.

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Resolución del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico racémico con Brucina Preparación de la sal diastereoisómera con Brucina

A temperatura ambiente se disolvieron 15,74 g (39,9 mmol) de Brucina en 475 ml de acetona con agitación vigorosa. Se añadió una solución de 29,5 g (79,8 mmol) del ácido 5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico racémico en 85 ml de acetona. La mezcla resultante se dejó cristalizar durante un par de días, después de lo cual se obtuvo un sólido cristalino. El sólido cristalino se filtró, se lavó con acetona fría y se secó para dar 13,66 g (45% en moles respecto a la base) de un sólido de color beige.

La relación de enantiómeros determinada por electroforesis capilar era:

99% de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-Brucina

1% de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-Brucina

Exceso enantiomérico ee = 98%

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Los líquidos madre filtradas se dejaron en el frigorífico y dieron una segunda fracción de cristales, que se filtraron y secaron para dar otros 1,56 g (5,1% en moles respecto a la base).

El análisis de la 2ª fracción por electroforesis capilar dio

99,3% de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-Brucina

0,7% de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-Brucina

Exceso enantiomérico ee = 98,6%

Rendimiento total:

15,22 g (50,1% en moles respecto a la base) de la sal con ee = 98%.

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Determinación de la quiralidad de la sal de Brucina por cristalografía de rayos X

La quiralidad del enantiómero que cristalizó con Brucina (ee 98%) se determinó por cristalografía de rayos X y corresponde al enantiómero S. Por consiguiente, el otro enantiómero que cristalizó con la (+)-cinchonina es el correspondiente enantiómero R.

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Preparación del ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico a partir del compuesto de adición del ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico con brucina

Se suspendieron 15,17 g (19,85 mmol) de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico-Brucina en 150 ml de HCl 6 N y la suspensión se agitó durante 10 minutos, seguido de la adición de 150 ml de tolueno, tras lo cual se observó la disolución completa. La mezcla resultante se agitó durante 30 minutos adicionales controlando por cromatografía en columna (gel de sílice, Cl_{2}CH_{2}:MeOH 95:5). Después se separaron las fases, la fase acuosa se extrajo con tolueno y las fases de tolueno combinadas se lavaron con agua tres veces, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se evaporaron hasta sequedad. Se obtuvieron 7 g (95,5%) de un aceite, que solidificó tras la adición de una pequeña cantidad de éter dietílico para dar un sólido blanco amorfo que mostró una transformación cristalina al fundir a 130-133ºC.

CCF (Cl_{2}CH_{2}:MeOH 95:5): R_{f} = 0,3

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El análisis de los enantiómeros por electroforesis capilar dio

99,1% de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico

0,9% de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico

Exceso enantiomérico ee = 98,2%

[\alpha]_{D} (c=1,23ºC, MeOH) = -480,5.

Pureza química determinada por HPLC: 99,1%

RMN ^{1}H (CDCl_{3}) \delta ppm: 3,2 (dd, J = 6,4 y 18,2 Hz, 1H), 3,7 (dd, J = 12,7 y 18,2 Hz, 1H), 5,85 (dd, J = 6,4 y 12,6 Hz, 1H), 7,0-7,2 (m, 7H).

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Aislamiento del enantiómero ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico a partir de los líquidos madre obtenidas de la cristalización del enantiómero ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico con (+)-cinchonina

El residuo obtenido en la evaporación de los líquidos madre obtenidas de la cristalización del ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico con (+)-cinchonina se trató con HCl 6 N como se ha descrito antes para obtener el ácido libre. Después de evaporar la fase orgánica se añadieron 23,63 g de una mezcla con una composición teórica de 13,34 mmoles de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico y 47,34 mmoles de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico. Se añadió dicha mezcla disuelta en 118 ml de acetona en la parte superior de una solución de 18,7 g (47,4 mmoles) de brucina en 650 ml de acetona, se agitó durante un par de minutos y se dejó cristalizar a temperatura ambiente durante toda la noche. Se obtuvo un sólido de color crema que se filtró y se secó para dar 28 (rendimiento 77,5% respecto a la sal (S)).

El exceso enantiomérico determinado por electroforesis capilar era ee = 98,2%.

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Preparación de la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Compuesto A)

Se disolvieron 9,94 g (26,89 mmol) de ácido (R)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico en 95 ml de tolueno, seguido de la adición de 2,35 ml (32,3 mmoles) de cloruro de tionilo y 4 gotas de DMF. La mezcla se calentó en atmósfera de nitrógeno anhidra a una temperatura de 75-80ºC con agitación vigorosa durante 2 horas y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Dicha solución de cloruro de ácido después se añadió gota a gota a una solución de 3,47 ml (31,2 mmol) de N-aminopiperidina, 15 ml (107,6 mmol) de trietilamina y 38 ml de tolueno anhidro, que se enfrió a 0-5ºC, manteniendo así la temperatura por debajo de 10ºC durante la adición. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche, después de lo cual se obtuvo una suspensión. Se añadieron agua y tolueno a dicha suspensión hasta que la disolución fue completa y se separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con tolueno, las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución de NaOH (al 10%) y agua, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y evaporaron hasta sequedad para dar 13,41 g de aceite amarillo claro, que no cristalizó. El aceite se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (eluyente: éter de petróleo:acetato de etilo 90:10 a 60:40) para dar 10,5 g (83,5%) de (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en forma de un sólido amorfo de color amarillo claro (punto de fusión
75-78ºC).

RMN ^{1}H(DMSO-d_{6}) \delta ppm: 9,25 (s, 1H), 7,5 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,4 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,3-7,25 (2d, J = 8,8 y 8,5 Hz, 3H), 7,1 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,8 (dd, J = 5,7 y 11,8 Hz, 1H), 3,65 (dd, J = 11,8 y 18,1 Hz, 1H), 3,0 (dd, J = 5,7 y 18,1 Hz, 1H), 2,75 (m, 4H), 1,5 (m, 4H), 1,2 (m, 2H).

Análisis del enantiómero por HPLC quiral: ee = 100%

Pureza química determinada por HPLC: 98,5%

[\alpha]_{D} (c=1, 23ºC, MeOH) = - 293,5

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Preparación de la sal de clorhidrato de la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Clorhidrato del compuesto A)

Se disolvieron 0,5 g (1,1 mmol) de la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5- dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en 10 ml de isopropanol, se enfrió con hielo y se añadió solución de etanol saturada con HCl. La solución cambió de color y se formó un sólido blanco, que se filtró, se lavó con isopropanol:éter dietílico (1:1) y se secó para dar 0,38 g (71%) de un sólido blanco con un punto de fusión de 160-165ºC. La pureza determinada por HPLC era 99,3%. Determinación de cloro: 7,15% (98,5% del valor teórico).

RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta ppm: 10,3 (s ancho, 1H), 7,5 (m, 2H), 7,3 (2d, J = 2,5 y 8,5 Hz, 3H), 7,15 (d, J = 8, 5 Hz, 2H), 5,8 (dd, J = 6,3 y 12,0 Hz, 1H), 3,7 (dd+H_{2}O), 3,05 (m, 5H), 1,7 (m, 4H), 1,4 (m, 2H).

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Ejemplo químico 2

Preparación de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Compuesto B)

Se disolvieron 5,27 g (14,26 mmol) de ácido (S)-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-pirazol-3-carboxílico en 30 ml de tolueno, seguido de la adición rápida gota a gota de 1,25 ml (17,11 mmoles) de cloruro de tionilo y 7 gotas de DMF. La mezcla se calentó en atmósfera de nitrógeno anhidra a una temperatura de 75-80ºC con agitación vigorosa durante 2 horas y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Dicha solución de cloruro de ácido después se añadió gota a gota a una solución de 1,84 ml (16,54 mmol) de N-aminopiperidina, 8 ml (57 mmol) de trietilamina y 25 ml de tolueno anhidro, que se enfrió a 0-5ºC, manteniendo así la temperatura por debajo de 10ºC durante la adición. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche, después de lo cual se obtuvo una suspensión. Se añadieron agua y tolueno a dicha suspensión hasta que la disolución fue completa y se separaron las fases. La fase acuosa se extrajo con tolueno, las fases orgánicas combinadas se lavaron con solución de NaOH (al 10%) y agua, se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y evaporaron hasta sequedad para dar 6,85 g de un aceite, que no cristalizó usando los disolventes etanol, acetato de etilo y acetona. El aceite se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (eluyente: éter de petróleo:acetato de etilo 90:10 a 50:50) para dar 4,7 g (73%) de (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en forma de un sólido amorfo de color amarillo claro (punto de fusión 73-76ºC).

Análisis del enantiómero por HPLC quiral: ee = 98%

Pureza química determinada por HPLC: 98,7%

Preparación de la sal de clorhidrato de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Clorhidrato del compuesto B)

Se disolvieron 0,2 g (0,4 mmol) de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida en 3 ml de isopropanol, se enfrió con hielo y se añadió solución de etanol saturada con HCl. La solución cambió de color y se formó un sólido blanco, que se filtró, se lavó con isopropanol:éter dietílico (1:1) y se secó para dar 0,14 g (72%) de un sólido blanco con un punto de fusión de 165-175ºC. La pureza determinada por HPLC era 99,3%. Determinación de cloro: 7,15% (98,5% del valor teórico).

RMN ^{1}H (DMSO-d_{6}) \delta ppm: 10,4 (s ancho, 1H), 7,45 (m, 2H), 7,3 (2d, J = 2,5 y 8,5 Hz, 3H), 7,15 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,8 (dd, J = 6,3 y 12,0 Hz, 1H), 3,7 (dd, J = 12,0 y 18,0 Hz, 1H), 3,05 (m, 5H), 1,7 (m, 4H), 1,4 (m, 2H).

Parte farmacológica Ejemplo 1 Determinación de la afinidad del Compuesto A y Compuesto B para los receptores CB1 de rata Procedimientos

La afinidad de unión al receptor CB1 se evaluó de acuerdo con el procedimiento de Govaerts y col. (2004) con las siguientes modificaciones. Brevemente, se diseccionaron con cuidado los cerebelos de ratas Wistar macho (250-300 g) en hielo y los homogeneizados se prepararon en solución fría de Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM, sacarosa 0,25 M, pH 7,4 con un homogeneizador Potter-Heljheim y la suspensión se centrifugó a 1.000 x g durante 5 minutos. Los líquidos sobrenadantes se recogieron y centrifugaron a 50.000 x g durante 15 min. Los sedimentos resultantes después se volvieron a suspender en tampón de Tris-HCl sin sacarosa, se homogeneizaron y se incubaron durante 15 min a 37ºC en un baño de agitación orbital y se volvieron a centrifugar a 50.000 x g durante 15 min. Los sedimentos se pesaron, se volvieron a suspender en tampón de Tris-HCl sin sacarosa, se homogeneizaron con un homogeneizador Utraturrax a 13.500 rpm durante 3 x 5 s y se hicieron partes alícuotas de volúmenes de 0,9 ml en tubos Eppendorf. Las partes alícuotas se centrifugaron a 20.800 x g durante 5 minutos, se descartaron los líquidos sobrenadantes y los sedimentos se congelaron a -80ºC hasta su uso. La concentración total de proteína se determinó usando un ensayo comercial de Bio-Rad basado en el método de Lowry. Los experimentos de unión competitiva se llevaron a cabo en presencia de [^{3}H]-CP 55.940 1 nM en tubos de vidrio siliconizados que contenían 100 \mug proteína/tubo resuspendidos en un volumen final de 1 ml de Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM, albúmina de suero bovino al 0,5% (p/v), pH 7,4. Los compuestos competidores estaban presentes con diferentes concentraciones y la unión no específica se determinó en presencia de HU-210 10 \muM. Después de 1 h de incubación a 30ºC, la suspensión se filtró rápidamente a través de filtros de fibra GF/B pretratados con PEI al 0,5% en un cosechador de 96 pocillos y se lavaron 3 veces con 3 ml de tampón de unión helado sin albúmina de suero bovino. La radiactividad de los filtros se midió en un contador Wallac Winspectral 1414 por centelleo de líquido en 6 ml de Ecoscint H (National Diagnostics, Reino Unido). Los ensayos se hicieron por triplicado.

Los datos de unión se analizaron por regresión no lineal con el software GraphPad Prism Versión 3.03.

Resultados

Cuando se determinó in vitro la afinidad del Compuesto A y Compuesto B por el subtipo de receptor CB1 de rata, se observó que el Compuesto A tenía una afinidad de buena a moderada por estos receptores con una CI_{50} de 22 nM (16,1 nM en otra medición) (Tabla 1). Por otra parte, con un valor de CI_{50} de 813 nM, el Compuesto B no tiene afinidad con importancia farmacológica por los receptores CB1 de rata (Tabla 1).

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TABLA 1 Afinidades de diferentes compuestos por los receptores CB1 de rata

26

Ejemplo 2 Efectos del Compuesto A y Compuesto B en la ingestión de alimento, peso corporal, adiposidad, dislipidemia y resistencia a la insulina en ratas que se han convertido en obesas por el consumo excesivo de alimento muy sabrosos Animales

El experimento se llevó a cabo en ratas Wistar hembras (inicialmente en el intervalo de peso de 250-300 g). Las ratas se alojaron por parejas en jaulas de polipropileno con suelos sólidos y lecho de serrín a una temperatura de 21\pm4ºC y humedad de 55\pm20%. Los animales se mantuvieron en un ciclo de fase inversa de luz-oscuridad (las luces se apagan durante 8 h de 9,30-17,30) y durante este tiempo la habitación se iluminaba con luz roja. Los animales tenían acceso libre a una dieta en polvo con alto contenido de grasa (VRF1 más manteca de cerdo al 20%), chocolate molido, cacahuetes molidos y agua corriente en todo momento. Las tres dietas diferentes estaban en tres recipientes de alimentación de vidrio separados con tapas de aluminio con un agujero de 3-4 cm cortado en las mismas para permitir el acceso a la comida. Los animales se alojaron en parejas durante 12 semanas para inducir la obesidad. Después los animales se alojaron solos en jaulas de polipropileno con suelos de rejilla de alambre para permitir registrar la ingestión de alimento de cada rata. Se pusieron bandejas de polipropileno con almohadillas de jaula debajo de cada jaula para detectar cualquier vertido de alimento. Se acostumbró a los animales a estas condiciones nuevas (alojamiento individual, y las jaulas con suelo de rejilla de alambre) durante al menos 14 días antes de empezar con las lecturas de los valores base.

Procedimientos experimentales para el estudio de alimentación

Aproximadamente una semana antes de empezar el estudio, los animales se pesaron (con precisión de 0,1 g usando una balanza de platillo superior electrónica) y se repartieron en 3 grupos de tratamiento con pesos igualados, que contenía cada uno 9-10 animales. Después de un periodo de prueba de valores base de 7 días, a los animales se les administró por la vía adecuada (por ejemplo vía oral) una vez al día vehículo (hidroxipropilmetil-celulosa [HPMC] al 0,5%; 1 ml/kg) o el fármaco de ensayo, es decir Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) y Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) una vez al día durante 28 días.

Se midieron la ingestión de alimento y el peso corporal una vez al día. Las variaciones de peso corporal y los niveles de energía de los diferentes tipos de alimento se tuvieron en cuenta expresando la ingestión de alimento en términos de kJ/kg de peso de rata.

Las comparaciones estadísticas entre los pesos corporales y las ingestiones de alimento diarias de los diferentes grupos de tratamiento se han hecho por análisis de covarianza seguido del ensayo de Dunnett para comparar cada grupo de tratamiento con los controles tratados con vehículo. Para los datos de peso corporal (pesos corporales diarios), se usaron los pesos de los animales el día 1 (es decir, inmediatamente antes del primer tratamiento con fármaco) como covariante. Así, se ajustaron las medias para las diferencias de los pesos corporales entre los grupos el día 1, y los errores típicos de la media (ETM) se calcularon a partir de los residuos del modelo estadístico. Todos los valores de peso corporal medio el día 1 son iguales (y por lo tanto el ETM es cero) porque el análisis de covarianza los ajusta todos para igualar la "media general" de los valores de ese día.

Determinación del contenido de grasa en los cadáveres de los animales

La grasa total extraíble en éter de las muestras liofilizadas se calculó por el principio de Soxhlet usando un sistema Foss Soxtec HT2. El protocolo usado se basó en las recomendaciones del fabricante para muestras de carne, aunque las muestras liofilizadas ahorran la necesidad de una etapa de hidrólisis de la grasa o mezcla de la muestra con arena para asegurar una extracción eficaz.

Se pesaron con precisión muestras de aproximadamente 1 g en dedales de extracción de celulosa de 26 mm x 60 mm que después se taponaron con aproximadamente 0,8 g de algodón hidrófilo. La grasa de la muestra se extrajo en copas de extracción metálicas convencionales previamente pesadas (incluyendo unas perlas de ebullición) usando 70 ml de éter de petróleo a 40-60ºC, un distribuidor de temperatura de 115ºC y un caudal de enfriamiento de 2 l/min. Se usó una etapa de ebullición de 25 min, seguido de una etapa de lavado de 40 min. Una etapa de secado de 10 min era suficiente para eliminar el éter de las copas de extracción.

El porcentaje de grasa en la muestra liofilizada se calculó como sigue:

% de grasa = [100 x (peso final de la copa - peso inicial de la copa)]/peso de la muestra

El porcentaje de grasa en la muestra original se calculó usando el % de agua como sigue:

% de grasa en la muestra original = % de grasa x [(100-% de agua)/100]

Determinación del contenido de proteína en los cadáveres de los animales

Las proteínas totales en las muestras liofilizadas se calcularon usando el principio de Kjeldahl. Se llevó a cabo un procedimiento de micro-Kjeldahl usando un bloque de digestión Foss 2012 y una unidad de destilación Foss 2200. El protocolo usado se basaba en las recomendaciones del fabricante para muestras de carne.

Se pesaron con precisión aproximadamente 0,3 g de muestra liofilizada en 100 ml de tubos de digestión (Foss UK Ltd) en gradillas de 12 tubos. Cada gradilla incluía al menos un tubo de blanco para determinar un blanco del reactivo. A cada tubo se añadieron dos comprimidos Kjetabs CQ y uno Antifoam S seguido de 10 ml de ácido sulfúrico al 98%. Las muestras se hicieron digerir a 420ºC durante 1 h para convertir las proteínas en sulfato amónico. Una vez enfriados los tubos, se liberó el amoniaco libre por adición de un exceso de solución de NaOH al 40% y se destiló el vapor en 30 ml de solución indicadora de ácido bórico al 4%. Después se determinó el amoniaco por valoración frente a HCl de grado volumétrico 0,1 M usando una bureta digital de 25 ml Brand. El contenido de nitrógeno y proteínas de las muestras se calculó como sigue:

% de nitrógeno = [(valoración de la muestra - valoración del blanco) x 0,1401]/peso de la muestra (g)

% de proteína = % de nitrógeno x 6,25

Determinación del contenido de cenizas en los cadáveres de los animales

Las cenizas totales en las muestras liofilizadas se calcularon determinando las cenizas no combustibles que quedaban después de quemar las muestras a altas temperaturas usando un horno de mufla Carbolite OAF 11/1.

Se quemaron previamente crisoles de sílice con forma achatada (600ºC) durante al menos 2 h para estabilizar los pesos. Se dejaron enfriar los crisoles (<300ºC) y se transfirieron a cajas de secado de gel de sílice. Después se pesaron los crisoles, se añadió aproximadamente 1 g de muestra y el crisol de volvió a pesar. También se incluyó una serie de crisoles vacíos. Los crisoles se quemaron a 6002C durante 4 h para convertir las muestras en cenizas y después se dejaron enfriar (<300ºC) antes de transferirlos a las cajas de secado de gel de sílice. Los pesos finales se determinaron cuando los crisoles se habían enfriado completamente.

El porcentaje de cenizas se determinó expresando el peso de la muestra residual después de quemarla como un porcentaje del peso de la muestra original. La variación media del peso de los crisoles de blanco era -0,02 \pm 0,04 mg (media \pm ETM, n = 14) y los pesos individuales variaban 0,5 mg o menos.

Análisis del plasma

Se tomaron muestras de sangre terminal por punción cardiaca de los animales inmediatamente después de la muerte en tubos con heparina de litio de 4,5 ml Sarstedt (Cat. nº 32.331). Después los tubos se centrifugaron a 1.500 g durante 5 minutos a 4ºC y se separó el plasma y se congeló inmediatamente en hielo seco (3 partes alícuotas por muestra en tubos Eppendorf cerrados). Las muestras de plasma se almacenaron a -75ºC hasta que fueron necesarias para el análisis. Todas las determinaciones se realizaron en muestras de plasma que se habían descongelado sólo una vez.

Ensayo de leptina

La concentración de leptina en el plasma se determinó usando el kit de ensayo inmunométrico de enzima leptina de rata de Assay Designs (Cat. nº 900-015) de acuerdo con el protocolo habitual del fabricante. Las muestras desconocidas se diluyeron 100 veces usando el tampón de ensayo de leptina antes de ensayar por duplicado. Se determinó la densidad óptica a 450 nm usando un lector de microplaca ajustable VERSAmax de Molecular Devices y las lecturas se transfirieron a GraphPad Prism. Se ajustó una curva polinómica de segundo orden a los datos de calibración y los valores desconocidos se extrapolaron a partir de este ajuste de la curva.

Ensayo de AGNE

Los ácidos grasos no esterificados (o libres) (AGNE) se determinaron por modificación de un kit de ensayo de analizador clínico comercial (Wako NEFA C procedimiento ACS-ACOD) a un formato de 96 pocillos. El ácido oleico convencional (1 mM) suministrado se diluyó en agua desionizada para crear una serie de concentraciones patrón de 50 \muM a 1000 \muM. Las muestras de plasma se ensayaron después de una dilución de 2 veces en agua desionizada. Los patrones y las muestras de plasma diluidas se pusieron con pipeta en las placas (Alpha Laboratories, FX9200 de fondo plano) como adiciones de 10 \mul por duplicado. Las placas de ensayo y los reactivos A y B se precalentaron a 37ºC y la reacción se inició por adición de 75 \mul de reactivo A seguido de incubación a 37ºC. Después de exactamente 10 minutos, se añadieron 150 \mul de reactivo B y la placa se incubó durante otros 10 minutos después de lo cual se determinó la densidad óptica a 540 nm usando un lector de microplaca ajustable VERSAmax de Molecular Devices. Después las lecturas de las densidades ópticas se transfirieron a GraphPad Prism y los valores para las muestras de plasma se extrapolaron de un ajuste de regresión lineal de la curva patrón. El ensayo era lineal hasta el patrón más alto usado (1000 \muM)

Ensayo de glicerol y triacilglicerol

El triacilglicerol en el plasma se determinó por modificación de un kit de ensayo discreto (Sigma Trigyceride determination kit, Cat. nº TR0100) a un formato de 96 pocillos. El kit realmente determina el glicerol liberado después de hidrólisis enzimática del triacilglicerol a ácidos libres y glicerol (1 mol de glicerol por mol de triacilglicerol). Por esta razón, es necesaria la corrección de la concentración de glicerol presente originalmente en el plasma. Por lo tanto, las muestras de plasma se ensayaron en ausencia (glicerol libre en el plasma) o presencia (triacilglicerol total) de la lipoproteína lipasa. La resta del glicerol libre de la concentración total de triacilglicerol da la concentración real de triacilglicerol.

Se obtuvo de Sigma trioleina 2,5 mg/ml equivalente al patrón de glicerol. El factor de conversión a mM suministrado por Sigma para este lote era 1,13 (es decir glicerol 2,83 mM). Se preparó una solución madre de glicerol de 10 mg/ml en solución salina y después se diluyó en solución salina para crear una serie de concentraciones patrón de 0,218 a 4,34 mM. Los patrones y las muestras de plasma (sin diluir) se pusieron con pipeta en las placas de 96 pocillos como adiciones de 10 \mul, por duplicado. Las placas de ensayo y los reactivos se precalentaron a 37ºC y la reacción se inició por adición de 200 \mul de glicerol o de reactivo de triacilglicerol total (reconstituido según el protocolo del fabricante) seguido de incubación a 37ºC durante 5 minutos, después de lo cual se determinó la densidad óptica a 540 nm usando un lector de microplaca ajustable VERSAmax de Molecular Devices. Después las lecturas de densidades ópticas se transfirieron a GraphPad Prism y los valores desconocidos se extrapolaron de un ajuste de regresión lineal a la curva patrón. El ensayo era lineal hasta el patrón de glicerol más alto usado (4,34 mM). La resta de la concentración de glicerol en las muestras de plasma de la concentración total de triacilglicerol da la concentración real de triacilglicerol.

Ensayo de insulina

La concentración de insulina en el plasma se determinó usando kits de ELISA para insulina de rata ultrasensibles Mercodia de acuerdo con el protocolo del fabricante para muestras de 50 \mul. Las muestras desconocidas se diluyeron 20 veces usando el patrón cero antes de ensayar por duplicado. La densidad óptica a 450 nm se determinó usando un lector de microplaca ajustable VERSAmax de Molecular Devices y las lecturas se transfirieron a GraphPad Prism. Se ajustó una curva de spline cúbico a los datos de calibración y los valores desconocidos se extrapolaron a partir de este ajuste de la curva.

Resultados Efectos crónicos del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) en el consumo de fuentes de macronutrientes individuales

En las ratas que se habían convertido en obesas después de un consumo excesivo de una dieta de tipo "cafetería" sabrosa que consistía en comida con alto contenido en grasa, chocolate con leche molido y cacahuetes tostados salados molidos, la administración oral repetida del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) produjo una reducción moderada relacionada con la dosis del consumo de estos alimentos de de alta densidad energética como se describe en la Figura 1. Las reducciones de consumo de alimento con el Compuesto B (30 mg/kg po solo) eran significativas comparadas con el grupo de control tratado con vehículo el primer día de la administración del fármaco, y la ingestión de alimento diaria permaneció significativamente inferior que en el grupo de control los días 2, 5, 6 y 7 y no se redujo significativamente hasta el día 14 (Figura 1). En comparación, el Compuesto B (10 mg/kg po) no alteró significativamente la ingestión de alimento comparado con el grupo de control tratado con vehículo ningún día de tratamiento con el fármaco, aunque las ingestiones diarias de alimento eran menores, que las del grupo de control los días 1 a 3 (Figura 1).

Los resultados en la Figura 1 son las medias (ajustadas para las diferencias entre las ingestiones de alimento de los diferentes grupos de tratamiento en los valores base (media de los días -6 a 0)) \pm ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico), n = 9-10. Las comparaciones múltiples frente al grupo de control tratado con vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas con el grupo de control se indican con *p<0,05 (los niveles p sólo se han dado en un nivel para mayor claridad).

Por comparación, el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) redujo la ingestión de alimento con mucha mayor intensidad que el Compuesto B como se muestra en la Figura 2. En comparación con el grupo de control tratado con vehículo, la reducción de ingestión de alimento sabroso se redujo significativamente con las dosis tanto de 10 como de 30 mg/kg el primer día de administración de fármaco y la ingestión diaria de alimento permaneció significativamente más baja que el grupo de control los días 2 a 7 con la dosis menor, y los días 2 a 10 y el día 15 para la dosis mayor (Figura 2).

Los resultados en la Figura 2 son las medias (ajustadas para las diferencias entre las ingestiones de alimento de los diferentes grupos de tratamiento en los valores base (media de los días -6 a 0)) \pm ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico), n = 9-10. Las comparaciones múltiples frente al grupo de control tratado con vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas con el grupo de control se indican con *p<0,05 (los niveles p sólo se han dado en un nivel para mayor claridad).

Efectos crónicos del Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) y Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) en los pesos corporales de ratas obesas con acceso a alimentos con macronutrientes muy sabrosos

Los pesos corporales del grupo de control tratado con vehículo aumentaron lentamente a lo largo del estudio (Figuras 3 y 4). En concordancia con las reducciones moderadas de ingestión de alimento descritas antes, la administración oral crónica del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po), provocó una pequeña disminución relacionada con la dosis de los pesos corporales de estas ratas obesas que se mantuvo durante la duración del tratamiento con fármaco (Figura 3). El peso corporal de los animales a los que se les administró el Compuesto B (30 mg/kg po) no alcanzó el nivel de significancia estadística comparado con el grupo de control hasta el día 6 y con una disminución máxima significativa el día 29 de 7,1% (Figura 3). Los pesos corporales de los animales a los que se administró el Compuesto B (10 mg/kg po) tenían tendencia a ser menores que los del grupo de control tratado con vehículo a lo largo del estudio (Figura 3), pero estas reducciones no alcanzaron significancia estadística comparado con el grupo vehículo, con la excepción del día 3. Al final del periodo de 28 días de tratamiento con fármaco, los pesos corporales de las ratas Wistar hembra, con obesidad inducida por la dieta a las que se les dio el Compuesto B (10 mg/kg po) eran 4,0ó menores, que los de los controles tratados con vehículo (Figura 3).

Los resultados mostrados en la Figura 3 son las medias (ajustadas para las diferencias entre los pesos corporales de los diferentes grupos de tratamiento en el valor base (día 1)) \pm ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico), n = 9-10. Los números representan el % de reducción comparado con el grupo de control el día 29 (es decir, después de 28 días de tratamiento). Las comparaciones múltiples frente al grupo de control tratado con vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas con el grupo de control se indican con *p<0,05 (los niveles p sólo se han dado en un nivel para mayor claridad).

La administración crónica del Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) produjo disminuciones relacionadas con la dosis mucho mayores en el peso corporal que el Compuesto B (Figura 4). Los pesos corporales de los animales a los que se les dio cualquiera de las dosis de Compuesto A eran significativamente menores que los del grupo de control el día 2 (es decir, 24 h después de la primera dosis de fármaco) y que cualquier otro día del periodo de tratamiento con fármaco (Figura 4). Así, al final del periodo de 28 días de tratamiento con fármaco, los pesos corporales de las ratas Wistar hembra, con obesidad inducida por la dieta a las que se les dio el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) eran 12,0% y 19,0% menores, respectivamente que los de los controles tratados con vehículo (Figura 4).

Los resultados mostrados en la Figura 4 son las medias (ajustadas para las diferencias entre los pesos corporales de los diferentes grupos de tratamiento en el valor base (día 1)) \pm ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico), n = 9-10. Los números representan el % de reducción comparado con el grupo de control el día 29 (es decir, después de 28 días de tratamiento). Las comparaciones múltiples frente al grupo de control tratado con vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas con el grupo de control se indican con *p<0,05 (los niveles p sólo se han dado en un nivel para mayor claridad).

Efectos crónicos del Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) y Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) en la adiposidad de ratas obesas con acceso a alimentos con macronutrientes muy sabrosos

Los efectos de la administración crónica oral del Compuesto B y Compuesto A durante 28 días en la composición corporal se muestran en las Figuras 5-8 (contenido de grasa, agua, proteínas y cenizas expresadas como g por rata).

La administración repetida con el compuesto B (10 y 30 mg/kg po) produjo reducciones relacionadas con la dosis de la grasa de los cadáveres de los animales, pero este efecto sólo era estadísticamente significativo con la dosis mayor (Figura 5). El Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) produjo una disminución de la grasa corporal absoluta de 26,2 y 11,1 g, respectivamente, comparado con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 5).

Los resultados en la Figura 5 se expresan como medias del grupo de tratamiento (n = 9-10 y están ajustadas para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en el valor base) y ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico). Las comparaciones estadísticas se hicieron con ANCOVA (valor base de peso corporal como covariante) seguido de ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas se indican por ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05.

Por comparación, el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) produjo disminuciones mucho mayores de la grasa corporal de 42,8 g y 67,8 g, respectivamente, comparado con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 5).

El Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) no alteraron significativamente los contenidos totales de agua (Figura 6), proteínas (Figura 7) o cenizas (Figura 8) de los cadáveres de los animales (expresado como peso por rata) con excepción del Compuesto A (30 mg/kg po) que disminuyó ligeramente, pero de forma significativa, el contenido total de agua.

Los resultados en la Figura 6 se expresan como medias del grupo de tratamiento (n = 9-10 y están ajustadas para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en el valor base) y ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico). Las comparaciones estadísticas se hicieron con ANCOVA (valor base de peso corporal como covariante) seguido de ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas se indican por *p<0,05.

Los resultados en las Figuras 7 y 8 se expresan como medias del grupo de tratamiento (n = 9-10 y están ajustadas para las diferencias entre los grupos en el peso corporal en el valor base) y ETM (calculado a partir de los residuos del modelo estadístico). Las comparaciones estadísticas se hicieron con ANCOVA (valor base de peso corporal como covariante) seguido de ensayo de Dunnett. No hay diferencias significativas respecto al control.

De acuerdo con las reducciones relativas de la grasa corporal mostradas en la Figura 5, los niveles de leptina en el plasma disminuyeron un 13,7% (no significativo) y 26,2% después del tratamiento crónico con el Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y 36,1% y 61,7% después del Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) cuando se compararon con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 9).

Los resultados en la Figura 9 se expresan como medias del grupo de tratamiento y ETM (todos n = 9-10). Se usó el análisis de covarianza usando el valor base de peso corporal y el orden de desangrado (número de animal) como covariante. Se usó la transformación de Rango. Las comparaciones múltiples frente al vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas se indican por *p<0,05 y ***p<0,001.

Efectos crónicos del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) en las concentraciones de AGNE en el plasma en ratas obesas con acceso a alimentos con macronutrientes muy sabrosos

Los efectos de la administración oral repetida del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) en las concentraciones de AGNE en el plasma se muestran en la Figura 10.

El Compuesto B (30 mg/kg po) disminuyó significativamente los niveles de AGNE en el plasma en un 24,4% comparado con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 10). Sin embargo, la dosis más baja de este compuesto, no tenía efecto en este parámetro de lípidos. En contraste, a pesar de la mayor pérdida de peso y menor adiposidad resultante de la administración repetida del Compuesto A (10 y 30 mg/kg po), ninguna de las dosis de este compuesto tenía efecto para reducir los niveles de AGNE en el plasma (Figura 10).

Los resultados en la Figura 10 se expresan como medias del grupo de tratamiento y ETM (todos n = 9-10). Se usó el análisis de covarianza usando el valor base de peso corporal y el orden de desangrado (número de animal) como covariante. Se usó la transformación de Rango. Las comparaciones múltiples frente al vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas se indican por *p 0,05.

Efectos crónicos del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) en las concentraciones de triacilglicerol y glicerol en el plasma en ratas obesas con acceso a alimentos con macronutrientes muy sabrosos

Los efectos de la administración oral repetida del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) en las concentraciones de triacilglicerol y glicerol en el plasma se muestran en las Figuras 11 y 12.

El Compuesto B (30 mg/kg po) provocó reducciones muy significativas de las concentraciones en el plasma de triacilgliceroles de 52,1% (p < 0,001) y de los niveles de glicerol en el plasma de 38,9% (p < 0,01), aunque el tratamiento con la dosis menor de 10 mg/kg no tenía efecto en estos parámetros de lípidos (Figuras 11 y 12).

El Compuesto A (30 mg/kg po) también redujo significativamente las concentraciones de triacilgliceroles en el plasma en 42% (p < 0,05) y los niveles de glicerol en el plasma en 33,6% (p < 0,05) (Figuras 11 y 12). A pesar de que el Compuesto A (10 mg/kg po) indujo una pérdida de peso y reducciones de la adiposidad mayores que el Compuesto B (30 mg/kg po), no tenía un efecto significativo en los niveles de triacilgliceroles o glicerol en el plasma (Figuras 11 y 12).

Los resultados en las Figuras 11 y 12 se expresan como medias del grupo de tratamiento y ETM (todos n = 9-10). Se usó el análisis de covarianza usando el valor base de peso corporal y el orden de desangrado (número de animal) como covariante. Se usó la transformación de Rango. Las comparaciones múltiples frente al vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas se indican por *p 0,05 y ***p<0,001.

Efectos crónicos del Compuesto B (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) en las concentraciones de insulina en el plasma de ratas obesas con acceso a alimentos con macronutrientes muy sabrosos

Los efectos del Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) y el Compuesto B (30 mg/kg po) en los niveles de insulina en el plasma se muestran en la Figura 13.

El Compuesto B (30 mg/kg po) redujo los niveles de insulina en el plasma en 15% a 28% comparado con el grupo de control (Figura 13).

El Compuesto A (10 y 30 mg/kg po) disminuyó significativamente los niveles de insulina en el plasma en un 38,9% y 41,8% respectivamente comparado con el grupo de control tratado con vehículo (Figura 13).

Los resultados en la Figura 13 se expresan como medias del grupo de tratamiento y ETM (todos n = 9-10). Se usó el análisis de covarianza usando el valor base de peso corporal y el orden de desangrado (número de animal) como covariante. Se usó la transformación de Rango. Las comparaciones múltiples frente al vehículo se hicieron con el ensayo de Dunnett. Las diferencias significativas se indican por *p<0,01 y ***p<0,001.

Discusión

En la presente invención, se ha demostrado que sorprendentemente la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida (Compuesto B) es inesperadamente beneficiosa como medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de la dislipidemia y trastornos metabólicos relacionados, incluidos la obesidad, adiposidad central, resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada (prediabetes), diabetes de tipo 2 y síndrome metabólico, que resultan del consumo excesivo o de atracones de alimentos muy sabrosos.

Esta invención es sorprendente como se demuestra con 4 descubrimientos:

1. Aunque su enantiómero el Compuesto A tiene un valor de CI_{50} de 22 nM, el Compuesto B carece de una afinidad con importancia farmacológica por el receptor de rata CB1, es decir tiene un valor de CI_{50} de 813 nM.

2. El Compuesto B provoca la disminución del consumo excesivo de alimentos con alto contenido en grasa (ilustrados por la comida con alto contenido en grasa), alimentos y dulces con alto contenido de hidratos de carbono (ilustrados con chocolate con leche molido) y alimentos con alto contenido de proteínas salados (ilustrados con cacahuetes salados tostados molidos) cuando se dejaron a libre disposición de los animales como fuentes individuales de macronutrientes de tipo "cafetería". La reducción de los alimentos sabrosos da como resultado reducciones de diferentes lípidos en el plasma, es decir, de AGNE, triacilgliceroles y glicerol, pérdida de peso mediada por la pérdida de grasa y reducciones moderadas de la insulina en el plasma. Puesto que el Compuesto B carece de afinidad por el receptor CB1 de rata, estos beneficios no pueden ser mediados por una inhibición de la función del receptor CB1, y por lo tanto, son mediados por un mecanismo nuevo y hasta ahora desconocido.

3. Comparado con el antagonista del receptor CB1, el Compuesto A, el Compuesto B era el único compuesto que disminuía las concentraciones de AGNE en el plasma.

4. El Compuesto B (30 mg/kg) provocaba mayores reducciones de triacilgliceroles y glicerol en el plasma que el Compuesto A (10 mg/kg) incluso cuando el primero producía menos pérdida de peso que este último.

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La consecuencia de los puntos 3 y 4 es que el Compuesto B tiene un efecto beneficioso en los lípidos del plasma que es mayor que el que se explica por la pérdida de peso solo.

En esta invención, se ha reivindicado el uso del Compuesto B en la profilaxis y el tratamiento de la dislipidemia que resulta del consumo excesivo o de atracones de alimentos muy sabrosos.

La dislipidemia existe como una enfermedad en sí misma pero también es un componente central de diferentes definiciones del síndrome metabólico. Por lo tanto, la dislipidemia comprende hipercolesterolemia familiar (HF) heterozigótica, hipercolesterolemia familiar (HF) homozigótica, apolipoproteína defectuosa familiar B-100 (ADF), hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia poligénicas incluida la hiperlipidemia combinada familiar, hipertrigliceridemia familiar y disbetalipoproteinemia familiar, colesterol HDL bajo (con o sin hipertrigliceridemia), dislipidemia diabética (es decir, dislipidemia aterogénica en personas con diabetes de tipo 2), colesterol LDL elevado y dislipidemia aterogénica. Otras dislipidemias secundarias incluyen, pero no se limitan, las provocadas por el hipertiroidismo, síndrome nefrótico y otros trastornos renales, enfermedad hepática obstructiva y dislipidemia inducida por inhibidor de proteasa.

Dentro de las diferentes definiciones para el síndrome metabólico que se dan a continuación, las anomalías lipídicas se definen específicamente como sigue:

Organización mundial de la salud (OMS) (1999)

- Triglicéridos en el plasma elevados (\geq 1,7 mmol/l; 150 mg/dl).

- Colesterol HDL en el plasma bajo (< 0,9 mmol/l, 35 m/dl en hombres; < 1,0 mmol/l, 39 mg/dl en mujeres).

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Programa de educación sobre el colesterol (NCEP), Tercer panel de tratamiento de adultos (ATP) III (2002)

- Triglicéridos en el plasma elevados (\geq 1,7 mmol/l; 150 mg/dl).

- Colesterol HDL en el plasma bajo (< 1,03 mmol/l, 40 m/dl en hombres; < 1,29 mmol/l, 50 mg/dl en mujeres).

\vskip1.000000\baselineskip

Federación internacional de diabetes (FID) (2005)

- Triglicéridos en el suero elevados (\geq 1,7 mmol/l; 150 mg/dl) o tratamiento específico para esta anomalía de lípidos

Como se establece también en las guías de NCEP ATP III (2002), la necesidad de tratar la dislipidemia en los pacientes no se define sólo por las concentraciones en el suero o plasma de los lípidos individuales, sino también por la coexistencia de anomalías de lípidos con otros factores de riesgo cardiovascular y/o trastornos relacionados, por ejemplo hipertensión, enfermedad cardiovascular, diabetes de tipo 2, la historia médica del paciente, también si el paciente tiene o no una historia de sucesos adversos cerebrovasculares o cardiovasculares, por ejemplo, infarto de miocardio, insuficiente cardiaca congestiva, angina y/o infarto cerebral hemorrágico o tromboembólico. Los expertos en la materia conocen bien estos factores clínicos y se tienen en cuenta en la decisión de si hay que prescribir o no medicamentos para tratar la dislipidemia.

Todas estas indicaciones se reivindican en esta solicitud.

También se sabe que la obesidad y la adiposidad visceral son consecuencias metabólicas importantes del consumo excesivo de alimentos de alta densidad energética y muy sabrosos (Zephier y col., 1997; International Diabetes Federation, 2003; Grundy, 2004; Deedwania, 2004), y en algunos casos, del ansia y de los atracones de comer alimentos sabrosos específicos (White y col., 2002; Phelan & Whadden, 2002; Yanovski, 2003; White & Grilo, 2005). Los datos presentados muestran que el Compuesto B es inesperadamente eficaz en la reducción de la obesidad y la adiposidad que resultan del consumo de estos alimentos muy sabrosos, y también se reivindica el uso del Compuesto B como medicamento para tratar o prevenir la obesidad y la adiposidad visceral que resultan del consumo excesivo o de atracones de alimentos muy sabrosos.

La dislipidemia, con o sin obesidad, que resulta del consumo excesivo de alimentos de alta densidad energética y muy sabrosos (Zephier y col., 1997; International Diabetes Federation, 2003; Grundy, 2004; Deedwania, 2004), y en algunos casos, del ansia y de los atracones de comer alimentos sabrosos específicos (White et al, 2002; Phelan & Whadden, 2002; Yanovski, 2003; White & Grilo, 2005) es la causa principal de la resistencia a la insulina y un conductor clave del avance de la prediabetes (resistencia a la insulina y/o tolerancia a la glucosa alterada) a la diabetes de tipo 2 (Boden & Laakso, 2004; Bays y col., 2004; IDF, 2005). Además, también hay un grado alto de asociación entre la diabetes de tipo 2 y la dislipidemia, de modo que esta última se caracteriza por niveles elevados en el plasma de partículas de colesterol LDL pequeñas y densas, triglicéridos elevados y concentraciones bajas de partículas de colesterol HDL (Boden & Laakso, 2004). Puesto que el Compuesto B ha mostrado inesperadamente que mejora la dislipidemia que resulta del consumo excesivo de alimentos muy sabrosos, y además, reduce los niveles de insulina en el plasma, también se reivindica el uso del Compuesto B como medicamento para tratar o prevenir la resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada o diabetes de tipo 2 que resultan del consumo excesivo o de atracones de alimentos muy sabrosos.

El consumo excesivo de alimentos de alta densidad energética y muy sabrosos (Zephier y col., 1997; International Diabetes Federation, 2003; Grundy, 2004; Deedwania, 2004), y en algunos casos, el ansia y los atracones de comer alimentos sabrosos específicos (White et al, 2002; Phelan & Whadden, 2002; Yanovski, 2003; White & Grilo, 2005) son la causa principal de la mayor frecuencia del síndrome metabólico. En este grupo de factores de riesgo cardiovasculares, la obesidad o adiposidad central, las anomalías de lípidos (triglicéridos en el suero elevados, colesterol HDL en el suero bajo) y la tolerancia a la glucosa alterada o diabetes de tipo 2 son síntomas centrales del síndrome metabólico, independientemente de si el diagnóstico se hace de acuerdo con los criterios definidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS, 1999), el Programa Nacional de Educación sobre Colesterol - Tercer panel de tratamiento de adultos (NCEP ATP III, 2001) o la Federación internacional de diabetes (FID, 2005). Las ratas obesas con alimentación de tipo cafetería usadas en estos experimentos son obesas, dislipidémicas y resistentes a la insulina, lo que hace sean un modelo excelente sustituto para el síndrome metabólico humano que resulta del consumo excesivo de alimentos muy sabrosos. Puesto que el Compuesto B ha mostrado inesperadamente que reduce la obesidad y la adiposidad, disminuye los niveles de AGNE, triacilgliceroles, glicerol e insulina en el plasma en este modelo animal, también se reivindica el uso del Compuesto B como medicamento para tratar o prevenir el síndrome metabólico que resulta del consumo excesivo o de atracones de alimentos muy sabrosos.

El efecto beneficioso del Compuesto B para disminuir los niveles de AGNE, triacilgliceroles, glicerol e insulina en el plasma es mayor que el que se puede explicar por la pérdida de peso solo. Por lo tanto, los resultados también demuestran que el Compuesto B será útil como medicamento para tratar o prevenir la dislipidemia y/o resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada o diabetes de tipo 2 o síndrome metabólico que resultan del consumo excesivo de alimentos de alta densidad energética y muy sabrosos o del ansia/atracones de alimentos sabrosos específicos, en sujetos en los que estas alteraciones metabólicas no están asociadas con ser obeso o tener sobrepeso.

Juntos, el Compuesto A y el Compuesto B son los enantiómeros que comprenden el compuesto racémico, la (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida que es una pirazolina que se ha reivindicado previamente como medicamento para el tratamiento y/o profilaxis de la obesidad. El Compuesto A es un antagonista del receptor CB1 que demuestra que es beneficioso en la obesidad y/o adiposidad central y/o dislipidemia y/o resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada o diabetes de tipo 2 y/o síndrome metabólico que resultan del consumo excesivo de alimentos de alta densidad energética y muy sabrosos o del ansia/atracones de alimentos sabrosos específicos, mientras que el Compuesto B proporciona efectos beneficiosos adicionales dependientes de la pérdida de peso e independientes de la pérdida de peso, en los factores de riesgo cardiometabólicos, mediante un mecanismo farmacológico nuevo y todavía no identificado. Basándose en esto la (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida será inesperadamente ventajosa como medicamento en sujetos no obesos, con sobrepeso u obesos, que padecen obesidad y/o adiposidad central y/o dislipidemia y/o resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada o diabetes de tipo 2 y/o síndrome metabólico, cuando son consecuencia del consumo excesivo de alimentos de alta densidad energética y muy sabrosos o del ansia o de atracones de alimentos sabrosos específicos.

Referencias

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Claims

1. Mezcla no racémica de (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida y (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, sus respectivas sales, polimorfos o solvatos, en especial hidratos.

2. Mezcla no racémica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque

la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en la mezcla en una cantidad X de 99 a 51 por ciento en peso, preferiblemente 95 a 55 por ciento en peso, más preferiblemente 90 a 60 por ciento en peso, de la forma más preferida 80 a 60 por ciento en peso y

y X + Y es 100.

3. Mezcla no racémica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque

y X + Y es 100.

4. Mezcla no racémica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizada porque una de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida o la (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida está presente en forma de su base o clorhidrato, preferiblemente ambas están presentes en forma de sus respectivas bases o clorhidratos, de la forma más preferida ambas están en forma de sus respectivas bases.

5. Medicamento que comprende al menos la mezcla no racémica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

6. Uso de la mezcla no racémica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar un medicamento para modular los receptores de cannabinoides, preferiblemente los receptores de cannabinoides 1 (CB_{1}), para la profilaxis y/o tratamiento de trastornos del sistema nervioso central, trastornos del sistema inmunitario, trastornos del sistema cardiovascular, trastornos del sistema endocrino, trastornos del sistema respiratorio, trastornos del tracto gastrointestinal o trastornos reproductivos.

7. Uso de la mezcla no racémica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de los trastornos de ingestión de alimento, preferiblemente bulimia, anorexia, caquexia, obesidad, diabetes mellitus de tipo II (diabetes mellitus no dependiente de insulina), más preferiblemente obesidad, diabetes de tipo II, síndrome metabólico y/o dislipidemia.

8. Formulación farmacéutica que comprende

- la mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida; o

- la mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y (R)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida; o

- la mezcla de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y (rac)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida; o

en compartimentos separados de la formulación farmacéutica.

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9. Formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque los compartimentos separados son capas o pellas.

10. Uso de la (S)-N-piperidinil-5-(4-clorofenil)-1-(2,4-diclorofenil)-4,5-dihidro-1H-pirazol-3-carboxamida, sus respectivas sales, polimorfos o solvatos, en especial hidratos, para preparar un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de la dislipidemia y otras alteraciones metabólicas que resultan del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que las otras alteraciones metabólicas que resultan del consumo excesivo de alimentos con macronutrientes muy sabrosos, se seleccionan de obesidad, adiposidad central, resistencia a la insulina/tolerancia a la glucosa alterada (prediabetes), diabetes de tipo 2 y síndrome metabólico; en especial síndrome metabólico o diabetes de tipo II.