ES2318183T3 - Procedimiento de concentracion de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para concentrar una proteína a partir de una solución acuosa inicial que tiene componentes en solución, los componentes en solución que comprenden la proteína y un polímero orgánico, el polímero orgánico se selecciona del grupo que consiste en los copolímeros en bloque de la familia de Pluronic, polietilenglicol y polímeros antiespuma, el procedimiento comprende: (1) someter la solución acuosa inicial a ultrafiltración para concentrar la proteína, de modo tal que se produce una primera solución retenida, (2) ajustar la conductividad de la primera solución retenida por debajo de aproximadamente 6 mS/cm medido a 22ºC para producir una segunda solución retenida, y (3) someter la segunda solución retenida a ultrafiltración para concentrar adicionalmente la proteína de modo que se genere una solución concentrada.
Description
Procedimiento de concentración de proteínas.
La presente invención se refiere generalmente a
la concentración de soluciones de macromoléculas tales como
proteínas. En una forma de realización, el procedimiento de la
invención involucra la ultrafiltración de una solución que
comprende macromoléculas y el polímero orgánico de coconcentración,
luego una diafiltración para reducir la conductividad, y luego una
segunda ultrafiltración para concentrar la macromolécula sin pérdida
significativa de rendimiento debido a la precipitación.
La producción de proteína involucra la creación
de grandes volúmenes de solución de proteína comparativamente
diluidos. Se prefiere concentrar la proteína después de la
fermentación para facilitar las etapas posteriores, tales como
congelamiento, almacenamiento a granel y descongelamiento y
purificación posterior. Sin embargo, en el pasado se ha comprobado
que la capacidad de obtener concentraciones de proteína óptimas
para los productos a partir de soluciones que contienen un polímero
orgánico de coconcentrante, tal como se halla en muchas soluciones
de sobrenadante de cultivos celulares producidos a partir de la
recolección de cultivos de células de mamífero, está limitada
debido al aumento de precipitación (y en consecuencia, pérdida) de
las moléculas de producto, ya que aumenta la concentración usando
ultrafiltración. Por ejemplo, la excesiva precipitación ha evitado
la concentración por ultrafiltración en más de
10-20 veces respecto de la concentración de proteína
en el sobrenadante del cultivo de células inicial.
El proceso de aislamiento o recuperación
primaria forma la interfaz entre la fermentación y la purificación
posterior, y a menudo es crítica tanto en términos de capacidad de
producción como de la economía del proceso. El principal objeto del
proceso de aislamiento es obtener el producto proteico en solución
libre de partículas, concentrada, que permite además realizar el
procesamiento y la purificación posterior.
La ultrafiltración (UF) es una tecnología
eficiente para la concentración de soluciones proteicas y con
frecuencia se usa como una etapa importante para el aislamiento de
las proteínas del sobrenadante del cultivo celular. En particular,
la ultrafiltración se usa en los procesos de fermentación
discontinuos y perfusión de células. Debido a que los procesos de
perfusión continua producen volúmenes grandes de producto de
proteína comparativamente diluidos, los factores de concentración
alta son deseables para facilitar los procesos finales. Una
limitación importante de los procesos de fabricación de proteínas
basados en cultivos celulares convencionales es el factor de
concentración obtenible del aislamiento de proteínas. En la mayoría
de los casos, los factores de concentración de solo
10-20 veces se obtienen usando ultrafiltración
durante el proceso de aislamiento. Los intentos de aumentar la
concentración han originado problemas de filtrabilidad crecientes y
pérdidas de producto debidas a la precipitación. La naturaleza y la
causa de la precipitación son generalmente desconocidas. En la
etapa de UF la concentración significativamente superior
normalmente no es fácilmente obtenible debida al aumento de
precipitación adicional. Esto puede lentificar las etapas
subsiguientes del proceso debido a que se deben procesar volúmenes
muy grandes. Esto es especialmente verdadero para los procesos de
perfusión continua debido a los títulos de producto
comparativamente bajos y al alto rendimiento volumétrico en
comparación con la fermentación discontinua.
Los sobrenadantes del cultivo celular consisten
en un amplio espectro de compuestos. Estos incluyen suplementos de
un medio de cultivo celular tal como copolímeros en bloque no
iónicos, particularmente de la familia de Pluronic de copolímeros
en bloque no iónicos comercializados por BASF, y aceite de silicio,
y los compuestos que se secretan de las células o liberan de la
tisis celular (por ejemplo, proteínas, lípidos). Usualmente se
requiere el polímero en bloque no iónico Pluronic
F-68 como suplemento del medio de cultivo celular
para proteger células de mamífero.
En una forma de realización preferida, la
presente invención se refiere a un procedimiento para aumentar
mucho la concentración del sobrenadante del cultivo celular sin
pérdida significativa del rendimiento de macromoléculas del
producto o problemas de filtrabilidad. Los solicitantes descubrieron
sorprendentemente que un sobrenadante del cultivo celular, que
comprende las macromoléculas del producto y un polímero orgánico
que se coconcentra con las macromoléculas del producto durante la
ultrafiltración, de modo que un copolímeros de Pluronic, se puede
concentrar mucho con rendimientos superiores a los de cualquiera de
los proceso informado conocidos por los solicitantes al someter el
sobrenadante a una ultrafiltración inicial, luego ajustar la
conductividad del retenido, tal como por diafiltración con agua para
inyección (WFI), diluyente o buffer, y luego someter la solución a
una segunda ultrafiltración.
En relación con la presente invención, se
proporcionan procedimientos para concentrar una macromolécula a
partir de una solución acuosa inicial que tiene en componentes en
solución. Los componentes en solución comprenden la macromolécula y
un polímero orgánico. La macromolécula se concentra al someter
primero la solución inicial a ultrafiltración para concentrar la
macromolécula de modo que se produce una primera solución retenida,
luego se ajusta la conductividad de la primera solución retenida de
modo de evitar sustancialmente o revertir sustancialmente la
precipitación de los componentes en solución inducida por el
polímero orgánico para producir una segunda solución retenida, y
luego la segunda solución retenida se somete a ultrafiltración para
concentrar adicionalmente la macromolécula de modo de producir una
solución concentrada. En una forma de realización, la conductividad
se ajusta por diafiltración contra agua, diluyente o buffer
adecuados.
Con preferencia, la invención se refiere a la
concentración de soluciones acuosas de proteínas nativas o
recombinantes. La solución inicial con preferencia comprende
sobrenadante del cultivo celular de mamífero o insecto. La
invención además se refiere con preferencia a los procedimientos
para la concentración del sobrenadante del cultivo celular que
comprende una proteína producto y polímero orgánicos de la familia
Pluronic de copolímeros en bloque, y con mayor preferencia que
comprende copolímero en bloque Pluronic F-68. La
invención también se puede practicar usando los sobrenadantes del
cultivo celular que contienen otros polímeros orgánicos tales como
polietilenglicoles o compuestos antiespuma. Los presentes
procedimientos producen soluciones de proteínas que tiene factores
de concentración altos (es decir, de 20 veces a 100 veces o mayor,
con preferencia de 75 veces a 100 veces o mayor).
Los solicitantes descubrieron que durante la
ultrafiltración, los polímeros orgánicos coconcentrados tal como
Pluronic F-68 inducen la precipitación de las
macromoléculas. También se descubrió que dicha precipitación depende
de la fuerza iónica de la solución. En consecuencia, de acuerdo con
la presente invención, se proporciona un procedimiento de
concentración de una solución que comprende macromoléculas y
polímero orgánico. El procedimiento comprende primero concentrar la
solución para producir una primera solución retenida, ajustar la
fuerza iónica de la primera solución retenida usando un agente de
dilución adecuado de modo de evitar sustancialmente o reducir
sustancialmente la precipitación de los componentes en solución
inducida por el polímero orgánico para obtener una segunda solución
retenida, y luego concentrar la segunda solución retenida en al
menos 50 veces, con preferencia al menos 100 veces, y aún con mayor
preferencia en más de 100 veces en comparación con la concentración
de macromolécula de la solución inicial y la b la obtención de
rendimientos de 75-100% de la macromolécula, con
preferencia al menos 95,0%, con mayor preferencia al menos 99,0%, y
en particular con preferencia un porcentaje de rendimiento de 99,5
o más de la macromolécula. En una forma de realización, el polímero
orgánico comprende un miembro de la familia Pluronic de copolímeros
en bloque no iónicos, y con mayor preferencia comprende Pluronic
F-68. Se pueden realizar etapas del proceso
adicionales opcionales. Por ejemplo, el producto de la macromolécula
del procedimiento de la invención se puede someter a congelamiento,
descongelamiento y filtración posdescongelamiento del producto
refinado para aumentar la pureza o preparar una dosis terapéutica
deseable.
En una forma de realización particular, la
presente invención se refiere a resolver el problema de
precipitación de proteína inducida por Pluronic. En una primera
etapa, se concentra el sobrenadante del cultivo celular, por
ultrafiltración, a un factor de concentración donde la pérdida de
producto es mínima (por ejemplo 20 veces con respecto a la
concentración original). Luego, con preferencia usando el mismo
equipamiento, el total o una porción del concentrado obtenido en la
primera etapa anterior se diafiltra contra agua (WFI) u otro buffer
adecuado para reducir la conductividad a un punto donde se evita
sustancialmente la precipitación del producto inducida por Pluronic,
es decir, una conductividad de menos de 6 mS/cm, y con mayor
preferencia de 0,5 a 5 mS/cm. Como se usa en la presente, las
mediciones de conductividad se realizan a 22ºC a menos que se
describa de otro modo. Finalmente, el material también se concentra
para obtener factores altos de concentración final (por ejemplo
75-100X con respecto a la concentración original)
con poca o sin pérdida de producto y con precipitación de proteína
a granel minimizada. Las tres etapas se pueden realizar en el mismo
equipo. En este caso, generalmente existe poco o ningún aumento de
complejidad y no es necesario material nuevo o requisitos de
hardware. La etapa de filtración inicial permite la minimización de
WFI o el consumo de buffer durante la etapa de diafiltración. Debido
a que el volumen adicional que se debe filtrar durante la etapa de
diafiltración es en consecuencia bajo (usualmente el volumen
adicional necesario durante la diafiltración es menor de 20%, con
frecuencia menor de 15%), el tiempo del proceso total no está
significativamente prolongado.
Un proceso de acuerdo con la presente invención
permite un incremento significativo del factor de concentración, es
decir, de 20 veces a 100 veces y superior, a la vez que también
aumenta el rendimiento del producto en comparación con un proceso
convencional. El presente proceso provee rendimientos del proceso
de 75% a 100%, con preferencia de 90% - 100%, y en muchos casos,
hasta 95%, o incluso hasta 99,5%, los que en el arte previo solo se
pueden obtener para factores de concentración mucho menores de
menos de 10 a 20 veces. La precipitación de proteína a granel se
reduce significativamente cuando se emplea un proceso de acuerdo
con la presente invención. Por ejemplo, la filtrabilidad para un
concentrado de 20 veces varía de 6 a 10 ml (10 ml es el máximo
teórico) medido usando un filtro de jeringa Acrodisc de 25 ml
fabricado por Pall Corporation que tiene 2,8 cm cuadrado de área de
filtro a 10 libras de presión. Esta es una mejora significativa en
comparación con un 1 a 5 ml que se usan en los procesos del arte
previo. Mediante un proceso de acuerdo con la invención se obtiene
mejor filtrabilidad para un concentrado 75 veces (6 ml de promedio)
que el concentrado de 20 veces que se usa en los procesos
convencionales de la técnica anterior (aproximadamente 3 ml de
promedio; ver, por ejemplo, datos de filtrabilidad que se muestran
en la Fig. 17).
Los objetos, características y ventajas de la
invención se expondrán en la siguiente descripción. Los objetos,
características y ventajas de la invención se pueden realizar y
obtener por medio de los instrumentos y la combinación indicadas
particularmente en la presente.
Los dibujos acompañantes, que se incorporan y
constituyen una parte de la memoria descriptiva, ilustran una forma
de realización preferida en este momento de la invención y junto con
la descripción general dada anteriormente y la descripción
detallada de la forma de realización preferida dada a continuación,
sirve para explicar los principios de la invención.
La Fig. 1 muestra de copolímeros en bloque de
Pluronic ejemplares.
Fig. 2: Desarrollo experimental para los
experimentos de adición de Pluronic F-68. Las
muestras se tomaron de una corrida de
UF-concentración típica (a 1 X-50X;
la muestra 50X (final) se tomó del concentrado de UF final extraído
del sistema). Las soluciones de Pluronic F-68 se
prepararon en un medio de cultivo de células estándar (a
0-200 g/l). El resultado es una matriz de 25
soluciones, con factores de concentración final de
0,5-25 veces en comparación con el sobrenadante y
las concentraciones de Pluronic F-68 entre 0,5 y
125 g/l (se asume una retención completa de Pluronic
F-68 durante la UF y 1 g/l de concentración de
Pluronic F-68 en el medio).
Fig. 3: (a) electroforesis en gel SDS seguida
por tinción con plata; (1) = Estándar IL-2SA (5
mg/l); (2) = Recolección de concentrado de UF (25X); (3) =
Sobrenadante de 25X después de centrifugación; (4) Pellet redisuelto
en 1 ml de buffer; (b) ZAP (transferencia western teñida usando
anticuerpo antihlL-2); (1) = Recolección no
concentrada; (2) = Recolección de concentrado de UF (25X); (3) =
Sobrenadante de 25X después de la centrifugación; (4) = Pellet
redisuelto en 10 ml.
Fig. 4: Viscosidad de soluciones de Pluronic
F-68 preparadas en medio de cultivo celular y
diversos concentrados de ultrafiltración. La dilución del medio de
cultivo se realizó con WFI para alcanzar 1-1,5 mS/cm
de conductividad.
Fig. 5: Precipitación durante la adición de
Pluronic F-68 en la recolección de cultivo
ultrafiltrado de diferente concentración, medida por incremento de
absorbancia a 580 nm en una cubeta estándar en un espectrofotómetro
estándar (comparar también la Fig. 2). El material para la muestra
25X (final) se tomó del concentrado extraído.
Fig. 6: Proteína total restante después de la
centrifugación en los experimentos de adición de Pluronic
F-68 (comparar también la Fig. 2). El material para
la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.
Fig. 7: IL-2SA restante en
solución después de la centrifugación en los experimentos de
adición de Pluronic F-68 (comparar también la Fig.
2). El material para la muestra 25X (final) se tomó del concentrado
extraído.
Fig. 8: Rendimiento de proteína a granel después
de la precipitación inducida por Pluronic F-68. Se
muestran las curvas para varias concentraciones de proteína
(compare La Fig. 2). El material para la muestra 25X (final) se
tomó del concentrado extraído.
La Fig. 9: Rendimientos de
IL-2SA después de la precipitación inducida por
Pluronic F-68. Se muestran las curvas para varias
concentraciones de proteína (compare La Fig. 2). El material para
la muestra 25X (final) se tomó del concentrado extraído.
Fig. 10: (a) Perfil de concentración para los
solutos retenidos en la superficie de la membrana (esquemática),
(b) Distribución de presión no homogénea y en consecuencia flujo
del permeado no homogéneo en filtración de flujo cruzado (de Vogel
et al., 2002), "TMP" es presión de transmembrana.
La Fig. 11: precipitación inducida por Pluronic
de proteína total y IL-2SA y su reducción por
conductividad reducida (experimentos de adición). Conductividad
baja = 1-1,5 mS/cm.
La Fig. 12: Influencia de la adición de sal a
concentrado de baja conductividad diafiltrado sobre la
precipitación de proteína a granel.
La Fig. 13: Influencia del pH sobre la
precipitación. Se usó ácido fosfórico concentrado para el descenso
gradual del pH del concentrado de UF/DF/LTF 75X.
La Fig. 14: Influencia de la conductividad sobre
la precipitación para dos pH diferentes (pH 6,0 ajustado por la
adición de ácido fosfórico concentrado). Se usó el concentrado de
UF/DF/UF 75X en ambos casos.
La Fig. 15: Esquema del proceso de aislamiento
de UF/DF/UF de acuerdo con una forma de realización preferida de la
invención.
La Fig. 16: Realización del esquema del proceso
de aislamiento de UF/DF/UF de la invención en comparación con el
proceso de UF convencional.
La Fig. 17: Filtrabilidad de
IL-2SA a granel concentrado por el nuevo esquema
del proceso de aislamiento UF/DF/UF en comparación con el proceso
de UF/DF convencional.
La Fig. 18: Influencia de las concentraciones
altas de Pluronic F-68 (75 g/l) sobre la unión de
IL-2SA a la resina de intercambio catiónico SP
Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech).
La presente invención es ventajosa para usar en
los procesos de fermentación por perfusión continua o semicontinua
y fermentación discontinua. Con más preferencia, la invención se
refiere a fermentación por perfusión continua o semicontinua. Como
es bien conocido en el arte, producir proteínas mediante procesos
continuos tiene ciertas ventajas. La proteína producida
generalmente es de mejor calidad debido al menor tiempo de retención
en el biorreactor. Asimismo las proteínas producidas por procesos
continuos están menos sujetas a la degradación. En los procesos
discontinuos, normalmente hay mayores concentraciones de proteína
en el sobrenadante de la fermentación, mientras que en los procesos
continuos, la proteína producida está en una solución más
diluida.
En consecuencia, el presente procedimiento es
particularmente beneficioso para la concentración de los productos
de proteína obtenidos de procesos de perfusión continuos o
semicontinuos, ya que tienen que procesar una solución de proteína
comparativamente más diluida. A menudo, en la perfusión continua
concentración de proteína es significativamente menor de 1 g/l y
algunas veces menor de 0,1 g/l. Los factores de concentración altos,
con preferencia 100 veces y superiores, son muy deseables para
facilitar el procesamiento posterior adicional. Además, la presente
invención se puede usar con proteínas producidas por lotes si se
deseara por alguna razón.
La presente invención involucra concentrar las
macromoléculas a partir de una solución acuosa que tiene
componentes en solución. Estos componentes en solución incluyen la
macromolécula y un polímero orgánico.
Los componentes en solución también pueden
incluir otros compuestos tales como los que se hallan comúnmente en
el sobrenadante del cultivo celular. Por ejemplo, los componentes
pueden incluir suplementos del medio de cultivo celular tal como
aceite de silicio y antiespuma y compuestos que se secretan de las
células o se liberan después de la lisis celular (por ejemplo,
proteínas y lípidos tales como que se hallan en la célula
huésped).
La presente invención es particularmente útil
para soluciones que están compuestas de un polímero orgánico tal
como un miembro de la familia Pluronic de copolímeros en bloque, y
con mayor preferencia compuestos de Pluronic F-68,
que es un componente esencial de muchos medio de cultivo celular
para los procesos de fabricación de proteínas. También se considera
que otros polímeros orgánicos se coconcentran con una macromolécula
deseada durante la ultrafiltración y producen la precipitación de la
macromolécula o proteína. En consecuencia, los procedimientos de la
invención se aplican para concentrar soluciones que comprenden
otros polímeros orgánicos para la coconcentración, tales como
polietilenglicol ("PEG"), polímeros antiespuma. En la mayoría
de los casos, se considera que la precipitación de proteína se
produce como resultado de la reducción de la constante dieléctrica
de la solución concentrada después de la ultrafiltración, así como
del aumento de la competición por las moléculas de agua necesarias
para la solvatación de los polímero orgánicos y macromoléculas
coconcentrados.
Se considera que el mecanismo fundamental de la
precipitación de las macromoléculas inducido por las
concentraciones aumentadas de un polímero orgánico tal como, por
ejemplo, Pluronic F-68, se aplica a las soluciones
que comprenden otras proteínas y macromoléculas, además de las
descritas en forma específica en los ejemplos. En consecuencia, los
procedimientos de la presente invención se pueden emplear con
muchos polímeros orgánicos y proteínas diferentes. Las soluciones
de macromoléculas usadas en los procedimientos de la invención
pueden ser soluciones de proteínas. En una forma de realización, se
puede emplear un proceso de acuerdo con la presente invención con
la proteína recombinante del agonista selectivo de la interleuquina
2 ("IL-2SA"). Otros productos de proteína
recombinante que se pueden procesar usando técnicas de la presente
invención incluyen el Factor VIII humano recombinante
comercializado por Bayer Corp. como Kogenate^{TM} infliximab
recombinante comercializado por Centocor, Inc. como Remicade^{TM}
abciximab recombinante comercializado por Johnson y Johnson como
Reopro^{TM}, agalfidafe beta comercializado por Genzyme Inc. como
Fabrazyme^{TM}, factor antihemofílico recombinante comercializado
por Wyeth Ayerst como Refacto^{TM} y factor antihemofílico
recombinante comercializado por Baxter Inc. como Recombinate^{TM}
y alguna y todas sus versiones de segunda y tercera generación, así
como muchos otros productos de proteína.
Una función principal de Pluronic
F-68 es proteger las células del daño potencial
causado por el burbujeo (ver por ejemplo Murhammer and Goochee,
1988; Murhammer and Goochee, 1990; Jordan et al., 1994), que
a su vez es necesario para asegurar suficiente transferencia de
oxígeno dentro de los biorreactores en producción en escala. Sin la
adición de sustancias protectoras como Pluronic
F-68, las células se adhieren a la interfaz
gas-líquido (Chalmers and Bavarian, 1991). Durante
la ruptura de las burbujas de gas, las células se someten
posteriormente a estreses de cizallamiento muy altos. Según el
diámetro de la burbuja, se han informado tasas de disipación de
energía máximas de hasta 9,52* 10^{7}
J*m-^{3}*s-^{1}, con burbujas
más pequeñas para una aireación más eficiente que también origina
estrés de cizallamiento superior (Boulton-Stone and
Blake, 1993; García-Briones et al., 1994). En
comparación, se sabe que las tasas de disipación de energía del
orden 10^{4}-10^{7} J*m^{-3}*s^{-1} causan
muerte celular en los campos de flujo bien definidos (por ejemplo
Schurch et al., 1988, Augenstein et al., 1971).
Pluronic F-68 protege a las
células sujetas a este alto estrés de cizallamiento al evitar la
adhesión celular a la interfaz aire-líquido
(García-Briones y Chalmers, 1992), que parece ser
el resultado de la reducción de la tensión superficial dinámica con
Pluronic F-68 (Michaels et al., 1995b).
Además, se ha demostrado que Pluronic F-68
interactúa directamente con la membrana celular, lo que produce una
sensibilidad al cizallamiento significativamente reducida (Goldblum
et al., 1990; Michaels et al., 1991).
El grado de protección mediante Pluronic
F-68 depende de su concentración en el medio. En
muchos casos, en la bibliografía se considera óptima una
concentración de 1 g/l (por ejemplo Mizrahi, 1984, Maiorella et
al., 1988). En el caso de IL-2SA, la
concentración de Pluronic F-68 también es con
preferencia 1 g/l (0.1%).
Los Pluronic generalmente comprenden un bloque
central de polioxipropileno hidrofóbico (PPO) entre bloques de
polioxietileno (PEO) hidrofílico, en consecuencia se pueden
describir generalmente como moléculas de tres bloques
PEO_{m}-PPO_{n}-PEO_{m} (ver
la Fig. 1). La cantidad de bloques de PEO varía para los diferentes
Pluronic de m = 2-130, mientras que la cantidad de
bloques de PPO varía de n = 15-67. La nomenclatura
de Pluronic provista por BASF Corp. de Parsippany NJ incluye un
código de letras para la forma física, es decir, líquida (L), pasta
(P) o escamas (F). La letra es seguida por un número de 2 ó 3
dígitos. El primer dígito, o en el caso del código de 3 dígitos, los
primeros dos dígitos, multiplicados por 300 indican el peso
molecular aproximado de la parte PPO hidrofóbica. El último dígito
multiplicado por 10 da el contenido aproximado de PEO hidrofílico
de la molécula completa (por ejemplo "8" significa 80% de
PEO).
Pluronic F-68 es un sólido
(escamas) con 80% de contenido de PEO. El peso molecular promedio
de la molécula completa es aproximadamente 8,4 kD (BASF Corp., NJ).
Debido al alto contenido de PEO hidrofílico (es decir, 80%), la
molécula es más soluble que muchos otros Pluronic (> 100 g/l en
agua a 25ºC; información del fabricante, BASF Corp, NJ).
En contraste con los tensioactivos
convencionales, la formación de micelas de los copolímeros de tres
bloques anfifílicos es intrínsecamente más compleja, y, en general,
no se observan CMC (concentración de micela crítica, concentración
a la que se forman las micelas a una temperatura dada) o CMT
(temperatura de micela crítica, la temperatura a la que se forman
las micelas para una concentración dada) marcadas. En cambio, se
halla un rango amplio de CMC y/o CMT por técnicas de dispersión
luminosa y/o espectroscópicas, por ejemplo, con sondas
fluorescentes (Alexandridis and Hatton, 1995). Este rango
generalmente es > 100 g/l. Debido a que la formación de micelas
es dirigida por la entropía, y la energía libre de la micelización
es principalmente una función del bloque de PPO hidrofóbico,
Pluronic F-68 con su carácter principalmente
hidrofílico no forma micelas fácilmente en agua a TA (Alexandridis
et al., 1994). En cambio, para las concentraciones de 10 g/l
en agua, la CMT está alrededor de 45-50ºC, mientras
que para las concentraciones de 100 g/l, la CMT está alrededor de
30-35ºC. En consecuencia, para TA, la CMC es >
100 g/l
(Alexandridis et al., 1994).
(Alexandridis et al., 1994).
Se sabe que Pluronic F-68 causa
contaminación adicional de la membrana en la etapa de
ultrafiltración a menudo empleada para concentración/aislamiento
inicial. Como se describe en Schulz et al. (1997) mencionado
supra, durante la ultrafiltración, se forma una membrana
secundaria, cuyas propiedades dominan la retención de los polímeros
orgánicos. Como resultado, Pluronic F-68 es al menos
parcialmente retenido incluso si se usan membranas límite de peso
molecular alto, que solo es posible para los productos
particularmente grandes (por ejemplo, 100 kD). En consecuencia,
Pluronic F-68 es muy difícil de eliminar por
procesos de filtración (Schulz et al., 1997).
Por ejemplo, se proporcionan los datos a partir
de un proceso para el aislamiento de una proteína recombinante
(IL-2SA). Investigaciones detalladas han demostrado
que Pluronic F-68 se coconcentra durante los
procesos de ultrafiltración e induce la precipitación de proteína
significativa con factores de concentración superiores
20-25 veces (para 1 g/l de Pluronic
F-68 en el medio).
Los procedimientos de la presente invención
incluyen la ultrafiltración, que se puede obtener usando
equipamiento y condiciones estándares conocidas por los expertos en
la técnica. La presente invención también incluye una etapa de de
ajuste de la conductividad de una solución. Esto se puede conseguir
por cualquier forma conocida por los expertos en la técnica. De
particular preferencia son diafiltración, dilución o filtración en
gel. La de mayor preferencia es diafiltración. Como se usa en la
presente, "solución" se refiere a una solución o
suspensión.
La invención se describe con más detalle por
medio de los siguientes ejemplos.
El análisis del precipitado formado durante la
concentración por ultrafiltración del sobrenadante del cultivo
celular por espectroscopia de infrarrojo identifica claramente la
proteína como el principal componente del precipitado.
Se obtuvo una recolección concentrada 25 veces a
partir de la fermentación de IL-2SA. El
sobrenadante se sometió a centrifugación y el pellet se redisolvió
en PBS. La Recolección concentrada por UF, el sobrenadante de
concentración de 25 veces y el pellet redisuelto se analizaron por
electroforesis en gel SDS seguido por tinción con plata (ver la Fig.
3a) e inmunotinción (análisis ZAP) con un anticuerpo
anti-hIL-2SA (ver la Fig. 3b). A
partir de la Fig. 3a, (4) se puede observar que el precipitado, que
estaba al menos parcialmente redisuelto en el buffer, en efecto
contiene cantidades significativas de proteína. Como se puede
observar a partir de la Fig. 3b, (4) también precipita algo de
IL-2SA. Sin embargo, la cantidad de
IL-2SA precipitado parece ser relativamente baja
(comparar 3b, (4) y (3)), lo que es compatible con los rendimientos
relativamente razonables de alrededor de 90% del proceso de
ultrafiltración convencional. En consecuencia, se puede concluir
que la mayor parte de la proteína a granel (proteína de la célula
huésped) forma el precipitado encontrado durante la ultrafiltración
de los sobrenadantes del cultivo celular.
\vskip1.000000\baselineskip
El peso molecular promedio de Pluronic
F-68 es 8,4 kD, que es relativamente alto. Debido a
la formación de membranas secundarias durante los procesos de
ultrafiltración y las condiciones intrínsecamente no homogéneas a
lo largo del canal de flujo cruzado, la selectividad de la
tecnología de UF convencional usualmente no permite la separación de
moléculas significativa en el rango de tamaño de Pluronic. Incluso
para membranas de UF de 100 kD, usadas para los productos de
proteína más grandes como rFVIII o gp220/350, usualmente se halla
una retención y coconcentración significativas de polímeros como
Pluronic F-68 (ver, por ejemplo, Schulz et
al., 1997). Se puede suponer que el coeficiente de retención R
de Pluronic F-68 durante el proceso de
ultrafiltración, por ejemplo, con NMWCO de 10 kD (límite de peso
molecular nominal) será cercano a 1 (o 100%). Debido a que la
concentración de Pluronic F-68 en el medio requerida
para obtener una protección celular adecuada durante la
fermentación es 1 g/l (0,1%), en consecuencia una concentración de
30 veces llevaría hasta 30 g/l (o 3%) de Pluronic
F-68 en el concentrado por UF.
Para confirmar esta hipótesis, las muestras de
retenido de varios factores de concentración (1X = sobrenadante del
cultivo, 2X, 4X, 8X, 16X y aproximadamente 50X) se sometieron a un
análisis por cromatografía en capa fina (TLC). Las concentraciones
resultantes de Pluronic F-68 fueron estimadas como
1-2 g/l para 1 y 2X, 4 g/l para 4X,
4-10 g/l para 8X, 10 g/l para 16 X y 50 g/l para
50X. Considerando la inexactitud intrínseca del procedimiento de
TLC, estos resultados confirman claramente la coconcentración de
Pluronic F-68 casi completa.
Esta coconcentración de Pluronic
F-68 posee evidentemente el efecto adicional de
incrementar la viscosidad de la solución del producto. Como se
puede observar a partir de la Fig. 4, los concentrados de varias
corridas de UF muestran efectivamente perfiles de viscosidad
similares (en función de la concentración de Pluronic
F-68 asumida) como soluciones de Pluronic
F-68 de concentración conocida preparadas tanto en
medio de cultivo como medio de cultivo diluido.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a que se ha demostrado que la
concentración final de Pluronic F-68 en el retenido
de ultrafiltración es usualmente muy alta, se realizaron
experimentos de adición con sobrenadante y concentrados de cultivo
de diferentes factores de concentración con el fin de caracterizar
la influencia de estas concentraciones de Pluronic
F-68 superiores sobre la solubilidad de la
proteína. Como se puede observar a partir de la Fig. 5, la adición
de Pluronic F-68 en las muestras de sobrenadantes
del cultivo preconcentrados efectivamente causa una precipitación
importante. Como se esperaba, la precipitación inducida por
Pluronic-F68 parece ser más fuerte para un factor de
concentración mayor. La Fig. 6 muestra la proteína total restante
en solución medida por el ensayo de Bradford (después de la
centrifugación) en función del factor de concentración y la
concentración de Pluronic-F68. Estos resultados son
coherentes con las mediciones de A580 y confirman que la proteína
está precipitando en función de la concentración de Pluronic
F-68 adicionada y el factor de concentración total.
Como se puede observar a partir de la Fig. 7, en principio esto
también es verdadero para el ejemplo de la molécula del producto
IL-2SA.
Se considera que esta inducción de la
precipitación de proteína por concentraciones aumentadas de
Pluronic F-68 es causada por dos efectos. Primero,
la unión de las moléculas de agua a los bloques de PEO hidrofílico
del Pluronic F-68 reduce la disponibilidad de las
moléculas del agua para la capa de hidratación de las proteínas.
Segundo, la concentración de Pluronic F-68
aumentado disminuye la constante dieléctrica el medio, que aumenta
las interacciones de Coulomb entre las moléculas de proteína. El
resultado total es una reducción de la protección electrostática y,
en consecuencia, una disminución de la capacidad del sistema para
solvatar completamente las moléculas de proteína.
La proteína comienza a precipitar a las
concentraciones de Pluronic F-68 de alrededor de
20-30 g/l (ver la Fig. 8). Esto es compatible con el
hecho de que en el proceso convencional, la precipitación fuerte
comienza a producirse a una concentración de alrededor de
20-25 veces, ya que a una concentración inicial de
1 g/l de Pluronic F-68 en el medio y 100% de
retención, las concentraciones finales serán 20-25
g/l.
Para el ejemplo de IL-2SA, la
molécula del producto precipita al concentraciones de Pluronic
F-68 algo superiores (ver la Fig. 9), lo que explica
que el proceso convencional aún tenga rendimientos relativamente
razonables en el proceso de UF mismo, si bien se produjeron grandes
pérdidas en las etapas posteriores como resultado de la
precipitación.
\newpage
Ejemplo comparativo
4
Para minimizar la precipitación de proteína, se
debería minimizar la concentración de proteína máxima del sistema.
Debido al transporte por convección de los solutos retenidos hacia
la superficie de la membrana, la concentración de proteína máxima
en cualquier sistema de ultrafiltración de flujo cruzado dado se
alcanza en la capa límite laminar de la superficie de la membrana,
es decir, equivale a c_{pared}. A partir de un simple equilibrio
de masa, se deduce que la concentración de pares depende
exponencialmente del flujo del permeado J y el coeficiente de
transferencia de masa kD (ver la Fig. 10):
Equilibrio de masa para la retención completa (R
= 1; comparar la Fig. 10).
Para el caso del flujo turbulento en el canal de
flujo relleno con espaciador y capa límite laminar de la superficie
de la membrana (modelo de película), se aplica el siguiente
equilibrio de masa: (acumulación de masa de proteína en la
membrana) = (transporte por convección) - (retrotransporte por
difusión)
(se emplea la ley de Fick para el transporte por
difusión)
con dm/dt = c * F (F = flujo volumétrico a
través de la membrana [por ejemplo, litros/h])
en estado estacionario, la
acumulación de proteínas en la superficie es = 0; la separación de
variables lleva
a:
integración de y = 0 (c =
c_{pared}) a y = espesor de la capa laminar S (c =
c_{masa}):
lleva
a:
y de este modo al flujo específico
(retención
completa):
En consecuencia, la concentración de superficie
normalizada para cualquier flujo del filtrado ajustado J es:
- A
- área
- C
- concentración
- c^{eq}
- concentración en equilibrio
- D
- coeficiente de difusión
- S
- espesor de la capa límite laminar
- F
- flujo volumétrico
- J
- flujo del permeado
- k_{D}
- coeficiente de transferencia de masa
- M
- masa
- q^{eq}
- masa unida por unidad de resina en equilibrio.
\vskip1.000000\baselineskip
El coeficiente de transferencia de masa (que
puede ser estimado sobre la base de la correlación empírica o
semiempírica del número de Sherwood con el número de Reynolds y
Schmidt) depende de la velocidad de flujo cruzado en el sistema y
su geometría. Sin embargo, la transferencia de masa es difícil de
optimizar en sistemas de flujo cruzado convencional debido al
acoplamiento intrínseco de la fuerza de cizallamiento y la
generación de presión (Ver, es decir, Vogel, J. H.:
"Kontrollierte Scheraffinitátsfiltration: Eine neue Technik zur
integrierten Aufarbeitung pharmazeutischer Proteine aus tierischer
Zellkultur". Fortschr.-Ber. VDI Reihe 17, Nr. 185. VDI Verlag,
Duesseldorf. ISBN
3-18-318517-2. ISSN
0178-9600.1999, Vogel, J. H., Anspach, B., Kroner,
K.-H. Piret, J. M., Haynes, C. A.: Controlled Shear Affinity
Filtration (CSAF): A New Technology for Integration of Cell
Separation and Protein Aislation from Mammalian Cell Cultures.
Biotechnology and Bioengineering. Vol. 78, 7. p.
806-814. 2002, los cuales se incorporan en la
presente como referencia). Más específicamente, el incremento de la
velocidad de flujo cruzado para aumentar la k_{D} también aumenta
el descenso de presión en el canal de flujo. Esto a su vez crea
condiciones no homogéneas en las que la c_{pared} puede variar a
lo largo del canal de flujo.
En cualquier caso, se ha demostrado que el
procedimiento hidrodinámico para reducir la c_{pared} solo reduce
ligeramente la precipitación de proteína total inducida por
Pluronic, de este modo se permite solo obtener factores de
concentración ligeramente superiores sin pérdidas de rendimiento
adicional. En consecuencia, hubo fundamentalmente una necesidad de
una nueva solución, y este problema se ha resuelto exitosamente con
los procesos y productos de acuerdo con la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En las condiciones fisiológicas del medio de
cultivo celular y la recolección, la solubilidad de proteína es
usualmente buena. Sin embargo, se postuló que en el sobrenadante
del cultivo celular concentrado, las concentraciones altas de
Pluronic extraerán más agua de las capas de hidratación de las
proteínas, lo que más probablemente permite las interacciones
hidrofóbicas impulsadas termodinámicamente entre las proteínas y
finalmente produce la precipitación de proteína. En efecto, esta
situación se podría caracterizar por "aumento de competición"
para las moléculas de agua necesarios para mantener la solubilidad
de las proteínas. Debido a que Pluronic no se puede separar
efectivamente, esto se analizó con otros experimentos de adición si
una reducción del contenido de sal por diafiltración contra WFI
(agua para inyección) ayuda a mantener la solubilidad de las
proteínas. Como se puede observar a partir de la Fig. 11, al reducir
la conductividad de 11-12 mS/cm (como en la
recolección) a aproximadamente 1-1,5 mS/cm, las
proteínas parecen precipitar solo a concentración alta de Pluronic
F-68.
Con el fin de confirmar la influencia del
conductividad, se agregó sal a muestras de baja conductividad para
restaurar la conductividad original del sobrenadante del cultivo
celular (ver la Fig. 12). Se agregó aCl (solución patrón 1 M) en
forma gradual con mezclado al concentrado 50X diafiltrado
(aproximadamente 0,9 mS/cm, pH 7,14) para aumentar la conductividad.
El aumento de la absorción a A580 y la disminución de la proteína
soluble muestran que la adición de nuevo de sal revierte el efecto
de la conductividad reducida. En este caso, se induce la fuerte
precipitación de proteína, medida por A580 (ver la Fig. 12).
Estos resultados demuestran que la reducción de
las concentraciones de las sales puede reducir significativamente o
incluso eliminar la precipitación del producto.
A partir de la Fig. 13 se puede observar que a
baja conductividad (es decir, desde 0,5 a 5, particularmente
1,2 mS/cm), se evita en forma eficiente la precipitación. Dichas condiciones se pueden obtener por ejemplo, al mantener un pH de más de 6,7. Si el pH se reduce por debajo de aproximadamente 6,7, los aumentos de A580 indican precipitación, mientras que la filtrabilidad del material comienza a caer. Cabe destacar que el pH de las fermentaciones del cultivo celular está controlado en condiciones neutrales, que aparentemente está dentro del rango de la precipitación minimizada. Una disminución potencial del pH durante el almacenamiento es despreciable debido a que la actividad metabólica de cualquiera de las células viables restantes en la recolección almacenada es baja a una temperatura de almacenamiento de 4ºC. Por el contrario, debido a que el sistema de buffer del medio de cultivo celular está frecuentemente basado en bicarbonato, la liberación de gas de CO_{2} (por ejemplo, durante la UF) lleva a un ligero aumento del pH. En cualquier caso, para valores de pH razonablemente altos, la sensibilidad de precipitación con respecto a la conductividad es superior que la sensibilidad con respecto al pH (ver la Fig. 14).
1,2 mS/cm), se evita en forma eficiente la precipitación. Dichas condiciones se pueden obtener por ejemplo, al mantener un pH de más de 6,7. Si el pH se reduce por debajo de aproximadamente 6,7, los aumentos de A580 indican precipitación, mientras que la filtrabilidad del material comienza a caer. Cabe destacar que el pH de las fermentaciones del cultivo celular está controlado en condiciones neutrales, que aparentemente está dentro del rango de la precipitación minimizada. Una disminución potencial del pH durante el almacenamiento es despreciable debido a que la actividad metabólica de cualquiera de las células viables restantes en la recolección almacenada es baja a una temperatura de almacenamiento de 4ºC. Por el contrario, debido a que el sistema de buffer del medio de cultivo celular está frecuentemente basado en bicarbonato, la liberación de gas de CO_{2} (por ejemplo, durante la UF) lleva a un ligero aumento del pH. En cualquier caso, para valores de pH razonablemente altos, la sensibilidad de precipitación con respecto a la conductividad es superior que la sensibilidad con respecto al pH (ver la Fig. 14).
Un procedimiento preferido de la invención
comprende ultrafiltración, diafiltración, luego ultrafiltración
("UF/DF/ UF") (comparar la Fig. 15). En una primera
etapa, el sobrenadante del cultivo celular se concentra por
ultrafiltración a un factor de concentración conocido por no causar
pérdida de producto, tal como 20X. Luego, en el mismo equipo de UF,
el concentrado se diafiltra contra agua (WFI) o buffer para reducir
la conductividad al punto en que se evita eficientemente la
precipitación del producto inducida por Pluronic. Finalmente, el
material también se concentra para obtener factores de
concentración muy altos (por ejemplo 75-100X) sin
pérdida de producto y con precipitación de proteína a granel
minimizada. La concentración inicial está destinada a minimizar el
consumo de agua/buffer y el tiempo de proceso total. Mediante esta
etapa, el volumen necesario para la posterior diafiltración es solo
aproximadamente el 15% del volumen inicial del sobrenadante del
cultivo celular. Después de la diafiltración, se reanuda la
concentración para obtener factores de concentración final muy
altos (por ejemplo >75 - 100 veces). Debido a la fuerza iónica
reducida, las proteínas permanecen en solución y la filtrabilidad
continúa alta.
Las tres etapas se pueden realizar en el mismo
equipo, según se desea. En este caso, no existe aumento de la
complejidad y no es necesario material nuevo ni requisitos de
hardware. La etapa de UF inicial permite la minimización del
consumo de WFI. Debido a que el volumen adicional que se debe
filtrar durante la etapa de DF es en consecuencia bajo (usualmente
menor de 15% más), el tiempo total del proceso no está
significativamente prolongado.
Para el ejemplo de IL-2SA, la
Fig. 16 muestra el rendimiento de un proceso de acuerdo con la
presente invención medido a diferentes etapas desde un factor de
concentración 20X hasta el 100X final. Como se puede observar, el
nuevo proceso permite un aumento significativo del factor de
concentración, a la vez que simultáneamente se maximiza el
rendimiento del producto en comparación con un proceso
convencional. Los factores de concentración se aumentan hasta 5
veces y se maximiza el rendimiento. La precipitación se reduce
significativamente, como se puede observar a partir de los datos de
filtrabilidad mostrados en la Fig. 17.
Un factor de concentración superior obtenido por
el proceso de UF-DF-UF significa
que la concentración de Pluronic F-68 del material
que ingresa en la primera columna de purificación también será
superior, por ejemplo aproximadamente 75 g/l (o 7,5%) para un valor
blanco 75X. En consecuencia, se realizaron otros estudios para
evaluar si estas concentraciones de Pluronic F-68
altas podrían tener un impacto negativo sobre la etapa inicial de
purificación final. A menudo la primera etapa de purificación es una
cromatografía de intercambio catiónico. La Fig. 18 muestra las
isotermas de adsorción para una resina de intercambio iónica
estándar a 20ºC con y sin Pluronic F-68 agregado
adicional. Debido a que el Pluronic F-68 es un
componente del medio esencial, no estuvo disponible un concentrado
completamente libre de Pluronic. Sin embargo, el concentrado de
UF-DF-UF-TCF 75
veces se diluyó hasta 160 veces para la medición de la isoterma
"control", que produce muy bajas concentraciones de Pluronic
F-68, especialmente para la pendiente inicial de la
isoterma. En contraste, la dilución con una solución de 75 g/l de
Pluronic F-68 en medio prediluido produce 75 g/l de
concentración final de Pluronic F-68 para todos los
puntos de la isoterma. Como se puede observar a partir de la
figura, ambas isotermas son muy similares, lo que indica ningún
efecto negativo de los niveles elevados de Pluronic sobre la
termodinámica de la adsorción.
El Pluronic se coconcentrará en prácticamente
todos los procesos de ultrafiltración. Como resultado, induce la
precipitación de proteína, que usualmente comenzará a un factor de
concentración de aproximadamente 20-25 veces. Este
problema "universal" de precipitación de proteína lleva a las
pérdidas de rendimiento y otros problemas en el proceso de
aislamiento/purificación e impide la obtención de factores de
concentración superiores.
Usando IL-2SA como ejemplo de
modelo, se ha demostrado que la reducción de la fuerza iónica del
sobrenadante del cultivo puede evitar o minimizar eficientemente la
precipitación de proteína inducida por Pluronic a concentraciones
de Pluronic F-68 muy altas.
El nuevo esquema de aislamiento resultante
(UF/DF/UF) ofrece una solución eficiente y robusta al problema de
la precipitación. Esto permite la obtención de una concentración de
hasta 100 veces (es decir, hasta 5 veces superior que en el proceso
antiguo), con rendimiento maximizado y filtrabilidad aumentada.
Esto, a su vez, facilita drásticamente las operaciones posteriores
adicionales.
Además, se ha demostrado que las concentraciones
altas de Pluronic F-68 resultantes (hasta 75 g/l y
mayores) no tienen influencia negativa sobre la unión de
IL-2SA durante el intercambio de cationes
posterior.
En consecuencia, el esquema del proceso de
UF/DF/UF atrae como una "tecnología de plataforma" muy
adecuada para el aislamiento de las proteínas de la fermentación
del cultivo celular. Además de su rendimiento aumentado, es robusto
y fácil de implementar y utiliza el equipamiento de ultrafiltración
y el procedimiento de limpieza estándares iguales a los de la UF
convencional.
Se han publicado los siguientes documentos, que
se refieren generalmente a la recuperación de las proteínas
producidas a partir de cultivos de células de mamífero y de
insectos usando la ultrafiltración así como ciertos materiales
tales como los polímeros usados en relación con estas:
Alexandridis, P. and Hatton, T.
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oxide)-poly(propylene
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Scheraffinitatsfiltration: Eine neue Technik zur integrierten
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Integration of Cell Separation and Protein Isolation from Mammalian
Cell Cultures. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 78, 7,
p. 806-814. 2002.
Claims (9)
1. Un procedimiento para concentrar una proteína
a partir de una solución acuosa inicial que tiene componentes en
solución, los componentes en solución que comprenden la proteína y
un polímero orgánico, el polímero orgánico se selecciona del grupo
que consiste en los copolímeros en bloque de la familia de
Pluronic, polietilenglicol y polímeros antiespuma, el procedimiento
comprende: (1) someter la solución acuosa inicial a ultrafiltración
para concentrar la proteína, de modo tal que se produce una primera
solución retenida, (2) ajustar la conductividad de la primera
solución retenida por debajo de aproximadamente 6 mS/cm medido a
22ºC para producir una segunda solución retenida, y (3) someter la
segunda solución retenida a ultrafiltración para concentrar
adicionalmente la proteína de modo que se genere una solución
concentrada.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la conductividad se ajusta por diafiltración contra agua,
diluyente o buffer adecuados.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la conductividad de la primera solución retenida se ajusta
entre aproximadamente 0,5 a 5 mS/cm medido a 22ºC.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la conductividad de la primera solución retenida se ajusta
entre aproximadamente 1,0 a 1,5 mS/cm medido a 22ºC.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polímero orgánico es un copolímero en bloque no
iónico.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polímero orgánico es un copolímero en bloque de
polioxietileno-polioxipropileno.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la solución inicial comprende sobrenadante de cultivo de
células de mamífero o insecto.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la solución concentrada tiene al menos una concentración 50
veces superior de proteína que la solución inicial.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la solución concentrada tiene al menos una concentración 100
veces superior de proteína que la solución inicial.
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